Diversidad metabólica del mundo microbiano · Metabolismo microbiano genes vías metabólicas...

Diversidad metabólica del mundomicrobiano

Metabolismo microbiano

genes

vías metabólicas

procesos moleculares reciclado de elementos

Desarrollo de la diversidad demetabolismos microbianos

3.8×109

años

interacción depresiones selectivas

evolución tiempo

habitat Microorganismos

Bacterias Arqueas Eucariotes

Diversidad

fisiológica

Metabolismo, replicación y herencia son inseparables del contexto ambiental

presión selectivarecursos

ClasificaciónClasificación metabólicametabólica segúnsegúnrequerimientosrequerimientos de C de C yy E E

Fuente de E

Fuente de C Fuente de C

Quimiotrofos Fototrofos

Aceptor final de electrones

Usa H2O para reducir CO2?

Si No

luzquímica

Comp. orgánicos Comp. orgánicos

Comp.orgánicos

Comp.inorgánicos

O2 No O2

CO2 CO2

Quimioheterotrofos Quimiolitotrofos FotoautotrofosFotoheterotrofos

FermentativoFotosíntesisanoxigénica

Fotosíntesisoxigénica

oxidativo

NO3-, SO4

2-,Fe(III), Mn(VI)

Bacteriasoxidantes deS, Fe y CO

GNB, PNB

MetabolismoMetabolismo::AnabolismoAnabolismo yy catabolismocatabolismo

• Biosíntesis• Creación de uniones C-C• Reducción asimilatoria de CO2, NO3

-, SO42-

• Oxidación de sustratos reducidos• Uso de fosforilación y transporte de electrones• Reducción disimilatoria de O2, NO3

-, Fe(OH)3, Mn(OH)4, SO4

2-, CO2

Material celular, macromoléculas, biomasa Recursos

ATP ATPIntercambio deenergía bioquímica

La La termodinámicatermodinámica predicepredice queque reaccionesreaccionesson son energéticamenteenergéticamente favorablesfavorables

Reactivos

Productos

Tipos de reacciónCambio de estadoDisolución/precipitaciónFormación de complejosReacción ácido/baseAdsorción/desorciónOxidación/reducciónOxidación/reducción

Reducción

Oxidación

A B A oxidado B reducido

ReaccionesReacciones redoxredox, , equilibrioequilibrio químicoquímicoyy energíaenergía librelibre

Reducción

Oxidación

moléculaorgánicacon 2H

NAD+ (carrierde electrones)

moléculaorgánicaoxidada

NADH + H+

(carrier de e-

reducido)

H+H+


Las Las coenzimascoenzimas aumentanaumentan la la diversidaddiversidad de dereaccionesreacciones redoxredox posiblesposibles en en unauna célulacélula

La cantidad de energía que puede serliberada de 2 hemi-reacciones se puedecalcular a partir de la diferencia en lospotenciales de reducción de las 2reacciones y el número de electronestransferidos:

Zehnder, A.J.B. and W. Stumm. 1988. Geochemistry and biogeochemistry of anaerobic habitats.A.J.B. Zehnder (ed.) Biology of Anaerobic Microorganisms, pp. 1–38

PotencialPotencial de de reducciónreducción: : medidamedida de la de la tendenciatendenciaa a donardonar electroneselectrones en en sistemassistemas biológicosbiológicos

estadooxidado

estadoreducido

1. 1. TermodinámicaTermodinámica de la hemi- de la hemi-reacciónreacción

Respiración aeróbica -125

Desnitrificación -119

Reducción de manganeso -98

Reducción de hierro -42

Fermentación -27

Reducción de sulfato -25

Metanogénesis -23

Acetogénesis -22

ΔG0 (kJ/ec)Proceso

2. 2. PresenciaPresencia de de constituyenteconstituyentegeoquímicogeoquímico en el en el ambienteambiente

Respiración aeróbica -125

Desnitrificación -119

Reducción de manganeso -98

Reducción de hierro -42

Fermentación -27

Reducción de sulfato -25

Metanogénesis -23

Acetogénesis -22

ΔG0 (kJ/ec)Proceso

Aceptor terminalde electrones

Producto Microorganismo

Aeróbico

Anaeróbico

3. 3. FisiologíaFisiología de los de los microorganismosmicroorganismos

Distancia

Proceso dominante de aceptor terminal de electrones

+10

0

-10

AceptoresAceptores de de electroneselectrones

pE

Respiraciónaeróbica

O2

orgánicas

O2

SOSO44--

ReducciónReducción de de sulfatosulfato

SOSO44--

HH22SS

Metanogenesis

CO2

CH4

H2

Desnitrificación

NO3-

NONO33--

Reducción de Fe (III)

Fe (III)

Fe (II)

Especies químicas

Equi

vale

nte

s

ImpactoImpacto geoquímicogeoquímico de la de la respuestarespuesta a aunauna perturbaciónperturbación ambientalambiental

gas oil


oxidación

reducción

－27.87 0 －744.6 －39.83

Energía libre de formación(de tablas)

TransducciónTransducción de de energíaenergía biológicabiológica

Los denominadores comunes en el metabolismo deenergía son ATP y los potentiales transmembrana

Fosforilación a nivel de sustrato

Respiración

Fotofosforilacion

Mecanismos para lageneración de ATP

La La conservaciónconservación de de energíaenergía estáestá ligadaligada a aun un estadoestado energizadoenergizado de la de la membranamembrana

Los transportadores de electrones estánorientados en la membrana de modo que amedida que los electrones sontransportados, los protones son separadosde los electrones

Potencial de reducción

+

FuerzaFuerza motoramotora de de protonesprotones ( (pmfpmf))

--- +++

DiversidadDiversidad catabólicacatabólica::quimio-organotrofosquimio-organotrofos

Flujo de carbonoFermentación

Flujo de carbonoen respiración

Comp orgánicosTransporte de e-Generación de pmf

Aceptores deelectrones

Respiración anaeróbica

Respiración aeróbica

Biosíntesis

aceptoresorgánicos

DiversidadDiversidad catabólicacatabólica::quimio-litotrofosquimio-litotrofos

Transporte de e-Generación de pmf

Aceptores deelectrones

Respiración anaeróbica

Respiración aeróbica

Biosíntesis

DiversidadDiversidad catabólicacatabólica::FotótrofosFotótrofos

Fotoheterótrofos

Compuestosorgánicos

Transportede electrones

Biosíntesis Biosíntesis

generación de pmfy poder reductor

Fotoautótrofosluz

Dadorde e-

DiversidadDiversidad metabólicametabólica yyeconomíaeconomía del del crecimientocrecimiento

EconomíaEconomía del del crecimientocrecimiento

glucólisis ciclodel

TCA

Los precursores, que son la fuente demonómeros para todos los componentescelulares, se originan en los pathwayscentrales: gucólisis y ciclo del ácidotricarboxílico (TCA)

Todos los sustratos ingresan en los pathwayscentrales luego de un número limitado dereacciones, para proveer al organismo con losmetabolitos precursores

bacteria

Glucosa 6-P Fructosa 6-P Gliceraldehido 3-P

3-P gliceratoFosfoenolpiruvato

piruvato

MetabolismoMetabolismo oxidativooxidativo

• Qué pasa con la energía?

• Qué pasa con la biomasa

ContaminantesContaminantesorgánicosorgánicos yynutrientesnutrientes((C,P,N,O,Fe,SC,P,N,O,Fe,S…………))

CrecimientoCrecimiento –– divisióndivisióncelularcelular

COCO22

consumoconsumo de O de O22

RespiraciónRespiración aeróbicaaeróbica

célula microbiana

fósforo

luz

calor

38 ATP

CH2OO2

CH2O

CO2

O2

CatabolismoCatabolismo de de hidratoshidratos de de carbonocarbono

4.75g/mol ATP

CinéticaCinética de de crecimientocrecimiento

tasa de utilización desustrato

Máximo coeficiente decrecimiento microbiano

Tasa de crecimientoespecífica

Concentración debiomasa activa

EfectoEfecto de la de la concentraciónconcentraciónde de sustratosustrato

Constante desaturación

Máxima tasa decrecimiento específica

Crecimiento debiomasa activa

Máxima tasa específica deutilización de sustrato

CrecimientoCrecimiento netoneto

Coeficiente dedecaimiento

Bodegom, Microb Ecol 2007, Vol. 53

Crecimiento en 3-Cl benzoato

SignificadoSignificado del del coeficientecoeficientede de decaimientodecaimiento bb

Por definición:

cuando

Smin es un parámetro cinético independiente de la configuración del reactor

Que pasa cuando b = 0?

La existencia de un Smin es consecuencia de decaimiento y mantenimiento microbiano

La mínima concentración de sustrato que se puede lograr en un sistema aumenta con b

RepresentaciónRepresentación genómicagenómica: : quéqué son, son,queque hacenhacen, de , de dondedonde vienenvienen??

Nelson, K.E., et al., 2002. Complete genome sequence and comparative analysis of the metabolically versatile Pseudomonas putidaKT2440. Environ. Microbiol. 4:799–808.

ConclusionesConclusiones extraídasextraídas de los de losgenomasgenomas bacterianosbacterianos

Nelson, K.E., et al., 2002. Complete genome sequence and comparative analysis of the metabolically versatile Pseudomonas putidaKT2440. Environ. Microbiol. 4:799–808.

1. Correspondencia entre el tamaño del genoma y número deORF

2. Cepas de la misma especie pueden tener variado genotiposy fenotipos

3. Diversidad en el tamaño

Cuanto conocemos de labiología de procariotas?

Almacenamientoy procesamientode información

Metabolismo Funciones nocaracterizadas

Procesoscelulares

Es Es importanteimportante el el cultivocultivo??

ImportanciaImportancia en en biotecnologíabiotecnología

Optimización de compuestos bioactivosa lo largo de la evolución

3.8×109

años

interacción depresiones selectivas

evolución tiempo

habitat Microorganismos

Bacterias Arqueas Eucariotes

Diversidad

fisiológica

ImportanciaImportancia del del cultivocultivo en en laboratoriolaboratorio

Bioprospección

Fisiologíaen cultivo

Secuenciadel genoma

Metagenómica Pre-genómica

Post-genómica

Elementos mayoritarios encélulas microbianas

Elemento FunciónC

O

H

N

S Proteínas, coenzimas

P Acidos nucleicos, fosfolípidos, ácido tecoico, coenzimas

K Principal catión inorgánico, cofactor enzimático

Mg Cofactor enzimático, unido a pared celular, membrana yésteres de fosfato, incluído ácidos nucleicos y ATP

Ca Cofactor enzimático, unido a pared celular

Fe Citocromos, ferredoxina, proteína Fe-S, cofactor enzimático

Na Transporte y transducción de energía

Cl Principal anión inorgánico

Constituyentes principales de las

células en las macromoléculas y

otras moléculas orgánicas

Elementos minoritarios:cofactores

Elemento Función

Mn2+ Superóxido dismutasa, fotosistema II

Co2+ Coenzima B12

Ni2+ Hidrogenasa, ureasa

Cu2- Citocromo oxidasa, oxigenasa

Zn2+ Alcohol deshidrogensa, aldolasa, fosfatasa alcalina,RNA y DNA polimerasa, arsenato reductasa

SeO32- Formato deshidrogenasa, glicina reductasa

MoO42- Nitrogenasa, nitrato reductasa, formato

deshidrogenasa, arsenato reductasa

WO42- Formato deshidrogenasa, aldehído oxidoreductasa

FactoresFactores de de crecimientocrecimiento

vitaminas

aminoácidos

purinas y pirimidinas

TemperaturaTemperatura

TemperaturaTemperatura

Ecuación de Arrhenius

Coeficiente de temperatura Q10

Relación de las velocidades de reacción a 2 temperaturasT2 y T1, con T2 =T1 +10

OxígenoOxígeno

Aerobios Facultativos Anaerobios Anaerobiosaerotolerantes Microaerófilos

CatalasaSuperoxido dismutasa

SOD-

UnaUna clasificaciónclasificación ecológicaecológica de debacteriasbacterias

Acidobacteria

Betaproteobacteria

Bacteroidetes

oligotrofos

copiotrofos

El El conceptoconcepto de de estrategasestrategas rr yy K K

rK

EstrategiasEstrategias de de vidavida: 2 : 2 extremosextremos de un de uncontinuocontinuo

K

r

Crecimientoexponencial

Crecimientologístico

Número de generaciones

Tam

año

de p

obla

cion

es (N

)

TriadaTriada de de supervivenciasupervivencia

Panikov, N.S. Microbial Ecology en Environmental Biotechnology (2010) Wang, L.K., Ivanov, V., Tay, J.H. Hung,Y.T. eds. Humana Press

RespuestaRespuesta a a condicionescondiciones ambientalesambientales

EnriquecimientoEnriquecimiento selectivoselectivo comocomo mecanismomecanismode de adaptaciónadaptación en en biotecnologíabiotecnología ambientalambiental

Alta tasa de crecimientoAlta afinidad por sustrato limitante

Los Los microorganismosmicroorganismos ““no no cultivablescultivables””““The great plate count anomalyThe great plate count anomaly””

Staley, J. T., and A. Konopka. 1985. Measurements of in situ activities of nonphotosynthetic microorganisms in aquatic andterrestrial habitats. Annu. Rev. Microbiol. 39:321-346.

Achtman M, Wagner M (2008) Microbial diversity and the genetic nature of microbial species. Nat Rev Microbiol 6:31–440

Los Los microorganismosmicroorganismos ““no no cultivablescultivables””The great plate count anomalyThe great plate count anomaly

PorPor quéqué los los microorganismosmicroorganismos se seresistenresisten a a crecercrecer en en cultivocultivo??

(i) El cultivo en el laboratorio destruye interacciones presentesen ambientes naturales

(ii) Incapacidad de crecer sobre sustratos del medio de cultivo

(iii) Infecciones por fagos

(iv) La alta concentración de sustrato necesaria para obtenercrecimiento detectable en el laboratorio puede ser tóxica

(v) Las prácticas de laboratorio suelen ignorar los primerosciclos de crecimiento en medio líquido que aparentemente nomuestran crecimiento, debido a la falta de buenos métodosde detección de densidad celular y falta de paciencia

El El crecimientocrecimiento microbianomicrobiano puedepuede determinarsedeterminarsesin el sin el usouso de de técnicastécnicas molecularesmoleculares

Zengler, K. Central Role of the Cell in Microbial Ecology (2009) Microbiol Mol Biol Rev, 73: 826-834

EfectoEfecto del del mediomedio de de cultivocultivo yy del deltiempotiempo de de incubaciónincubación

Davis et al., Effects of Growth Medium, Inoculum Size, and Incubation Time on Culturability and Isolation of Soil Bacteria (2005)Appl Environ Microbiol, 71, 826–834

Gellan como agente solidificante:

UsoUso de de aceptoraceptor de de electroneselectronesalternativosalternativos

Kopke et al., Microbial Diversity in Coastal Subsurface Sediments: a Cultivation Approach Using Various Electron Acceptors andSubstrate Gradients (2005) Appl Environ Microbiol, 71, 7819-7830

Costa del Mar de NorteAlta eficiencia de cultivo: 23% del número total de células

en los 2 m superficiales

UsoUso de de aceptoraceptor de de electroneselectronesalternativosalternativos: : reductoresreductores de de sulfatosulfato

Widdel et al., Anaerobic degradation of hydrocarbons with sulphate as electron acceptor (2007) en Sulphate Reducing Bacteria,Barton & Hamilton, eds. Cambridge

UsoUso de de aceptoraceptor de de electroneselectronesalternativosalternativos: : sedimentossedimentos anóxicosanóxicos

Zengler et al., Methane formation from long-chain alkanes by anaerobic microorganisms (1999) Nature, 401, 266

UsoUso de de compuestoscompuestos queque median mediancomunicacióncomunicación entre entre bacteriasbacterias

Ver también Bruns et al., Effect of Signal Compounds and Incubation Conditions on the Culturability of Freshwater Bacterioplankton(2003) Appl Environ Microbiol, 69, 1980–1989

Monómero/óxico Polímero/óxico

Polímero/anóxicoMonómero/anóxico

OHHL: N-(oxohexanoyl)-dl-homoserine lactone

BHL: N-(butyryl)-dl-homoserinelactone

cAMP: AMP cíclico

Bruns et al., 2002

CultivoCultivo yy deteccióndetección de demicroorganismosmicroorganismos

• Mínima cantidad de nutrientes• Incubaciones largas (30d)• Protección de peróxidos• Ácidos húmicos• QS (AHL)

• aeróbico• 1-2% O2• anóxico• 5% CO2

Stevenson et al., New Strategies for Cultivation and Detection of Previously Uncultured Microbes (2004) Appl Environ Microbiol, 70,4748-4755

CultivoCultivo yy deteccióndetección de demicroorganismosmicroorganismos

Stevenson et al., New Strategies for Cultivation and Detection of Previously Uncultured Microbes (2004) Appl Environ Microbiol, 70,4748-4755

CultivoCultivo de de microorganismosmicroorganismos en enmicrogotasmicrogotas encapsuladasencapsuladas en gel en gel

Zengler et al. Cultivating the uncultured(2002) PNAS 99: 15681-15686

suspensión aceite-bacteria en hielo con a 1,100 rpm

107 microgotas de gel (GMDs)10% ocupadas por una única célula encapsulada

Dilución de células agarosa (40°C).

2,200rpm

+

SeparaciónSeparación celularcelular porpor citometríacitometríade de flujoflujo

CultivoCultivo de de microorganismosmicroorganismos GMDsGMDsproblemasproblemas yy solucionessoluciones

Alain, K., Querellou, J. (2009) Cultivating the uncultured: limits, advances and future challenges. Extremophiles, 13, 583–594

CultivoCultivo de de microorganismosmicroorganismos marinosmarinosen en cámarascámaras de de difusióndifusión

Kaeberlein et al., Isolating “Uncultivable” Microorganisms in Pure Culture in a Simulated Natural Environment (2002) Science, 70,1127-1129

agar

membrana sedimento

La mayoría es invisible a simple vistaLa mayoría no crece luego de 2-3 pasajes

CultivoCultivo de de microorganismosmicroorganismos marinosmarinosen en cámarascámaras de de difusióndifusión

Bollmann et al. Incubation of Environmental Samples in a Diffusion Chamber Increases the Diversity of Recovered Isolates (2007)Appl Environ Microbiol, 73, 6386–6390

Los mútiples pasajes en cámaras de difusión permiten la adaptación al cultivo in vitro

CámarasCámaras de de difusióndifusión en en formatoformatomasivomasivo: : ““IchipIchip””

Nichols et al. Use of Ichip for High-Throughput In Situ Cultivation of “Uncultivable” Microbial Species (2010) Appl Environ Microbiol,76, 2445–2450

OtrosOtros métodosmétodoscon con membranasmembranas

Ferrari et al Cultivating previously uncultured soil bacteria using a soil substrate membrane system (2008) Nature Protocols 3,1261-1264

Microplaca de Petri: un millón decámaras de cultivo

óxido dealuminio poroso

7 x 7µm

Ingham et al. (2007) The micro-Petri dish, a million-well growth chip for the culture and high-throughput screening ofmicroorganisms. PNAS 104, 18217–18222

Microplaca de Petri: un millón decámaras de cultivo


chip de 8x36 mmrecubierto en Pt 180.000 cámaras20µm x 20µm

Los chips Los chips puedenpueden ser ser utilizadosutilizados parapararecuentorecuento de UFC de UFC


Imagen de microscopio invertido mostrando elcrecimiento de L plantarum (círculos claros) encámaras de 20 x 20 µm

Screening de 200.000 Screening de 200.000 aislamientosaislamientosbasadosbasados en el en el metabolismometabolismo de un de un

organofosforadoorganofosforado


fluorescein 3,6-diphosphate fluoresceina

1. Incubación 6 días

2. Recuento: 200.000 c

3. Screening

4. Identificación

“Ley de Moore” de duplicación del númerode transistores en un circuito integrado

Duplica cada 18 meses Ley de Moore Procesador Intel

““LeyLey de Moore de Moore”” parapara la la miniaturizaciónminiaturización de decultivoscultivos microbianosmicrobianos

Gefen & Balaban (2010) The Moore’s Law of microbiology – towards bacterial culture miniaturization with the micro-Petri chip.Trends in Biotechnology 26 , 345-347

Se aplica al volumen de cultivo pero noal número de aislamientos obtenidos!

CultivoCultivo de de ““no no cultivablescultivables””: : resumenresumende de estrategiasestrategias

Alain, Querellou (2009) Cultivating the uncultured: limits, advances and future challenges. Extremophiles 13:583

CultivoCultivo de de ““no no cultivablescultivables””::estrategiasestrategias futurasfuturas

Williamson et al. (2005) Intracellular Screen to Identify Metagenomic Clones that Induce or Inhibit a Quorum-Sensing Biosensor ApplEnviron Microbiol 71: 6335-6344

• Descubrimiento de autoinductores en análisis metagenómicos

LuxR: activador de transcripión

METREX: metabolite-regulated expression

BibliografíaBibliografía adicionaladicional

McMahon, K.D., Garcia Martin, K.D., Hugenholtz, P. (2007) Integratingecology into biotechnology. Current Opinion in Biotechnology, 18: 287–292

Rittmann, B.E. et al. (2006) A Vista for Microbial Ecology and EnvironmentalBiotechnology. Environmental Science and Technology, 40, 1096–1103

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