radiopharmacy.net doctoral JLGP.pdf · 2012-09-06 · Índice i 1....
148
UNIVERSIDAD DE CÁDIZ FACULTAD DE MEDICINA Estudio de las mutaciones somáticas en los genes IgV H 3 de células plasmáticas humanas de diferentes territorios Tesis doctoral Jesús Luis Gómez Perales
Transcript of radiopharmacy.net doctoral JLGP.pdf · 2012-09-06 · Índice i 1....
UNIVERSIDAD DE CÁDIZ
FACULTAD DE MEDICINA
Estudio de las mutaciones somáticas en
los genes IgV H3 de células plasmáticas
humanas de diferentes territorios
Tesis doctoral
Jesús Luis Gómez Perales
Índice
i
1. Abreviaturas.....................................................................................................1
2. Introducción.....................................................................................................3
2.1 El sistema inmune........................................................................................4
2.1.1 Antígenos ............................................................................................... 5
2.1.2 Células y órganos del sistema inmune ........................................................ 6
2.1.2.1 Células del sistema inmune ................................................................. 6
2.1.2.2 Tejidos y órganos del sistema inmune ................................................... 9
2.1.3 Inmunidad humoral ................................................................................10
2.2 Los anticuerpos .........................................................................................11
2.2.1 Estructura de las inmunoglobulinas ...........................................................12
2.2.2 Heterogeneidad de las inmunoglobulinas....................................................15
2.2.2.1 Variedad isotípica..............................................................................15
2.2.2.2 Variedad alotípica..............................................................................18
2.2.2.3 Variedad idiotípica.............................................................................18
2.3 Ontogenia de los linfocitos B: Bases genéticas de la diversidad y
especificidad de los anticuerpos ......................................................................19
2.3.1 Ontogenia de los linfocitos B: Recombinación somática ................................20
2.3.2 Maduración periférica de los linfocitos B: cambio de isotipo e hipermutación
somática .......................................................................................................26
2.3.2.1 Distribución de las mutaciones somáticas .............................................29
2.3.2.2 Mecanismos moleculares de la hipermutación somática...........................33
2.3.3 Selección por Ag en los centros germinales ................................................35
2.4 Células plasmáticas ...................................................................................36
3. Objetivos ........................................................................................................40
4. Materiales y métodos .....................................................................................43
4.1 Metodología ...............................................................................................44
4.2 Purificación de células plasmáticas humanas ............................................45
4.2.1 Purificación de células plasmáticas de amígdala ..........................................45
4.2.2 Purificación de células plasmáticas de sangre periférica ................................46
4.3 Purificación de ARN total a partir células plasmáticas ...............................46
4.4 Síntesis de ADN complementario a partir de ARN total ..............................47
4.5 Amplificación del ADNc ..............................................................................47
4.5.1 Amplificación por PCR..............................................................................48
4.5.1.1 Diseño de los cebadores.....................................................................48
Abreviaturas
ii
4.5.1.2 Condiciones de la PCR........................................................................50
4.5.2 Purificación de ADN.................................................................................51
4.5.2.1 Purificación de ADN a partir de disoluciones ..........................................51
4.5.2.2 Purificación de ADN a partir de geles de agarosa....................................51
4.5.3 Clonación celular del ADNc.......................................................................52
4.5.3.1 Formación de la molécula de ADN recombinante ....................................52
4.5.3.2 Digestión de fragmentos amplificados de ADN con XbaI ..........................54
4.5.3.3 Preparación del vector .......................................................................54
4.5.3.4 Ligación del plásmido con el ADN ........................................................56
4.5.3.5 Transformación.................................................................................58
4.5.3.6 Selección de células que han incorporado moléculas de ADNr ..................58
4.5.3.7 Extracción del ADN plasmídico: minipreps.............................................58
4.5.3.8 Verificación de los clones....................................................................59
4.6 Secuenciación del ADN ..............................................................................60
4.6.1 Reacción de secuenciación .......................................................................60
4.6.2 Purificación de ADN por precipitación.........................................................61
4.6.3 Secuenciación automática de ADN.............................................................62
4.7 Análisis y procesamiento informático de los datos.....................................63
4.7.1. Identificación de las secuencias de la línea germinal ...................................63
4.7.2. Análisis de la SHM con la aplicación “IgDSM 1.0”........................................63
4.7.3. Parámetros de interés en los estudios de SHM ...........................................64
4.8 Análisis estadístico ....................................................................................68
4.9 Materiales..................................................................................................69
5. Resultados......................................................................................................74
5.1 La aplicación IgDSM en el análisis de la SHM.............................................75
5.2 Frecuencia de mutaciones en las regiones de IgV......................................80
5.3 Comparación de la SHM en secuencias IgVH3 obtenidas de CPADM y CPADC ..82
5.4 Comparación de la SHM en secuencias IgVH3 obtenidas de diferentes
isotipos en amígdala........................................................................................86
5.5 Comparación de la SHM entre diferentes isotipos de Ig en secuencias IgVH3
de CP de sangre...............................................................................................88
5.6 Comparación de la SHM en secuencias IgVH3 de CP de amígdala y sangre.90
5.7 Efecto del número total de mutaciones somáticas (R+S) sobre la
distribución de las mutaciones ........................................................................95
Abreviaturas
iii
5.8 Probabilidades de distribución de las mutaciones R...................................98
5.9 Análisis de la SHM según el nucleótido mutado .........................................98
5.10 Análisis de segmentos JH y D..................................................................101
5.11 Análisis comparativo de la longitud de CDR3 .........................................103
5.12 Análisis de la frecuencia de utilización de las subfamilias de genes VH3 104
5.13 Análisis de inserciones y deleciones ......................................................107
6. Discusión......................................................................................................108
6.1 La aplicación informática IgDSM facilita los estudios de SHM..................109
6.2 SHM en VH3 de CP. No existen diferencias mutacionales en VH3 entre CPADM
y CPADC ...........................................................................................................111
6.3 Existen diferencias en los patrones mutacionales de IgVH3 de CP entre
isotipos en amígdala y, en menor extensión, en sangre.................................112
6.4 Diferencias en los patrones mutacionales de IgVH3 entre CPA y CPSP .......113
6.5 La frecuencia de mutaciones varía con el tejido considerado...................115
6.6 La región más mutada de los segmentos VH3 es CDR1.............................116
6.7 R/S vs maduración de la afinidad ............................................................117
6.8 Probabilidades de distribución: SHM vs selección antigénica...................120
6.9 Preferencias en la sustitución de nucleótidos ..........................................121
6.10 Uso sesgado de los segmentos D y JH ....................................................124
6.11 Longitud del segmento CDR3 .................................................................125
6.12 Uso sesgado de los 22 miembros de VH3................................................127
6.13 Inserciones y deleciones son esporádicas en la SHM .............................128
7. Conclusiones ................................................................................................129
8. Bibliografía ...................................................................................................132
Abreviaturas
1
1. Abreviaturas
Abreviaturas
2
Éstas son algunas de las abreviaturas más utilizadas en este estudio. En la medida de
lo posible se han utilizado las siglas en castellano, salvo para aquellos términos
ampliamente asentados en su versión inglesa:
aa aminoácido
Ac anticuerpo
ADC amígdala disgregada con colagenasa
ADN ácido desoxirribonucleico
ADNc ADN complementario
Ag antígeno
ADM amígdala disgregada mecánicamente
ARN ácido ribonucleico
CDR región determinante de la complementariedad (Complementary Determining
Regions),
CP célula plasmática
CSR recombinación para el cambio de isotipo (class switch recombination)
dNTPs 2'-desoxirribonucleótidos-5'-trifosfato
EDTA ácido etilendiaminotetraacético
EtOH etanol
FACS separación celular por fluorescencia activada (fluorescence activated cell
sorting)
FR región marco (Framework Region)
LP lámina propia
MHC complejo principal de histocompatibilidad (major histocompatibility complex)
mhs mutaciones en hotspots
MO médula ósea
pb pares de bases
pBK vector plasmídico Bluescript
R mutaciones reemplazantes
PCR reacción en cadena de la polimerasa (polymerase chain reaction)
S mutaciones silentes
SEM error estándar de la media (standard error of mean)
SHM hipermutación somática (somatic hypermutation)
SP sangre periférica
TCR receptor de linfocito T (T cell receptor)
X-Gal 5-Bromo-4-cloro-3-indoil-β-D-galactopiranósido
Introducción
3
2. Introducción
Introducción
4
2.1 El sistema inmune
Todos los organismos están continuamente sujetos a ataques de otros
organismos. En respuesta a los predadores, los animales han desarrollado una
enorme variedad de estrategias defensivas. Sin embargo, el ataque por parte de
microorganismos y virus patógenos constituye una amenaza más insidiosa. Para
defenderse de ellos los organismos superiores han desarrollado un elaborado
sistema de protección conocido como sistema inmune (del latín, immunis: exento),
que tiende a distinguir lo propio de lo extraño, y que se encarga de destruir a los
patógenos que logran romper la primera línea de defensa. Dicha línea defensiva
está formada por una serie de obstáculos a la infección: barreras físicas (piel y
membranas mucosas), factores químicos (el bajo pH de la secreción gástrica, el
manto ácido que cubre la superficie de la piel, la lisozima presente en las lágrimas y
la saliva), fisiológicos (permeabilidad de los orificios y conductos naturales, flujo
normal de las secreciones). Cuando fracasan los mencionados obstáculos, o cuando
su acción es insuficiente, entran en acción otros mecanismos defensivos que dan
lugar a las dos formas de inmunidad conocidas clásicamente como innata y
adquirida.1
La inmunidad innata, constitutiva o inespecífica, constituye la respuesta
protectora inicial frente a las infecciones, actúa indistintamente frente a agresores
diferentes y existe antes e independientemente de la presencia del agente
infeccioso o sus productos. Es una línea de defensa que permite controlar la mayor
parte de los agentes patógenos y se produce en el mismo grado en cualquier
momento de la infección, reconociendo estructuras compartidas por distintos
microorganismos.
La inmunidad adquirida, adaptativa o específica, se desarrolla más lentamente,
pero permite al final una defensa más eficaz, pues suministra una respuesta
específica frente a cada agente infeccioso y mejora con las exposiciones repetidas a
una infección dada, es decir, tiende a reforzarse y perfeccionarse por el repetido
contacto con el material antigénico (memoria inmunológica). Las células que dirigen
y ejecutan esta respuesta son los linfocitos, y la especificidad de la misma viene
dada por la de los receptores presentes sobre la superficie de estas células, que les
permiten reconocer la presencia del antígeno capaz de activarlos. La inmunidad
adquirida se basa en una respuesta que tiene dos vertientes: humoral y celular.
Debe tenerse en cuenta que los sistemas inmunes innato y adaptativo no
actúan separadamente, sino que están interrelacionados en sus funciones.
Introducción
5
2.1.1 Antígenos
En general, a las sustancias extrañas a un organismo se las denomina
antígenos (Ag), y son ellos los que desencadenan en el organismo una serie de
eventos celulares que provocan la activación de los mecanismos de defensa, como
la generación de anticuerpos (Ac). Por tanto, puede definirse como Ag toda aquella
sustancia que al ser introducida en un organismo es capaz de inducir una respuesta
inmunológica, ya sea por Ac específicos o por células linfocitarias que van a
reaccionar con el Ag inductor.2 La región del Ag que interactúa con los receptores
específicos del sistema inmune se denomina determinante antigénico o epítopo. Los
epítopos pueden ser aminoácidos, péptidos, cadenas laterales de azúcares,
glucopéptidos, etc., excepto lípidos puros.
Se define como hapteno aquel grupo químico definido, de pequeño tamaño, que
por sí mismo no es inmunógeno, pero que unido covalentemente a una molécula
portadora se comporta como inmunógeno.
Generalmente los Ag se presentan en la naturaleza como componentes de
membranas celulares, cápsulas bacterianas, cilios y flagelos de bacterias y
protozoos, cápsides virales, toxinas bacterianas, etc. Los Ag deben tener un alto
peso molecular y un cierto grado de complejidad, y deben ser reconocidos como
extraños por el organismo. Los “mejores” Ag son las proteínas, aunque
prácticamente todas las macromoléculas biológicas son antigénicas. Por ello, para
evitar la autodestrucción, el sistema inmune animal debe discriminar entre los Ag
propios y extraños, es decir, que el sistema inmune debe ser autotolerante. Un
proceso como éste debe ser exquisitamente selectivo, ya que un vertebrado, por
ejemplo, tiene decenas de miles de macromoléculas diferentes, cada una de las
cuales posee numerosos sitios antigénicos característicos. Por ello, el sistema
inmune elimina los clones de linfocitos que reconocen los Ag presentes en el
período crítico durante el cual el sistema inmunológico se vuelve activo. Con todo, y
a causa de que nuevos clones de linfocitos, cada uno de ellos con una dotación
prácticamente única de determinantes antigénicos, surgen a lo largo de la vida del
animal (los Ac y los receptores de las células T son antigénicos de por sí), la
autotolerancia debe ser un proceso continuo. Sin embargo, a veces el sistema
inmune pierde la tolerancia frente a algunos de sus Ag propios, produciéndose las
denominadas enfermedades autoinmunes.
Introducción
6
2.1.2 Células y órganos del sistema inmune
La inmunidad innata y la adaptativa son el resultado de la acción conjunta de
diversas moléculas y células distribuidas por el organismo.
2.1.2.1 Células del sistema inmune
Todas las células del sistema inmune proceden de células pluripotenciales
hematopoyéticas, a través de dos líneas principales de diferenciación3 (Fig.1):
- La línea linfoide conduce a la producción de linfocitos, que median la
inmunidad adaptativa.
- La línea mieloide conduce a la producción de fagocitos y otras células
accesorias.
Figura 1 Árbol hematopoyético
Los linfocitos son las únicas células del organismo capaces de reconocer y
diferenciar específicamente distintos determinantes antigénicos, y son por lo tanto
responsables de las dos características que definen el sistema inmune adaptativo:
la especificidad y la memoria. El adulto humano tiene alrededor de 1012 células
linfoides, y el conjunto del tejido linfoide representa aproximadamente el 2% del
peso corporal total.4 Estas células constituyen alrededor del 20% de los leucocitos
totales presentes en la circulación del adulto. Existen distintas clases de linfocitos
Introducción
7
con funciones distintas: las células T, las células B y las células citotóxicas
naturales. Cada una de estas clases de linfocitos es fácilmente diferenciable, pues
poseen proteínas de membrana distintas que actúan como marcadores fenotípicos,
que permiten diferenciar poblaciones de linfocitos distintas desde el punto de vista
funcional.
Los linfocitos T son las células efectoras de la inmunidad denominada celular.
Estas células deben su nombre al hecho de que sus precursores se originan en la
médula ósea, pero a continuación migran al timo, donde maduran. Los linfocitos T
se dividen en dos subpoblaciones principales: los linfocitos T CD4, denominados
frecuentemente colaboradores, y los linfocitos T CD8, que en gran medida son
citolíticos o citotóxicos.
Los linfocitos B recibieron este nombre debido a que en las aves se observó que
maduraban en un órgano denominado bolsa de Fabricio. En los mamíferos no existe
un equivalente anatómico de esta bolsa, y las primeras fases de la maduración de
las células B tienen lugar en la médula ósea. Los linfocitos B representan alrededor
del 10% del reservorio linfoide circulante, y se caracterizan por la presencia de
inmunoglobulinas (Ig) endógenas, insertadas en la membrana superficial en la que
actúan como receptores específicos para el Ag.
Figura 2 Linfocitos B y T.
Imágenes de microscopía electrónica de barrido
correspondientes a un linfocito B (a) y T (b).
Durante su desarrollo, tanto los linfocitos T como los B adquieren receptores
(moléculas de reconocimiento) específicos para Ag de distribución clonal, lo que
significa que existen muchos clones de estas células que tienen diferentes
receptores para Ag. Todos los miembros de cada clon expresan receptores para Ag
de la misma especificidad, que es diferente de la de los receptores expresados por
Introducción
8
los demás clones. Los receptores para el Ag son moléculas de Ig de superficie (IgS)
en el caso de las células B y un tipo de molécula distinto (TCR del inglés T cell
receptor), aunque de organización molecular y génica parecida a la de aquéllas, en
el caso de los linfocitos T.
Los linfocitos recién formados (vírgenes o naive) se activan cuando se unen con
su Ag específico en presencia de células accesorias, lo que provoca que los
linfocitos proliferen y maduren. El compartimento de linfocitos vírgenes se mantiene
en un estado de equilibrio, mediante la generación de nuevas células a partir de
progenitores de la médula ósea y por la muerte de las células que no se encuentran
con Ag. Si no se encuentran con un Ag, los linfocitos no estimulados acaban por
morir por un proceso de apoptosis. La selección clonal, a través del reconocimiento
del Ag, provoca la expansión de clones específicos, que acaban diferenciándose en
células efectoras. Además, algunos linfocitos de la progenie de células B y T
activadas por Ag se diferencian en células de memoria, que pueden sobrevivir
durante mucho tiempo una vez eliminado el Ag, en un estado quiescente desde el
punto vista funcional. Estas células de memoria median respuestas rápidas y
potenciadas a las subsiguientes exposiciones a ese mismo Ag. La fase efectora de
las células B está constituida por las denominadas células plasmáticas, que están
especializadas en secretar grandes cantidades de Ac específico contra un Ag
determinado
Las células citotóxicas naturales (NK, del inglés natural killer) son una tercera
subpoblación de linfocitos que no poseen receptores para Ag como los linfocitos B y
T, y cuya principal función tiene lugar en el marco de la inmunidad innata. Las NK
son capaces de reconocer las alteraciones de la membrana de células infectadas por
virus, a las que se unen para lisarlas.4 Las NK son activadas por interferón, que
constituye uno de los elementos de la inmunidad innata y que es producido por
células infectadas por microorganismos, y a veces también por los linfocitos.
Las células accesorias de la línea mieloide promueven la activación de los
linfocitos y realizan funciones efectoras que pueden potenciarse por respuestas
inmunitarias adaptativas humorales o celulares. Las principales poblaciones de
células accesorias del sistema inmune son los fagocitos y las células dendríticas.
Los fagocitos son células de varias clases distintas: monocitos, macrófagos y
granulocitos polimorfonucleares (neutrófilos, basófilos o eosinófilos, según la tinción
histológica de sus gránulos). Pero todas ellas proceden de células primordiales de la
médula ósea. La función básica de los fagocitos consiste en englobar a los agentes
infecciosos, hacia los que se dirigen por quimiotaxis, para destruirlos. Los
macrófagos fagocíticos de los tejidos forman una red denominada sistema
reticuloendotelial, que se encuentra repartida en muchos órganos.
Introducción
9
2.1.2.2 Tejidos y órganos del sistema inmune
Existen dos tipos esenciales de órganos linfoides:
- Órganos generadores o primarios, donde se produce el desarrollo
ontogénico de los linfocitos. Es en estos órganos donde los linfocitos
expresan por primera vez los receptores antigénicos y alcanzan la madurez
fenotípica y funcional. En el hombre son órganos linfoides primarios la
médula ósea y el timo.
- Órganos periféricos o secundarios, destinados a optimizar las interacciones
celulares necesarias para las fases de reconocimiento y activación de las
respuestas inmunitarias específicas. En estos órganos se acumulan las
células maduras y se inicia y desarrolla la respuesta de los linfocitos a los Ag
extraños. Son órganos y tejidos linfoides secundarios los ganglios linfáticos,
el bazo, el sistema inmune cutáneo y el sistema inmune de las mucosas.
Existen además agregados poco definidos de linfocitos en el tejido conectivo y
en prácticamente todos los órganos, excepto en los del sistema nervioso central.
La médula ósea es el lugar en el que se generan todas las células sanguíneas
circulantes del adulto, incluidos los linfocitos inmaduros, y es el lugar de
maduración ontogénica de los linfocitos B. Cuando se lesiona la médula ósea o
cuando existe una demanda excepcional de producción de nuevas células
sanguíneas, el hígado y el bazo pueden ser reclutados como sitios de
hematopoyesis extramedular. Además de los progenitores con capacidad de
autorrenovación y su progenie en diferenciación, la médula ósea contiene
numerosas células plasmáticas secretoras de Ac, que se desarrollan en los tejidos
linfoides periféricos por estimulación antigénica de las células B y que luego migran
a la médula.
El timo, órgano primario T, es un órgano linfoepitelial bilobulado situado en el
mediastino antero-superior. Los linfocitos del timo (timocitos) son linfocitos T en
distintos estadios de maduración. Sólo los linfocitos T maduros abandonan el timo y
entran en la sangre y los tejidos linfoides periféricos
Los ganglios linfáticos son los lugares en los que los linfocitos B y T inician las
respuestas inmunes adaptativas, frente a los Ag que son recogidos por la linfa que
Introducción
10
drena los tejidos linfoides periféricos. Los ganglios linfáticos son pequeños
agregados nodulares de tejido rico en linfocitos, situados a lo largo de los conductos
linfáticos distribuidos por todo el cuerpo y que actúan de filtros de la linfa antes de
que ésta alcance la sangre.
El bazo (órgano situado en el hipocondrio izquierdo) es el principal lugar en el
que se producen las respuestas inmunitarias frente a los Ag transportados por la
sangre. Los individuos que carecen de bazo son extremadamente susceptibles a las
infecciones por bacterias encapsuladas, tales como neumococos y meningococos,
debido a que estos microorganismos son eliminados en condiciones normales
mediante opsonización y fagocitosis, función que es defectuosa en ausencia del
bazo.
Las mucosas disponen de agregados adyacentes de linfocitos, que se
distribuyen en palcas de Peyer y lámina propia, y que en conjunto forman el tejido
linfoide asociado a mucosa (MALT).
Todos los órganos linfoides secundarios están organizados en áreas destinadas
a los linfocitos B (folículos y zona marginal) y áreas destinadas a los linfocitos T
(zonas parafoliculares).
2.1.3 Inmunidad humoral
En la inmunidad humoral (humor es un término arcaico para designar fluido) las
células no actúan directamente contra los Ag, sino que lo hacen los Ac. Este tipo de
respuesta es la que se produce cuando aparecen patógenos extracelulares o toxinas
bacterianas. En la fase efectora de la inmunidad humoral, los Ac secretados se
unen al Ag con una elevada especificidad, marcándolo de este modo para su
destrucción mediante diversos mecanismos efectores, tales como la neutralización,
la activación del sistema del complemento, la opsonización, etc. Aunque la
especificidad de la fase efectora se debe a las interacciones Ag-Ac, las funciones
efectoras (en sí distintas de la neutralización del Ag) no suelen ser específicas del
Ag desencadenante.
En Occidente la primera inmunización eficaz se remonta a 1796. Un médico
inglés, Edward Jenner, introdujo la inoculación con viruela vacuna como medida de
protección frente a la viruela humana (de ahí el término de vacunación).5
En 1881, Louis Pasteur, a raíz de un descuido fortuito, descubrió la posibilidad
de inmunizar con cepas atenuadas de microorganismos virulentos: unos cultivos de
Pasteurella aviseptica (productora del cólera de los pollos) olvidados en el
laboratorio durante las vacaciones, no sólo habían perdido su virulencia sino que
Introducción
11
una vez inyectados protegían a los animales frente a la cepa silvestre. Pasteur
dedujo que los cultivos olvidados contenían microbios alterados (cepa atenuada)
capaces de inmunizar frente a la cepa virulenta, y aplicó este concepto para
vacunar contra el ántrax.
En 1890, Behring y Kitasato aportaron la primera prueba sólida sobre el
concepto de inmunidad humoral, al demostrar que el suero de animales
inmunizados con toxoide tetánico o diftérico poseía una actividad antitóxica
neutralizante. Ésta y otras evidencias posteriores apoyaban la existencia de
factores humorales capaces de atacar a los microbios sin que la presencia de
células fuera necesaria. En este sentido, Bordet demostró en 1898 que tanto la
bacteriolisis como la lisis de los eritrocitos requerían al menos dos factores séricos:
uno termoestable y específico para cada inmunógeno (que denominó factor
sensibilizador) y otro termolábil e inespecífico (que llamó alexina). Es en estos años
cuando se acuñaron los términos Ag y Ac. De este modo, un Ag sería cualquier
sustancia que induce a una acción inmune contra si misma y por contraposición el
Ac sería la sustancia del suero que posee dicha actividad (y que se corresponde con
el factor sensibilizador descrito por Bordet).6
2.2 Los anticuerpos
Las Ig o Ac son un grupo de glucoproteínas presentes en el suero y en los
líquidos intersticiales de todo el organismo, así como en la superficie de los
linfocitos B, y cuya función consiste en reconocer y unirse específicamente al Ag
para provocar su destrucción. Los Ac son fabricados exclusivamente por los
linfocitos B y su producción es inducida cuando el sistema linfoide del huésped
entra en contacto con un Ag. Las primeras Ig sintetizadas son moléculas de
membrana o superficie (IgS), que actúan como receptores para el Ag de la célula B.
Posteriormente, los Ac también son producidos en una forma secretada por las
células B estimuladas por el Ag. Las moléculas de Ac se acoplan con una parte
específica del Ag, conocida como determinante antigénico o epítopo. Por tanto, los
Ac son específicos para los epítopos y no para el total de la molécula antigénica. Se
entiende por reacción Ag-Ac a la unión específica entre un Ac y el determinante
antigénico inductor. Esta unión es reversible, sólo se mantiene por fuerzas no
covalentes de carácter débil que permiten la unión del Ag con su Ac específico. Se
denomina afinidad a dicha fuerza de unión entre Ag y Ac.
Esta forma de inmunidad humoral constituye uno de los elementos del sistema
inmune adaptativo, ya que junto con los TCR, son las moléculas que utilizan la
inmunidad adaptativa para el reconocimiento de Ag. Las Ig pueden reconocer al Ag
Introducción
12
nativo, mientras que los TCR sólo reconocen una parte del Ag cuando le es
presentada unida a determinadas moléculas del MHC.
Hasta 1936 no se logró el aislamiento de Ac puros, a partir de sueros, por parte
de Heidelberg y Kendall. En 1939 los Ac se identificaron como γ-globulinas,
mediante dos procedimientos técnicos distintos: de una parte la aplicación de la
ultracentrífuga de Svedberg por Heidelberg y Pedersen, y de otra parte la
electroforesis en medio líquido a cargo de Tiselius y Kabat. De este modo, el
término Ig comenzó a utilizarse para englobar el conjunto de los Ac de un modo
genérico, en cuanto a sus cualidades comunes, independientemente de sus
especificidades.
2.2.1 Estructura de las inmunoglobulinas
En 1972, Gerald Edelman y Rodney Porter recibieron el premio Nobel de
medicina por su contribución a la determinación de la estructura química de los Ac.
Demostraron que la mayoría de las Ig, o más concretamente las unidades
estructurales básicas en que se fundamentan todas ellas, son glucoproteínas
globulares de gran peso molecular formadas por cuatro cadenas polipeptídicas: dos
cadenas ligeras (L de light) idénticas de ~ 25 kD y dos cadenas pesadas (H de
heavy) idénticas de 50 a 77 kD. Estas subunidades se asocian mediante enlaces
disulfuro e interacciones no covalentes para formar una molécula simétrica (L-H)2
en forma de Y (Fig. 3). La estructura básica de cuatro cadenas, dos pesadas y dos
ligeras, es común a todas las clases de Ig, pero en algunas la molécula completa
puede ser un polímero de esa unidad básica. Cada cadena ligera está unida
covalentemente a una cadena pesada por un puente disulfuro, y las dos cadenas
pesadas están unidas entre sí también mediante puentes disulfuro. Las cadenas H y
L presentan dos regiones diferenciadas: la región variable (V) amino terminal (N-
terminal), y la región constante (C) carboxi terminal (C-terminal). Las cadenas de
las Ig están formadas por unas unidades estructurales de unos 110 aa
denominadas dominios de Ig. En la cadena pesada la región V consta de un dominio
de Ig y la región C de tres o cuatro dominios de Ig, dependiendo del isotipo. En la
cadena ligera la región V consta de un dominio de Ig y la región C consta también
de un dominio de Ig.
Introducción
13
Figura 3 Estructura básica de las Ig.
La estructura básica de Ig consiste en dos cadenas polipeptídicas ligeras idénticas y
otras dos cadenas polipeptídicas pesadas idénticas, enlazadas por puentes disulfuro.
Los dominios variables reciben este nombre debido a que contienen regiones de
variabilidad en su secuencia de aminoácidos, que diferencian los Ac sintetizados por
distintos clones de células B. Los dominios variables son los responsables de
reconocer al Ag y unirse a él, ya que ahí se encuentra el parátopo que se une al
epítopo del Ag. La variabilidad de los dominios variables no es totalmente aleatoria,
sino que éstos poseen zonas relativamente conservadas, a las que se denomina
regiones de entramado o armazón (FR del inglés Framework Region), entre las que
se encuentran intercaladas tres regiones hipervariables (Fig. 4), llamadas regiones
determinantes de la complementariedad (CDR del inglés Complementary
Determining Regions), por ser las que condicionan la unión selectiva a cada Ag. La
asociación de todas esas regiones forma el lugar de unión con el Ag,7 cuya
conformación es mantenida por los FR.8
Figura 4 Dominio VH de una Ig.
CDR1 y CDR2 son relativamente invariables en longitud. En la cadena pesada,
CDR1 y CDR2 están codificados por el segmento génico VH y definen unos 50
grupos de genes VH de la línea germinal, que imponen el límite en el número
Introducción
14
posible de estructuras diferentes para el sitio de unión al Ag en el repertorio de las
Ig de los linfocitos B vírgenes. La más diversa de las tres CDR es la CDR3 de la
cadena pesada, que se localiza en el centro del sitio de unión al Ag, manteniendo
mayor contacto con el Ag que los otros CDR. La CDR3 es la región que más varía en
longitud por que está construida a partir de varios componentes (VH, D y JH) que
aportan diversidad. Además, a menudo contiene nucleótidos N aleatoriamente
insertados en las uniones VH-D y D-JH, que aportan más diversidad. De esta forma,
en CDR3 tanto su longitud como la composición de aa codificados, contribuyen a la
especificidad antigénica, siendo su extraordinaria diversidad el resultado de varios
mecanismos.9
La región V de una cadena pesada (VH) se yuxtapone con la región V de una
cadena ligera (VL) para formar un sitio de unión al Ag. Debido a que la unidad
estructural básica de cada molécula de Ac contiene dos cadenas pesadas y dos
cadenas ligeras, la molécula contiene dos sitios de unión al Ag. En la mayoría de los
casos es la cadena pesada la que tiene más contactos con el Ag, pero la estabilidad
del sitio de combinación depende de la interacción entre ambas cadenas.
Los dominios de la región C son independientes del sitio de unión al Ag y no
participan en el reconocimiento antigénico. La región constante se une a las células
del sistema inmune para activarlas, siendo responsable de la variedad de funciones
efectoras y por tanto de los tipos de Ig. Adopta por lo general una de cinco formas
más importantes, que determinan la clase o isotipo de Ig. En las cadenas H aparece
una zona denominada región bisagra. Esta región posee la característica de ser
muy flexible, permitiendo adquirir distintos ángulos entre las regiones V y C, así
como entre los brazos de la Ig. Las regiones C de las cadenas L no participan en las
funciones efectoras ni se fijan a las membranas celulares.
La IgS, producida por una célula B como receptor para el Ag, y la Ig que esa
célula secreta son idénticas excepto por una porción de aminoácidos en el extremo
C terminal de las cadenas pesadas. Las IgS son más largas que sus equivalentes
secretadas y su porción adicional de aminoácidos atraviesan la membrana celular
para anclar la molécula.
Introducción
15
2.2.2 Heterogeneidad de las inmunoglobulinas
En 1953 Grabar y Williams demostraron la heterogeneidad de las Ig,
descubriendo la IgA. Durante estos años se establece la nomenclatura de las Ig.
Por otro lado, trabajos más recientes demostraron que el ARNm para un polipéptido
de las Ig se produce por empalme de las secciones de ese ARNm que codifican las
diferentes partes del polipéptido. Por ejemplo, la producción del ARNm de la cadena
ligera implica la unión de dos segmentos ARNm, uno para el dominio V y otro para
el dominio C. Además, el segmento de ADN que codifica los genes V es producido, a
su vez, por combinación de varios genes de la línea germinal. Puesto que varios
genes producen un solo polipéptido, esto crea problemas al analizar la variabilidad
genética de un polipéptido único. A pesar de todo, la variabilidad de los Ac se puede
clasificar en tres tipos: isotípica, alotípica e idiotípica.10
2.2.2.1 Variedad isotípica
Las moléculas de Ac pueden separarse en clases y subclases específicas en
función de las diferencias en la estructura de las regiones C de sus cadenas
pesadas. Estas distintas clases de moléculas de Ac reciben el nombre de isotipos.
En mamíferos se conocen cinco isotipos de Ig, que en el hombre se denominan:
IgG, IgA, IgM, IgD e IgE (ejemplo, figura 5). Los cinco isotipos de Ig difieren en sus
correspondientes tipos de cadenas pesadas, designadas por γ, α, µ, δ y ε,
respectivamente. También hay dos clases de isotipos de cadenas ligeras,
denominadas κ y λ, si bien éstas se encuentran en las Ig de todas las clases. Estas
cadenas se distinguen por sus regiones C carboxi terminales. Toda molécula de Ac
tiene dos cadenas ligeras κ o dos cadenas ligeras λ, pero nunca una de cada. Los
genes para las variantes isotípicas están presentes en todos los miembros sanos de
una especie. Por ejemplo, los genes para las cadenas γ1, γ2, γ3, γ4, µ, α1, α2, δ, ε, κ
y λ están todos presentes en el genoma humano y son, por tanto, isotipos.
Figura 5
Introducción
16
Las clases o isotipos difieren unas de otras en tamaño, carga, composición de
aminoácidos y contenido de carbohidratos. Se conocen subclases de la IgG y de la
IgA humana, pero en las IgM, IgD e IgE no se han descrito subclases claramente
diferenciadas. Las diferencias entre las diversas subclases dentro de una misma
clase de Ig son menores que las existentes entre clases diferentes. Las subclases
de Ig parecen haber aparecido después de haberse formado las especies, y así las
subclases humanas no son comparables, por ejemplo, con las subclases de IgG
identificadas en el ratón.
Los isotipos y subtipos de Ig difieren en sus regiones C y, por lo tanto, en las
funciones efectoras que realizan. A continuación repasamos brevemente los cinco
isotipos humanos de Ig.
La IgG es la Ig principal en el suero humano (8-16 mg/ml), representando el
70-75% del total de Ig. Está distribuida por igual entre la sangre y el fluido
intersticial. Representa la Ig principal de la respuesta inmunitaria secundaria
sistémica y es la única que actúa como antitoxina. La producción de IgG empieza
de 2 a 3 días después de que la IgM aparezca por primera vez. La IgG es la única
que puede atravesar la placenta, por ello es responsable de la inmunidad fetal y la
del recién nacido. Existe sólo como unidad básica (L-H)2. Las cuatro subclases de la
IgG humana (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) tienen cadenas pesadas llamadas γ1, γ2, γ3
y γ4, respectivamente, las cuales difieren estructuralmente entre sí por el tamaño
de la región bisagra y el número de puentes disulfuro entre las cadenas pesadas.
La IgA representa el 10-15% de Ig séricas humanas (1,4-4 mg/ml). Más del
80% de las moléculas de IgA adopta la forma monómera básica de cuatro cadenas,
presentándose el resto como un dímero (Fig. 6). Es la Ig predominante en las
secreciones seromucosas, como la saliva, el sudor, las lágrimas, la secreción
traqueobronquial, el calostro, la leche y las secreciones de las mucosas gastro-
intestinal y genitourinarias.
Figura 6 Estructura dimérica de la IgA humana.
Introducción
17
La IgA protege contra los patógenos invasores, uniéndose a sus sitios
antigénicos a fin de bloquear su unión a las superficies epiteliales. Actúa
protegiendo la superficie corporal y los conductos secretores. Genera, junto con la
IgG, la inmunidad del recién nacido, al encontrarse en la leche. En el ser humano el
isotipo IgA puede subdividirse en dos subgrupos, llamados IgA1 e IgA2. En el suero
predomina la subclase IgA1, que aparece como monómero; pero en las secreciones
seromucosas es muy abundante la IgA2, que aparece como dímero.
Las moléculas multiméricas de IgM e IgA también contienen un polipéptido
adicional (de ~ 20 kD) denominado cadena de unión (J, del inglés joining), que está
unida mediante puentes disulfuro a los fragmentos terminales, estabilizando los
complejos multiméricos.
La IgM representa del 5 al 10% de las Ig séricas (1,5 mg/ml de media). Esta
Ig, confinada prácticamente al espacio intravascular, es la Ig predominante en la
respuesta primaria, activando el sistema del complemento contra los
microorganismos infecciosos antigénicamente complejos. Es la primera Ig que
sintetiza el neonato por sí mismo, y también es la primera en aparecer durante la
respuesta primaria. Su producción empieza de 2 a 3 días después de que el Ag es
detectado por primera vez.
Figura 7 Estructura pentamérica de la IgM humana.
La IgM es un pentámero de la unidad básica (Fig. 7), aunque también aparece
en forma monomérica como IgS. Es la unión del Ag a esta última forma de la IgM la
que inicia la respuesta inmunitaria humoral.
La IgD supone menos del 1% de las Ig séricas, pero se sabe que está presente
junto a IgM en la membrana de muchos linfocitos B circulantes. En su forma libre
en plasma su función es desconocida. Existe sólo como unidad básica (L-H)2. Su
estructura es similar a la estructura de la IgG, aunque varía en la posición de los
restos glucosídicos de las cadenas proteicas.
Introducción
18
La IgE es la menos abundante en suero (0,3 mg/ml), pero se halla en la
membrana de los basófilos y mastocitos de todos los individuos. Es un Ac
esencialmente relacionado con los fenómenos alérgicos o de hipersensibilidad.
También proporciona protección local frente a ciertos patógenos grandes, como
helmintos: sirve para reclutar células fagocíticas y efectoras a través de una
reacción de inflamación aguda. Existen sólo como unidad básica (L-H)2.
2.2.2.2 Variedad alotípica
La variación alotípica se refiere a la variación genética dentro de una especie
que implica alelos diferentes en un locus determinado. No todos los miembros
sanos de una especie tiene un alotipo particular (p. ej., las formas alélicas de los
grupos sanguíneos). Así, la variante de la IgG3 llamada G3m (b0) (un alotipo
caracterizado por tener fenilalanina en la posición 436 de su cadena pesada) no se
encuentra en todas las personas, y es por tanto un alotipo. La mayoría de las
veces, los alotipos aparecen como variantes de las regiones constantes de las
cadenas pesadas (Fig. 8).
Figura 8
2.2.2.3 Variedad idiotípica
La variación en los dominios variables produce idiotipos. Todas las moléculas de
Ig comparten las mismas características estructurales básicas, pero presentan una
notable variabilidad en las regiones de unión al Ag. Esta variabilidad justifica la
capacidad de los diferentes Ac de unirse a un asombroso número de Ag
estructuralmente distintos. Pueden existir más de 109 moléculas de Ac diferentes en
cada individuo, cada una con secuencias de aminoácidos únicas en sus sitios de
unión al Ag. Las variantes idiotípicas se pueden encontrar en un solo individuo de
una misma especie o en varios, dependiendo si estuvieron o no en contacto con el
Introducción
19
mismo Ag. Están inducidas por los diferentes epítopos de los Ag y se localizan en
las zonas hipervariables de las cadenas pesadas y ligeras (Fig. 9).
Figura 9
2.3 Ontogenia de los linfocitos B: Bases genéticas de la diversidad y
especificidad de los anticuerpos
El sistema inmune tiene la capacidad de generar Ac contra casi cualquier Ag
que encuentre. Cada linfocito produce sólo Ig de una única especificidad como Ac,
de forma que cada Ag selecciona y estimula sólo aquellos linfocitos con Ig
específicas para él. Además, los Ac no sólo deben proporcionar sitios de
combinación distintos y suficientes para reconocer los millones de formas
antigénicas posibles, sino que cada clase de Ac tiene también una región efectora
diferente. La extraordinaria variabilidad potencial de la especificidad de los Ac llega
a la enorme cifra de 1015, es decir, unos mil billones de receptores de distintas
estructuras potencialmente posibles en un mismo individuo.11 Sin embargo, el
repertorio real consta de alrededor de 109 especificidades diferentes.12 Si tenemos
en cuenta que cada linfocito sólo reconoce un determinante antigénico
determinado, y que el conjunto del sistema inmune puede reconocer de forma
específica muchos miles de Ag, esto significa que los linfocitos reconocedores de
cualquier Ag particular constituyen una proporción muy pequeña del total.
Existe, por tanto, una enorme variedad de Ac tanto potencial como real, y
resulta extraordinario el hecho de que esta enorme diversidad se logra con una
producción que parte sólo de unos 400 genes. Por ello, la manera en que la
información genética, requerida para codificar un número tan extremadamente
grande de proteínas, está guardada en el genoma y es transmitida a través de las
generaciones, ha sido un asunto central de la inmunogenética durante décadas,
siendo aún hoy día un tema de candente actualidad.13
Los dominios variables y constantes de las Ig están codificados por genes
distintos, pero no suficientes para la enorme diversidad de Ig que se producen en la
Introducción
20
respuesta inmune. Para resolver esta aparente limitación, la producción de Ig
dispone de una organización especial del genoma y de diferentes mecanismos de
expresión, que permiten producir gran diversidad con pocos genes fijos. Los dos
mecanismos más importantes, al menos en humanos, responsables de esta gran
producción son la recombinación somática y la hipermutación somática. Mediante
estos dos mecanismos se origina un repertorio de millones de Ac diferentes,
utilizando para ello una pequeña cantidad de material genético.
2.3.1 Ontogenia de los linfocitos B: Recombinación somática
La maduración central u ontogénica de los linfocitos B a partir de precursores
comprometidos ocurre en el hígado fetal y, tras el nacimiento, en la médula ósea.
Durante este proceso las células de la estirpe de los linfocitos B pasan por diversos
estadios secuenciales (Fig. 10), cada uno de los cuales se caracteriza por un patrón
específico de expresión de genes de Ig y por la expresión de otras proteínas de la
superficie celular que sirven de marcadores fenotípicos de estos estadios de
maduración.
Las fases iniciales de la maduración de los linfocitos B se caracterizan por una
elevada actividad mitótica, que tiene como consecuencia un aumento marcado del
número de células, proporcionando un repertorio muy diverso de linfocitos
específicos de Ag. Estas fases están controladas por múltiples moléculas, tales
como citoquinas secretadas, proteínas unidas a la membrana y factores reguladores
de la transcripción (Ikaros, E2A, Pax5/BSAP, etc.), que actúan de manera
coordinada sobre los linfocitos en desarrollo.
Las primeras células de la médula ósea comprometidas con la estirpe de las
células B se denominan células pro-B, las cuales aún no poseen Ig. En esta etapa
se activa el gen Pax5, que codifica la proteína activadora específica del linaje de
linfocitos B (BSAP del inglés B-cell lineage specific activator protein), la cual es
esencial para el desarrollo de las células B.14
Introducción
21
Figura 10 Estadios de la maduración de los linfocitos B
Las células pre-B representan el siguiente estadío del desarrollo, y es el primer
tipo celular que sintetiza una forma inmadura de Ig de membrana, compuesta por
la cadena pesada µ asociada a una proteína invariable adicional, denominada
cadena ligera sustitutiva, que presenta homología estructural con las cadenas
ligeras κ y λ, pero que es invariable, es decir, no tiene regiones V y son idénticas en
todas las células B en este estadio.
En el siguiente estadío de la maduración, las células B inmaduras producen
además una cadena ligera κ o λ, y expresan IgM de membrana. La proliferación de
las células B inmaduras se estimula por acción de una serie de estímulos,
suministrados por las células del estroma específicas de la médula ósea.
Tras el estadío de expresión de IgM, la célula coexpresa cadenas pesadas µ y δ
en asociación con la cadena ligera κ o λ y, por lo tanto, produce tanto IgM de
membrana como IgD de membrana. Ambas clases de Ig de membrana tienen la
misma región V y por consiguiente la misma especificidad antigénica. La
coexpresión de IgD e IgM se acompaña de la adquisición de la competencia
funcional, por lo que estas células reciben el nombre de células B maduras, aunque
también reciben el nombre de células no estimuladas (vírgenes o naive), porque no
han sido activadas por Ag. Las células B maduras ya responden a los Ag, y si no
encuentran un Ag en un cierto tiempo, mueren por apoptosis. Las células B
maduras abandonan la médula ósea y entran en la circulación y en los tejidos
linfoides periféricos, donde se produce su proliferación y diferenciación en respuesta
a Ag extraños.
Introducción
22
La expresión de los genes del receptor para el Ag es el acontecimiento clave de
la maduración ontogénica de los linfocitos B, pues este hecho es la base para que
se genere un repertorio diverso de especificidades antigénicas y se garantice la
supervivencia selectiva de los linfocitos dotados de especificidades útiles. En el
genoma de la línea germinal de una célula, a diferencia de la mayoría de las
proteínas que son codificadas por genes únicos (copia materna y paterna), la
información genética para la cadena polipeptídica de las regiones variables de los
TCR y de las Ig, está contenida en múltiples segmentos génicos, dispersos a lo
largo de un cromosoma. De esta forma, la codificación no se hace mediante genes
completos preformados, sino por la recombinación de varios segmentos génicos, de
cada uno de los cuales existe en el genoma un elenco más o menos amplio.
Durante la maduración de los linfocitos se crean genes funcionales que codifican al
receptor para el Ag mediante un proceso denominado recombinación somática, en
el cual un conjunto relativamente limitado de secuencias de ADN de la línea
germinal, que inicialmente se encuentran separadas unas de otras, se ponen en
contacto mediante procesos enzimáticos de deleción y unión. La diversidad inicial
del repertorio de linfocitos se genera durante la unión de los diferentes segmentos
génicos (V, D y J). En este sentido, se ha publicado que sólo un gen IgVH es
suficiente para generar un amplio repertorio de Ac con respuestas específicas hacia
Ag.15
La recombinación somática es un proceso que sólo ocurre en un momento
temprano del desarrollo de los linfocitos T y B. Además, cada clon de linfocitos y su
progenie expresan una combinación única de esos segmentos génicos para formar
el código genético de sus receptores antigénicos.
El mecanismo de reagrupamiento de los genes de Ig en los linfocitos B se ha
descrito con detalle.16,17 Susumu Tonegawa obtuvo el premio Nobel de Medicina y
Fisiología en 1987 por sus estudios sobre la base genética de la diversidad de los
Ac, donde propuso la reordenación de los genes de las Ig como base de la
diversidad de los Ac.18 Aunque la idea de que las regiones V y C de una cadena de
Ig están codificados por dos “genes” separados en la línea germinal de la célula, y
que experimentan un reagrupamiento para unirse en el desarrollo de los linfocitos,
fue primeramente sugerido por Dreyer y Bennet19 y después por Smithies.20
En los estudios de genes humanos se han identificado más de 100 genes VH de
la línea germinal en el cromosoma 14. Debido a que no todos esos genes son
funcionales y que algunos de ellos son casi idénticos (pudiendo tratarse de
variantes alélicas) finalmente quedan tan solo 51 genes disponibles para
reagrupamiento.21 Aunque cada segmento génico VH difiere en secuencia respecto
de todos los demás, es posible agrupar los genes VH de cada locus en 7 familias
Introducción
23
(VH1, VH2, VH3, VH4, VH5, VH6 y VH7 con 11, 3, 22, 11, 2, 1 y 1 miembros
funcionales respectivamente), basándose en su homología de secuencia. Los
miembros de una misma familia poseen más de un 80% de homología en sus
secuencias.22 La presencia de secuencias de nucleótidos conservadas en cada
familia sugiere una presión evolutiva para conservar ciertas estructuras de los
genes VH.23 No se conoce todavía la importancia fisiológica de estas familias de
genes V, pues los miembros de cada familia no parecen codificar regiones VH de la
Ig de especificidad similar.
En el extremo 5’ de cada exón de la región VH se encuentra una secuencia de
nucleótidos que codifica los 20-30 aa terminales de la proteína traducida, y que
constituyen el péptido señal o líder. Las secuencias señal participan en dirigir a los
polipéptidos que se van sintetizando en los ribosomas hasta el retículo
endoplasmático, y se eliminan probablemente antes de que se complete la
traducción, no estando presentes en las proteínas maduras.
También se conoce la existencia de 6 segmentos génicos JH24 (Fig. 11) y 27
segmentos génicos D agrupados en 7 familias25 (Fig. 12).
CDR3 ------------------------------- 100 110
JH1 -- --- --- --- GCT GAA TAC TTC CAG CAC TGG GGC CAG GGC ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA G/
JH2 -- --- --- --C TAC TGG ... ... G.T .T. ... ... .GT ... ... ... ... ..T ... ... ... ./
JH3 -- --- --- --- --. ..T GCT ..T G.T AT. ... ... ..A ..G ..A A.. ... ... ... ..T ... ./
JH4 -- --- --- --- --- -.C ... ..T G.C T.. ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ./
JH5 -- --- --- --- -AC A.C .GG ... G.C .C. ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ./
JH6 AT TAC TAC TAC TAC T.C GGT A.G G.C GT. ... ... ..A ..G ... AC. ... ... ... ... ... ./
Figura 11 Secuencias de los segmentos JH
D1 1-1 GGTACAACTGGAACGAC 1-7 ....T.........T.. 1-20 ....T............ 1-26 ....T.GTG...G.T..TACD2 2-2 AGGATATTGTAGTAGTACCAGCTGCTATACC 2-8 ...........C..A.GGTGTA......... 2-15 .............G..GGT........CT.. 2-21 ..C.......G..G..G---A.......T..D3 3-3 GTATTACGATT---TTTGGAGTGGTTAT---TATACC 3-9 ..........A---...T..C.......---....A. 3-10 .......T..G---G..C.G.GA.....---....A. 3-16 ......T....ACG.....G.GA.....CGT...... 3-22 .......T..G---A.A.T.........---..CTA.D4 4-4 TGACTAC---AGTAACTAC 4-11 .......---......... 4-17 .......---G..G..... 4-23 .......GGTG......C.D5 5-5 GTGGATACAGCTA---TGGTTAC 5-12 .......T..TGGCTAC.A.... 5-18 .............---....... 5-24 ..A..G.TG....---CAA....D6 6-6 GAGTATAGCA---GCTCGTCC 6-13 .G........GCA...G..A. 6-19 .G........GTG...G..A.D7 7-27 CTAACTGGGGA
Figura 12 Secuencias de los segmentos D
Introducción
24
Para la formación del gen funcional completo resultante se requieren tres
eventos de recombinación (VH-D, VHD-JH y VHDJH-C) para las cadenas pesadas de
las Ig (Fig. 13), mientras que bastan dos eventos de recombinación (VL-JL y VLJL-C)
para las cadenas ligeras.
Figura 13 Recombinación somática
a) Organización en el ADN de las familias de genes de las Ig antes de su reordenamiento.
b) ARNm que se sintetiza tomando como molde al ADN reordenado con una copia de un gen V, D y J.
c) Ig ya sintetizada. El reordenamiento de los segmentos V, D y J constituye el extremo VH de la Ig.
El proceso molecular subyacente a la recombinación V(D)J consiste primero en
las rupturas de la doble hebra de ADN, catalizadas por el complejo enzimático
recombinasa V(D)J, seguido de la recombinación de los extremos de los
fragmentos, uniéndose en un proceso de reparación de ADN denominado
ensamblado de extremos no homólogos. Los dos componentes específicos de la
recombinasa V(D)J son dos enzimas codificadas por los genes activadores de la
recombinación RAG-1 y RAG-2 (del inglés recombination-activating gene), que sólo
se expresan en los linfocitos inmaduros de los órganos linfoides primarios. Las otras
enzimas que forman parte de la recombinasa V(D)J se expresan en muchos tipos
celulares y participan en la reparación del ADN.
El proceso de recombinación somática es aleatorio, por lo que no depende ni se
ve influenciado por la presencia de Ag, es decir, que los receptores para el Ag se
expresan antes del encuentro de los linfocitos con los Ag. De hecho, las primeras
recombinaciones de los genes de la Ig ocurren en el locus de la cadena pesada en
las células pro-B. La recombinación al azar, aunque de manera ordenada, de los
elementos individuales que integran el elenco de cada uno de estos segmentos
génicos, origina un alto grado de diversidad de los genes completos resultantes, y
Introducción
25
por tanto de las cadenas polipeptídicas a que estos genes darán lugar. Durante la
unión de los segmentos génicos pueden producirse imprecisiones en el ensamblado,
así como la adición de cortas secuencias palindrómicas (P) de nucleótidos al final de
las secuencias,26 la deleción de un número variable de nucleótidos al final de los
segmentos por actividad exonucleasa, y la inserción de un número variable de
nucleótidos (N) a las uniones V-D y D-J por actividad deoxinucleotidil transferasa
terminal (TdT),27 que es una especie de ADN-polimerasa independiente de molde.
La introducción de estos nucleótidos está regulada desde el punto de vista del
desarrollo: se encuentran inserciones N en el 68% de las células B fetales, en el
86% de las neonatales y en el 91-100% de las células B de los adultos.28 Además,
el segmento génico D puede reagruparse en orientación inversa (3’–5’) o
combinado con otro segmento D (D-D).
Todos estos factores incrementan todavía mucho más la diversidad de los
receptores antigénicos. La gran variedad de combinaciones posibles recibe el
nombre de diversidad combinatorial. Pero hay que tener en cuenta que muchos de
los reagrupamientos y variaciones expuestas a menudo no producen genes
funcionales codificantes de Ig. Cuando esto ocurre se habla de reordenamientos no
productivos. En consecuencia, muchos linfocitos en desarrollo no expresan los
receptores codificados por estos genes y mueren por un proceso de apoptosis,
garantizando así que no se produzcan linfocitos inútiles sin receptores funcionales.
Además, también se elimina por apoptosis aquellas células B inmaduras de la
médula ósea que expresan receptores autorreactivos, manteniendo así la tolerancia
de las células B frente a los autoantígenos (tolerancia central). Sin embargo, en
algunas células B inmaduras que reconocen autoantígenos se puede inducir un
cambio de especificidad mediante un proceso denominado edición del receptor. En
este proceso los genes RAG se reactivan, se producen recombinaciones adicionales
V-J de la cadena ligera y se produce una nueva cadena ligera de la Ig, lo que
permite a la célula expresar un receptor Ig diferente que no es autorreactivo.29
Las Ig constan de dos cadenas H idénticas y dos cadenas L idénticas. Esta
homogeneidad es esencial para el adecuado funcionamiento del sistema inmune, ya
que las Ig que constaran de dos tipos de cadenas pesadas y/o ligeras tendrían dos
sitios diferentes de combinación con Ag y de este modo no podrían formar
entramados con los Ag. A pesar de ello, las células B, que como las otras células
somáticas son diploides, contienen dos familias de genes que codifican las cadenas
H (un alelo materno y otro paterno) y cuatro familias de genes que codifican las
cadenas L (dos κ y dos λ). Las células B son capaces de suprimir la expresión de
todos los alelos, excepto uno de cadena H y uno de cadena L, en un proceso
conocido como exclusión alélica, mediante la inhibición de ulteriores
Introducción
26
recombinaciones somáticas de los genes de la cadena H y de la cadena L, una vez
se ha dado una recombinación productiva.
Si cada segmento génico funcional de la línea germinal tuviera la misma
probabilidad de sufrir reagrupamiento para formar la unidad de transcripción VH-D-
JH, entonces el repertorio de genes V en los linfocitos B preinmunes contendría
todos los segmentos génicos funcionales VH en la misma proporción. Es decir, si
suponemos la existencia de 83 segmentos génicos funcionales en la línea germinal,
la frecuencia de cada uno de ellos, en una población representativa de linfocitos B
preinmunes, sería de 1,2%. Sin embargo esto no es así, sino que algunos genes VH
aparecen con mayor frecuencia que otros.30 Y lo mismo ocurre en el repertorio
preinmune con el uso de los segmentos D y JH.31 Caben dos posibles explicaciones
al sesgo existente en el repertorio de estos genes: por propiedades inherentes a los
genes sobreexpresados o por selección clonal. La primera explicación está
sustentada por el uso restrictivo de genes V que se ha encontrado en
reagrupamientos no productivos de células pre-B,32 por lo que el sesgo ha sido
introducido antes de la expresión de la Ig de superficie, y por tanto antes de
cualquier influencia de Ag. Este sesgo puede deberse al número de copias de cada
gen en la línea germinal, a una accesibilidad ventajosa de la recombinasa frente a
algunos genes o a la presencia de secuencias específicas promotoras o
potenciadoras de transcripción.
2.3.2 Maduración periférica de los linfocitos B: cambio de isotipo e
hipermutación somática
Durante la fase periférica o antigénica del proceso de maduración, los linfocitos
adquieren su competencia funcional efectora. Todos los diferentes isotipos de Ig
utilizan los mismos conjuntos de genes de la región variable. Cuando cambia el
isotipo lo único que debe ser conmutado es la región constante de la cadena
pesada. Así, durante la respuesta inmune, en los centroblastos, las unidades V(D)J
pueden unirse a diferentes genes de la región constante para alterar la clase de Ac
en un proceso denominado recombinación para el cambio de clase (CSR del inglés
class switch recombination), para expresar una de las regiones constantes (Fig.
14), dando lugar así a los distintos isotipos de Ig con sus correspondientes
funciones efectoras.33
Introducción
27
Figura 14 Recombinación para el cambio de isotipo
A pesar de la gran diversidad en el repertorio de Ig, generada por
recombinación somática, dicha diversidad puede aumentar todavía más mediante
otros mecanismos, favoreciendo la maduración de la afinidad de las Ig por los Ag.
La maduración de la afinidad es el proceso que aumenta la afinidad de los Ac por
un Ag determinado a medida que avanza la respuesta humoral, y es el resultado
del aumento en el repertorio de especificidades de Ig, seguido de la supervivencia
selectiva de los clones de células B que producen los Ac de mayor afinidad hacia el
Ag. Esta maduración de la afinidad se produce en los linfocitos B durante su
maduración periférica. Las células B maduras son activadas cuando son estimuladas
por Ag, es decir, cuando sus IgS reconocen específicamente un Ag afín. Los
linfocitos B activados entran en los centros germinales de los órganos linfoides
periféricos, donde se produce una segunda oleada de diversificación en las Ig,
mediante un proceso de hipermutación somática (SHM) y/o de conversión génica
de la región V de los genes de Ig, para generar sitios de unión de alta afinidad para
el Ag.34,35 No parece que exista una relación clara entre el nivel filogenético de las
especies y la elección del mecanismo de maduración de la afinidad. Incluso entre
los mamíferos, diferentes especies usan preferencialmente uno u otro de dichos
mecanismos básicos. La conversión génica se produce principalmente en gallinas y
conejos entre otras especies,36 mientras que la SHM es el mecanismo predominante
en la mayoría de los mamíferos, incluidos humanos y ratones. En el hombre sólo se
produce SHM, por lo que centraremos nuestro interés en el estudio de este
mecanismo.
La maquinaria de la SHM se activa en la primera semana tras la estimulación
antigénica37,38 y continúa durante un periodo limitado de tiempo, cesando varias
semanas después de la activación.39,40 El proceso de SHM tiene lugar en los
linfocitos B, cuando éstos llegan a los centros germinales de los órganos linfoides
periféricos y se convierten en centroblastos y centrocitos con altas tasas de
proliferación.
Introducción
28
En ratones y en humanos, las regiones V de los genes de Ig (principalmente en
las regiones determinantes de la complementariedad de unión al Ag) de los
centroblastos muestran tasas de hasta 10-3 mutaciones por cada pb y división
celular. Estas tasas mutacionales son por lo menos un millón de veces superiores a
las observadas en otros genes,41 motivo por el cual la mutación del los genes V de
las Ig se denomina también hipermutación. Los genes V de las cadenas H y L
expresados de cada célula B contienen un total de unos 700 nucleótidos; esto
implica que las mutaciones se acumularán en las regiones V expresadas a una tasa
media de casi una por división celular. Semejante tasa mutacional tendría un efecto
devastador en cualquier célula; por ejemplo, cuando se produce SHM en genes
distintos de los de Ig, puede ser causa de linfomas.42 Sin embargo, el proceso de
SHM se encuentra estrechamente regulado, de tal manera que, en circunstancias
normales, el proceso tiene lugar sólo en la región reagrupada V(D)J de los genes de
Ig de las células B, durante una breve etapa de su desarrollo y en un
microambiente fisiológico muy restringido como son los centros germinales.43 Al
parecer, las células B poseen enzimas que intervienen en el proceso de SHM de los
segmentos génicos que codifican las regiones variables de las Ig. No obstante, la
secuencia de ADN objeto de SHM no tiene que ser necesariamente la de una Ig,
pues sustratos artificiales o secuencias de bacterias que se encuentren en el
contexto de un gen de Ig, pueden también mutar.44
La SHM incrementa en varios órdenes de magnitud el número posible de Ac
diferentes que se pueden producir, en relación a los estimados a partir de
recombinación somática. El número final es tan elevado, que un individuo sintetiza
sólo una pequeña fracción de su repertorio potencial de Ig. También se ha
demostrado que la progenie de un solo clon de células B acumula progresivamente
mutaciones con el paso del tiempo desde la inmunización. Así, se ha descrito que el
proceso de SHM puede generar más o menos mutaciones en un gen IgV,
dependiendo de la cantidad y el tiempo de la exposición antigénica,45,46 de forma
que la inmunización con bajas dosis de Ag favorece patrones mutacionales con
pocas mutaciones, mientras que altas dosis de Ag, o exposiciones repetidas a un
mismo Ag, favorecen patrones mutacionales con mayor número de mutaciones.
Estas mutaciones somáticas pueden generar Ac de grandes afinidades hacia el Ag.
Las células B portadoras de genes mutados son seleccionadas para sobrevivir en
base a la afinidad de la Ig codificada por el Ag activante.43
Introducción
29
2.3.2.1 Distribución de las mutaciones somáticas
La SHM está restringida a un pequeño segmento de ADN, que incluye todo el
segmento que codifica la región V.47 En el extremo 5’ la SHM comienza
repentinamente, tanto en las cadenas pesadas como en las ligeras48. Dicho
surgimiento de las mutaciones, independientemente de la secuencia de ADN, se
produce a unas 150-200 bases después del promotor,49 extendiéndose
aproximadamente 1,5 kb, terminando prácticamente antes del potenciador
intrónico (Eµ) y siendo muy escasas en la región C.50
Las mutaciones somáticas consisten principalmente en sustituciones
individuales de bases, aunque ocasionalmente también se pueden producir
inserciones y deleciones de uno o varios nucleótidos en genes V de Ig durante la
SHM (menos del 2% de los clones con mutaciones somáticas),51 siendo una forma
adicional de diversificar el repertorio de Ig intrínsecamente relacionada con el
proceso de SHM.52
Desde el punto de vista de los nucleótidos sustituidos, las sustituciones pueden
ser: transiciones, cuando cambia una purina por la otra purina, o una pirimidina por
la otra pirimidina, y transversiones, cuando se sustituye una purina por una
pirimidina, o una pirimidina por una purina.
Atendiendo al posible cambio del aminoácido codificado por el codón donde se
produce la mutación somática, las mutaciones que se producen en el genoma
codificante pueden ser silentes (S) cuando no afectan a la secuencia de
aminoácidos, o bien reemplazantes (R) cuando tienen efecto fenotípico, alterando la
secuencia de aminoácidos y, por tanto, la funcionalidad de la proteína.
El análisis molecular de los patrones de distribución de las mutaciones
somáticas en segmentos génicos IgV, es de gran utilidad en los estudios sobre el
desarrollo normal o anormal de linfocitos B. La maduración periférica de los
linfocitos B y, más concretamente, la maduración de la afinidad de las Ig hacia los
Ag, es el resultado de un proceso de SHM sobre los reagrupamientos génicos V(D)J
y una selección antigénica de los mutantes con mejor afinidad hacia el Ag. Por ello,
resulta de gran interés poder evaluar si una determinada distribución de
mutaciones en un gen IgV se debe al proceso de selección antigénica o si es sólo
consecuencia directa de la SHM. En la mayor parte de la literatura publicada, se
comparan los valores esperados y observados de las frecuencias de mutaciones R y
S, en los CDR y FR de los genes de Ig, para evaluar el grado de selección
antigénica.
Introducción
30
Como consecuencia de la degeneración del código genético, muchas mutaciones
puntuales en la tercera base de un codón son fenotípicamente silentes, ya que el
codón mutado codifica el mismo aa que el codón silvestre. Existe un total de 526
sustituciones posibles de nucleótidos (392 reemplazantes y 134 silentes) en los 61
codones que codifican los 20 aminoácidos. Como resultado, en ausencia de una
presión selectiva sobre la producción de los genes, un proceso mutacional aleatorio
conllevaría una distribución uniforme de mutaciones a lo largo de toda la secuencia,
con un 75% de mutaciones R y un 25% de mutaciones S. Sin embargo, las Ig
seleccionadas por Ag poseen una mayor frecuencia de mutaciones R en las CDR de
los genes IgV que en las FR, donde la proporción de mutaciones S suele ser mayor.
La suposición inicial fue que la selección antigénica crea un sesgo a favor de las
mutaciones R en los CDR y de las mutaciones S en los FR,53 por lo que la tendencia
a que el ratio R/S sea mayor en CDR que en FR, se ha considerado como un
indicativo de selección por Ag.54 El alto ratio de mutaciones R/S característico de los
segmentos génicos CDR de los IgV de afinidad ya madurada, es consistente con el
efecto de una presión positiva sobre la maduración para conseguir una mayor
afinidad hacia el Ag.55 A su vez, el bajo ratio R/S característico de las secuencias
FR, es consistente con su necesidad de preservar la estructura del Ac alrededor de
los sitios de unión al Ag.
En cuanto a la producción de las mutaciones durante el proceso de SHM, se
asumió inicialmente un patrón aleatorio en la distribución de las mutaciones R y S,
cuando Shlomchik et al.56 aplicaron, en sus trabajos realizados con ratones, un
modelo de distribución binomial para determinar la probabilidad de que una
distribución determinada de mutaciones en los CDR se deba a un proceso de
selección antigénica. Este modelo considera que las mutaciones pueden tener lugar
aleatoriamente en cualquier posición del gen de IgV con igual probabilidad. Por lo
tanto, de acuerdo con la aplicación de este modelo y en ausencia total de presión
selectiva, el número de mutaciones en una región particular sería proporcional a la
longitud relativa de dicha región. De esta forma, en el caso de las IgVH la frecuencia
de mutaciones en FR sería tres veces mayor que en CDR, al ser la longitud de FR
aproximadamente el triple que la de CDR. De esta forma, un ratio (R en CDR / R en
FR) > 0,3 indicaría selección antigénica.
Sin embargo, posteriormente se comprobó la existencia de diferencias
intrínsecas de la mutabilidad entre regiones diferentes de un segmento génico IgV,
lo que crea durante el proceso de SHM un sesgo estadísticamente significativo,
incluso en ausencia de selección antigénica.57,58,59,60 Por tanto, la SHM dista
bastante de ser un proceso totalmente aleatorio, y las secuencias CDR y FR de los
Introducción
31
segmentos génicos IgV difieren significativamente en sus susceptibilidades
inherentes para sufrir mutaciones simples de nucleótidos. La probabilidad de que
una sustitución (R o S) se produzca en una determinada región depende también
de la composición de los codones de dicha región. Hay una tendencia a que se
produzcan más mutaciones R que S en los CDR y a que se produzcan más
mutaciones S que R en los FR. Esto es debido a que los CDR contienen codones
más susceptibles de sufrir mutaciones R que los FR. Para dar cuenta de la
susceptibilidad inherente de los CDR y FR hacia las mutaciones R, Chang y Casali
calcularon la tendencia relativa a sufrir mutaciones R de las distintas regiones de
los genes IgV de la línea germinal,61 mediante el parámetro Rf = Rp / (Rp + Sp) (ver
sección 4.7.3). Después usaron los valores obtenidos de Rf para calcular las
frecuencias esperadas de mutaciones R y S en los CDR y FR para un número dado
de mutaciones totales. Para una línea germinal con la misma proporción de todos
los codones posibles y cuyos productos no estén sometidos a una presión selectiva
se puede demostrar que Rf = 0,745 y que R/S = 2,925. Los CDR contienen más
codones susceptibles de sufrir mutaciones R, presentando unos valores de Rf y R/S
inherentes mayores que los que cabría esperar en una secuencia aleatoria. Por el
contrario, las secuencias FR contienen codones menos susceptibles de sufrir
mutaciones R, presentando unos valores de Rf y R/S inherentes menores que los
esperados. Por tanto, la acumulación de mutaciones de nucleótidos a lo largo de la
secuencia de ADN de un segmento génico IgV, dará lugar a un mayor ratio R/S en
CDR que en FR, incluso en ausencia de selección antigénica. Según lo expuesto, se
consideró un ratio R/S > 2,925 en CDR como una marca de selección antigénica.
Además, Chang y Casali también utilizaron el modelo de distribución binomial
propuesto por Shlomchik et al., para calcular la probabilidad asociada a un
particular número de mutaciones R en una determinada región mediante un
proceso estocástico.
Por otro lado, aunque las mutaciones se producen a lo largo de todas las
regiones de reagrupamiento V y sus flancos inmediatos, varios estudios han
demostrado la existencia de motivos y regiones exclusivas a lo largo de los genes
Ig, denominados hotspots, que parecen ser blancos preferenciales de la maquinaria
mutacional.62,63 La secuencia RGYW y su antisentido WRCY (R = A o G, Y = C o T,
W = A o T) está consensuada como objetivo preferente de hipermutación, mediante
análisis de IgVH humanos seleccionados64. Mediante el análisis de mutaciones en
secuencias no codificantes en genes IgV de origen murino, se ha identificado
dinucleótidos (GC y TA) y trinucleótidos (AGC, TAC, GCT y GTA) como objetivo
también preferente de las mutaciones.65 Mientras algunas bases constituyen
hotspots para las mutaciones, otras están rigurosamente conservadas (coldspots),
Introducción
32
sin embargo la mayoría forman un espectro entre ambos extremos, variando su
susceptibilidad hacia la SHM. Los hotspots acumulan sobre el 50% de las
mutaciones, el resto se producen en coldspots y zonas neutras. Los 64 tripletes de
nucleótidos han sido ordenados de mayor a menor mutabilidad en base a un
estudio realizado a partir de una amplia base de datos de mutaciones somáticas en
segmentos génicos IgV.63 El nucleótido G perteneciente al hotspot de mayor
mutabilidad (AGC) posee un índice de mutabilidad (IM) de 3,36 que indica que es
3,36 veces más susceptible de ser mutado que si el proceso fuera independiente de
la secuencia. El nucleótido G en el contexto de primer nucleótido del coldspot GAC
posee un IM = 0,09 que indica que muta unas diez veces menos de lo esperado.
Los datos proceden de regiones no traducidas, por lo que es improbable que hayan
sufrido sesgo por selección antigénica.
Un problema crítico con el que nos encontramos, a la hora de analizar los
patrones mutacionales en secuencias sujetas a SHM, es el efecto de la selección
antigénica. Este efecto incrementa la tendencia de las mutaciones a acumularse en
los CDR, ya que las mutaciones que producen un deterioro en la función del Ac
(principalmente en las FR), o que disminuyen la afinidad por el Ag, generalmente
acaban en la apoptosis de la célula portadora de dichas mutaciones.66 En este
sentido, el análisis de los reagrupamientos no productivos (secuencias fuera del
marco de lectura) de genes VH de células B, proporciona una oportunidad para
examinar el impacto inmediato del proceso de reagrupamiento V(D)J o de la SHM
sin la influencia impuesta por la selección por Ag, dado que los reagrupamientos no
productivos no codifican una proteína y por tanto las células B que expresan estos
reagrupamientos no están directamente influenciadas por dicha selección.
Por otro lado, sería de gran interés el estudio del papel preciso de la maquinaria
mutacional versus la subsiguiente selección sobre la frecuencia y distribución de las
mutaciones en el repertorio de Ig humanas expresadas. La comparación de los
patrones mutacionales entre reagrupamientos productivos y no productivos de
genes VH humanos,67 proporcionaría una mayor comprensión sobre las influencias
de la SHM y la subsiguiente selección sobre el repertorio expresado de IgVH.
Introducción
33
2.3.2.2 Mecanismos moleculares de la hipermutación somática
A pesar de la importancia de la SHM en la respuesta inmune humoral, se sabe
relativamente poco acerca de su mecanismo molecular, aunque el desarrollo de
modelos in vitro ha permitido profundizar más en su conocimiento.68 También el
análisis de mutaciones somáticas en secuencias fuera del marco de lectura ha
demostrado ser una poderosa herramienta para la elucidación del mecanismo de la
SHM, al no presentar éstas el sesgo de la selección antigénica.
Aunque la SHM y la CSR tienen lugar en las células B en la misma fase de
diferenciación, parecían estar sujetos a procesos bioquímicos diferentes. Existen
IgM que expresan regiones V que han experimentado SHM, así como IgG e IgA sin
mutaciones somáticas, lo cual sugiere que la SHM y la CSR son procesos
independientes mediados por enzimas diferentes. Sin embargo, el descubrimiento
de un enzima presente en las células B y conocida como citidina deaminasa
inducida por activación (AID del inglés activation-induced cytidine deaminase) y la
demostración de que es necesaria en los procesos de SHM, conversión génica y
CSR, ha producido muchos de los recientes avances en este campo.69 La AID sería,
por tanto, un elemento esencial en la generación de la diversidad de Ac, pues
representaría un punto de convergencia para tres de los mecanismos que generan
dicha diversidad. Sin embargo, cómo la AID está implicada en esos tres procesos
continúa siendo un misterio.
La iniciación de la transcripción parece estar directamente implicada en el
proceso de hipermutación, tanto en los genes de las cadenas ligeras como de las
cadenas pesadas.70 Aunque la SHM y la transcripción están reguladas de diferente
forma, ciertos elementos reguladores de la transcripción activan la hipermutación,71
de forma que la transcripción es necesaria pero no suficiente para activar la SHM.72
La duplicación del promotor puede crear un segundo dominio mutacional, y cuando
el promotor transcripcional de una región V se sitúa antes de la región C se observa
una tasa mutacional en C del mismo orden que la de la región V. Basándose en
este hallazgo se propuso un modelo en el que la SHM está asociada a la
transcripción, requiriendo la acción de varios elementos potenciadores específicos,
pero no la del promotor 5’ ni la de la secuencia intacta del gen de Ig.73 Así, genes
irrelevantes de mamíferos, o incluso bacterianos, pueden sufrir mutaciones si
residen dentro del contexto de un gen de Ig y de sus elementos reguladores.74
Estos resultados sugieren que son las características del locus de Ig, pero no la
misma secuencia codificante, las que pueden haber evolucionado para permitir la
SHM. Sin embargo esta conclusión es discutible, debido a que el análisis mutacional
Introducción
34
de sustratos que contienen los elementos reguladores de Ig, indican que los genes
no-Ig no mutan en el mismo grado que los genes Ig.74
La actual hipótesis, ampliamente aceptada, es que la SHM es un proceso que
ocurre en dos pasos:75
• Inicialmente el proceso tiene lugar mediante la acción de la AID que cataliza
en el ADN la desaminación de citidina, que pasa así a convertirse en uracilo. La
lesión generada por esta mutación es resuelta por diferentes mecanismos,
dependiendo de la región donde se produce. En los hotspots RGYW/WRCY se
reflejan las preferencias del complejo AID76 en cuanto a las mutaciones de G y C.
La ausencia de un sesgo de hebra en mutaciones G/C unido al hecho de que los
motivos RGYW/WRCY sean secuencias complementarias inversas la una de la otra,
apuntan a un mecanismo no dependiente de hebra.59
• El segundo paso de la SHM implica enzimas polimerasas con baja fidelidad de
copia (error prone repair) que generan más mutaciones, en este caso de A y T. En
varios estudios se ha observado un sesgo de hebra de mutaciones A vs mutaciones
T, encontrándose mayor número de mutaciones de A.77 El motivo de hotspot para
mutaciones de A generalmente aceptado es WA.78 Una evidencia de que estas
mutaciones A/T tuvieran lugar mediante el mismo mecanismo sobre ambas hebras
de ADN, sería que las mutaciones de T se produjeran preferentemente en el
hotspot TW, complementario inverso de WA. Esto es lo que se ha encontrado en
algunos casos, habiéndose utilizado para predecir las mutaciones de T.79 Sin
embargo, otros estudios muestran que el hotspot para las mutaciones de A y T
varía dependiendo de que las mutaciones sean transiciones o transversiones,80 no
siendo necesariamente secuencias complementarias inversas. Por tanto, el sesgo de
hebra en las mutaciones A/T indica una posible preferencia del proceso mutacional
sobre una de las hebras de ADN, o la existencia de dos procesos mutacionales
separados para las mutaciones de A y las de T.
Introducción
35
2.3.3 Selección por Ag en los centros germinales
Los procesos de recombinación y mutación somática están muy regulados, de
forma que cada linfocito B sólo expresa un gen (reordenado y mutado
adecuadamente) de la cadena pesada y otro de la cadena ligera, produciendo un
único tipo de Ig. La especificidad de las Ig, como se ha visto, está determinada por
la estructura primaria de la molécula, cuya diversidad corresponde a su origen
policlonal: cada línea o clon celular sólo es capaz de formar Ig o receptores de una
única especificidad, habiendo al menos tantos clones celulares distintos como
especificidades de reconocimiento antigénico. La maduración de la afinidad de los
Ac durante la respuesta inmune se basa en dos mecanismos: uno molecular, que
implica la introducción de mutaciones somáticas en los genes reagrupados de Ig, y
otro celular, que implica la selección y expansión clonal de las células B que
expresan en su superficie Ig de alta afinidad por Ag.43
Algunas de las mutaciones somáticas en los genes de las Ig son de utilidad,
porque generan Ac de mayor afinidad. Otras mutaciones pueden introducir un
codón de stop, impidiéndose la producción de la cadena polipeptídica completa de
Ig. Sin embargo, muchas de las mutaciones pueden provocar una reducción de la
afinidad en la unión al Ag , o incluso una falta de unión al mismo. Además, una
gran proporción de genes de Ig mutados se vuelven no funcionales o conducen al
desarrollo de receptores autorreactivos que se unen a Ag propios, desarrollando
una peligrosa auto-anti-especificidad. Por consiguiente, el paso siguiente y crucial
en el proceso de maduración de la afinidad es la selección de las células B útiles de
gran afinidad. Por tanto, el potencial de la SHM para generar diversidad en las
moléculas de Ig hacia las uniones con Ag, implica como coste la eliminación de un
gran número de células B del repertorio inmune expresado, pues la proporción de
linfocitos B en los que las mutaciones somáticas disminuye la afinidad de sus Ac es
elevada. La selección por Ag conduce así a la expansión de las células B que
contienen mutaciones que incrementan la afinidad hacia el Ag exógeno. De esta
forma sólo los “mutantes” que enlazan al Ag con alta afinidad sobreviven,
reduciendo así la presencia en el sistema inmunitario de clones celulares inútiles
para la defensa del organismo.
Sobre el 90% de los linfocitos B mueren por apoptosis debido a la selección
clonal.81 Así, la respuesta de los linfocitos B a los Ag constituye un microcosmos de
evolución Darwiniana, en la que el entorno (Ag) y las mutaciones del gen V
cooperan para seleccionar los clones de células B cuyas Ig respondan mejor al reto
antigénico. Un buen número de evidencias indican que este fenómeno selectivo
tiene como base la existencia de una cantidad limitada de Ag, que es presentado en
la superficie de las células dendríticas foliculares dentro del centro germinal. Los
Introducción
36
centrocitos con IgS de alta afinidad reconocen al Ag y reciben señales de
supervivencia; los menos afines son desplazados de dichas señales y sufren
apoptosis.
Los linfocitos B seleccionados tras el proceso de selección por Ag se
transforman en células plasmáticas y en células B de memoria. Las células de
memoria adquieren la capacidad para sobrevivir durante largos períodos,
aparentemente sin estimulación antigénica, y son capaces de poner en marcha
respuestas rápidas frente al contacto posterior con el mismo Ag. También es
posible que las células de memoria se estén generando de forma continua y que
sean mantenidas gracias a una estimulación de bajo nivel proporcionada por el Ag,
que puede ser expresado por las células dendríticas foliculares durante meses o
años. No se sabe por qué algunas de las progenies de los clones de células B
estimuladas por el Ag se diferencian hacia células secretoras de Ac de vida breve,
mientras que otras llegan a ser células de memoria funcionalmente inactivas y de
vida larga.
La diferenciación inducida por Ag de las células B vírgenes o de memoria
culmina con la formación de células secretoras de Ac, que pueden identificarse
desde el punto de vista morfológico como células plasmáticas.
2.4 Células plasmáticas
Los linfocitos B experimentan un proceso de diferenciación que, en su fase
efectora final, genera una forma celular denominada célula plasmática (CP), capaz
de fabricar Ac a gran escala, pero incapaz de dividirse. Las CP exhiben una
morfología característica y, en correspondencia con la función que se les atribuye,
presentan una gran cantidad de Ig en su citoplasma, lo que permite identificarlas
por microscopía mediante su tinción.82 La CP es la fase celular B que presenta la
tasa más alta de transcripción de ARNm para la forma soluble de las Ig, que
muestra la vida media más larga y que posee la mayor tasa de secreción de Ig (107
moléculas/célula/hora).83 Las Ig producidas por una CP poseen una sola
especificidad y pertenecen a una solo isotipo.
Las CP tienen núcleos de aspecto característico (Fig. 15): un abundante retículo
endoplasmático rugoso (lugar de síntesis de Ig) y aparato de Golgi perinuclear bien
definido, en el que las moléculas de Ig se convien¡rten en sus formas finales y son
empaquetadas para su secreción.
Introducción
37
Figura 15 Linfocito B y célula plasmática.
Las CP se desarrollan en los órganos linfoides y en sitios de respuestas
inmunes, como resultado final de procesos de activación, proliferación y
diferenciación de los linfocitos B específicos, en presencia del Ag y de estímulos
producidos por linfocitos T y otras células adyuvantes. Las CP tempranas se forman
en la denominada reacción extrafolicular, en la que algunos linfocitos B pueden
diferenciarse en CP de vida corta, cuyos segmentos génicos VH mantienen su
configuración germinal al no haber sufrido todavía mutaciones somáticas.84 En el
caso de existir linfocitos B de memoria para el Ag inductor, éstos son también
reclutados en estos focos, donde se diferencian a CP tempranas. Posteriormente, y
si existe suficiente Ag, se produce la activación del centro germinal. En los centros
germinales los linfocitos B proliferan, maduran la afinidad de sus Ig mediante SHM
y selección antigénica, y experimentan cambio de isotipo.85 Tras estos procesos
algunas CP migran a la médula ósea, donde pueden sobrevivir durante largos
periodos de tiempo una vez inducida la respuesta inmune, e incluso una vez
eliminado el Ag; sólo una pequeña proporción permanece en otros órganos
secundarios como el bazo.86 El mecanismo selectivo por el cual algunas CP no
sufren apoptosis y tienen la capacidad para emigrar a la MO no está claramente
establecido, si bien es posible que la mayor afinidad por el Ag de las Ig intervenga
de alguna manera, aún no conocida, en esa selección.
Las CP han sido consideradas generalmente como una etapa final y
homogénea, tanto morfológica como funcional, de la diferenciación de las células B.
Sin embargo, la vida de las CP puede variar entre unos pocos días hasta varios
meses. Estudios en animales de experimentación revelaron diferencias importantes
dentro de este compartimento celular, según el órgano estudiado. Así,
experimentos en ratas revelaron que la vida media de las CP de áreas inductivas
(bazo, ganglios) era inferior a 3 días, mientras que la de las presentes en la MO era
superior a 3 semanas.87 Más recientemente, mediante experimentos en animales
Introducción
38
inmunizados, se ha demostrado la existencia de CP específicas de larga vida (hasta
3 meses), aunque sólo en la MO.88 Estos hallazgos concuerdan con la observación
de que las CP presentes en áreas inductivas, pero no las de MO, desarrollan rápida
apoptosis masiva in vivo.89 Por tanto, los datos apuntan la existencia de marcadas
diferencias en cuanto a longevidad y a susceptibilidad para sufrir apoptosis por
parte de las CP presentes en diversos órganos.90 Además, se han presentado
evidencias de la existencia de diferencias en la frecuencia y distribución de las
mutaciones somáticas en los segmentos génicos IgV entre CP de distintos órganos,
indicando un progresivo enriquecimiento de CP que sintetizan Ig de mayor afinidad,
que generalmente tienen mayor número de mutaciones, en los órganos de
depósito.91,92 Conjuntamente, estos datos indican que los niveles de maduración
funcional de las CP no son homogéneos, siendo mayor en los órganos de depósito
que en los órganos inductivos.
La biología de las CP humanas se conoce en menor extensión por razones
experimentales obvias, aunque parece razonable pensar que pueden seguir un
modelo madurativo similar al descrito en animales, hipótesis apoyada en el hecho
de que se han observado diferencias en la capacidad de sufrir apoptosis, así como
en la cinética de secreción de Ig, entre CP de diferentes tejidos.93,94 Un bajo
número de CP está presente en áreas inductivas de órganos linfoides secundarios,
como resultado de la continua activación por Ag;95 mientras que la médula ósea es
el mayor reservorio de CP, no siendo generadas in situ sino en áreas inductivas,
alcanzando después la médula ósea como precursores circulantes.96,97 En este
contexto, el precursor circulante de las CP de médula ósea puede representar una
etapa transicional entre las CP tempranas de los órganos inductivos y las CP de la
médula ósea.98 Puesto que la generación de Ac con mayor afinidad es un fenómeno
tardío de la respuesta humoral, y que se focaliza en la MO, debe existir un
reclutamiento selectivo de CP que contengan IgV mutados de la forma más
conveniente para incrementar la afinidad de las Ac. De hecho, se ha podido
demostrar que el incremento de la afinidad de los Ac producidos por CP de la MO
ocurre de forma progresiva, por un mecanismo posterior a la desactivación del
centro germinal, y aparentemente ejercido directamente sobre las CP reclutadas en
este órgano.99
Es interesante también destacar que experimentos realizados en nuestro
laboratorio indican que en amígdala humana coexisten dos poblaciones de CP que
difieren en: intensidad de unión a los tejidos, capacidad secretora de Ig y expresión
de moleculas de adhesión.100 La primera población celular (CPADM) se aisla mediante
procedimientos de disgregación mecánica, mientras que la segunda población
celular (CPADC) se aisla mediante un tratamiento de los restos de amígdala, que
Introducción
39
quedan de la disgregación mecánica, con colagenasa para liberar células más
intensamente unidas al tejido. El marcaje CD20/CD38 muestra que ambas
fracciones presentan un porcentaje similar de CP (células CD38h). Sin embargo, las
células de la fracción CPADC producen cuatro veces más IgA y dos veces más IgG
que las de la fracción CPADM, aunque la producción de IgM es similar en ambas
fracciones. Estas diferencias, en cantidad de Ig y distribución de isotipos,
difícilmente podía explicarse por una mayor presencia de células secretoras en los
cultivos de la fracción CPADC, pues la frecuencia de la subpoblación CD38h era
similar en ambos casos. En cuanto a marcadores de supervivencia y apoptosis, las
dos moléculas estudiadas CD95 y Bcl-2 también presentaban diferencias que,
unidas a los datos previos, indicaban que las CPADC han alcanzado mayor nivel de
maduración.
Las CP, como estadío terminal en la diferenciación B, tambien han sido
estudiadas en cuanto a sus mutaciones somáticas, si bien su estudio ha estado
confinado a muestras escasas, lo que imposibilita un análisis exhaustivo, y
principalmente a su localización en lámina propia intestinal, donde este tipo de
célula es muy abundante. Los estudios de secuenciación de los genes IgVH
utilizados por CP aisladas de bazo y lámina propia humanos, han demostrado un
mayor número de mutaciones en los CDR en las CP de lámina propia.101 Esto último
parece indicar la presencia de mecanismos selectivos sobre aquellas CP que
fabrican Ac de mayor afinidad. No existen datos sobre el número de mutaciones
somáticas presentes en las IgV de las CP humanas de SP y MO.
Objetivos
40
3. Objetivos
Objetivos
41
Hipótesis de trabajo
Los datos disponibles indican que el compartimento de las CP dista mucho de
ser homogéneo. Fenómenos de la biología de estas células, tales como la necesaria
emigración de las CP desde las áreas formadoras o inductivas a los órganos de
deposito, el papel de la apoptosis de buena parte de las CP tempranas, o la
selección en la MO de las CP con Ig más eficaces, están aún por esclarecer. Por
tanto, establecer hipótesis acertadas y globales de cómo funcionan las CP,
esenciales para la respuesta humoral, es aventurado. En primer lugar, es necesario
aclarar y caracterizar al máximo las distintas etapas del proceso. En humanos,
aunque hay datos parciales que lo sugieren, resta por establecer con claridad la
jerarquía madurativa entre CP de órganos inductivos (amígdala, ganglio, bazo),
tejido migratorio (sangre) y órganos de depósito (MO, LP). Se propone que las CP
circulantes se reclutan de entre las CP de mayor afinidad (mayor frecuencia de
mutaciones somáticas) de entre las generadas en las respuestas tempranas de los
órganos inductivos. Por lo tanto, este gradiente de madurez creciente podría
demostrarse mediante el análisis comparativo del número y características de las
mutaciones que presenten los segmentos génicos IgVH de las CP, datos hasta la
fecha desconocidos para la mayoría de los territorios nombrados.
Objetivos
En los estudios de hipermutación somática es necesario el procesamiento de
numerosos datos, lo que supone un gran consumo de tiempo y un riesgo potencial
de error. Por ello, nos hemos planteado crear un protocolo informatizado, mediante
el desarrollo de una aplicación informática, que permita disminuir el tiempo de
procesamiento de estos datos, así como aumentar la fiabilidad al minimizar el error
humano en dicho procesamiento de datos. Es decir, pretendemos desarrollar una
aplicación informática, que automatice la comparación de las secuencas de los
clones obtenidos con los de la familia VH correspondiente, así como el
procesamiento de todos los datos necesarios en los estudios de SHM para su
posterior análisis.
Habiéndose encontrado evidencias de que existen dos poblaciones de CP en
amígdala, se propone estudiar también si el patrón de SHM de los segmentos
génicos IgVH en ambas poblaciones difiere o no entre ellas y entre los diferentes
isotipos que pretendemos estudiar.
El objetivo general de esta tesis es aportar datos que permitan confirmar la
hipótesis de que en las CP existe un gradiente madurativo entre órgano inductivo y
Objetivos
42
tejido sanguíneo, que se evidenciaría en un aumento del número de mutaciones en
los segmentos génicos IgVH en el sentido de dicho gradiente, asumiendo una
correspondencia funcional a nivel genético en cuanto a maduración de la respuesta
inmune. Se propone también que estas diferencias madurativas se evidenciarán
entre los isotipos IgM, IgG e IgA, y por tanto en los estadíos de la respuesta
inmune, al corresponder cada isotipo a respuestas inmunes más tempranas o
tardías.
Los objetivos específicos a alcanzar son los siguientes:
- Generar una herramienta que posibilite la informatización del procesamiento de
datos de los estudios de SHM
- Estudiar comparativamente el nivel de madurez de las poblaciones de CP,
mediante:
- Disposición de ADNc procedente de poblaciones altamente purificadas de CP
humanas obtenidas de territorios inductivos (amígdala) y territorio
migratorio (sangre).
- Secuenciación de los genes de CP que codifican la región variable de las
cadenas pesadas de las Ig, más concretamente la IgVH3, que es la que
cuenta con más miembros (22 funcionales) y es la más usada de entre todos
los IgVH.
- Análisis de las mutaciones observadas.
- Comparación de las mutaciones (número, clase y localización) entre las
diferentes zonas de la región variable de la molécula de Ig, FR1, CDR1; FR2,
CDR2, FR3, FR (suma de las FRs), CDR (suma de las CDRs), y total (región
V completa). No se ha incluido CDR3 donde la hipermutación somática no
puede distinguirse de la diversidad debida a la imprecisión de unión de los
segmentos VDJ.
- Estudio del uso de segmentos D y J.
- Longitud del segmento CDR3
Materiales y métodos
43
4. Materiales y métodos
Materiales y métodos
44
4.1 Metodología
Los procedimientos que se describen a continuación proceden de diversas fuentes
bibliográficas. En general se siguen básicamente las especificaciones de la literatura,
excepto pequeñas modificaciones. La mayor parte de los protocolos pueden encontrarse
en manuales generales de Biología Molecular tales como “Molecular cloning” 102 y “Current
protocols in molecular biology”.103 En aquellos casos, en los que el protocolo se ha
obtenido de una fuente literaria diferente a las mencionadas anteriormente, artículo
científico o protocolo de una casa comercial, se indica la referencia correspondiente o la
compañía que comercializa el producto.
De forma muy resumida, los pasos a seguir en todo el proceso necesario para el
estudio de las mutaciones somáticas de genes IgV de CP son los siguientes:
● Purificación de CP humanas de diferentes territorios.
● Purificación de ARN total a partir de las CP.
● Síntesis de ADNc a partir de ARN.
● PCR para amplificación del ADNc.
● Purificación de la solución de ADN.
● Digestión del ADN con XbaI.
● Ligación del plásmido con el ADN.
● Transformación.
● Cultivo en placa.
● Crecimiento en LB-Amp.
● Minipreps.
● Reacción de secuenciación.
● Análisis de las secuencias.
● Análisis y procesamiento informático de los datos.
● Análisis estadístico.
Materiales y métodos
45
4.2 Purificación de células plasmáticas humanas
Las CP que se han utilizado en el presente estudio, fueron purificadas siguiendo los
protocolos de purificación descritos por Medina et al.98 Se resume a continuación los
procesos básicos seguidos para cada territorio.
4.2.1 Purificación de células plasmáticas de amígdala
Las amígdalas se obtuvieron a partir de pacientes, con edades comprendidas entre
los 6 y los 12 años, sometidos a amigdalectomía por amigdalitis crónica, no siendo
necesarias para su diagnóstico. Como ya se ha mencionado, en la amígdala coexisten dos
poblaciones de CP que difieren en intensidad de unión a los tejidos, capacidad secretora
de Ig y expresión de moléculas de adhesión.
La primera población de CP de amígdala (CPADM) se obtuvo del siguiente modo:
1. El tejido, inmerso en disolución de Hank, se disgregó mecánicamente cortando y
presionando con ayuda de pinza y bisturí hasta que quedó reducido a restos fibrosos.
2. La suspensión así obtenida se dejó reposar durante 5 min. en un tubo de 50 ml sobre
hielo picado para que sedimentaran los agregados de mayor tamaño.
3. A continuación se recogió el sobrenadante, con cuidado de no movilizar el sedimento
y se centrifugó (10 min. a 400 g y 4oC). El pellet así obtenido se resuspendió en
disolución de Hank.
4. Finalmente, los linfocitos T se eliminaron de la suspensión de células mediante la
técnica de rosetas de hematíes de carnero.104 A la población celular resultante la
denominamos células BADM.
La segunda población de CP de amígdala se obtuvo por extracción de células de los
tejidos mediante digestión con colagenasa para digerir la matriz y de este modo extraer
las células allí alojadas. El tejido se desmenuzó en pequeños trozos (<2-3 mm de
diámetro) y se incubó 15 minutos a 37ºC en agitación en medio RPMI 1640 junto con 1
mg/ml de colagenasa V. Acabado el tratamiento se añadió medio de cultivo, suplementado
con STF (suero de ternera fetal) para inhibir la colagenasa, se lavaron las células (7 min. a
400 g y 4oC) y se resuspendieron adecuadamente. A la población celular resultante la
denominamos células BADC.
La purificación de CP, tanto para CPADM como para CPADC, se realizó mediante un
enriquecimiento previo de células CD38a (a = alta intensidad), mediante selección de
células activadas por inmunomagnetismo (MACS del inglés immunomagnetic activated cell
selection) vía CD31+, mediante técnica descrita por Medina y col.105 Después se purificó la
subpoblación CD38a mediante una técnica de separación por fluorescencia activada (FACS
del inglés fluorescence activated cell sorting). La pureza en CP en estas fracciones fue
superior 97%.
Materiales y métodos
46
4.2.2 Purificación de células plasmáticas de sangre periférica
Las CP del territorio de sangre periférica (SP) se obtuvieron a partir de muestras de
sangre, que procedían de voluntarios vacunados con una dosis de recuerdo de toxoide
tetánico. De este modo se obtiene una respuesta rápida frente al Ag, que genera en SP
una oleada de CP específicas. Transcurridos 6 días, momento en que la presencia de CP es
máxima, se extrajeron 50-200 ml de SP a cada voluntario y se la sometió a una
separación en gradiente de Ficoll para obtener la fracción mononuclear.
La purificación de las CP se realizó con un enriquecimiento previo mediante MACS vía
CD19+. De este modo se obtuvo la fracción CD19+ que se enriquecía en células CD38a y
constituía un punto de partida adecuado para purificar la subpoblación CD38a mediante
FACS. El resultado final de este protocolo generaba una fracción altamente purificada de
células CD38a (96,6% ± 1).
4.3 Purificación de ARN total a partir células plasmáticas
Las manipulaciones con muestras de ARN se realizaron con las precauciones
convencionales para establecer un ambiente libre de ribonucleasas. Las disoluciones y
materiales se trataron con una disolución de DEPC al 0,1% durante al menos 1 hora a
37ºC y posteriormente se autoclavaron para eliminar el DEPC.
El ARN total de las CP purificadas fue extraído usando el kit comercial “Strataprep
total RNA extraction Stratagene kit” de Stratagene, mediante el protocolo recomendado
por el fabricante, que se resume en:
1. Añadir 0,7 µl de ß-mercaptoetanol (ßME) a 100 µl de tampón de lisis por cada muestra
de células y mezclar con ayuda de una pipeta hasta homogeneizar.
2. Añadir un mismo volumen (100 µl) de etanol al 70% a la muestra, mezclar con vortex.
3. Transferir la muestra a las columnas, colocar éstas en el tubo colector y tapar.
4. Centrifugar a máxima velocidad durante 1 min.
5. Retirar el filtrado y volver a poner la columna en el tubo.
6. Tratamiento opcional con ADNasaI. Es necesario si se requiere ARN libre de ADN.
Añadir 600 µl de 1xLow Salt Wash Buffer, tapar y centrifugar a máxima
velocidad durante 1 min.
Desechar el filtrado, volver a poner el filtro en el tubo colector, taparlo y
centrifugar 2 min a máxima velocidad para secar la matriz.
Preparar la disolución de ADNasaI mezclando 5 µl de RNase-free DNase I
con 25 µl de DNase digestion buffer.
Añadir la solución de ADNasaI directamente sobre el filtro.
Colocar la muestra 15 min a 37ºC.
7. Añadir 500 µl de 1xHigh-Sal Wash buffer a la columna, tapar y centrifugar a máxima
velocidad durante 1 min.
Materiales y métodos
47
8. Desechar el filtrado del tubo colector, volver a poner el filtro en dicho tubo y añadir
600 µl de 1xLow-Salt Wash Buffer, tapar y centrifugar a máxima velocidad 1 min.
9. Desechar el filtrado y colocar de nuevo el filtro en el tubo colector. Añadir 300 µl de
1xLow-Salt Wash Buffer. Tapar y centrifugar a máxima velocidad durante 2 min. para
secar la matriz.
10. Colocar el filtro en un tubo eppendorf de 1,5 ml.
11. Añadir 30 µl de tampón de elución directamente sobre la matriz, tapar e incubar a
temperatura ambiente 2 min. Centrifugar 1 min a máxima velocidad. Este paso se
puede repetir para aumentar la cantidad de ARN.
El ARN obtenido fue procesado inmediatamente para síntesis del ADNc.
4.4 Síntesis de ADN complementario a partir de ARN total
La síntesis del ADNc se realizó mediante transcripción inversa. Se usó el kit comercial
“First Strand cDNA Synthesis Kit” de Roche. El ARN total purificado se desnaturalizó a
70ºC durante 5 min. Se añadió 2 µl MgCl2 50 mM, 4 µl de tampón AMV-RT 5X, 2 µl de
dNTPs 10 mM cada uno, 12,5 U de RNasin, 0,5 µg de pdN6 “Random Hexamer” y 15 U de
AMV-RT en un volumen final de 20 µl. La reacción se desarrolló a 42ºC durante 1 h, se
desnaturalizó el enzima a 90ºC durante 5 min. y posteriormente se diluyó hasta 50 µl con
H2O y se almacenó a -20ºC.
4.5 Amplificación del ADNc
La clonación de ADN, junto con la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR), constituyen dos procedimientos experimentales que tienen como objetivo la
amplificación de secuencias de ADN de un genoma concreto. Se diferencian en que:
mientras la clonación consiste en una amplificación llevada a cabo in vivo y de una forma
no específica (cualquier región del genoma), la otra técnica (PCR) consiste en una
amplificación in vitro y de una forma muy específica, pues se amplifica una región muy
concreta del genoma de la cual se tiene información previa de su secuencia.
Materiales y métodos
48
4.5.1 Amplificación por PCR
4.5.1.1 Diseño de los cebadores
Los cebadores (oligonucleótidos o “primers”) son secuencias sintéticas, cortas y
específicas de ADN de una sola hebra (18-30 nucleótidos), que delimitan la región de ADN
objetivo de nuestro interés (secuencia diana). Sus secuencias han de ser
complementarias, respectivamente, a los extremos 3’ de la región diana (uno en cada
hebra), que en nuestro caso se trata de la región VDJ de los genes de IgVH3. Necesitamos
pues dos tipos de cebadores: un “cebador VH”, complementario al péptido señal previo a la
zona VH, y un “cebador de isotipo”, complementario a la región constante que determina
cada uno de los isotipos que vamos a estudiar (IgG, IgA e IgM).
El “cebador VH” se diseñó mediante el análisis de las secuencias genómicas humanas
correspondientes a los péptidos señal de los genes de la familia VH3. En la comparación de
dichas secuencias (Fig. 16) se observa regiones homólogas, que permiten el diseño de un
cebador degenerado para los diferentes miembros de la familia VH3.
VH3 -19 -10 -1 | | |
TA RRG GGT GTC CAG TGT3-07 5’-ATG GAA TTG GGG CTG AGC TGG GTT TTC CTT GTT GCT ATT TTA GAA GGT GTC CAG TGT-3’3-09 ... ..G ... ..A ... ... ... A.. ... ... T.G ... ... ... A.. ... ... ... ...3-11 ... ..G ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... A.. A.. ... ... ... ...3-13 ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ...3-15 ... ..G ..T ... ... ... ... A.. ... ... .C. ... ... ... A.. ... ... ... ...3-16 ... ... ..T ... ... ... ... ... ..T ... .C. ... ... ... A.. ... ... ... ...3-20 ... ..G ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... A.. ... ... ... ...3-21 ... ... C.. ... ..C C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...3-23 ... ..G ..T ... ... ... ... C.. ..T ... ..G ... ... ... A.. ... ... ... ...3-30 ... ..G ..T ... ... ... ... ... ... ..C ... ... C.. ... AG. ... ... ... ...3-30.5 ... ..G ..T ... ... ... ... ... ... ..C ... ... C.. ... AG. ... ... ... ...3-33 ... ..G ..T ... ... ... ... ... ... ..C ... ... C.. ... AG. ... ... ... ...3-35 ... ... ..T ..C ... ... ... ... ... ... .C. ... ... ... A.. ... ... ... ...3-38 ... C.G ..T .T. ... ... ... ... ... ... ... .G. ... ... A.. .T. TA. AG. ...3-43 ... ..G ..T ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... A.. ... ... ... ...3-48 ... ..G ... ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...3-49 ... ..G ..T ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... A.. ... ... ..A ...3-53 ... ..G ..T T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... A.. ... ... ... ...3-64 .C. ..G ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T A.. ... ... ... ...3-66 ... ..G ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... A.. ... ... ... ...3-72 ... ..G ..T ... ... ... ... ... ... ... ... .T. ... ... C.. ... ... ... ...3-74 ... ..G ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... A.. ... ... ... ...
Figura 16
Alineamiento del cebador VH con las secuencias de los péptidos señal de VH3 (R = A o G).
La secuencia del cebador VH es: 5’-TARRGGGTGTCCAGTGT-3’
Materiales y métodos
49
El cebador de isotipo (antisentido), es decir, el correspondiente a las regiones
constantes (Cµ , Cγ y Cα), se diseñó específicamente para cada isotipo, mediante el análisis
de las secuencias genómicas humanas correspondientes a dichas regiones (Fig. 17).
Isotipo Secuencias y sus correspondientes cebadores
IgM 5’-GGG AGT GCA TCC GCC CCA ACC CTT TTC CCC-3’
5’-GCA TCC GCC CCA ACC CTT TTC–3’
IgA1 5’-GCA TCC CCG ACC AGC CCC AAG GTC TTC CCG–3’
IgA2 5’-GCA TCC CCG ACC AGC CCC AAG GTC TTC CCG–3’
5’-CCG ACC AGC CCC AAG GTC TTC–3’
IgG1 5’-GCC TCC ACC AAG GGC CCA TCG GTC TTC CCC–3’
IgG2 5’-GCC TCC ACC AAG GGC CCA TCG GTC TTC CCC–3’
IgG3 5’-GCT TCC ACC AAG GGC CCA TCG GTC TTC CCC–3’
IgG4 5’-GCT TCC ACC AAG GGC CCA TCC GTC TTC CCC–3’
5’-ACC AAG GGC CCA TCS GTC TTC–3’
Figura 17
Alineamiento del cebador de isotipo con lasregiones constantes de los isotipos (S = C o G).
Puesto que se trata de los oligos antisentido, las secuencias de los cebadores de
isotipo son:
3´- CGT AGG CGG GGA TGG GAA AAG- 5’ para IgM
3´- GGC TGG TCG GGG TTC CAG AAG- 5’ para IgA
3´- TGG TTC CCG GGT AGS CAG AAG- 5’ para IgG
Para facilitar el clonaje, se añadió al extremo 5´ de las secuencias de los cebadores la
secuencia 5’... AGATCTAGA ... 3’. Dichas secuencias permitirán utilizar los enzimas de
restricción XbaI (5'...T/CTAGA...3') y BglII (5'...A/GATCT...3'). Una vez diseñados los
cebadores fueron sintetizados por Sigma-Aldrich Química, y sus secuencias finales son las
siguientes:
Materiales y métodos
50
Oligo VH3 5’... AGATCTAGATARRGGGTGTCCAGTGT ... 3’
Pm = 8090 Tf = 63,7ºC
Oligo IgG 3’-TGGTTCCCGGGTAGSCAGAAGAGATCTAGA-5’
Pm = 9316 Tf = 73,1ºC
Oligo IgA 3’-GGCTGGTCGGGGTTCCAGAAGAGATCTAGA-5’
Pm = 9352 Tf = 76,3ºC
Oligo IgM 3’-CGTAGGCGGGGTTGGGAAAAGAGATCTAGA-5’
Pm = 9425 Tf = 77,0ºC
donde R = A o G y S = C o G
Se remarcan en gris las secuencias, de las enzimas de restricción XbaI y BglII,
añadidas para clonaje posterior.
4.5.1.2 Condiciones de la PCR
La PCR para amplificar el ADNc se realizó con Expand High FidelityPLUS PCR System
(ROCHE), cuya tasa de error es de aproximadamente 0,5-1 x 10−6/nucleotido/ciclo. Las
condiciones de las PCR fueron las siguientes:
Componente Volumen (30 µl)
Agua bidestilada estéril 17,2 µl.......
Tampón EHF-PCR-S 10X 6,0 µl.......
Mix dNTPs 10 mM 0,6 µl.......
Primer Ig 20 mM 1,5 µl.......
Primer VH3 20 mM 1,5 µl.......
Taq + Pgo 5 U/µl 0,2 µl......
ADNc 3,0 µl......
94 ºC 3 min.
Desnaturalización 94 ºC 30 s
Templado 50 ºC 30 s 32 ciclos
Elongación 72 ºC 1 min.
72 ºC 7 min.
4 ºC ∞
Materiales y métodos
51
Finalizada la PCR se chequea mediante electroforesis de una alícuota (3 µl de la PCR +
12 µl de H2O + 3µl de tampón de carga 6X). La banda debe ser de ~ 400 pb.
4.5.2 Purificación de ADN
La purificación de ADN, a partir de geles de agarosa o de algunas disoluciones, se
llevó a cabo mediante el kit comercial “GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit” de
Amersham Bioscience. Para purificar algunas disoluciones de ADN (eliminar tampones
enzimáticos) también se utilizó el procedimiento de fenolización-precipitación.
4.5.2.1 Purificación de ADN a partir de disoluciones
Protocolo
1. Colocar una columna GFX en un tubo colector.
2. Añadir 500 µl de tampón de captura a la columna GFX.
3. Transferir la disolución de ADN a la columna GFX.
4. Mezclar bien mediante 5 ó 6 pipeteos.
5. Centrifugar 30 s a máxima velocidad.
6. Vaciar el filtrado del tubo colector.
7. Añadir 500 µl de tampón de lavado a la columna y centrifugar 30 s a máxima
velocidad.
8. Transferir la columna a un tubo eppendorf, añadir 40 µl de H2O e incubar 1 min. a
R.T.
9. Centrifugar 1 min. a máxima velocidad para recuperar el ADN purificado.
4.5.2.2 Purificación de ADN a partir de geles de agarosa
Protocolo
1. Pesar un tubo eppendorf vacío.
2. Cortar la banda de gel de agarosa con el ADN. Cortar la banda en varios trozos y
meterlos al tubo eppendorf.
3. Pesar de nuevo el tubo eppendorf y calcular el peso del gel.
4. Añadir 10 µl de tampón de captura por cada 10 mg de gel.
5. Agitar en vórtex e incubar a 60ºC durante 5-15 min. hasta que se disuelva
completamente.
6. Transferir la muestra a la columna GFX e incubar 1 min. a R.T.
7. Continuar a partir del punto 5 del protocolo anterior.
Materiales y métodos
52
4.5.3 Clonación celular del ADNc
Las poblaciones de CP, aisladas por los métodos descritos, son heterogéneas, es
decir, están formadas por CP que secretan inmunoglobulinas de distintas especificidades e
isotipos. Por tanto, las fracciones de ADN de las regiones VDJ, que hemos purificado
mediante los métodos descritos, son también heterogéneas, pues están formadas por
distintas recombinaciones VDJ y afectadas de diferentes mutaciones somáticas. Los
siguientes pasos estarán orientados, por tanto, a conseguir la separación y amplificación
de los distintos segmentos de ADN, correspondientes a los distintos reagrupamientos-
mutaciones VDJ, que nos permita el análisis de sus secuencias de nucleótidos. El
aislamiento de fragmentos VDJ procedentes de una única CP lo realizamos por clonación
mediante el uso de vectores plasmídicos, método muy utilizado en Biología Molecular.
Nuestro objetivo en la clonación es la producción de un gran número de copias del
ADNc correspondiente a un único VDJ mediante el uso de bacterias. La clonación se basa,
al igual que la PCR, en la realización de múltiples rondas de replicación, pero en este caso
catalizadas por la ADN polimerasa propia de la célula en la que se lleva a cabo el proceso
(célula anfitriona). Para ello, el fragmento (inserto) de ADNc a clonar se une a otro ADN
(vector de clonación), y la molécula de ADN recombinante formada se incorpora a la célula
anfitriona donde tiene lugar la amplificiación por replicación. El vector debe ser digerido
por un enzima de restricción para luego poder unirlo al ADN externo (fragmento de ADN
producto de la PCR y posterior digestión con el mismo enzima de restricción). Por un lado
debe prepararse el vector en el que se realizará la clonación, y por otro se deberá
preparar el inserto de ADN, teniendo en cuenta las compatibilidades entre los extremos y
las cantidades de cada uno, para posteriormente proceder a ligarlos. El producto de la
ligación será introducido mediante transformación a células competentes, que se harán
crecer en placas selectivas. Finalmente mediante la extracción del ADN introducido y su
análisis por restricción se comprobará que se tiene la construcción deseada
4.5.3.1 Formación de la molécula de ADN recombinante
El vector que hemos utilizado para clonar y aislar los fragmentos de ADN de interés,
es un plásmido. Un plásmido es una molécula de ADN de tamaño pequeño y circular, con
secuencia y mapa de restricción conocidos, de fácil introducción en la célula (bacteria)
anfitriona. El plásmido es material genético accesorio, que se replica de manera
independiente al cromosoma bacteriano. Así, cada vez que se replica la bacteria también
Materiales y métodos
53
lo hace el fragmento de ADN clonado. En cada división celular, el cromosoma origina una
sola copia por célula hija, mientras que el plásmido (en su caso, el ADNr formado a partir
de él) sufre replicaciones múltiples y origina varias copias por célula (de 20 a 50). El
plásmido que hemos utilizado como vector es el fagémido pBlueScript II KS/SK (+) de
2.961 pb (Stratagene), al que llamamos pBK para simplificar (Fig. 18).
Figura 18 Fagémido pBlueScript II KS/SK (+)
Las características más importantes del pBK son:
- Como cualquier plásmido, se replica utilizando la maquinaria del huésped
independientemente del ADN genómico, pudiendo almacenar muchas copias en su
interior.
- Contiene en su secuencia un marcador de selección, un gen de resistencia a la
ampicilina (ampr), que codifica una β-lactamasa capaz de degradar la ampicilina,
confiriendo a la bacteria que alberga el vector la capacidad de crecer en medios
conteniendo dicho antibiótico.
- Contiene un marcador de color que permite la visualización de las colonias que
contienen plásmidos con inserto de ADN. Se trata del gen de E. Coli lacZ que produce
β-galactosidasa cuando está íntegro. Este enzima es capaz de romper un sustrato
sintético, el X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indoil-β-D-galactopiranósido), y producir una
colonia azul. Cuando un fragmento de ADN se clona dentro del gen lacZ, la región
Materiales y métodos
54
codificante se interrumpe y el enzima no se produce, resultando colonias de color
blanco normal.
En nuestro caso (utilización de plásmidos bacterianos) tenemos que proceder de la
siguiente forma. En primer lugar se digiere el ADN de la especie objeto de estudio con una
enzima de restricción adecuada (XbaI). Dado que esta enzima genera extremos de corte
cohesivos, se utilizará la misma enzima de restricción para digerir los plásmidos, dado que
los extremos de ambas moléculas serán complementarios. La enzima elegida ha de cortar
una sola vez el plásmido (sólo debe existir una diana para dicha enzima en su secuencia
de bases). A continuación, el plásmido vector y los fragmentos de ADN a clonar se incuban
en presencia de la enzima ligasa que sellará la ligación entre ambas moléculas. El ADNr
resulta de la unión covalente, catalizada por ligasa, entre los extremos cohesivos del
fragmento de restricción de ADN (inserto) y del vector.
4.5.3.2 Digestión de fragmentos amplificados de ADN con XbaI
Hemos usado XbaI como endonucleasa de restricción para obtener, mediante un
proceso de digestión con la misma, los fragmentos VDJ amplificados de ADN (Fig. 19).
Figura 19 Digestión de fragmentos amplificados de ADN con XbaI
La digestión consistió en incubar a 37 ºC durante 1h una mezcla compuesta por 4 µl
de agua bidestilada estéril, 5 µl de OPA 10X, 1 µl DE XbaI (15 U) y 40 µl del fragmento de
ADNc amplificado. Tras la digestión se añade 10 µl de tampón de carga 6X y se somete a
electroforesis en gel de agarosa (~ 400 pb). Después se purifica el ADN a partir del gel de
agarosa con el kit GFX PCR DNA.
4.5.3.3 Preparación del vector
El vector pBK es sometido a digestión con el mismo enzima de restricción que el
inserto de ADN, es decir, con XbaI. Se usó como tampón OPA (“one phor all”) .
Figura 20
Materiales y métodos
55
Se chequea por electroforesis (100 V) en gel de agarosa al 1,5% (1 µl de digerido +
14 µl TE + 3 µl azul de carga) y se purifica mediante fenolización-precipitación,
resuspendiendo en 90 µl de H2O.
Para evitar posibles recirculaciones del vector al realizar la ligación, se procede a su
desfosforilaron para eliminar los grupos fosfato del extremo 5’.
1h a 37 ºC
Figura 21
Para inactivar la PA se añade 2 µl de EDTA 0,5 M , se homogeneiza y se incuba
durante 10 min. a 85-90ºC. Después se purifica mediante fenolización-precipitación,
siguiendo el siguiente protocolo:
1. Añadir 1/10 V de LiCl 4M y 1V de fenol saturado (fenol-cloroformo-isoamílico
25:24:1).
2. Agitar en vórtex y centrifugar 5 min. a 13.000 rpm.
3. Retirar sobrenadante (con el ADN) y desechar lo de abajo.
4. Añadir 1V de fenol saturado.
5. Agitar en vórtex y centrifugar 5 min. a 13.000 rpm.
6. Separar el sobrenadante (desechando el resto) y añadirle 2,5V de EtOH absoluto
frío. Mezclar por inversión y dejar 30 min. a –70ºC ó 1h a –20ºC.
7. Centrifugar 10 min. a 13.000 rpm (posicionar el tubo tubo eppendorf para situar el
pellet).
8. Desechar el sobrenadante con cuidado de no arrastrar el pellet de ADN.
9. Añadir ~ 500 µl de EtOH al 70% frío.
10. Centrifugar 5 min. a 13.000 rpm.
11. Desechar sobrenadante con cuidado.
12. Secar a vacío ~ 10 min. para obtener el pellet seco de ADN
Finalmente se resuspende el pellet en 30 µl de H2O y se analiza una alícuota mediante
electroforesis en gel de agarosa, midiendo la concentración de ADN por fotometría.
Materiales y métodos
56
4.5.3.4 Ligación del plásmido con el ADN
Una vez preparados el inserto y el vector, realizamos la reacción de ligación de los
mismos. Para catalizar la ligación se utiliza el enzima ADN ligasa del T4, capaz de catalizar
la formación de uniones fosfodiéster entre los extremos terminales 5’-fosfato y 3’-hidroxil
en ADN de doble cadena, permitiendo la unión de fragmentos de restricción con extremos
cohesivos o romos. Tras la asociación por apareamiento de las bases, la ligasa establece la
unión covalente sellando las dos mellas. En la práctica, pueden ocurrir diversos tipos de
unión (Fig. 22), todas ellas catalizadas por la ligasa. En primer lugar, siempre puede darse
la asociación intramolecular, es decir, entre los dos extremos de una misma molécula
(vector o inserto). Esta interacción está favorecida cuando la concentración de ADN es
baja (pues la probabilidad de que dos moléculas se encuentren es menor). En segundo
lugar, puede tener lugar una asociación intermolecular, tanto la que conduce al ADNr
(vector + inserto) como otras que conducen a productos no deseados: vector + vector,
inserto + inserto, unión de más de dos moléculas, etc.; todas ellas pueden ser circulares o
lineales. Estas interacciones son más probables para concentraciones más elevadas de
ADN.
Figura 22 Tipos de uniones entre insertos y vectores
Para evitar la formación de estos productos secundarios, que disminuyen el
rendimiento de la clonación, se acude a estrategias experimentales previas a la mezcla de
vector e inserto, tales como la escisión con dos enzimas de restricción diferentes, que
evita la recircularización del vector o, como en nuestro caso, la desfosforilación del vector
con fosfatasa alcalina.
En la Figura 23 se resume esquemáticamente el proceso de preparación del ADNr.
Materiales y métodos
57
Figura 23 Preparación de ADNr.
Es importante tener en cuenta que los dos extremos de doble cadena, tanto del
inserto como del vector, son equivalentes, al haber sido escindidos con el mismo enzima
de restricción. Por tanto, el inserto puede ensamblarse mediante dos posibles
orientaciones en cuanto a su cadena de ADN codificante y su complementaria, siendo más
probable la que esté más favorecida conformacionalmente.
Para realizar la ligación se mezclaron unos 100 ng de vector con la cantidad apropiada
de inserto. La relación molar inserto:vector debe estar entre 2:1 y 3:1. Para estimar dicha
relación se corrieron en el mismo gel de agarosa sendas alícuotas y se estimó visualmente
la concentración relativa. Vector e inserto se mezclaron con el tampón de ligación 1X
conteniendo 1U de ligasa T4 (Roche). La reacción, en un volumen final de 10 µl, se incubó
de 3 a 24 horas a 15ºC.
Ligación Para el control
3 µl ADN
1 µl pBK 1 µl pBK
1 µl buffer ligasa 1 µl buffer ligasa
1 µl T4 DNA ligasa 1 µl T4 DNA ligasa
4 µl H2O 7 µl H2O
10 µl 10 µl
Al resto de la ligación que no se vaya a transformar inmediatamente, se le inactiva el
encima incubando a 70ºC durante 10 min.
Materiales y métodos
58
4.5.3.5 Transformación
Transformar una bacteria consiste en introducirle una molécula ajena de ADN. Tan
solo una molécula específica de ADNr plasmídico es incorporada a cada bacteria, por lo
que cada bacteria sólo contendrá un tipo específico de inserto de ADNc. El ADNr se
replicará varias veces dentro de la bacteria, de acuerdo con las propiedades de los
plásmidos.
Las transformaciones se realizaron mediante el método de Hanahan106, añadiendo 2
µl de ADN procedente de la ligación a 50 µl de células competentes JM 101, descongeladas
en hielo en el momento de su uso. Las células competentes JM 101 fueron previamente
preparadas mediante el método SEM de Inoue 107. Las bacterias se incuban en hielo con el
ADN durante 30 min., sometiéndose a continuación a un choque térmico de 42ºC durante
1 min., y después otros 2 min. en hielo. Finalmente se añade 450 ml de medio SOC y se
deja crecer a 37ºC durante 1 h con agitación lenta (200 rpm).
4.5.3.6 Selección de células que han incorporado moléculas de ADNr
Una vez transformado un cultivo bacteriano, hay que seleccionar entre las colonias
de bacterias obtenidas las que poseen plásmido recombinante. Como hemos mencionado
anteriormente, el resultado de la ligación puede originar una diversidad de plásmidos
recombinantes (con insertos de interés) y plásmidos no recombinantes (sin inserto y, por
tanto, sin interés para nosotros). Tenemos que tener en cuenta, además, que esa mezcla
es la que utilizamos para transformar las bacterias y que en nuestro cultivo bacteriano,
tras el experimento de transformación convivirán tres poblaciones de células: células no
transformadas, células transformadas con plásmido no recombinante y células
transformadas con plásmido recombinante (las únicas que nos interesan). Por tanto,
tendremos que seleccionar las células de interés. Esta selección se realiza en placas de
Petri que contienen medio de cultivo LB suplementado con ampicilina y con X-Gal/IPTG, a
37ºC durante unas 12-18 h para que crezcan las colonias. Sólo las bacterias con el vector
en su interior son capaces de crecer en medio con ampicilina, y sólo las colonias blancas
tienen el fragmento de interés insertado en el vector.
4.5.3.7 Extracción del ADN plasmídico: minipreps
Para la extracción del ADN plasmídico en pequeña escala se inoculó cada colonia
blanca bacteriana en 5 ml de medio LB conteniendo 200 µg/ml de ampicilina y se cultivó a
37ºC hasta saturación. A continuación se aplicó el protocolo de miniprep recomendado por
el fabricante (Promega), que se resume a continuación.
Materiales y métodos
59
1) Centrifugar las suspensiones en LB-amp de bacterias en tubos (3.000 rpm, 10 min.).
2) Preparar un tubo tubo eppendorf con 1 ml de tierra de diatomeas para cada miniprep.
3) Separar el sobrenadante del pellet de bacterias por aspiración. En este paso se puede
detener el proceso, congelando el pellet celular.
4) Añadir 200 µl de solución I para resuspender la células, si es necesario con la ayuda de
un vórtex, y transferirlas a un tubo tubo eppendorf.
5) Añadir 200 µl de solución II y mezclar por inversión para lisar las bacterias.
6) Añadir 200 µl de solución III para neutralizar y mezclar vigorosamente por inversión
hasta que se forme un precipitado blanquecino.
7) Centrifugar 5 min. a máxima velocidad. El ADN quedará en el sobrenadante y las
proteínas en el pellet.
8) Extraer el sobrenadante y adicionarlo al tubo eppendorf con tierra de diatomeas.
9) Añadir las mezclas a los filtros de miniprep y bajar lentamente el émbolo.
10) Añadir a cada columna 2 ml de Etanol absoluto + disolución de lavado (1:1) y bajar
lentamente los émbolos.
11) Colocar los filtros en tubo eppendorfs y centrifugar a máxima velocidad (un pulso)
para eliminar la solución de lavado.
12) Poner los filtros en tubo eppendorfs limpios y añadir a cada filtro 50 µl de H2Od
caliente.
13) Dar un pulso y guardar el ADN en el congelador.
4.5.3.8 Verificación de los clones
Para saber si hay inserto, tras la extracción de ADN, se toman pequeñas alícuotas de
cada clon (procedente de las minipreps) y se digieren con XbaI:
2 µl ADN
1,5 µl buffer OPA 10 X
0,2 µl XbaI
11,3 µl H2Od
15 µl Incubar a 37º C durante 1 hora
Se añade 3 µl tampón de carga y se chequea por electroforesis en gel de agarosa al
1% (banda de ≈ 400 pb). La visualización de las bandas de ADN se realizó con luz U.V.
(260 ó 360 nm) y las imágenes se adquirieron con el sistema de imagen “BioCaptMW”
(Vilbert Loumart) (Fig. 24).
Materiales y métodos
60
Figura 24 Electroforesis de segmentos de ADN clonados y digeridos con XbaI
4.6 Secuenciación del ADN
Una vez clonados los segmentos de ADN objeto de nuestro estudio, para obtener la
secuencia de nucleótidos de los mismos es necesario realizar previamente una medición
de la concentración de ADN de nuestras muestras, las reacciones de secuencia de las
mismas, la precipitación del ADN y finalmente la secuenciación propiamente dicha. A
continuación se describe cada uno de dichos pasos.
4.6.1 Reacción de secuenciación
Para la secuenciación de los fragmentos de ADN se requiere realizar previamente las
denominadas reacciones de secuenciación empleando los cuatro dNTPs, cada uno de ellos
marcados con una sonda fluorescente distinta. Para ello usamos el kit de secuenciación
“ABI PRISM BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing” de Applied Biosystems y un
ciclador térmico. Las condiciones de la PCR, según fabricante, fueron:
Materiales y métodos
61
Componente Volumen (10 µl)
Agua bidestilada estéril 3 µl.......
Premix 2 µl.......
Buffer (Big Dye Terminator) 1 µl.......
Primer UP (3,2 pmol/ µl) 1 µl......
ADN (≈ 400 ng) 3 µl......
El volumen de disolución necesario para tener aproximadamente 400 ng se determinó
a partir de la concentración de ADN, y ésta a partir de medición de absorción
espectrofotométrica a 260 nm.
96 ºC 2 min.
Desnaturalización 96 ºC 10 s
Hibridación 50 ºC 5 s 25 ciclos
Elongación 60 ºC 4 min
4 ºC ∞
4.6.2 Purificación de ADN por precipitación
El ADN procedente de las reacciones de secuenciación se precipitó mediante el
siguiente protocolo:
- Pasar los 10 µl de cada PCR a un tubo eppendorf.
- Añadir a cada tubo eppendorf 40 µl de MgCl2 0,5 mM en etanol al 70%, y dejar reposar
durante 15 min. a temperatura ambiente.
- Centrifugar a velocidad máxima 20 min.
- Retirar el sobrenadante con cuidado de no arrastrar el pellet.
- Secar a vacío unos 10 min. para obtener el pellet seco de ADN.
Si no se va a analizar inmediatamente la reacción de secuenciación se puede guardar a
-20 ºC.
Materiales y métodos
62
4.6.3 Secuenciación automática de ADN
Cada pellet de ADN se resuspendió en 25 µl de TSR (Template Supression Reagent)
de Applied Biosystems, y se desnaturalizó a 96ºC durante 5 minutos. Se procedió al
análisis del ADN secuenciado mediante un analikzador automático ABI PRISM 310 Genetic
Analyzer de Perkin-Elmer Applied Biosystems (Fig. 25), que permite analizar fragmentos
de ADN utilizando técnicas de electroforesis capilar.
Figura 25 Secuenciador automático ABI PRISM 310 Genetic Analyzer
El equipo está acoplado a un ordenador en el que se recogen y analizan los datos, que
se presentan como electroferograma (Fig. 26) y como una secuencia escrita, que puede
ser copiada en cualquier editor o procesador de texto.
Figura 26 Electroferograma
Materiales y métodos
63
4.7 Análisis y procesamiento informático de los datos
Una vez se han obtenido las secuencias de nucleótidos de nuestros fragmentos de
ADN, debe localizarse las mutaciones que presentan comparándolas con el miembro de
IgVH3 al que corresponde cada una. A continuación se debe obtener todos los datos
relacionados con dichas mutaciones que puedan ser útiles para nuestros estudios de SHM.
4.7.1. Identificación de las secuencias de la línea germinal
Las secuencias de la línea germinal, de las que se derivan las secuencias de nuestros
clones mediante SHM, fueron identificadas en la base de datos V BASE mediante el
programa DNAPLOT (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/). DNAPLOT compara la secuencia de
nuestro segmentos de ADN con la de aquellos miembros de IgVH a los que más se parece,
indicando las diferencias de nucleótidos, es decir las mutaciones de nuestra secuencia con
respecto a la comparada. Los reagrupamientos con inserciones o deleciones no son
detectados por este programa. La longitud de los CDR3 se determinó utilizando la base de
datos “international ImMunoGeneTics (http://imgt.cines.fr/textes/vquest/).
4.7.2. Análisis de la SHM con la aplicación “IgDSM 1.0”
En los estudios de SHM es necesario el procesamiento de numerosos datos, lo que
supone un gran consumo de tiempo y un riesgo potencial de error. Por ello, hemos
desarrollado un programa informático que automatiza el procesamiento de todos los datos
necesarios de los estudios de SHM para su posterior análisis. Dicha aplicación informática
la hemos nombrado “IgDSM 1.0” (Immunoglobulin DNA somatic mutation). “IgDSM 1.0”,
se ha programado y compilado con Visual Basic 6.0, y su programa de instalación se ha
realizado con Visual Studio Installer. Los resultados son reflejados en hojas de cálculo de
Microsoft Excel, donde se reorganizan mediante macros, siendo por último exportados a la
aplicación SPSS para los estudios estadísticos pertinentes.
Visual Basic es un lenguaje de programación, desarrollado por Microsoft, que
desciende del lenguaje de programación BASIC. Su primera versión fue presentada en
1991, con la intención de simplificar la programación utilizando un ambiente de desarrollo,
completamente gráfico, que facilitara la creación de interfaces gráficas y en cierta medida
también la programación misma. Visual Basic es un lenguaje guiado por eventos y
centrado en un motor de formularios poderoso. Además posee una biblioteca para manejo
de bases de datos llamada ADO. Una extensión propia del lenguaje llamada Visual Basic
Materiales y métodos
64
for Applications (VBA) permite codificar módulos (llamados macros) para las aplicaciones
de Microsoft Office. En la Fig. 27 se muestra la interfaz de desarrollo de “IgDSM 1.0” en
Visual Basic, concretamente el diseño del formulario de trabajo del programa.
Figura 27 Interfaz del formulario de IgDSM 1.0 en Visual Basic 6.0
4.7.3. Parámetros de interés en los estudios de SHM
Las variables independientes son las que el investigador controla y sirven para
establecer agrupaciones en una investigación; también son aquellas que identifican
intrínsecamente a los sujetos de estudio. Las variables independientes de nuestros
estudios de SHM son:
- familia del gen VH: VH1, VH2, VH3, VH4, VH5, VH6
- sujeto del que se extrae la muestra: 1, 2, … , n
- tipo de muestra: SP, MO, ANC, AC.
- isotipo: IgG, IgA, IgM
- clon: 1, 2, … , m
- zona de la región V: FR1, FR2, FR3, FR, CDR1, CDR2, CDR, Total
Materiales y métodos
65
donde:
FR = framework regions
CDR = complementarity-determining regions
FR = FR1 + FR2 + FR3
CDR = CDR1 + CDR2
Total = FR1 + FR2 + FR3 + CDR1 + CDR2
Las variables dependientes son las de respuesta que se observan en la investigación, a
partir de las cuales se obtendrán las conclusiones del estudio. Las variables dependientes
están condicionadas por los valores que adopten las variables independientes. Las 39
variables dependientes de nuestros estudios de SHM son:
R (nº de mutaciones reemplazantes) %R por región
S (nº de mutaciones silentes) %S por región
R+S (nº de mutaciones) R/S
Transiciones % transiciones frente a mutaciones en esa zona
AG %AG “ “ “
CT %CT “ “ “
GA %GA “ “ “
TC %TC “ “ “
Transversiones % transversiones frente a mutaciones en esa zona
AC %AC “ “ “
CG %CG “ “ “
GC %GC “ “ “
TA %TA “ “ “
AT %AT “ “ “
CA %CA “ “ “
GT %GT “ “ “
TG %TG “ “ “
Mut HS %Mut hs
Frec. mut.
Frec. R
P
donde:
R = nº de mutaciones reemplazantes (dan lugar a reemplazamiento de aa).
S = nº de mutaciones silentes (no dan lugar a reemplazamiento de aa).
A y G son bases púricas, C y T son bases pirimidínicas.
Materiales y métodos
66
Transición es el cambio de una purina por otra purina o el cambio de una pirimidina por
otra pirimidina. Por ejemplo, AG simboliza el cambio de adenina por guanina.
Transversión es el cambio de una purina por una pirimidina o el cambio de una pirimidina
por una purina. Por ejemplo, AC simboliza el cambio de adenina por citosina.
Mut HS = número de mutaciones en hotspots.
Frec. Mut = frecuencia de mutaciones.
Frec. R = frecuencia de mutaciones reemplazantes.
P = la probabilidad de la distribución.
En este estudio hemos utilizado los hotspots sin sesgo de hebra más ampliamente
aceptados y difundidos en la literatura, que son RGYW y su antisentodo WRCY (donde
R=A/G, Y=C/T, W=A/T).
Cadena sentido
Cadena antisentido
Uno de los parámetros que vamos a analizar es p (probabilidad de la distribución), y
para entender su significado hemos de recordar el concepto de distribución binomial. Un
proceso de Bernoulli es un experimento aleatorio que consta de un número n de pruebas y
que sigue el modelo de distribución binomial porque cumple las siguientes características:
- En cada prueba del experimento sólo son posibles dos resultados, el suceso A (éxito) y
su contrario Ā (fracaso).
- La probabilidad p del suceso A es la misma en cada experimento y, por tanto, no se ve
afectada por los resultados anteriores. La probabilidad de Ā es 1- p.
Admitiendo que la producción de mutaciones somáticas se ajuste a dicho modelo de
distribución binomial108, “P” representa la probabilidad de distribución, es decir, la
probabilidad de que al producirse n mutaciones en una secuencia de ADN, se obtenga k
mutaciones reemplazantes en un determinado segmento de la secuencia, como
consecuencia sólo del azar. Esta probabilidad se calcula mediante la expresión:
p(X = k) = {n!/[k!(n-k)!]} qk (1-q)n-k
donde:
k = número de mutaciones reemplazantes (R) observadas en el segmento CDR o FR.
n = número total de mutaciones observadas (R+S) en toda la secuencia.
AGCA AGCT AGTA AGTT GGCA GGCT GGTA GGTT
TGCT AGCT TACT AACT TGCC AGCC TACC AACC
Materiales y métodos
67
q : probabilidad de que una mutación reemplazante esté en CDRs o FRs
qR = CDRrel x RfCDR o FRrel x RfFR
qS = CDRrel x SfCDR o FRrel x SfFR
CDRrel = tamaño relativo de CDRs FRrel = tamaño relativo de FRs
Rf = Rp / (Rp + Sp) Rp = nº de mutaciones R posibles
Sf = Sp / (Rp + Sp) Sp = nº de mutaciones S posibles
El Rf se define como la frecuencia de reemplazamiento inherente a una secuencia, y
representa la proporción de todos los posibles reemplazamientos de nucleótidos, dentro de
dicha secuencia, que pueden dar lugar a un reemplazamiento del aminoácido.
El número de mutaciones reemplazantes teóricamente esperadas en CDRs o FRs viene
dado por Re = n x qR ; y el número de mutaciones silentes teóricamente esperadas en
CDRs o FRs viene dado por: Se = n x qS
El valor de p se ha utilizado ampliamente para determinar si una particular
distribución de mutaciones, en un gen de Ig, ha sido producida por selección antigénica.109
Los resultados de todos los parámetros anteriormente mencionados son calculados por
el programa “IgDSM 1.0” y reflejados en hojas de cálculo de Microsoft Excel XP. Para
llevar a cabo el análisis estadístico de las variables dependientes en función de las
variables independientes, es necesario distribuir todos los resultados de las variables de
forma adecuada para su posterior exportación al programa de análisis estadístico (SPSS).
Este reagrupamiento de las variables se lleva a cabo mediante una macro programada (en
lenguaje VBA) en un libro de Excel.
Materiales y métodos
68
4.8 Análisis estadístico
Los resultados de este estudio se han expresado generalmente como media
aritmética (m) de los experimentos realizados ± el error estándar de la media (SEM) como
medida de dispersión. La significación estadística (p) de las diferencias entre dos series de
datos se determinó mediante las pruebas estadísticas que se mencionan a continuación.
Los tests de hipótesis se basan en:
- Hipótesis nula (H0): no existe relación entre la variable dependiente y la
independiente, o lo que es lo mismo, no existe diferencia entre la media de la
variable entre las muestras.
- Hipótesis alternativa (H1): sí existe relación entre la variable dependiente y la
independiente, o lo que es lo mismo, sí existe diferencia entre la media de la
variable entre las muestras.
El nivel de significación escogido es p = 0,05 , de forma que
- Si p ≥ 0,05 aceptamos la hipótesis nula H0
- Si p < 0,05 aceptamos la hipótesis alternativa H1
Para determinar si una variable se ajusta o no a una distribución normal, se ha
aplicado el test de Kolmogorov-Smirnov.
- Si p ≥ 0,05 ⇒ H0 = los datos están distribuidos normalmente
- Si p < 0,05 ⇒ H1 = los datos no están distribuidos normalmente
Para comparar los valores medios de una variable entre varias series de datos,
aplicamos tests de hipótesis paramétricos si las muestras presentan distribuciones
normales de dicha variable. En el caso de que las muestras no presenten una distribución
normal de la variable en estudio, aplicamos tests de hipótesis no paramétricos.
● Tests paramétricos:
- t de Student (con el test de Levene de homocedasticidad) para dos grupos.
homocedasticidad ⇒ Tukey
- ANOVA para más de dos grupos (Post Hoc)
heterocedasticidad ⇒ Games-Howell
Materiales y métodos
69
La prueba utilizada para determinar si existe o no homogeneidad de las varianzas
(homocedasticidad) de las muestras fue el test de Levene, de forma que:
- Si p ≥ 0,05 aceptamos la hipótesis nula H0 (homocedasticidad)
- Si p < 0,05 aceptamos la hipótesis alternativa H1 (heterocedasticidad)
● Tests no paramétricos:
- Mann-Withney para dos grupos.
- Kruskall-Wallis para más de dos grupos.
Para todos los test el nivel de significación escogido es p = 0,05
- Si p ≥ 0,05 ⇒ H0 = no existe diferencia significativa entre las medias
- Si p < 0,05 ⇒ H1 = sí existe diferencia significativa entre las medias
Por otro lado, la comparación entre distribuciones de variables cualitativas nominales,
con más de dos grupos independientes, se realizó mediante la prueba de Chi-cuadrado de
Pearson. Cuando en un 20% o más de los grupos el valor obtenido no es superior a 5, se
aplicó el método de aproximación de Monte Carlo con un nivel de confianza del 99%.
4.9 Materiales
Los reactivos, medios, disoluciones y tampones que se utilizaron para llevar a cabo
este trabajo se describen a continuación.
● X-gal (5-Bromo-4-Cloro-3-Indol-β-D-galactósido)
Se utilizó para suplementar las placas de LB a una concentración de 40mg/l, disuelto
en N,N dimetil formamida
● Disolución de tiocianato
25 g de Tiocianato de Guanidinio en 33 ml de disolución:
42 mM Citrato Sódico
0,2 mM β-Mercaptoetanol
0,83% N-Laurilsarcosina
Materiales y métodos
70
● Fenol/cloroformo/isoamílico
1 vol de Fenol
1 vol de CHCl3/3-metil-1-butanol (24:1)
● TB
10 mM Pipes
55 mM Cl2Mn (2H2O)
15 mM Cl2Ca (2H2O)
250 mM ClK
Todos los componentes excepto el MnCl2 se mezclan y disuelven, ajustandose el pH a
6,7 con KOH. Se disuelve entonces el MnCl2 y la disolución se esteriliza por filtración a
través de un filtro de 0,22 µm y se almacena 4ºC.
● OPA 10X (One-Phor-All)
100 mM Tris-acetato (pH 7,5)
100 mM acetato de magnesio
500 mM acetato de potasio
● Tampón TBE 1X
89 mM Tris base
89 mM Acido Bórico
2 mM EDTA pH 8
● Buffer 10X-TBE pH 8,3
500 mM Tris Base
500 mM H3BO3
5 mM EDTA
● Solución madre de bromuro de etidio
10 mg/ml (mantener en frío y oscuridad)
● Tampón de carga 5x
20 % Ficoll (tipo 400)
50 mM EDTA pH 8,0
0,05 % Azul de bromofenol
0,1 % Azul de xilanocianol
Materiales y métodos
71
● Tampón TE pH 8
10 mM Tris-HCl pH 8
1 mM EDTA
● Tampón de Fosfatasa 10 X
500 mM Tris-HCl pH 9
10 mM MgCl2
1 mM ZnCl2
10 mM Espermidina
● Tampón de ligación 10 X
660 mM Tris-HCl pH 7,5
10 mM DTE
50 mM MgCl2
10 mM ATP
● SOB
Para 200 ml
Bactotriptona 4 g
Extracto de levadura 1 g
NaCl 0,1 g
Se ajusta el pH a 7,5 con KOH y se esteriliza en autoclave. Justo antes de usar se añaden
4 ml de MgSO4 1 M esterilizado por separado en autoclave.
● Medio SOC
2 % Bactotriptona
0,5 % Extracto de Levadura
10 mM NaCl
2,5 mM KCl
Esterilizar en Autoclave y añadir:
10 mM MgCl2 (estéril)
10 mM MgSO4 (estéril)
20 mM Glucosa (estéril)
Materiales y métodos
72
● Medio LB (Luria Bertani) para 1 litro:
Bactotriptona 1 g
extracto de levadura 0,5 g
NaCl 1 g
Disolver en agua destilada (volumen final 100 ml) ajustando el pH a 7 con disoluciones de
NaOH y HCl, y esterilizar en autoclave.
● Medio LB-Agar
Igual que el medio LB pero añadiendo además 1,6 g de Bactoagar
● Placas LB-ampicilina X-Gal
Se prepara 250 ml de LB-agar, autoclavar y dejar enfriar hasta 40-45°C.
Añadir 25 mg Ampicilina.
5 mg IPTG (uso a 0.6mg/ml)
50 µl de X-Gal (50 mg/ml en dimetil-formamida filtrada con 0,22 µm)
Repartir aproximadamente 25 ml/placa Petri de 10 cm de diámetro.
● TBE 10X
500 mM Tris Base
500 mM Ácido Bórico
25 mM EDTA
Este tampón tiene un pH = 8,3
● Para minipreps:
Disolución I
50 mM Tris pH 7,5
10 mM EDTA
100 µg/ml ARNasa
Disolución
1% Dodecilsulfato sódico
0,2 M NaOH
Disolución III (50 ml)
1,32 M Acetato potásico pH 4,8 ajustado con ácido acético.
Materiales y métodos
73
Tierra de Diatomeas (10 mg/ml)
4 M Tiocianato de Guanidina
50 mM Tris-HCl pH 7
20 mM EDTA
Para preparar 50 ml:
1. Suspender 0,5 g de tierra de diatomeas en 5 ml de agua y dejar sedimentando la
suspensión durante 3 horas a temperatura ambiente.
2. Disolver precalentando 23,6 g de tiocianato de guanidina en 2,5 ml de tris 1M pH 8, 2
ml de EDTA 0,5M pH 8 y unos 15 ml de agua.
3. Eliminar el sobrenadante de la tierra de diatomeas, resuspender la tierra de diatomeas
en la disolución anterior y ajustar el volumen a 50 ml.
Guardar protegida de la luz a temperatura ambiente. Cuando se utilice la resina debe
agitarse vigorosamente para que esté lo más homogénea posible.
Resultados
74
5. Resultados
Resultados
75
5.1 La aplicación IgDSM en el análisis de la SHM
La aplicación informática “IgDSM 1.0” (immunoglobulin DNA somatic mutations)
se ha programado y compilado con Visual Basic 6.0, y su programa de instalación
se ha realizado con Visual Studio Installer. El formulario de trabajo de IgDSM
consta de 6 cuadros de texto, que aparecen numerados en la figura 28, y 10
cuadros numéricos en la parte inferior del formulario.
Figura 28 Formulario principal de IgDSM 1.0
Los cuadros de texto sirven para introducir cadenas de caracteres, ya sea
tecleándolas o bien mediante copiado y pegado desde archivos de texto. Cada
cuadro de texto tiene una finalidad:
- 1: La determinación del antisentido de una secuencia de ADN es necesaria
cuando nuestra secuencia de estudio corresponde al antisentido de la cadena
codificante, debido a la orientación predominante del inserto de ADN dentro del
vector en la ligación (ver apartado 4.4.3.4). La introducción de una secuencia
en el cuadro de texto 1 permite determinar su secuencia complementaria, o su
secuencia inversa, o la secuencia inversa de su complementaria (su
antisentido). El resultado aparecerá en el cuadro de texto 2 con sólo hacer clic
en el botón correspondiente.
- 2: En el caso de que no sea necesario determinar el antisentido de la secuencia
que queramos analizar, podemos introducirla directamente en el cuadro de
texto 2.
1
2
3
4 5
6
Resultados
76
- 3: Introducción de secuencias de ADN de los miembros de la familia o familias
de IgV que queramos estudiar.
- 4: Nombre de la secuencia de ADN a analizar.
- 5 y 6: Nombre de la secuencia IgV de la que deriva la secuencia de ADN que
vamos a analizar y con la que la vamos a comparar.
Los cuadros numéricos sirven para delimitar los límites de las regiones FR y
CDR. No se ha incluido CDR3 debido a que en esta zona la hipermutación somática
no puede distinguirse de la diversidad producida por el ensamblado en el
reagrupamiento V-D-J.
Al hacer clic en el botón “codon reader” se abre el formulario que se muestra
en la Fig. 29, el cual nos permite la lectura simultánea de dos codones.
Figura 29 Formulario de lectura de codones.
Al hacer clic en el botón “i” del formulario principal se muestra un archivo de
texto con información acerca de los parámetros que son objeto de estudio en el
análisis de secuencia de ADN por parte del programa (ver sección 4.6.3).
Los botones de la figura 30 sirven para trabajar con los registros, de la base de
datos del programa, correspondientes al cuadro de texto sobre el que se sitúan.
1 2 3 4 5 6 7 8
Figura 30 Botones de registros
1. Buscar registro2. Mostrar primer registro3. Mostrar registro anterior4. Número de registro actual5. Número total de registros6. Mostrar registro siguiente7. Mostrar último registro8. Crear nuevo registro
Resultados
77
● En nuestro caso estudiamos la SHM en genes IgVH3. Esta familia consta de 28
miembros: 22 funcionales y 6 no funcionales. Por tanto, se introdujo las 22
secuencias de IgVH3 en la base de datos de IgDSM a través del cuadro de texto 3, y
las nombramos en el cuadro de texto 6 (IGVH3-07, IGVH3-09, etc.).
● Se introdujeron todas las secuencias de ADN que hemos clonado a través del
cuadro de texto 2, y las nombramos en el cuadro de texto 4.
● Se averiguó de qué miembro de IgVH3 deriva cada una de las secuencias clonadas
de ADN con la aplicación DNAPLOT (http://www.dnaplot.de/input/human_v.html)
tal como se describe en la sección 4.6.1.
● Una vez conocido el nombre del miembro VH lo escribimos en el cuadro de texto
5, por ejemplo “IGVH3-48”. Al hacer clic en el botón “Buscar línea germinal VBASE”
aparece la secuencia de IGVH3-48 en el cuadro de texto 3, tal como se muestra en
la figura 31.
Figura 31 Búsqueda del miembro IgVH3 a partir de una secuencia de ADN
● Haciendo clic en “S M Analysis” el programa analiza las mutaciones somáticas de
la secuencia por zonas y muestra los resultados en una hoja de cálculo Excel tal
como se muestra en la figura 32. En la primera línea se muestra la secuencia de
ADN del correspondiente miembro de la familia VH3, quedando resaltados en color
Resultados
78
verde los hotspots. En la segunda línea aparecen sólo las bases mutadas: en azul si
se trata de mutaciones silentes y en rojo cuando son reemplazantes. En la tercera
línea se muestra, sólo para los codones con reemplazamiento de aa, el nuevo aa
que es codificado por el codón. Y en la tabla se muestran los valores obtenidos para
todas las variables independientes en el análisis de la SHM de la secuencia de ADN
estudiada, así como todos los valores potenciales de R y S, los valores teóricamente
esperados de R, S, Rf y R/S en función de dicha secuencia estudiada, y las
probabilidades de distribución “p”. El tiempo necesario para la obtención de los
resultados es de aproximadamente 17 segundos con un procesador Pentium III y
de 10 segundos con un Pentium IV.
Con la ayuda de IgDSM fueron analizados en este estudio un total de 633
clones VH3-D-JH. En conjunto, fueron analizadas 9.870 mutaciones (6.488
reemplazantes y 3.382 silentes) en un total de 183.570 bases secuenciadas (5,3%
de frecuencia de mutación).
Resultados
79
Figura 32 Resultado del análisis de mutaciones en hoja de Excel
Resultados
80
5.2 Frecuencia de mutaciones en las regiones de IgV
Es un hecho bien establecido que una norma esencial en el proceso de SHM es
que éste se orienta preferentemente sobre las regiones CDR, y que da lugar sobre
todo a mutaciones R. Por ello, esto es lo primero que se comprobó en el presente
estudio. Se secuenciaron reagrupamientos productivos VH3-D-JH de 449 clones de
CP purificadas de amígdala y de 184 clones de CP purificadas de sangre. En ambos
casos las CP se aislaron por “cell sorting” y su pureza fue superior al 97%. Los
detalles sobre estos clones están en las tablas 1 y 2 que se describen más adelante.
Se compararon las frecuencias de mutaciones R+S y de mutaciones R en FR y CDR
de todas las secuencias analizadas. Como se observa en la figura 33, tanto las
mutaciones totales como las R eran claramente más frecuentes en las regiones
CDR. Así mismo, en la figura 34 puede apreciarse que el ratio R/S es mayor en CDR
que en FR tanto en amígdala como en sangre.
VH3 frec. (R+S) frec. R
Amígdala
* *
Sangre
* *
FRm ± SEM p<0,05 *
CDR
3
5
8
10
0
2
4
6
8
0
3
6
9
12
0
5
10
15
Figura 33 Frecuencia de mutaciones en FR vs CDR
Figura 34 Ratio R/S en FR vs CDR
Amígdala Sangre
* *
FRm ± SEM p<0,05 *
CDR
1
2
3
4
R / S
1
2
3
4
R / S
Resultados
81
Profundizando más en este estudio, se compararon las frecuencias de
mutaciones en las zonas CDR1 y CDR2. Como puede apreciarse en la Figura 35 la
zona CDR1 de los reagrupamientos productivos VH3-D-JH presenta una frecuencia
mutacional significativamente mayor que la zona CDR2, tanto en clones
procedentes sangre como de amígdala. Sin embargo, el ratio R/S es mayor en
CDR2 que en CDR1 tanto en amígdala como en sangre (Fig. 36).
VH3 frec. mut. R+S frec. mut. R
Amígdala
* *
Sangre
* *
CDR1m ± SEM p<0,05 *
CDR2
0
4
8
12
16
0
5
10
15
0
5
10
15
0
4
8
12
16
Figura 35 Frecuencia de mutaciones en CDR1 vs CDR2
Figura 36 Ratio R/S en CDR1 vs CDR2
Amígdala Sangre
* *
CDR1m ± SEM p<0,05 *
CDR2
0
1
2
3
4
R /
S
0
1
2
3
4
R /
S
Resultados
82
5.3 Comparación de la SHM en secuencias IgVH3 obtenidas de CPADM y CPADC
Se aplicó el programa descrito al examen del proceso mutacional en secuencias
VH3 de CP de amígdala humana. Como se ha explicado antes, experimentos previos
realizados en nuestro laboratorio indicaban la existencia de dos poblaciones de CP
en amígdala, que presentaban notables diferencias fenotípicas y funcionales.100
Para ello, fueron secuenciados 449 clones de reagrupamientos productivos VH3-D-JH
procedentes de CP de amígdala (209 procedentes de CPADM y 240 procedentes de
CPADC), obtenidos de tres individuos distintos (experimentos 149, 152 y 155) y
correspondientes a los isotipos IgM, IgG e IgA. En la tabla 1 se muestra el número
de clones obtenido en cada experimento e isotipo.
CPADM CPADC
Experimento Isotipo nº clones nº clones
IgM 31 28
Exp.149 IgG 28 30
IgA 18 21
IgM 19 27
Exp.152 IgG 28 31
IgA 22 27
IgM 13 25
Exp.155 IgG 22 25
IgA 28 26
Tabla 1 Secuencias clonadas VH3-D-JH procedentes de CP de amígdala
Fueron analizadas 5.932 mutaciones (3.930 reemplazantes y 2.002 silentes) en
un total de 130.210 bases secuenciadas (4,5% de frecuencia de mutación). Las
comparaciones de los valores medios de las mutaciones reemplazantes (R),
mutaciones silentes (S), mutaciones totales (R+S), ratio R/S, número de
mutaciones en hotspots (mhs) y porcentaje de mutaciones en hotspots (%mhs) en
las distintas zonas de las secuencias VH3 (FR1, FR2, FR3, FR, CDR1, CDR2, CDR y
secuencia total) no muestran en general diferencias estadísticas significativas entre
los clones procedentes de CPADM y CPADC. En concreto, en el isotipo IgM no se ha
encontrado ninguna diferencia (Fig. 37); en IgG las únicas diferencias significativas
que se han encontrado son para R+S en CDR1, para R en FR1, R/S en FR, y para
mhs en CDR1 (Fig. 38); y en IgA las únicas diferencias significativas que se han
encontrado son para S en FR2 y para R/S en FR (Fig. 39). Estos resultados inducen
a concluir que, en lo esencial, no existen diferencias importantes en la
manifestación de la SHM entre CPADM y CPADC, por lo que a partir de ahora se
estudiarán en conjunto, denominándose CP de amígdala.
Resultados
83
Figura 37 Comparación de la SHM de VH3 de IgM entre CPADM y CPADC
R+S R S R/S mhs %mhs
Total
FR
FR1
FR2
FR3
CDR
CDR1
CDR2
ADM
IgM VH3 m ± SEM p<0,05 *ADC
0
5
10
0
5
10
0
2
4
0
1
2
3
0
5
0
25
50
0
5
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
0,0
0,5
1,0
1,5
0
20
40
0
1
2
0,0
0,5
1,0
0
1
0
1
0,0
0,5
0
20
40
0,0
0,5
1,0
0,0
0,5
1,0
0,0
0,2
0,4
0,0
0,5
1,0
1,5
0,0
0,5
0
20
40
60
0
1
2
3
0
1
2
0,0
0,5
1,0
1,5
0
1
2
0,0
0,5
1,0
0
15
30
0
3
6
0
3
6
0,0
0,5
1,0
1,5
0
2
4
0
2
4
0
25
50
75
0
1
2
0
1
2
0,0
0,2
0,4
0
1
2
3
0,0
0,5
1,0
1,5
0
50
100
0
2
4
0
1
2
3
0,0
0,5
1,0
0
1
2
3
0
1
2
0
1
2
Resultados
84
Figura 38 Comparación de la SHM de VH3 de IgG entre CPADM y CPADC
R+S R S R/S mhs %mhs
Total
FR
*
FR1
*
FR2
FR3
CDR
CDR1
* *
CDR2
ADM
IgG VH3 m ± SEM p<0,05 *ADC
0
5
10
15
0
5
10
0
2
4
0
1
2
3
0
2
4
6
0
15
30
45
0
4
8
0,0
1,5
3,0
4,5
0
1
2
3
0
1
2
0
1
2
0
10
20
30
0
1
2
3
0
1
2
0,0
0,5
1,0
1,5
0,0
0,5
1,0
1,5
0,0
0,5
1,0
0
20
40
0,0
0,5
1,0
0,00
0,15
0,30
0,45
0,0
0,2
0,4
0,0
0,5
1,0
0,0
0,2
0,4
0
20
40
60
0
2
4
0
1
2
0
1
2
0,0
0,5
1,0
1,5
0,0
0,5
1,0
0
10
20
30
0
2
4
6
0
2
4
6
0,0
0,5
1,0
1,5
0,0
2,0
4,0
0
2
4
0
25
50
75
0
1
2
0,0
0,5
1,0
1,5
0,0
0,2
0,4
0
1
2
3
0
1
2
0
25
50
75
100
0
2
4
0
2
4
0,0
0,5
1,0
0
1
2
3
0
1
2
3
0
25
50
75
Resultados
85
Figura 39 Comparación de la SHM de VH3 de IgA entre CPADM y CPADC
R+S R S R/S mhs %mhs
Total
FR
*
FR1
FR2
*
FR3
CDR
CDR1
CDR2
ADM
IgA VH3 m ± SEM p<0,05 *ADC
0
10
20
0
5
10
15
0
2
4
6
8
0
1
2
3
0
5
10
0
25
50
0
5
10
0
2
4
6
8
0
2
4
6
0
1
2
0
2
4
0
10
20
30
0
2
4
0
1
2
3
0
1
2
0
1
2
0,5
1,0
1,5
0
25
50
0,0
0,5
1,0
1,5
0,0
0,5
1,0
0,0
0,5
1,0
0,0
0,5
1,0
0
1
1
0
20
40
60
0
2
4
6
0
2
4
0
1
2
3
0
1
2
0,0
0,5
1,0
1,5
0
10
20
30
0
5
10
0
4
8
0
1
2
0
2
4
0
2
4
6
0
25
50
75
0
1
2
3
0
1
2
0,0
0,5
1,0
0
1
2
3
0
1
2
0
50
100
0
2
4
6
0
2
4
6
0
1
2
0
2
4
0
2
4
0
25
50
75
Resultados
86
5.4 Comparación de la SHM en secuencias IgVH3 obtenidas de diferentes
isotipos en amígdala
A continuación se agruparon todas las secuencias obtenidas de CP de amígdala,
sin distinguir el método de aislamiento, y se compararon los patrones de SHM de
los tres isotipos. Como se ve en la Figura 40, el número de mutaciones totales
(R+S), mutaciones silentes (S), mutaciones reemplazantes (R) y mutaciones en
hotspots (mhs) varían en general de forma estadísticamente significativa en todas
las zonas de las secuencias en función del isotipo, presentando un gradiente
creciente en el sentido IgM>IgG>IgA, siendo sus frecuencias mutacionales totales
3,3%, 3,9% y 6,3% respectivamente. Hallazgos parecidos se obtuvieron cuando se
compararon los distintos isotipos obtenidos de CPADM o de CPADC por separado
(datos no mostrados).
El ratio R/S no muestra en general diferencias estadísticas significativas entre
isotipos, con las excepciones de diferencias entre IgM e IgG en FR1, entre IgM e
IgA en FR1, CDR2 y CDR, y entre IgG e IgA en CDR2 y CDR.
El porcentaje de mutaciones en hotspots (%mhs) no presenta diferencias
estadísticas significativas entre los tres isotipos en ninguna zona de las secuencias,
excepto en FR1 entre IgA e IgM.
Resultados
87
Figura 40 Comparación de la SHM de VH3 de amígdala entre isotipos
R+S R S R/S mhs %mhs
Total
● ▼ ■ ● ▼ ■ ● ▼ ■ ● ▼ ■
FR
● ▼ ■ ● ▼ ■ ● ▼ ■ ● ▼ ■
FR1
● ▼ ■ ● ▼ ■ ● ■ ▼ ■ ● ▼ ■ ■
FR2
● ■ ● ■ ● ■ ● ■
FR3
● ▼ ■ ● ▼ ■ ● ▼ ■ ● ▼ ■
CDR
● ▼ ■ ● ▼ ■ ● ■ ● ■ ● ▼ ■
CDR1
● ■ ■ ● ■ ● ■
CDR2
● ▼ ■ ● ▼ ■ ● ▼ ■ ● ■ ● ▼ ■
IgM ● IgG/IgA
m ± SEM IgG p<0,05 ▼ IgG/IgM
IgA ■ IgA/IgM
Amígdala VH3
0
5
10
15
20
0
4
8
12
0
2
4
6
8
0
1
2
3
0
5
10
0
25
50
0
5
10
0
2
4
6
0
2
4
6
0
1
2
0
2
4
0
20
40
0
2
4
0
1
2
0
1
2
3
0
1
2
0
1
2
0
25
50
0,0
0,5
1,0
1,5
0,0
0,2
0,4
0,6
0,0
0,2
0,4
0,6
0,0
0,5
1,0
1,5
0,0
0,2
0,4
0,6
0
20
40
60
0
2
4
6
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
0,0
0,5
1,0
1,5
0
10
20
30
0
4
8
0
2
4
6
0
1
2
0
2
4
0
2
4
6
0
25
50
75
0
1
2
0
1
2
0,0
0,2
0,4
0,6
0
1
2
0
1
2
0
25
50
75
100
0
2
4
6
0
2
4
6
0
1
2
0,0
2,0
4,0
0
2
4
0
20
40
60
Resultados
88
5.5 Comparación de la SHM entre diferentes isotipos de Ig en secuencias
IgVH3 de CP de sangre
Se realizó un examen similar al descrito en los puntos anteriores sobre
secuencias VH3 de CP sanguíneas, en concreto fueron secuenciados 184 clones de
reagrupamientos productivos VH3-D-JH procedentes de CP aisladas de sangre
periférica de tres individuos distintos (experimentos 417, 418 y 155) y
correspondientes a los isotipos IgM, IgG e IgA. En la tabla 2 se muestra el número
de clones obtenidos por individuo e isotipo.
Experimento Isotipo nº clonesIgM 24
Exp.417 IgG 19IgA 20IgM 26
Exp.418 IgG 30IgA 26IgM 6
Exp.155 IgG 16IgA 17
Tabla 2 Secuencias clonadas VH3-D-JH procedentes de CP de sangre
Fueron analizadas 3.938 mutaciones (2.558 reemplazantes y 1.380 silentes) en
un total de 53.360 bases secuenciadas (7,3% de frecuencia de mutación). Las
frecuencias medias mutacionales encontradas fueron 6,2% para IgM, 8,1% para
IgG y 7,4% para IgA. La Figura 41 resume los datos obtenidos del estudio de los
diversos parámetros, de forma similar a las figuras anteriores. Como puede verse,
en general IgG era el isotipo más mutado, IgM el menos mutado, e IgA ocupaba
una posición intermedia. Así, el número de mutaciones totales (R+S) presenta
diferencias estadísticamente significativas entre IgM e IgG en FR1, FR3, FR y en la
secuencia completa, y entre IgG e IgA en FR3 y FR. El número de mutaciones R
presenta diferencias estadísticamente significativas entre IgM e IgG en FR1, FR3,
FR y total, y entre IgG e IgA en FR. El número de mutaciones S presenta
diferencias estadísticamente significativas entre IgM e IgG en FR2, FR3, FR, CDR2,
CDR y total, entre IgG e IgA en FR3, FR y CDR1 y entre IgM e IgA en CDR2. El
cociente R/S presenta diferencias estadísticamente significativas entre IgM e IgG en
FR3, CDR y total. El número de mutaciones en hotspots (mhs) presenta diferencias
estadísticamente significativas entre IgM e IgG en FR1, FR2, FR3, FR y total, y
entre IgG e IgA en FR1, FR3, FR, CDR1 y total. El porcentaje de mutaciones en
hotspots (%mhs) presenta diferencias estadísticamente significativas entre IgM e
IgG en FR2 y FR3, entre IgM e IgA en FR2, CDR2, CDR y total, y entre IgG e IgA en
CDR.
Resultados
89
Figura 41 Comparación de la SHM de VH3 de sangre entre isotipos
R+S R S R/S mhs %mhs
Total
▼ ▼ ▼ ▼ ● ▼ ■
FR
● ▼ ● ▼ ● ▼ ● ▼
FR1
▼ ▼ ● ▼
FR2
▼ ▼ ▼ ■
FR3
● ▼ ▼ ● ▼ ▼ ● ▼ ▼
CDR
▼ ▼ ● ■
CDR1
● ●
CDR2
■ ▼ ■ ■
IgM ● IgG/IgA
m ± SEM IgG p<0,05 ▼ IgG/IgM
IgA ■ IgA/IgM
S.P VH3
0
10
20
30
0
5
10
15
0
5
10
0
1
2
3
0
4
8
12
0
25
50
0
5
10
15
2
4
6
8
0
2
4
6
8
0
1
2
0
3
6
0
20
40
0
3
6
0
2
4
0
1
2
3
0
1
2
0
1
2
0
25
50
0
1
2
0,0
0,5
1,0
0,0
0,5
1,0
0,0
0,5
1,0
0,0
0,5
1,0
0
25
50
75
0
4
8
0
3
6
0
2
4
0
1
2
0
1
2
0
10
20
30
0
5
10
0
4
8
0
1
2
3
0
3
6
0
2
4
6
0
25
50
75
0
1
2
3
0
1
2
3
0,0
0,5
1,0
0
1
2
3
0
1
2
3
0
25
50
75
100
0
2
4
6
8
0
2
4
6
0
1
2
0,0
2,5
5,0
0
2
4
0
25
50
75
Resultados
90
5.6 Comparación de la SHM en secuencias IgVH3 de CP de amígdala y
sangre
Una vez analizada en detalle la SHM en secuencias VH3 de CP de un órgano
inductivo, como es la amígdala, y de CP circulantes, se compararon ambas bases
de datos para obtener una visión comparativa de la SHM en los dos territorios. Las
figuras 42, 43 y 44 resumen esta comparación para las secuencias de los isotipos
IgM, IgG e IgA, respectivamente. En general, el análisis comparativo revela que
para IgM e IgG (Fig. 42 y 43), las CP de sangre contenían secuencias claramente
más mutadas, mientras que para IgA (Fig. 44), las diferencias eran mucho
menores. A continuación se detallan las diferencias halladas para cada isotipo.
Los resultados obtenidos en IgM (Fig. 42) mostraron que el número de
mutaciones totales (R+S) y las mutaciones R eran siempre mayores en sangre que
en amígdala con diferencias estadísticamente significativas en todas las zonas. Lo
mismo ocurre con el número de mutaciones S, aunque en este caso sólo existían
diferencias estadísticamente significativas en las zonas FR1, FR3, FR y total. El
cociente R/S era significativamente mayor en sangre sólo en las zonas FR1, CDR2 y
CDR. El número de mutaciones en hotspots era también significativamente mayor
en sangre en todas las zonas menos en FR1 donde la diferencia no era
estadísticamente significativa. El porcentaje de mutaciones en hotspots no
presentaba diferencias estadísticamente significativas entre sangre y amígdala.
Los resultados obtenidos en IgG (Fig. 43) mostraron que el número de
mutaciones R, S, (R+S) y mhs eran siempre mayores en sangre que en amígdala
con diferencias estadísticamente significativas en todas las zonas. El cociente R/S
era significativamente mayor en sangre sólo en las zonas FR3 y CDR2. El
porcentaje de mutaciones en hotspots no presentaba diferencias estadísticamente
significativas entre sangre y amígdala, salvo en FR2 donde era mayor en sangre
que en amígdala.
Los resultados obtenidos en IgA (Fig. 44) mostraron que el número de
mutaciones totales (R+S) tiende a ser mayor en sangre, aunque las únicas
diferencias significativas se daban en las zonas FR1, CDR2. El número de
mutaciones R también tiende a ser mayor en sangre, aunque las únicas diferencias
significativas se daban en las zonas CDR2. El número de mutaciones S no
presentaba en general diferencias significativas, salvo en la zona FR1 donde era
significativamente mayor en sangre que en amígdala. El cociente R/S y el número
de mutaciones en hotspots no presentaban diferencias significativas entre sangre y
amígdala en ninguna zona. El porcentaje de mutaciones en hotspots presentaba
diferencias estadísticamente significativas entre sangre y amígdala sólo en las
zonas FR2, CDR2.
Resultados
91
R+S R S R/S mhs %mhs
Total
* * * *
FR
* * * *
FR1
* * * * *
FR2
* *
FR3
* * * *
CDR
* * * *
CDR1
* * *
CDR2
* * * *
Amígdala
IgM VH3 Amígdala vs Sangre m ± SEM p<0,05 *Sangre
0
2
4
0
1
2
3
0
1
2
S
0,0
0,5
1,0
0,0
0,5
1,0
1,5
10
20
30
40
0,0
0,5
1,0
0,0
0,4
0,8
0,0
0,2
0,4
0,0
0,5
1,0
1,5
0,0
0,3
0,6
0
30
60
0
3
6
0
1
2
3
0
1
2
3
0,0
0,5
1,0
1,5
0,0
0,5
1,0
0
15
30
0
1
2
3
0
1
2
0,0
0,3
0,6
0
1
2
3
0
1
2
0
40
80
0
3
6
0
3
6
0,0
0,5
1,0
1,5
0
2
4
0
1
2
3
0
30
60
0
5
10
15
20
0
6
12
0
3
6
0
1
2
3
0
4
8
0
25
50
0
5
10
0
3
6
0
2
4
6
0
1
2
0
1
2
3
0
10
20
30
0
4
8
0
4
8
0,0
0,5
1,0
1,5
12345
12345
0
25
50
75
Figura 42 Comparación de la SHM de VH3 en IgM entre amígdala y sangre
Resultados
92
Figura 43 Comparación de la SHM de VH3 en IgG entre amígdala y sangre
R+S R S R/S mhs %mhs
Total
* * * *
FR
* * * *
FR1
* * * *
FR2
* * * * *
FR3
* * * * *
CDR
* * * *
CDR1
* * * *
CDR2
* * * * * Amígdala
IgG VH3 Amígdala vs Sangre m ± SEM p < 0,05 *Sangre
0
3
6
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
0
1
2
0
20
40
0
1
2
0,0
0,5
1,0
0,0
0,5
1,0
0,0
0,5
1,0
0,0
0,5
1,0
0
20
40
60
0
4
8
0
2
4
6
0
2
4
0
1
2
0
1
2
0
15
30
0
1
2
3
0
1
2
0,0
0,5
1,0
0
1
2
0
1
2
0
50
100
0
4
8
0
3
6
0
1
2
0
1
2
3
0
2
4
0
30
60
510152025
0
5
10
15
0
5
10
0
1
2
3
0
4
8
12
0
25
50
0
5
10
15
2
4
6
8
0
2
4
6
0
1
2
12345
0
10
20
30
0
5
10
0
4
8
0
1
2
3
1
2
3
4
0
2
4
6
0
25
50
75
Resultados
93
Figura 44 Comparación de la SHM de VH3 en IgA entre amígdala y sangre
R+S R S R/S mhs %mhs
Total
* *
FR
FR1
* *
FR2
*
FR3
CDR
* *
CDR1
CDR2
* * *Amígdala
IgA VH3 Amígdala vs Sangre m ± SEM p<0,05 *Sangre
0
2
4
0
1
2
3
0
1
2
0,0
0,5
1,0
1,5
0,0
0,5
1,0
1,5
0
25
50
0,0
0,5
1,0
1,5
0,0
0,4
0,8
0,0
0,2
0,4
0,6
0,0
0,5
1,0
0,0
0,5
1,0
0
25
50
75
0
4
8
0
2
4
0
1
2
3
0
1
2
0,0
0,5
1,0
1,5
05
10152025
0
1
2
0
1
2
0,0
0,3
0,6
0
1
2
3
0
1
2
0
45
90
0
4
8
0
3
6
0
1
2
0
1
2
3
0
2
4
0
30
60
0
5
10
15
20
0
5
10
15
2
4
6
8
0
1
2
3
0
5
10
0
25
50
0
4
8
12
0
4
8
0
3
6
0
1
2
0
2
4
0
10
20
30
0
5
10
0
4
8
0
1
2
0
2
4
0
3
6
0
25
50
75
Resultados
94
Para tener una aproximación gráfica de las diferencias de SHM entre CP de
sangre y amígdala, se compararon los histogramas de distribución del número de
clones de cada territorio según el número de mutaciones totales (R+S) de los
mismos. Como se observa en la Figura 45, los histogramas de distribución fueron
claramente diferentes, mostrando el de CP de sangre (en rojo en la parte inferior
de la figura) una clara tendencia a un mayor número de mutaciones. De hecho las
CP de amígdala presentaron un número medio de mutaciones R+S de 13,2 ± 0,4,
mientras que número medio de mutaciones en las CP de sangre fue de 21,4 ± 0,7.
Similar resultado se obtuvo cuando la comparación se realizó para cada uno de los
isotipos: en IgM R+S en sangre (18,6 ± 1,1) era mayor que en amígdala (9,5 ±
0,7) (p=0,000); en IgG R+S en sangre (23,7 ± 0,9) era mayor que en amígdala
(12,3 ± 0,6) (p=0,000); y en IgA R+S en sangre (21,6 ± 1,3) era mayor que en
amígdala (18,1 ± 0,8) (p=0,026).
Figura 45 Histogramas de mutaciones en amígdala y sangre
El ratio R/S ha sido considerado un parámetro distintivo de la SHM producida
en las diferentes regiones de los segmentos génicos V. En la tabla 3 se muestran
los valores obtenidos en sangre y en amígdala en las distintas zonas de la
secuencia, así como los valores teóricamente esperados según un proceso azaroso
no sometido a selección, calculados según lo descrito por Chang y Casali.61
Tabla 3 Ratios R/S en amígdala, en sangre y teóricamente esperados
FR1 FR2 FR3 CDR1 CDR2 Total
R/S observados amígdala 1,2 0,7 1,4 1,9 2,6 2,4
R/S observados sangre 1,4 0,8 1,7 1,8 3,4 2,4
R/S esperados 2,5 2,8 3,2 8,4 3,6 3,1
Ig VH3 p = 0,000
9
7
5
3
1
1
3
5
7
0 10 20 30 40 50R + S
Frec
uenc
ia d
e m
utac
ione
s (%
)
Amígdala Sangre
Resultados
95
Como puede verse, los valores observados son claramente inferiores a los
teóricos, con la única excepción de los obtenidos para CP sanguíneas en la región
CDR2. Es también destacable la diferencia existente entre la mutabilidad intrínseca
de CDR1 y los valores observados.
5.7 Efecto del número total de mutaciones somáticas (R+S) sobre la
distribución de las mutaciones
Existía la posibilidad de que la cantidad de mutaciones totales (R+S)
influenciara la manifestación de la SHM. Para analizar esta hipótesis se agruparon
todas las secuencias clonadas (CP de amígdala y de sangre) en tres grupos de
intervalos mutacionales según el número de mutaciones somáticas totales (R+S):
el grupo 0 estaba formado por clones con menos de 10 mutaciones, el grupo 1
estaba formado por clones que presentan entre 10 y 20 mutaciones y el grupo 2
estaba formado por clones con más de 20 mutaciones. La comparación del ratio
R/S entre dichos grupos en función de si proceden de amígdala o de sangre
periférica (Fig. 46), mostraron diferencias significativas entre los tres grupos
mutacionales en todos los casos, salvo entre los grupos 1 y 2 en CDR en sangre.
Tanto en amígdala como en sangre, las zonas FR presentaban al principio un
aumento de R/S al aumentar el número de mutaciones, pero por encima de 20
mutaciones, es decir, en el grupo 2 se producía una disminución de la relación R/S.
Sin embargo, las zonas CDR de amígdala presentaban un continuo aumento de
R/S, hasta alcanzar valores cercanos a 4, al aumentar el número de mutaciones,
mientras que en sangre aumentaban al pasar del grupo 0 al 1, dónde parecía
permanecer constante a pesar del aumento en el número de mutaciones.
Figura 46 Relación del coeficiente R/S
con el número de mutaciones totales en
CP de sangre y amígdala
Amígdala Sangre
FR
● ▼■ ●▼■
CDR
● ▼■ ●▼
0 R+S<10 ● 0/1
m ± SEM 1 10<R+S<20 p<0,05 ▼0/2
2 R+S>20 ■ 1/2
R/S
1
2
1
2
1
23
4
1
2
12
34
Resultados
96
La comparación de los valores de R/S por isotipo y territorio se muestra en la
figura 47. Como puede verse, el único análisis que mostró un aumento de R/S
proporcional al incremento de mutaciones en los intervalos estudiados es el de la
región CDR de IgM de amígdala. En el resto no se detectan incrementos de R/S
entre los dos intervalos de mayor número de mutaciones, o incluso se observan
disminuciones, como en CDR de IgA.
AMÍGDALA SANGREIgM IgG IgA IgM IgG IgA
FR
● ▼ ●▼
CDR
●▼■ ●▼ ▼ ●▼ ●▼■
R+S<10 ● 0/1
m ± SEM 10<R+S<20 p<0,05 ▼0/2
R+S>20 ■ 1/2
R/S
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
12345
1
23
4
0,0
0,5
1,0
1,5
0,0
0,5
1,0
1,5
12345
0,51,01,52,02,5
0
2
4
6
1
2
3
4
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
12345
Figura 47 Relación del coeficiente R/S con el número de mutaciones
totales en CP para cada isotipo por territorios
Seguidamente se analizó si el número de mutaciones modificaba su frecuencia
en los hotspots. La comparación del porcentaje de mutaciones en hotspots entre los
grupos mutacionales en función de si proceden de amígdala o de sangre periférica
(Fig. 48), muestra diferencias significativas entre el grupo 0 y los grupos 1 y 2 tan
solo en las zonas FR de clones procedentes amígdala, sin embargo en las zonas FR
de sangre y en las CDR, tanto de sangre como de amígdala, el porcentaje de
mutaciones en hotspots no depende del número de mutaciones totales. También es
de destacar que el porcentaje de mutaciones en hotspots es mayor en CDR que en
FR.
Resultados
97
Figura 48 Relación del % de mutaciones somáticas en hotspots con
el número de mutaciones totales en sangre y amígdala
La comparación del porcentaje de mutaciones en hotspots entre los grupos de
intervalos mutacionales en función del isotipo (Fig. 49), muestra diferencias
estadísticamente significativas en entre los grupos 0 y 2 y entre los grupos 1 y 2 en
las zonas FR de IgG, así como entre los grupos 0 y 1 y entre los grupos 0 y 2 en las
zonas FR de IgA, sin embargo en las zonas FR de IgM y en las CDR de los tres
isotipos, el porcentaje de mutaciones en hotspots no depende del número de
mutaciones totales. También se cumple para los tres isotipos que el porcentaje de
mutaciones en hotspots es mayor en CDR que en FR.
Figura 49
Relación del % mhs con el número de
mutaciones totales en cada isotipo
Amígdala Sangre
FR
● ▼
CDR
0 R+S<10 ● 0/1
m ± SEM 1 10<R+S<20 p<0,05 ▼ 0/2
2 R+S>20 ■ 1/2
% de mutaciones en hotspots
10
20
30
0
20
40
60
0
20
40
20
40
60
IgM IgG IgA
FR
▼■ ●▼
CDR
0 R+S<10 ● 0/1
m ± SEM 1 10<R+S<20 p<0,05 ▼0/2
2 R+S>20 ■ 1/2
% de mutaciones en hotspots
10
20
30
0
25
50
75
10
20
30
0
20
40
60
10
20
30
0
20
40
60
Resultados
98
5.8 Probabilidades de distribución de las mutaciones R
Se ha propuesto el cálculo de la probabilidad (“p”) de una distribución de
mutaciones para demostrar la presencia de selección antigénica en una secuencia
mutada.110 Según estos autores valores inferiores a 0,05 indican selección
antigénica. Aplicando el modelo de distribución binomial, se calculó dicha
probabilidad de distribución de las mutaciones reemplazantes en todos los clones,
procedentes tanto de CPA como de CPSP, para cada una de las regiones del gen IgV.
En la tabla 4 se resume los valores medios obtenidos. Existen diferencias
estadísticas significativas entre amígdala y sangre en todas las regiones salvo en
CDR1. Todas las medias de las probabilidades “p” son bastante mayores de 0,05.
Tabla 4 Valores medios de la probabilidad de distribución de R
5.9 Análisis de la SHM según el nucleótido mutado
Se realizó un estudio sobre las mutaciones en relación a la naturaleza del
nucleótido mutado y el sustituyente. Para ello se usó el conjunto total de
mutaciones observadas en nuestro estudio (n = 9.870 mutaciones). La tabla 5
muestra la distribución en transiciones y transversiones. Como se observa, los
resultados muestran que en términos de promedio el 55% de las mutaciones son
transiciones y el 45% son transversiones, lo cual se cumple tanto para amígdala
como para sangre (Fig. 50A), así como para los tres isotipos (Fig. 51A) sin
diferencias estadísticas significativas.
n = 9.870 % transiciones % transversionesmedia 54,89 44,94
mediana 56 44Desv. Est. 17,78 17,73Error est. 0,72 0,72
Tabla 5
También se estimaron las frecuencias de todas y cada una de las 12 posibles
sustituciones. Los resultados se incluyen en las figuras 50B y 51B donde puede
apreciarse que no existen diferencias significativas entre sangre y amígdala ni entre
isotipos. Las sustituciones más frecuentes son G por A (18%) y C por T (15%) y las
menos frecuentes son T por A (3%) y T por G (3%).
FR1 FR2 FR3 CDR1 CDR2
0,166 0,256 0,184 0,185 0,156
0,119 0,190 0,138 0,195 0,110
p
Amígdala
S.P.
Resultados
99
En cuanto a las frecuencias de los nucleótidos que sufren sustituciones tampoco
existen diferencias significativas entre sangre y amígdala (Fig. 50C) ni entre
isotipos (Fig. 51C). El nucleótido con mayor frecuencia de sustituciones es G
(35%), seguido de C (26%), A (24%) y por último T (15%).
% transiciones % transversiones
m ± SEM Amígdala S.P.
A
0
20
40
60
0
20
40
60
Figura 50 Tipos de mutaciones y frecuencia de
nucleótidos mutados en amígdala y sangre
B
97,3% de coincidencia; p = 1,0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
GA CT AG GC TC CG AC AT GT CA TA TG
tipo de mutación
%
Amígdala Sangre
Total
C
98,7% de coincidencia; p = 1,0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
G C A T
base mutada
%
Amígdala Sangre
Resultados
100
Figura 51 Tipos de mutaciones y frecuencia de
nucleótidos mutados por isotipo
IgGIgA
IgGIgM
IgAIgM
94,0% 0,995
94,4% 0,999
94,3% 1,000
coincidencia p
B
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
GA CT AG GC TC CG AC AT CA GT TA TG
tipo de mutación
%
IgM IgG IgA
IgGIgA
IgGIgM
IgAIgM
99,2%
95,9%
1,000
0,995
C
p
0,999
coincidencia
95,7%
0
5
10
15
20
25
30
35
40
G C A T
base mutada
%
IgM IgG IgA
% transiciones % transversiones
m ± SEM IgM IgG IgA
A
IgM IgG IgA0
20
40
60
IgM IgG IgA0
20
40
60
Resultados
101
5.10 Análisis de segmentos JH y D
Ya se ha mencionado la dificultad de estudiar la región CDR3, debido a que en
esta zona la hipermutación somática no puede distinguirse de la diversidad
producida por el ensamblado en el reagrupamiento V-D-J. No obstante, se ha
realizado un esfuerzo por identificar los segmentos adyacentes JH y D de las 633
secuencias obtenidas. Se observó que la frecuencia de utilización de cada uno de
los seis segmentos JH era distinta, siendo el más frecuente JH4 (54’5%) y el menos
frecuente JH1 (2,0%). No se encontraron diferencias significativas en los resultados
obtenidos de amígdala y sangre (Fig. 52), así como entre los tres isotipos
estudiados (Fig. 53), aunque entre IgG e IgM se observó una diferencia
estadísticamente significativa (p=0,02), que expresaba una discreta mayor
frecuencia de JH3 en secuencias de IgM y de JH1 y JH6 en secuencias de IgG.
Figura 52 Utilización de segmentos JH en amígdala y sangre
IgGIgA
IgGIgM
IgAIgM
88,2% 0,021
90,5% 0,125
isotipos coincidencia p
89,0% 0,149
0
10
20
30
40
50
60
JH1 JH2 JH3 JH4 JH5 JH6
% c
lone
s IgMIgGIgA
Figura 53 Utilización de segmentos JH por isotipo
94,3% de coincidencia; p = 0,630
0
10
20
30
40
50
60
JH1 JH2 JH3 JH4 JH5 JH6
% c
lone
s
AmígdalaSangre
Resultados
102
En cuanto a los segmentos D, la frecuencia de su uso tampoco era homogénea,
siendo el más frecuente D1-26 (11,1%) y el menos frecuente D3-9 (0,5%). Se
observaron diferencias significativas en los resultados obtenidos de amígdala y
sangre (Fig. 54), pero no entre los tres isotipos estudiados (Fig. 55).
74,8% de coincidencia; p = 0,003
0
2
4
6
8
10
12
14
%
Amígdala Sangre
Figura 54 Utilización de los segmentos D en amígdala y sangre
Figura 55 Utilización de los segmentos D por isotipo
IgMIgG
IgMIgA
IgGIgA
p = 0,414
78,6%
80,6%
81,1%
coincidencia p
0,202
0,516
0,721
0
2
4
6
8
10
12
14
16
D1-
1
D1-
7
D1-
14
D1-
20
D1-
26
D2-
2
D2-
8
D2-
15
D2-
21
D3-
3
D3-
9
D3-
10
D3-
16
D3-
22
D4-
11
D4-
17
D4-
23
D5-
5
D5-
12
D5-
24
D6-
6
D6-
13
D6-
19
D6-
25
D7-
27
%
IgM IgG IgA
Resultados
103
5.11 Análisis comparativo de la longitud de CDR3
Si bien en el estudio de la SHM no se pudo abordar el análisis de la región
CDR3, sí pudo examinarse la longitud de dicho segmento. La longitud de CDR3
presentó una media de 14,48 ± 0,15 en amígdala y de 13,35 ± 0,25 en sangre,
siendo estadísticamente significativa la diferencia (p=0,000). Además, entre
amígdala y sangre existen también diferencias estadísticamente significativas
(p=0,000) en cuanto a sus distribuciones (Fig. 56).
Figura 56 Distribución del número de codones en CDR3 en amígdala y sangre
Respecto a los isotipos no se observaron diferencias significativas entre ellos
(Fig. 57) en cuanto a la distribución de longitudes de CDR3 (p=0,221) ni en cuanto
a sus medias (p=0,693).
Figura 57 Distribución del número de codones en CDR3 por isotipo
77,2% de coincidencia p = 0,000
02468
101214161820
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26
longitud (codones)
% c
lone
s
Amígdala Sangre
IgMIgG
IgMIgA
IgGIgA
0,056
0,350
0,646
isotipos coincidencia p
82,9%
77,3%
79,5%
0
5
10
15
20
25
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26
longitud (codones)
% c
lone
s
IgM IgG IgA
Resultados
104
Además se investigó el posible efecto del número total de mutaciones sobre la
longitud de CDR3. Para ello se agruparon las secuencias clonadas en los tres grupos
de intervalos mutacionales ya descritos previamente (apartado 5.7), no
observándose diferencias significativas entre ellos (Fig. 58) en cuanto la
distribución de longitudes de CDR3 (p=0,336) ni en cuanto a sus medias
(p=0,409).
<1010-20
<10>20
10-20>20
0,143
0,234
0,675
mutaciones coincidencia p
85,2%
82,6%
87,3%
0
2
4
6
8
10
12
14
16
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26
longitud (codones)
% c
lone
s
<10 10-20 >20
Figura 58 Distribución del número de codones en CDR3 en relación al nº de mutaciones
5.12 Análisis de la frecuencia de utilización de las subfamilias de genes VH3
El repertorio de genes VH3 utilizados en las 633 secuencias obtenidas fue
explorado a continuación. Como puede verse en la Fig. 59, el uso de genes VH3 no
es homogéneo, siendo el más frecuentemente utilizado el VH3-23 (18,6%) y el
menos frecuentemente utilizado el VH3-64 (0,2%). Las subfamilias VH3-35 y VH3-38
no han sido detectadas.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
23 48 30 74 09 11 07 21 33 15 30.5 53 66 43 72 13 20 73 49 64 35 38
VH3
Frec
uenc
ia (%
)
Figura 59 Frecuencia de uso de las subfamilias de genes VH3 en CP (sangre + amígdala)
Resultados
105
Se detectaron diferencias estadísticas significativas entre amígdala y sangre (p
= 0,000) en cuanto a sus histogramas de distribución de uso de genes VH3 (Fig.
60), así como entre los tres isotipos (Fig. 61). La mayor diferencia entre amígdala y
sangre se produce principalmente en el isotipo IgG (Fig. 62).
Figura 60 Frecuencias de uso de los genes VH3 en CP de amígdala y sangre
IgM
IgG
IgM
IgA
IgG
IgA
77,6% 0,002
77,6% 0,011
isotipos coincidencia p
77,9% 0,005
0
5
10
15
20
25
07 09 11 13 15 20 21 23 30 30.5 33 35 38 43 48 49 53 64 66 72 73 74
VH3
% c
lone
s
IgM IgG IgA
Figura 61 Frecuencias de uso de los genes VH3 en CP por isotipos
77,1% de coincidencia; p = 0,000
0
5
10
15
20
25
07 09 11 13 15 20 21 23 30 30.5 33 35 38 43 48 49 53 64 66 72 73 74
VH3
% c
lone
s
Amígdala Sangre
Resultados
106
Figura 62 Frecuencias de uso de los genes VH3
en CP de amígdala y sangre por isotipos
IgM 69,2% de coincidencia; p = 0,099
0
5
10
15
20
25
07 09 11 13 15 20 21 23 30 30.5 33 35 38 43 48 49 53 64 66 72 73 74
VH3
%
Amígdala SP
IgG 75,0% de coincidencia; p = 0,018
0
5
10
15
20
25
07 09 11 13 15 20 21 23 30 30.5 33 35 38 43 48 49 53 64 66 72 73 74
VH3
%
Amígdala SP
IgA 71,0% de coincidencia; p = 0,050
0
5
10
15
20
25
07 09 11 13 15 20 21 23 30 30.5 33 35 38 43 48 49 53 64 66 72 73 74
VH3
%
Amígdala SP
Resultados
107
5.13 Análisis de inserciones y deleciones
Han sido detectadas 6 inserciones y 8 deleciones (Tabla 6) de entre un total de
9.870 mutaciones detectadas en las 633 secuencias clonadas, lo que supone un
2,2% de inserciones y deleciones frente al número de clones y 0,14% frente al total
de mutaciones.
Muestra Isotipo VH3 D JH nt CDR3 Inserciones DelecionesSangre IgG 21 D1-14 JH4 24 TTG en FR2Sangre IgG 23 D2-21 JH6 51 GGT en CDR2Sangre IgA 20 D4-23 JH4 27 TTT GAT en FR1Sangre IgA 74 D6-6 JH3 48 GGT GGT en CDR2Sangre IgM 23 D4-17 JH4 24 GGT en CDR2Sangre IgM 23 D6-19 JH4 45 GGT en CDR2Sangre IgM 23 D2-15 JH4 45 GGT en CDR2Sangre IgM 07 D6-6 JH4 36 ATG en FR3Sangre IgM 23 D4-23 JH3 45 ATGAATTACGCT en FR1Sangre IgM 23 D7-27 JH4 42 TTT en CDR2Sangre IgG 23 D6-25 JH2 51 GAT en CDR2
Amígdala IgA 48 D2-8 JH1 48 AGT en CDR2Amígdala IgM 48 D1-26 JH4 36 AGT en CDR2Amígdala IgM 30 D4-11 JH5 45 TAT en CDR2
Tabla 6
Discusión
108
6. Discusión
Discusión
109
6.1 La aplicación informática IgDSM facilita los estudios de SHM
Un estudio sobre SHM conlleva el análisis y registro adecuado de muchos datos.
Concretamente, en nuestro estudio hemos trabajado con 312 valores numéricos por
cada secuencia de ADN clonada (39 variables dependientes x 8 zonas). El tiempo
necesario para analizar y registrar todos esos valores de una forma “manual” sería
de aproximadamente 1 h/secuencia. Lógicamente, la automatización del análisis y
registro de dichos datos reduce el tiempo necesario y el posible error asociado. En
los últimos años el uso de algoritmos iterativos ha supuesto el desarrollo de nuevos
y mejores programas para la alineación de secuencias de nucleótidos.111 Sin
embargo, en los estudios de SHM sobre secuencias de nucleótidos, se requiere la
utilización de varios programas informáticos para la alineación de las secuencias, el
cómputo y la clasificación de las mutaciones, y los cálculos con parámetros y
análisis estadísticos. A la inconveniencia de tener que utilizar varios programas, se
suma el hecho del pago de las licencias de algunos de ellos, pues la mayoría no son
gratuitos, tales como: GeneJockey112 (programa que funciona sólo en Macintosh),
VectorNTI113 (http://www.invitrogen.com/content.cfm?pageid=10129),
GeneWorks114 (http://www.geneworks.com.au/products/products.asp?catid=35),
PC/GENE115 (http://www.ccmb.res.in/bicfram/bioinfpag/softwr.html),
SeqMan116 (http://www.dur.ac.uk/stat.web/Bioinformatics/seqman.htm),
Sequencher117 (http://www.genecodes.com/sequencher/), etc.
Además, ninguno de estos programas satisfacía todas nuestras necesidades de
análisis sobre SHM. Por otro lado, programas gratuitos tales como IMGT/V-
QUEST118 (http://imgt.cines.fr/cgi-bin/IMGTdnap.jv?livret=0&Option=humanIg) o
DNAPLOT119 (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) permiten el alineamiento de una
secuencia de Ig con la de su línea germinal y la localización de las mutaciones
somáticas, pero no la clasificación de las mismas en silentes y reemplazantes ni su
cómputo por regiones. Otro programa gratuito relacionado que podemos encontrar
es el de Lossos et al.110 (http://www-stat.stanford.edu/immunoglobin/), para el
cálculo de la probabilidad de que el número de mutaciones R producidas se deba al
azar, usando el modelo de distribución binomial. Pero este programa sólo calcula
uno de los muchos parámetros utilizados en nuestros estudios de SHM; además, el
usuario del programa debe hacer cortados y pegados de las secuencias
correspondientes a las regiones FR y CDR para cada secuencia V estudiada. Por
otro lado, éste programa así como los otros gratuitos mencionados anteriormente,
sólo funcionan mediante conexión a Internet.
Por todo lo expuesto anteriormente, hemos desarrollado un programa
informático específicamente diseñado para facilitar los estudios sobre SHM, al que
hemos denominado IgDSM (immunoglobulin DNA somatic mutations).
Discusión
110
IgDSM es una aplicación informática gratuita (freeware) que puede
encontrarse, junto con su código fuente totalmente disponible, en la página web de
la Sociedad Española de Inmunología (http://www.inmunologia.org/main.htm).
Concretamente, la dirección donde se puede descargar IgDSM es:
http://www.inmunologia.org/inmunologia/ver_biblioteca.htm?id=529
Con la ayuda de IgDSM, el tiempo necesario para analizar y registrar todos los
valores es tan sólo 1 min/secuencia. En la Figura 63 se representa el tiempo
necesario para el procesamiento de los datos en función del número de secuencias
clonadas, tanto de forma “manual” (en azul) como con la ayuda de IgDSM (en
rojo).
0
200
400
600
800
1000
1200
0 200 400 600 800 1000 1200
número de clones
hora
s
Figura 63
Tiempo de análisis de datos de SHM en función del número de clones estudiados
Nuestro estudio ha constado de 633 secuencias clonadas, por tanto el tiempo
necesario para procesar todos los parámetros de forma “manual” habría sido de
unas 600 horas; mientras con que con la ayuda del programa IgDSM el tiempo
empleado para el procesamiento de los datos fue tan sólo de unas 11 horas.
Hemos desarrollado, por tanto, una aplicación informática a medida para los
estudios de SHM, que disminuye considerablemente el tiempo necesario para el
análisis y registro de datos, así como los errores asociados.
“manual”
con IgDSM
Discusión
111
6.2 SHM en VH3 de CP. No existen diferencias mutacionales en VH3 entre
CPADM y CPADC
Al iniciar la discusión de los resultados encontrados en el presente trabajo,
conviene destacar que este estudio se ha desarrollado sobre secuencias de IgVH3
obtenidas de CP. Esto significa que las conclusiones que puedan extraerse de los
mismos, deben hacerse teniendo en cuenta que estas células son el producto final
de la diferenciación B, y el resultado de la selección de la población definitivamente
escogida para producir los Ac que nos defenderán contra los diversos Ag. Como
tales, las CP y sus Ig revelan menos de cómo funciona la(s) maquinaria(s)
mutadora(s) y, sin embargo, nos pueden dar más indicios de los sesgos debidos a
la selección por Ag. Otro dato a destacar inicialmente del presente trabajo, es el
hecho de que en él se analizan las muestras más extensas de secuencias obtenidas
de CP, de entre los realizados hasta el momento.
Como ya vimos en la introducción, en amígdala humana coexisten dos
poblaciones de CP (CPADM y CPADC) que, por su distintiva forma de obtención,
parecen diferir en su modo e intensidad de unión a los tejidos. En este sentido, se
ha demostrado previamente que la zona subepitelial de la amígdala alberga la
mayoría de las CP productoras de IgA.120 En un estudio previo llevado a cabo en
nuestro laboratorio,100 se pudo establecer que estos dos tipos de CP pueden ser
distinguidas por una variedad de características: A) Aunque ambas exhiben un
fenotipo típico de CP (CD38a, CD20b, CD19+), las CPADC expresan DR con baja
intensidad mientras que las CPADM lo expresan de forma similar a los linfocitos B, es
decir, intensamente. B) En cuanto a moléculas de adhesión, las últimas expresan
CD11a y niveles más bajos de CD44 y CD49d. C) Las CPADM expresan mayores
niveles de la molécula pro-apoptótica CD95 y más bajos de la proteína anti-
apoptótica bcl-2, hechos que sugieren que éstas presentan menor capacidad de
supervivencia. D) El estudio de la producción de Ig por ambos tipos en cultivos
muestra que CPADC contiene la mayoría de las células secretoras de IgA.
Conjuntamente, estos resultados apuntan a que la sub-población CPADC esté
integrada por CP con mayor madurez (DR bajo y mayor supervivencia) y ligadas a
un compartimento predominantemente IgA y por lo tanto relacionado, al menos en
parte, con el espacio subepitelial cercano a las criptas mucosas amigdalares. Estos
rasgos, en definitiva, sugieren que las CPADC conformen una población más madura,
quizás perteneciente a un área de depósito submucoso, mientras que las CPADM
contienen CP generadas en áreas inter-foliculares o en centros germinales, más
relacionadas con respuestas tempranas a Ag de origen sistémico. A pesar de esto,
en nuestro estudio no hemos encontrado diferencias significativas en los patrones
mutacionales entre dichas poblaciones si se estudiaban isotipo a isotipo. Esta
Discusión
112
aparente contradicción quizás pueda deberse al hecho de que, si bien no existen
diferencias dentro de cada isotipo, ya se comentó previamente que un alto
porcentaje de las CPADC está formado por células secretoras de IgA, y como se ha
demostrado en el presente trabajo y se discutirá en detalle a continuación, este
isotipo mostraba una mayor cantidad de mutaciones somáticas en las dos
poblaciones. Por tanto, se puede concluir que las CPADC en su conjunto presentan
rasgos de mayor madurez mutacional.
La no existencia de diferencias sustanciales al comparar los mismos isotipos
entre secuencias IgVH3 de CPADM y CPADC nos permitió unirlas, considerando todas
las CP procedentes de amígdala como población única (CPA), y así disponer de una
base de datos más amplia de mutaciones somáticas, que nos sirva para los estudios
comparativos inter-isotipos dentro de la población de CP de amígdala, y entre éstas
y las de la sangre.
6.3 Existen diferencias en los patrones mutacionales de IgVH3 de CP entre
isotipos en amígdala y, en menor extensión, en sangre
Los resultados del presente estudio revelan que, dentro de la población de CPA,
se han encontrado diferencias significativas entre los patrones mutacionales de los
reagrupamientos VH3-D-JH de los isotipos IgM, IgG e IgA. Tanto el número de
mutaciones totales (R+S), como las mutaciones reemplazantes (R), las mutaciones
silentes (S) y las mutaciones en hotspots (mhs), son mayores en IgG que en IgM, y
mayores aún en IgA que en IgG, tanto en el conjunto total de la secuencia como en
cada una de sus regiones (FR y CDR). Sin embargo, la relación R/S y el porcentaje
de mutaciones en hotspots no presentan en general diferencias significativas entre
isotipos, es decir, que estos parámetros no parecen depender del isotipo
considerado. Estos datos concuerdan con los publicados por Pascual et al.,121
obtenidos de linfocitos B en varios estadios evolutivos procedentes de amígdala,
donde se afirma que IgG presenta mayor número de mutaciones que IgM. Este
hecho podría deberse a que la maquinaria de la SHM sea más activa en las que
expresan IgG o, como sugirieron Kepler et al.,122 que se deba a la diferente
capacidad de re-entrada de las células seleccionadas en los centros germinales con
el fin de aumentar todavía más la afinidad mediante la producción de más
mutaciones somáticas. Aunque no se conocen en detalle los mecanismos
moleculares que sustentan la existencia de mayor cantidad de mutaciones en CP
proveniente de células "post-switch" (con isotipos no IgM), el hecho de que el
Discusión
113
"switch" de isotipo y la SHM están regulados conjuntamente por AID123 debe ser
importante. El patrón mutacional exhibido por las secuencias IgA es el que muestra
una mayor tendencia a tener más mutaciones y mayor ratio R/S, sobretodo en
CDR. Esto tiene especial relevancia y parece indicar que las CP con este isotipo son
el producto de procesos selectivos repetidos, lo que concordaría con la idea de que
las CP IgA situadas en la zona submucosa reflejan la intensa participación de este
órgano en la defensa anti-bacteriana local.
Por el contrario, en CPSP no se ha observado, entre los tres isotipos, diferencias
significativas generalizadas para todos los parámetros mutacionales estudiados, con
la excepción de la comparación entre CP IgM e IgG, que revela que estas últimas
están claramente más mutadas que las primeras, de una forma similar a lo descrito
en la amígdala.
6.4 Diferencias en los patrones mutacionales de IgVH3 entre CPA y CPSP
Un objetivo importante del presente trabajo era el de comparar los fenómenos
mutacionales ocurridos en poblaciones de CP de diferentes territorios. En ese
sentido se escogió la amígdala como un lugar sujeto a una intensa estimulación por
Ag, donde la activación linfoide B es altamente frecuente, dando lugar a la
generación de gran cantidad de CP tempranas. El otro territorio objeto de estudio
fue el compartimento de CP de la sangre, el cual ha sido escasamente explorado
desde este punto de vista, en gran parte por la reducida presencia de esta
subpoblación. No obstante esta dificultad, las CP circulantes son de gran interés
potencial, dado que se ha demostrado que las CP de depósito final (de MO o LP,
para la respuesta humoral sistémica o mucosa, respectivamente), provienen de una
CP precursora circulante.98,124,125 El presente trabajo demuestra que los
reagrupamientos IgVH3-D-JH de isotipo IgM e IgG presentan un claro y significativo
incremento de los fenómenos mutacionales en las CPSP con respecto a las CPA. Si se
asume que el compartimento de las CP circulantes se forma a partir de CP
tempranas (como las que predominan en las CPA), es lógico pensar que debe existir
un mecanismo que seleccione las más mutadas de entre las CPA para que puedan
pasar a integrar las CPSP. La señal o señales requeridas para este fenómeno
selectivo son desconocidas, si bien hay algunos aspectos ya sustentados que
explicarían, al menos en parte, este proceso. Así, en primer lugar, se ha
demostrado que las CP tempranas están sujetas a una alta tasa de apoptosis, y es
también conocido que las CP que alcanzan la MO a través de la sangre son las que
presentan Ac con más alta afinidad por el Ag.126,127 Todo esto conduce a pensar que
Discusión
114
sólo las CP tempranas con estas últimas características son capaces de emigrar a la
sangre, mientras que el resto, con Ac menos afines, muere por apoptosis. Esto
explicaría porqué las CPSP presentan un mayor número de fenómenos mutacionales,
lo que sería expresión de una mayor selección por Ag. Aunque el mero hecho de
poseer un mayor número de mutaciones no tiene necesariamente que implicar
mayor afinidad del Ac por el Ag, parece sensato pensar que los datos presentados
indiquen que las CPSP, más mutadas, han sido seleccionadas por su mayor afinidad.
Esto ha sido recientemente demostrado en nuestro laboratorio, ya que un estudio
similar al presente, desarrollado con CP aisladas de MO, órgano de depósitos final
para CP en las respuestas sistémicas, así lo indica (en preparación). No se ha
aclarado aún cual es el mecanismo que condiciona la entrada de una CP
determinada dentro del estadio madurativo y migratorio descrito. Es posible que la
señal del Ag sobre una Ig de superficie capaz de reconocerlo con alta afinidad sea
la encargada de inducir la secuencia de cambios que desarrollan la capacidad
migratoria de las CP con Ac de mayor afinidad. En este sentido se ha demostrado
que la expresión del receptor de quemoquina CXCR4, una molécula esencial para la
emigración de las CP, aparece más altamente expresada en CP circulantes y de MO,
un compartimento este último que, como se ha dicho, está altamente enriquecido
en CP que producen Ac de alta afinidad.126,127
Recientemente, nuestro laboratorio ha publicado evidencias de que la población
CPSP es altamente compleja, conteniendo CP de generación reciente tras el estímulo
antigénico in vivo, junto a otras CP más avanzadas en la secuencia madurativa
plasmocítica, y que quizás provengan de depósitos previamente establecidos.128
El isotipo IgA parece no encajar totalmente en este esquema de
funcionamiento, ya que no se detectaron diferencias entre secuencias IgVH3
obtenidas de CPA y CPSP que sugirieran procesos de selección madurativa como los
observados para los otros dos isotipos examinados. Una posible explicación a esta
aparente incongruencia se ha señalado ya, y es la de considerar que la población de
CPA con isotipo IgA, aunque contiene CP tempranas, está integrada
predominantemente por CP de alojamiento final submucoso, y por lo tanto con
mayor número de mutaciones. Esto daría como resultado la no existencia de
diferencias entre esta población y la seleccionada para emigrar a la sangre para
integrar el compartimento CPSP.
Discusión
115
6.5 La frecuencia de mutaciones varía con el tejido considerado
La frecuencia total de mutaciones en genes IgV ha sido usada previamente con
el objetivo de establecer comparaciones madurativas entre diferentes territorios
linfoides. La tabla 7 incorpora nuestros datos y los obtenidos en poblaciones de CP
de bazo humano por otros autores. Como puede verse, estas últimas presentan
frecuencias claramente inferiores a las de amígdala. Este dato es consistente con el
hecho de que el bazo contiene esencialmente CP tempranas generadas en
respuesta a Ag hematógenos, y escasa cantidad, si alguna, de CP de vida
prolongada.129 El hecho de que las CP de amígdala presenten mayores frecuencias
de mutaciones se debe posiblemente a que este órgano sufre mayor exposición
antigénica, y al hecho, ya mencionado, de que contiene un área submucosa de
depósito de CP maduras.
Tabla 7 Frecuencia de mutaciones en CP de distintos territorios
Los datos de CP de bazo proceden de Ellyard et al.86 mientras que los de amígdala y sangre provienen del presente estudio.
La unión de nuestros datos obtenidos sobre CP de amígdala y sangre con otros
descritos en la bibliografía para bazo, parótida y colon, nos permite elaborar la
tabla 8 que muestra el gradiente de R+S por diferentes territorios e isotipos.
Tabla 8 Número medio de mutaciones totales por isotipo y territorio
Los datos de bazo y parótida proceden de Dunn-Walters et al. 130
Los datos de colon proceden de Dunn-Walters et al. 131
Los datos de amígdala y sangre provienen del presente estudio.
Como puede verse la tabla 8 muestra la existencia de un gradiente de
incremento en el número total de mutaciones entre los diferentes territorios. Así, se
observa la presencia de secuencias menos mutadas en las CP de bazo y de
amígdala, incrementándose claramente el número de las mutaciones en las CP de
sangre, y en órganos finales de depósito mucoso como colon y parótida. Datos
preliminares de nuestro laboratorio sobre este parámetro obtenido en CP de MO
humana muestran que este último territorio contiene las CP con mayor número de
FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 Totalbazo 2,1% 6,9% 0,8% 3,4% 2,3% 2,5%
amígdala 2,8% 11,6% 1,8% 8,6% 4,1% 4,5%sangre 5,0% 15,8% 3,0% 12,6% 7,1% 7,3%
isotipo bazo amígdala sangre colon parótida
IgM 5 10 19 20
IgG 12 24
IgA 14 18 22 21 29
Discusión
116
mutaciones, como corresponde a su papel de zona de depósito de CP de prolongada
supervivencia y con Ac de alta afinidad (estudio en preparación). Este gradiente se
observa similarmente para los tres isotipos explorados, si bien parece que las
secuencias IgM acumulan un número ligeramente menor de mutaciones en todos
los territorios. Colectivamente, todos estos hallazgos revelan que los parámetros
mutacionales explorados son claros índices de maduración funcional de las CP en su
conjunto, y corroboran aspectos esenciales de la fisiología de estas células. Así, las
CP humanas siguen una dirección madurativa que va de áreas de formación de CP
tempranas → compartimento circulante → áreas de depósito final, y esta vía está
marcada desde su inicio para aquellas CP que poseen genes IgVH con un número
elevado de mutaciones, lo que parece paralelo a la adquisición de mayor afinidad
para el Ag por parte del Ac codificado por ese gen.
6.6 La región más mutada de los segmentos VH3 es CDR1
Chang y Casali.61 entre otros, describieron que en secuencias seleccionadas por
Ag los ratios R/S inherentes a las CDR son mayores que los inherentes a las FR y
concretamente en los CDR1 mayores que en los CDR2. Sin embargo, nuestros
datos muestran que el ratio R/S observado es mayor en CDR2 que en CDR1, tanto
en amígdala como en sangre. No obstante cuando analizamos la frecuencia de
mutaciones, tanto totales como reemplazantes y tanto en amígdala como en
sangre, es mayor en CDR1 que en CDR2. Esto coincide con los datos de Pascual et
al.121 obtenidos de linfocitos B procedentes de amígdala. Esta discrepancia puede
deberse a que las muestras analizadas en el presente estudio provienen de
poblaciones de CP generadas in vivo, mientras que las reportadas por Chang y
Casali están integradas por hibridomas construidos a partir de poblaciones B.
Por otro lado, Rada y Milstein han analizado frecuencias de mutaciones en
relación a la distancia a la región promotora de los genes VH y han descrito un
decaimiento intrínseco de la probabilidad de mutación en relación a la distancia de
dicha región.50 Este decaimiento es similar para cadenas pesadas y ligeras. Este
estudio apoya la hipótesis de que, independientemente de los hotspots, la
probabilidad intrínseca de mutaciones en CDR1 es mayor que en CDR2 y en éste
mayor a su vez que en CDR3.
La combinación de los datos obtenidos en este estudio en cuanto a R/S
observado, R/S esperado (mutabilidad intrínseca) (tabla 3) y frecuencia mutacional,
revela que CDR1, a pesar de tener más mutaciones y una mayor mutabilidad
Discusión
117
intrínseca,132 mantiene un R/S observado llamativamente más bajo que CDR2. Este
hecho sugiere que los cambios en la secuencia de CDR1 están claramente más
limitados y restringidos que en CDR2, en el proceso de maduración de la afinidad
por el Ag. Esto quizás se explique por el papel más “central” que CDR1 ocupe en el
reconocimiento del Ag.133,134
6.7 R/S vs maduración de la afinidad
Ya se ha mencionado que el valor relativo del ratio R/S puede servir como un
indicador del nivel de maduración de la afinidad de una Ig como consecuencia de la
SHM (sección 2.3.2.1). En general, las Ig seleccionadas por Ag poseen una mayor
frecuencia de mutaciones R que de mutaciones S en los CDR. Esto es consistente
con el hecho de que las mutaciones S no modifican la afinidad de la Ig, al no dar
lugar a cambio del aminoácido codificado. Sin embargo, las mutaciones R sí que
alteran la estructura y, por tanto, la afinidad de la Ig. Cuando la alteración produce
un aumento en la afinidad de la Ig, ésta es seleccionada por Ag. Por tanto, el alto
ratio de mutaciones R/S característico de los segmentos génicos CDR de afinidad ya
madurada, es consistente con el efecto de una presión positiva sobre la maduración
para conseguir una mayor afinidad hacia el Ag. Lo expuesto para los segmentos
CDR no se cumple para los segmentos FR, donde un aumento del ratio R/S dificulta
la preservación de la estructura de la Ig alrededor de los sitios de unión al Ag.8,61
No obstante, los mecanismos que actúan para determinar los límites de la SHM en
FR y CDR están aún por esclarecer completamente. En este sentido es interesante
destacar las claras diferencias obtenidas entre los valores R/S observados y los
esperados si sólo participase el azar (tabla 3). Como se ve, las FR tienden a tener
valores de R/S inferiores a los esperados, lo que seguramente está relacionado con
la inviabilidad funcional de cambios en las secuencias que alteren la estabilidad en
la estructura de estas zonas. Más llamativo es aún el hecho de que los valores
observados de R/S en CDR están también muy por debajo de los esperados. Esto
revela que la actividad de la SHM se manifiesta a nivel de selección antigénica sólo
dentro de unos límites, como se verá más adelante.
Teniendo en cuenta lo anterior, es decir que el valor del ratio R/S podría ser
tomado como una medida de maduración (aumento de afinidad), hemos comparado
la media de dicho ratio obtenido en nuestros clones de isotipo IgM de CPA, con el
obtenido por Yavuz et al.135 también para el isotipo Ig M de CPA. En la Figura 64 se
muestra el ratio correspondiente a las distintas regiones de los genes VH, donde
Discusión
118
puede observarse que dicho ratio es mayor en las CDR que en las FR, sugiriendo un
proceso de selección por afinidad. Como cabría esperar no se observan diferencias
significativas (p = 0,93) entre nuestros datos y los de Yavuz et al. (que no aportan
valores para FR1), teniendo en cuenta que las mutaciones y la selección por
afinidad sigue un mecanismo general y que las secuencias comparadas
corresponden ambas al mismo órgano linfoide secundario (amígdala).
Figura 64 Ratio R/S por regiones en IgM de CP de amígdala
Por otro lado, sería lógico pensar que, en general, el aumento en el número de
mutaciones totales (R+S) conlleve a un aumento del ratio R/S, dado que los clones
seleccionados irían acumulando las mutaciones R que le confieren más afinidad.
Esto se cumple parcialmente en los resultados obtenidos (Fig. 47, p. 98). Si
observamos los valores obtenidos para los CDR (para todos los isotipos, IgA, IgM e
IgG) observamos que la tendencia es la de aumentar el ratio R/S cuando aumenta
el número R+S. Según lo que hemos establecido anteriormente, sería lógico
observar mayor aumento de mutaciones R (que van confiriendo aumento de
afinidad) en los CDR. No obstante, si analizamos el ratio en los FR (que siempre es
bastante menor que en los CDR), observamos que aumenta a medida que
aumentan las mutaciones totales en el rango de 10-20 mutaciones por secuencias,
pero dicho ratio cae cuando las mutaciones aumentan por encima de este rango.
Esto podría deberse a que las FR presentan un umbral de mutaciones tal que sólo
admite un cierto número de mutaciones R (por razones de mantenimiento
estructural de las Ig). Así, se irían seleccionando los clones que han adquirido un
mayor número de mutaciones acumuladas en los CDR, en detrimento de los que
mutan en los FR (que son mayoritariamente eliminados o no seleccionados).
1,7
1,0
2,1
1,5
2,0
1,1
3,2
1,4
0,8
0
1
2
3
4
FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3
R/S
Nuestros resultados Yavuz et al.
Discusión
119
Dorner et al. investigaron genes IgVH humanos con secuencias fuera del marco
de lectura,136,137 siendo por tanto genes no seleccionados por Ag; comprobaron que
estos genes poseen un ratio R/S mayor que los genes con secuencias dentro del
marco de lectura, lo que sugiere que la selección por Ag no implica una
acumulación mayor de mutaciones R. A pesar de ser una población seleccionada, la
mayoría de los genes dentro del marco de lectura no parecen ser seleccionados
cuando se analizan mediante los modelos estadísticos existentes. Incluso Ig
seleccionadas de alta afinidad no siempre satisfacen los criterios estadísticos de
genes seleccionados. Por otro lado, Dunn-Walters et al. han observado la
acumulación de mutaciones S en secuencias dentro del marco de lectura.138 Es
probable que esto refleje la eliminación de mutaciones R perjudiciales mientras que
las mutaciones S se acumulan. El hecho de que las mutaciones R parezcan no ser
seleccionadas positivamente, a pesar de su tendencia inherente a producirse,
sugiere que una consecuencia general de la selección es mantener la integridad
funcional de la secuencia, previniendo de una excesiva alteración de la misma
debido a las mutaciones R, no sólo en las regiones FR como se pensaba
anteriormente. En relación con esto, el presente trabajo revela que el aumento de
la frecuencia de mutaciones R observado en las regiones CDR no es indefinido. Así,
se observa que una vez se alcanza un valor promedio de R/S de aproximadamente
4, la acumulación de más mutaciones no eleva este ratio (Fig. 46, 47). La
explicación de la existencia de este umbral máximo para el ratio R/S es
desconocida. En este sentido, se podría especular con que dicho umbral confiere un
nivel de afinidad por el Ag suficientemente bueno, y que la acumulación de nuevas
mutaciones R que dieran lugar a cambios importantes, serían no selecionadas. Un
hecho a destacar en este sentido es que la velocidad con la que se alcanza el
umbral máximo de R/S no es homogénea. Así, para IgM y en amígdala el aumento
del ratio R/S parece ser proporcional al aumento del número de mutaciones,
mientras que en IgG, IgA y sangre el umbral máximo se alcanza antes, cuando se
acumulan más de 10 mutaciones. Estas diferencias podrían quizás deberse a que
existan diferentes requerimientos de afinidad entre respuestas tempranas (de
predominio IgM y en órganos de inducción como la amígdala) y más tardías, siendo
las primeras menos exigentes en cuanto al reconocimiento del Ag.
Por tanto, podría concluirse que el proceso de SHM presenta un sesgo intrínseco
hacia la acumulación de mutaciones reemplazantes en los CDR sobre los FR. El
proceso de selección podría actuar tanto a favor como en contra de tales
mutaciones, dependiendo de su contribución relativa a la afinidad y a la integridad
estructural. Una pequeña cantidad crítica de mutaciones reemplazantes puede ser
suficiente para incrementar enormemente la afinidad.
Discusión
120
6.8 Probabilidades de distribución: SHM vs selección antigénica
Los métodos utilizados hasta ahora para estimar la probabilidad de que una
determinada distribución de mutaciones R en una determinada región de un gen de
Ig, se produzca como consecuencia del azar y no por un proceso de selección, se
basan también en el número total de mutaciones (R+S) observadas en toda la
secuencia del gen IgV; en este sentido, cuando el número R+S es muy alto es
necesario imponer una restricción más rigurosa (por ejemplo un valor de corte
considerablemente menor de 0,05) para obtener conclusiones biológicamente
significativas.
De acuerdo con la literatura científica reciente, el análisis de secuencias de
genes de Ig mediante el método que utiliza el modelo de distribución binomial, es
el que se usa más ampliamente para verificar la implicación de la selección
antigénica en casos de diferentes enfermedades autoinmunes139,140,141,142,143,144 y
linfomas.145,146,147,148,149,150,151 Sin embargo, el modelo de distribución binomial no
tiene en cuenta las diferencias de mutabilidad intrínseca entre las diversas regiones
del gen de Ig. El modelo de distribución binomial, por definición, es aplicable a
variables que tienen sólo dos distribuciones posibles, mientras que las mutaciones
en genes de Ig presentan cuatro distribuciones diferentes posibles (R o S en FRs o
en CDRs). Por esta razón, Lossos et al. propusieron el uso de un modelo de
distribución multinomial para determinar si el número de mutaciones R de una
región se debe al azar o a una presión selectiva antigénica, encontrando
discrepancias significativas frente al modelo binomial en el 9% de los clones
estudiados.152
Muy recientemente, Bose y Sinha153 han modificado el método estadístico de
Chang y Casali61, para incluir los efectos de la mutabilidad intrínseca de las
diferentes regiones del gen de la Ig. Las modificaciones introducidas se basan en la
utilización de los índices de mutabilidad (IM) intrínseca de cada nucleótido en el
contexto de cada codón. Estos índices de mutabilidad fueron propuestos por
Shapiro et al. mediante el análisis de un conjunto de reagrupamientos no
productivos de segmentos génicos VH, tanto humanos como de ratón.154 Si IM > 1
se considera como hotspot, mientras que si IM < 1 se señala un coldspot. A partir
de los IM de los nucleótidos, Bose y Sinha definieron la mutabilidad relativa (MR) de
cada región. En este método modificado, la frecuencia esperada de mutaciones R o
S en una determinada región depende de su longitud relativa, de la composición de
sus codones y de la mutabilidad intrínseca de sus nucleótidos. Sin embargo, incluso
con las modificaciones incluidas, el análisis estadístico de las mutaciones es
demasiado simplista como para verificar el papel de la selección antigénica en la
maduración de un clon. Por tanto, Bose y Sinha sugieren que un análisis estadístico
Discusión
121
simple del patrón de distribución de mutaciones somáticas en un clon no puede ser
utilizado como herramienta fiable para establecer si una Ig es o no producto de la
selección antigénica.
Nuestros resultados de la probabilidad de distribución de mutaciones “p” en
secuencias VH3 de amígdala y sangre vienen a corroborar lo anterior, puesto que
los valores promedios obtenidos para p son bastante superiores a los que cabría
esperar tratándose de IgV procedentes de CP. Existen fuertes sesgos en la
tendencia individual de las bases en IgV a mutar en ausencia de proceso selectivo.
La fuerza de dichos sesgos es tal, que no es posible determinar concluyentemente
si se ha producido o no una selección por Ag en un gen expresado sólo mediante
análisis estadístico de la distribución de mutaciones.
6.9 Preferencias en la sustitución de nucleótidos
Si todas las sustituciones de nucleótidos se produjeran y seleccionaran con la
misma probabilidad, cabría esperar el doble de transversiones que de transiciones,
como puede deducirse de la tabla 9. Sin embargo, nuestros resultados muestran
que las transiciones (55%) predominan sobre las transversiones (45%), tanto en
amígdala como en sangre, lo que está en concordancia con lo descrito en general
en la bibliografía relacionada13,155,156,157 y en particular con los datos de Yavuz et
al.135 obtenidos de CP de amígdala (52% de transiciones y 48% de transversiones).
Tabla 9
En cuanto al patrón de distribución de las bases sustituidas, nuestros resultados
concuerdan (p = 0,31) con los obtenidos por Yavuz et al.135 en CP de amígdala (Fig.
65), y además muestran que no existe diferencia alguna entre CP procedentes de
sangre y de amígdala (Fig. 50, p. 99).
transiciones transversionesAG ACCT CGGA GCTC TA
ATCAGTTG
33,33% 66,67%
Discusión
122
Figura 65 % de bases mutadas en IgM de CP de amígdala
Yavuz et al.135
Por otro lado, hemos comparado nuestros resultados sobre la distribución de las
proporciones de sustitución de cada una de las bases, obtenidos de CP, con los de
Pascual et al.121 obtenidos de linfocitos B en varios estadios evolutivos procedentes
de amígdala, y con los de Betz et al.157 obtenidos a partir de segmentos
transgénicos y de secuencias flanqueantes de genes IgV y, por tanto, sin influencia
de proceso selectivo (Fig. 66).
Figura 66 Distribución de las bases sustituidas en función del estadio madurativo
Los datos de secuencias transgénicas (ausencia de proceso selectivo) proceden de Betz et al.157
Los datos de linfocitos B de amígdala proceden de Pascual et al.121
Los datos de CP de amígdala proceden de nuestro estudio
Como puede apreciarse en la Figura 66, en general, los patrones de distribución
de las bases sustituidas no dependen significativamente del estadio evolutivo, no
existiendo diferencias significativas de nuestros resultados con los de Betz et al. (p
= 0,47), ni con los de Pascual et al. (p = 0,66).
35
2426
15
31
20
27
22
0
10
20
30
40
G A C T
%
Nuestros resultados Yavuz et al.
37
29
21
13
38
2022
14
35
2426
15
0
10
20
30
40
G A C T
%
Ausencia de proceso selectivo Linfocitos B de amígdala CP de amígdala
Discusión
123
La comparación de nuestros datos con los de Pascual et al.121, obtenidos de
linfocitos B, en cuanto al patrón de distribución de todas las sustituciones posibles
(Fig. 67), muestra en cambio la existencia de diferencias significativas (p = 0,036).
Figura 67 Patrones de distribución de sustituciones en linfocitos B vs CP
Los datos de linfocitos B de amígdala proceden de Pascual et al.121
Los datos de CP de amígdala proceden de nuestro estudio
Otra observación importante son las diferencias encontradas entre la frecuencia
de mutaciones de A respecto a las de T, que ya han sido reflejadas en la bibliografía
y que podría explicarse por el sesgo de la maquinaria mutacional WA/TW.77,158
Según se ve en la comparativa realizada en la figura 66, esta diferencia parece
acuciarse en secuencias no seleccionadas o menos maduras. Sin embargo, la figura
66 también muestra diferencias del mismo orden en cuanto a la frecuencia de
mutaciones de G respecto a las de C.
Todos estos datos vienen a indicarnos que nuestros datos concuerdan con lo ya
observado por otros grupos, los cuales advierten un número similar (e incluso
ligeramente mayor) de transiciones que de transversiones, cuando debería de ser la
mitad de estas últimas. Esto significa que la maquinaría está claramente sesgada
hacia las transiciones y que este sesgo es independiente de la selección por Ag. Una
razón que podría ser la causa de ello es que posiblemente la polimerasa y/o
maquinaria mutacional introduzca bases nucleicas parecidas estructuralmente
(alosterismo) a las que existían inicialmente.
0
5
10
15
20
25
GA CT AG GC TC CG AC AT GT CA TA TG
mutaciones
%Linfocitos B de amígdala CP de amígdala
Discusión
124
6.10 Uso sesgado de los segmentos D y JH
La identificación de los segmentos génicos D puede ser difícil, especialmente en
los reagrupamientos altamente mutados. En nuestro caso al 13% de las secuencias
no se le pudo asignar un segmento D. La distribución del uso de los segmentos D
se encuentra sesgada, con diferencias estadísticas significativas ente amígdala y
sangre pero no entre los isotipos IgM, IgG e IgA. En cualquier caso, los segmentos
que hemos encontrado con más frecuencia en los reagrupamientos VH3-D-JH son
D1-26, seguido de D6-19 y D3-22, que difiere un poco de lo encontrado por Rosner
et al.159 para VH6 en linfocitos B de sangre periférica, donde los segmentos D más
frecuentes son D6-19, seguido de D1-26 y D6-13.
La distribución del uso de los segmentos JH también está sesgada, aunque dicha
distribución, y por tanto su sesgo, es igual entre CP de amígdala que de sangre y
entre isotipos. El segmento JH4 es el más frecuente (57,6%) en los
reagrupamientos VH3-D-JH, seguido de JH6 (18,2%). Esta distribución difiere (p <
0,000) de la descrita por Brezinschek et al.160 para reagrupamientos productivos de
linfocitos B de sangre periférica (Fig. 68) donde JH4 y JH6 son también los
segmentos preferentemente usados pero con frecuencias muy similares (41% y
38%).
Figura 68 Distribución de segmentos JH en sangre periférica
Los datos de células B de SP proceden de Brezinschek et al 160
Los datos de CP de SP proceden de nuestro estudio
14
9
41
7
38
2,9 2,9
8,8
57,6
9,4
18,2
0
20
40
60
JH1 JH2 JH3 JH4 JH5 JH6
%
cel. B de SP CP de SP
Discusión
125
Sin embargo, nuestros datos concuerdan (p = 0,184) con los obtenidos por
Yavuz et al.135 también en CP de amígdala (Fig. 69).
Figura 69 Distribución de segmentos JH en CP de amígdala
En CP aisladas de duodeno, parótida y bazo se ha descrito que el segmento JH
más utilizado es también JH4.130
Estos datos parecen indicar que la distribución de segmentos JH es homogénea
en CP, difiriendo ligeramente de linfocitos B, por lo que podría haber cierta
especificidad de uso según el nivel de diferenciación dentro de la serie B.
6.11 Longitud del segmento CDR3
Tanto la longitud como la composición de aminoácidos determina la habilidad
de las CDR para unirse al Ag con alta afinidad. Mientras que la longitud de CDR1 y
CDR2 es relativamente invariante, la longitud del CDR3 en la cadena pesada es
extremadamente diversa (de 15 a 72 nt ó 5-24 aa). Esta variedad en la longitud de
CDR3 se genera durante el reagrupamiento VH-D-JH. Se ha especulado con la
posibilidad de que las Ig de linfocitos B con CDR3 cortos pueden unirse al Ag con
mayor afinidad que las que tienen CDR3 más largos, lo cual puede deberse al hecho
de que el CDR3 está situado en el centro del sitio de unión del Ac, de forma que la
menor longitud favorezca el acomodamiento en el espacio antigénico al que se
une.161 La estructura tridimensional de varios anticuerpos muestra que un CDR3
largo llena sobradamente la cavidad de unión del anticuerpo saliéndose de la
1,65,3
10,6
53,2
9,5
19,7
1,9 3,7
12
42
10,3
30
0
20
40
60
JH1 JH2 JH3 JH4 JH5 JH6
%
Nuestros resultados Yavuz y col.
Discusión
126
misma162. Por el contrario, los anticuerpos con CDR3 cortos presentan menor
impedimento espacial en la unión al Ag.
La longitud del CDR3 varía según la edad del donante y del estado de
hipermutación del gen V. En cuanto a la edad, se produce un continuo incremento
en la longitud durante la vida fetal hasta el nacimiento, debido principalmente a la
relativa ausencia de regiones N en los genes fetales163. Aparentemente, este
incremento no continúa en la vida adulta, pues se ha descrito que la longitud de
CDR3 no varía entre los 26 y 86 años.164 En cuanto al grado de mutación del gen V,
gracias a las librerías de ADNc, que incluyen genes con y sin mutaciones, se pone
de manifiesto una diferencia en la longitud según el grado de mutación. Las
regiones mutadas poseen segmentos CDR3 más cortos que las no mutadas,159,165 lo
que también sugiere que el Ag puede seleccionar reagrupamientos con CDR3 más
cortos. Brezinschek et al. encontraron que el segmento génico más largo (JH6)
aparece menos frecuentemente en las cadenas pesadas mutadas que en las no
mutadas,166 contribuyendo a la diferencia de longitud. También Brezinschek et al.
describieron, en su estudio con linfocitos B de sangre, que los segmentos CDR3
tienden a ser más cortos en los reagrupamientos productivos que en los no
productivos,160 lo cual podría deberse a que una mayor longitud del segmento CDR3
haga más improbable que se exprese la cadena pesada.
En nuestro estudio con CP hemos encontrados diferencias significativas en la
distribución de longitudes de CDR3 entre amígdala y sangre (Fig. 56, p. 103), pero
no entre isotipos IgM, IgG e IgA (Fig. 57, p. 103). Además nuestros resultados
muestran que dicha distribución de longitudes de CDR3 no depende del número de
bases sustituidas mediante SHM (Fig. 58, p. 104).
En consonancia con lo descrito por Yavuz et al.135 en CP de amígdala, hemos
encontrado que la longitud media de CDR3 en las secuencias a las que no se puede
asignar un segmento D (36 nt) es menor que las de aquellas a las que sí se puede
asignar segmento D (43 nt).
Hemos unido nuestros datos de longitud de CDR3 procedentes de amígdala y
sangre con los publicados por otros autores en otros tejidos (tabla 10).
isotipo bazo amígdala sangre glándula salivarIgM 50 44 39 34IgG 43 41IgA 44 43 40 36
Tabla 10 Longitud media (nt) de CDR3 por isotipo y territorio
Los datos de bazo y parótida proceden de Dunn-Walters et al.130
Discusión
127
Dado que el mismo reagrupamiento génico puede estar asociado con diferentes
isotipos, no es sorprendente que no existan diferencias significativas del tamaño de
CDR3 entre isotipos, sin embargo sí existe un gradiente creciente de la longitud del
CDR3 en distintos órganos en el sentido parótida, sangre, amígdala y bazo, justo en
sentido contrario al gradiente del número de mutaciones totales, como era de
esperar. Se ha sugerido que el alto contenido antigénico de las superficies mucosas
puede dar lugar a una constante estimulación de los linfocitos B a entrar en los
centros germinales y acumular un mayor número de mutaciones.167 No obstante,
esto también podría deberse al hecho de que la lámina propia de los órganos
mucosos (en este caso la parótida) es un lugar de depósito final para las CP de
mayor afinidad y, consiguientemente, más mutadas, hecho que es concordante con
poseer CDR3 más cortos.
La diferencia de longitud de CDR se debe principalmente al uso de los
segmentos D, siendo bastante improbable que la producción de inserciones o
deleciones influya en la longitud de CDR3, pues no existen evidencias de las
mismas en los segmentos estudiados.130 Recientemente, utilizando ratones
transgénicos con un único segmento “D” posible, se ha visto la importancia de
determinados residuos con carga positiva que han de conservarse en el CDR3 para
la posterior selección clonal y producción de anticuerpos.168
6.12 Uso sesgado de los 22 miembros de VH3
Brezinschek et al. describieron la existencia de un cierto sesgo a favor del uso
de los miembros de la familia VH3 en linfocitos B de sangre periférica humana.160 De
entre las familias de genes VH, VH3 es la más frecuentemente usada (56,3%),
seguida por VH4, VH1, VH5, VH2, VH6 y VH7, un orden que es similar al número de
genes funcionales de cada familia. Sin embargo, el porcentaje que supone el
número de miembros de VH3 en el genoma es de 43,1% de los segmentos
funcionales VH. Además, esta preferencia por la familia VH3 es similar en
reagrupamientos tanto productivos como no productivos (56,3% y 61,3%
respectivamente). Por tanto, es probable que dicho sesgo esté relacionado con el
mecanismo molecular de la recombinación somática y no con una selección clonal
de los miembros de la familia VH3.
Dentro de la familia VH3, nuestros datos muestran también la existencia de una
distribución sesgada en el uso de sus miembros, siendo VH3-23 el miembro más
frecuente, tanto en amígdala (17%) como en sangre (22%). Este resultado es
consistente con lo observado por Brezinschek y col.160 en sangre periférica y por
Discusión
128
Yavuz et al.135 en CP de amígdala, lo cual indica la falta de influencia del proceso
selectivo en dicho sesgo. Además, no hemos encontrado diferencias significativas
de la distribución en el uso de los miembros de VH3 entre isotipos o entre CP de
sangre y amígdala.
6.13 Inserciones y deleciones son esporádicas en la SHM
Aunque la SHM se describe típicamente como la generación de sustituciones de
nucleótidos, también se ha descrito la producción esporádica de inserciones y
deleciones en genes IgV durante la SHM, como una forma adicional de diversificar
el repertorio de anticuerpos. En todas las secuencias con inserciones/deleciones se
producen sustituciones de nucleótidos en la región adyacente a la inserción o a la
deleción, lo que sugiere que la mutación somática y la inserción/deleción están
estrechamente relacionadas y posiblemente inducidos por una maquinaria
enzimática relacionada. Aunque el mecanismo exacto que produce inserciones y
deleciones no se conoce todavía, la escasa detección de estos eventos en CP
sugiere que juegan un papel muy pequeño en la generación de diversidad,
posiblemente debido a la eliminación de las células que expresan moléculas de Ig
funcionalmente dañadas por esas alteraciones.
En nuestro estudio de SHM en CP de amígdala y sangre, hemos encontrado que
el 2,2% de los clones analizados presentan inserciones o deleciones, que suponen
el 0,14% del total de mutaciones producidas. Las inserciones y deleciones se
producen muy preferentemente en los CDR, donde con más frecuencia se
encuentran los hotspots, preferentemente en CDR1 y CDR2 o sus proximidades. La
mayoría consiste en la inserción o deleción de un único codón, aunque existen
casos de inserciones/deleciones de dos o más codones (hasta cuatro codones). La
mayoría de las inserciones/deleciones se han encontrado en CP de sangre, y dentro
de la secuencia IgVH la región con mayor incidencia de estas mutaciones es CDR2.
De esta forma, nuestros resultados son consistentes con los de Ohlin et al. 169 y los
de Wilson et al.,170 quienes han descrito que las inserciones y deleciones se
producen en menos del 2% de los clones con mutaciones somáticas.
Conclusiones
129
7. Conclusiones
Conclusiones
130
Del presente estudio podemos considerar las siguientes conclusiones:
1) “IgDSM 1.0” es un programa informático que automatiza la obtención y el
procesamiento de los datos necesarios en los estudios de SHM para su posterior
análisis, reduciendo en gran medida el tiempo necesario para dicho
procesamiento de datos y aumentando su fiabilidad al minimizar el error
humano. El programa se encuentra disponible gratuitamente en
http://www.inmunologia.org/inmunologia/ver_biblioteca.htm?id=529
2) Las mutaciones somáticas presentes en secuencias IgVH3 obtenidas de CP
humanas de amígdala y sangre presentan un patrón de distribución
predominante en las CDR, siendo claramente priorizadas las mutaciones que
dan lugar a reemplazamientos de aminoácidos.
3) No existen diferencias en los patrones mutacionales de IgVH3 entre las CP de
amígdla aisladas por medios mecánicos y las aisladas enzimáticamente con
colagenasa, comparadas por isotipos.
4) En CP de amígdala, el isotipo IgA está claramente más mutado que IgG, y éste
a su vez está más mutado que IgM. Estas diferencias hablan del distinto uso y
papel funcional de los mismos en la respuesta humoral. Los datos de IgA
parecen relacionar estas CP con un compartimento funcional de depósito
submucoso.
5) En CP de sangre periférica las diferencias mutacionales entre isotipos están más
atenuadas que en amígdala, si bien se sigue observando mayor cantidad de
mutaciones totales en secuencias IgG que en IgM. No hay diferencias
apreciables entre IgG e IgA.
6) La comparación de SHM entre CP de amígdala y de sangre revela la existencia
de una clara selección de las poblaciones circulantes, en el sentido de mayores
cantidades de mutaciones en las secuencias IgM e IgG. Esto implica la
existencia de jerarquías funcionales entre diferentes territorios. Por el contrario,
no se observan diferencias entre las secuencias IgA de ambos territorios.
Conclusiones
131
7) El análisis del efecto cuantitativo de la SHM revela que el aumento del número
total de mutaciones induce una acumulación inicial de mutaciones R hasta un
determinado umbral, por encima del cual aumentos sucesivos no implican
incremento del ratio R/S. La velocidad con que se alcanza este umbral de R/S
no es homogénea, lo que puede deberse a diferencias en el requerimiento para
la afinidad por el Ag.
8) El análisis estadístico de la distribución de mutaciones somáticas en una
secuencia de IgVH, no es suficiente para diferenciar entre el efecto exclusivo de
la SHM y su maquinaria intrínseca, y el sesgo introducido por la selección
antigénica para la maduración de la afinidad de los anticuerpos.
9) La región más mutada de los genes IgVH3 es CDR1, tanto en CPA como en CPSP.
A pesar de este dato, la diferencia entre la mutabilidad observada y la
mutabilidad intrínseca teórica en esta región es mayor que en CDR2, que
presenta mayores valores de R/S. Estos datos indican que los cambios en CDR1
están especialmente limitados por la selección antigénica.
10) Los patrones de distribución de los nucleótidos sustituidos no dependen del
territorio (sangre o amígdala), isotipo o número total de mutaciones.
11) La distribución de uso de los segmentos JH no depende del territorio o del
isotipo.
12) Existen diferencias en la distribución del uso de los segmentos D y de la
longitud de CDR3 entre territorios. La menor longitud del CDR3 en sangre sería
consistente con la idea de que el acortamiento de este segmento se asocia a
mayor madurez.
13) Existen sesgos en el uso de los 22 miembros de VH3 para los reagrupamientos
VH3-D-J, con diferencias entre regiones e isotipos, pero en todos los casos el
miembro más utilizado es VH3-23.
14) Las inserciones y deleciones representan un porcentaje muy pequeño de las
mutaciones somáticas (2,2% de los clones mutados y 0,14% de las mutaciones
totales).
Bibliografía
132
8. Bibliografía
Bibliografía
133
Bibliografía
1 Delves P.J. & Roitt I.M. (2000) The immune system. First of two parts. N Engl JMed, 343, 37.
2 Roitt I., Brostoff J., Male D. Immunology. 3ª ed. Mosby (1993). Capítulo 1.
3 Abbas, A.K., Litchtman, A.H., Pober, J.S. Inmunología Celular y Molecular. 4ª ed.McGraw-Hill Interamericana (2002). Capítulo 2.
4 Roitt I., Brostoff J., Male D. Immunology. 3ª ed. Mosby (1993). Capítulo 2.
5 Pelczar MJ, Reid RD. Microbiología. México DF: McGraw-Hill, 1966:225-7, 419-20.
6 Stites D.P. et al. Antecedentes históricos de la Inmunología. En: InmunologíaBásica y Clínica. 6ª ed. El Manual Moderno (1988) p. 6.
7 Alzari P.M., Lascombe M.B. & Poljak R.J. (1988) Three-dimensional structure ofantibodies. Annu Rev Immunol, 6, 555.
8 Foote J. & Winter G. (1992) Antibody framework residues affecting theconformation of the hypervariable loops. J Mol Biol, 224, 487.
9 Sanz I. (1991) Multiple mechanisms participate in the generation of diversity ofhuman H chain CDR3 regions. J Immunol, 147, 1720.
10 Roitt I., Brostoff J., Male D. Immunology. 3ª ed. Mosby (1993). Capítulo 5.
11 Delves P.J. & Roitt I.M. (2000) The immune system. First of two parts. N Engl JMed, 343, 43.
12 Abbas, A.K., Litchtman, A.H., Pober, J.S. Inmunología Celular y Molecular. 4ª ed.McGraw-Hill Interamericana (2002). Pag. 132
13 Li Z., Woo C.J., Iglesias-Ussel M.D., Ronai D. & Scharff M.D. (2004) Thegeneration of antibody diversity through somatic hypermutation and class switchrecombination. Genes Dev, 18, 1.
14 Busslinger M. (2004) Transcriptional control of early B cell development. AnnuRev Immunol, 22, 55.
15 Suarez E, Magadan S, Sanjuan I, Valladares M, Molina A, Gambon F, et al.(2006) Rearrangement of only one human IGHV gene is sufficient to generate awide repertoire of antigen specific antibody responses in transgenic mice. MolImmunol,43, 1827.
16 Seidman J.G. & Leder P. (1978) The arrangement and rearrangement of antibodygenes. Nature, 276, 790.
17 Schatz D.G., Oettinger M.A. & Schlissel M.S. (1992) V(D)J recombination:molecular biology and regulation. Annu Rev Immunol, 10, 359.
18 Tonegawa, S. (1983) Somatic generation of antibody diversity. Nature, 302, 575.
19 Dreyer, W.J. and J.C. Bennett. (1965) The molecular basis of antibody formation:a paradox. Proc Natl Acad Sci U S A, 54, 864.
Bibliografía
134
20 Smithies, O. (1967) Antibody variability. Somatic recombination between theelements of "antibody gene pairs" may explain antibody variability. Science, 157,267.
21 Tomlinson I.M., Walter G., Marks J.D., Llewelyn M.B. & Winter G. (1992) Therepertoire of human germline VH sequences reveals about fifty groups of VHsegments with different hypervariable loops. J Mol Biol, 227, 776.
22 Stewart, A.K. and R.S. Schwartz. (1994) Immunoglobulin V regions and the Bcell. Blood, 83, 1717.
23 Schroeder, H.W., Jr., J.L. Hillson, and R.M. Perlmutter. (1990) Structure andevolution of mammalian VH families. Int Immunol, 2, 41.
24 Ichihara, Y., H. Matsuoka, and Y. Kurosawa (1988) Organization of humanimmunoglobulin heavy chain diversity gene loci. Embo J, 7, 4141.
25 Corbett S.J., Tomlinson I.M., Sonnhammer E.L., Buck D. & Winter G. (1997)Sequence of the human immunoglobulin diversity (D) segment locus: a systematicanalysis provides no evidence for the use of DIR segments, inverted D segments,"minor" D segments or D-D recombination. J Mol Biol, 270, 587.
26 Lafaille J.J., DeCloux A., Bonneville M., Takagaki Y. & Tonegawa S. (1989)Junctional sequences of T cell receptor gamma delta genes: implications for gammadelta T cell lineages and for a novel intermediate of V-(D)-J joining. Cell, 59, 859.
27 Alt F.W. & Baltimore D. (1982) Joining of immunoglobulin heavy chain genesegments: implications from a chromosome with evidence of three D-JH fusions.Proc Natl Acad Sci U S A, 79, 4118.
28 Wasserman R., Galili N., Ito Y., Reichard B.A., Shane S. & Rovera G. (1992)Predominance of fetal type DJH joining in young children with B precursorlymphoblastic leukemia as evidence for an in utero transforming event. J Exp Med,176, 1577.
29 Abbas, A.K., Litchtman, A.H., Pober, J.S. Inmunología Celular y Molecular. 4ª ed.McGraw-Hill Interamericana (2002). Pag. 154
30 Stewart A.K., Huang C., Long A.A., Stollar B.D. & Schwartz R.S. (1992) VH-generepresentation in autoantibodies reflects the normal human B-cell repertoire.Immunol Rev, 128, 101.
31 Chen P.P., Olsen N.J., Yang P.M., Soto-Gil R.W., Olee T., Siminovitch K.A. &Carson D.A. (1990) From human autoantibodies to the fetal antibody repertoire toB cell malignancy: it's a small world after all. Int Rev Immunol, 5, 239.
32 Wasserman R., Ito Y., Galili N., Yamada M., Reichard B.A., Shane S., Lange B. &Rovera G. (1992) The pattern of joining (JH) gene usage in the human IgH chain isestablished predominantly at the B precursor cell stage. J Immunol, 149, 511.
33 recombination. Trends Immunol, 2002. 23(1): p. 31-9.Manis J.P., Tian M. & Alt F.W. (2002) Mechanism and control of class-switchrecombination. Trends Immunol, 23, 31.
Bibliografía
135
34 MacLennan I.C. (1994) Germinal centers. Annu Rev Immunol, 12, 117.
35 Kelsoe, G. (1995) The germinal center reaction. Immunol Today, 16, 324.
36 Weill, J.C. and C.A. Reynaud. (1996) Rearrangement/hypermutation/geneconversion: when, where and why? Immunol Today, 17, 92.
37 Kocks C. & Rajewsky K. (1989) Stable expression and somatic hypermutation ofantibody V regions in B-cell developmental pathways. Annu Rev Immunol, 7, 537.
38 French D.L., Laskov R. & Scharff M.D. (1989) The role of somatic hypermutationin the generation of antibody diversity. Science, 244, 1152.
39 Berek C. & Milstein C. (1987) Mutation drift and repertoire shift in the maturationof the immune response. Immunol Rev, 96, 23.
40 Weiss U., Zoebelein R. & Rajewsky K. (1992) Accumulation of somatic mutants inthe B cell compartment after primary immunization with a T cell-dependentantigen. Eur J Immunol, 22, 511.
41 Rajewsky, K., I. Forster, and A. Cumano. (1987) Evolutionary and somaticselection of the antibody repertoire in the mouse. Science, 238, 1088.
42 Pasqualucci L., Neumeister P., Goossens T., Nanjangud G., Chaganti R.S.,Kuppers R. & Dalla-Favera R. (2001) Hypermutation of multiple proto-oncogenes inB-cell diffuse large-cell lymphomas. Nature, 412, 341.
43 Jacob J., Kelsoe G., Rajewsky K. & Weiss U. (1991) Intraclonal generation ofantibody mutants in germinal centres. Nature, 354, 389.
44 Storb, U. (1996) The molecular basis of somatic hypermutation ofimmunoglobulin genes. Curr Opin Immunol, 8, 206.
45 Griffiths G.M., Berek C., Kaartinen M. & Milstein C. (1984) Somatic mutation andthe maturation of immune response to 2-phenyl oxazolone. Nature, 312, 271.
46 Gonzalez-Fernandez A. & Milstein C. (1998) Low antigen dose favours selectionof somatic mutants with hallmarks of antibody affinity maturation. Immunology,93, 149.
47 Milstein, C. and M.S. Neuberger. (1996) Maturation of the immune response. AdvProtein Chem, 49, 451.
48 Lebecque, S.G. and P.J. Gearhart. (1990) Boundaries of somatic mutation inrearranged immunoglobulin genes: 5' boundary is near the promoter, and 3'boundary is approximately 1 kb from V(D)J gene. J Exp Med, 172, 1717.
49 Rada C., Yelamos J., Dean W. & Milstein C. (1997) The 5' hypermutationboundary of kappa chains is independent of local and neighbouring sequences andrelated to the distance from the initiation of transcription. Eur J Immunol, 27, 3115.
50 Rada, C. and C. Milstein. (2001) The intrinsic hypermutability of antibody heavyand light chain genes decays exponentially. Embo J, 20, 4570.
Bibliografía
136
51 Wilson P.C., de Bouteiller O., Liu Y.J., Potter K., Banchereau J., Capra J.D. &Pascual V. (1998) Somatic hypermutation introduces insertions and deletions intoimmunoglobulin V genes. J Exp Med, 187, 59.
52 Ohlin, M. and C.A. Borrebaeck. (1998) Insertions and deletions in hypervariableloops of antibody heavy chains contribute to molecular diversity. Mol Immunol, 35,233.
53 Shlomchik M.J., Marshak-Rothstein A., Wolfowicz C.B., Rothstein T.L. & WeigertM.G. (1987) The role of clonal selection and somatic mutation in autoimmunity.Nature, 328, 805.
54 Du M., Diss T.C., Xu C., Peng H., Isaacson P.G. & Pan L. (1996) Ongoingmutation in MALT lymphoma immunoglobulin gene suggests that antigenstimulation plays a role in the clonal expansion. Leukemia, 10, 1190.
55 Chothia C., Lesk A.M., Gherardi E., Tomlinson I.M., Walter G., Marks J.D.,Llewelyn M.B. & Winter G. (1992) Structural repertoire of the human VH segments.J Mol Biol, 227, 799.
56 Shlomchik M.J., Aucoin A.H., Pisetsky D.S. & Weigert M.G. (1987) Structure andfunction of anti-DNA autoantibodies derived from a single autoimmune mouse. ProcNatl Acad Sci U S A, 84, 9150.
57 Wagner S.D., Milstein C. & Neuberger M.S. (1995) Codon bias targets mutation.Nature, 376, 732.
58 Rogozin I.B. & Kolchanov N.A. (1992) Somatic hypermutagenesis inimmunoglobulin genes. II. Influence of neighbouring base sequences onmutagenesis. Biochim Biophys Acta, 1171, 11.
59 Dunn-Walters D.K., Dogan A., Boursier L., MacDonald C.M. & Spencer J. (1998)Base-specific sequences that bias somatic hypermutation deduced by analysis ofout-of-frame human IgVH genes. J Immunol, 160, 2360.
60 Smith D.S., Creadon G., Jena P.K., Portanova J.P., Kotzin B.L. & Wysocki L.J.(1996) Di- and trinucleotide target preferences of somatic mutagenesis in normaland autoreactive B cells. J Immunol, 156, 2642.
61 Chang B. & Casali P. (1994) The CDR1 sequences of a major proportion of humangermline Ig VH genes are inherently susceptible to amino acid replacement.Immunol Today, 15, 367.
62 Jolly C.J., Wagner S.D., Rada C., Klix N., Milstein C. & Neuberger M.S. (1996)The targeting of somatic hypermutation. Semin Immunol, 8, 159.
63 Shapiro G.S., Aviszus K., Ikle D. & Wysocki L.J. (1999) Predicting regionalmutability in antibody V genes based solely on di- and trinucleotide sequencecomposition. J Immunol, 163, 259.
64 Foster, S.J., T. Dorner, and P.E. Lipsky. (1999) Somatic hypermutation ofVkappaJkappa rearrangements: targeting of RGYW motifs on both DNA strands andpreferential selection of mutated codons within RGYW motifs. Eur J Immunol, 29,4011.
Bibliografía
137
65 Smith D.S., Creadon G., Jena P.K., Portanova J.P., Kotzin B.L. & Wysocki L.J.(1996) Di- and trinucleotide target preferences of somatic mutagenesis in normaland autoreactive B cells. J Immunol, 156, 2642.
66 Liu Y.J., Joshua D.E., Williams G.T., Smith C.A., Gordon J. & MacLennan I.C.(1989) Mechanism of antigen-driven selection in germinal centres. Nature, 342,929.
67 Dorner T., Foster S.J., Brezinschek H.P. & Lipsky P.E. (1998) Analysis of thetargeting of the hypermutational machinery and the impact of subsequent selectionon the distribution of nucleotide changes in human VHDJH rearrangements.Immunol Rev, 162, 161.
68 Denepoux S., Razanajaona D., Blanchard D., Meffre G., Capra J.D., BanchereauJ. & Lebecque S. (1997) Induction of somatic mutation in a human B cell line invitro. Immunity, 6, 35.
69 Fugmann S.D. & Schatz D.G. (2002) Immunology. One AID to unite them all.Science, 295, 1244.
70 Peters, A. and U. Storb, Somatic hypermutation of immunoglobulin genes islinked to transcription initiation. Immunity, 1996. 4(1): p. 57-65.
71 Klotz, E.L. and U. Storb. (1996) Somatic hypermutation of a lambda 2 transgeneunder the control of the lambda enhancer or the heavy chain intron enhancer. JImmunol, 157, 4458.
72 Hengstschlager, M., M. Williams, and N. Maizels. (1994) A lambda 1 transgeneunder the control of a heavy chain promoter and enhancer does not undergosomatic hypermutation. Eur J Immunol, 24, 1649.
73 Betz A.G., Milstein C., Gonzalez-Fernandez A., Pannell R., Larson T. & NeubergerM.S. (1994) Elements regulating somatic hypermutation of an immunoglobulinkappa gene: critical role for the intron enhancer/matrix attachment region. Cell, 77,239.
74 Yelamos J., Klix N., Goyenechea B., Lozano F., Chui Y.L., Gonzalez Fernandez A.,Pannell R., Neuberger M.S. & Milstein C. (1995) Targeting of non-Ig sequences inplace of the V segment by somatic hypermutation. Nature, 376, 225.
75 Rada C., Ehrenstein M.R., Neuberger M.S. & Milstein C. (1998) Hot spot focusingof somatic hypermutation in MSH2-deficient mice suggests two stages of mutationaltargeting. Immunity, 9, 135.
76 Larijani M., Frieder D., Basit W. & Martin A. (2005) The mutation spectrum ofpurified AID is similar to the mutability index in Ramos cells and in ung(-/-)msh2(-/-) mice. Immunogenetics, 56, 840.
77 Spencer J. & Dunn-Walters D.K. (2005) Hypermutation at A-T base pairs: the Anucleotide replacement spectrum is affected by adjacent nucleotides and there is noreverse complementarity of sequences flanking mutated A and T nucleotides. JImmunol, 175, 5170.
78 Rogozin I.B., Pavlov Y.I., Bebenek K., Matsuda T. & Kunkel T.A. (2001) Somaticmutation hotspots correlate with DNA polymerase eta error spectrum. NatImmunol, 2, 530.
Bibliografía
138
79 Michael N., Martin T.E., Nicolae D., Kim N., Padjen K., Zhan P., Nguyen H.,Pinkert C. & Storb U. (2002) Effects of sequence and structure on thehypermutability of immunoglobulin genes. Immunity, 16, 123.
80 Spencer J., Dunn M. & Dunn-Walters D.K. (1999) Characteristics of sequencesaround individual nucleotide substitutions in IgVH genes suggest different GC andAT mutators. J Immunol, 162, 6596.
81 Strasser A. (1995) Life and death during lymphocyte development and function:evidence for two distinct killing mechanisms. Curr Opin Immunol, 7, 228.
82 DeMellors R. And Korngold L. (1936) The cellular origin of humanimmunoglobulins. J. Exp. Med. 118, 387.
83 Hibi, T. and H.M. (1986) Dosch, Limiting dilution analysis of the B cellcompartment in human bone marrow. Eur J Immunol, 16, 139.
84 McHeyzer-Williams M.G., McLean M.J., Lalor P.A. & Nossal G.J. (1993) Antigen-driven B cell differentiation in vivo. J Exp Med, 178, 295
85 Calame K.L. (2001) Plasma cells: finding new light at the end of B celldevelopment. Nat Immunol, 2, 1103.
86 Ellyard J.I., Avery D.T., Phan T.G., Hare N.J., Hodgkin P.D. & Tangye S.G. (2004)Antigen-selected, immunoglobulin-secreting cells persist in human spleen and bonemarrow. Blood, 103, 3805.
87 Ho F., Lortan J.E., MacLennan I.C. & Khan M. (1986) Distinct short-lived andlong-lived antibody-producing cell populations. Eur J Immunol, 16, 1297.
88 Manz, R.A., A. Thiel, and A. Radbruch. (1997) Lifetime of plasma cells in thebone marrow. Nature, 388, 133.
89 Smith K.G., Hewitson T.D., Nossal G.J. & Tarlinton D.M. (1996) The phenotypeand fate of the antibody-forming cells of the splenic foci. Eur J Immunol, 26, 444.
90 Manz, R.A. and A. Radbruch. (2002) Plasma cells for a lifetime? Eur J Immunol,32, 923.
91 Smith K.G., Light A., Nossal G.J. & Tarlinton D.M. (1997) The extent of affinitymaturation differs between the memory and antibody-forming cell compartments inthe primary immune response. Embo J, 16, 2996.
92 Takahashi Y., Dutta P.R., Cerasoli D.M. & Kelsoe G. (1998) In situ studies of theprimary immune response to (4-hydroxy-3-nitrophenyl)acetyl. V. Affinitymaturation develops in two stages of clonal selection. J Exp Med, 187, 885.
93 Brieva J.A., Roldan E., Rodriguez C. & Navas G. (1994) Human tonsil, blood andbone marrow in vivo-induced B cells capable of spontaneous and high-rateimmunoglobulin secretion in vitro: differences in the requirements for factors andfor adherent and bone marrow stromal cells, as well as distinctive adhesionmolecule expression. Eur J Immunol, 24, 362.
Bibliografía
139
94 Medina F., Segundo C., Rodriguez C. & Brieva J.A. (1997) Regulatory role ofCD95 ligation on human B cells induced in vivo capable of spontaneous and high-rate Ig secretion. Eur J Immunol, 27, 700.
95 Bhan A.K., Nadler L.M., Stashenko P., McCluskey R.T. & Schlossman S.F. (1981)Stages of B cell differentiation in human lymphoid tissue. J Exp Med, 154, 737.
96 Kodo, H., R.P. Gale, and A. Saxon. (1984) Antibody synthesis by bone marrowcells in vitro following primary and booster tetanus toxoid immunization in humans.J Clin Invest, 73, 1377.
97 Saxon A., Mitsuyasu R., Stevens R., Champlin R.E., Kimata H. & Gale R.P. (1986)Designed transfer of specific immune responses with bone marrow transplantation.J Clin Invest, 78, 959.
98 Medina F., Segundo C., Campos-Caro A., Gonzalez-Garcia I. & Brieva J.A. (2002)The heterogeneity shown by human plasma cells from tonsil, blood, and bonemarrow reveals graded stages of increasing maturity, but local profiles of adhesionmolecule expression. Blood, 99, 2154.
99 Takahashi Y., Dutta P.R., Cerasoli D.M. & Kelsoe G. (1998) In situ studies of theprimary immune response to (4-hydroxy-3-nitrophenyl)acetyl. V. Affinitymaturation develops in two stages of clonal selection. J Exp Med, 187, 885.
100 Medina F. Estudio sobre la maduración fenotípica y funcional de las célulasplasmáticas humanas. Tesis doctoral. U.C.A. 2000.
101 Dunn-Walters, D.K., L. Boursier, and J. Spencer. (1997) Hypermutation,diversity and dissemination of human intestinal lamina propria plasma cells. Eur JImmunol, 27, 2959.
102 Sambrock, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. (1989) Molecular cloning. A laboratorymanual. 2ª edición. Cold Spring Harbor Laboratory Press.
103 Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Struhl,K. (1989) Current protocols in molecular biology. John Wiley and Sons.
104 Stevens R.H., Macy E., Morrow C. & Saxon A. (1979) Characterization of acirculating subpopulation of spontaneous antitetanus toxoid antibody producing Bcells following in vivo booster immunization. J Immunol, 122, 2498.
105 Medina F., Segundo C. & Brieva J.A. (2000) Purification of human tonsil plasmacells: pre-enrichment step by immunomagnetic selection of CD31(+) cells.Cytometry, 39, 231.
106 Hanahan D., Jessee J. & Bloom F.R. (1991) Plasmid transformation ofEscherichia coli and other bacteria. Methods Enzymol, 204, 63.
107 Inoue, H., H. Nojima, and H. Okayama. (1990) High efficiency transformation ofEscherichia coli with plasmids. Gene, 96, 23.
108 Chang, B. and P. Casali. (1994) The CDR1 sequences of a major proportion ofhuman germline Ig VH genes are inherently susceptible to amino acid replacement.Immunol Today, 15, 367.
Bibliografía
140
109 Dunn-Walters D.K. & Spencer J. (1998) Strong intrinsic biases towards mutationand conservation of bases in human IgVH genes during somatic hypermutationprevent statistical analysis of antigen selection. Immunology, 95, 339.
110 Lossos I.S., Tibshirani R., Narasimhan B. & Levy R. (2000) The inference ofantigen selection on Ig genes. J Immunol, 165, 5122.
111 Thompson J.D., Plewniak F. & Poch O. (1999) A comprehensive comparison ofmultiple sequence alignment programs. Nucleic Acids Res, 27, 2682.
112 Yiannis A. Ioannou. (2000) SOFTWARE: Sequence Analysis. Science, 289, 412
113 Gorelenkov V., Antipov A., Lejnine S., Daraselia N. & Yuryev A. (2001) Set ofnovel tools for PCR primer design. Biotechniques, 31, 1326.
114 Miller M.J. & Powell J.I. (1994) A quantitative comparison of DNA sequenceassembly programs. J Comput Biol, 1, 257.
115 Moore J., Engelberg A. & Bairoch A. (1988) Using PC/GENE for protein andnucleic acid analysis. Biotechniques, 6, 566.
116 Swindell S.R. & Plasterer T.N. (1997) SEQMAN. Contig assembly. Methods MolBiol, 70, 75.
117 Tippmann H.F. (2004) Analysis for free: comparing programs for sequenceanalysis. Brief Bioinform, 5, 82.
118 Giudicelli V., Chaume D. & Lefranc M.P. (2004) IMGT/V-QUEST, an integratedsoftware program for immunoglobulin and T cell receptor V-J and V-D-Jrearrangement analysis. Nucleic Acids Res, 32, W435.
119 Retter I., Althaus H.H., Munch R. & Muller W. (2005) VBASE2, an integrative Vgene database. Nucleic Acids Res, 33, D671.
120 Merville P., Dechanet J., Desmouliere A., Durand I., de Bouteiller O., Garrone P.,Banchereau J. & Liu Y.J. (1996) Bcl-2+ tonsillar plasma cells are rescued fromapoptosis by bone marrow fibroblasts. J Exp Med, 183, 227.
121 Pascual V., Liu Y.J., Magalski A., de Bouteiller O., Banchereau J. & Capra J.D.(1994) Analysis of somatic mutation in five B cell subsets of human tonsil. J ExpMed, 180, 329.
122 Kepler T.B. & Perelson A.S. (1993) Cyclic re-entry of germinal center B cells andthe efficiency of affinity maturation. Immunol Today, 14, 412.
123 Muramatsu M., Kinoshita K., Fagarasan S., Yamada S., Shinkai Y. & Honjo T.(2000) Class switch recombination and hypermutation require activation-inducedcytidine deaminase (AID), a potential RNA editing enzyme. Cell, 102, 553.
124 Kallies A., Hasbold J., Tarlinton D.M., Dietrich W., Corcoran L.M., Hodgkin P.D. &Nutt S.L. (2004) Plasma cell ontogeny defined by quantitative changes in blimp-1expression. J Exp Med, 200, 967.
125 Blink E.J., Light A., Kallies A., Nutt S.L., Hodgkin P.D. & Tarlinton D.M. (2005)Early appearance of germinal center-derived memory B cells and plasma cells inblood after primary immunization. J Exp Med, 201, 545.
Bibliografía
141
126 Smith K.G., Light A., Nossal G.J. & Tarlinton D.M. (1997) The extent of affinitymaturation differs between the memory and antibody-forming cell compartments inthe primary immune response. Embo J, 16, 2996.
127 Takahashi Y., Dutta P.R., Cerasoli D.M. & Kelsoe G. (1998) In situ studies of theprimary immune response to (4-hydroxy-3-nitrophenyl)acetyl. V. Affinitymaturation develops in two stages of clonal selection. J Exp Med, 187, 885.
128 Gonzalez-Garcia I, Ocana E, Jimenez-Gomez G, Campos-Caro A, Brieva JA.(2006) Immunization-induced perturbation of human blood plasma cell pool:progressive maturation, IL-6 responsiveness, and high PRDI-BF1/BLIMP1expression are critical distinctions between antigen-specific and nonspecific plasmacells. J Immunol,176, 4042.
129 Ellyard J.I., Avery D.T., Mackay C.R. & Tangye S.G. (2005) Contribution ofstromal cells to the migration, function and retention of plasma cells in humanspleen: potential roles of CXCL12, IL-6 and CD54. Eur J Immunol, 35, 699.
130 Dunn-Walters D.K., Hackett M., Boursier L., Ciclitira P.J., Morgan P.,Challacombe S.J. & Spencer J. (2000) Characteristics of human IgA and IgM genesused by plasma cells in the salivary gland resemble those used in duodenum butnot those used in the spleen. J Immunol, 164, 1595.
131 Dunn-Walters D.K., Boursier L. & Spencer J. (1997) Hypermutation, diversityand dissemination of human intestinal lamina propria plasma cells. Eur J Immunol,27, 2959.
132 González-Fernández A., Milstein C. (1993) Analysis of somatic hypermutation inmouse Peyer’s patches using immunoglobulin κ light-chain transgenes.Immunology, 90, 9862.
133 Tomlinson IM, Walter G, Jones PT, Dear PH, Sonnhammer EL, Winter G. (1996)The imprint of somatic hypermutation on the repertoire of human germline Vgenes. J Mol Biol, 256, 813.
134 Kirkham PM, Schroeder HW, Jr. (1994) Antibody structure and the evolution ofimmunoglobulin V gene segments. Semin Immunol, 6, 347.
135 Yavuz S., Grammer A.C., Yavuz A.S., Nanki T. & Lipsky P.E. (2001) Comparativecharacteristics of mu chain and alpha chain transcripts expressed by individualtonsil plasma cells. Mol Immunol, 38, 19.
136 Dorner T., Brezinschek H.P., Brezinschek R.I., Foster S.J., Domiati-Saad R. &Lipsky P.E. (1997) Analysis of the frequency and pattern of somatic mutationswithin nonproductively rearranged human variable heavy chain genes. J Immunol,158, 2779.
137 Dorner T., Brezinschek H.P., Foster S.J., Brezinschek R.I., Farner N.L. & LipskyP.E. (1998) Delineation of selective influences shaping the mutated expressedhuman Ig heavy chain repertoire. J Immunol, 160, 2831.
138 Dunn-Walters D.K. & Spencer J. (1998) Strong intrinsic biases towards mutationand conservation of bases in human IgVH genes during somatic hypermutationprevent statistical analysis of antigen selection. Immunology, 95, 339.
Bibliografía
142
139 Behrendt M., Partridge L.J., Griffiths B., Goodfield M., Snaith M. & Lindsey N.J.(2003) The role of somatic mutation in determining the affinity of anti-DNAantibodies. Clin Exp Immunol, 131, 182.
140 Jury K.M., Loeffler D., Eiermann T.H., Ziegler B., Boehm B.O. & Richter W.(1996) Evidence for somatic mutation and affinity maturation of diabetesassociated human autoantibodies to glutamate decarboxylase. J Autoimmun, 9,371.
141 Lieby P., Soley A., Knapp A.M., Cerutti M., Freyssinet J.M., Pasquali J.L. & MartinT. (2003) Memory B cells producing somatically mutated antiphospholipidantibodies are present in healthy individuals. Blood, 102, 2459.
142 Lopez Bergami P., Mateos P., Hoebeke J., Levin M.J. & Baldi A. (2003) Sequenceanalysis, expression, and paratope characterization of a single-chain Fv fragmentfor the eukaryote ribosomal P proteins. Biochem Biophys Res Commun, 301, 819.
143 Giles I.P., Haley J.D., Nagl S., Isenberg D.A., Latchman D.S. & Rahman A.(2003) A systematic analysis of sequences of human antiphospholipid and anti-beta2-glycoprotein I antibodies: the importance of somatic mutations and certainsequence motifs. Semin Arthritis Rheum, 32, 246.
144 Li Z., Schettino E.W., Padlan E.A., Ikematsu H. & Casali P. (2000) Structure-function analysis of a lupus anti-DNA autoantibody: central role of the heavy chaincomplementarity-determining region 3 Arg in binding of double- and single-stranded DNA. Eur J Immunol, 30, 2015.
145 Aiello A., Du M.Q., Diss T.C., Peng H.Z., Pezzella F., Papini D., Giardini R., PilottiS., Pan L.X. & Isaacson P.G. (1999) Simultaneous phenotypically distinct butclonally identical mucosa-associated lymphoid tissue and follicular lymphoma in apatient with Sjogren's syndrome. Blood, 94, 2247.
146 Matolcsy A., Schattner E.J., Knowles D.M. & Casali P. (1999) Clonal evolution ofB cells in transformation from low- to high-grade lymphoma. Eur J Immunol, 29,1253.
147 Capello D., Cerri M., Muti G., Berra E., Oreste P., Deambrogi C., Rossi D., DottiG., Conconi A., Vigano M., Magrini U., Ippoliti G., Morra E., Gloghini A., RambaldiA., Paulli M., Carbone A. & Gaidano G. (2003) Molecular histogenesis ofposttransplantation lymphoproliferative disorders. Blood, 102, 3775.
148 Miklos J.A., Swerdlow S.H. & Bahler D.W. (2000) Salivary gland mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma immunoglobulin V(H) genes show frequentuse of V1-69 with distinctive CDR3 features. Blood, 95, 3878.
149 Endo S., Zhang S.J., Saito T., Kouno M., Kuroiwa T., Washiyama K. & KumanishiT. (2002) Primary malignant lymphoma of the brain: mutation pattern ofrearranged immunoglobulin heavy chain gene. Jpn J Cancer Res, 93, 1308.
150 Sahota S.S., Leo R., Hamblin T.J. & Stevenson F.K. (1997) Myeloma VL and VHgene sequences reveal a complementary imprint of antigen selection in tumor cells.Blood, 89, 219.
Bibliografía
143
151 Degan M., Rupolo M., Bo M.D., Stefanon A., Bomben R., Zucchetto A., CantonE., Berretta M., Nanni P., Steffan A., Ballerini P.F., Damiani D., Pucillo C., AttadiaV., Colombatti A. & Gattei V. (2004) Mutational status of IgVH genes consistentwith antigen-driven selection but not percent of mutations has prognostic impact inB-cell chronic lymphocytic leukemia. Clin Lymphoma, 5, 123.
152 Lossos IS, Tibshirani R, Narasimhan B, Levy R. (2000) The inference of antigenselection on Ig genes. J Immunol, 165, 5122.
153 Bose B. & Sinha S. (2005) Problems in using statistical analysis of replacementand silent mutations in antibody genes for determining antigen-driven affinityselection. Immunology, 116, 172.
154 Shapiro G.S., Aviszus K., Murphy J. & Wysocki L.J. (2002) Evolution of Ig DNAsequence to target specific base positions within codons for somatic hypermutation.J Immunol, 168, 2302.
155 Golding G.B., Gearhart P.J. & Glickman B.W. (1987) Patterns of somaticmutations in immunoglobulin variable genes. Genetics, 115, 169.
156 Both G.W., Taylor L., Pollard J.W. & Steele E.J. (1990) Distribution of mutationsaround rearranged heavy-chain antibody variable-region genes. Mol Cell Biol, 10,5187.
157 Betz A.G., Neuberger M.S. & Milstein C. (1993) Discriminating intrinsic andantigen-selected mutational hotspots in immunoglobulin V genes. Immunol Today,14, 405.
158 Mastache EF, Lindroth K, Fernandez C, Gonzalez-Fernandez A. (2006) Somatichypermutation of Ig genes is affected differently by failures in apoptosis caused bydisruption of Fas (lpr mutation) or by overexpression of Bcl-2. Scand J Immunol,63, 420.
159 Rosner K., Winter D.B., Tarone R.E., Skovgaard G.L., Bohr V.A. & Gearhart P.J.(2001) Third complementarity-determining region of mutated VH immunoglobulingenes contains shorter V, D, J, P, and N components than non-mutated genes.Immunology, 103, 179.
160 Brezinschek H.P., Brezinschek R.I. & Lipsky P.E. (1995) Analysis of the heavychain repertoire of human peripheral B cells using single-cell polymerase chainreaction. J Immunol, 155, 190.
161 Wu, T.T., G. Johnson, and E.A. Kabat. (1993) Length distribution of CDRH3 inantibodies. Proteins, 16, 1.
162 Alzari P.M., Spinelli S., Mariuzza R.A., Boulot G., Poljak R.J., Jarvis J.M. &Milstein C. (1990) Three-dimensional structure determination of an anti-2-phenyloxazolone antibody: the role of somatic mutation and heavy/light chainpairing in the maturation of an immune response. Embo J, 9, 3807.
163 Feeney A.J. (1990) Lack of N regions in fetal and neonatal mouseimmunoglobulin V-D-J junctional sequences. J Exp Med, 172, 1377.
164 Xue W., Luo S., Adler W.H., Schulze D.H. & Berman J.E. (1997) Immunoglobulinheavy chain junctional diversity in young and aged humans. Hum Immunol, 57, 80.
Bibliografía
144
165 Brezinschek H.P., Foster S.J., Brezinschek R.I., Dorner T., Domiati-Saad R. &Lipsky P.E. (1997) Analysis of the human VH gene repertoire. Differential effects ofselection and somatic hypermutation on human peripheral CD5(+)/IgM+ and CD5(-)/IgM+ B cells. J Clin Invest, 99, 2488.
166 Brezinschek H.P., Foster S.J., Dorner T., Brezinschek R.I. & Lipsky P.E. (1998)Pairing of variable heavy and variable kappa chains in individual naive and memoryB cells. J Immunol, 160, 4762.
167 Dunn-Walters D.K., Isaacson P.G. & Spencer J. (1997) Sequence analysis ofhuman IgVH genes indicates that ileal lamina propria plasma cells are derived fromPeyer's patches. Eur J Immunol, 27, 463.
168 Ippolito G.C., Schelonka R.L., Zemlin M., Ivanov, II, Kobayashi R., Zemlin C.,Gartland G.L., Nitschke L., Pelkonen J., Fujihashi K., Rajewsky K. & SchroederH.W., Jr. (2006) Forced usage of positively charged amino acids in immunoglobulinCDR-H3 impairs B cell development and antibody production. J Exp Med, 203,1567.
169 Ohlin M. & Borrebaeck C.A. (1998) Insertions and deletions in hypervariableloops of antibody heavy chains contribute to molecular diversity. Mol Immunol, 35,233.
170 Wilson P.C., de Bouteiller O., Liu Y.J., Potter K., Banchereau J., Capra J.D. &Pascual V. (1998) Somatic hypermutation introduces insertions and deletions intoimmunoglobulin V genes. J Exp Med, 187, 59.
![Reglamento Graduacion Doctoral[1]](https://static.fdocuments.ec/doc/165x107/5695d2191a28ab9b02991a4e/reglamento-graduacion-doctoral1.jpg)
