Dra. Yolanda de Diego Otero - Espacios Salud Investiga · BIOTECNOLOGÍA Y LA INVESTIGACIÓN...

Dra. Yolanda de Diego OteroCoordinadora del grupo de investigación CTS546.

Fundación IMABIS. Hospital Regional Universitario Carlos Haya. Málaga.

INSTITUTO MEDITERRÁNEO PARA EL AVANCE DE LA BIOTECNOLOGÍA Y LA INVESTIGACIÓN SANITARIA

Síndrome X frágil

Prevalencia afectados

1 en 2500 varones 1 en 4000 mujeres

Prevalencia portadores

1 en 800 varones 1 en 250 mujeres

FUNDACIÓN IMABIS. HOSPITAL CARLOS HAYA

SXF SXF SXF

Programa “Iguales pero diferentes”. Linea 900. Premio IMSERSO

Estrabismo (36%)

Car

a al

arga

daas

imét

rica

(75%

)

Mandíbula prominente y paladar hendido (65%)

Macrocefalia (70%)

Frente amplia

Orejas grandes y evertidas (70%)

CARACTERÍSTICAS FENOTÍPICAS MAS FRECUENTES

FACIALES CORPORALES


Macroorquidismo(50% pre- 90% post pubertad)

Escoliosis (65%)

Pies planos (65%)

Hipotonía en la infancia(80%)

Alteraciones cardiacas

(35%)

Bardoni & Mandel, 2002

Síndrome X Frágil con fenotipo

similar al Síndrome Prader-Willi

SXF con fenotipo Prader-Willi tienen Autismo y

disminución de la proteína CYFIP (Nowicki y col. 2005)


Un 20-25 % de los pacientes con SXF tienen hipersensibilidad

sensorial y autismo.

Fenotipo Autista en el

Síndrome X Frágil


Síndrome X frágil

• Pies planos

• Alteraciones cerebrales

•Hipersensibilidad sensorial


RASGOS DE CONDUCTA Y APRENDIZAJE

Hiperactividad y déficit de atención

Ansiedad

Problemas del lenguaje

Rasgos autistas

Estereotipias motoras

Problemas de razonamiento abstracto

Dificultad de aprendizaje

NO EXISTE TRATAMIENTO ESPECÍFICO QUE EVITE LA APARICIÓN DE LOS

SINTOMAS DEL SÍNDROME


Hipersensibilidad sensorial

Timidez

Retraso del desarrollo psicomotor

Gen FMR1mutado

CromosomaX

Xq27.3

Necesidades terapéuticas y educativas

Estimulación precoz

Terapia de integración sensorial

Logopedia, terapia del habla

Estímulo visual junto con estímulo verbal

Programa educativo de inclusión apropiado

Clases muy estruturadas y rutinas en el apredizaje

Reforzamiento positivo del buen comportamiento

Instrucciones claras y concisas

Tratamiento farmacológico sintomático

Terapia ocupacional

Integración socio-laboral

Síndrome X frágil


PATOLOGIAS DE PORTADORES

DE LA PREMUTACION DEL GEN

FMR1


♦ En mujeres menopausia precoz por fallo ovárico prematuro ( POF

15-25% de mujeres con premutación )

♦ En varones y mujeres mayores de 50 años: Síndrome de tremor

ataxia (FXTAS)

♦ En niños mayor frecuencia de autismo

Patologías descritas en portadores de la Premutación(50-200 CCG en el Gen FMR1)

Bourgeois et al. J Clin Psychiatry. 2009. 70(6):852-862.


Intervención Multidisciplinar IntegradaIntervención Multidisciplinar IntegradaIntervención Multidisciplinar Integrada

F Tratamiento Personalizado CoordinadoF Niveles de Actuación:

» SanitarioF Diagnóstico Clínico y GenéticoF Consejo Genético y Asesoramiento FamiliarF Seguimiento Médico y FarmacológicoF Estimulación Precoz e Integración Sensorial

F Apoyo Psicopedagógico y Logopédico» Educación y Aprendizaje

» Integración Social y Laboral


0 puntos 1 punto 2 puntos

IQ >85 70-85 <70

Historia familiar de retraso mental en la parte materna

No aparece Aparece Se observa y está ligado al cromosoma X .

Cara alargada No aparece Moderado Muy alargada

Orejas grandes y hacia afuera No aparece Levemente Muy evidente

Problemas de atención con hiperactividad

No aparece Hiperactividad Hiperactividad y problemas de atención

Autismo y problemas de comportamiento

No aparecen Aparece levemente uno de los dos

Aparecen ambos o uno de los dos muy marcado

Suma de los puntos

Puntuación mayor de 6, pedir diagnóstico del Síndrome X frágil.

Tabla de ayuda al diagnóstico del SXF


Mutación Genética en el gen FMR1

responsable del Síndrome X frágil


CARIOTIPO MOSTRANDO FRAGILIDAD FRAXA


GEN FMR1 NORMAL

ARNm

FMRP

Xq 27.1

Xq 27.2

Xq 25.0Xq 23.0

Xq 22.2Xq 21.33

Xq 21.31Xq 21.1

Xq 13.2Xq 12.0

Xp 11.22Xp 11.3

Xp 21.1

Xp21.11

Xp 21.12Xp 22.2

Xp 22.32

Xq 27.3

5’ 3’

GEN fmr1NORMAL

CGGn6-55

ADN

17 exones

exón 1

(CGG)50 GEN fmr1

INTERRUPCIÓN (TCC)

INTERRUPCION (TCC)

Las interrupciones AGG/TCC estabilizan

la secuencia de repeticiones CGG/GCC

Secuencia Inestable a partir de 55 CGG

5’ 3’

exón 1

GEN fmr1 PREMUTADO

ADN

RNA tóxico en neuronasFXTAS

Síndrome de temblor / ataxia asociado al X

frágil

CGGn55- 200

FMRP

ARNm

GEN FMR1 PREMUTACION

expansión

Brouwer y cols., 2006

Riesgo de expansión en una premutación (55-200 CGG) vía Materna

Numero de repeciones Riesgo aproximado Riesgo aproximadoCGG en la madre de tener un hijo afectado de tener una hija afectada

56–59 7 % 3.5 %60–69 10 % 5 %70–79 29 % 15 %80–89 36 % 18 %90–99 47 % 24 %>100 50 % 25 %

Riesgo de expansión en una premutación via Paterna

Todas las hijas reciben la premutacion del mismo tamaño o a veces menor

5’ 3’

MUTACION DINAMICA POR EXPANSION DE LOS TRIPLETES CGG CON METILACION DEL GEN FMR1

(CGG)n > 200

ADN

FMRP

ARNm

Mutación Genética responsable del Síndrome X frágil

CGG exón 1


fmr1

Inhibición de la expresión Ausencia de la proteína FMRP

Árbol genealógico Familia1. Tesis Doctoral: Y. de Diego Otero. 1997. Universidad de Sevilla.


Efecto fundador de la mutación X frágil en España

5 10 15 20 25 30 35 %10 %20304050607080

5C2D1C0C6Z6A7E5D3A2D1D7A6C2B8C2C1A2A6D7D7C

controles (141) pacientes XF (107)alelo

LOS HAPLOTIPOS: 2A, 2C, 6A, 6C, 6D, 6Z ACOMPAÑAN A MUTACIONES ANCESTRALES

QUE ACUMULAN EL 60% DE LAS MUTACIONES FXS QUE DETECTAMOS HOY

Y. de Diego Otero and P. Chiurazzi. 2000. Universidad Erasmus de Rotterdam.


Diagnóstico molecular del Síndrome X frágil

Se inicia a partir de 1991 (por Southern-blot o por PCR)

Southern-blot: analiza el tamaño de los CGG y la metilación

Válida en todas las muestras (mutaciones y premutaciones)

Técnica laboriosa y cara


VarónNormal 5.2Kb -

Mutados > 5.9 kb - Premutado 5.3-5.8 kb

Varones con S. X frágil

Varón portador

Determina el número de repeticiones CGG

Técnicas recientes permiten detectar hasta400-600 CGG, así como las interrupcionesAGG y el grado de metilación

Técnica sencilla y relativamente más barata


PCR de las repeticiones (CGG)n del gen FMR1 causante del SXF:

Premutación 50-200 CGG

Normal6-49 CGG

Consejo Genético y Asesoramiento Familiar

• Explicación a la familia del tipo de estudio y modo de herencia.

• Análisis de la familia a traves del genograma o pedigree.

• Deteccción de posibles portadores.

• Calculo del riesgo empírico que existe de heredar la mutación.

• Indicar las posibilidades actuales de tener descendencia sana:

• Diagnóstico Prenatal • Diagnóstico Preimplantacional• Donante de Gametos• Adopción

PREVENCION DEL SINDROME X FRAGIL

FISIOPATOLOGÍA DEL

SÍNDROME X FRÁGIL

Mientjes y col, 2005

EXPRESIÓN DE FMRP EN CEREBRO

CORTEZA CEREBELO

HIPOCAMPO

de Diego Otero y col., 2000

CP

CG


Ratón SXF

Ratón Normal

HIPOCAMPO (CA1)

Grossman y cols., 2006

Alteración morfológica en espinas dendríticas de las neuronas del cerebro

morfología ≠

Morfología


Inmaduras

Maduras

El SXF presenta mayor número de dendritas inmaduras

FMRP-ARNm /FXRP

ARNm núcleo

Asociación directa ribosoma

Síntesis local de proteínas

Glutamato

FUNCIÓN DE FMRP EN LAS NEURONAS

Begni y cols., 2006

FMRP-ARNm /FXRP/CYFIP

Grossman et al. Journal of neuroscience. 2006

Alteración en las conexiones y señales intracelulares durante la sinapsis neuronal


http://www.jneurosci.org/content/vol26/issue27/images/large/zns0270619720001.jpeg

de Diego Otero y col., 2000

GLÁNDULA SUPRARRENAL

TESTICULO

Mientjes y col., 2005

EXPRESIÓN DE FMRP EN TEJIDOS PERIFÉRICOS


Ensayo Fase I: An On-Label Trial of Donepezil in Fragile X Syndrome

Stanford University. September 2006

Ensayo: Add-on trial of lithium in fragile X syndrome.

Rush University medical center. Chicago. Illinois. 2004.

Ensayo Fase II: Effects of CX516 on Functioning in Fragile X Syndrome and Autism

Cortex Pharmaceuticals, Inc. y FRAXA Foundation UC Davis-MIND Institute, California. 2002.

Ensayo del compuesto CX516, un modulador de receptores glutamato AMPA, demuestra

efectividad pero tiene un problema de dosificación (Berry-Kravis y col 2007)

Ensayos Clínicos del SXF

• Ensayos con Riluzol para comportamiento obsesivo compulsivo (Christian 2009).

• Ensayo del farmaco NPL-2009, para comprobar su seguridad (Neuropharm 2008).

• Ensayo del fármaco AFQ056 para comprobar su efectividad en problemas de

comportamiento y aprendizaje en los pacientes (Novartis 2008).

• Ensayo fase II con el fármaco RO4917523, para comprobar sus eficacia en

comportamiento y cognición en pacientes (Hoffmann-La Roche 2009).



• Ensayo con Fenoban, antagonista del receptor glutamato (Berry-Kravis y col. 2009).

• Ensayo con Donezepil (inhibidor de la acetilcolinesterasa), mejora funciones cognitivas

y de comportamiento en pacientes afectados (Kesler y col. 2009).

• Ensayo con Nemantine (Erickson y col 2009).

• Ensayo con Minociclina, efecto positivo en pacientes (Paribelo 2009).

• Ensayo con L-acetilcarnitina, eficaz para reducir la hiperactividad y mejorar la

relación social de los niños afectados de 6 a 13 años (Torrioli y col. 2008).

NUESTRA INVESTIGACIÓN DEL

SÍNDROME X FRÁGIL

Pacientes con SXF Raton fmr1-nulo

Macroorquidismo Macroorquidismo

Hiperactividad Incremento de la actividad locomotora

Aumento de Cortisol y adrenalina en

estrés

Alteraciones en la secreción de Corticosterona y

adrenalina

Discapacidad intelectualDeficiencia en la prueba de reconocimiento de objeto

Alteraciones en tareas de aprendizaje y memoria.

Espinas dendríticas inmadurasEspinas dendríticas inmaduras

Alteración en el tamaño de fibras musgosas

Episodios epilépticos espontáneosAumento de la susceptibilidad a padecer episodios

epilépticos con estímulos auditivos


Comparación fenotípica

Resultados publicados en pacientes(Hessl y col Ment Retard Dev Disabil Res Rev. 2006)

Alteraciones del eje HPA regulador de la respuesta al estres

Aumento significativo de los niveles de Cortisol

Posible implicación de la Glándula suprarrenal en la fisiopatología de la enfermedad


Respuesta fisiológica al estrés(Secreción de hormonas suprarrenales, Adrenalina y Cortisol)

Supervivencia del individuo

Respuesta adaptativa

Adecuada Inadecuada Excesiva Prolongada

Eje HPAEje del CrecimientoEje TiroideoEje ReproductivoEje MetabólicoFunción DigestivaSistema Inmunológico

HOMEOSTASIS(Salud)

Sistemas hormonalesen equilibrio

RESPUESTA PATOLÓGICA

ALTERACIÓN DE LOS EJES HORMONALES


Espinas dendríticas inmaduras

OXIDACIÓN

FMRP

Activación de Rac1 y NADPH-oxidasa

Glucocorticoides y adrenalina

SXF

Glutamato


Behl y cols., 1997

La carencia de la proteína FMRP produce estrés

oxidativo, y este mecanismo fisiopatológico podría

participar en el deterioro cognitivo y las alteraciones de

comportamiento de los ratones fmr1-KO.

El tratamiento con compuestos antioxidantes podrían

mejorar el estatus oxidativo, así como las alteraciones de

comportamiento y el deterioro cognitivo.

HIPÓTESIS


Exceso de radicales libres y estrés oxidativo en el Síndrome X frágil

Radical Hidroxilo

Superoxido anión

Peróxido de hidrogeno

Oxido Nítrico & Catecolaminas

Ac. Ascórbico

Tocoferol

Lactato & Piruvato

Catalasa

Superoxido dismutasa

GSH peroxidasa & reductasa

Glutation Taurina & Hipotaurina

ROSAntioxidantes

Estrés OxidativoParkinson

Alzheimer

Envejecimiento

Autismo

Síndrome de Down

Síndrome de Rett

Síndrome X frágil

ENFERMEDAD

ANTIOXIDANTES


Origen del estrés oxidativo

H2O2O2-

HO-

NO

1O2 OONO-

-NADPH-Oxidasa-Xantina Oxidasa

-Lipooxigenasa

-Ciclooxigenasa

-Citocromo P450

MetabolismoCelular

MitocondriaSistemas

Enzimáticos

Xenobióticos

- Herbicidas y contaminantes

- Fármacos

- Radiaciones

- Ozono.

- Alcohol

Hormonas Adrenales

- Glucocorticoides

- Catecolaminas


La proteína RAC1 está activada en cerebro de ratón FMR1-KO (SXF)


Funciones de RAC1-GPTasa

Activación NADPH-oxidasa

Aumento de secreción adrenal

Aumento de Neurotransmisores

Crecimiento de dendritas sinápticas

Cerebro

Rac1 WBPAK1-PBD Pulldown

KOWT

Total Rac1

- 21 kDa

- 21 kDa

O2 O2-

NADPH NADP- + H+

Nox1p22

gp91

Fuente de producción de radicales libres: NADPH-oxidasa.

p67p47

p40 Rac 1REPOSOACTIVA

citoplasma

p67p47

p40

Rac 1


CerebroAct

ivid

ad d

e N

AD

PH

-oxi

dasa

(nm

ol/m

g pr

oteí

nas

por m

in)

0

20

40

60

80

100

120

140

Actividad del complejo proteico NADPH oxidasa

O2 O2-

NADPH NADP- + H+

Nox1p22

gp91

p67p47

p40

Rac

citoplasma

**

Los ratones fmr1-KO muestran una mayor actividad del complejo NADPH-

oxidasa en cerebro y mayor producción de radicales libres.

Ratón normalRatón SXF


♦ Grupos de animales FMR1-KO (n=80) y Control-WT (n=80)

♦ Estudio de Comportamiento Laberinto en campo abierto,

Laberinto en cruz elevado,

Caja de reflejos condicionado

Oxidación de lípidos y proteínas, glutation y Corticosterona♦ Técnicas bioquímicas

♦ Tratamiento durante 30 días

COMPUESTOS CARACTERÍSTICA

Melatonina

Hormona Antioxidante endogena. Regula el ciclo sueño/vigilia.Potente acción como antioxidante. Influye en la actividad y regulaciónde GSHpx, SOD y Catalasa

Tianeptina

Antidepresivo que potencia la recaptación de serotonina. Restaura laplasticidad neuronal, normalizando el eje HPA y disminuyendo lasecreción de glucocorticoides.

Vitamina EAntioxidante liposoluble no enzimático. Limita la propagación de lareacción en cadena de la peroxidación de lípidos.

Diseño experimental


Los tratamientos antioxidantes en ratones fmr1-KO revierten la hiperactividad

0

1500

3000

4500

6000

7500

9000

Loco

moc

ión

(cm

)**

* *

# #&

Naïve Vehículo Mel Tianeptina Vit E

#

Campo Abierto

Hiperactividad



Laberinto en cruz elevado

0

10

20

30

40

50

60

Naïve Vehículo Mel Tianeptina Vit E

% T

iem

po B

razo

Abi

erto *

**

#

&

#

*p< 0.05; **p< 0.01 entre los genotipos#p< 0.05; entre fmr1-nulo tratado vs. vehículo&p< 0.05; entre wt tratado vs. vehículo

Respuesta ansiosa

Los tratamientos antioxidantes en el fmr1-KO revierten la ansiolisis



Memoria y aprendizaje

Los tratamientos antioxidantes en el ratón fmr1-KO

revierten la deficiencia en memoria y aprendizaje

0

5

10

15

20

Vehículo Vit E

#

% M

iedo

Con

dici

onad

o

*

Nuevo Ambiente + EC

VITAMINA ERatón normalRaton SXF

0

5

10

15

20

*

Vehículo Mel

Nuevo Ambiente + EC

MELATONINA

Caja de aprendizaje condicionado


El ratón fmr1-KO, modelo de estudio del síndrome X frágil, muestra:

• Hiperactividad, ansiolísis y déficits en aprendizaje y memoria.

• Alteraciones significativas en los parámetros bioquímicos de estrés oxidativo.

El tratamiento crónico con antioxidantes (Vitamina E o Melatonina) en el ratón Fmr1-KO:

• Revierte la hiperactividad, la ansiolisis y el defícit de aprendizaje.

• Normaliza el estrés oxidativo en cerebro y testículos

• Normaliza los niveles plasmáticos de corticosterona.

• Normaliza el tamaño de los testículos

Conclusiones


De Diego-Otero Y, Romero-Zerbo Y, el Bekay R, Decara J, Sanchez L, Rodriguez-de Fonseca F, del Arco-

Herrera I.

Alpha-tocopherol protects against oxidative stress in the fragile X knockout mouse: an experimental therapeutic

approach for the Fmr1 deficiency. Neuropsychopharmacology. 2009 34:1011-26.

Romero-Zerbo Y, Decara J, el Bekay R, Sanchez-Salido L, Del Arco I, de Fonseca FR, de Diego-Otero Y.

Protective effects of melatonin against oxidative stress in Fmr1 knockout mice: a therapeutic research model for the

fragile X syndrome. J Pineal Res. 2009 46:224-34.

el Bekay R, Romero-Zerbo Y, Decara J, Sanchez-Salido L, Del Arco-Herrera I, Rodríguez-de Fonseca F, de

Diego-Otero Y.

Enhanced markers of oxidative stress, altered antioxidants and NADPH oxidase activation in brains from Fragile X

mental retardation 1-deficient mice, a pathological model for Fragile X syndrome. Eur J Neurosci. 2007

26:3169-80.

Grupo de Investigación Básica, Clínica, Genética y Epidemiológica de los Trastornos Mentales.

PAI: CTS546

Publicaciones científicas

PAI: CTS-546 Grupo de Investigación Básica, Clínica, Genética

y Epidemiológica de los Trastornos Mentales.

Fundación IMABIS. Hospital Carlos Haya Málaga.

Investigadores Básicos: Investigadores clínicos:

Dra. Rajaa el Bekay Dra. Lucia Perez Costillas

Dr. Raul Heredia Farfan Lic. Rocio Calvo Medina

Tec. Lourdes Sánchez Salido Lic carolina Quintero Navarro

Dra. Elena Lina Cabello

Tec. Ana Higuero Tapiador

Colaboradores del Grupo: Dr. Ignacio del Arco. Instituto de Innovación para el Bienestar Ciudadano. Málaga.Dra. Isabel Fernández. Universidad de Valladolid.Dra. Rafaela Caballero Andaluz. Universidad de Sevilla.Dr. Marcos Isamat. Fundación Echevarne. Barcelona.Dr. José Ramón Alonso. Universidad de Salamanca.

Coordinadora: Dra. Yolanda de Diego Otero


E-mail: [email protected] Telf: 951290346. 633515175

TITULO: Ensayo de tratamiento Fase III, doble ciego para investigar la efectividad y seguridad de la

combinación de Ácido Ascórbico (vitamina C) y Tocoferol (vitamina E) versus placebo para el

tratamiento de los trastornos cognitivos y de comportamiento de los afectados con Síndrome X frágil.

Promotor: Dra. Yolanda de Diego Otero. Grupo INTRAM CTS546. Fundación IMABIS. Hospital Carlos Haya. Málaga.

Investigador Principal: Dra. Lucia Pérez Costillas. Grupo INTRAM CTS546. Servicio de psiquiatría. Hospital Carlos Haya. Málaga.

Equipo investigador:

Dra. Rocío Calvo Medina. Servicio de Neuropediatría. Hospital Carlos Haya. Málaga.

Lic. Carolina Quintero. Facultad de Psicología. Universidad de Málaga.

Dr. Raúl Heredia. Laboratorio de investigación. Fundación IMABIS. Málaga.

Dra. Lucia Madrigal. Laboratorio de investigación. Fundación IMABIS. Málaga.

Dra. Isabel Fernández. Departamento de Pediatría. Facultad de Medicina. Universidad de Valladolid.

Dra. Rafaela Caballero. Departamento de Psiquiatría. Universidad de Sevilla.

Dr. Ignacio del Arco. Instituto de Innovación para el bienestar ciudadano. Málaga.

Dra. Elizabetth Pintado. Universidad de Sevilla.

ENSAYO: TRA-152.


Sujetos:

Afectados mayores de 3 años (niños y niñas) con Síndrome X Frágil (con más de

200-CGG y metilación del gen FMR1).

Objetivo:

Definir la eficacia de la combinación de vitaminas C y E, en el

tratamiento de los pacientes con el Síndrome X frágil.

ENSAYO: TRA-152.


Fundación

FundaciónOrganismos que financian nuestra investigación sobre Síndrome X frágil

Proyectos ISCIII: G03/098, MCYT :SAF2003-00200 & SAF2080-00486, SAS:128-20003, Conquer Fragile x foundation. PI09-0507. PAI : CTS-546. SXF-2009-2010. Fundation Jerome Lejeune Paris.

Proyecto de excelencia: P10-CTS-05704. Ensayos: TRA152. EC10-191

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