C A P - 2 + S D S - P A G E + W E S T E R N B L O T

DNA-RNA-SÍNTESIS DE PROTEÍNAS

Laboratorio de Fisiología y Genética de Bacterias Lácticas

UTILIZACIÓN DE ENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTICIA

ENZIMAS UTILIZADAS

• Alfa-amilasa• Quimosina• Lipasas• Proteasas

Producción de proteínas

de interés

• E. coli• Bacterias lácticas• Levaduras• Plantas• Animales

Expresión de proteínas

recombinantes en diferentes huéspedes

• Replicación del DNA• Transcripción• Traducción• Métodos para

detectar las proteínas

Clonado, vectores de expresión, modificación

del genoma

EL “DOGMA” CENTRAL DEL FLUJO DE LA INFORMACIÓN GENÉTICA

ESTRUCTURA DEL DNA

• Unidades individuales: Nucleótidos• Base orgánica• Azúcar (pentosa)• Grupo fosfato

• Los nucleótidos están unidos por enlaces fosfodiester• Entre el grupo fosfato del carbono

5’ de un nucleótido y el grupo 3’ OH del azúcar del nucleótido adyacente

• Una cadena tiene un grupo 3’ OH en un extremo y un grupo fosfato 5’ en el otro extremo

ESTRUCTURA DE LA DOBLE CADENA

• Las cadenas del DNA se mantienen unidas mediante enlaces de hidrógeno entre las bases de las cadenas opuestas.

• A interacciona con T mediante 2 enlaces

• C interacciona con G mediante 3 enlaces

ESTRUCTURA DE LA DOBLE CADENA

• Las cadenas son antiparalelas, una orientada 5’-3’ y la otra 3’-5’.

• 5′-TAGGCAT-3′• 3′-ATCCGTA-5′

FUNCIONES

• El material genético tiene dos funciones principales• Codifica la información para la síntesis de proteínas• Es replicado con precisión para transmitir la información

REPLICACIÓN DEL DNA

• El grupo fosfato de cada nucleótido es unido mediante un enlace fosfodiester al último nucleótido que fue incorporado.

• Los nucleótidos utilizados para la replicación poseen tres grupos fosfato

REPLICACIÓN DEL DNA• Durante la replicación los grupos

fosfato γ y β son cortados y el α se une al 3’OH del nucleótido previamente incorporado,

• La maquinaria de síntesis de DNA involucra a varias proteínas.

• DNA polimerasa es la responsable de la unión de los deoxiribonucleótidos, colocar el correcto (de acuerdo a la complementariedad) formar la unión fosfodiéster.

DECODIFICANDO LA INFORMACIÓN GENÉTICA

RNA Y PROTE ÍNAS

• La mayoría de los genes codifican información para la producción de cadenas de proteínas.

• Las proteínas son polímeros involucrados en casi todas las funciones biológicas.• Catalizan reacciones químicas, trasportan moléculas

dentro de la célula, escoltan moléculas entre células, controlan la permeabilidad de las membranas, etc.

DECODIFICACIÓN

• La decodificación de la información genética es llevada a cabo a través de moléculas intermediarias de RNA.

PROPIEDADES DEL RNA

• Una cadena, no doble hélice. Apareamiento intramolecular

• Azúcar ribosa (OH en el carbono 2’)• Esqueleto azúcar-fosfato en posiciones 5’-3’ del azúcar

como DNA• Uracilo en vez de Timina, hibrida con Adenina, y

también con Guanina cuando se pliega (no en la transcripción).

• Catalizador biológico

APAREAMIENTO INTRAMOLECULAR

Estructura secundaria: La hibridación intramolecular de nucleótidos produce un plegamiento de la molécula de RNA

RNA VS DNA

TIPOS DE RNA

• RNA mensajero (mRNA)

• RNA funcional• RNA de transferencia (tRNA)• RNA ribosómico (rRNA)• RNA nuclear pequeño (snRNA)• MicroRNA (miRNA)• RNA de interferencia pequeño (siRNA)

TRANSCRIPCIÓN

• Propiedades que hacen posible la síntesis del transcrito de RNA

1. COMPLEMENTARIEDAD ENTRE BASESA-U, C-G, G-C, T-A

2. UNIÓN DE PROTEÍNAS ESPECIFICAS AL DNA1. RNA Polimerasa y otras proteínas que actúan como factores de

transcripción

Función: la formación del transcrito de RNA mediante la catálisis de la unión de nucleótidos libres a la cadena molde del DNA formando una mono hebra de RNA.

Nomenclatura de las cadenas en relación a la transcripción

REPRESENTACIÓN DE UN GEN PROCARIOTA

¿QUÉ CADENA DE LA DOBLE HÉLICE ES LA CODIFICANTE?

• Depende de cada gen, no es un propiedad del cromosoma.

Orientación de la transcripción

PGen a transcribir

PROMOTOR PROCARIOTA TIPO

REPRESENTACIÓN DE UN GEN EUCARIOTA

SPLICING ALTERNATIVO

TRADUCCIÓN

Laboratorio de Fisiología y Genética de Bacterias Lácticas

TRADUCCIÓN• Proceso por el que la secuencia de nucleótidos de un mRNA

determina la estructura primaria de una proteína

• Aparato decodificador -> Secuencia primaria del polipéptido• Ribosomas (rRNA + proteínas): lugar de síntesis• tRNA: Portador de aminoácidos• mRNA: Portador del mensaje cifrado• Factores adicionales: IF, EF, RF, enlaces fosfatos

• Separación componentes mediante centrifugación en gradiente de sacarosa (velocidad de sedimentación, S-Svedberg)

CÓDIGO GENÉTICO

• Número bases por aa• 3 bases (triplete) / aa mínimo para la síntesis de 20 aa

• 64 codones• 3 stop• 1 para iniciación

• Código es degenerado: varios codones determinan el mismo aminoácido

CÓDIGO GENÉTICO

CÓDIGO GENÉTICO

GGA:26% Humanos9% E. coli

CÓDIGO GENÉTICO – MARCOS DE LECTURA

RIBOSOMA

CONTEXTO CELULAR• El movimiento browniano es la

fuerza dominante en el contexto celular

RIBOSOMA

TRNA

Región específica (anticodón) que se une al mRNA (codón)

AMINOACIL-TRNA SINTETASAS

• Activan los aminoácidos al unirlos covalentemente a los tRNAs

• Cada una de las 20 sintetasas reconocen:• un aminoácido• todos los tRNAs compatibles

INICIACIÓN

El elemento Shine-Delgarno se encuentra en el extremo 5' del codón iniciador AUG en mRNAs policistrónicos de procariotas. El elemento es complementario a la secuencia presente cerca del extremo 3' del rRNA 16S del ribosoma procariótico.

INICIACIÓN• La subunidad pequeña del ribosoma se

une al mRNA por hibridación con la secuencia Shine-Dalgarno,

• El tRNA fMet-tRNA se une mediante su anticodón (UAC) al codón de iniciación AUG.• fMEt: formil-metionina

• Factores de iniciación favorecen la unión del tRNA.

• La subunidad grande del ribosoma se une para formar el complejo de iniciación

ELONGACIÓNA. El Segundo codón (CUG)

hibrida con el anticodón(GAC) de Leu-tRNALeu.

B. La metionina del tRNAiniciador se une a la leucina del Leu-tRNA porun enlace peptídico, y el tRNA iniciadordescargado es eyectadodel ribosoma.

C. La traslocación del peptidil-tRNA y el mRNA al sitio peptidyl abre el sitioaminoacyl para el próximo codón (UUU).

D. …

Requiere GTP + 2 factores de elongación

POLIRRIBOSOMA

TERMINACIÓN

• Codón sin sentido• No codifica ningún aminoácido• UAG (Ambar), UAA (Ocre), UGA

(Opal)• Factor de liberación o

terminación (RF) y un GTP -> Liberan la proteína del ribosoma

• Disociación del ribosoma

TRADUCCIÓN-RESÚMEN• Requiere mucha energía (90%) Un enlace peptídico

requiere: 2 ATP carga 2 tRNA, 1 GTP (tRNA en sitio A), 1GTP (translocación)

• Procariotas:• Acoplamiento transcripción – traducción• Más de un gen por mRNA: mensajeros policistrónicos. Vel

síntesis: 300 aa/20 segundos

• Eucariotas: • No hay acoplamiento, mensajeros no policistrónicos. Vel

síntesis: 30 aa/2,5 minutos

DETECCIÓN DE PROTEÍNASSDS-PAGE Y WESTERN BLOT

SDS-PAGE

• SDS-PAGE, sodium dodecyl sulfate polyacrylamidegel electroforesis, es una técnica ampliamente utilizada en bioquímica, forense, genética y biología molecular:• Para separar proteínas de acuerdo a su movilidad

electroforética (una función dependiente del largo de la cadena polipeptídica o el peso molecular)

• Para separar proteínas solamente de acuerdo a su tamaño.

SDS• SDS (dodecyl sulfato de sodio) es un detergente que puede disolver

moléculas hidrofóbicas pero que además tiene una carga negativa (sulfato).

Antes de incubar con SDS la proteína (linearosada) muestra carga positivas y negativas deacuerdo a los grupos cargados en la proteína.La letra H representa dominios hidrofóbicos.Luego de incubar con SDS, el detergenterompe las áreas H y las recubre con muchascargas negativas que sobrepasan las cargaspositivas que la proteina tenía.La proteina resultante ha sido desnaturalizadapor el SDS, es decir reducida a su estructuraprimaria de aminoácidos y como resultado ha sido linealizada.

SDS

• El detergente se une a las regiones hidrofóbicas enuna relación constante de1.4 g of SDS por gramode proteína.

PAGE• Si colocamos a las proteínas desnaturalizadas (con SDS)

en un campo eléctrico, se van a mover hacia el polo positivo a la misma velocidad, sin separación por tamaño.

• Sin embargo, si colocamos a las proteínas en un medioambiente poroso, las moléculas pequeñas se van a mover mas rápido que las moléculas grandes.

• El medioambiente poroso se logra con poliacrilamida, entonces el proceso completo se denomina electroforesis en gel de poliacrilamida (polyacrylamidegel electrophoresis (PAGE)).

COMPOSICIÓN DEL GEL• Acrilamida • Agente entrecruzante Bisacrilamida• APS (Persulfato de amonio) radicales sulfato inician la

polimerización • TEMED (Tetrametilen, etilendiamina) propaga la

polimerización

Electroforesis vertical

Soporte: Gel de Poliacrilamida

* Polimerización de dos componentes: Acrilamida + Bisacrilamida* Variación de la concentración variación del tamaño de poro

[poliacrilamida] tamaño poro

1. Preparación del gel2. Montaje de la cubeta3. Aplicación de la muestra4. Electroforesis5. Detección por tinción:

Azul de CoomassieSales de plata

PAGE

PAGE

• Condiciones de la electroforesis:• No desnaturalizantes: separamos por CARGA y TAMAÑO ->

PAGE• Desnaturalizantes: separamos sólo por TAMAÑO -> SDS-PAGE• Agentes desnaturalizantes:

• SDS (dodecilsulfato sódico), urea• Reductores: DTT, β-mercaptoetanol

• SDS: detergente aniónico (-), dota a todas las proteínas de carga (-)

• todas migrarán hacia el ánodo (+), separándose sólo por tamaño

PAGE

S-SS-S

-----

-- -

- ---

-- -

+ SDS+ DTT

25 kDa

S-S

+ SDS - --

---

----

---

-- - -

---

----

-- -

--

-

- - 44 kDa

S-SS-S

50 kDa

BUFFER DE SIEMBRAcontiene: • Mercaptoetanol, un agente reductor, que

se encarga de eliminar los puentes disulfuroque se forman en la estructura terciaria de las proteínas entre los residuos de Cisteína

• El SDS (lauril sulfato) es el detergente que se une a las proteínas, las desnaturaliza y le aporta su carga negativa

• Azul de bromofenol, colorante con carga negativa y con una movilidad electroforética que equivaldría a pequeños polipéptidos. Su función es la de marcar el frente de electroforesis.

• Glicerol, para darle densidad a la mezcla y que permanezca en el pocillo de siembra.

MIGRACIÓN

• Al aplicar un campo eléctrico a la muestra inmersa en elbuffer de siembra, el complejo proteína-SDS migrará hacia elpolo positivo y se separará según su tamaño.

• Los polipéptidos de menor pesomolecular migrarán más rápido.

• Los de alto peso lo harán máslentamente.

APLICACIONES

• Análisis del grado de pureza de una proteína• Determinación de su peso molecular• Verificación de la concentración de proteínas• Detección de proteólisis• Identificación de proteínas inmunoprecipitadas• Separación de proteínas marcadas con isótopos radioactivos

Ventajas:• Gran poder de separación por TAMAÑO• Químicamente inertes• Transparentes (permite densitometría)• Estables (pH, fuerza iónica, temperatura)• Versatilidad en cuanto al tamaño de poro y entramado uniforme

ESTIMACIÓN DEL PESO MOLECULAR• Marcadores de peso molecular: • Mezcla de diferentes proteínas de las que

conocemos el peso molecular.• Por comparación podemos averiguar el PM

aparente de nuestra proteína.

ESTIMACIÓN DEL PESO MOLECULAR

Rf=migración de la proteína/migración del frente de corrida

PREPARACIÓN DEL GEL

ELECTROFORESIS DISCONTINUASe preparan 2 geles:

• el gel de corrida donde se separan las proteínas• el gel de apilamiento o gel concentrador (stacking) que concentra la mezcla

• El gel de Corrida que separará las muestras posee mayor concentración de Acrilamida (10%) y pH más básico ( 8,3). Ofrece mayor resistencia en la corrida

• El gel de apilamiento posee baja concentración de acrilamida (4%) en buffer ligeramente ácido (Tris/HCl 1M pH 6,8). Ofrece poca resistencia a la mezcla de proteínas sometidas a electroforesis por tanto lo atraviesan con relativa rapidez.

• Una vez preparado y polimerizado el gel de corrida, se prepara, en la parte superior de éste el gel de apilamiento.

• Bajo la acción del campo eléctrico, la mezcla proteica, colocada sobre el gel de apilamiento, comienza a migrar hacia el polo positivo.

ELECTROFORESIS DISCONTINUA• Cuando las proteínas atraviesan el gel de apilamiento, se encuentran con la

resistencia ejercida por el gel de corrida de manera que aquellas proteínas retardadas puedan alcanzar al resto y todas inicien la separación desde el mismo punto, mejorando así la calidad de la corrida.

• El gel de apilamiento se prepara siempre a una concentración de acrilamida del 4%, mientras que el gel de separación o gel de corrida se prepara según el rango óptimo de resolución:

Preparación y colocación de las muestras:

Cuando el gel de apilamiento haya polimerizado, colocar el cassette en el tanque de electroforesis con aproximadamente 500 ml buffer de corrida en el cual estén sumergidos los electrodos.

Quitar cuidadosamente el peine para que queden libres los pocillos del gel.

Preparar las muestras. Se tomarán 20 μl de la muestra y se diluirán con 4 μl de tampón muestra 5X por pocillo. Calentar 3 min. a 90°C para desnaturalizar.

Incluir un estándar de peso molecular.

SIEMBRA

CORRIDA• Corrida Electroforética aplicando corriente (100 mA) de 40 a 80 volts 2 h aprox.• Finalizada la corrida, extraer los vidrios cuidadosamente del cassette y separarlos

de manera que el gel quede posado sobre uno de los vidrios.• Sumergir el gel en solución colorante azul de Coomassie durante 40 minutos.• Sumergir el gel en solución decolorante metanol, ácido acético glacial, agua

dest. para eliminar las asociaciones inespecíficas del gel al colorante.• Observar las bandas proteicas

WESTERN BLOT• Las proteínas se separan por electroforesis en gel, generalmente SDS-PAGE.• Luego se transfieren a una hoja de papel especial llamado membrana de

nitrocelulosa. • Las proteínas retienen el mismo patrón de separación que tenían en el gel.• La membrana se incuba con una proteína genérica (por ejemplo proteínas

de la leche o BSA) para que se unan a los sitios remanentes de la nitrocelulosa.

• Luego se agrega un anticuerpo que sea capaz de unirse a la proteína de interés.

• Luego se agrega un segundo anticuerpo que reconozca el primero, pero este posee una enzima unida (por ej. Fosfatasa alcalina o peroxidasa de rabano), o un colorante que no se vea en este momento.

• La localización del anticuerpo es revelada al incubar la membrana con un sustrato incoloro que la enzima pueda convertir en un producto coloreado.

WESTERN BLOT

• El western blot puede detectar una proteína en una mezcla y además dar información del tamaño.

• Este método, sin embargo depende del uso de un anticuerpo de alta calidad dirigido contra la proteína de interés.

• O un anticuerpo dirigido contra un fragmento adicionado (por ejemplo 6xHis, FLAG)

SDS-PAGE

TRANSFERENCIA

• Las proteínas separadas por SDS-PAGE son transferidas a la membrana por electroforesis.

• La localización de las proteínas no cambia.

EQUIPO DE TRANSFERENCIA

Dos sistemas principales• Semi-seco

• No tiene reservorio de buffer de transferencia

• Sumergido• Tiene un reservorio lleno de

buffer de transferencia

BLOQUEO• La membrana tiene la capacidad de unir

proteínas, en este caso ambas son proteínas (el blanco y el anticuerpo) entonces podría haber uniones inespecíficas de los anticuerpos.

• El bloqueo de la unión inespecífica se logra colocando la membrana en una solución de proteínas, típicamente BSA o leche descremada, con un bajo porcentaje de detergente como Tween 20.

• Las proteínas en la solución se unen en todos los lugares de la membrana donde las proteínas transferidas no se han unido.

• Entonces, cuando se agrega el anticuerpo no hay lugar donde pueda unirse que no sea su lugar específico de reconocimiento.

ANTICUERPO PRIMARIO

• El anticuerpo primario reconoce la proteína de interés.

ANTICUERPO SECUNDARIO• El anticuerpo secundario reconoce el

anticuerpo primario utilizado en el paso anterior.

• Antes de agregarlo, se debe lavar la membrana con buffer por 5-10 min.

• Estos anticuerpos son desarrollados contra el animal en los que se realizaron los anticuerpos primarios.

• Están conjugados con una enzima.• Se adicionan y se incuba la membrana a

temperatura ambiente durante 1 hora.

DETECCIÓN

• Colorimétrica• Fluorescencia• Quimioluminiscencia

RESULTADO

• Alfa-amilasa• Quimosina• Lipasas• Proteasas

Producción de proteínas

de interés

• E. coli• Bacterias lácticas• Levaduras

Expresión de proteínas

recombinantes en diferentes huéspedes

• Replicación del DNA• Transcripción• Traducción• Métodos para

detectar las proteínas

Clonado, vectores de expresión, modificación

del genoma