Dra Mª Luisa Casas LosadaJefe de Servicio Unidad de Análisis Clínicos

Área de Laboratorio

Hospital Universitario Fundación Alcorcón Madrid

Más de 30 años sin cambios conceptuales significati vos!

UN BREVE PASEO POR LA HISTORIA DEL DIAGNÓSTICO DE L A ALERGIA

“El diagnóstico alergológico molecular es una estrategia destinada a perfilarla sensibilización alergénica del paciente a escala molecular por medio de

Componentes alergénicos purificados naturales o recombinantes ( componentesalergénicos) en sustitución de los extractos alergénicos. Desde su aparición

el diagnóstico molecular ha adquirido cada vez mayor difusión en la atención ordinariay hoy los componentes alergénicos comercializados para el análisis “in vitro” de lasIgE específicas (sIgE) superan las 130.”

Extracto alergénico natural

•La mayor parte de los Alergenos se han estudiado por técnicas de determinación de proteínas:

• Separación e Identificación:EEF e Inmunoblotting, Purificación, Standarización

• Desconocimiento de la naturaleza Molecular de los Alergenos

•Desarrollo de la tecnología DNA recombinante en los 80 Utilización mediante sistemas de expresión procariotas E. Coli

•Capaces de unirse a IgE y de inducir activación de células T y basófilos

•Mismas características inmunológicas alergenos naturales

•Útiles para el Diagnóstico “in vitro” de la Alergia

Alergenos recombinantes

Aislamiento ARNm

ADNc sintasa

Inserción cDNA en vectores y empaquetamiento en fagos

Célula huésped ( sistema de expresión) Eucariota/ Procariota

Infección de E Coli con fagos recombinantes

Producción del alergeno recombinante

Fuente alergénica natural

Alergenos recombinantes

Vehículo de clonación Plásmidos, Fagos

¿Qué es un alergeno recombinante?

Molécula alergénica producida por biotecnología

Alergenos recombinantes

La expresión recombinante de DNA proporciona un sistema de producción ilimitado de alergenosaltamente homogéneos, comparable a los naturales en reactividad

Alergenos recombinantes

Los extractos alergénicos se obtienen por extracción acuosa. Son mezclas de proteínas.

Los recombinantes obtenidos por biotecnología de ADN son proteínas puras

recombinantesCaracterísticas

ManzanaMalus domestica

Mal d 1: PR-10Mal d 2 : Taumatina (TLP, PR-5)Mal d 3: LTP (proteina de transferencia de lípidos)Mal d 4: Profilina

Del origen alergénico al componente

Cortesía Angel Barahona Thermofisher

Componentes: específicos y Rx cruzada

Componentes alergénicos específicos de especie

–Alergenos exclusivos de una determinada fuentes alergénica–Utilidad como componentes alergénicos marcadores específicos

Componentes alergénicos marcadores de reactividad cruzada

-Reactividad cruzada entre diferentes fuentes alergénicas

-Proteínas que comparten cierta homología estructural

Componentes alergénicos específicos de especie

Phleum Pratense ( Hierba Timotea)

Phl p 1

Phl p 2

Phl p 3

Phl p 4

Phl p 5

Phl p 6

Phl p12

Componentes específicos- Indican sensibilización genuina

EggGal d 1

TimothyPhl p 1

PeanutAra h 2

Honey beeApi m 1

Cortesía Angel Barahona Thermofisher

Reactividad cruzada (panalergenos)Profilina

PolcalcinaTropomiosina

AlbuminasCCD

PR-10 LTP

AbedulBet v 1Bet v 2Bet v 4

lecheBos d 4Bos d 5Bos d 6Bos d 8

HuevoGal d 1Gal d 2Gal d 3Gal d 4

GramineasPhl p 1 Phl p 5 Phl p 11Phl p 2 Phl p 6 Phl p 12Phl p 4 Phl p 7

MelocPru p 1Pru p 2Pru p 3Pru p 4

KiwiAct d 1Act d 2Act d 8

CacahueteAra h 1 Ara h 5Ara h 2 Ara h 8Ara h 3 Ara h 9

ManzanaMal d 1Mal d 2Mal d 3Mal d 4

cucarachaBla g 1Bla g 2Bla g 4Bla g 5Bla g 7

ácarosDer p 1Der p 2

Der p 10

GambaPen a 1

CaballoEqu c 1Equ c 2Equ c 3

PerroCan f 1Can f 2Can f 3Can f 4Can f 5

GatoFel d 1Fel d 2Fel d 4

OlivoOle e 1Ole e 2Ole e 3Ole e 7Ole e 9

Presentes en diferentes fuentes alergénicas y causan reactividad cruzada entre alergenos

VespidosVes v 1Ves v 2Ves v 5

Cortesía Angel Barahona Thermofisher

Perfiles de sensibilizacióncosensibilización y reactividad cruzada

Cosensibilización:�Sensibilización auténtica a mas de una fuente alergénica�Sensibilización independiente�Siempre es sensibilización primaria

Reactividad cruzada :�Sensibilización a mas de una fuente alergénica por Rx cruzada

�Reconocimiento entre moléculas alergénicas similares presentesen especies distintas.�Alergenos de especies cercanas (Rx entre gramíneas)�Alergenos de especies muy dispares:

•Moléculas conservadas con función similar•Pertenecen a la misma familia proteica•Ejm Tropomiosina

-Der p10 Ácaros del polvo doméstico-Pen m1 Langostino tigre negro

Reactividad cruzada

¿Una sola fuente?, ¿grupo reducido de especies similares? ¿varias fuentes diferentes?

��AntAntíígenos responsables de la reactividad cruzada entre genos responsables de la reactividad cruzada entre especies que no se relacionan de forma directa entre sespecies que no se relacionan de forma directa entre síí. .

��Pueden dar reacciones cruzadas tanto clPueden dar reacciones cruzadas tanto clíínicamente nicamente como solo a nivel de laboratorio (silentes).como solo a nivel de laboratorio (silentes).

�� 1 de cada 5 pacientes pol1 de cada 5 pacientes políínicos tiene sensibilizacinicos tiene sensibilizacióón n frente a alergenos de origen vegetalfrente a alergenos de origen vegetal

��Suelen corresponder a proteSuelen corresponder a proteíínas relacionadas con una nas relacionadas con una funcifuncióón similar. Pertenecientes a la misma familia de n similar. Pertenecientes a la misma familia de proteproteíínasnas

Concepto clave:Panalergenos y reactividad cruzada

Familias de Proteínas

• Homólogos del Bet v 1, proteínas PR-10

• LTP, Proteínas transferidoras de lípidos

• Profilinas

• Polcalcinas, proteínas fijadoras de calcio

• Proteína de almacenamiento

• CCD, componentes carbohidratados de reactividad cruzada

• Proteínas de almacenaje de plantas: albúminas, globulinas y gliadinas

• Tropomiosina

• Albúminas séricas

• Taumatinas, proteínas PR-5

• Parvalbúminas

• Lipocaínas

Los alergenos se clasifican en familias que comparten:

Características estructurales

Funciones biológicas

Proteínas que unen actina y participan en la organización del citoesqueletoPanalergenos implicados en reacciones cruzadas entre pólenes y alimentosUn 20% de alérgicos a pólen tienen IgE frente a profilinaEs uno de los panalergenos mas importantesdel reino vegetal.

Profilinas

Bet v 1 homóloga

Familia de PR10 proteína Bet v 1 homóloga

�Proteínas homólogas al alergeno mayor del abedul, relevantes en zona norte�Responsables cros-sensibilización pólenes-alimentos�Proteínas lábiles. Se asocian a síndrome de alergia oral

Ara h 8

Gly m4

Pru av1Mal d 1

Dau c 1

Proteínas de transferencia de lípidos

�Polipéptidos de 9 Kd identificados como LTPs�Perfil de sensibilización a rosáceas típico del área mediterránea�Melocotón Pru p3 70-90%, Manzana Mal d 3�Frutos secos, hortalizas, cereales�Látex, y pólenes de olivo , parietaria, gramíneas�Epítopos IgE comunes responsables de reactividad cruzada

Polipéptidos9 Kds LTP

Proteínas de transferencia de lípidos: Severidad

�LTPs altamente resistentes a enzimas y ttos térmicos�Mantienen su actividad en alimentos procesados�Productos derivados: cerveza

�Asociadas a síntomas sistémicos severos�Modelo alimentos vegetales

Diagnóstico Molecular: Evaluación del riesgo

�Capacidad para valorar el riesgo�Mayor utilidad alergias alimentarias

�Identifica:�Moléculas de “bajo riesgo”�Moléculas de “alto riesgo”

Moléculas alergénicas con alto y bajoriesgo de anafilaxia

Valenta et al. JIACI, 2007; 17 (sup 1): 36-40

Component-Resolved Diagnosis to Optimize Allergen-Specific Immunotherapy in the Mediterranean Area

CDR cambia las rutinas y las decisiones diagnósticas !

Engineerid allergen molecules . Linhart and Valenta. Cur Opin Immunol,2005; 17: 646-655

The introduction of recombinant allergen-based test s into clinical practice improves the selection of patients for traditional specific immu notherapyand allows monitoring of the immunological efficac y of specificimmunotherapy by measuring allergen-specific IgG antibodies .

Mothes et al, Clin Chem Lab Med, 2006; 44: 125-132

Dx con separación de componentes

Moléculas de Alergenos

Se denomina diagnóstico alergológico con separación de componentes CDR al empleo de moléculas de alergenos purificados principalmente recombinantes para el diagnóstico en Alergia.

Mediante CDR podemos:

Identificar individualmente los alergenos que producen la enfermedad en cada paciente . Conocer las posibles interacciones de reactividad cruzada

Definir el perfil de sensibilización de un paciente

Sospecha clínica de alergia IgE- mediada

Estudio sensibilización “in vivo” o “in vitro”

Extractos alergénico, fuente natural

Identificar Fuente/s Alergénicas

Moléculas de alergenos purificados

Identificación Moléculas Alergénicas

Monosensibilizados Polisensibilizados

Diagnóstico con separación por componentes

Extracto alergénico de fuente natural de pólen de Abedul

Identificación fuente alergénica: pólen de Abedul

Alergeno mayor pólen de Abedul

rBet v1

rBet v1: +

R Bet v2: 4-

Elevada

Alergenos menores pólen de Abedul

Reactividad cruzada

rBet v2, r Bet v4

rBet v1: +

R Bet v2,4: +

Intermedia

rBet v1: -

R Bet v2,4: +/-

Baja

IT con Alergenos Clave

Alergenos recombinantes del polen del Abedul: rBet v1,rBetv2, rBet4

¿Inmunoterapia?

Diagnóstico molecular: perfil de sensibilización

� Identifica pacientes co-sensibilizados (auténtica)� Diferencia la sensibilización a panalergenos (Rx cruzada)

� Mejora el perfil de sensibilización:

� Informa polisensibilización� Identifica pacientes idóneos IT� Permite evaluar el riesgo, identifica:

� Moléculas de bajo riesgo� Moléculas de alto riesgo.

Mal d 1: PR-10Mal d 2 : Taumatina (TLP, PR-5)Mal d 3: LTP (proteina de transferencia de lípidos)Mal d 4: Profilina

Concepto clave

Dx con Álergenos recombinantes disponibles actualmente

�Paneles de Alergenos recombinantes

�Micoarrays de proteínas alergénica

Multiplex IgE testing with allergen component panel

ImmunoCAP ISAC®; the 21st century choice of testin g

112 allergen components

47 allergen sources

Covers most relevant allergen components and cross-reactive

marker allergens

RESUMEN Y CONCLUSIONES

�Las directrices internacionales aconsejan una anamnesis minuciosa como primeralínea y pruebas de sIgE con extractos de alergenos ( IgE específicas in vitro o punción cutánea) como segunda línea de estudio.

�El DM de las alergias se considera la tercera línea para los pacientes cuyos estudiosde primera y segunda línea no muestran resultados concluyentes. Para los usuarios experimentados el diagnóstico molecular puede figurar en la segunda línea.

�El DM engloba un conjunto de métodos nuevos y complejos que en un futuro próximose convertirán en una herramienta habitual del alergólogo. Se precisan programas educativos de DM para los alergólogos.

Estamos dando nuestros primeros pasos

juntos el Laboratorio y la Clínica

Muchas gracias por su atención