DQANB_Desarrollos metodologicos en cromatografia de gases.pdf

FA C U LTA D D E C I E N C I A S Q U M I C A S

Departamento de Qumica Analtica,Nutricin y Bromatologa

D E S A R R O L L O S M E T O D O L G I C O S E NC R O M AT O G R A F A D E G A S E S Y

E L E C T R O F O R E S I S C A P I L A R

Memoria que para optar al grado de Doctor en Qumicapresenta el licenciado

Luis Ruano Miguel

Salamanca, 15 de enero de 2009

Fdo.: Luis Ruano Miguel

D. Rita Carabias Martnez, Catedrtica de la Universidad de Salamanca, y

D. Encarnacin Rodrguez Gonzalo, Profesora Titular de la Universidad de

Salamanca, directoras del trabajo Desarrollos metodolgicos en cromato-

grafa de gases y electroforesis capilar, realizado por D. Luis Ruano Miguel

para optar al grado de Doctor en Qumica por la Universidad de Salamanca,

autorizan la presentacin del mismo, por considerar que se han alcanzado

los objetivos inicialmente previstos.

Salamanca, 15 de enero de 2009

Fdo.: Rita Carabias Martnez Fdo.: Encarnacin Rodrguez Gonzalo

Deseo expresar mi agradecimiento alMinisterio de Ciencia y Tecnologa por laconcesin de una beca de Formacin dePersonal Investigador durante el perodo20032007.

El trabajo realizado ha sido financiado porlos proyectos: BQU-2002-02314 yCTQ2005-00292 de la Direccin General deInvestigacin (Ministerio de Ciencia eInnovacin), y SA-044/02 y SA007A05 de laJunta de Castilla y Len.

Muchas gracias...

... a Rita y a Encarna, por tabajar intensamentepara sacar esta tesis adelante, por vuestrapaciencia, por confiar en m y, sobre todo, por loque me habis transmitido a lo largo de estos aos.

... al Dr. D. Csar Garca Hermida, codirector demi trabajo de Grado de Salamanca, y a la postreprimera parte de esta tesis, por tus sabios consejosy cordialidad durante todo este tiempo.

... al Dr. D. Csar Raposo Funcia por tu ayudadesinteresada, amable disposicin y acertadoasesoramiento durante la primera parte de la tesis.

... a toda el rea de Qumica Analtica, tanto losde arriba como los de abajo, especialmente atodos mis compaeros de laboratorio que he vistoir y venir, por los buenos ratos y por todo lo queme habis enseado tanto en el mbito personalcomo profesional. Nunca olvidar esta etapa de mivida.

... a Norman W. Smith y todo su equipo del MicroSeparations Group en el Kings College Londonpor vuestra excepcional acogida y todo loaprendido durante mi estancia all.

... a toda mi familia y amigos, en especial mispadres, por interesaros por lo que hago, porvuestro apoyo incondicional, continuo nimo ypor desearme siempre lo mejor.

N D I C E

Acrnimos y abreviaturas viii

Objeto del trabajo ix

I Determinacin de plaguicidas carbmicos mediante gc condiferentes etapas de preconcentracin

1. Introduccin 3

1.1. Importancia de los plaguicidas carbmicos 4

1.2. Antecedentes bibliogrficos 5

1.2.1. Anlisis de plaguicidas carbmicos mediante gc 5

1.2.2. spe aplicada a la preconcentracin de plaguicidas carbmicos 8

1.2.3. spme aplicada a la preconcentracin de plaguicidas carbmicos 12

1.3. Objetivo 14

2. Parte experimental 15

2.1. Instrumental 15

2.2. Reactivos y disoluciones 17

2.3. Procedimientos 17

2.3.1. Separacin cromatogrfica y deteccin mediante ms 17

2.3.2. Determinacin mediante gc-ms con spme 18

2.3.3. Determinacin mediante gc-ms con spe y spme 19

2.3.4. Determinacin mediante gc-ms con spe 20

i

3. Resultados y discusin 21

3.1. Comportamiento de plaguicidas carbmicos en gc 21

3.1.1. Identificacin de las seales cromatogrficasgeneradas por inyeccin directa 21

3.1.2. Reactividad de plaguicidas carbmicos en gc 26

3.2. Preconcentracin mediante spme 28

3.2.1. Identificacin de las seales cromatogrficas generadas despus de spme 28

3.2.2. Optimizacin del proceso de spme 33

3.2.3. Optimizacin de la separacin cromatogrfica 43

3.3. Caractersticas analticas de los mtodos propuestos 44

3.3.1. Determinacin de plaguicidas carbmicos mediante gc-mscon spme como etapa de preconcentracin 44

3.3.2. Determinacin de plaguicidas carbmicos mediante gc-mscon spe y spme como etapas de preconcentracin 46

3.3.3. Determinacin de plaguicidas carbmicos mediante gc-mscon spe como etapa de preconcentracin 49

4. Conclusiones 53

II Separacin de tocoferoles mediante cec

5. Introduccin 59

5.1. Electrocromatografa capilar 59

5.1.1. Fases estacionarias con grupos polares incrustados 60

5.1.2. Fases estacionarias monolticas 62

5.2. Analitos modelo: tocoferoles 68

5.2.1. Separacin de vitamina E mediante cec 70

5.3. Objetivo 72

ii





6.3.1. Fabricacin de columnas capilares empaquetadas 75

6.3.2. Fabricacin de columnas monolticas 80

6.3.3. Separacin de vitamina E mediante ceccon columnas empaquetadas 82

6.3.4. Separacin de vitamina E mediante cec con columnas monolticas 83


7.1. Separacin con columnas empaquetadas 85

7.1.1. Efecto de la composicin de la fase mvil en medios no acuosos 86

7.1.2. Separacin de los ismeros y en una fase estacionariacon grupos polares incrustados 89

7.1.3. Conclusiones 95

7.2. Separacin en columnas polimricas monolticas 97

7.2.1. Optimizacin de la fabricacin de las columnas 97

7.2.2. Caractersticas cromatogrficas 105

7.2.3. Conclusiones 111

III Separacin mediante ce de plaguicidas carbmicos ypreconcentracin en polmeros monolticos

8. Introduccin 115

8.1. ce para el anlisis de plaguicidas carbmicos 116

8.2. Extraccin en fase slida y ce 120

8.2.1. Preconcentracin en capilares abiertos 122

8.2.2. Preconcentracin en columnas empaquetadas 124

iii

8.2.3. Preconcentracin en columnas monolticas 126

8.2.4. Preconcentracin en columnas de cec 128

8.3. Objetivo 129





9.3.1. Separacin de plaguicidas carbmicos mediante mekc 132

9.3.2. Separacin de Pirimicarb y Carbendazima mediante cze 133

9.3.3. Fabricacin de polmeros monolticos 134

9.3.4. Separacin de plaguicidas carbmicos mediante mekctras una etapa de preconcentracin en un polmero monoltico 135

9.3.5. Separacin de Pirimicarb y Carbendazima mediante czetras una etapa de preconcentracin in-line 136


10.1. Preconcentracin y separacin de plaguicidascarbmicos mediante mekc 139

10.1.1. Separacin mediante mekc 139

10.1.2. Preconcentracin y separacin mediante mekc 146

10.1.3. Caractersticas analticas 166

10.2. Preconcentracin y separacin de plaguicidascarbmicos mediante cze 173

10.2.1. Separacin mediante cze 173

10.2.2. Preconcentracin in-line y separacin mediante cze 185

10.2.3. Caractersticas analticas 193

11. Conclusiones 199

iv

Apndices

A. Plaguicidas estudiados 203

B. Monmeros empleados 205

C. Proveedores y marcas 207

D. Legislacin 209

Publicaciones

Behaviour of carbamate pesticides in gc and their determi-nation with spe and spme as preconcentration steps 213

Use of a polar-embedded stationary phasefor the separation of tocopherols by cec 223

In-capillary preconcentration of pirimicarband carbendazim with a monolithic polymericsorbent prior to separation by cze 231

In-capillary microextraction using monolithic polymers.Application to preconcentration of carbamatepesticides prior to their separation by mekc 243

v

A C R N I M O S Y A B R E V I AT U R A S

A, uA Absorbancia, unidad deabsorbancia

aibn 2,2-Azobis(2-metilpropionitrilo),Azobisisobutyronitrile

amps cido 2-acrilamido-2-metil-1-propanosulfnico, 2-acrylamido-2-methyl-1-propanesulfonicacid

bma Metacrilato de butilo o butilmetacrilato

bge Electrolito de separacin,Background electrolyte

ce Electroforesis capilar, Capillaryelectrophoresis

cec Electrocromatografa capilar,Capillary electrochromatography

cmc Concentracin micelar crtica

cze Electoforesis capilar zonal, Capillaryzone electrophoresis

dvb Divinilbenceno

egdma Dimetacrilalto de etileno,Ethylene glycol dimethacrylate

eof Flujo electro-osmtico,Electroosmotic flow

es, esi Ionizacin medianteelectro-espri, Electro-sprayionisation

fid Deteccin de ionizacin por llama,Flame ionisation detector

gc Cromatografa de gases, Gaschromatography

hplc Cromatografa lquida de altaeficacia, High performance liquidchromatography

lc Cromatografa lquida, Liquidchromatography

ld Lmite de deteccin

-maps metacrilato de3-(trimetoxisilil)propilo, -metha-cryloxypropyltrimethoxysilane

ms Espectrometra de masas, Massspectrometry

mekc Cromatografa electrocinticamicelar capilar, Micellarelectrokinetic chromatography

nace Electoforesis capilar en medios noacuosos, Non-aqueous capillaryelectophoresis

npd Detector de nitrgeno-fsforo,Nitrogen-phosphorus detector

odpva octadecilo y alcohol polivinlico,octadecyl polyvinyl alcohol

pdms-dvb Polidimetilsiloxano-divinilbenceno

pca Anlisis de componentesprincipales, Principal componentanalysis

peek Politer-ter-cetona,Polyetheretherketone

vii

pdvb Polidivinilbenceno

pfps Slice enlazada a fentafluorofenilo(pentafluorophenylsilica)

pm Peso molecular

ptv Inyeccin con rampa detemperatura, Programmedtemperature vaporizing injector

Rs Resolucin

rp Fase inversa, Reversed phase

rsd Desviacin estndar relativa,Relative standard deviation

sfe Extraccin con fluidos supercrticos,Supercritical fluid extraction

sle Extraccin slido-lquido,Solid-liquid extraction

sds Dodecilsulfato sdico, Sodiumdodecyl sulphate

sem Microscopa de barrido electrnico,Scanning electron microscopy

sim Seguimiento de iones seleccionados,Selected ion monitoring

spe Extraccin en fase slida, Solid-phaseextraction

spme Microextraccin en fase slida,Solid-phase microextraction

Tris 2-amino-2-hidroximetil-1,3-propanodiol, otris-hidroximetil-aminometano

uhq Calidad de agua ultrapura (Ultrahigh quality)

uv Ultravioleta

viii

O B J E T O D E L T R A B A J O

El trabajo que se presenta tiene por objeto el desarrollo de nuevos mto-dos de anlisis basados en cromatografa de gases (gc) y electroforesis ca-pilar (ce), con diferentes configuraciones de tratamiento de muestra parala determinacin de diversos tipos de compuestos en muestras de intersmedioambiental y alimentario. Los analitos estudiados son, por una parte,contaminantes orgnicos procedentes de la actividad agrcola (plaguicidascarbmicos), y por otro, vitaminas del grupo de los tocoferoles (vitamina E),para los cuales estas tcnicas no han sido, hasta el momento, satisfactoria-mente desarrolladas. Especial atencin se dar al diseo de nuevos esquemaspara la extraccin y preconcentracin de los analitos que, aplicados de for-ma individual o combinados entre s, permitan determinar concentracionesadecuadas con el mnimo tratamiento de muestra posible.

El primer captulo de la memoria trata del desarrollo de mtodos analticospara la separacin, identificacin y cuantificacin de plaguicidas carbmicosmediante cromatografa de gases con espectrometra de masas (gc-ms). De-bido a su inestabilidad trmica, los miembros de esta familia de plaguididasno son directamente analizables mediante gc, y requieren etapas previas dederivatizacin que incrementan el tiempo de anlisis y pueden generar in-terferencias. Se pretende evitar la derivatizacin utilizando la tcnica de mi-croextraccin en fase slida (spme) con objeto de conseguir una degradacincontrolada de estos analitos y obtener seales cromatogrficas reproduciblesde los productos de descomposicin. Para tal fin se aprovechar la etapa dedesorcin trmica que tiene lugar tras la etapa de preconcentracin.

Un segundo aspecto de especial importancia en esta tesis es la sntesis y elestudio de nuevas fases estacionarias para su uso en electrocromatografa ca-pilar (cec). En este sentido se estudiarn las posibilidades que presentan los

ix

materiales polimricos monolticos formados in situ en el interior del capilarcomo fases estacionarias y se compararn con otro tipo de fases estacionariasempaquetadas de slice enlazada.

El uso de estos polmeros monolticos como etapa de limpieza y preconcen-tracin previa a una separacin electrofortica es el ltimo aspecto de estetrabajo y, quiz, el ms innovador. Esta parte de la investigacin se centraren la aplicacin de estos polmeros monolticos como sorbentes eficaces yse estudiar su acoplamiento a la separacin electrofortica de plaguicidascarbmicos, los cuales sern separados por electroforesis capilar zonal enmedios no acuosos o por cromatografa electrocintica micelar.

x

Parte I

D E T E R M I N A C I N D E P L A G U I C I D A SC A R B M I C O S M E D I A N T E C R O M AT O G R A F A

D E G A S E S C O N D I F E R E N T E S E TA PA S D EP R E C O N C E N T R A C I N

1I N T R O D U C C I N

Se define plaguicida o pesticida como cualquier producto qumico destinadoa matar, repeler, atraer, regular o interrumpir el crecimiento de seres vivosconsiderados plagas. Actualmente, ms de 1.400 compuestos estn registra-dos en todo el mundo como plaguicidas o sus metabolitos. Los plaguicidasse pueden clasificar segn sus grupos funcionales o su estructura molecular(inorgnicos, organoclorados, organofosforados, carbmicos, etc.) o segn suactividad biolgica (insecticidas, herbicidas, acaricidas, etc.). Su uso ms co-mn es como herbicidas, seguido de insecticidas y fungicidas. Su empleocada vez ms frecuente y la contaminacin adicional debida a emisiones du-rante su fabricacin han dado como resultado la presencia de su residuos yde sus metabolitos en suelos, aguas y alimentos.

Debido a su uso en agricultura y posterior filtracin, la contaminacin porplaguicidas de aguas superficiales y acuferos ha sido bien documentada yexisten numerosas referencias del anlisis de muestras de diferente comple-jidad como suelos, alimentos o fluidos biolgicos. Por otra parte, los produc-tos de transformacin o los metabolitos que se forman como consecuencia deprocesos tales como hidrlisis, biodegradaciones, oxidaciones, fotlisis, etc.son frecuentemente ms txicos y persistentes en el medio ambiente que losplaguicidas de los que provienen. En las ltimas dcadas, el anlisis de pla-guicidas en muestras ambientales ha recibido una creciente atencin, dandolugar a numerosos programas ambientales de control para una amplia varie-dad de estos productos. Su concentracin y la de sus metabolitos en el medioambiente es frecuentemente muy baja y su determinacin puede presentarun gran nmero de interferencias. Por este motivo son necesarias tcnicas

3

4 introduccin

muy sensibles y selectivas para la deteccin y cuantificacin de dichos con-taminantes a nivel de trazas.

1.1. importancia de los plaguicidas carbmicos

Las probadas persistencia y toxicidad de los plaguicidas organofosforadosy organoclorados justific su sustitucin por otros ms fcilmente degrada-bles, polares, lbiles y menos persistentes, como son los N-metil carbamatos.Los plaguicidas carbmicos comenzaron a aplicarse al principio de la dcadade 1950 y desde entonces se han usado extensamente en el control de plagasdebido a su efectividad y amplio espectro de actividad biolgica (insecti-cidas, fungicidas, herbicidas, etc.). En cuanto a su estructura, correspondea la de steres de cidos carbmicos N-sustituidos (Figuras 1.1 y A.1, pg.203). La mayora son steres de fenoles o anillos aromticos heterocclicos,con sustituyentes metlicos en el nitrgeno. La elevada polaridad, su solubi-lidad en agua y su inestabilidad trmica son caractersticas tpicas de estosplaguicidas.

RO

CN

R''

O

R' R

R' CH3

HR'' CH3

Figura 1.1. Estructura general de los plaguicidas carbmicos.

Su toxicidad aguda es elevada, su efecto a corto plazo es muy potente, y larpida degradacin dificulta su deteccin. Debido a ello, adems de su usoapropiado, esta familia de compuestos se emplea como veneno para anima-les, en especial el Aldicarb y el Carbofurano, que han sido encontrados encebos y cadveres. Debido al incremento de su uso en agricultura, aunquesu aplicacin sea correcta, sus restos y los de sus metabolitos pueden encon-

1.2. antecedentes bibliogrficos 5

trarse en el suelo, en aguas de escorrenta, en alimentos y en cosechas, comoconsecuencia de su filtracin y elevada solubilidad en agua.

Los plaguicidas carbmicos se absorben por inhalacin, ingestin y, en me-nor medida, mediante absorcin cutnea, aunque sta sea la ruta menos txi-ca. Actan mediante un mecanismo de inhibicin reversible de la acetilcoli-na, que es un neurotransmisor presente en las uniones nerviosas degradadocontinuamente por la acetilcolinesterasa. Causan una carbamilacin de laenzima que ocasiona una acumulacin de la acetilcolina y una estimulacinexcesiva de los receptores nerviosos caracterizada por cambios en el estadode conciencia, espasmos, debilidad muscular, falta de coordinacin, excesi-va actividad secretora y, en concentraciones altas, insuficiencia respiratoriay muerte. Son hidrolizados enzimticamente por el hgado a los correspon-dientes alcoholes, y los productos de degradacin (glucurnidos) se excretanpor va renal.

1.2. antecedentes bibliogrficos

1.2.1. Anlisis de plaguicidas carbmicos mediante cromatografa de gases

Las tcnicas analticas ms frecuentemente empleadas para la separacin ycuantificacin de plaguicidas son la cromatografa de gases (gc) y la croma-tografa lquida de alta eficacia (hplc). Sin embargo, los plaguicidas carb-micos y sus productos de transformacin, al igual que las fenilureas, sontrmicamente inestables, lo que limita el uso de la gc. Este inconvenientese evita mediante una etapa previa de derivatizacin, la cual implica un in-cremento del tiempo de anlisis y puede introducir interferencias. Por estemotivo, la tcnica preferida para su determinacin es hplc con deteccinfluorimtica [1, 2, 3], de absorcin uv [4, 5, 6] o espectrometra de masas [7].

[1] Mtodo us epa 8318a. N-Methylcarbamates by hplc, 2000. Rev. 1.

[2] Mtodo aoac 985.23. N-methylcarbamate insecticide and metabolite residues; liquid chromato-graphic method, 1986.

[3] Mtodo aoac 991.06. N-methylcarbamoyloximes and N-methylcarbamates in finished drinkingwater, 1993.

[4] Mtodo us epa 531.1. Measurement of N-methylcarbamoyloximes and N-methylcarbamates inwater by direct aqueous injection hplc with post column derivatization.

6 introduccin

No obstante, algunos investigadores han propuesto mtodos para analizaresta familia de compuestos mediante gc.

En 1991 Stan y Klaffenbach [8] proponen una reaccin con anhdrido acticode 10 plaguicidas carbmicos para conseguir derivados trmicamente esta-bles y voltiles para su posterior anlisis mediante gc-ms. En 2006 Zhang yLee [9] emplean una derivatizacin en columna para la determinacin de5 plaguicidas carbmicos en muestras acuosas tras una etapa de microextra-cin en fase lquida.

Lambropoulou et al. [10] evaluaron la contaminacin de plaguicidas en el roKalamas (Grecia) mediante spme y gc-ms. Entre los compuestos estudiadosse incluye el Carbofurano, para el cual el mtodo propuesto tiene un lmitede deteccin de 0,03 g/L.

Lu y Que Hee [11] estudian la permeabilidad de los guantes de nitrilo alMetomilo mediante gc-ms. Con el fin de minimizar la descomposicin delMetomilo se propone trabajar con temperaturas inferiores a 180 C.

Algunos autores han propuesto dispositivos especiales para minimizar ladegradacin trmica de los plaguicidas carbmicos en gc. Por ejemplo, Wig-field et al. [12] recomiendan emplear columnas cortas (10m), y un dispositivo

[5] Mtodo aoac 984.09. Benomyl in insecticidal formulations; rp liquid chromatographic method,1984.

[6] Mtodo aoac 995.14. Methomyl in insecticidal formulations; rp liquid chromatographic method,1995.

[7] Mtodo us epa 8321B. Solvent-extractable nonvolatile compounds by hplc/ts/ms or uv detec-tion.

[8] H. J. Stan and P. Klaffenbach. Determination of carbamate pesticides and some ureapesticides after derivatization with acetic anhydride by means of gc-msd. Fresenius J.Anal. Chem., 339:151157, 1991.

[9] J. Zhang and H. K. Lee. Application of liquid-phase microextraction and on-columnderivatization combined with gc-ms to the determination of carbamate pesticides. J.Chromatogr. A, 1117:3137, 2006.

[10] D. A. Lambropoulou, V. A. Sakkas, D. G. Hela, and T. A. Albanis. Application of spme inthe monitoring of priority pesticides in the Kalamas River (N. W. Greece). J. Chromatogr.A, 963:107116, 2002.

[11] X. Lu and S. S. Que Hee. Permeation of methomyl in Lannate L through nitrile gloves.J. Hazard. Mater., 59:279285, 1998.


de inyeccin con temperatura programada (ptv), el cual permite incrementarprogresivamente la temperatura del inyector.

Zrostlkov et al. [13] comparan la tcnica de inyeccin con ptv con otros mo-dos de inyeccin usados en gc. Comprueban que con ptv se evita la degrada-cin de los compuestos trmicamente lbiles y lo aplican a la determinacinde 26 plaguicidas de diferentes familias, entre ellos el Carbarilo.

Matovsk et al. [14] utilizan gc-ms a baja presin para evitar la degrada-cin trmica de Metiocarb y Carbarilo. El vaco necesario lo suministraba labomba del espectrmetro de masas que funcionaba como detector.

El grupo de Amirav et al. [15, 16] desarrolla una nueva tcnica denomina-da gc-ms supersnica con la cual alcanzan una elevada sensibilidad paraun nmero elevado de plaguicidas en matrices agrcolas complejas. Entrelas principales ventajas de esta nueva tcnica se encuentra la capacidad deanalizar compuestos trmicamente lbiles mediante gc.

A pesar de los problemas que presenta el anlisis de plaguicidas carbmicosmediante gc, existen muy pocas referencias que estudien el proceso de des-composicin trmica y propongan cules son sus productos de degradacin.Trehy et al. [17] muestran que el Aldicarb se degrada a su correspondientenitrilo tanto trmicamente como en presencia de microorganismos anaero-

[12] Y. Y. Wigfield, R. Grant, and N. Snider. Gas chromatographic and mass spectrometricinvestigation of seven carbamate insecticides and one metabolite. J. Chromatogr., 657:219222, 1993.

[13] J. Zrostlkov, J. Hajlov, M. Godula, and K. Matovsk. Performance of ptv, pulsedsplitless and on-column injection techniques in analysis of pesticide residues in plantmatrices. J. Chromatogr. A, 937:7386, 2001.

[14] K. Matovsk, S. J. Lehotay, and J. Hajlov. Optimization and evaluation of low-pressuregc-ms for the fast analysis of multiple pesticide residues in a food commodity. J. Chroma-togr. A, 926:291308, 2001.

[15] M. Kochman, A. Gordin, P. Goldshlag, S. J. Lehotay, and A. Amirav. Fast, high-sensitivity,multipesticide analysis of complex mixtures with supersonic gc-ms. J. Chromatogr. A,974:185212, 2002.

[16] A. B. Fialkov, A. Gordin, and A. Amirav. Extending the range of compounds amenablefor gc-mass spectrometric analysis. J. Chromatogr. A, 991:217240, 2003.

[17] M. L. Trehy, R. A. Yost, and J. J. McCreary. Determination of Aldicarb, Aldicarb oxime,and Aldicarb nitrile in water by gc-ms. Anal. Chem., 56:12811285, 1984.

8 introduccin

bios; comprueban que la degradacin trmica se minimizaba mediante eluso de columnas capilares cortas (inferiores a 5m). Fialkov et al. [16] obtie-nen resultados similares con columnas cortas.

Santos Delgado et al. [18] realizan un estudio para conocer la estabilidadtrmica de varios plaguicidas carbmicos, y proponen un mtodo para sudeterminacin mediante gc con deteccin fid y npd. El mtodo propuestose ha aplicado de manera satisfactoria a la determinacin en purs de patataprecocinados de Propoxur, Carbofurano, Metiocarb y Carbarilo. Estos auto-res proponen que las variables que afectan a su estabilidad son: programade temperatura del horno, longitud de la aguja de la jeringa, temperaturadel inyector, concentracin de plaguicida, volumen de aire al final de la agu-ja y edad de la columna. En las condiciones de trabajo y siempre que seinyectan concentraciones inferiores a 20mg/L, se obtienen las seales croma-togrficas correspondientes a los analitos sin descomponer; sin embargo, silas concentraciones inyectadas son superiores, se detectan los productos dedescomposicin, cuya seal aumenta al incrementar la concentracin de pes-ticida. Proponen que los compuestos con estructura de carbamato de fenilose descomponen mediante un reordenamiento de McLafferty, y originan loscompuestos fenlicos correspondientes.

1.2.2. Extraccin en fase slida aplicada a lapreconcentracin de plaguicidas carbmicos

En la mayora de las ocasiones, los mtodos de separacin y deteccin por ssolos no son suficientemente sensibles como para determinar plaguicidas enlos niveles en los que se encuentran en muestras ambientales; necesitan, co-mo etapas previas al anlisis, su aislamiento y preconcentracin en diferen-tes tipos de muestras (aguas, alimentos, suelos, etc.). Mediante el aislamientode los analitos se incrementa la selectividad y con la preconcentracin se au-menta la sensibilidad del mtodo. Las tcnicas ms empleadas habitualmen-te para la preconcentracin de plaguicidas, son la extraccin lquido-lquido,la extracin en fase slida (spe) y la microextraccin en fase slida (spme).


La spe es una de las tcnicas ms usadas para efectuar una preconcentracinde contaminantes en muestras ambientales. En ella tiene lugar la distribucinde los analitos entre un material adsorbente o absorbente slido, y la fase l-quida donde estn disueltos. Los analitos quedan retenidos en el material,del cual son eluidos, tras una etapa de lavado, con un volumen relativamentepequeo de un disolvente adecuado. Las ventajas de la spe son su selectivi-dad (que depende del material y el extractante elegidos), el elevado factor depreconcentracin, su fcil automatizacin, y el bajo consumo de disolventesorgnicos. Los fundamentos tericos, as como los desarrollos experimenta-les de esta tcnica de preconcentracin han sido ampliamente recogidos enla literatura [19].

En cuanto a la aplicacin concreta de spe a la preconcentracin de plagui-cidas carbmicos, Soriano et al. [20] publicaron en 2001 una extensa revi-sin bibliogrfica sobre la preconcentracin de esta familia de compuestosy de sus metabolitos en aguas mediante spe y posterior separacin porlc, con 141 referencias que incluyen mtodos de preconcentracin on-liney off-line. En dicha recopilacin queda patente que los materiales ms em-pleados para la preconcentracin de plaguicidas carbmicos son fases de

[18] M. J. Santos Delgado, S. Rubio Barroso, G. Toledano Fernndez-Tostado, and L. M. Polo-Dez. Stability studies of carbamate pesticides and analysis by gc with flame ionizationand nitrogen-phosphorus detection. J. Chromatogr. A, 921:287296, 2001.

[19] E. M. Thurman and M. S. Mills. Solid-phase Extraction: Principles and Practice. Wiley, 1998.

[20] J. M. Soriano, B. Jimnez, G. Font, and J. C. Molt. Analysis of carbamate pesticides andtheir metabolites in water by spe and lc: a review. Crit. Rev. Anal. Chem., 31:1952, 2001.

[21] A. Di Corcia, R. Samperi, A. Marcomini, and S. Stelluto. Graphitized carbon black extrac-tion cartridges for monitoring polar pesticides in water. Anal. Chem., 65:907912, 1993.

[22] S. Chiron, A. Valverde, A. Fernndez-Alba, and D. Barcel. Automated sample prepara-tion for monitoring groundwater pollution by carbamate insecticides and their transfor-mation products. J. aoac Int., 78:13461352, 1995.

[23] K. M. Moore, S. R. Jones, and C. James. Multi-residue analytical method for uron andcarbamate pesticides in water using spe and lc-ms. Water Res., 29:12251230, 1995.

[24] A. Junker-Buchheit and M. Witzenbacher. Pesticide monitoring of drinking water withthe help of spe and hplc. J. Chromatogr. A, 737:6774, 1996.

[25] D. Giraud, A. Ventura, V. Camel, A. Bermond, and P. Arpino. Determination of traces ofpesticides in water by spe and lc-ionspray ms. J. Chromatogr. A, 777:115125, 1997.

[26] I. Vassilakis, D. Tsipi, and M. Scoullos. Determination of a variety of chemical classesof pesticides in surface and ground waters by off-line spe, gc with electron-capture and

10 introduccin

C18 [21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28], de carbono graftico [21, 29, 30, 31, 32, 33, 27]y materiales polimricos basados en estireno-divinilbenceno [24, 34, 27].

Molina et al. [35] aplican una preconcentracin on-line con cartuchos polim-ricos a una separacin multiresiduo mediante mekc. Arrez-Romn et al. [36]efectan un paso previo de spe antes de la separacin por mekc de Aldicarby Carbofurano.

nitrogenphosphorus detection, and hplc with post-column derivatization and fluores-cence detection. J. Chromatogr. A, 823:4958, 1998.

[27] J. M. Soriano, B. Jimnez, M. J. Redondo, and J. C. Molt. Comparison of differentsorbents for on-line liquid-solid extraction followed by hplc determination of nitrogen-containing pesticides. J. Chromatogr. A, 822:6773, 1998.

[28] T. M. Primus, D. J. Kohler, M. Avery, P. Bolich, M. O. Way, and J. J. Johnston. Novel fieldsampling procedure for the determination of methiocarb residues in surface waters fromrice fields. J. Agric. Food Chem., 49:57065709, 2001.

[29] A. Di Corcia and M. Marchetti. Multiresidue method for pesticides in drinking waterusing a graphitized carbon black cartridge extraction and liquid chromatographic analy-sis. Anal. Chem., 63:580585, 1991.

[30] C. Crescenzi, A. Di Corcia, G. Passariello, R. Samperi, and M. I. T. Carou. Evaluation oftwo new examples of graphitized carbon blacks for use in spe cartridges. J. Chromatogr.A, 733:4155, 1996.

[31] A. Cappiello, G. Famiglini, and F. Bruner. Determination of acidic and basic/neutralpesticides in water with a new microliter flow rate lc/ms particle beam interface. Anal.Chem., 66:14161423, 1994.

[32] J. Slobodnk, . ztezkizan, H. Lingeman, and U. A. T. Brinkman. spe of polar pesticidesfrom environmental water samples on graphitized carbon and Empore-activated carbondisks and on-line coupling to octadecyl-bonded silica analytical columns. J. Chromatogr.A, 750:227238, 1996.

[33] S. Guenu and M. C. Hennion. Prediction from liquid chromatographic data of obliga-tory backflush desorption from spe cartridges packed with porous graphitic carbon. J.Chromatogr. A, 725:5766, 1996.

[34] S. Guenu and M. C. Hennion. Evaluation of new polymeric sorbents with high speci-fic surface areas using an on-line spe-liquid chromatographic system for the trace-leveldetermination of polar pesticides. J. Chromatogr. A, 737:1524, 1996.

[35] M. Molina, D. Perez-Bendito, and M. Silva. Multi-residue analysis of N-methylcarbamatepesticides and their hydrolytic metabolites in environmental waters by use of spe andmekc. Electrophoresis, 20:34393449, 1999.

[36] D. Arrez-Romn, A. Segura-Carretero, C. Cruces-Blanco, and A. Fernndez-Gutirrez.Determination of Aldicarb, Carbofurano and some of their main metabolites in ground-water by application of mekc with dad and spe. Pest Manage. Sci., 60:675679, 2004.


Otras aplicaciones ms recientes incluyen el uso de polmeros impresos [37,38] y spe dispersiva [39, 40]. Del Carlo et al. [41] comparan la determina-cin de Carbarilo mediante un bioensayo electroqumico con la extraccinen cartuchos de C18 y separacin mediante hplc. Caballo-Lpez et al. [42]comparan el mtodo epa 8318 [1] con la extraccin con ultrasonidos y poste-rior limpieza on-line y separacin.

Adems de los trabajos mencionados, existen varias publicaciones recientesque incluyen etapas de spe antes de una separacin cromatogrfica [43, 44,45].

[37] J. Hantash, A. Bartlett, P. Oldfield, G. Dns, R. ORielly, and F. David. Application ofan in-line imprinted polymer column in a potentiometric flow-injection chemical sensorto the determination of the carbamate pesticide carbaryl in complex biological matrices.Anal. Bioanal. Chem., 387:351357, 2007.

[38] M. L. Mena, P. Martnez-Ruiz, A. J. Reviejo, and J. M. Pingarrn. Molecularly imprintedpolymers for on-line preconcentration by spe of Pirimicarb in water samples. Anal. Chim.Acta, 451:297304, 2002.

[39] M. Liu, H. Yuki, Y. Song, and J. Lin. Determination of carbamate and organophosphoruspesticides in fruits and vegetables using lc-ms with dispersive spe. Chinese J. Anal. Chem.,34:941945, 2006.

[40] M. Liu, Y. Hashi, Y. Song, and J. M. Lin. Simultaneous determination of carbamate and or-ganophosphorus pesticides in fruits and vegetables by lc-ms. J. Chromatogr. A, 1097:183187, 2005.

[41] M. Del Carlo, M. Mascini, A. Pepe, G. Diletti, and D. Compagnone. Screening of foodsamples for carbamate and organophosphate pesticides using an electrochemical bioas-say. Food Chem., 84:651656, 2004.

[42] A. Caballo-Lpez and M. D. Luque de Castro. Continuous ultrasound-assisted extractioncoupled to on line filtration-spe-column lc-post column derivatisation-fluorescence de-tection for the determination of N-methylcarbamates in soil and food. J. Chromatogr. A,998:5159, 2003.

[43] T. Prez-Ruiz, C. Martnez-Lozano, and M. D. Garca. Determination of N-methylcarbamate pesticides in environmental samples by an automated spe and liquidchromatographic method based on post-column photolysis and chemiluminescence de-tection. J. Chromatogr. A, 1164:174180, 2007.

[44] P. Morrica, P. Fidente, and S. Seccia. Liquid chromatographic determination of nine N-methylcarbamates in drinking water. Biomed. Chromatogr., 19:107110, 2005.

[45] G. zhan, S. Topuz, and B. Alpertunga. A simple method for the determination of car-baryl and 1-naphthol in fruit juices by hplc-dad. J. Food Prot., 66:15101513, 2003.

12 introduccin

1.2.3. Microextraccin en fase slida aplicada a lapreconcentracin de plaguicidas carbmicos

Una tcnica de preconcentracin alternativa a la spe, es la microextraccinen fase slida (spme). Presenta las ventajas de no necesitar disolventes org-nicos, es relativamente barata, ya que las fibras son reutilizables (se puedenefectuar ms de 50 extracciones por fibra), requiere pequeos volmenes demuestra, se puede usar directamente en un gran nmero de matrices, y esposible su automatizacin.

Esta tcnica consiste en la retencin de los analitos en una fase extractante denaturaleza polimrica, dispuesta como revestimiento de una fibra de slicefundida. La fase polimrica recubre un centmetro de longitud de la fibra deslice, y puede exponerse o retraerse dentro de una aguja protectora de aceroinoxidable. En la aplicacin de la spme se distinguen dos etapas:

1. La fibra se expone a la muestra y los analitos se reparten entre la matrizy el revestimiento polimrico.

2. Finalmente, la fibra con los analitos concentrados se coloca en el dis-positivo de inyeccin de un cromatgrafo de gases, donde se desorbentrmicamente, o bien se disuelven en un disolvente orgnico apropiadosi la spme se va a acoplar a una separacin por hplc.

Aunque la spme ha sido muy empleada en el aislamiento y preconcentracinde plaguicidas de diferente naturaleza (organoclorados, organofosforados,triazinas, fenilureas, etc.) en diferentes matrices (aguas, suelos y alimentos),en la revisin bibliogrfica realizada se han encontrado escasas referenciassobre su aplicacin a plaguicidas carbmicos. Dada su elevada polaridad, eltipo de recubrimiento polimrico empleado para la preconcentracin de pla-guicidas carbmicos es el poli(dimetilsiloxano-divinilbenceno) (pdms-dvb) sila tcnica de separacin es hplc, que es lo ms habitual.

Blanco et al. [46] aplican la spme a la preconcentracin de Carbofurano enmuestras de agua, encontrando que la fibra ms adecuada es una de pdms-

[46] M. C. Lpez-Blanco, B. Cancho-Grande, and J. Simal-Gndara. Comparison of spe andspme for carbofuran in water analyzed by hplc-dad. J. Chromatogr. A, 963:117123, 2002.


dvb. Estudian el efecto que la temperatura y el efecto salino ejercen en elproceso de extraccin y observan que la eficacia de la separacin crece conla fuerza inica y disminuye al aumentar la temperatura. El anlisis se reali-z mediante hplc-dad y presenta un lmite de deteccin de 8,9 g/L. Estosautores realizan un estudio comparativo utilizando spme y spe empleandouna fase extractante de C18. Las precisiones de ambos procedimientos deextraccin son comparables, pero el lmite de deteccin es inferior con spe(0,06 g/L).

Volmer y Hui [47] encuentran unos lmites de cuantificacin entre 0,3 y1,9 g/L para 9 plaguicidas carbmicos en aguas mediante spme y hplc-ms/ms.

El grupo de Pawliszyn, quien introdujo la tcnica de spme, emplea una nuevamodalidad (in-tube spme o spme intratubular) [48, 49, 50, 51]. En esta meto-dologa, en la etapa de preconcentracin se pasa la muestra por el interior deun capilar de slice fundida recubierto interiormente de la fase polimrica.La etapa de desorcin se lleva a cabo pasando por el capilar un disolventeorgnico apropiado. La spme intratubular permite su automatizacin, puesse puede acoplar en lnea en una vlvula de inyeccin de hplc. Los lmi-tes de deteccin encontrados utilizando deteccin espectrofotomtrica son0,02 g/L para el Carbarilo y 0,16 g/L para el Metiocarb.

Mder et al. [52] proponen un mtodo para la determinacin de plaguicidascarbmicos y triazinas en muestras de suelos y lodos y los analizan median-te hplc-ms. Sagratini et al. [53] analizan trazas de fenilureas y plaguicidascarbmicos en zumos de frutas preconcentrando 1mL durante 90min antesde su deteccin mediante hplc-ms/ms.

[48] Y. Gou and J. Pawliszyn. In-tube spme coupled to capillary lc for carbamate analysis inwater samples. Anal. Chem., 72:27742779, 2000.

[49] Y. Gou, C. Tragas, H. Lord, and J. Pawliszyn. On-line coupling of in-tube spme to hplcfor analysis of carbamates in water samples: Comparison of two commercially availableautosamplers. J. Microcolumn Sep., 12:125134, 2000.

[50] Y. Gou, R. Eisert, and J. Pawliszyn. Automated in-tube spme-hplc for carbamate pesticideanalysis. J. Chromatogr. A, 873:137147, 2000.

[51] J. Wu, C. Tragas, H. Lord, and J. Pawliszyn. Analysis of polar pesticides in water and winesamples by automated in-tube spme coupled with hplc-ms. J. Chromatogr. A, 976:357367,2002.

14 introduccin

1.3. objetivo

El objetivo de la primera parte de esta memoria es la puesta a punto de m-todos analticos para la identificacin y cuantificacin de siete plaguicidascarbmicos mediante gc-ms. Debido a que la mayora de ellos son trmi-camente inestables, se pretende conseguir una degradacin controlada conel fin de obtener seales cromatogrficas reproducibles de los productos dedescomposicin. Para lograr esta descomposicin controlada se aprovecha-r la desorcin trmica que tiene lugar tras una etapa de preconcentracinmediante microextraccin en fase slida (spme).

En primer lugar se ha estudiado el comportamiento de los plaguicidas car-bmicos en gc-ms, en funcin de las condiciones de inyeccin y de si la intro-duccin en el sistema cromatogrfico se realiza directamente o por desorcintrmica tras una etapa de spme. Posteriormente se han optimizado los dife-rentes parmetros que afectan al proceso de extraccin (spme) y, en las con-diciones ptimas encontradas, se han evaluado las caractersticas analticasdel mtodo con una etapa de preconcentracin mediante spme. Finalmente,se comparan diversos mtodos analticos con diferentes configuraciones depreconcentracin basados en spme, spe, o el uso conjunto de ambas tcnicasde forma previa al anlisis mediante gc-ms.

[52] M. Mder, P. Popp, R. Eisert, and J. Pawliszyn. Determination of polar pesticides in soilby spme coupled to hplc-es/ms. Fresenius J. Anal. Chem., 363:680685, 1999.

[53] G. Sagratini, J. Maes, D. Giardin, P. Damiani, and Y. Pic. Analysis of carbamateand phenylurea pesticide residues in fruit juices by spme and lc-ms. J. Chromatogr. A,1147:135143, 2007.

2PA RT E E X P E R I M E N TA L

2.1. instrumental

La separacin cromatogrfica se ha llevado a cabo en un equipo Shimad-zu gc-17A equipado con detector de cuadrupolo Shimadzu qp5000. Se em-plearon dos columnas capilares: una J&W db5 (5% de polidifenilo y 95%de polidimetilsiloxano) de 30m de longitud, 250m de dimetro interno y0,25m de espesor de fase estacionaria, y otra columna de las mismas carac-tersticas usada intensamente durante dos aos, con 1m de espesor de faseestacionaria.

La preconcentracin mediante spme se realiz en una fibra de poliacrilato de85m de Supelco en viales de 12mL con tapn de rosca y septo perforablede silicona recubierto de tefln. El vial con la muestra se mantuvo sobre unagitador magntico Jenway 1000, y a temperatura constante con la ayuda deun termostato de inmersin de la marca SBS (Figura 2.2).

Se usaron cartuchos Sep-Pak tC18 de Waters con 900mg de relleno para lapreconcentracin mediante spe. Las muestras de agua fueron impulsadascon una bomba peristltica Gilson Minipuls 2. Para la etapa de elucin seutiliz una bomba de vaco acoplada a una urna de vidrio con capacidadpara 20 cartuchos simultneos de spe de la marca Varian. Para redisolver elresiduo seco se utiliz un equipo de agitacin de tubos por vrtice.

15

16 parte experimental

Figura 2.1. Dispositivo comercial de spme.

TermostatoAgitador magntico

Camisa termostatada

Fibra de SPME

Figura 2.2. Montaje experimental para la spme.

2.2. reactivos y disoluciones 17

2.2. reactivos y disoluciones

Los patrones de plaguicidas (Carbofurano, Propoxur, Metiocarb, Carbari-lo, Carbetamida, Aldicarb y Pirimicarb) y metabolitos (Isopropoxifenol y 1-Naftol) tuvieron un porcentaje mnimo de pureza superior al 98,5%. Todosse obtuvieron de Dr. Ehrenstorfer excepto el Pirimicarb (Fluka).

Se prepararon disoluciones madre de todos los plaguicidas y sus metabolitosen metanol con una concentracin de 200mg/L. A partir de estas disolucio-nes madre se obtuvieron por dilucin las disoluciones de trabajo. Todas lasdisoluciones se almacenaron a 4 C en ausencia de luz.

Los disolventes orgnicos empleados (acetonitrilo y metanol) fueron de Merckcon calidad para hplc. El agua se obtuvo mediante un sistema de purifica-cin de agua Elgastat uhq, de la marca Elga.

El resto de reactivos empleados para la preparacin de disoluciones fueronde calidad reactivo analtico.

2.3. procedimientos

2.3.1. Separacin cromatogrfica y deteccin mediante espectrometra de masas

La temperatura de la interfase fue de 270 C. La temperatura del inyectorfue de 300 C. El gas portador fue helio con un caudal de 1,7mL/min y unavelocidad lineal de 46,8 cm/min. El modo de inyeccin fue splitless (sin divisinde muestra). El programa de temperaturas ptimo se encuentra en la figuray tabla de la pgina 18.

El modo de recogida de datos en los distintos mtodos propuestos en estetrabajo fue sim, con una frecuencia de muestreo de 5Hz, adquiriendo datosdesde el minuto 10 hasta el 18. Los estudios previos de identificacin depicos fueron realizados en modo scan, con un muestreo de 2Hz y divisinde muestra 1:50.

La identificacin se realiza mediante el tiempo de retencin y tres relacionesm/z caractersticas para cada analito; un ion cuantificador (el ms abundan-


50

100

150

200

250

5 10 15

tiempo / min

T em

p er a

t ur a

/

C

Velocidad / C/min T objetivo / C Tiempo / min

40 7

30 140 1

40 270 5

te) y dos cualificadores. En la Tabla 2.1 se muestran los compuestos detecta-dos, los plaguicidas de los que provienen, las relaciones m/z escogidas, sustiempos de retencin y los intervalos de tiempo seleccionados.

La cuantificacin se realiza por el mtodo del patrn externo. Debido a lasvariaciones de intensidad del detector entre das es necesario hacer un cali-brado siempre que se analicen muestras.

2.3.2. Determinacin mediante cromatografa de gases yespectrometra de masas con microextraccin en fase slida

Las fibras nuevas o que llevan mucho tiempo sin usarse han de ser acon-dicionadas segn las instrucciones del fabricante, exponindolas como m-nimo durante 2h a 300 C en el inyector del cromatgrafo. Posteriormentese realizan ensayos en blanco hasta no obtener seales procedentes de lospegamentos empleados para fijar la fibra.

De una disolucin multicomponente de los plaguicidas convenientementediluida a partir de las disoluciones madre disponibles, se aaden 100L enun matraz aforado de 10,0mL, se adicionan 6,0mL de disolucin saturadade NaCl y se completa el aforo con agua ultrapura; la composicin resultan-

2.3. procedimientos 19

Tabla 2.1. Compuestos detectados, plaguicidas de los que provienen y relacio-nes m/z escogidas con sus abundancias relativas.

Plaguicida Compuesto detectado m/z ( %) tR / min Intervalo / min

AldicarbNitrilo de Aldicarb (1a)b 68(100), 100(53), 115(35) 10,6 10,011,1

No identificado (1) 86(100), 87(98), 100(22) 12,6 12,413,4

CarbetamidaIsocianato de fenilo (2)b 119(100), 91(83), 64(70) 11,6 11,511,8

Anilina (2) 93(100), 66(54) 11,9 11,812,4

Propoxur Isopropoxifenol (3) 110(100), 152(10), 81(10) 13,5 13,414,0

Carbofurano Fenol de Carbofurano (4) 164(100), 149(93), 103(37) 14,3 14,015,0

Carbarilo 1-Naftol (5) 144(100), 115(89), 89(17) 15,615,017,0

Metiocarb Fenol de Metiocarb (6) 168(100), 109(79), 153(70) 15,7

Pirimicarb Pirimicarb (7) 72(100), 166(44), 238(10) 17,4 17,018,0

a Para la identificacin de las seales vanse los cromatogramas de la Figura 3.1.b Compuesto elegido para cuantificar.

te es de 60% de disolucin saturada de NaCl y 1% de metanol. Los 10,0mLse transfieren a un vial que contiene una barra agitadora magntica en suinterior. El vial con la muestra se coloca en el interior de una camisa termos-tatada situada sobre un agitador magntico (Figura 2.2). Una vez perforadala tapa del vial con la aguja de spme, y puesto en funcionamiento el agita-dor, se expone la fibra a la disolucin, con cuidado de que sta no resultedaada por la barra magntica. Tras 2h de preconcentracin a 25 C, la fibrase retrae, se saca del vial y se expone durante 6,5min a 300 C en el inyectordel cromatgrafo de gases.

2.3.3. Determinacin mediante cromatografa de gases y espectrometra de masascon extraccin en fase slida y microextraccin en fase slida

250,0mL de muestra se hacen pasar con la ayuda de una bomba peristlticacon un caudal de 7mL/min por un cartucho de C18 acondicionado previamen-


te con 10,0mL de acetonitrilo y 10mL de agua. Tras el paso de la muestra,el cartucho se seca durante 5min aplicando vaco y los analitos se eluyencon 2,0mL de acetonitrilo directamente sobre el vial donde posteriormentese llevar a cabo la spme. El acetonitrilo se evapora con una corriente de ni-trgeno y el residuo se redisuelve con 8,0mL de una disolucin acuosa con60% (v/v) de disolucin saturada de NaCl. Al residuo redisuelto se le aplicala etapa de preconcentracin con spme indicada en la seccin 2.3.2.

2.3.4. Determinacin mediante cromatografa de gases yespectrometra de masas con extraccin en fase slida

250,0mL de muestra se preconcentran en un cartucho de spe como en laseccin 2.3.3. Los analitos retenidos se eluyen con 2,0mL de acetonitrilo y serecogen en un tubo de ensayo. El volumen recogido se evapora hasta seque-dad con la ayuda de una corriente de nitrgeno y el residuo se redisuelve en500L de acetonitrilo con ayuda del agitador de tubos durante 10 s. 1L deesta disolucin se inyecta en el cromatgrafo de gases.

3R E S U LTA D O S Y D I S C U S I N

3.1. comportamiento de plaguicidas carbmicosen cromatografa de gases

El objetivo de esta seccin es conocer el comportamiento en gc-ms de losplaguicidas carbmicos objeto de estudio (Carbofurano, Propoxur, Metio-carb, Carbarilo, Carbetamida, Aldicarb y Pirimicarb), as como establecer lascondiciones ptimas de resolucin y sensibilidad.

3.1.1. Identificacin de las seales cromatogrficas generadas por inyeccin directa

Trabajando con el detector en el modo scan, se inyect 1L de una disolu-cin de los 7 plaguicidas en metanol con una concentracin de 10mg/L paraidentificar por sus espectros de masas los picos obtenidos. El programa detemperatura fue: 40 C durante 10min. 5 C/min hasta 140 C (2min). 5 C/minhasta 210 C (2min). 7 C/min hasta 260 C (hasta 80min de anlisis). Tem-peratura de inyeccin: 270 C . El cromatograma obtenido se muestra en laFigura 3.1-A.

La Tabla 3.1 contiene todos los compuestos identificados en gc-ms confirma-dos por su espectro de masas, as como los plaguicidas de los que provieneny las etiquetas empleadas en los cromatogramas de esta parte de la memoria.

El Pirimicarb fue el nico de los plaguicidas del que se encontr el pico co-rrespondiente a su molcula sin descomponer (etiquetado como 7). Ademsde este pico se detecta el N,N-dimetil carbamato de metilo (7), cuya nicamolcula precursora puede ser el Pirimicarb.

21

22 resultados y discusin

A)

A 7

1

2

2

1

3 4

2

5

6

7

B)

1

3

4 5 67

1

2

2

1

2

2

1

34

5

6

3

47

5

6

2

C)

Figura 3.1. Cromatogramas en modo scan de los 7 plaguicidas estudiados enA) una columna muy usada cuando se inyectan disueltos en metanol,B) en una columna muy usada disueltos en acetato de etilo, yC) en una columna nueva disueltos en acetato de etilo.Concentracin: 10mg/L. Identificacin de los picos como en la Tabla 3.1

3.1. comportamiento de plaguicidas carbmicos en gc 23

Tabla3.1.

Com

pues

tos

iden

tific

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engc

-ms

ypl

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los

que

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El Aldicarb origin dos picos, uno de los cuales corresponde al nitrilo deAldicarb (1), y otra seal minoritaria identificada como Aldicarb por la bs-queda automtica de la base de datos de espectros, pero con un grado demuy bajo de concordancia, que posiblemente es un compuesto de descom-posicin no identificado (1).

La Carbetamida es precursora de isocianato de fenilo (2), anilina (2) y N-fenil carbamato de metilo (2).

Los plaguicidas con estructura de N-metil carbamatos de fenilo, Propoxur,Carbofurano, Carbarilo y Metiocarb, originaron seales identificadas por labase de datos como las molculas sin despomponer (37), a pesar de noposeer los iones moleculares. Segn algunos autores [18] los carbamatos defenilo se descomponen trmicamente para originar su forma fenlica, porello cabe esperar que stos sean los compuestos obtenidos. Para comprobaresta hiptesis se inyect una disolucin de 1-Naftol e Isopropoxifenol, y sepudo comprobar que las seales obtenidas coincidan en tR y espectro demasas con la inyeccin de Carbarilo y Propoxur, respectivamente.

Adems de los picos ya indicados, aparece un pico correspondiente a N-metil carbamato de metilo (etiquetado como A), cuyas posibles molculasprecursoras son aquellas con estructura de N-metil carbamatos (Aldicarb,Propoxur, Carbofurano, Carbarilo y Metiocarb), por su reaccin con el me-tanol. Este compuesto es anlogo a los obtenidos de la Carbetamida (N-fenilcarbamato de metilo) y del Pirimicarb (N,N-dimetil carbamato de metilo).

Influencia del disolvente

Debido a que se detectaron diversos compuestos (2, A y 7) como posiblesproductos de la reaccin de algunos de los analitos con el metanol, se realizun estudio utilizando acetato de etilo como disolvente. Para ello, se inyectuna disolucin con la misma concentracin (10mg/L) manteniendo el restode condiciones.

El cromatograma obtenido se representa en la Figura 3.1-B. Si se comparael cromatograma con el obtenido empleando metanol como disolvente seobserva que:


1. En la inyeccin directa de los 7 plaguicidas disueltos en acetato deetilo no se detectan las seales correspondientes al N-metil carbamatode metilo (A), N,N-dimetil carbamato de metilo (7) ni N-fenil carba-mato de metilo (2), lo que confirma que el metanol interviene en ladescomposicin de los analitos.

2. Las seales cromatogrficas de los productos de degradacin de losplaguicidas cuando la muestra se inyecta en acetato de etilo son supe-riores a los obtenidas cuando se inyectan en metanol.

3. La relacin de intensidades entre la seal del isocianato de fenilo (2) yla de la anilina (2) (ambos procedentes de la Carbetamida), es muchomayor cuando se utiliza acetato de etilo en la inyeccin.

Influencia del estado de la columna cromatogrfica

Segn lo observado, existen diferencias notables en el comportamiento delos compuestos entre una columna cromatogrfica nueva y una vieja.

Cuando se reemplaz la columna cromatogrfica, que haba sido usada in-tensamente durante dos aos para identificacin y anlisis de pureza deproductos de sntesis orgnica, se observ un cambio del comportamientode los analitos estudiados. La principal diferencia fue que en la columnanueva se detectaron los picos de los plaguicidas sin descomponer: Carbeta-mida (2), Propoxur (3), Carbofurano (4), Carbarilo (5) y Metiocarb (6),confirmados por la base de datos de espectros de masas.

La Figura 3.1-C muestra la inyeccin directa de 1L de los 7 plaguicidasdisueltos en acetato de etilo en una columna nueva.

La principal conclusin que se puede extraer de estos resultados es que losplaguicidas carbmicos no se degradan slo en la etapa de inyeccin, comopodra pensarse de los resultados obtenidos con la columna cromatogrfi-ca vieja. Con una columna muy usada, la porcin de plaguicida que no sedegrada en el inyector, lo hace en la columna. Este hecho es el responsablede la ausencia de los picos de las molculas enteras y de la peor morfologa(picos asimtricos) de sus productos de descomposicin. Santos et al. [18]


han comprobado tambin que el uso de columnas muy usadas favorece ladegradacin de compuestos trmicamente inestables.

El hecho de que las seales de los productos de degradacin se observensiempre, indica que estas seales son ms adecuadas para la cuantificacinde los plaguicidas con cualquier columna, independientemente de su gradode desgaste.

3.1.2. Reactividad de plaguicidas carbmicos en cromatografa de gases

De acuerdo con sus estructuras, los analitos estudiados pueden dividirse en4 grupos, cada uno con un comportamiento diferente segn el disolventeempleado:

Propoxur, Carbofurano, Carbarilo y Metiocarb son N-fenil carbamatosde fenilo. Santos et al. [18] concluyen que este tipo de compuestos sedescomponen mediante un reordenamiento de McLafferty para origi-nar el fenol y el isocianato de metilo. La presencia de N-metil carbama-to de metilo cuando el disolvente es metanol se explica por la reaccinde ste con el isocianato de metilo.

O

N

a

b

c

d

O

H

a

b

c

d

O

a

b

c

d

OH

+

O

C

NH

Plaguicidacarbmico

Fenol

calor

O

N

O

H

N-metil carbamato de metilo

CH3OH


El Pirimicarb tiene 2 grupos metilo unidos al nitrgeno del grupo car-bmico y no puede tener lugar el reordenamiento anterior. La forma-cin de N,N-dimetil carbamato de metilo cuando el disolvente es me-tanol sugiere una ruta alternativa de degradacin, que es minoritariaen los plaguicidas en los que s pueda tener lugar el reordenamiento.

N N

N

O

O

N

N N

N

OH

O

O

N

H3C OH++

PirimicarbN,N-dimetil carbamato de metilo

La estructura del Aldicarb corresponde a la de un carbamato de unaoxima y el producto de su descomposicin trmica es su correspon-diente nitrilo [17].

SN

O

O

NH SN

Aldicarb

calor

Nitrilo de Aldicarb

La Carbetamida tiene estructura de N-fenil carbamato y durante sudescomposicin origina principalmente isocianato de fenilo. El restode compuestos observados se deben a reacciones de ste que depen-den del disolvente empleado y el estado de la columna. El compuestodetectado mayoritario es el N-fenil carbamato de metilo cuando el di-solvente es metanol, y el isocianato de fenilo cuando se usa un disol-vente menos reactivo como el acetato de etilo. Tambin se forma anili-na, especialmente cuando se usa una columna muy gastada y existen


trazas de agua en el medio. Este comportamiento de la carbetamida essimilar al de otros plaguicidas de la familia de las fenilureas [54].

NHO

OO

HN

NH

OO

NC

O

NH2

Carbetamida

N-fenil carbamato de metilo

Isocianato de fenilo

Anilina

calor

H2O

CH3OH

3.2. preconcentracin mediantemicroextraccin en fase slida

3.2.1. Identificacin de las seales cromatogrficas generadasdespus de microextraccin en fase slida

El comportamiento en gc de compuestos trmicamente inestables es funcinde variables como el disolvente, el modo y la temperatura de inyecin, yel programa de temperaturas empleado. En un trabajo previo se ha podidocomprobar que las fenilureas, que tambin son trmicamente lbiles, puedendeterminarse mediante gc siempre que se utilice una etapa de preconcentra-cin con spme [54]. En dichas condiciones, la fragmentacin se produce deuna forma reproducible en la etapa de desorcin de los analitos de la fibra.A la vista de estos antecedentes, en este trabajo se ha estudiado el compor-tamiento cromatogrfico que presentan los analitos despus de haber sido

[54] R. Carabias-Martnez, C. Garca-Hermida, E. Rodrguez-Gonzalo, F. E. Soriano-Bravo, andJ. Hernndez-Mndez. Determination of herbicides, including thermally labile phenylu-reas, by spme and gc-ms. J. Chromatogr. A, 1002:112, 2003.

3.2. preconcentracin mediante spme 29

preconcentrados en una fibra de poliacrilato, y posteriorente desorbidos enel inyector de un cromatgrafo de gases.

Se inyect por triplicado 1L de una disolucin en acetato de etilo de los 7analitos y se compararon los resultados con los obtenidos tras efectuar unapreconcentracin mediante spme a una disolucin con las mismas concen-traciones durante 15min y desorber trmicamente los compuestos a 270 Cdurante 5min. La concentracin fue de 1mg/L excepto para Aldicarb y Car-barilo (8mg/L). El medio de preconcentracin fue una disolucin acuosa con1% de metanol y 20% de disolucin saturada de NaCl. La recogida de da-tos fue en modo sim con el ion ms caracterstico de cada compuesto paraaumentar la sensibilidad y disminuir el ruido.

En las Figuras 3.2-A y 3.2-B se muestran los cromatogramas obtenidos coninyeccin directa y despus de la preconcentracin, respectivamente. En laTabla 3.2 se muestran las reas de los picos obtenidos y la variacin en tantopor ciento entre las seales de los compuestos preconcentrados y sin precon-centrar.

Tabla 3.2. reas de pico mediante inyeccin directa y previa spme para la misma con-centracin de plaguicidas.

Plaguicida Compuesto detectado m/z rea / 104 c s

(Iny. directa)rea / 104 c s

(spme)Variacin ( %)

Aldicarb Nitrilo de Aldicarb (1) 100 56 46 17

CarbetamidaIsocianato de fenilo (2) 119 9,6 1,7 83

Anilina (2) 93 1,7 15 773

Propoxur Isopropoxifenol (3) 110 4,3 129 2015

Carbofurano Fenol de Carbofurano (4) 164 6,9 35 413

Carbarilo 1-Naftol (5) 144 142 Saturado

Metiocarb Fenol de Metiocarb (6) 168 11 162 1401

Pirimicarb Pirimicarb (7) 166 35 21 41


2

1

2

3

4

5

6

7

1

2

2

3

4

5

67

A)

B)

Figura 3.2. Cromatogramas en modo sim de la misma concentracin de plagui-cidasA) mediante inyeccin directa, yB) tras spme (15min de preconcentracin).Identificacin de los picos en Tabla 3.2


Los analitos con una preconcentracin ms favorable son los carbamatos defenilo, especialmente el Metiocarb, que es el menos polar de los estudia-dos. Adems del aumento de sensibilidad, se aprecia para estos analitos unamejora notable de la forma de pico debido a su descomposicin durante ladesorcin de la fibra en lugar de durante su elucin en la columna. Cuandose inyectan los plaguicidas directamente se obtienen unas acusadas asime-tras de los picos de 1-Naftol y fenol de Carbofurano, procedentes de Propo-xur y Carbofurano, respectivamente, hecho que dificulta la cuantificacin deestos compuestos (Figuras 3.2 y 3.3).

En la Figura 3.4 se muestra la comparacin de los picos obtenidos para lostres analitos que presentan menor sensibilidad con spme que con inyeccindirecta: Aldicarb, Carbetamida y Pirimicarb. El analito con peor preconcen-tracin ha sido el Aldicarb, que es a su vez el plaguicida ms polar. Por otraparte, no es posible conocer exactamente el grado de preconcentracin de laCarbetamida, ya que se descompone en dos compuestos (anilina e isociana-to de fenilo) que se encuentran en diferentes proporciones segn el medioempleado (Figura 3.4-B); la formacin de anilina es mayoritaria en presenciade agua (spme).

B

SPME

Inyeccin directa

A

SPME

Inyeccin directa

Figura 3.3. Comparacin de los picos con inyeccin directa y mediante spme deA) Propoxur, yB) Carbofurano.


C)

A)

B)

SPME

SPME

SPME

Inyeccin directa

Inyeccin directa

Inyeccin directa

Inyeccin directa

SPME

Isocianato de fenilo

Anilina

Figura 3.4. Superposicin de los picos procedentesA) del Aldicarb,B) la Carbetamida, yC) el Pirimicarb cuando se inyectan directamente y mediante spme.


3.2.2. Optimizacin del proceso de microextraccin en fase slida

La etapa de preconcentracin mediante spme fue optimizada por medio deuna estrategia secuencial de experimentos. En general, una optimizacinbien diseada necesita estudiar todos los factores simultneamente para lacomprensin de todos los efectos e interacciones, y adems mantener el n-mero de experimentos al mnimo. Existen varios trabajos publicados dondese ha optimizado los parmetros que afectan a la extraccin y desorcinde analitos en un fibra de spme por medio de un diseo de experimentos[55, 56, 57]. El diseo de experimentos tambin se ha aplicado a la extrac-cin de plaguicidas mediante spme en muestras ambientales [58, 59].

En este caso, se realiz una etapa de criba de factores (diseo factorial frac-cionado a 2 niveles) y un posterior diseo de superficie de respuesta de tresniveles. Las respuestas evaluada han sido ls reas de pico de cada analito.

Diseo factorial fraccionado

En primer lugar, para establecer qu factores son significativos y qu nivelesescoger en diseos posteriores ms exhaustivos, se realiz un diseo inicialcon las variables ms influyentes: temperatura de extraccin, fuerza inica,tiempo de extraccin y temperatura de desorcin.

[55] J. Salafranca, C. Domeo, C. Fernndez, and C. Nern. Experimental design applied tothe determination of several contaminants in Duero River by spme. Anal. Chim. Acta,477:257267, 2003.

[56] J. C. Penteado, R. E. Bruns, and L. R. F. de Carvalho. Factorial design optimization ofspme conditons for gc-ms analysis of linear alkylbenzenes in detergents. Anal. Chim.Acta, 562:152157, 2006.

[57] Y. Zhou, Q. Jiang, Q. Peng, D. Xuan, and W. Qu. Development of a spme-gc-ms methodfor the determination of pentachlorophenol in human plasma using experimental design.Chemosphere, 70:256262, 2007.

[58] V. Casas, M. Llompart, C. Garca-Jares, R. Cela, and T. Dagnac. Multivariate optimizationof the factors influencing the spme of pyrethroid pesticides in water. J. Chromatogr. A,1124:148156, 2006.

[59] A. Bouaid, L. Ramos, M. J. Gonzalez, P. Fernndez, and C. Cmara. spme method for thedetermination of atrazine and four organophosphorus pesticides in soil samples by gc. J.Chromatogr. A, 939:1321, 2001.


Del factor tiempo de preconcentracin se sabe de antemano que siempreva a ser positivo, ya que la cantidad de analito extrada siempre aumenta conel tiempo hasta alcanzar un equilibrio. El hecho de incluir dicho factor enestos diseos tiene por objeto comprobar que no hay interacciones entre l ylos dems factores, esto es, que el resto de variables influyan en la respuestade manera independiente del tiempo empleado en la preconcentracin.

El diseo escogido fue un diseo factorial fraccionado con 2 niveles para ca-da factor y 8 experimentos (241) ms dos centros para evaluar la curvaturay el fallo de ajuste.

Los diseos con dos niveles slo permiten calcular relaciones lineales entrelos factores y la respuesta; sin embargo, no es posible comprobar si hay com-ponentes no lineales (cuadrticas, por ejemplo). Si se sospecha que la relacinno es lineal, se puede efectuar una prueba de curvatura, incluyendo uno oms experimentos en los que todos los factores estn fijados en un valor in-termedio. Tales experimentos se llaman centros, ya que estn literalmente enel centro del diseo. Tras efectuar el anlisis de los datos obtenidos, se com-para la respuesta en estos puntos centrales con el valor medio del resto deldiseo; si la media de las respuestas en el centro del diseo es significativa-mente diferente de la media del resto de experimentos del diseo, entonceshay razones para creer que la suposicin de una relacin lineal entre factoresy respuesta no es cierta.

Por otra parte, el hecho de que existan medidas replicadas permite haceruna estimacin de la significacin del fallo de ajuste. La variabilidad de es-tas rplicas da informacin del error aleatorio de las medidas, y por tanto,permite separar el error experimental en sus dos componentes: el error de-bido a la variacin aleatoria, llamado error puro, y el error debido al fallo deajuste. Estas dos componentes se comparan mediante una prueba estadsti-ca F. Si el error debido al fallo de ajuste no resulta ser significativo (con unaprobabilidad mayor del 5%) no hay suficiente evidencia para concluir quehay fallo de ajuste. Es decir, se comprueba si la relacin entre la respuesta ylos factores queda descrita adecuadamente por el modelo propuesto, o bienhay certeza para decir que faltan trminos que necesitan ser incluidos en elmodelo.


Debido a que cada factor tiene unas unidades y oscila entre niveles dife-rentes, y para poder comparar ms fcilmente los efectos, los coeficientes secalculan con los factores expresados en unidades codificadas (1 para losniveles bajos y 1 para los niveles altos). Los coeficientes as estimados re-presentan el cambio en la respuesta cuando cada factor vara de 0 a 1 enunidades codificadas, mientras los otros factores permanecen en sus nivelesintermedios. Tambin se pueden expresar los efectos de cada factor estiman-do el cambio en la respuesta cuando cada factor oscila entre sus nivelesmnimo y mximo.

La Tabla 3.3 muestra los niveles escogidos de cada factor y el efecto encon-trado para cada uno (calculado con los factores codificados). Para establecerqu efectos se consideran significativos se ha determinado la desviacin es-tndar de cada efecto y se ha multiplicado por la t de Student para unasignificacin del 5%. De esta manera se conocen los intervalos de confian-za de los efectos. Otra forma de establecer objetivamente qu efectos sonsignificativos es mediante un anlisis de varianza. De este modo es posibleconocer si el modelo propuesto explica la variabilidad de la respuesta, y, encaso afirmativo saber qu probabilidad tiene cada efecto de ser significativo.Se considera que si la probabilidad de un efecto es menor del 5% (p calcula-do menor de 0,05 ), ste explica ms de la variabilidad de la respuesta de laque podra esperarse de fenmenos aleatorios.

En todos los casos la probabilidad de fallo de juste es superior a 0,05. Estosresultados indican que la spme de todos los plaguicidas se puede explicarcon modelos sencillos en los que no es necesario incluir los efectos debidos ainteracciones de dos factores. Los coeficientes de correlacin son superioresa 0,93 excepto el de la Carbetamida (0,84). Para este compuesto los intervalosde confianza son mayores debido a la falta de reproducibilidad en la relacinde las seales procedentes de este plaguicida (anilina e isocianato de fenilo).Por este motivo, este analito no se ha incluido en estudios posteriores deoptimizacin.

Se puede observar que la temperatura de extraccin es una variable signifi-cativa para todos los analitos excepto el Carbarilo. La fuerza inica ejerce unefecto significativo en la extraccin de Aldicarb, Carbofurano y Pirimicarb.El tiempo de extraccin, como es previsible, influye positivamente en la se-


Tabla3.3.

Diseo

factorialfraccionado.Efectos

como

coeficientesde

regresinde

losfactores

codificados.Ennegrita

losefectos

significativos.

Efecto(p) a

/10

5cuentas

s

Factor(nivelbajonivelalto)

Aldicarb

Carbetam

idaPropoxur

Carbofurano

Carbarilo

Metiocarb

Pirimicarb

Temperatura

deextraccin

(2550C

)20

56

414

610

31

13

221

7

(0,0002)(0,0233)

(0,0014)(0,0005)

(0,1639)(0,0434)

(0,0005)

Fuerzainica

(0,510%

b)8

52

45

64

30

12

28

7

(0,0131)(0,4317)

(0,0697)(0,0247)

(0,5091)(0,0628)

(0,0246)

Tiempo

deextraccin

(1060m

in)25

56

414

610

33

17

217

7

( tR() en la fase C30. Este comportamiento confirmala participacin de mecanismos de retencin adicionales a los puramentehidrofbicos, que predominan en la fase C30.


C30

5 10 15 20

2 4 6 8 10 12

1000

A

1000

A

Tiempo/ min

Tiempo / min

100

200

100

200

Tiourea

-TO

H

-TO

H

-TO

H

-TO

H

Tiourea

-TO

H

-TO

H-TO

H

-TO

H

Ultima C18

Figura 7.6. Separacin de , , y tocoferoles con las fases estacionarias,ULTIMA C18 y C30. Fase mvil: Tris 5mm en metanol. Separacin a 30kV,30 C.

7.1. separacin con columnas empaquetadas 93

En un intento de conseguir una separacin ms efectiva de los 4 tocoferolesen la fase ULTIMA C18, se aument gradualmente el contenido de aguaen una fase mvil de metanol. Se consigui una buena separacin de los 4compuestos (Rs(,) = 1,2) en un tiempo razonable (menos de 30min) conuna fase mvil compuesta por 95/5 (metanol/agua, v/v). Hay que sealarque la adicin de un pequeo porcentaje de agua mejora la resolucin perotriplica los tiempos de retencin. Un ejemplo de la separacin se muestra enla Figura 7.7.

1 00 0

A

Tiourea

-T O

H

Tiempo / min

-T O

H -

T OH

-T O

H

0

50

100

150

200

250

5 10 15 20 25

Figura 7.7. Separacin de , , y tocoferoles en la fase estacionaria ULTIMAC18 empleando una fase mvil compuesta por 95/5 (metanol/agua, v/v) yTris 5mm. Resto de condiciones como en la Figura 7.6.

Selectivad de la fase estacionaria ULTIMA C18

El ismero -tocoferol parece ser ms polar que el -tocoferol, ya que esteltimo es retenido ms fuertemente en la fase de C30, donde el mecanismode retencin corresponde nicamente a interacciones hidrofbicas. Estos re-sultados estn de acuerdo con los ya publicados [124]. El orden de retencinencontrado en la fase estacionaria con grupos polares incrustados es el in-verso para estos dos compuestos. Este mismo orden (tR() > tR()) ha sido


encontrado por Richheimer et al. [130] en la separacin mediante hplc confase inversa en una columna de slice enlazada a pentafluorofenilo (pfps).Abidi et al. han publicado el mismo orden de elucin en fases estaciona-rias de octadecilo con alcohol polivinlico (odpva) y pfps en separacionesmediante hplc y cec [119, 125].

La caracterstica que tienen en comn estas fases estacionarias de fase inversa(pfps, odpva y ULTIMA C18), en las que el orden de elucin es tR() >tR(), es que todas ellas presentan algn tipo de grupo polar. Debe tenerseen cuenta que este orden de elucin es el tradicionalmente observado paraestos dos ismeros cuando se separan por medio de hplc en fase normal encolumnas de slice. Segn esto, la retencin de las formas y parece estarrelacionada con su facilidad de interaccin con los grupos polares de estasfases estacionarias.

La posicin de los grupos metilo en el anillo aromtico es lo que distingueambos ismeros (Figura 5.2, pg. 69). En el -tocoferol estn en posicinpara (en las posiciones 5 y 8 del grupo cromanol), y actan como un escu-do, proteguiendo la zona polar de la molcula (grupo -OH), favoreciendo suhidrofobicidad; por ello, posiblemente el -tocoferol presenta mayores tiem-pos de retencin en la columna C30. Este efecto protector podra dificultar lainteracin del ismero con el grupo amido de la fase estacionaria ULTIMAC18, y por lo tanto su retencin en esta columna no estara favorecida. Porel contrario, el -tocoferol tiene los dos grupos metilo en las posiciones 7 y8 (posicin orto), de tal manera que el efecto protector no tiene lugar, sinoque la formacin de puentes de hidrgeno con el nitrgeno del grupo amidode la fase estacionaria se ve favorecida, explicando sus mayores tiempos deretencin respecto al ismero en este tipo de columnas.

[130] S. L. Richheimer, M. C. Kent, and M. W. Bernart. rp high-performance liquid chromato-graphic method using a pentafluorophenyl bonded phase for analysis of tocopherols. J.Chromatogr. A, 677:7580, 1994.

7.1. separacin con columnas empaquetadas 95

7.1.3. Conclusiones

Se ha estudiado la separacin de tocoferoles mediante cec en una fase es-tacionaria con un grupo polar amido situado en medio de una cadena hi-drocarbonada, llamada ULTIMA C18, y se han comparado los resultadosobtenidos con los que presentan los tocoferoles empleando fases estaciona-rias alqulicas lineales de C18 y C30.

Efecto de la composicin de la fase mvil en medios no acuosos

El comportamiento de todas las fases estacionarias investigadas fue evaluadocon diferentes fases mviles compuestas de acetonitrilo, metanol y mezclasde ambos. Fueron evaluados parmetros tales como los factores de retencin,eficacia y resolucin en la separacin de los tocoferoles , y .

Se obtuvieron unas buenas separacin y resolucin de los tres compuestoscon las tres fases estacionarias empleando metanol y Tris 5mm como fasemvil. Con las fases estacionarias de C18 y C30 la adicin de acetonitrilo a lafase mvil implica un aumento de los tiempos de retencin de los analitos,sin apenas modificar el resto de las caractersticas de la separacin. Sin em-bargo, cuando se emplea la fase estacionaria ULTIMA C18, porcentajes deacetonitrilo superiores al 50% dan como resultado una prdida notable deresolucin y eficacia.

Separacin de los ismeros y en una fase estacionariacon grupos polares incrustados

Tanto la fase estacionaria de C30 como la ULTIMA C18 mostraron selectivi-dad suficiente para la separacin de los ismeros de posicin y . Sin em-bargo, el orden de elucin de estos dos compuestos se invierte: tR() > tR()en la fase ULTIMA C18, y tR() > tR() en la fase C30. El orden de sepa-racin en la columna de C30 se debe a un reparto debido a interaccioneshidrofbicas exclusivamente.

La fase estacionaria ULTIMA C18 consigue para este par de compuestosunos tiempos de retencin, resolucin y selectividad mayores que los obte-


nidos en fases de C18 convencionales, debido a la participacin de interac-ciones polares entre el grupo amido de la fase estacionaria y el grupo -OHde los tocoferoles. El incremento de la selectividad parece estar relacionadocon la accesibilidad de la parte polar de los analitos para interaccionar conlos grupos polares (grupos amido) de la fase estacionaria.

En este trabajo se ha demostrado que trabajando con la fases estacionaria congrupos polares incrustados ULTIMA C18 y una fase mvil compuesta pormetanol/agua (95/5, v/v) y Tris 5mm se obtiene una separacin adecuadade los cuatro tocoferoles mediante cec.

7.2. separacin en columnas polimricas monolticas 97

7.2. separacin de tocoferoles en columnaspolimricas monolticas

7.2.1. Optimizacin de la fabricacin de las columnas

Inicialmente se realizaron diversos estudios previos empleando como mon-meros el cido metacrclico y sus steres, y utilizando distintos disolventesporognicos (tolueno, diferentes mezclas de alcoholes, acetonitrilo, agua...).Tras varios ensayos que dieron lugar a monolitos no permeables durante laetapa de lavado, se decidi seguir trabajando con metacrilato de butilo (bma)como monmero principal, dimetacrilato de etileno (egdma) como comon-mero entrecruzador y amps como monmero cargado capaz de generar flujoelectroosmtico (eof), y una mezcla ternaria de 1,4-butanodiol, 1-propanol yagua, como disolvente porognico. Ya se ha comentado que variando la com-posicin de esta mezcla se pueden controlar con precisin caractersticas dela fase estacionaria como porosidad y superficie especfica [131, 83, 94, 95].

Influencia del tipo de polimerizacin

En los datos encontrados en bibliografa el tiempo de polimerizacin trmicaoscila entre 16 y 24 horas [83, 94, 95, 132, 133, 134, 131]. En las primeras co-lumnas, tiempos tan prolongados de polimerizacin dieron como resultadocolumnas poco permeables e imposibles de lavar con una bomba de hplca 400 bar. Debido a ello, se eligi interrumpir la polimerizacin tras 60minde reaccin, controlando el tiempo de un modo preciso para no perder re-producibilidad. En este trabajo se han utilizado los monmeros tal cual se

[131] T. Jiang, J. Jiskra, H. A. Claessens, and C. A. Cramers. Preparation and characterizationof monolithic polymer columns for cec. J. Chromatogr. A, 923:215227, 2001.

[132] J. K. Adu, S. S. Lau, D. G. Watson, M. R. Euerby, G. G. Skellern, and J. N. Tettey. Cec of the-rapeutic peptides on mixed-mode butylmethacrylate monoliths. Electrophoresis, 26:344551, 2005.

[133] G. S. Chirica and V. T. Remcho. Fritless capillary columns for hplc and cec prepared byimmobilizing the stationary phase in an organic polymer matrix. Anal. Chem., 72:360510,2000.

[134] B. Buszewski and M. Szumski. Study of bed homogenity of methacrylate-based monoli-thic columns for -hplc and cec. Chromatographia, 60:261267, 2004.


obtuvieron del distribuidor, sin ninguna etapa de purificacin para eliminarlos aditivos que normalmente se aaden para prolongar su conservacin;posiblemente debido a ello los resultados obtenidos en este trabajo no coin-cidan exactamente con los descritos en bibliografa.

Con el fin de comparar sus caractersticas electrocromatogrficas, los pol-meros se sintetizaron tanto trmicamente como con radiacin uv. Las condi-ciones de polimerizacin fueron las siguientes:

Polimerizacin trmica: bao termostatado a 60 C durante 60min.

Polimerizacin uv: cmara de 10L recubierta internamente con papelde aluminio y cerrada completamente salvo una abertura que coincideen tamao con la ventana de la lmpara uv (8W, 254nm). Polimeriza-cin a temperatura ambiente durante 16h.

Las columnas polimricas obtenidas con radiacin uv resultaron poco homo-gneas, con fragmentos muy porosos, acompaados de otros muy compactosy de partes sin polimerizar. Esto es debido, posiblemente, a que la polime-rizacin no ha tenido lugar en un fotoreactor adecuado, y a que la lmparaempleada tiene poca potencia.

Adems, se pudo apreciar en los primeros cromatogramas una mayor reten-cin y eficacia en las columnas polimerizadas trmicamente. Un ejemplo delas dos separaciones obtenidas con polmeros generados mediante radiacinuv y mediante iniciacin trmica se muestran en la Figura 7.8.

Derivatizacin de la pared del capilar

En las primeras columnas fabricadas se pudo comprobar que si el polme-ro era poco permeable, el monolito se desplazaba en la etapa de lavado eincluso poda llegar a ser expulsado del capilar. Por ello, antes de la etapade polimerizacin fue necesario tratar el interior del capilar con un reactivobifuncional (-maps) que en primer lugar se une a los grupos silanol de lapared, para ms tarde participar en la reaccin de polimerizacin y fijar elpolmero al capilar. En la Seccin 6.3.2 (pg. 80) y en la Figura 7.9 se describeel procedimiento de derivatizacin de la pared usando este reactivo.


tiempo / min

tiourea

-TOH -TOH

2 4 6

A)

-TOH

-TOH

B)

10 20

tiourea

Figura 7.8. Comparacin de los cromatogramas obtenidos con inicio de la po-limerizacin mediante A) una lmpara uv, y B) trmicamente. Fase mvil:acetonitrilo/Tris 10mm, 80/20. Voltaje de separacin: 30kV, longitud efecti-va: 10 cm.

SiO2

OH

OH

OHOCH3

Si

OO

H3COOCH3

+ SiO2 O Si O

O

OCH3

OCH3

OH

OH

+ CH3OH

SiO2 O Si O

O

OH

OH

OH

OH

+ 2 CH3OH

+ 2 H2O

SiO2 O Si O

O

OH

OH

OH

OH

OO

+ (n+1)SiO2 O Si O

O

OH

OH

OH

OH

O O O O

n

Figura 7.9. Proceso de derivatizacin de la pared interna del capilar de slicecon -maps.


En la Figura 7.10 se muestran las microfotografas realizadas mediante mi-croscopa electrnica de barrido (sem) a capilares derivatizados y sin deriva-tizar. Se puede observar cmo en la columna sin ningn tipo de tratamientoel monolito est separado de la pared del capilar debido a la contraccinque sufre durante la polimerizacin, mientras que en las paredes tratadas,el polmero queda perfectamente alineado con el corte debido a la adhesinde la fase estacionaria, adems de observarse el recubrimiento de la paredinterna.

Estudio de porosidad

Se ha comprobado que una de las variables que ms influyen en la efica-cia de las columnas es la fraccin de disolvente porognico presente en lamezcla total. Se mantuvieron constantes tanto la composicin de disolventescomo la de monmeros, pero variando la relacin entre ellas. Los resulta-dos obtenidos indican que, en general, cuando el porcentaje de disolvente esmayor se obtienen polmeros con poros de mayor tamao, y por tanto conmenor eficacia en las separaciones (Tabla 7.2).

Tabla 7.2. Relacin entre la canti-dad de disolvente porognico yeficacia.

Disolvente ( %) Eficacia / 103 platos/m

77 35

60 1030

54 5090

Cuando se observan las microfotografas obtenidas mediante sem (Figu-ra 7.11) se puede ver que una variacin entre el 60% y el 50% de disolventeporognico tiene una gran influencia en la morfologa del polmero. Se ad-vierte cmo los huecos son mayores y menos homogneos en las columnasobtenidas con mayor porcentaje de disolvente porognico mientras que losporos son menores y la superficie especfica es mucho mayor cuando se tra-


500

01

000

100

0

4 m

20

m20

m

Sin -

MAP

S

Pare

d tr

atad

a co

n -

MAP

S

Figu

ra7.10.

Com

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opr

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-maps

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.


5 0 0 0

4 m

5 0 0 0

4 m

5 4 % , p / p6 0 % , p / p

5 0 % , p / p 5 0 0 0

4 m

Figura7.11.

Microfotografas

semtom

adasa

seccionesde

monolito

obtenidosem

pleandodiferentes

porcentajesde

disolventeporognico

enla

mezcla

inicial.


baja con menor porcentaje de disolvente. Por estas razones, en los siguientesestudios se utiliz la menor fraccin de disolvente porognico posible quepermiti un fcil lavado del polmero y un paso adecuado de la corrienteelctrica.

Influencia de la longitud de fase estacionaria

Se ensayaron longitudes efectivas de columna de entre 5 y 24,5 cm. Se com-prob que con la longitud estndar para columnas de cec de 24,5 cm lostiempos de retencin fueron excesivamente largos (en ocasiones de hasta90min para el -tocoferol) y no reproducibles. Adems hay que indicar queestas columnas son muy difciles de lavar y proporcionan un eof y unacorriente inestables. Los tiempos de retencin, forma de los picos y la re-producibilidad se mejoraron cuando se trabaj con longitudes menores. LaFigura 7.12 muestra un ejemplo de las separaciones obtenidas con una longi-tud de fase estacionaria de 30 cm y de 5 cm. Con estas columnas fue necesariomodificar la composicin de fase mvil necesaria para conseguir una buenaseparacin de los tres tocoferoles principales. A la vista de estos resultadosse continu trabajando con capilares rellenos co

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