Dx. Gonorrea

MPR-CNSP-008 Instituto Nacional de Salud

Portada: Frontis del local central del Instituto Nacional de Salud.

MINISTERIO DE SALUD

Ministro

Dr. Fernando Carbone Campoverde

Vice-Ministro

Dr. Oscar Ugarte Ubillúz

INSTITUTO NACIONAL DE SALUD

Jefe

Dr. Luis Fernando Llanos Zavalaga

Sub-Jefe

Dra. Aída Cecilia Palacios Ramírez

Centro Nacional de Salud Pública

Dra. Susana Zurita Macalupú

Directora General

Centro Nacional de Alimentación

y Nutrición

Dra. Doris Jhusey Schreiber

Directora General

Centro Nacional de Control de Calidad

Dra. Rosa Guevara Ormeño

Directora General

Centro Nacional de Producción de Biológicos

Q. F. Ricardo Valera Sánchez

Director General

Sub-Comité Editor

Presidente

Dra. Aída Palacios Ramírez

Secretario Técnico

Dr. César Cabezas Sánchez

Miembros

Dr. Jorge Alarcón Villaverde

Q.F. Zulema Arévalo Chong

Dr. Jorge Barnaby Rodríguez

Dr. Zuño Burstein Alva

Dr. Javier Cieza Zevallos

Dr. José Espinoza Babilón

Lic. Iván Gómez-Sánchez Prieto

Dr. Eduardo Gotuzzo Herencia

Dr. Alfredo Guillén Oneeglio

Dr. César Náquira Velarde

Lic. Margarita Rodríguez Gutarra

Dr. Víctor Suárez Moreno

Edición

Dr. Leonid Lecca García

Revisores

Dr. Alfredo Guillén Oneeglio

Dr. Víctor Suárez Moreno

Blga. Martha Glenny Araujo

I Instituto Nacional de Salud

Manual de procedimientos para el diagnóstico bacteriológico de gonorrea

MPR - CNSP - 008

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS PARA EL DIAGNÓSTICO BACTERIOLÓGICO DE GONORREA

ELABORACIÓN:

José Luis Portilla CarbajalMicrobiólogo

Laboratorio de Bacterias de Transmisión SexualDivisión de Bacteriología

Centro Nacional de Salud PúblicaInstituto Nacional de Salud


Instituto Nacional de SaludIIMPR - CNSP - 008

Catalogación hecha por el Centro de Documentación del INS

Portilla Carbajal, José Luis Manual de procedimientos para el diagnóstico bacteriológico de gonorrea /Elaborado por José Luis Portilla Carbajal. -- Lima : Ministerio de Salud, InstitutoNacional de Salud, 2002.

44 p.-- : 30 cm. -- (Serie de Normas Técnicas; 33)

1. GONORREA /diagnósticoI. José Luis Portilla CarbajalII. Instituto Nacional de Salud (Perú)III. Perú. Ministerio de Salud

ISBN 9972 – 857 – 23 – 9ISSN 1607 - 4904Hecho el Depósito Legal Nº 1501012002-2005

©Ministerio de Salud, 2002Av. Salaverry cuadra 8 s/n, Jesús María, Lima, PerúTelf.: 431-0410

©Instituto Nacional de Salud, 2002Cápac Yupanqui 1400, Jesús María, Lima, PerúTelf.: 471-9920 Fax 471-0179e-mail: [email protected]ágina Web: www.ins.sld.pe

Publicación aprobada con R.J. Nº 151 – 2002.

Se autoriza su reproducción total o parcial siempre y cuando se cite la fuente.

III Instituto Nacional de Salud


MPR - CNSP - 008

CONTENIDO

INTRODUCCIÓN V

SECCIÓN 1 GENERALIDADES 11.1 Objetivo 11.2 Campo de aplicación 11.3 Responsabilidades 11.4 Documentos de referencia 21.5 Definiciones 3

SECCIÓN 2 MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD 52.1 Responsabilidades 52.2 Agente 52.3 Riesgos en el laboratorio 52.4 Precauciones 52.5 Manejo del agente 5

SECCIÓN 3 OBTENCIÓN DE LA MUESTRA 63.1 Condiciones generales para la obtención de la muestra 63.2 Registro de datos 63.3 Materiales y equipos 63.4 Hisopado de uretra masculina 73.5 Hisopado cervico-vaginal 83.6 Hisopado rectal 83.7 Hisopado faríngeo 83.8 Hisopado de conjuntiva 93.9 Otras localizaciones 9

SECCIÓN 4 TRANSPORTE DE LA MUESTRA 104.1 Objetivo 104.2 Condiciones específicas 104.3 Condiciones generales 104.4 Consideraciones para el transporte de la muestra (aislamientos) 11

SECCIÓN 5 PROCEDIMIENTOS PARA EL DIAGNÓSTICO BACTERIOLÓGICO 125.1 Objetivo 125.2 Materiales y equipos 125.3 Examen directo de la muestra 135.4 Cultivos 145.5 Identificación presuntiva 155.6 Identificación confirmatoria de Neisseria gonorrhoeae 17

SECCIÓN 6 DETECCIÓN DE CEPAS PRODUCTORAS DE BETA-LACTAMASA 236.1 Objetivo 236.2 Campo de aplicación 236.3 Condiciones generales 236.4 Método de la cefalosporina cromógena, CEFINASE 23

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6.5 Método Yodométrico Rápido 246.6 Control de calidad para la prueba beta-lactamasa 246.7 Preparación de reactivos para la prueba beta-lactamasa 25

SECCIÓN 7 PROCEDIMIENTOS PARA LOS DE AISLAMIENTOS RECEPCIONADOS EN EL INS 267.1 Objetivo 267.2 Transporte de aislamientos para la identificación confirmatoria 267.3 Identificación confirmatoria 26

SECCIÓN 8 PROCEDIMIENTOS PARA LA PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO 278.1 Fundamento de los medios de cultivo 278.2 Objetivo 278.3 Materiales y equipos 278.4 Preparación del agar Thayer-Martin modificado 288.5 Preparación del agar chocolate enriquecido 298.6 Preparación del medio CTA-carbohidrato modificado 298.7 Medios para la crioconservación de las cepas 308.8 Medios de transporte 308.9 Registros de los medios de cultivos preparados 30

SECCIÓN 9 CONTROL DE CALIDAD DEL MEDIO DE CULTIVO THAYER-MARTIN Y AGARCHOCOLATE ENRIQUECIDO 31

9.1 Objetivo 319.2 Campo de aplicación 319.3 Condiciones específicas 319.4 Criterios para el control de calidad 319.5 Cepas de referencia 329.6 Materiales y equipos 329.7 Procedimiento 32

BIBLIOGRAFÍA 34

ANEXOS

ANEXO A FICHA DE REGISTRO DE DATOS DEL PACIENTE. 36

ANEXO B FICHA DE DATOS PARA EL TRANSPORTE DE AISLAMIENTOS PARA LACONFIRMACIÓN DE Neisseria gonorrhoeae. 37

ANEXO C PREPARACIÓN DE COLORANTES. 38

ANEXO D FLUJOGRAMA PARA EL AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE Neisseria gonorrhoeae. 39

ANEXO E FLUJOGRAMA PARA EL DIAGNÓSTICO CONFIRMATORIO DE Neisseria gonorrhoeae

POR EL MÉTODO BIOQUÍMICO CTA-CH. 40

ANEXO F FICHA DE DATOS PARA EL REGISTRO DE MEDIOS DE CULTIVOS PREPARADOS. 41

ANEXO G ILUSTRACIONES DEL EMBALAJE PARA EL TRANSPORTE DE LOS AISLAMIENTOS. 42

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INTRODUCCIÓN

Neisseria gonorrhoeae pertenece a la familia Neisseriaceae, es el agente causante de blenorragia o gonorrea,

enfermedad muy antigua descrita desde el año 2637 A.C. Fue observada en 1879 por Albert Neisser en exudados

purulentos de uretra de un paciente que presentaba uretritis gonocócica y cultivada por primera vez en 1882 por

Leistikow.

La gonorrea es, generalmente, una infección de transmisión sexual (ITS). En varones, el cuadro clínico es sintomá-

tico en 75,0% a 85,0%, lo contrario sucede en mujeres, donde la infección en la mayoría de casos es asintomática.

Las infecciones más frecuentes causadas por el gonococo son: uretritis, cervicitis, proctitis, salpingitis, faringitis,

vulvovaginitis en niñas, y oftalmía del recién nacido y adultos, entre otras. Es poco frecuente la infección sistémica

y la artritis gonocócica.

El éxito del aislamiento primario del gonococo depende de una adecuada obtención de la muestra, contar con

personal debidamente capacitado y de la calidad de los medios de cultivo; además, que la identificación confirmatoria

del mismo garantiza el diagnóstico clínico y orienta el tratamiento del paciente infectado.

Existen diversas pruebas de laboratorio para confirmar el diagnóstico bacteriológico del gonococo: pruebas

bioquímicas, serológicas con anticuerpo monoconal, hibridación del ácido desoxiribonucleico (ADN), amplificación

del ADN, siendo el más común el método bioquímico de utilización de carbohidratación en base CTA, conocido

como el método “convencional” o método del crecimiento.

El Instituto Nacional de Salud (INS), organismo técnico-normativo, pone a disposición del personal de salud este

manual que representa el resultado del esfuerzo de profesionales de la institución y acoge las recomendaciones

técnicas sugeridas por la Organización Mundial de la Salud (OMS), la Organización Panamericana de la Salud

(OPS), el Centro de Control de Enfermedades Infecciosas (CDC) y el Programa de Vigilancia de la Susceptibilidad

Antimicrobiana in vitro del Gonococo (GASP). En tal sentido, el presente manual tiene por objetivo establecer los

procedimientos técnicos para el diagnóstico bacteriológico de N. gonorrhoeae que el INS aplica y recomienda,

mediante la transferencia de tecnología a los laboratorios de la red nacional.

1 Instituto Nacional de Salud


MPR - CNSP - 008

SECCIÓN 1

GENERALIDADES

1.1 OBJETIVO

Establecer los procedimientos técnicos para realizar el diagnóstico bacteriológico de la infección causada

por N. gonorrhoeae en la población.

1.2 CAMPO DE APLICACIÓN

1.2.1 Aplicable para el Laboratorio de Bacterias de Transmisión Sexual y Leptospiras del Centro Nacional de

Salud Pública (CNSP) del Instituto Nacional de Salud - Ministerio de Salud, recomendándose su aplicación

en los laboratorios de la Red Nacional, así como también en los laboratorios de instituciones particulares.

1.2.2 Comprende:

1.2.2.1 Obtención de muestras de pacientes.

1.2.2.2 Procedimientos de laboratorio para el aislamiento e identificación de N. gonorrhoeae.

1.2.2.3 Procedimiento para detección de cepas de N. gonorrhoeae productoras de betalactamasa.

1.2.2.4 Envío de muestras al Laboratorio de Referencia Nacional.

1.2.2.5 Control de calidad y registros necesarios para su control.

1.3 RESPONSABILIDADES

1.3.1 El Centro Nacional de Salud Pública (CNSP), a través de su Dirección Ejecutiva de Laboratorios de Refe-

rencia, es responsable de autorizar la elaboración, revisión y actualización del presente manual, de acuer-

do a los procedimientos aprobados por el Instituto Nacional de Salud (INS).

1.3.2 Los directores de los establecimientos de salud orientados al control de las infecciones de transmisión

sexual (ITS), son responsables de autorizar, proporcionar los recursos necesarios y designar al personal

para la aplicación de las disposiciones contenidas en el presente manual.

1.3.3 El analista, técnico de laboratorio o profesional de salud a cargo de realizar las pruebas de laboratorio, son

responsables de aplicar las disposiciones establecidas en éste manual.

1.3.4 El resultado de la prueba es responsabilidad del analista, jefe de laboratorio.

1.3.5 La detección del incumplimiento de las disposiciones establecidas, amerita que el jefe de división (o depar-

tamento) recomiende, a través de la Dirección Ejecutiva, las medidas correctivas y ésta a su vez informe al

Director General sobre las medidas adoptadas.


Instituto Nacional de Salud2MPR - CNSP - 008

1.3.6 El analista dispondrá de un cuaderno de registro, donde anotará los resultados obtenidos de las pruebasrealizadas. El jefe del laboratorio supervisará que el libro de registro esté actualizado.

1.3.7 Es responsabilidad del analista, jefe de laboratorio y jefe de división (o departamento) que los medios decultivos, colorantes, soluciones y reactivos que se utilizan en las pruebas, sean de buena calidad.

1.3.8 El personal de laboratorio, responsable de la preparación de los medios de cultivo, colorantes, solucionesy buffers, puede proponer por escrito ante su jefe inmediato medidas que permitan mejorar el procedimien-to. El jefe inmediato dirigirá el documento ante el Director General del CNSP, quien elevará la propuestamediante documento dirigido al Jefe del INS. Este último presentará la propuesta ante el Comité TécnicoEspecial para que la evalúe y emita su opinión.

1.4 DOCUMENTOS DE REFERENCIA

1.4.1 Instituto Nacional de Salud. Manual de Normas de Bioseguridad Lima: INS; 1996. Serie de NormasTécnicas N° 18.1996.

1.4.2 Instituto Nacional de Salud. Manual de Procedimientos para la Obtención y Envío de Muestras (I). Lima:INS; 1997. Serie de Normas Técnicas Nº 15.1997.

1.4.3 Dillon JR, Li H. WHO/PAHO Co-ordinating Center for Gonococcal Antimicrobial Surveillance Programs inthe Américas and the Caribbean. Ottawa - Canadá. In: A Laboratory Course Manual : Identification andAntimicrobial Susceptibility Testing of Neisseria gonorrhoeae. 3er ed. Ottawa : WHO/PAHO; 1996.

1.4.4 Ehret JM, Judson FN, Biddle JW. Gonorrhea. In: Wentworth B, Judson N, Biddle JW. Laboratory Meth-ods for the Diagnosis of Sexually Transmitted diseases. American Public Health Association. USA; 1984.p. 43–79.

1.4.5 Kellogg JA, Orwig LK. Comparison of gono gen, gono gen II and micro trak direct fluorescent antibodytest with carbohidrate fermentation for confirmation of culture isolates of Neisseria gonorrhoeae. J ClinMicrobiol 1995; 33(2): 474-6.

1.4.6 Morello JA, Janda WM, Bohnhoff M. Neisseria and Branhamell. In: Lennette HE. Manual of ClinicalMicrobiology. 4ta. ed. USA: Am Soc F Mic; 1985. p. 176-92.

1.4.7 Luger A. Neisseria gonorrhoeae: resistencia a múltiples antibióticos. Bol Epidemiol 1982; 3(7).

1.4.8 Organización Mundial de la Salud. Neisseria gonorrhoeae e infecciones gonocócicas. Ginebra: OMS;Informe de un Grupo Científico de la OMS.1978.

1.4.9 Organización Panamericana de la Salud. Enfermedades de Transmisión Sexual. Bol Epidemiol 1981; 2(1).

1.4.10 Potter LD, Lewis JS, Wentworth B, Larsen H. Ammonium bicarbonate as a replacement for carbon dioxidein transgrow botheles for primary isolation of Neisseria gonorrhoeae. J Clin Microbiol 1983; 18: 1258-9.

1.4.11 Sonnenwirth A, Leonard J. Métodos y diagnóstico de laboratorio clínico. 8va ed. Buenos Aires: EditorialMédico Panamericano; 1969.

1.4.12 Thayer JD, Martin JE. A Selective medium for the cultivation of Neisseria gonorrhoeae and N. meningitidis.

Public Health Reports 1964; 79(1): 49-57.



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1.4.13 Neylan V, Genus I. Neisseria Trevisan1885, 105AL. In: Krieg NR. Bergey’s manual of systematic bacteriology.Vol 1. Baltimore-London; 1984.p. 290-6.

1.4.14 Weyant RS, Weaver RE, Hollis DG, Jordans JG, Cook EC, Daneshvar DI. Identification of UnusualPathogenic Gram-Negative Aerobic and Facultatively Control Bacteria. 2nd. USA : CDC; 1995.

1.5 DEFINICIONES

1.5.1 ACH: Agar chocolate enriquecido.

1.5.2 ATMM: Agar Thayer Martin Modificado.

1.5.3 aislamiento primario: Obtención del agente infeccioso a partir del cultivo de la muestra.

1.5.4 aislamiento del agente infeccioso: Obtención del agente infeccioso en cultivo puro, libre demicroorganismos contaminantes.

1.5.5 bacteria: Microorganismo perteneciente al reino protista.

1.5.6 bacilo: Bacteria que tiene la forma de bastón o cilíndrico.

1.5.7 CDC: Center for Disease Control (Centro de Control de Enfermedades).

1.5.8 CTA: Agar cistina - tripticasa.

1.5.9 cepa bacteriana: Cultivo identificado de acuerdo a la sistemática taxonómica.

1.5.10 colonia bacteriana: Población de bacterias que se desarrollan en la superficie de medios de cultivosólidos que son observables a simple vista.

1.5.11 cultivo bacteriano: Proceso mediante el cual se pretende obtener el desarrollo de bacterias que tenganen común las mismas características.

1.5.12 GASP: Gonococcal Antimicrobial Surveillance Program (Programa de Vigilancia de la SusceptibilidadAntimicrobiana in vitro del gonococo para las Américas y el Caribe) - Canadá.

1.5.13 Glu : Glucosa.

1.5.14 identificación: Procedimiento mediante el cual se identifica a un organismo, siguiendo las pautas reco-mendadas por la sistemática de identificación.

1.5.15 identificación presuntiva: Identificación previa a confirmación. Por lo regular, se llega a identificar hastael género.

1.5.16 identificación confirmatoria: Prueba complementaria a la identificación presuntiva. Por lo general sellega hasta especie y en ciertos casos, hasta subespecie, biotipo, serotipo, etc.

1.5.17 LCR: Líquido cefaloraquídeo.



1.5.18 Lac: Lactosa.

1.5.19 Mal: Maltosa.

1.5.20 medio de cultivo artificial: Medio de cultivo preparado en el laboratorio para el sembrado de muestras

con la finalidad de aislar al microorganismo patógeno.

1.5.21 medio de cultivo selectivo: Medio de cultivo en el que se desarrolla la bacteria de interés. Las bacterias

cuyo desarrollo no es deseado, tendrán desarrollo parcial o serán totalmente inhibidas.

1.5.22 medio de cultivo no selectivo: Medio de cultivo en el que se desarrollan los microorganismos presentes

en la muestra.

1.5.23 Sac: Sacarosa.



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SECCIÓN 2

MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD

2.1 RESPONSABILIDADES

El personal responsable de la obtención, el transporte y el procesamiento de las pruebas de diagnóstico delaboratorio de N. gonorrhoeae deben poner en práctica las medidas de bioseguridad establecidas en elManual de Normas de Bioseguridad (Serie de Normas Técnicas N° 18) editado por el Instituto Nacional deSalud (INS).

2.2 AGENTE

2.2.1 Es sensible a los desinfectantes como hipoclorito de sodio al 1%, etanol al 70%, glutaraldehído, yodo yformaldehído.

2.2.2 Es sensible al calor húmedo a presión (121°C por 15 minutos) y al calor seco (160°C-170°C por una hora).

2.2.3 Se ha reportado que puede sobrevivir hasta 48 horas en vidrio, papel hasta 3 días, plástico por 24 horas yasientos de baño por varias horas.

2.2.4 Debido a la producción de betalactamasas de origen plasmídico y/o cromosomal, se ha incrementado elnúmero de cepas resistentes a penicilina.

2.3 RIESGOS EN EL LABORATORIO

2.3.1 Infecciones adquiridas en el laboratorio: Se han reportado 4 casos en Estados Unidos.

2.3.2 Muestras en las que puede estar presente: exudados de conjuntiva, uretra o cervix uterino, líquido sinovial,orina, heces y líquido cefaloraquídeo.

2.3.3 Riesgos primarios: inoculación parenteral accidental, contacto directo o indirecto de las membranas mucosascon material clínico infeccioso, etc.

2.4 PRECAUCIONES

2.4.1 Contención: Nivel 2 de bioseguridad para toda actividad que envuelva material clínico y cultivos.

2.4.2 Ropa de protección: Usar mandil de laboratorio y guantes cuando haya posibilidad de contacto de la pielcon el material infeccioso.

2.5 MANEJO DEL AGENTE

2.5.1 Derrames: Usando ropa protectora, dejar que los aerosoles se depositen, colocar papel toalla sobre elderrame y añadir hipoclorito de sodio al 1%, empezando desde el perímetro hacia el centro. Dejar 30minutos para permitir un contacto adecuado antes de limpiar.

2.5.2 Todo material usado debe ser descontaminado, utilizando calor húmedo, desinfección química o incineración.

2.5.3 La manipulación de los cultivos debe hacerse en condiciones estrictamente de esterilidad con la finalidadde no contaminar con microorganismos que se encuentran en el ambiente, en el manipulador o que lamanipulación sea cruzada entre los cultivos.



SECCIÓN 3

OBTENCIÓN DE LA MUESTRA

La eficacia del diagnóstico de laboratorio de las ITS, así como también de otras infecciones, depende en gran parte

de una adecuada obtención de la muestra. El aislamiento de N. gonorrhoeae mediante el cultivo permitirá un diag-

nóstico acertado y oportuno.

Las muestras deberán obtenerse antes que el paciente inicie el tratamiento con antimicrobianos. Para cada zona de

muestreo (uretra, cervix, nasofaringe, ocultar, etc.) se aplicará un procedimiento específico, debiendo recolectarse

la muestra, preferentemente con hisopos de baja toxicidad como dacrón o alginato de calcio. Si se utilizan los

hisopos de algodón, debe sembrarse inmediatamente en el medio de cultivo.

3.1. CONDICIONES GENERALES PARA LA OBTENCIÓN DE LA MUESTRA

3.1.1. El paciente debe ser informado en forma clara y sencilla, de acuerdo a su grado de instrucción, sobre los

procedimientos a realizar.

3.1.2. Elegir el lugar correcto a partir del cual se obtendrá la muestra empleando la técnica apropiada. Debe

obtenerse la muestra del sitio de infección en condiciones de asepsia para asegurar la no-contaminación

de la muestra por microorganismos de la flora normal.

3.1.3. Obtener suficiente cantidad de muestra para asegurar el aislamiento del microorganismo relacionado con

el proceso infeccioso en estudio y evitar resultados falsos negativos.

3.1.4. Obtener la muestra antes del inicio de la terapia antimicrobiana. Si el paciente ya ha recibido alguna dosis

del antimicrobiano antes de la obtención de la muestra, el laboratorio debe ser informado.

3.1.5. Enviar las muestras al laboratorio para su procesamiento inmediatamente después de haber sido obteni-

das, con la finalidad de aumentar la probabilidad del aislamiento de los microorganismos involucrados en

el proceso infeccioso.

3.1.6. Colocar las muestras en un recipiente secundario apropiado para el transporte hacia el laboratorio, evitan-

do de esa manera el derrame de la muestra y los riesgos que podría ocasionar.

3.2. REGISTRO DE DATOS

3.2.1. El laboratorio debe contar con un cuaderno de registro donde se anotarán los datos del paciente, así como

también las pruebas realizadas en el laboratorio (Anexo A). Hoy en día existen programas de computación

donde estos datos se registran y se evalúan con rapidez y eficacia.

3.3. MATERIALES Y EQUIPOS

3.3.1. Hisopos de dacrón o algodón

3.3.2. Asa bacteriológica

3.3.3. Láminas porta-objetos



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3.3.4. Mechero de alcohol

3.3.5. Espéculos estériles

3.3.6. Gasa estéril

3.3.7. Algodón quirúrgico

3.3.8. Solución salina fisológica estéril

3.3.9. Pinza Metzembaum

3.3.10. Agua hervida fría

3.3.11. Guantes

3.3.12. Mascarillas

3.3.13. Bandejas metálicas

3.3.14. Autoclave eléctrico

3.3.15. Horno eléctrico

3.4. HISOPADO DE URETRA MASCULINA

3.4.1. La muestra se puede obtener directamente de la uretra o de un exudado obtenido exprimiendo la uretra,siguiendo los pasos que a continuación se detallan:

3.4.1.1 El paciente no debe miccionar 2 horas antes de la obtención dela muestra.

3.4.1.2 Si hubiese abundante secreción, limpiar externamente con unagasa estéril.

3.4.1.3 Exprimir la uretra peneana.

3.4.1.4 Obtener la muestra con hisopo de alginato de calcio o de dacrón,a 1-2 cm del meato uretral.

3.4.1.5 Si hay secreción abundante colocar la secreción directamentesobre el hisopo. Rotar el hisopo durante 20 segundos en la ure-tra (Figura N° 1).

3.4.1.6 Sembrar el hisopado en placa con medio de cultivo (ThayerMartín y/o Agar Chocolate enriquecido) e incubar a 35°C-37°C,en condiciones de humedad y anhidrido carbónico.

3.4.1.7 Con otro hisopo, obtener nuevamente la muestra y extenderla suavemente sobre una lámina porta-objeto

limpia y desengrasada, para realizar la coloración de Gram.

Figura N° 1. Hisopado de uretra masculina



3.5. HISOPADO CERVICO-VAGINAL

3.5.1. Colocar el espéculo estéril en el canal vaginal. Si es necesario lubricarlo con agua destilada estéril, nunca

con otro tipo de lubricante que pueden ser letales para los

gonococos. Si el himen estuviese intacto, la muestra se obten-

drá directamente del orificio vaginal.

3.5.2. Si hubiese abundante secreción vaginal, limpiar la región del

exocervix con una gasa.

3.5.3. Obtener la muestra con hisopo de algodón, alginato de calcio o

de dacrón, a 1-2 cm directamente del canal cervical (Figura N° 2).

3.5.4. Rotar el hisopo durante 20 segundos en el canal cervical en sen-

tido horario.

3.5.5. Sembrar el hisopado en placa con medio de cultivo (Thayer Martin

y/o agar chocolate enriquecido) e incubar a 35°C - 37°C, en con-

diciones de humedad y anhídrido carbónico.

3.5.6. Con otro hisopo, obtener nuevamente la muestra y extenderla suavemente sobre una lámina porta objetolimpia y desengrasada, para realizar la coloración de Gram.

3.6. HISOPADO RECTAL

3.6.1. La muestra del ano se puede tomar directamente o con ayuda de un espéculo (anoscopio).

3.6.2. Si hubiese secreción rectal (heces o sangrado), limpiar con una gasa.

3.6.3. Obtener la muestra con hisopo de dacrón, introduciendo 2-3 cmen el recto (Figura N° 3).

3.6.4. Rotar el hisopo durante 20 segundos en las paredes del recto, ensentido horario (si se observase abundante contaminación fecalen el hisopo, descartarlo y obtener una segunda o tercera muestra).

3.6.5. Sembrar el hisopado en placa con medio de cultivo (Thayer-Martiny/o agar chocolate enriquecido) e incubar a 35°C-37°C, en con-diciones de humedad y anhídrido carbónico.

3.6.6. Con otro hisopo, obtener nuevamente la muestra y extenderla suavemente sobre una lámina porta-objetolimpia y desengrasada, para realizar la coloración de Gram.

3.7. HISOPADO FARÍNGEO

3.7.1. Las muestras de faringe se toman directamente de las criptas amigdaliana.

3.7.2. Obtener la muestra con un hisopo de algodón o de dacrón, introduciendo el hisopo hasta las criptas

amigdalianas. Evitar que el hisopo choque con la lengua o el paladar, sujetando con un bajalengua.

Figura N° 2. Hisopado cervico-vaginal.

Figura N° 3. Hisopado rectal.



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3.7.3. Rotar el hisopo durante 20 segundos en sentido contrario.

3.7.4. Sembrar la muestra en la placa con el medio de cultivo (Thayer-Martin y/o agar chocolate enriquecido) e

incubar a 35°C - 37°C, en condiciones de humedad y anhídrido carbónico.

7.5. Con otro hisopo, obtener nuevamente la muestra y extenderla suavemente sobre una lámina porta-objeto


3.8. HISOPADO DE CONJUNTIVA

3.8.1. Las muestras de conjuntiva se obtendrán de siguiente manera:

3.8.1.1 Limpiar la zona adyacente al ojo con gasa humedecida con solución salina fisiológica estéril. Obtener

suavemente la muestra de la secreción conjuntival.

3.8.1.2 Sembrar el hisopado sobre los medios de cultivo (Thayer-Martin y/o agar chocolate enriquecido) e incubar

a 35°C - 37°C, en condiciones de humedad y anhídrido carbónico.

3.8.1.3 Con otro hisopo, obtener nuevamente la muestra y extenderla suavemente sobre una lámina porta objeto


3.9 OTRAS LOCALIZACIONES

Si se sospecha de infección gonocócica diseminada, se obtendrán muestras urogenital, faríngea y rectal,

así como muestras de sangre y fluído articular, pues la combinación de todas ellas presenta una alta

sensibilidad. En caso de pacientes con enfermedad pélvica inflamatoria, se obtendrán las muestras por

laparoscopía.



SECCIÓN 4

TRANSPORTE DE LA MUESTRA

4.1 OBJETIVO

Describir el procedimiento y condiciones para el transporte de las muestras desde el lugar de su obtenciónhacia el laboratorio donde se realizará el análisis. También se describe el procedimiento de envío deaislamientos o cultivos desde el laboratorio donde se realizó el aislamiento del microorganismo hacia elLaboratorio de Referencia Nacional, donde se realizará la identificación confirmatoria y otros estudios demayor complejidad.

4.2 CONDICIONES ESPECÍFICAS

4.2.1 Las muestras (hisopados clínicos, biopsias, etc.) deben llegar al laboratorio en buenas condiciones, de talmanera que el gonococo se mantenga viable y pueda ser aislado.

4.2.2 Si se trata de un aislamiento sospechoso de ser gonococo y es enviado al Laboratorio Referencial para elrespectivo diagnóstico confirmatorio, el remitente debe asegurarse que el cultivo esté viable y libre de

contaminantes, porque la presencia de éstos en el medio de transporte puede ocasionar la no viabilidad dela bacteria.

4.3 CONDICIONES GENERALES

4.3.1 Las muestras o cultivos sospechosos deben ser transportados en medios adecuados, dependiendo deltiempo que demorará para llegar a su destino. Estos se clasifican en:

4.3.1.1 Medios no Nutritivos, como el Amies con carbón, el cual es adecuado cuando la muestra va a llegar allaboratorio dentro de las seis horas de su obtención. El tiempo es muy importante para las muestrasprocedentes de portadores asintomáticos o de pacientes tratados con antimicrobianos, las que podríanpresentar escasos gonococos viables.

a. Procedimiento:

- Depositar la muestra junto con el hisopo (utilizar hisopo sintético).

- Introducir el hisopo al tubo, previamente rotulado, que contiene elmedio de transporte.

- Romper el mango sobrante y cerrar bien la tapa del tubo del hisopo.

4.3.1.2 Medios Nutritivos o de Crecimiento, tal como el Transgrow o Placas JEMBEC o en medio decrioconservación, cuando las muestras no van a ser sembradas dentro de las seis horas. El tiempo óptimode transporte en éstos medios es de 24 a 28 horas.

a. Procedimiento

- Sembrar la muestra sobre la superficie del medio de cultivo haciendo estrías.

- Hacer una incubación previa antes del transporte, a 35°C-37°C durante 18-24 horas.

Figura N° 4. Medio de transporte.



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- Llegado al laboratorio, los cultivos serán incubados en ambiente sin CO2 a 35°C-37°C durante 24-48

horas. Es recomendable, simultáneamente, hacer sub-cultivos de la muestra en agar chocolate enriquecido.

4.4 CONSIDERACIONES PARA EL TRANSPORTE DE LA MUESTRA (AISLAMIENTOS)

4.4.1 Embalaje, rotulado y transporte de las muestras

4.4.1.1 Asegurar que las muestras antes del embalaje hayan recibido el tratamiento de acuerdo al tipo de mues-

tras, Ejm. : proceso de secado, adición de agentes de estabilización u otros.

4.4.1.2 Las muestras deben ser embaladas apropiadamente, de acuerdo a las especificaciones técnicas corres-

pondientes a cada tipo de recipiente primario: láminas de vidrio, placas, frascos, viales u otros recipientes.

Rotular individualmente cada recipiente primario, utilizando etiquetas, rótulos o fichas.

4.4.1.3 Adicionar la Ficha de datos para el transporte de aislamientos (Anexo B).

4.4.1.4 Embalar los recipientes primarios utilizando un recipiente secundario que asegure la conservación de la

muestra durante el transporte y el almacenamiento hasta llegar a su destino. Se deben evitar riesgos de

golpes accidentales, vibraciones u acción nociva de agentes contaminantes, gases, vapores y líquidos, así

como de la exposición a la interperie y la humedad.

4.4.1.5 Rotular el recipiente secundario, indicando los datos correspondientes al establecimiento de salud o labo-

ratorio de destino, incluyendo la siguiente información:

a. Nombre y dirección del destinatario.

b. Nombre y dirección del remitente.

c. Nivel de bioseguridad.

d. Instrucciones para la conservación durante el transporte y almacenamiento. Temperatura en °C y hume-

dad relativa en %, en caso sean requeridas.

e. Instrucciones sobre el tiempo de vida útil en caso sean requeridas.

f. Instrucciones para posición (etiqueta de orientación), en caso sean requeridas.

g. Instrucciones para manipulación (etiqueta de fragilidad), en caso sean requeridas.

h. Otras instrucciones establecidas en las normas de seguridad para el transporte de sustancias peligrosas.



SECCIÓN 5

PROCEDIMIENTOS PARA EL DIAGNÓSTICO BACTERIOLÓGICO

El agente etiológico de la gonorrea es Neisseria gonorrhoeae, bacteria Gram negativa, que tiene forma de coco a laobservación microscópica, se agrupan generalmente en pares, dando la apariencia de riñones o granos de café, noforma esporas, ni presenta flagelos. Presenta pili y microcápsulas, metabolismo oxidativo e utiliza la glucosa sinproducción de gas. Es una bacteria muy exigente, que desarrolla en medios de cultivos artificiales, con vitaminas,hierro y ciertos aminoácidos. Asimismo, requiere de humedad 50-70%, anhídrido carbónico 7-10% y temperatura35°C-37ºC.

5.1 OBJETIVO

Establecer los procedimientos técnicos para el aislamiento del agente, mediante el cultivo de secrecioneso hisopados de pacientes con sospecha de infección por gonococo.

5.2 MATERIALES Y EQUIPOS

5.2.1 Agar Thayer-Martin modificado (ATMM)

5.2.2 Agar chocolate enriquecido (ACH)

5.2.3 N,N-Dimethyl-1,4 phenylenediamonium HCl o N,N,N.N-tetramethyl-p-phenylenediamine-HCl solución 1 % .

5.2.4 Medios diferencial CTA-carbohidrato (Glu, lac, fru, mal y sac)

5.2.5 Peróxido de hidrógeno 30 %

5.2.6 Placas petri 15 x 100 mm

5.2.7 Tubos de ensayo de vidrio clase A (borosillicato) 10 x 75 mm

5.2.8 Asas de siembra (nicrón, aluminio)

5.2.9 Aguja bacteriológica

5.2.10 Mondadientes estériles

5.2.11 Estufa a 35°C – 37°C

5.2.12 Microscopio compuesto, binocular, con lentes objetivo de 10X, 40X y 100X

5.2.13 Autoclave

5.2.14 Balanza

5.2.15 Jarra de cierre hermético tipo GasPak System

5.2.16 Refrigeradora doméstica 4°C-8°C



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5.2.17 Cabina de flujo laminar clase IIB

5.2.18 Potenciómetro

5.3 EXAMEN DIRECTO DE LA MUESTRA

5.3.1 Campo de aplicación

Se aplica a la obtención de muestra para el diagnóstico de gonorrea mediante el exámen microscópico,

utilizando la coloración de Gram (Anexo C).

5.3.2 Procedimiento para el frotis de la muestra

5.3.2.1 De las muestras obtenidas con asa bacteriológica o hisopo,

preparar dos frotices tan finos como sean posibles y que

abarquen una buena extensión en la lámina porta-objeto (lim-

pia, desengrasada, no rayada). Para evitar alteraciones de

la morfología celular, no debe frotarse vigorosamente (Figu-

ra N° 5).

5.3.2.2 Cuando la muestra se obtiene por hisopado, ésta se debe rotar

suavemente sobre la superficie de la lámina porta-objetos (Fi-

gura N° 6).

5.3.2.3 Deje secar la muestra a temperatura ambiente o a calor sua-

ve, para luego realizar la coloración de Gram.

5.3.3 Coloración de Gram (modificado por Hucker) (Figura N° 7).

5.3.3.1 Cubrir el frotis con cristal violeta durante un minuto.

5.3.3.2 Lavar con agua corriente.

5.3.3.3 Aplique la solución de lugol para Gram durante dos minutos.


5.3.3.5 Decolore con alcohol-acetona (1:1).


5.3.3.7 Cubra el frotis con safranina durante 20 a 30 segundos.


5.3.3.9 Deje secar la lámina al aire o suavemente con papel absorbente.

5.3.3.10 Observar la lámina al microscopio con lente objetivo de inmersión.

Figura N… 5. Extensi n de la muestrausando hisopo.

Figura N… 7. Coloraci n de Gram.

Figura N… 6. Frotis de la muestrausando hisopo.



5.3.4 Interpretación del resultado del examen directo

5.3.4.1 Positivo : Si se observa la presencia de diplococos intracelulares Gram negativos típicos (ovales, de

formas arriñonadas agrupados en pares) (Figura N° 8).

5.3.4.2 Sospechoso : Si sólo se observan diplococos Gram negativos extracelulares

5.3.4.3 Negativo : Si no se observan diplococos Gram negativos

5.3.4.4 En términos generales, el informe del examen directo (colora-

ción de Gram), debe indicar además la presencia y cantidad

de leucocitos polimorfonucleares. Este dato es muy importan-

te para el clínico, ya que puede indicar estar frente a un caso

de infección no gonocócica.

5.3.4.5 La coloración de Gram es de gran valor para el diagnóstico de

gonorrea aguda en varones (tiene una sensibilidad y especifi-

cidad de 99,0%), mientras que en la mujer es considerable-

mente menor (especificidad de 45,0% a 55,0%) debido a la

presencia de flora bacteriana nativa, siendo necesaria la rea-

lización del cultivo.

5.3.5 Control de calidad de la coloración de Gram

5.3.5.1 Es importante que el laboratorio controle periódicamente los componentes que conforman la batería de la

coloración de Gram con la finalidad de garantizar un resultado efectivo. Para ello, debe contar con bacte-

rias de referencia: Gram positivas (Staphylocococcus epidermidis) y Gram negativas (Escherichia coli).

5.4 CULTIVOS

5.4.1 Objetivo

Describir los procedimientos técnicos para realizar el aislamiento del gonococo a partir de hisopados clíni-

cos, secreciones, LCR, biopsias o cualquier otro tipo de muestra corporal. Mediante el cultivo se puede

lograr la identificación presuntiva y/o confirmatoria del gonococo, así como también realizar estudios espe-

ciales, tales como susceptibilidad antimicrobiana, tipificación molecular, etc.

5.4.2 Condiciones específicas

Los cultivos de secreciones para el aislamiento primario deben ser colocados lo más antes posible en

condiciones de CO2, humedad y temperatura adecuada. Mientras se van recolectando las muestras, las

placas que ya han sido sembradas pueden mantenerse dentro de una jarra hermética que contenga CO2.

No deben permanecer por más de 4 horas sin incubación.

5.4.3 Procedimiento

5.4.3.1 Inocular el hisopado de la muestra en una placa conteniendo agar chocolate y luego en medio ATMM,

haciendo girar el hisopo sobre el medio, más o menos la cuarta parte del borde superior.

Figura N… 8. Observaci n de diplodocusintracelulares Gram negativos.



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5.4.3.2 Con ayuda de una asa bacteriológica, diseminar la muestra por todo el medio, por estriamiento. La siem-

bra en agar chocolate debe ser más estricta que en el medio de cultivo Thayer-Martin.

5.4.3.3 Incubar las placas sembradas, casi de inmediato, a 35°C-37°C en un ambiente que contenga 3 a 7% de

CO2 y 50-70% de humedad. Esto se logra colocando las placas dentro de una jarra de cierre hermético o

tipo GasPak sobre una base de gasa humedecida con agua destilada estéril y, encima de éstas, se coloca

una vela blanca encendida. Antes de incubarlas, asegurarse que la vela se haya apagado, de esta manera

el ambiente interno de la jarra tendrá las condiciones adecuadas que necesita el gonococo para su desa-

rrollo. La vela apagada indica que la cámara ha cerrado herméticamente.

5.4.3.4 Examinar los cultivos cada 18-24 horas y descartar positividad después de las 72 horas de incubación.

5.4.4 Interpretación del cultivo

Las colonias primarias de N. gonorrhoeae que desarrollen en medio

Thayer-Martin y/o agar chocolate enriquecido, después de 18-24

horas. de incubación, tienen un tamaño de 1-2 mm. de diámetro,

son ligeramente levantadas, lobulares, traslúcidas y, generalmente,

mucoides (Figura N° 9).

5.5 IDENTIFICACION PRESUNTIVA

5.5.1 Objetivo

Describir los procedimientos técnicos para el diagnóstico presuntivo de la infección causado por el gonococo. Si

el laboratorio no cuenta con los medios necesarios para la confirmación diagnóstica, debe remitir su aislamiento

al Laboratorio de Referencia.

5.5.2 Condiciones generales

La identificación presuntiva de las colonias sospechosas que desarrollan en medio selectivo ATMM y/o en

agar chocolate, se realiza según los siguientes criterios:

5.5.2.1 Reacción oxidasa positiva y catalasa positiva.

5.5.2.2 Presencia de diplococos Gram negativos con morfología típica.

5.5.2.3 Reacción positiva al superoxol (Prueba de catalasa usando peróxido de hidrógeno 30%).

5.5.2.4 Desarrollo en agar Thayer-Martin y no desarrollo en agar tripticasa soya (TSA).

5.5.3 Prueba para detectar oxidasa

5.5.3.1 Se realiza con el reactivo N,N,N,N-tetrametil-p-fenilenediamina HCl o con N,N-dimetil-1,4-fenilenediamonio

HCl, solución 1%, con el cual se humedece un pedazo de papel filtro estéril dentro de una placa petri. Para

la diseminación de la muestra sobre el papel con el reactivo, se utiliza una asa de platino o aluminio (el

nicrón u otras asas que contengan fierro pueden causar reacción falsa positiva) o un mondadientes estéril.

Figura N… 9. Colonias de N. gonorrhoeaeen medio de cultivo.



5.5.3.2 Si el resultado es positivo usando el tetrametil, se observará una man-

cha azul - violeta, y con el reactivo dimethyl el color será rojo - grosella.

Si el resultado es negativo, no se observará color (Figura N° 10).

5.5.3.3 El reactivo dimetil tiene mayor estabilidad. Ambos son carcinogénicos,

por lo que se recomienda evitar el contacto con la piel.

5.5.3.4 Procedimiento

a. Colocar un pedazo de papel filtro estéril dentro de una placa petri.

b. Humedecer el papel con el reactivo de oxidasa.

c. Extraer algunas colonias (1-3) del cultivo en estudio.

d. Con ayuda de una asa de platino o aluminio o un mondadientes estéril, colocar y extender el inóculo sobre

el papel humedecido con el reactivo.

e. Observar si se produce reacción en el transcurso de 10 a 15 segundos de haberse realizado la prueba.

f. Alternativamente, una solución del reactivo al 0,5% puede ser goteada directamente sobre la colonia.

5.5.3.5 Control de calidad de la prueba para detectar oxidasa

Pseudomonas sp es oxidasa positiva y Escherichia coli es oxidasa negativa.

5.5.4 Prueba para detectar catalasa

5.5.4.1 Esta prueba se realiza con el reactivo peróxido de

hidrógeno 30%.

5.5.4.2 La prueba será positiva si inmediatamente se evi-

dencia la presencia de burbujas y será negativa si

no se forman burbujas o éstas aparecen muy len-

tamente (Figura N° 11).

5.5.4.3 Procedimiento:

a. Colocar algunas colonias del cultivo en estudio sobre una lámina porta-objetos limpia con ayuda del asa

de siembra.

b. Añadir sobre el inóculo una gota del reactivo peróxido de hidrógeno (H2O

2).

c. Observar inmediatamente la reacción.

5.5.4.4 Control de calidad de la prueba para detectar catalasa

Aeromonas sp es catalasa positiva.

Figura N… 10. Prueba paradetectar oxidasa.

Figura N… 11. Prueba para detectar catalasa.



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5.5.5 Interpretación de la identificación presuntiva

5.5.5.1 En la coloración de Gram del cultivo sospechoso deberán observarse diplococos Gram negativos de forma

arriñonada y dar reacción positiva a las pruebas de oxidasa y catalasa.

5.5.5.2 El cultivo sospechoso deberá desarrollarse en el medio de cultivo Thayer-Martin y no en agar nutritivo o

tripticasa de soya.

5.6 IDENTIFICACIÓN CONFIRMATORIA DE Neisseria gonorrhoeae (Anexos D y E)

Realizada la identificación presuntiva de N. gonorrhoeae, si el laboratorio cuenta con los insumos necesa-

rios para realizar la confirmación, lo hará aplicando las tecnologías recomendadas por los Laboratorios

Referenciales. Existen diversas pruebas de laboratorio para la confirmación del diagnóstico bacteriológico

del gonococo, entre ellas citamos: bioquímica, serología con anticuerpo monoclonal, hibridación y amplifi-

cación del ADN, entre otras.

En el presente manual se describen las pruebas de diagnóstico confirmatorio que se utilizan en nuestro

laboratorio (Laboratorio de Referencia Nacional). Así tenemos:

Prueba convencional- Prueba bioquímica de utilización de carbohidratos en base CTA.

Pruebas rápidas usando kits diagnósticos- Quad Ferm System (BioMérieux Vitek): Tiempo de incubación de 2 horas.

- NEISSERIA 4 H (Pasteur): Tiempo de incubación de 4 horas.

- GonoGen I (BBL).

- GonoGen II (BBL).

5.6.1 Utilización de carbohidratos en base CTA

5.6.1.1 Prueba convencional ampliamente utilizada por los países en desarrollo, no es muy costosa pero requiere

de un buen inóculo y de mayor tiempo de incubación (de 18 a 72 horas), en comparación con las pruebas

rápidas que sólo requieren de 2 a 4 horas, dependiendo del kit empleado.

5.6.1.2 Condiciones Específicas

Esta prueba debe realizarse con cultivo joven de 18-24 horas, procedente de sub cultivo en agar chocolate

con suplemento enriquecedor.


a. Inocular la bacteria en estudio en tubos de 13x100 mm que contienen el medio diferencial CTA-Carbohidrato.

Depositar un buen inóculo.

b. Inocular por picadura en el tercio superior del citado medio diferencial y luego diseminar por estriación

sobre la superficie inclinada (pico de flauta).

c. Incubar a 37°C sin CO2 durante 18-72 horas. Frecuentemente, resulta suficiente 18-24 horas.



d. Examinar e interpretar: Es positiva, cuando el medio ha cambiado del color rojo inicial hacia el amarillo

claro o pálido en el área del inóculo. Si el color amarillo se extiende por todo el medio diferencial, podría

tratarse de bacterias contaminantes. En estos casos se debe hacer

una coloración de Gram y repetir la prueba, previa descontaminación,

en medio selectivo ATMM (Figura N° 12).

5.6.1.4 Fundamento de la prueba

a. La prueba consiste en determinar la capacidad de la bacteria

Figura N… 12. . Utilizaci n de carbohi-drato en base CTA.

sospechosa de ser gonococo de utilizar oxidativamente, uno o

más carbohidratos (glucosa, lactosa, maltosa, y sacarosa),

mientras se va desarrollando.

b. El carbohidrato presente en el medio diferencial se encuentra en un agar base cisteína-tripticasa, el cual

tiene como indicador rojo de fenol, siendo el pH del medio de cultivo 7,1±0,1.

c. N. gonorrhoae sólo utiliza glucosa, produciendo acidificación del medio, sin producción de gas, lo cual se

evidencia por el viraje de color rojo a amarillo.

d. Kellog y Orwing determinaron que esta prueba tiene una sensibilidad de 97,6% y una especificidad de

100,0%.

5.6.2 Kit Quad Fermes System


Este kit es una prueba rápida que determina la utilización de determinado sustrato por la bacteria en

estudio. El fundamento de esta técnica se basa en detectar la presencia de enzimas pre formadas para los

sustratos presentes en el kit.


a. Hacer una suspensión densa en 2 mL de solución salina fisiológica estéril, McFarland Nº 3, del cultivo

sospechoso a gonococo.

b. Repartir 200 microlitros (0,2 mL) de la suspensión bacteriana a cada pocillo del kit, cuidando de no contaminar

su contenido.

c. Con ayuda de una micropipeta, homogenizar cada uno de los pocillos inoculados.

d. Incubar a 37°C sin CO2 en cámara húmeda durante 2 horas. Antes de las dos horas puede haber reacción.

e. Leer e interpretar el cambio de color de cada pocillo. Un cambio de rojo a amarillo indica que la bacteria en

estudio ha acidificado el medio, al actuar sobre un determinado sustrato: glucosa, maltosa, lactosa, sacarosa,

hidrólisis del ADN e hidrólisis al anillo beta-lactámico.

f. Este kit no solamente identifica a N. gonorrhoeae, sino también a Moraxella (Branamella) catarrhalis.



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5.6.3 Kit Neisseria 4 H


Este kit permite realizar la identificación confirmatoria de la

bacteria, por medio de una prueba bioquímica, que permite

detectar una enzima pre-formada.

5.6.3.2 La microplaca del kit tiene 16 pocillos (2 filas de 8 pocillos),

de los cuales 12 son utilizados para realizar 10 pruebas.

Cada pocillo corresponde a una prueba bioquímica, excepto

el primero que es el control negativo (Figura N° 13)

5.6.3.3 Las pruebas que se realizan son las siguientes:

a. Utilización de azúcares: glucosa, maltosa, fructosa y sacarosa.

b. Detección de beta-galactosidasa (ONPG).

c. Hidrólisis de tributirín (TR).

d. Síntesis de polisacáridos (PS).

e. Detección de gamma-glutamiltransferasa (YGT).

f. Reducción de nitratos (NO3).

g. Reducción de nitritos (NO2).

5.6.3.4 Material adicional requerido

a. Tubo McFarland N° 3 (9,7 ml solución H2SO4 1% + 0,3 mL solución BaCI2 1%)

b. Lugol de Gram

c. Reactivo de Gries

d. Hipoclorito de sodio 5%


a. Hacer una suspensión de la bacteria en estudio, McFarland N° 3 como mínimo, dentro de la ampolla que

contiene un medio de suspensión.

b. Escribir en la parte inferior del Kit la referencia del paciente o de la cepa aislada.

c. Distribuir tres gotas (100 µL) de la suspensión bacteriana a cada uno de los pocillos hasta el pocillo NO2

(1), utilizando una pipeta de transferencia que trae el kit.

Figura N… 13. Kit Neisseria 4H.



d. En el pocillo NO2 (1) homogenizar inmediatamente el contenido para luego transferirlo al pocillo NO2 (2).

e. Colocar la cubierta (tapa) sobre la microtapa e incubar a 37°C por 4 horas

NOTA: Dada la fragilidad que tienen estas bacterias, los pocillos deben ser inoculados en un tiempo no mayor de15 minutos luego de haberse preparado el inóculo.

5.6.3.6 Lectura de los resultados

a. Leer los resultados después de 4 horas, excepto el pocillo denominado “Síntesis de polisacáridos”que requiere de 24 horas de incubación.

b. Sobre la etiqueta de la microplaca, escriba debajo de cada pocillo el resultado positivo (+) o negativo (-),de acuerdo a las indicaciones mostradas en la Tabla N° 1.

c. El desarrollo de reducción de nitratos (NO3) se detecta adicionando sucesivamente 1 gota del reactivo I y1 gota del reactivo II del reactivo de Gries.

d. La identificación de la especie se obtiene correlacionando los datos obtenidos con la Tabla N° 2.

5.6.3.7 Interpretación de resultados

a. Los datos obtenidos de las pruebas bioquímicas, serán comparados con tablas de referencia establecidaspor Organismos Referenciales, tales como OMS, OPS, CDC y GASP.

b. El cultivo en estudio será identificado como N. gonorrhoeae si reúne las siguientes características: diplococoGram negativo, de forma arriñonada, oxidasa positiva, catalasa positiva, desarrolla en medio de cultivoThayer-Martin, no desarrollo en agar nutritivo o TSA, y oxidativamente, solamente utiliza glucosa y no

utiliza lactosa, fructosa, maltosa, ni sacarosa.

Tabla N° 1. Lectura de resultados de la prueba Kit Neisseria 4H.

Prueba Tiempo de RESULTADOIncubación Positivo Negativo

Glucosa 4 horas Amarillo o naranja Rojo o violeta

Maltosa 4 horas Amarillo o naranja Rojo o violeta

Fructuosa 4 horas Amarillo o naranja Rojo o violeta

Sacarosa 4 horas Amarillo o naranja Rojo o violeta

ONPG 4 horas Amarillo Incoloro

Tributrirín 4 horas Amarillo o naranja Rojo o violeta

Síntesis de polisacáridos* 24 horas Violeta o marrón Amarillo

YGT 4 horas Amarillo Incoloro

Reducción de NO3

4 horas Rojo Indoloro

Reducción de NO2

4 horas Amarillo Incolora o gris

* Lectura después de adicionar 1 a 2 gotas de lugol.

ONPG: ß-gactosidasa.

YGT: gamma-glutamiltransferasa.



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5.6.4 Kit Gonogen II


Es una prueba colorimétrica basada en anticuerpos monclonales que detectan las proteínas de la membrana

externa I del gonococo, cultivado ya sea en medio selectivo o en agar chocolate enriquecido (Figura N° 14).

5.6.4.2 Componentes del Kit

a. Reactivo 1: amortiguador solubilizante.

b. Reactivo 2: anticuerpos monoclonales de múrido.

c. Control positivo: N. gonorrhoeae destruido con calor.

d. Control negativo: especies de Neisseria destruidos con calor.

e. Bandeja de análisis: consiste en pocillos con matriz especial y material absorbente.

f. Pipetas de transferencia graduadas.


a. Rotular un tubo de ensayo (12x75 mm) por cada muestra.

Tabla N° 2. Pruebas bioquímicas para la identificación de Neisseria

Hidrólisis de:Glucosa + + + + - + + + + +Maltosa - + + + - + - + + +Fructosa - - - + - - + + - +Sacarosa - - - + - ± + + - -ONPG - - + - - - - - - -Tributirín - - - - + - - - - -YGT - + - ± - - - ± ± ±Reducción de:NO3 - - - + + - - - - -NO2 - (-) (+) + (+) + + + + +Síntesis de polisacáridos (24 horas) - - - + - + + + - -Desarrollo en medio selectivo + + + - - + - - - -Colonia pigmentada - - + ± - + - - ++ ++

± Puede variar de acuerdo a la cepa.( )La mayoría de las cepas presentan esta característica.

Especie

N. g

on

orr

ho

eae

N. l

acta

mic

a

N. m

enin

git

idis

N. m

uco

sa

M. (

B)

cata

rrh

alis

N. p

olis

ach

area

N. d

enit

rifi

can

s

N. s

icca

N. s

ub

flav

a

N. f

lava

Figura N… 14. Kit Gonogen II



b. Agregar a cada tubo 500 µl del reactivo 1.

c. Hacer una suspensión de la bacteria en estudio, utilizando hisopo de algodón/poliester, hasta alcanzarturbidez 1 de la escala Mc. Farland.

d. Desechar el hisopo dentro de un recipiente que contenga solución desinfectante.

e. Agitar vigorosamente el reactivo 2 y añadir una gota en cada uno de los tubos a analizarse.

f. Mezclar bien y permitir que los tubos reposen por lo menos 5 minutos.

g. Con ayuda de una pipeta de transferencia, añadir 2 gotas de cada suspensión a analizarse a cada uno delos pocillos de la bandeja de prueba. Utilizar un pocillo para cada prueba.

h. Finalmente, añadir un gota del reactivo 1 a cada pocillo donde se está procesando.

5.6.4.4 Interpretación de la prueba

a. Punto rosa o rojo en el pocillo de la bandeja de análisis significa que se ha identificado N. gonorrhoeae.

b. Si el punto resulta blanco o pálido, la bacteria en estudio no es N. gonorrhoeae.

5.6.4.5 Control de calidad de la prueba

Para asegurarse que el sistema está funcionando adecuadamente, los controles que traen el kit (control +y control -), deben ser analizados antes que se realice la prueba.



MPR - CNSP - 008

SECCIÓN 6

DETECCIÓN DE CEPAS PRODUCTORAS DE BETA-LACTAMASA

Desde el año 1976 se reporta la presencia de cepas productoras de beta-lactamasa (penicilinasa), así como de

cepas resistentes a otros antibióticos utilizados en el tratamiento de la gonorrea.

La prueba de susceptibilidad antibiótica para el gonococo comúnmente se realiza mediante el método de concentracióninhibitoria mínima (CIM), con el objetivo de realizar vigilancia de resistencia antibiótica y evaluar los esquemas deltratamiento.

6.1 OBJETIVO

Establecer los procedimientos para realizar la detección de la enzima beta-lactamasa en cepasde gonococo.

6.2 CAMPO DE APLICACIÓN

Aplicable a los laboratorios que aislan e identifican al gonococo y que cuentan con recursos necesariospara realizar este diagnóstico. El laboratorio comprometido para realizar esta prueba es el Laboratorio deReferencia Nacional.

6.3 CONDICIONES GENERALES

6.3.1 Haber realizado el aislamiento e identificación de N. gonorrhoeae.

6.3.2 La cepa no debe estar contaminada y debe ser un cultivo joven, de preferencia, de subcultivo en agarchocolate enriquecido.

6.3.3 Las técnicas que comúnmente utilizamos en el Laboratorio de Referencia Nacional son:

6.3.3.1 Método de la cefalosporina cromógena, Cefinase (prueba directa).

6.3.3.2 Método yodométrico rápido (prueba indirecta).

6.4 MÉTODO DE LA CEFALOSPORINA CROMÓGENA, CEFINASE

6.4.1 Fundamento

Consiste en un disco de papel impregnado con cefalosporina cromógena (NITROCEFIN) que cambia deamarillo a rojo cuando el anillo beta-lactámico es hidrolizado por la enzima beta-lactamasa. Esta pruebatiene un amplio espectro de susceptibilidad , es fácil de realizar y no requiere de mucho tiempo.

6.4.2. Procedimiento

6.4.2.1 Con la ayuda de una pinza estéril, coger un disco por prueba a realizar y colocarlo dentro de una placa petrivacía.

6.4.2.2 Humeder el disco con 1 gota de agua destilada estéril.



6.4.2.3 Impregnar varias colonias de N. gonorrhoeae en la superficie del disco humedecido con un asa estéril o un

mondadientes.

6.4.2.4 Observa la reacción durante 1 a 5 minutos.

6.4.3 Interpretación del método

Si la cepa en estudio produce beta-lactamasa, el disco cambiará

de amarillo a rojo (Figura N° 15).

6.5 MÉTODO YODOMÉTRICO RÁPIDO

6.5.1 Fundamento de la prueba

Este método se basa en la reacción del yodo con el almidón vegetal, amilosa, dando un color violeta

oscuro. La enzima beta-lactamasa tiene la capacidad de romper el anillo beta-lactámico de la penicilina u

otros beta-lactámicos produciendo iones altamente reductores, los cuales reducen el yodo, por lo que no

da la reacción característica al actuar con el almidón.

6.5.2 Procedimiento

6.5.2.1 Descongelar los tubos de ensayo que contienen 0,1 mL de solución de penicilina. Considerar un blanco, el

cual no será inoculado con la bacteria en estudio.

6.5.2.2 En la solución de penicilina, preparar una suspensión densa (Mc. Farland N° 3 como mínimo) de un cultivo

de 18-24 horas.

6.5.2.3 Agitar la solución de penicilina durante 30 segundos y dejar reposar por 30 minutos.

6.5.2.4 Añadir 0,05 mL (2 gotas con pipeta Pasteur) de solución almidón a los tubos de prueba.

6.5.2.5 Mezclar bien y añadir 0,02 mL (1 gota con pipeta Pasteur) de

solución yodurada.

6.5.2.6 Agitar la mezcla durante un minuto.

6.5.3 Interpretación del método

Una decoloración rápida indica que la bacteria en estudio pro-

duce beta-lactamasa. Si el color azul se mantiene durante más

de 10 minutos, la bacteria en estudio no produce la mencionada

enzima (Figura N° 16).

6.6 CONTROL DE CALIDAD PARA LA PRUEBA BETA-LACTAMASA

Para tener la seguridad que la prueba es satisfactoria, el laboratorio debe contar con la cepa de referencia

N. gonorrhoeae ATCC 31426, productora de beta-lactamasa. Si no se dispone de la mencionada cepa

control, puede utilizarse Escherichia coli productora de beta-lactamasa.

Figura N… 15 . M todo de la cefalosporinacrom gena.

Figura N… 16 . M todo yodom trico r pido.



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6.7 PREPARACIÓN DE REACTIVOS PARA LA PRUEBA BETA-LACTAMASA

6.7.1 Buffer fosfato pH 6,0

6.7.1.1 Prepare la solución A (fosfato monopotásico 0,06M) : disolver 0,9073 g de KH2PO4 en 100 mL de agua.

6.7.1.2 Prepare la solución B (fosfato sódico 0,06M) : disolver 0,4733 g de la Na2HPO4 o 0,594 g de Na2HPO42H2O

en 50 mL de agua destilada.

6.7.1.3 Mezclar 87,7 ml de la solución A con 12,3 mL de la solución B. Este buffer es estable durante varias

semanas a temperatura ambiente.

6.7.2 Penicilina G sódica o potásica

6.7.2.1 Pesar 0,06 g de penicilina G y disolver en 10 mL de buffer fosfato pH 6,0 (penicilina a 6000 µg/mL).

6.7.2.2 Esterilizar la solución de penicilina haciéndola pasar por un filtro de 45 µm de diámetro de poro antes de

utilizarla.

6.7.2.3 Alicuotar la solución de penicilina, 0,1 ml en tubos 10x75, taparlos herméticamente y guardarlos congelados

a –20°C.

6.7.2.4 Eliminar los tubos que no han sido utilizados después de haberlos descongelado.

6.7.3 Solución de almidón 1%

6.7.3.1 Pesar 0,1 g de almidón soluble para 10 mL de agua destilada y disolverlo completamente en baño de agua

hervida. No debe hervirse.

6.7.3.2 Preparar una solución fresca, la que se conservará en el refrigerador no más de una semana.

6.7.4 Solución de yodo

6.7.4.1 Disolver 0,406 g de yodo y 10,64 g de yoduro de potasio en 20 mL de agua destilada y guardar a temperatura

ambiente en un frasco de vidrio oscuro.

6.7.4.2 Preparar una nueva solución cuando el precipitado sea excesivo, lo que puede suceder al cabo de uno o

varios meses.



SECCIÓN 7

PROCEDIMIENTOS PARA LOS AISLAMIENTOS RECEPCIONADOS EN EL INS

7.1 OBJETIVO

Describir el procedimiento para procesar de los aislamientos sospechosos de ser gonococo, remitidos delos laboratorios referenciales.

7.2 TRANSPORTE DE AISLAMIENTOS PARA LA IDENTIFICACIÓN CONFIRMATORIA

Al remitir sus cultivos al Instituto Nacional de Salud (INS) para la identificación confirmatoria del gonococo,se recomienda proceder de la siguiente manera:

7.2.1. Del cultivo primario de las colonias sospechosa a gonococo, hacer subcultivos en agar chocolate enriquecidocon la finalidad de tener un cultivo puro.

7.2.2. Realizar la coloración de Gram de los subcultivos para tener la seguridad que el cultivo (diplococos gram-negativos), se encuentre libre de microorganismos contaminantes.

7.2.3. Para el transporte, sembrar dos o tres colonias aisladas por estriamiento en placa petri descartableconteniendo agar chocolate enriquecido o en Medio Transgrow modificado en frasco de vidrio tipo penicilina.Estos medios no deben estar deshidratados.

7.2.4. Rotular los frascos y realizar una pre-incubación a 35°C- 37°C durante 18 a 24 horas antes de remitir loscultivos al INS. El tiempo de incubación podría ser menor, siempre y cuando se visualice el desarrollo delas colonias características a gonococo.

7.2.5. Remitir el(los) cultivo(s) dentro de un depósito que los proteja de rupturas durante el transporte, adjuntandosu respectiva ficha de envío de cepas (Anexo B).

7.3. IDENTIFICACIÓN CONFIRMATORIA

7.3.1. Sembrar en agar chocolate enriquecido y en agar Thayer-Martin e incubar las placas y los cultivosrecepcionados en sus respectivos medios de transporte durante 18-24 horas.

7.3.2. Realizar un frotis del cultivo recepcionado y colorear con Gram.

7.3.3. Después de las 18-24 horas de incubación, examinar los subcultivos y cultivos recepcionados.

7.3.4. Si no hubiese desarrollo de colonias típicas en los cultivos recientes, realizar una coloración de Gram,pruebas de oxidasa y catalasa. Si son diplococos Gram-negativos, oxidasa positiva y catalasa positiva,continuar con el procedimiento de identificación previamente descrito en este manual.

7.3.5. Si no hubiese desarrollo de colonias típicas de Neisseria, volver a incubar durante 24-48 horas adicionalesy a la vez volver a sembrar, del cultivo recepcionado que tendría ya 24 horas de incubación, en agarchocolate enriquecido y en Thayer-Martin.

7.3.6. Examinar las placas cada 24 horas hasta las 72 horas. Si no hay desarrollo, el cultivo ha estado no viable.A veces viene el aislamiento contaminado con otros microorganismos, ello dificulta la recuperación de la

bacteria sospechosa de ser gonococo.



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SECCIÓN 8

PROCEDIMIENTOS PARA LA PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

El éxito en el aislamiento del gonococo a partir de hisopados clínicos u otro tipo de muestras biológicas, además de

una buena obtención de la muestra, depende también de la calidad de los medios de cultivos a utilizarse.

Los medios de cultivo que se utilizan tanto en el aislamiento primario del gonococo como en los estudios de

identificación son: Medios de cultivos selectivos (Thayer-Martin, Thayer-Martin modificado, Martin-Lewis, New York

City) y medios de cultivos no selectivos como el agar chocolate enriquecido. El medio selectivo que más

frecuentemente es utilizado para el aislamiento del gonococo a partir de secreciones es el agar Thayer-Martin

modificado.

Los medios de cultivo que se describen en este Manual son los recomendados por la OPS/OMS, CDC y el GASP.

8.1 FUNDAMENTO DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

8.1.1 Tanto el medio de cultivo agar chocolate enriquecido como el agar Thayer-Martin modificado, son medios

que contienen vitaminas, aminoácidos e iones de hierro, favoreciendo el desarrollo del gonococo, bacteria

muy exigente para desarrollar en medios artificiales de laboratorio.

8.1.2 El agar Thayer-Martin Modificado es un medio de cultivo selectivo, es decir, permite el desarrollo del

gonococo e inhibe el desarrollo de bacterias saprofitas que podrían encontrarse en la muestra. El poder

selectivo de este medio se debe a que contiene antibióticos: colistina (inhibe a bacterias Gram negativos),

nistatina (inhibe a Candida), vancomicina (inhibe a Gram positivos) y trimetoprim (inhibe a Proteus).

8.2 OBJETIVO

Describir los procedimientos técnicos para la preparación de los diferentes medios de cultivo de manera

eficiente para el aislamiento, estudio, conservación y transporte del gonococo.


8.3.1 Agar Base GC

8.3.2 Hemoglobina bovina deshidratada

8.3.3 Bacto agar o agar bacteriológico

8.3.4 Suplemento enriquecedor

8.3.5 Inhibidor antimicrobiano VCNT

8.3.6 Agua destilada calibrada a 7,2 ± 0,2

8.3.7 Barra magnética

8.3.8 Refrigeradora doméstica



8.3.9 Estufa eléctrica de 35°C – 37°C

8.3.10 Autoclave eléctrica

8.3.11 Balanza

8.3.12 Mechero de Bunsen

8.3.13 Homogenizador magnético térmico

8.3.14 Potenciómetro

8.3.15 Cabina de flujo laminar clase II-B

8.4 PREPARACIÓN DEL AGAR THAYER MARTIN MODIFICADO

Se mezcla la solución doble concentrada de hemoglobina con el agar base GC doble concentrado, volumena volumen, teniendo cuidado que no se formen burbújas al hacer dicha mezcla. Estas soluciones deberánestar previamente preparadas y esterilizadas.

8.4.1 Solución de hemoglobina 2% (2X)

8.4.1.1 En un matraz de 2 L colocar 10 g de hemoglobina para disolver en 500 ml de agua destilada calibrada,adicionar una barra magnética de 75 mm de longitud y agitar hasta obtener una completa disoluciónutilizando un homogenizador magnético, quedando lista la solución de hemoglobina para ser esterilizadaen el autoclave.

8.4.1.2 Método Alternativo

Colocar la hemoglobina en polvo dentro de un recipiente o un mortero y disolverla en un pequeño volumende agua destilada tibia, ayudándose con un agitador de vidrio o algún instrumento similar. Una vez que sehaya obtenido una mezcla homogénea, adicionar el volumen restante de agua destilada.

8.4.2 Agar base GC 2X

8.4.2.1 En un matraz de 2 L preparar un agar base GC suspendiendo 36 g del medio. Adicionar 10 g de agar paraun volumen de 480 mL de agua destilada calibrada y disolver antes de esterilizar.

8.4.2.2 Esterilizar por separado el agar base GC, pH 7,2 ± 0,2 y la solución de hemoglobina en autoclave a 121°Cpor 15 minutos.

8.4.2.3 Mantener las soluciones estériles en baño María a una temperatura de 50°C-56°C.

8.4.2.4 Reconstituir los inhibidores antimicrobianos con agua destilada estéril y dejar reposar por 20 minutos.

8.4.2.5 Reconstituir el suplemento enriquecedor de acuerdo a las indicaciones del fabricante y agitar para aseguraruna completa disolución.

8.4.2.6 Agregar asépticamente 10 mL de suplemento enriquecedor (Isovitalex BBL 11876, Suplemento B Difco

0276, Suplemento VX Difco 3354 o 30 ml del Suplemento Oxoid SR 105B).



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8.4.2.7 Agregar asépticamente 10 mL del inhibidor antimicrobiano VCNT (Difco 3198-60 o BBL 12408) o 4 mL delantimicrobiano Oxoid.

8.4.2.8 Alternativamente, se puede utilizar el suplemento de crecimiento con antimicrobiano de Oxoid (SR 56D),siguiendo las indicaciones del fabricante.

8.4.2.9 Agregar una solución de hemoglobina al agar base, evitando la formación de burbujas y mezclarsuavemente. El pH final debe ser 7,2 ± 0,2.

8.4.2.10 Repartir en placas petri estériles 18-20 mL del medio en placas de 100 mm de diámetro.

8.4.2.11 Realizar el control de esterilidad del medio de cultivo recientemente preparado.

8.5 PREPARACIÓN DEL AGAR CHOCOLATE ENRIQUECIDO

8.5.1 Composición

Tiene la misma composición del medio de cultivo Thayer-Martin, excepto que no lleva el inhibidorantimicrobiano VCNT.

8.5.2 Preparación

Del mismo modo que para el medio de cultivo Thayer-Martin, pH final 7,2 ± 0,2.

8.5.3 Condiciones óptimas del medio de cultivo

8.5.3.1 Un buen medio de cultivo es aquel cuyo resultado de control de calidad es ACEPTABLE, es decir, es deaspecto homogéneo, superficie lisa, no muestra contaminación por microorganismos ambientales y elgonococo desarrolla satisfactoriamente. El Medio Thayer-Martin Modificado debe tener la capacidad deinhibir total o parcialmente el desarrollo de microorganismo saprofitos.

8.6 PREPARACIÓN DEL MEDIO CTA-CARBOHIDRATO MODIFICADO

8.6.1 Para 50 mL de medio CTA-carbohidrato

8.6.1.1 Suspender 2,47 g CTA más 0,75 g de bacto agar en 40 mL de agua destilada.

8.6.1.2 Ajustar el pH a 7,1 ± 0,1.

8.6.1.3 Esterilizar en autoclave a 120°C durante 15 minutos.

8.6.1.4 Atemperar a 50°C en baño de agua.

8.6.1.5 Adicionar asépticamente 10 mL de solución del carbohidrato al 7,5%, el que previamente debe seresterilizado por filtración (pesar 0,75 g de CH para 10 mL de agua).

8.6.1.6 Mezclar bien el contenido y repartir 2,5 mL en tubos 12 x 75 mm.

8.6.1.7 Dejar solidificar en plano inclinado a temperatura ambiente.



8.6.1.8 Cambiar los tapones de algodón por tapones de jebe estériles.

8.6.1.9 Almacenar a 4°C.

8.7 MEDIOS PARA LA CRIOCONSERVACIÓN DE LAS CEPAS

8.7.1 Utilizar caldo tripticasa soya que no contenga glucosa (Difco o BBL) más glicerol 15%, caldo Mueller

Hinton más glicerol 15%, o caldo BHI más glicerol al 20%, contenidos en viales tapa rosca de polipropileno

de 2 mL de capacidad (criovial), pH 7,2 ± 0,1. Alternativamente, se puede utilizar el medio leche descremada

(Skim milk) 10%.

8.7.2 La crioconservación de cepas bacterianas se realiza haciendo una suspensión bacteriana densa en medio

para crioconservación aproximadamente x109 (Mc. Farland 3-4) e inmediatamente se conserva a –70°C y

se hacen pasajes cada 6 a 12 meses. Si se conserva a -20°C o se congela en una refrigeradora doméstica,

los pasajes se harán cada 2 a 3 semanas.

8.8 MEDIOS DE TRANSPORTE

8.8.1 Medio de transporte Amies Carbón

8.8.1.1 Este medio se basa en la modificación del Medio de Transporte Stuart, incorporando carbón activo al

medio (concentración final 1%) para evitar la necesidad de usar un hisopo impregnado en carbón.

8.8.2.1 Preparación:

a. Suspender los ingredientes en 1000 mL de agua destilada. Calentar hasta hervir, para disolver

completamente.

b. Dispensar el medio caliente hasta 0,5 cm del tope en frasquitos pequeños (de 6 a 8 mL de capacidad) o en

tubos pequeños con tapa rosca.

c. Cerrar herméticamente y autoclavar a 121°C durante 15 minutos. Invertirlos inmediatamente para distribuir

el carbón con uniformidad, antes de que el medio se solidifique.

NOTA : Este medio de transporte se comercializa en forma deshidratada.

8.8.2 Medio Transgrow

8.8.2.1 Este medio de transporte está compuesto por agar Thayer-Martin modificado (ATMM), al que se adiciona

bicarbonato de amonio a una concentración final de 0,1%. Este medio debe estar contenido en un frasco

de cierre hermético, con suficiente superficie de inclinación. Ejemplo: una solución al 10% (esterilizado por

filtración, 0,45 µm de diámetro del poro) se prepara adicionando 1 mL por cada 100 mL de medio de

transporte preparado.

8.9 REGISTROS DE LOS MEDIOS DE CULTIVOS PREPARADOS

8.9.1 El laboratorio debe contar con un cuaderno o folder de registro donde se anotarán los medios de cultivopreparados (Anexo F).



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SECCIÓN 9

CONTROL DE CALIDAD DEL MEDIO DE CULTIVO THAYER MARTIN Y AGAR CHOCOLATE ENRIQUECIDO

El éxito del aislamiento del agente causante de gonorrea, depende de una adecuada preparación del medio decultivo a utilizarse en el aislamiento primario, así como del medio donde se realizan los subcultivos, con el fin deobtener células potencialmente activas para realizar pruebas de identificación y de estudios fisiológicos.

El control de calidad de los medios de cultivos sólidos se realiza en función del indice de crecimiento absoluto (ICA),que determina su productividad y selectividad. La metodología utilizada fue propuesta por Mossel y col, quienescrearon un método ecométrico que evalúa la sensibilidad de los medios de cultivos sólidos selectivos al desarrollode bacterias deseadas y resistentes a la colonización por bacterias no deseadas, así como también los medios decultivos sólidos no selectivos.

9.1 OBJETIVO

Describir el procedimiento técnico propuesto por Mossel y col. para evaluar el control de calidad del mediode cultivo Thayer-Martin y el agar chocolate enriquecido que se utilizan en el aislamiento e identificacióndel gonococo.

.9.2 CAMPO DE APLICACIÓN

Se aplica a la evaluación de la calidad de los medios de cultivos que se preparan para el aislamiento delgonococo, de tal manera que se garantice la optimización del medio Thayer Martin y del agar chocolateenriquecido.

9.3 CONDICIONES ESPECIFICAS

Los medios de cultivo a evaluar serán de reciente preparación y elaborados según los procedimientosdescritos en este manual.

9.4 CRITERIOS PARA EL CONTROL DE CALIDAD (Tabla N° 3)

Tabla N° 3. Criterios para el control de calidad de medios de cultivo sólidos

Medio Agente ICAAgar chocolate N. gonorrhoeae 3,0

N. gonorrhoeae 2,5Medio Thayer-Martin Escherichia coli, Staphylococcusmodificado epidermidis, Proteus mirabilis, 2,0

Candida albicans

ICA: Indice de crecimiento absoluto

≥≥

≤



9.5 CEPAS DE REFERENCIA

Los microorganismos que se emplean en la evaluación del control de calidad de los medios de cultivo en

mención son los propuestos en el Manual BBL. Para este caso, la bacteria deseada es N. gonorrhoeae y

los microorganismos no deseados son: Escherichia coli, Staphylococcus epidermidis, Proteus mirabilis y

Cándida albicans, microorganismos que comúnmente se encuentran como flora acompañante de la muestra.


9.6.1 2 placas agar chocolate con suplemento

9.6.2 5 placas medio Thayer-Martin

9.6.3 Cepas de referencia: Neisseria gonorrhoeae, Escherichia coli, Staphylococcus epidermidis, Proteus mirabilis

y Candida albicans.

9.6.4 Caldo BHI en tubo de ensayo

9.6.5 Tubos Mc Farland 0,5 y 1,0

9.6.6 Medio de cultivo de referencia

9.6.7 Asa de siembra calibrada a 2 µL

9.7 PROCEDIMIENTO

9.7.1 Preparación de las cepas (microorganismos deseados y no deseados)

9.7.1.1 Preparar cultivos frescos, fase estacionaria en tubos de ensayo conteniendo infusión cerebro corazón

(BHI).

9.7.1.2 Incubar los cultivos a 35°C-37°C durante 24 horas.

9.7.1.3 Ajustar la concentración de bacterias a la escala Mc. Farland 0,5.

9.7.1.4 Sembrar inmediatamente los cultivos ajustados.

9.7.2 Preparación de los medios de cultivo en placa petri

9.7.2.1 El medio de cultivo a evaluar debe estar en placa petri 100x10 mm en cantidad no menor de 20 mL (no

menor de 4 mm de espesor).

9.7.2.2 Antes de realizar la prueba, deje secar las placas en posición invertida en una estufa a 45°C por una hora

(a 37°C por 2 horas).

9.7.2.3 Divida la placa en 4 cuadrantes similares y luego enumere dichas zonas (ver Figura N° 17).



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9.7.3 Sembrado de los microorganismos deseados y no deseados

9.7.3.1 Agar chocolate: siembre la bacteria deseada (N. gonorrhoeae).

9.7.3.2 Agar Thayer-Martin modificado: Siembre sólo un microorganismo deseado y no deseado por placa.

9.7.3.3 Utilizar un asa calibrada de 2 µL para sembrar los microorganismos deseados y no deseados ajustados a

Mc Farland 0,5.

9.7.3.4 Trazar sobre la superficie del medio de cultivo, 5 estrías paralelas (±2 cm de longitud) en cada cuadrante

y una estría al centro, en forma prefresiva sin recargar ni torcer el asa de siembra.

9.7.3.5 Incubar las placas en posición invertida a 35°C-37°C durante 24 horas en ambiente de 3-7% de CO2 y 50-

70% de humedad.

9.7.4 Determinación del índice de crecimiento absoluto (ICA)

A cada estría que muestra crecimiento del microorganismo inoculado, se le asigna un valor de 0,2, dicho

valor se multiplica por el número de estrías en las que se observa crecimiento, excepto la estría central que

vale 1,0. Por ejemplo, si hubo desarrollo en todas las estrías, cada cuadrante alcanza el valor de 1,0, 1,0 x

4 = 4,0 + 1,0. Es decir, el Indice de Crecimiento Absoluto (ICA) alcanzado sería igual a 5.

9.7.5 Resultado

De acuerdo al valor ICA alcanzado, el medio de cultivo evaluado puede resultar de: CALIDAD ACEPTABLEO NO ACEPTABLE. Si el valor ICA de los microorganismos ensayados supera el valor límite, el medio de

cultivo será considerado de CALIDAD NO ACEPTABLE.

Figura N° 17. División de la placa y estriamiento

1

4 5

2

3



BIBLIOGRAFÍA

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2. Dickinson B. BBL paper discs for the determination of B-lactamase enzymes. 88-0080-1; 1992.

3. Dickinson B. GonoGen Ii. 88-102025; 1994.

4. Dillon JR, Li H. A laboratory course manual: identification and antimicrobial susceptibility testing of Neis-

seria gonorrhoeae. Third Edition. Ottawa-Canada: WHO/PAHO GASP Coordinating Center; 1994.

5. Ehret JM, Judson FN, Biddle JW. Gonorrhea. In: Wentworth BB, Judson FN. Laboratory methods for the

diagnosis of sexually transmitted diseases. USA: American Public Health Association; 1984. p. 43-79.

6. Instituto Nacional de Salud. Manual de procedimientos para la obtención y envío de muestras (I). Segunda

edición. Lima, Perú: INS; 1997. Serie de Normas Técnicas N° 15.

7. Instituto Nacional de Salud. Manual de procedimientos técnicos para el diagnóstico bacteriológico de

gonorrea. Segunda edición. Lima, Perú: INS; 1997. Serie de Normas Técnicas N°19.

8. Instituto Nacional de Salud. Manual de normas de bioseguridad. Lima, Perú: INS; 1996. Serie de Normas

Técnicas N°18.

9. Kellogg J, Orwig LK. Comparison of gono gen, gono gen II and micro trak direct fluorescent antibody test

with carbohidrate fermentation for confirmation of culture isolates of Neisseria gonorrhoeae. J Clin Microbiol

1995; 33(2): 474-6.

10. Krieg NR. Bergey’s manual of systematic bacteriology. Vol. 1. Williams and Wilkins. Baltimore-London;

1984.

11. Morello JA, Janda W, Bohnhoff M. Neisseria and Branhamella. In: Lennette HE (Ed.). Manual of clinical

microbiology. American Society for Microbiology. Fourth edition. USA; 1985. p. 176-92.

12. Organización Mundial de La Salud. Neisseria gonorrhoeae e infecciones gonocócicas. Ginebra: OMS;

1978. Serie de Técnicos 616. p. 156.

13. Organización Panamericana de la Salud. Guía técnica para el estudio de evaluación del riesgo

microbiológico en la vía pública en ciudades de América Latina. OPS; 1994.

14. Sonnenwirth A, Jarett L. Métodos y diagnóstico del laboratorio clínico. 8°edición. Ed. Panamericana.

Buenos Aires-Argentina; 1984.

15. Sonnenwirth A, Gradwohl JL. Métodos y diagnóstico del laboratorio clínico. 8° edición. Ed. Médico

Panamericana. Buenos Aires; 1969.



MPR - CNSP - 008

16. Thayer JD, Martin JE. A selective medium for the cultivation of Neisseria gonorrhoeae and Neisseria

meningitidis. Public Heralth Reports 1964; 79(1): 49-57.

17. Neylan V, Genus I. Neisseria Trevisan1885, 105AL. In: Krieg NR. Bergey’s manual of systematic bacteriol-

ogy. Vol.1. Williams and Wilkins. Baltimore-London. 1984. p. 290-6.

18. Wentworth BB, Judson F. In: Laboratory methods for the diagnosis of sexually transmitted diseases.

American Public Health Association. USA; 1984.

19. Weyant RS, Weaver RE, Hollis DG, Jordans JG, Cook EC, Daneshvar MI. Identification of unusual

pathogenic gram-negative aerobic and facultatively anaerobic bacteria. Second edition. Williams and

Wikins. Center for Disease Control and Prevention; 1995.



ANEXO A

FICHA DE REGISTRO DE DATOS DEL PACIENTE

Fecha de ingreso de muestra: ........................................ Código de la muestra: .................................................

Establecimiento de salud: ...............................…………….......................................................................................

Región de salud: ........................................................................................................................................................

Nombre del paciente: ..................................................................................... Edad: .......... Sexo: ..........................

Conducta de riesgo: ..................................................................................................................................................Trabajadora sexual (TS), cliente (CL), hombre que tiene sexo con con otro hombre (HSH), población general (PG),drogadicto (D), población privada de su libertad (PPL), Otro: (Indicar) ......................................................................................................................................................................................

Tipo de muestra: .......................................................................(secreción uretral, cervical, faríngea, etc.)

Diagnóstico clínico: ....................................................................................................................................................

Diagnóstico bacteriológico: .......................................................................................................................................

PRUEBAS DE LABORATORIO

Desarrollo en Thayer Martin: ......................... Desarrollo en TSA: ..........................................................................

Coloración de Gram de la colonia sospechosa: .....................................................................................................

Prueba de oxidasa: ........................................ catalasa: .........................................................................................

RESULTADO DEL DX. PRESUNTIVO: .......................................................................................................................

RESULTADO CONFIRMATORIO

Utilización de carbohidrato en base CTA : ..............................................................................................................

Otra tecnología de identificación utilizada : .............................................................................................................. .............................................................................................................. (género – especie)

Fecha de procesamiento de la muestra :Inicio: ....................................................................... Término: ..................................................................................

........................................................Responsable



MPR - CNSP - 008

ANEXO B

FICHA DE DATOS PARA EL TRANSPORTE DE AISLAMIENTOSPARA LA CONFIRMACIÓN DE Neisseria gonorrhoeae

Código de recepción del cultivo en el INS: .............................................................................................................

Código de procedencia/nombre del paciente:.........................................................................................................(Consigne el código de la muestra y las iniciales del nombre del paciente: Apellido paterno, Apellido materno, primery segundo nombre)

Establecimiento de salud: ...................................................................................................................(Indique el nombre del establecimiento de salud (DISA a la que pertenece) donde se hizo el aislamiento del germen)

Edad: ............................................. Sexo: ..........................................(a: años, m: meses, d: días) (M: masculino, F: femenino)

Grupo poblacional: ........................................................................................................................................................(Consigne PG: población general, TS: trabajadora sexual, HSH: hombre que tiene sexo con otro hombre, CL:cliente, PPL: población privada de su libertad, DRO: drogadicto, Otro: indique)

Tipo de muestra: .........................................................................................................................................................Trabajadora sexual (TS), cliente (CL), hombre que tiene sexo con con otro hombre (HSH), población general (PG),drogadicto (D), población privada de su libertad (PPL), Otro: (Indicar).......................................................................................................................................................................................

Fecha de obtención de muestra: ........................ Dx. bacteriológico: ...........................................................................(Registre: día, mes y año)

Fecha de aislamiento: .................................... Fecha de envío al INS: .................................................................(Registre: día, mes y año)

........................................................Responsable



ANEXO C

PREPARACIÓN DE COLORANTES

COLORANTE DE GRAM

C1. CRISTAL VIOLETA DE HUCKER

Solución «A»: Cristal violeta (certificada).. 2 g Etanol (95%)................... 20 mL

Solución «B»: Oxalato de amonio............. 0,8 g Agua destilada................ 80 mL

Disolver el cristal violeta en etanol (solución «A»).Disolver el oxalato de amonio en agua destilada (solución «B»).

Procedimiento

⟨ Mezclar las soluciones «A» y «B», filtrar con papel filtro después de las 24 horas de haber realizado lamezcla.

⟨ Guardar en frasco oscuro.⟨ Etiquetar y anotar la fecha de su preparación

NOTA: Almacenar el colorante filtrado en frasco de vidrio oscuro.

C2. SAFRANINA: Solución al 0,25%

Safranina O (certificada).. 0,25 g Etanol (95%).............. 10 mL Agua destilada............ 90 mL

C3. DECOLORANTE ALCOHOL-ACETONA (1:1)

Etanol (95%)............... 50 mL Acetona qp. ............... 50 mL

C4. YODO DE GRAM

Cristales de yodo......... 1 g Yoduro de potasio......... 2 g Agua destilada............ 300 mL

Procedimiento

• Mezclar en un mortero los cristales de yodo y el yoduro de potasio.

• Agregar agua destilada en pequeñas cantidades.

• Almacenar la solución preparada en frascos de vidrio oscuro.



MPR - CNSP - 008

ANEXO D

FLUJOGRAMA PARA EL AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE Neisseria gonorrhoeae

MUESTRA // Transporte en:- Amies o

- Transgrow

- Otros.

Examen directo Cultivo en:

(Coloración de Gram) - Agar Thayer Martin

modificado (MTM)

y/o

- Agar chocolate con

suplemento enriquecedor

Incubación a 35°C,

con 3-7 % de CO2 y 70% de

humedad.

Lectura cada 18-24 horas. Descartarpositividad después de las 72 horas

De las colonias sospechosas hacer:

coloración Gram, prueba oxidasa y catalasa.

Diplococos gramnegativos típicos

oxidasa (+) y catalasa (+)

Utilización de carbohidratos

en base CTA:

Glucosa Lactosa Maltosa Sacarosa + - - -

N. gonorrhoeae (LAB. REF. REGIONAL)

ENVIO AL LABORATORIO DEREFERENCIA NACIONAL (INS)

-

IDENTIFICACIONPRESUNTIVA

IDENTIFICACIONCONFIRMATORIA



ANEXO E

FLUJOGRAMA PARA EL DIAGNÓSTICO CONFIRMATORIO DE Neisseria gonorrhoeae POR EL MÉTODOBIOQUÍMICO CTA-CH

: Punto crítico

IDENTIFICACIÓNPRESUNTIVA

IDENTIFICACIÓNCONFIRMATORIA

Incubaci n a 3…C, 3-10%de CO2, 50-70%

humedad/ 24-72 horas

COLORACIÓNDE

GRAMCATALASA OXIDASA

PRUEBA BIOQUÍMICA CTA-CH:

Prueba: beta-lactamasa

SISLAB: Sistema de Información de Laboratorios.



MPR - CNSP - 008

ANEXO F

FICHA DE DATOS PARA EL REGISTRO DE MEDIOS DE CULTIVOS PREPARADOS

Fecha de preparación: ...............................................................................................................................................

Nombre del medio de cultivo: ..................................................................................................................................

Cantidad: ........................ Cantidad de placas servidas: .......................... Cantidad de frascos: ..............................

COMPONENTES:

Marca de la base GC: ................................... Fecha exp.: .................................. lote:.............................................

Marca de la hemoglobina: ............................................................ Marca: ...............................................................Fecha exp.: .......................................lote: ...........................................

Nombre del suplemento enriquecedor: ..................................... Marca: ...............................................................Fecha exp.: ...................................... lote: ...........................................

Iniciales de los antibióticos: ......................................................... Marca: ...............................................................Fecha exp.: ....................................... lote: ............................................

Agar adicionado: ........................................................................... Marca:................................................................Fecha exp.: ...................................... lote: ............................................

........................................................Responsable



ANEXO G

ILUSTRACIONES DEL EMBALAJE PARA EL TRANSPORTE DE LOS AISLAMIENTOS

Figura G1. Forma adecuada de embalar los recipientes primarios.

Figura G2. Forma adecuada de embalar los recipientes primarios.



MPR - CNSP - 008

Figura G3. Forma de colocar varios recipientes primarios dentro del recipiente secundario.

Figura G4. Forma de tapar y sellar con cinta de embalaje.



Figura G5. Etiqueta de identificación.

Figura G6. Etiqueta de orientación y forma de colocar dos etiquetas de

orientación en cada extremo del contenedor.



MPR - CNSP - 008



ARTES Y DISE OS LASER S.R.Ltda.Teodoro C rdenas 124 - B

Santa BeatrizLima 01 - Per

Telf.: 470-6172 Telefax: 472-4525

Mayo 2002

Tiraje: 3,000 ejemplares

Dx. Gonorrea

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