E N Z I M A S

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICAESFUNO EUTM

A. Propiedades generales

B. Principios fundamentales de su acción catalítica

C. Introducción a la cinética enzimática

D. Regulación de la actividad enzimática

Enzimas

En su gran mayoría son proteínas

Catalizadores biológicos: aceleran muchísimo la velocidad de las reacciones (106 – 1014 veces)

Poseen un elevado grado de especificidad por el sustrato

La actividad catalítica depende de la integridad de la estructura nativa así como del pH y temperatura

Algunas poseen cofactores o grupos prostéticos: grupos no proteícos que colaboran en el mecanismo de catálisis

Su actividad puede ser regulada

A. Propiedades generales

N° Clase Tipo de reacción catalizada

1 Oxidoreductasas Transferencias de equivalentes de reducción de un grupo a otro

2 Transferasas Reacciones de transferencia de grupos funcionales de un sustrato a otro

3 Hidrolasas Reacciones de hidrólisis (transferencia de grupos funcionales de un sustrato al agua)

4 Liasas Adición o extracción de grupos H2O, NH3 o CO2

5 Isomerasas Reacciones de isomerización

6 Ligasas Formación de enlaces acopladas a la hidrólisis de ATP

Clasificación:

Nomenclatura: generalmente se adiciona sufijo “asa” al nombre del sustrato o de la reacción que cataliza

Ejemplos:

• Glucoquinasa: transferencia de grupo fosfato (kinasa) del ATP a la glucosa

• Ureasa: hidrólisis de la urea

A. Propiedades generales

B. Principios fundamentales de su acción catalítica

C. Introducción a la cinética enzimática

D. Regulación de la actividad enzimática

Enzimas

B. ¿Cómo funcionan?

E + S ↔ ES → E + P

Unen un sustrato lo convierten en un producto y lo liberan

La reacción enzimática tiene lugar dentro de un pequeño lugar en la enzima: el sitio activo

•En condiciones fisiológicas las reacciones sin catalizar tienden a ser lentas (estabilidad de biomoléculas)

•Muchas reacciones bioquímicas suponen situaciones poco probables

•Una enzima soluciona estos problemas proporcionando un ambiente tridimensional favorable a la reacción (sitio activo)

B. ¿Cómo funcionan?

B. ¿Cómo funcionan?

Aumenta la velocidad de reacción sin cambiar el equilibrio

Coordenada de reacción

Ener

gía

libre

, G

Reacción no catalizada

Reacción catalizada

Estado de transición

Ener

gía

libre

, G

Coordenada de reacción

A. Propiedades generales

B. Principios fundamentales de su acción catalítica

C. Introducción a la cinética enzimática

D. Regulación de la actividad enzimática

Enzimas

Cinética enzimática

• Es el estudio de la velocidad de las reacciones enzimáticas

La velocidad de una reacción se puede medir como:

I. la cantidad de producto formado por unidad de tiempo

II. la cantidad de sustrato que se consume por unidad de tiempo

S → P

v = d [P] - d[S] dt = dt = k[S]

Velocidad: concentración/tiempo (µM/min)k (de primer orden): tiempo -1 (min-1)

Velocidad de reacción

Modelo de de Michaelis- Menten

E + S ↔ ES → E + P

Michaelis y Menten propusieron un modelo para explicar el comportamiento de las enzimas:

• Postularon que la enzima se combina en primer lugar con el sustrato, de forma reversible

• El complejo se descompone en una reacción más lenta, dando lugar al producto y enzima libre

Modelo de de Michaelis- Menten

+=

SSmaxV

ovmK

Vmax = Velocidad máxima

Km = [S] a la cual la velocidad es igual a ½ de Vmax

Parametros cinéticos:

•La velocidad de la reacción depende de la concentración de sustrato

•La relación entre ambas variables está descrita por una hipérbola rectangular (cinética de saturación)

ES E + S E + Pk2

k-1

k1

• Los parámetros Km y Vmax son característicos para cada enzima y para cada uno de sus sustratos

* Vmax depende de la concentración de enzima

Modelo de de Michaelis- Menten

La velocidad inicial depende de la concentración de enzima: Constante catalítica Kcat

Si [S] >> Km: la enzima se encuentra “saturada”todos sus sitios activos ocupados por el sustrato

Vo = Vmax

Vmax = kcat [E] total

V0 = k2 [ES]

Concentración de enzima

Velo

cida

d in

icia

l (Vo

)

E + S ↔ ES → E + PK1 k2

K-1

ET = E libre + ES

Kcat o número de recambio

Kcat = Vmáx[ET]

Número de recambio

Número de moléculas de sustrato convertidas a producto por una unidad de tiempo por una molécula de enzima cuando la

misma se encuentra saturada por el sustrato

• Es la velocidad medida en

los primeros instantes de

la reacción y cuando se ha

consumido menos de un

10% de sustrato

• Velocidad inicial

¿Cómo se determina experimentalmente la actividad enzimática?

Se mide la velocidad

inicial de reacción

mantentiendo constante

la [E] y variando la [S]

¿Cómo se determina experimentalmente la actividad enzimática?

[ ] max11

max1

VSVmK

ov +⋅=

+=

SSmaxV

ovmK

Linealización de Lineweaver Burk

y = a x + b

Determinación de los parámetros cinéticosGráfico de dobles recíprocos

Dependencia de la velocidad con el pH

pH óptimo

Dependencia de la velocidad con la temperatura

Temperatura óptima

Determinación de la actividad enzimática en muestras clínicas

Se mide en presencia de concentraciones de sustrato saturantes (> 10 Km)

Se expresan en UI/mL

Se deben estandarizar las condiciones de pH, temp, fuerza iónica, etc.

Algunas enzimas utilizadas en diagnóstico clínico de enfermedades

Enzima Tejido Uso diagnóstico

Creatina fosfoquinasa (CK) Músculo esquelético, corazón

Distrofia muscular, infarto de miocardio

Alanina amino transferasa (ALT) Hígado Hepatopatía (por ej.

hepatitis)

Amilasa Páncreas, glandulas salivales

Pancreatitis aguda, obstrucción biliar

Fosfatasa alcalina Osteoblasto Enfermedad ósea, tumores óseos

Gama-glutamil transferasa (GGT) Hígado Hepatitis, exceso de alcohol

A. Propiedades generales

B. Principios fundamentales de su acción catalítica

C. Introducción a la cinética enzimática

D. Regulación de la actividad enzimática

Enzimas

D. Regulación de la actividad enzimática

La actividad de las enzimas puede ser modulada positiva- o negativamente según las necesidades del organismo

Esta propiedad es la base de muchos fármacos utilizados en la medicina para tratar una enorme diversidad de afecciones

D. Regulación de la actividad enzimática

1. Inhibidores reversibles

a) Inhibidores competitivos

b) Inhibidores acompetitivos

c) Inhibidores no competitivos

2. Inhibidores irreversibles

3. Modulación alostérica

4. Modulación covalente

5. Activación por proteolisis

1. Inhibidores Reversibles

a. Inhibidor competitivoEl inhibidor competitivo interfiere con la unión del sustrato al sitio activo

•Los inhibidores competitivos suelen ser similares al sustrato

Ejemplos de inhibidores competitivos

I. malonato•El malonato es inhibidor de la enzima mitocondrial succinato deshidrogenasa.

•Su estructura es muy similar a la del sustrato (succinato) y compite por su unión al sitio activo.

Ejemplos de inhibidores competitivos

II. metotrexato

• Se usa como anti-cancerígeno

• Es un inhibidor de la enzima tetrahidrofolato reductasa

• Tiene una afinidad 1000 veces mayor que el sustrato (ácido fólico) por la enzima

Determinación del tipo de inhibición

KM app > KM

a. Inhibidor competitivo

KM real KM ap

Sin inhibidor

Con inhibidor

Vmáx

Velo

cida

d de

rea

cció

n

½Vmáx

[Sustrato]

Determinación del tipo de inhibición

Con inhibidor

Sin inhibidor

Linealización de Lineweaver Burk

y = a x + b donde: a= pendiente KM/Vmáx b = corte en el eje de las y 1/Vmáx

Otros tipos de inhibidores reversibles

Acompetitivo

No competitivo

Competitivo

Mixto

2. Inhibidores Irreversibles

• Se unen o modifican covalentemente a la enzima y la inhiben

• Ejemplo: penicilina

La penicilina se parece al péptido sustrato de la enzimatranspeptidasa (involucrada en la formación de la pared bacteriana)Al unirse a la enzima reacciona con un aminoácido del sitio activo de la enzima y la inactiva

3. Modulación alostérica

• Implica la unión reversible de un modulador en un sitio diferente al sitio activo.

• Esta unión puede llevar a una disminución o a un aumento de la actividad enzimática (modulación positiva o negativa)

• La misma enzima puede estar sujeta a regulación por varios moduladores diferentes

3. Modulación alostérica

• Las enzimas alostéricas no siguen una cinética de Michaelis Menten

• La relación entre velocidad y [S] está descrita por una curva sigmoidea

3. Modulación alostérica

Existen moduladores positivos (activan) y negativos (inhiben)

3. Modulación alostérica

Problema:

Las enzimas X e Y catalizan la misma reacción y presentan las curvas vo en función de [S] que se muestran en la figura. ¿Qué enzima es más eficiente a baja [S]? ¿Cuál es más eficiente a alta [S]?

4. Modulación covalente

Ejemplos:

• Fosforilación• Adenililación• Uridililación• ADP-ribosilación• Metilación

•En este tipo de regulación una enzima es modificada covalentemente por otra enzima

•La modificación produce un cambio conformacional en la enzima y cambia su actividad.

•La modificación puede ser adicionada o eliminada según las necesidades de la célula

5. Activación por proteólisis

- Muchas enzimas son sintetizadas como pro-enzimas y permanecen inactivas hasta que son clivadas por otras proteínas.

Es el caso de :

- Enzimas digestivas

- Cascada de coagulación

- Caspasas ( muerte celular)