Diseño y evaluación de péptidos insecticidas para el ...

Diseño y evaluación de péptidos insecticidas para el control de Aedes

aegypti

Paula Andrea Giraldo Hincapié

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias, Escuela de Biociencias

Medellín, Colombia

2020

Diseño y evaluación de péptidos insecticidas para el control de Aedes

aegypti

Paula Andrea Giraldo Hincapié

Tesis presentada como requisito parcial para optar al título de:

Doctora en Biotecnología

Director:

Doctor Sergio Orduz Peralta

Grupo de Investigación:

Biología Funcional

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias, Escuela de Biociencias

Medellín, Colombia

2020

Dedicatoria

A Nidia, Víctor, Mónica y Jorge por todo su amor, paciencia, e imbatible fe en mí.

La Verdad siempre será infinitamente más compleja que cualquiera de los acercamientos del ser

humano.

Seis hindúes sabios, inclinados al estudio, quisieron saber qué era un elefante. Como eran ciegos,

decidieron hacerlo mediante el tacto. El primero en llegar junto al elefante, chocó contra su ancho y

duro lomo y dijo: «Ya veo, es como una pared». El segundo, palpando el colmillo, gritó: «Esto es

tan agudo, redondo y liso que el elefante es como una lanza». El tercero tocó la trompa retorcida y

gritó: «¡Dios me libre! El elefante es como una serpiente». El cuarto extendió su mano hasta la

rodilla, palpó en torno y dijo: «Está claro, el elefante, es como un árbol». El quinto, que

casualmente tocó una oreja, exclamó: «Aún el más ciego de los hombres se daría cuenta de que el

elefante es como un abanico». El sexto, quien tocó la oscilante cola acotó: «El elefante es muy

parecido a una soga». Y así, los sabios discutían largo y tendido, cada uno excesivamente terco y

violento en su propia opinión y, aunque parcialmente en lo cierto, estaban todos equivocados.

«Parábola de los Seis Sabios Ciegos y el Elefante».

Atribuida a Rumi, sufí persa del s. XIII.

Agradecimientos

Al profesor Sergio Orduz por confiarme este proyecto y a todos los estudiantes que han

pasado por el Laboratorio de Prospección y Diseño de Biomoléculas de la Universidad

Nacional de Colombia, con quienes entendí que la mejor manera de aprender es enseñar

desinteresadamente. Agradezco especialmente a Laura Bolívar y a Johan Bedoya, por

las memorables horas de café, terapia y amistad honesta.

A Johana Arboleda y Natalia Ortiz del Centro de Microscopía avanzada de la SIU. Luisa

Fernanda Muñoz y Leonardo Navarro del laboratorio de Patología Animal de la

Universidad de Antioquia, por la asistencia técnica en los métodos de microscopía.

Mis más sinceras gracias al Doctor Paul Linser de la Universidad de la Florida y a los

Doctores Darío Estrín y Diego Javier Alonso del Instituto INQUIMAE de la Universidad de

Buenos Aires. Sus recomendaciones fueron determinantes para llevar a feliz término esta

investigación.

Este trabajo fue financiado por la Universidad Nacional de Colombia (Proyectos de

Investigación internos, código Hermes 35058 y 39323). Programa de Becas Doctorados

Nacionales del Departamento Administrativo de Ciencia, Tecnología e Innovación

COLCIENCIAS (567-2012).

Resumen y Abstract IX

Resumen

Como consecuencia del desarrollo de resistencia a insecticidas en Ae. aegypti, existe la

necesidad de encontrar nuevas moléculas para su control. Los péptidos bioactivos son

considerados como productos naturales promisorios debido a su amplio espectro de

actividad como antimicrobianos e insecticidas. Trabajos previos han demostrado el

potencial de fragmentos de proteínas de conformación alfa-hélice, como insecticidas. De

acuerdo con lo anterior, en este trabajo, utilizando métodos de predicción in silico, se

estudiaron péptidos con actividad insecticida vía oral para larvas de Aedes aegypti, a

partir del diseño de análogos del péptido insecticida BTM-P1 y de la búsqueda de otros

segmentos alfa-hélice presentes en dominio I de las toxinas Cry y Cyt de Bacillus

thuringiensis. Se encontraron tres péptidos análogos a BTM-P1 y un segmento de 16

aminoácidos en la toxina Cyt2Aa, denominado CBYH3, con potencial insecticida y

actividad hemolítica nula o reducida. También se validó por dinámica molecular el

mecanismo formación de poros toroidales de BTM-P1 sobre un modelo simplificado de

membrana eucariota y se observó el daño celular causado por BTM-P1 y CBYH3 y su

aparente asociación con mitocondrias y la matriz peritrofica en el intestino de los

mosquitos utilizando la técnica de inmunolocalización immunogold.

Palabras clave: Péptidos insecticidas, Control biológico de vectores, bicapa lipídica,

Dinámica molecular

X Diseño y evaluación de péptidos insecticidas para el control de Aedes aegypti

Abstract

Design and evaluation of insecticide peptides for the control of Aedes aegypti

As a consequence of the development of insecticide resistance in Aedes aegypti, there is

a need to find new molecules to control it. Bioactive peptides are considered promising

natural products due to their broad spectrum of antimicrobial and insecticidal activity.

Previous work has shown the potential of alpha-helix protein fragments as insecticides. In

this work, using in silico prediction methods were designed peptides with oral insecticidal

activity for Ae. aegypti larvae, from the design of analogs of the insecticidal peptide BTM-

P1 and the search for other segments alpha-helix present in domain I of Cry and Cyt

toxins from Bacillus thuringiensis. Three BTM-P1-like peptides and a 16 amino acid

segment were found in the Cyt2Aa toxin, called CBYH3, with insecticidal potential and no

or reduced hemolytic activity. Molecular dynamics also validated the toroidal pore

formation mechanism of BTM-P1 on a simplified eukaryotic membrane model. The

cellular damage caused by BTM-P1 and CBYH3 and their association to the mitochondria

and peritrophic matrix was observed in the mosquito gut using the immunogold

technique.

Keywords: Insecticidal peptides, Biological vector disease control, Lipid bilayer,

Molecular Dynamics

Contenido XI

Contenido

Resumen…………………………………………………………………………………………IX

Abstract…………………………………………………………………………………………...X

Introducción……………………………………………………………………………….…….17

Objetivos……..…………………….…………………………………………………………....19

1. Capítulo. Estado del arte ....................................................................................... 21 Importancia médica de los mosquitos Aedes y métodos vigentes para su control

21 Péptidos de actividad biológica sobre membranas y su potencial como

bioinsecticidas ............................................................................................................ 27 1.2.1 Ciclótidos ....................................................................................................... 29 1.2.2 Defensinas ..................................................................................................... 30 1.2.3 Péptidos alfa-helicoidales .............................................................................. 30 Toxinas Cry y Cyt de B. thuringiensis para el diseño de péptidos insecticidas . 32 Metodologías para el diseño in silico de péptidos con actividad biológica sobre

membranas ................................................................................................................. 35

2. Capítulo. Actividad insecticida de análogos de BTM-P1 ..................................... 38 Introducción ...................................................................................................... 38 Materiales y Métodos ....................................................................................... 39

2.2.1 Diseño de análogos de BTM-P1 .................................................................... 39 2.2.2 Modelamiento de estructuras mediante simulación MD y cálculo de propiedades dependientes de la estructura 3D ........................................................ 41 2.2.3 Evaluación de actividad biológica .................................................................. 42 Resultados y discusión ..................................................................................... 45

2.3.1 Diseño de análogos de BTM-P1 .................................................................... 45 2.3.2 Estructuras 3D y propiedades ........................................................................ 49 2.3.3 Actividad Biológica ......................................................................................... 53 Conclusiones .................................................................................................... 58

3. Capítulo. Simulación Coarse-Grain de la interacción de BTM-P1 con un modelo simplificado de membrana ........................................................................................... 60

Introducción ...................................................................................................... 60 Materiales y métodos ....................................................................................... 62

3.2.1 Configuración del sistema .............................................................................. 62 3.2.2 Condiciones de la simulación ......................................................................... 63 Resultados y Discusión .................................................................................... 64 Conclusiones .................................................................................................... 74

XII Diseño y evaluación de péptidos insecticidas para el control de Aedes aegypti

4. Capítulo. Un fragmento de la toxina Cyt2Aa1 de B. thuringiensis var. kyushuensis con actividad insecticida sobre larvas de Ae. aegypti. .........................75

Introducción ...................................................................................................... 75 Materiales y Métodos ........................................................................................ 77

4.2.1. Selección de las hélices y predicción de actividad biológica ...........................77 4.2.1 Evaluación de actividad biológica ...................................................................78 Resultados y Discusión ..................................................................................... 80 Conclusiones .................................................................................................... 91

5. Conclusiones y recomendaciones ........................................................................93 Conclusiones finales .................................................................................................... 93 Recomendaciones ....................................................................................................... 93

Anexo A Anexo Péptidos adicionales evaluados sobre larvas de Ae. aegypti, durante la ejecución del proyecto……………………………………………………..……91

Anexo B Parámetros utilizados en los experimentos de simulación por Dinámica Molecular…………………………………………………………………………….…………..93

Anexo C Propiedades fisicoquímicas y predicción de actividad biológica de las hélices Cry y Cyt ……………………………………………………………………………….95

Bibliogafía …………………………………………………………………………………….100

Contenido XIII

Lista de figuras Pág.

Figura 1.1 Ocurrencia global de las cuatro principales enfermedades arbovirales

humanas: Dengue, Zika, Chikungunya y Fiebre Amarilla. .............................................. 22

Figura 1.2: Diversidad estructural de péptidos insecticidas............................................ 29

Figura 1.3: Mecanismo de acción de toxinas Cry y Cyt sobre larvas de mosquito. ........ 34

Figura 2.1: Nomenclatura de la especificidad enzima sustrato. ..................................... 40

Figura 2.2: Diagramas de la rueda helical de Edmundson de BTM-P1 y péptidos

análogos......................................................................................................................... 48

Figura 2.3: Variación en la probabilidad de actividad biológica de los análogos con

respecto a BTM-P1, según los predictores web. ............................................................. 48

Figura 2.4: Figura 2.4: Conformación promedio de cada residuo de BTM-P1 y sus

análogos......................................................................................................................... 50

Figura 2.5: 2D-RMSD de cada conformación vs todas las conformaciones de BTM-P1. 51

Figura 2.6: Momento Hidrofóbico 3D y mapa de potencial electrostático de BTM-P1 y

péptidos análogos .......................................................................................................... 53

Figura 2.7: Efecto de BTM-P1 y sus análogos sobre linfocitos y eritrocitos humanos. ... 55

Figura 2.8: Efecto de BTM-P1 y sus análogos sobre la viabilidad de la línea celular

C6/C36. .......................................................................................................................... 56

Figura 2.9: Mortalidad de BTM-P1 y análogos sobre larvas (L4) de Ae. Aegypti ............ 58

Figura 3.1: Estructura 3D y propiedades fisicoquímicas de los péptidos simulados. ...... 64

Figura 3.2: Orientación de BTM-P1 sobre el modelo POPC-POPE-ChoL. ..................... 66

Figura 3.3: Formación de un poro toroidal desordenado por BTM-P1. ........................... 67

Figura 3.4: Área por lípido de la membrana POPC-POPE-ChoL + BTM-P1 .................. 69

Figura 3.5: Espesor de la membrana de POPC-POPE-ChoL + BTM-P1. ...................... 70

Figura 3.6: Parámetros de orden de la membrana POPC-POPE-ChoL + magainina-2. . 72

Figura 3.7: Formación de poro temporal por MG2 en un modelo de membrana POPC-

POPE-ChoL. .................................................................................................................. 73

Figura 4.1: Alineamiento entre las secuencias seleccionadas y péptidos bioactivos

reportados en la base de datos APD3. ........................................................................... 83

Figura 4.2: Caracterización estructural el péptido CBYH3. ............................................ 83

Figura 4.3: Actividad biológica de CBYH3 sobre linfocitos humanos, células y larvas de

mosquito......................................................................................................................... 85

Figura 4.4: Esquema del intestino de larvas de Ae. aegypti........................................... 86

Figura 4.5: Perfil histopatológico de larvas L4 de Ae. aegypti tratadas con los péptidos

BTM-P1(D) y CBYH3(D). ................................................................................................ 87

XIV Diseño y evaluación de péptidos insecticidas para el control de Aedes aegypti

Figura 4.6: Localización de BTM-P1(D) y CBYH3(D) en el células epiteliales del intestino

medio de larvas L4 de Ae. aegypti. ................................................................................. 90

Contenido XV

Lista de tablas Pág.

Tabla 1.1: Insecticidas de síntesis química utilizados para el control de Ae. aegypti ...... 24

Tabla 1.2: Controladores biológicos de Ae. aegypti, en uso o considerados promisorios.

....................................................................................................................................... 26

Tabla 1.3: Innovaciones en el control genético y biológico de vectores, por tipo, población

blanco y resultado. ......................................................................................................... 27

Tabla 1.4: Péptidos insecticidas de estructura alfa-helicoidal. ........................................ 31

Tabla 1.5: δ-endotoxinas producidas por B. thuringiensis tóxicas para mosquitos

vectores.......................................................................................................................... 32

Tabla 2.1: Mapa de sitios de corte por tripsina sobre BTM-P1 según PeptideCutter. ..... 46

Tabla 2.2: Propiedades fisicoquímicas de análogos de BTM-P1. ................................... 46

Tabla 2.3: Probabilidad de actividad biológica de BTM-P1 y análogos predicha por los

servidores web. .............................................................................................................. 49

Tabla 2.4: Propiedades sobre la estructura 3D de BTM-P1 y sus análogos. .................. 52

Tabla 2.5: Actividad biológica de BTM-P1 y péptidos análogos. .................................... 54

Tabla 3.1: Resumen de las condiciones de los experimentos de simulación de

magainina-2 y BTM-P1 con el modelo de membrana POPE-POPC-ChoL. ..................... 64

Tabla 4.1: Data set de hélices del dominio I de toxinas Cry y hélices de Cyt. ................ 81

Tabla 4.2: Resumen propiedades fisicoquímicas del data set de hélices Cyt y Cry. ....... 82

Tabla 4.3: Resultados de la predicción de actividad de los péptidos seleccionados según

los criterios de predicción de los servidores CAMPR3, HemoPI y AntiCP. ..................... 82

Introducción

Alcance y limitaciones de la tesis

La propuesta inicial del grupo de Biología Funcional para el desarrollo de un trabajo

doctoral, planteaba en términos generales utilizar herramientas bioinformáticas para el

diseño de péptidos politcatiónicos alfa-helicoidales, que tuvieran como blanco las células

del intestino de larvas de Aedes aegypti. Todo ello teniendo como punto de partida la

siguiente información:

(i) Los trabajos realizados con el péptido BTM-P1 de estructura alfa-helicoidal, carga neta

positiva, y amplísima actividad biológica como antibacteriano, citotóxico, e incluso

insecticida para larvas de Aedes aegypti siempre y cuando sea administrado en su forma

enantiomérica D.

(ii) La hipótesis eléctrica propuesta por Lemeshko y Orduz (2013), que sugiere que la

capacidad permeabilizante de algunas toxinas entomopatógenas o sus fragmentos (como

es el caso del péptido BTM-P1), ocurre de una manera dependiente del potencial

eléctrico negativo. El cual en las células epiteliales intestinales de Ae. aegypti se hace

favorable de acuerdo con los gradientes electroquímicos generados por la distribución

asimétrica de las ATPasas vacuolares. De manera que podría sugerirse una semejanza

con las membranas negativamente cargadas de las bacterias, que son el blanco más

estudiado en relación con los péptidos policatiónicos. En consecuencia, algunos péptidos

policatiónicos pueden tener actividad insecticida.

(iii) La información sobre las propiedades fisicoquímicas de los péptidos antimicrobianos

e insecticidas experimentalmente validados, con el fin de utilizarla en la selección de

nuevos candidatos.

Al respecto, el grupo de investigación ha desarrollado scripts orientados a la búsqueda

en secuencias primarias de cualquier proteína, segmentos que cumplen con parámetros

18 Diseño y evaluación de péptidos insecticidas para el control de Aedes aegypti

fisicoquímicos que, junto con la estructura alfa-helicoidal, están asociados a la actividad

biológica de los péptidos antimicrobianos. Entre ellos se encuentran la carga neta

positiva, los porcentajes de hidrofobicidad mayores al 45%, y la anfipaticidad. Aunque

este método ha sido utilizado para el diseño de péptidos antimicrobianos, principal

objetivo del grupo de investigación, todos los péptidos que fueron seleccionados y

sintetizados con este propósito, en el marco de otros proyectos, fueron evaluados

también como posibles insecticidas sobre larvas de Ae. aegypti, sin éxito (ver anexo A).

En definitiva, como punto de partida para el diseño se contaba únicamente con el BTM-

P1 como péptido insecticida activo sobre larvas de Ae. aegypti, así como con información

de péptidos validados experimentalmente como no insecticidas a pesar de cumplir con

los parámetros fisicoquímicos seleccionados para péptidos antimicrobianos. ¿Cómo

abordar entonces el desafío de un diseño in silico?

De acuerdo con lo anterior se formularon como preguntas de investigación las siguientes:

¿se puede diseñar péptidos insecticidas de actividad vía oral contra larvas de Ae.

aegypti, a partir del estudio in silico predictores de actividad biológica y propiedades

fisicoquímicas determinantes de la interacción péptido-membrana? ¿Es posible

implementar un modelo in silico de interacción péptido membrana para la validación del

efecto citolítico como mecanismo de acción?

En este trabajo se propusieron estrategias combinando métodos bioinformáticos y de

dinámica molecular para el diseño de péptidos y el estudio de los mecanismos de

interacción péptido-membrana, para lo cual se establecieron como hipótesis de trabajo

las siguientes:

1. Péptidos análogos de BTM-P1 mantienen la actividad insecticida sobre larvas de Ae.

aegypti.

2. La modificación de L por D aminoácidos en la secuencia de péptidos insecticidas

potencia la su actividad in vivo sobre larvas de Ae. aegypti.

3. BTM-P1 puede formar poros en bicapas lipídicas mixtas.

4. Hélices de dominio I de toxinas Cry y Cyt de B. thuringiensis pueden tener actividad

insecticida sobre larvas de Ae. aegypti.

19

Se diseñaron péptidos análogos de BTM-P1 y se estudiaron parámetros adicionales en

términos de propiedades fisicoquímicas que pudieran ser útiles en el diseño de péptidos

a partir de otras alfa-hélices presentes en toxinas insecticidas. Los péptidos

seleccionados fueron evaluados in vitro como insecticidas sobre el modelo celular

C6/C36 de Ae. albopictus e in vivo como péptidos de actividad vía oral, sobre larvas Ae.

aegypti. Adicionalmente, se evaluó la actividad hemolítica sobre eritrocitos humanos y se

llevaron a cabo ensayos de viabilidad celular sobre linfocitos humanos como estudios

adicionales de citoxicidad sobre modelos eucariotas.

En el capítulo 1, se expone el estado del arte integrando en términos generales la

importancia del control de vectores y la información disponible para plantear los métodos

de diseño. En el capítulo 2 presentan los resultados del diseño de análogos del péptido

BTM-P1, apoyado en el uso de los predictores de actividad biológica disponibles y en el

estudio de propiedades sobre la estructura tridimensional, a partir de modelos obtenidos

por el método de simulación por dinámica molecular y su validación experimental. En el

capítulo 3, utilizando simulación por dinámica molecular con el método de grano grueso,

se validó la formación de poros toroidales como mecanismo de acción del péptido BTM-

P1 sobre un modelo simplificado de membrana, representativo de un modelo eucariota.

Por último, en el capítulo 4, se evalúo un set de predictores como clasificadores de alfa

hélices con actividad biológica, a partir de las hélices alfa del Dominio I de las proteínas

Cry, la validación experimental in vivo e in vitro de uno los péptidos así como la

verificación del efecto sobre el intestino del mosquito mediante inmunolocalización con

por el método de immunogold.

De acuerdo con lo anterior, fue posible cumplir con los objetivos planteados en el

proyecto descritos a continuación.

Objetivos

General

Diseñar péptidos con actividad insecticida, y estudiar su mecanismo de acción sobre

larvas de Ae. aegypti.


Específicos

1. Diseñar péptidos policatiónicos, anfipáticos, helicoidales, con potencial actividad

sobre el intestino de larvas de Ae. aegypti.

2. Construir y evaluar un modelo de bicapa lipídica, y su interacción con péptidos

insecticidas, mediante simulación por dinámica molecular.

3. Determinar el efecto insecticida de péptidos sintéticos sobre larvas de Ae. aegypti.

4. Detallar la localización de péptidos sintéticos seleccionados sobre cortes

histológicos de intestino de larvas de Ae. aegypti.

5. Evaluar el efecto citotóxico de los péptidos diseñados sobre linfocitos humanos.

6. Evaluar el efecto hemolítico de los péptidos diseñados sobre eritrocitos humanos.

21

1. Capítulo. Estado del arte

Importancia médica de los mosquitos Aedes y métodos vigentes para su control

Los mosquitos del género Aedes (Ae.) Ae. aegypti y Ae. albopictus (Diptera: Culicidae,

Subgénero Stegomyia) son dos de las especies de mayor importancia médica debido a

su capacidad vectorial en la transmisión de arbovirus patógenos humanos. Son especies

invasoras originarias de África y el sudeste asiático respectivamente, que se han

introducido y establecido en gran parte de las regiones tropicales y subtropicales,

provocando un aumento en la escala y frecuencia de brotes de enfermedades

emergentes y re-emergentes como, el Dengue, Fiebre Amarilla, Zika, y Chikungunya [1].

Aunque la carga total de estas enfermedades a nivel mundial es incierta, son

consideradas como un problema prioritario de salud pública particularmente grave para

las regiones de escasos recursos, en las cuales hay presencia de por lo menos una de

estas arbovirosis, con tasas significativas de morbilidad y mortalidad [2–4] (Figura 1.1).

Ambas especies comparten características adaptativas que las convierten en especies

invasoras exitosas, entre ellas, la preferencia por los asentamientos urbanos y

suburbanos, la capacidad de desarrollarse en recipientes artificiales o naturales, e incluso

en fuentes de agua contaminada [5].

Su ciclo de vida es relativamente corto y sus huevos son resistentes a la baja humedad

[6]. Sumado a ello, el incremento en la temperatura provocado por el cambio climático, y


la globalización del transporte, favorecen la dispersión pasiva y el establecimiento de los

mosquitos Aedes en nuevas áreas geográficas [6,7]. Por lo tanto, bajo las condiciones

climáticas actuales y de densidad poblacional, ambas especies continuarán

extendiéndose, aumentando el riesgo de coinfección y cocirculación de arbovirus, así

como también la probabilidad de introducción de otros virus y especies con capacidad

vectorial [8,9]. Se estima que para el 2050 el 49,13% de la población mundial estará en

riesgo de transmisión de arbovirus [10,11].

Figura 1.1 Ocurrencia global de las cuatro principales enfermedades arbovirales humanas: Dengue, Zika, Chikungunya y Fiebre Amarilla.

Mapa modificado de Leta et al., [3], de acuerdo a la información disponible en la Health

Information Platform for the Americas (PLISA) para Colombia y las Américas. El número de

casos confirmados de Zika y Chikungunya corresponde a datos entre el 2015 y 2017.

Las vacunas son una medida esencial para el control y prevención de las arbovirosis.

Desde la década de 1940 por lo menos seis vacunas contra la fiebre amarilla han sido

licenciadas por la Organización Mundial de la Salud (OMS), con recomendaciones para

su aplicación en población expuesta a zonas de alto riesgo como África y Suramérica

[12]. Lo que ha reducido de manera significativa la ocurrencia de la enfermedad en el

mundo [13]. Sin embargo, la baja disponibilidad de la vacuna no ha permitido su

implementación permanente en los programas básicos de inmunización, y por lo tanto, se

23

siguen presentando brotes de fiebre amarilla selvática que pueden migrar a ambientes

urbanos [1].

Filipinas y Tailandia. Esta vacuna tetravalente contra el dengue es de aplicación limitada

a habitantes de zonas endémicas, entre los 9 y 45 años de edad y con historia previa de

infección con dengue. Las recomendaciones se deben a que la vacuna se ha asociado

con un aumento en el riesgo de dengue grave y hospitalización en las personas sin

exposición previa al virus [14,15]. Colombia como país endémico de dengue y circulación

simultánea y alternativa de los cuatro serotipos, fue partícipe de las pruebas clínicas de

Dengvaxia [16], pese a ello no ha sido autorizado el uso de la vacuna en el país y en

cambio se espera continuar combatiendo la enfermedad con medidas preventivas [17].

Se conoce también el desarrollo de vacunas contra los virus Zika y Chikungunya en

diferentes fases de evaluación clínica [18,19], siendo la vacuna contra el Zika de mayor

interés por la asociación del virus con enfermedades congénitas de tipo neuronal en

neonatos, desarrolladas por la infección con Zika durante el embarazo [20].

A pesar de los esfuerzos en el desarrollo de vacunas, la correlación entre la distribución

de especies de Aedes y los brotes de arbovirosis hace necesario mantener el control de

las poblaciones de vectores como método primario para prevenir la transmisión de

arbovirus. Además, estos mosquitos presentan transmisión vertical y transestadial, como

también la capacidad de coinfección por diferentes virus y cepas, convirtiéndose en

reservorios de largo plazo, con consecuencias epidemiológicas importantes [21,22].

El control de Aedes se ha realizado mediante la combinación de medidas como la

aplicación de insecticidas de síntesis química (Tabla 1.1), el uso de ovitrampas en los

criaderos para la captura de hembras grávidas, la liberación de depredadores y la

aplicación de bioinsecticidas con base en microorganismos entomopatógenos y toxinas o

metabolitos derivados de estos (Tabla 1.2). Todo lo anterior tiene como objetivo el control

poblacional de los mosquitos durante los brotes epidémicos a través de la interrupción de

su ciclo de vida, para prevenir la picadura por mosquitos infectados.

La fumigación de espacios para el control de vectores está recomendada solo en

situaciones de emergencia para erradicar o frenar una epidemia. Para esto se utilizan


insecticidas neurotóxicos que actúan como agonistas del sistema nervioso del mosquito

[23]. Sin embargo, su uso intensivo, y el número reducido de blancos moleculares, ha

dejado como consecuencia el desarrollo de resistencia y resistencia cruzada en

poblaciones de Aedes a nivel mundial [24,25], así como efectos nocivos sobre la salud

humana, organismos no blanco y el medio ambiente, en razón a su amplio rango de

toxicidad, baja especificidad y potencial bioacumulación [26–29].

Según el Instituto Nacional de Salud [30], el estado de la susceptibilidad y resistencia de

las poblaciones de Ae. aegypti a los insecticidas de uso en salud pública en Colombia es

preocupante. En el 2018, se encontró resistencia a Lambdacialotrina, Deltametrina y

Fenitrotión en un 55%, 53%, y 41% de las poblaciones evaluadas, en 11 departamentos

del país. Así mismo, se encontró resistencia a Temefos, un larvicida organofosforado de

amplio uso recomendado por la OMS para aplicación en agua potable, el cual se utiliza

para el control de Aedes en los sitios de cría.

Tabla 1.1: Insecticidas de síntesis química utilizados para el control de Ae. aegypti

Grupo Tipo Químico Mecanismo de acción Ejemplos de uso actuales

Blanco

Neuro

tóxic

os

Organofosforados Inhiben la acción de la enzima acetilcolinesterasa, interrumpiendo la transmisión de impulsos entre las células nerviosas

Temefos Malation

Fenitrotion

L A A

Piretroides Interfieren con los canales de sodio en la membrana nerviosa interrumpiendo la transferencia de iones y la transmisión de impulsos entre las células nerviosas

Deltametrina Lambdacialotrina

A A

Mim

éticos

Horm

on

ale

s IGRs Análogos de la hormona juvenil ó

Inhibidores de la síntesis de quitina. Interfieren con los procesos de formación de quitina, eclosión y muda

Pyriproxyfen Diflubenzuron

Novaluron

L L L

(L) Larvas; (A) Adultos. IGRs del inglés (insect growth regulator)

Los insecticidas IGRs por sus siglas en inglés (insect growth regulator) son el método de

elección para el control de inmaduros en poblaciones resistentes a Temefos [31]. Aunque

se han reportado casos de susceptibilidad reducida a IGRs como Pyriproxyfen y

Metopreno [32], los IGRs son los menos tóxicos para comunidades planctónicas y

25

animales terrestres [28]. Además, son utilizados para la autodiseminación, una

metodología que consiste en impregnar mosquitos macho que son posteriormente

liberados en sitios de cría para potenciar la transferencia de insecticidas a los sitios de

oviposición [33].

Por otro lado, a diferencia del control con productos químicos de emergencia, las

estrategias más recientes de control biológico de Ae. aegypti avanzan hacia la

manipulación genética y biológica de mosquitos. El objetivo de estas estrategias es

suprimir o sustituir individuos en las poblaciones naturales para reducir su reproducción

masiva y al mismo tiempo su potencial para transmitir enfermedades arbovirales (Tabla

1.3). Estas metodologías incluyen, la esterilización de mosquitos macho mediante

radiación ionizante, [34], la inserción en poblaciones silvestres de machos transgénicos

genéticamente incompatibles, portadores de genes que causan letalidad, o genes

autolimitantes que le impiden a la descendencia alcanzar el estado adulto [35].

Al respecto se destaca la iniciativa World Mosquito Program llevada a cabo por lo menos

en 12 países (entre ellos Colombia), en los cuales se han realizado liberaciones

controladas de mosquitos Ae. aegypti transinfectados con Wolbachia pipientis [36].

Wolbachia es un género de bacterias endosimbiontes presente en poblaciones naturales

de insectos incluido Ae. albopictus y muy poco frecuente en Ae. aegypti [37]. La

presencia de Wolbachia en mosquitos trainsfectados reduce la replicación de arbovirus

[38,39]. Aunque el mecanismo mediante el cual ocurre este fenómeno no está

completamente entendido, se sabe que la presencia de Wolbachia incrementa la

expresión de genes de respuesta inmune en los mosquitos transinfectados. Además se

ha planteado que la competencia por recursos metabólicos, puede incidir de manera

negativa en la replicación de los arbovirus presentes en los tejidos de mosquitos que

contienen grandes cantidades de Wolbachia [40].

Las cepas de Wolbachia se transmiten por vía materna y provocan feminización,

partenogénesis, y alteraciones en el esperma de los machos causando incompatibilidad

citoplasmática (IC), favoreciendo la reproducción de hembras infectadas. Como

consecuencia de la IC se produce descendencia viable entre machos y hembras

infectadas que transmitirán la bacteria por vía transovárica conservando la infección en la


población, mientras que el apareamiento entre machos infectados y hembras no

infectadas ocasiona la muerte prematura de los embriones [41].

La eficacia de los métodos de control con base en manipulación biológica y genética

sobre poblaciones de mosquitos Aedes apenas comienza a ser evaluada, como también

la validez de estas medidas para la disminución en la incidencia de infecciones

arbovirales [42,43]. En este sentido se mantiene la necesidad de identificar nuevos

compuestos con actividad insecticida preferentemente de origen biológico, mejorar

las estrategias de control conocidas, encontrar nuevos blancos, y desarrollar

estrategias para minimizar el incremento de resistencia.

Tabla 1.2: Controladores biológicos de Ae. aegypti, en uso o considerados promisorios.

Grupo Clase de Controlador

Especie/ Especie Productora

Mecanismo de acción Blanco

Depredadores

Peces Poecilia reticulata Depredadores de larvas de los primeros instar

L

Copépodos Mesocyclops spp. L

Larvas de mosquito

Toxorhynchites sp. L

Neurotóxicos Bacterias

Saccharopolyspora spinosa

Unión a receptores nicotínicos de acetilcolina, causando excitación neuronal involuntaria contracción muscular, temblores, parálisis y muerte

L

Enterotóxicos Bacillus thuringiensis spp.

Toxinas formadoras de poros en células del tejido epitelial intestinal, causan lisis coloidosmótica y muerte.

L

Endoparásitos Wolbachia pipientis* Distorsiones reproductivas que disminuyen la sobrevida de los adultos; Disminución de la capacidad vectorial

A

Causales de Infección sistémica

Hongos Metarhizium anisopliae** Beauveria bassiana**

Adhesión y germinación de la espora en la cutícula del insecto (o ingestión de conidias), penetración en el hemocele, y desarrollo del hongo, que generalmente resulta en la muerte del insecto.

A - L

(A) Adultos; (L) Larvas. * Promisorios en estudios de campo o laboratorio..** Promisorios, con

resultados en laboratorio pero sin implementar en programas oficiales de control de Ae. aegypti

27

Tabla 1.3: Innovaciones en el control genético y biológico de vectores, por tipo, población

blanco y resultado.

Tipo de manipulación

Población blanco Resultado esperado

Macho modificado Hembra silvestre

Macho Hembra

Mosquitos Estériles

Irradiación Estériles (-) Huevos no viables

Gen autolimitante (RISL) (antes denominado “RIDL”: gen dominante letal)

Promotor femenino (FsRISL)

Gen dominante inserto (+)

(-)

Gen dominante portador

Hembras sin capacidad de vuelo

Gen de letalidad Estadio específico

Letalidad prematura (+)

(-) Larvas que no se desarrollan

Letalidad tardía (+) (-) Larvas que no se convierten en pupas

Genes de inmunidad

Genes de inmunidad RNAi

RNAi portador (-) RNAi portador

Resistentes a infección (DEN2)

Wolbachia: Intervenciones sin modificación genética

Incompatibilidad citoplasmática (IC)

Portador de Wolbachia

(-) Muerte embrionaria, ausencia de descendencia (disminuye la tasa de eclosión) o reducción de la sobrevida (capacidad vectorial)

Wolbachia (+) y (-) Wolbachia (+) de diferente cepa

Portador de Wolbachia

Wolbachia (+) de la misma cepa

Descendencia viable

Reducción de la sobrevida

(-) Portador de Wolbachia (huevos)

Disminuye la sobrevida de los adultos, incide en la capacidad vectorial

Inhibe la replicación viral (interferencia)

(-) Portador de Wolbachia (huevos)

Disminuye la competencia vectorial

Tomado de, Evaluación de las estrategias innovadoras para el control de Aedes aegypti: desafíos

para su introducción y evaluación del impacto [43]. DEN2 (Dengue serotipo 2).

Péptidos de actividad biológica sobre membranas y su potencial como bioinsecticidas

Los péptidos con actividad insecticida conocida pueden clasificarse en dos grandes

grupos de acuerdo con su mecanismo de acción. El primero se refiere a las neurotoxinas

ricas en puentes disulfuro e inhibidoras de canales iónicos que han sido aisladas a partir

de venenos de arañas, escorpiones, y algunos insectos [44]. Al segundo, pertenecen los

péptidos citolíticos formadores de poro con afinidad por los lípidos de membrana, que a

su vez tienen actividad antimicrobiana y por esta razón son mejor conocidos como


péptidos antimicrobianos (AMPs, por sus siglas en inglés) (Figura 1.2). En el segundo

mecanismo es en el cual se centra el presente trabajo.

Los AMPs son polímeros de aminoácidos de tamaño menor que una proteína. Han sido

aislados a partir del sistema inmune de diversos organismos [45], aunque también son el

resultado del diseño racional [46–48] y del estudio de fragmentos de proteínas [49,50].

Presentan unos amplios perfiles de actividad biológica como antimicrobianos, antivirales,

anticancerígenos, insecticidas, entre otros [51,52]. Por lo que representan un enorme

potencial terapéutico.

La naturaleza proteica y estructura modular de los péptidos facilita su producción

utilizando métodos de síntesis química, DNA recombinante [53], plantas y animales

transgénicos [16,17]. De manera que el número de péptidos terapéuticos y péptidos

diseñados para el suministro de fármacos está en aumento, como también el desarrollo

de estrategias in silico para disminuir los tiempos y costos asociados a los procesos

iniciales de aislamiento, caracterización y validación en laboratorio [56–58].

Aunque el principal mecanismo de acción de los péptidos antimicrobianos es el efecto

citolítico, existe evidencia de que pueden ejercer actividades inhibitorias a nivel

intracelular, como mecanismo primario o de apoyo para lograr una muerte eficiente [59].

Sin embargo, su propiedad más relevante es la afinidad por los lípidos de membrana, no

solo porque es determinante en cuanto al espectro de organismos potencialmente

susceptibles, sino además para la activación de mecanismos de perturbación que

desencadenan la muerte celular. Por lo tanto, la investigación científica en el tema

avanza en la búsqueda de nuevos péptidos, la validación del efecto sobre diversos

organismos blanco y al mismo tiempo, en el planteamiento de modelos de interacción

con membranas, que ofrezcan información fisicoquímica importante para el diseño de

nuevos péptidos [60,61]. De tal forma que la búsqueda y diseño de péptidos

biológicamente activos es un área de investigación necesariamente multidisciplinar que

precisa operar en conjunto desde la bioquímica, la biofísica, la química computacional y

la bioinformática.

Según la Antimicrobial Peptide Database (APD) a diciembre de 2019 se han registrado

3171 péptidos antimicrobianos, de los cuales 39 han sido evaluados como insecticidas

29

[62], 26 de ellos están confirmados o predichos como de estructura alfa-helicoidal, 3 de la

clase defensinas, 4 péptidos ciclótidos y los restantes de estructura sin resolver. Todos

ellos aislados de plantas, venenos de artrópodos, o anfibios.

Figura 1.2: Diversidad estructural de péptidos insecticidas.

Por Paula Giraldo en Biorender.com

1.2.1 Ciclótidos

Los ciclótidos son péptidos de entre 28 y 37 residuos aminoácidos, su estructura circular

es estabilizada por tres puentes disulfuro que forman un lazo de cisteína (CCK)

característico de la familia, lo que les otorga resistencia a la degradación térmica y

enzimática [63]. Los ciclótidos son sintetizados vía ribosomal como parte del sistema

inmune de plantas. Se encuentran en las flores, hojas, tallos y raíces de especies de las

familias Rubiaceae y Violaceae aunque también se han aislado ciclótidos análogos en

genomas de especies de Brassicaceae, Fabaceae, y Poaceae [64]. Se han encontrado

ciclótidos con actividad antibacteriana sobre cepas Gram negativas [65], con acción

nematicida sobre larvas y adultos de parásitos del ganado [66], y como insecticidas de

actividad vía oral para los lepidópteros plaga Helicoverpa punctigera y Diatraea

saccharalis [67,68]. Además, se ha demostrado que el péptido Kalata B1, aislado de

Oldenlandia affinis, una maleza asociada al cultivo de cítricos, induce daños en las

células epiteliales intestinales de larvas de H. punctigera de manera similar a las δ-

endotoxinas de B. thuringiensis [69]. Kalata B1 presenta afinidad por modelos de

membrana lipídica que contienen fosfatidiletanolamina (PE) [70], un fosfolípido de

membrana que en células de insectos como Spodoptera frugiperda, representa el 38%

de la fracción lipídica, mientras que en células de mamífero el contenido de PE es del

16% [71].


1.2.2 Defensinas

Las defensinas son una familia de péptidos antimicrobianos catiónicos y anfipáticos,

caracterizada por una conformación αβ estabilizada por tres o cuatro puentes disulfuro.

Están presentes como parte de los sistemas inmunes de plantas, vertebrados e

invertebrados. Tienen un amplio espectro de actividad al permeabilizar la membrana de

bacterias Gram positivas, Gram negativas, hongos y ser activas contra virus envueltos.

[51]. Las defensinas tienen afinidad por diferentes lípidos de membrana. Por ejemplo, las

defensinas de insectos y plantas, con actividad antifúngica, se asocian a los

esfingolípidos colocalizados con ergosterol en balsas lipídicas ricas en proteínas de

membrana. En cambio, las defensinas de vertebrados tienen afinidad por fosfolípidos

aniónicos como fosfatidilglicerol y cardiolipinas [72]. Se conocen tres defensinas

insecticidas de actividad vía oral, que han sido expresadas con éxito en levaduras e

incorporadas en plantas transgénicas: VrD1 y VrCrP procedentes de semillas de frijol

Mungo Vigna radiata, inhiben el crecimiento de larvas del gorgojo del fríjol

Callosobruchus chinensis, cuando son alimentadas con semillas artificiales que las

contienen [73,74], y la defensina NaD1 aislada de las flores de la planta de tabaco

Nicotiana alata, que actúa como un inhibidor de tripsina y quimotripsina en larvas de H.

punctigera y H. armigera [75].

1.2.3 Péptidos alfa-helicoidales

Los péptidos alfa-helicoidales reportados como insecticidas están resumidos en la tabla

1.4. Son politcatiónicos, y poseen un porcentaje de hidrofobicidad de entre 40% y 65%,

características que se consideran importantes para la interacción con las fracciones

lipídicas de las membranas. Al ser aislados a partir de venenos, se cree que su actividad

primaria en insectos podría estar asociada al bloqueo receptores celulares del sistema

nervioso, razón por la cual su evaluación como insecticidas se ha llevado a cabo a través

de inyección intrahemocélica en adultos. No obstante, el estudio de su efectividad sobre

otros modelos celulares como bacterias, levaduras y eritrocitos, ha permitido conocer su

capacidad citolítica. Los péptidos Lycotoxina I y Esculetina-1, son los únicos que también

han sido evaluados como insecticidas de actividad vía oral, incorporándolos en dietas

artificiales.

31

La aplicación de bioinsecticidas contra insectos plaga se lleva a cabo a través de la

aspersión de cultivos, o el uso de plantas genéticamente modificadas, que expresan la

molécula de interés. Para el caso de los insectos vectores, se prefiere el control de los

estados larvarios, por lo que el bioinsecticida debe poder aplicarse en el agua. En todos

los casos, es esencial que los nuevos bioinsecticidas sean tóxicos para los insectos por

vía oral, es decir que tengan como blanco componentes del intestino, o la habilidad de

atravesar el epitelio intestinal y entrar en la hemolinfa para acceder a otros blancos como

los receptores celulares del sistema nervioso. Por esta razón, se trabaja en el diseño de

péptidos que sean resistentes a proteasas mediante la ciclación molecular, la inserción

de D-aminoácidos en la secuencias, y finalmente, en métodos de conjugación con otras

proteínas para liberación intrahemocélica [76,77].

Tabla 1.4: Péptidos insecticidas de estructura alfa-helicoidal.

Nombre Procedencia Tamaño secuencia

Carga

%H Insecto blanco Otra actividad

Ref

Familia Cupieninas

Cupieninus. salei

35 7 - 8

45 - 48

Drosophila. melanogaster

♦ [78]

Melitina Apis mellifera 26 6 41 D. melanogaster ♦●■▲ [79]

Magainina 2 Xenopus laevis 23 3 43 D. melanogaster ♦●■▲ [78]

Esculentina-1* Rana esculenta 46 6 41 D. melanogaster ♦ [80]

Familia Ponericinas

Pachycondyla goeldii

18 - 26 2 - 7

65 - 46

Acheta domesticus

♦■ [81]

Lycotoxina I ** Lycosa carolinensis

25 6 52 Spodoptera frugiperda

♦■ [82]

Marcina-22 Mesobuthus eupeus

22 6 45 Musca domestica ♦

[83]

Meucina-22 M. eupeus 22 5 45 M. domestica ♦

MeuFSPL-2 M. eupeus 18 2 61 M. domestica ♦

Marmelittina M. eupeus 26 4 46 M. domestica ♦

Cyto-insectotoxina 1a

Lachesana tarabaevi

69 4 39 Sarcophaga carnaria

♦ [84]

BTM-P1 Sintético 26 5 57 Ae. aegypti ♦ [85]

♦ Antibacteriano; ■ Antifúngico; ● Antiviral; ▲Anticáncer. * Administrado vía oral por ingestión en dieta

artificial; **Administrado vía oral por ingestión de levaduras (vector de expresión del péptido).

Porcentaje de hidrofobicidad (%H).


Toxinas Cry y Cyt de B. thuringiensis para el diseño de péptidos insecticidas

Como se mencionó anteriormente, los métodos de control biológico de mosquitos utilizan

especialmente enemigos naturales y entomopatógenos, que son efectivos contra los

estados larvarios y por lo tanto, son adecuados para su aplicación en el agua. Entre ellos

se destaca el uso de los bioinsecticidas compuestos por ð-endotoxinas formadoras de

poro (Cry) y citolíticas (Cyt), producidas principalmente por cepas de la bacteria Bacillus

thuringiensis subsp. israelensis (Bti) (Tabla 1.5). También se ha reportado actividad

insecticida sobre mosquitos vectores, de las toxinas Cry pertenecientes a los grupos

Cry10, Cry16, Cry17, Cry19 y Cry20 [86].

A diferencia de los insecticidas de síntesis química, los bioinsecticidas que contienen

toxinas Cry y Cyt se activan al ser consumidas (infección vía oral), tienen como blanco

las células epiteliales intestinales en las larvas de mosquito y su activación depende de

las condiciones de pH alcalino en el intestino de los insectos (Figura 1.3) [87]. Lo que ha

permitido su implementación en los programas de control de vectores a partir de

diferentes formulaciones que contienen esporas o cristales que pueden ser aplicados en

contenedores de agua, estanques, lagos y canales de riego.

Tabla 1.5: δ-endotoxinas producidas por B. thuringiensis tóxicas para mosquitos vectores.

Toxina Forma activa (kDa)

Toxicidad Actividad sinergística

Cry4Aa (134 kDa ) 20 y 45 Cx≥An≥Ae Cry4Ba,Cry11Aa,CytAa,Cyt2Ba

Cry4Ba (128 kDa) 18 y 45 An≥Ae≥Cx Cry4Aa,Cry11Aa,Cry10Aa,Cyt1Aa,Cyt2Aa

Cry11Aa (72 kDa) 30-33 y 34-38 Ae≥Cx≥An Cry4Aa,CryBa,Cyt1Aa,CytBa

Cyt1Aa (27 kDa) 22- 25 Cx ≥Ae≥An Cry4Aa,Cry4Ba,Cry11aa,Cry10Aa

Cry10Aa (78 kDa) 58-68 Ae≥Cx Cyt1Aa,Cry4Ba

Cry11Ba 33 -36 Ae≥Cx Cry4Aa

Cry11Bb 30 -35 Ae≥Cx≥An ND

Cyt2Ba (29 kDa) 22,5 Cx≥Ae≥An Cry4Aa,Cry4Ba,Cry11Aa

CytCa (57 kDa) ND ND ND

Las seis proteínas Cry – Cyt con toxicidad diferencial y sinergia sobre mosquitos vectores de los

géneros Aedes (Ae), Culex (cx) y Anopheles (An). [88]. ND información no disponible.

33

La eficiencia de los productos basados en Bti depende de factores ambientales como el

pH, la temperatura y calidad del agua [86]. La radiación UV en combinación con altas

temperaturas inactiva las esporas y cristales de Bti en condiciones de campo, en

consecuencia su eficacia depende del tipo de formulación y en general se considera que

son de baja residualidad [88].

A pesar de que los niveles de resistencia de mosquitos vectores a toxinas de Bti no se

perciben como significativos [89], se ha demostrado un aumento en la tolerancia a las

toxinas en poblaciones de Aedes en Brasil y Francia [90,91] y bajos niveles de

resistencia no solo en Aedes, sino también en otros mosquitos vectores de los géneros

Culex y Anopheles [92–94]. Bajo este panorama, se hace necesario continuar con la

búsqueda de nuevas cepas y desarrollar estrategias que permitan potenciar la actividad

de las toxinas, como medida de respuesta a la probable aparición de resistencia [89].

Las proteínas Cry son un modelo bien estudiado en cuanto a su mecanismo de acción a

nivel fisiológico y molecular, no solamente por su actividad sobre mosquitos, sino además

porque esta familia incluye toxinas que son activas sobre nematodos y especies plaga de

Lepidoptera y Coleoptera, entre otros [95,96]. La especificidad de las toxinas Cry para

actuar sobre un determinado orden de insectos se debe en parte a la afinidad de los

dominios II y III por los receptores celulares, mientras que el mecanismo de formación de

poros del dominio I, está definido por la interacción con los lípidos de la membrana

(Figura 1.3) [97].

Esta capacidad para formar poros en las membranas celulares, ha propiciado que se

explore el efecto de las toxinas Cry sobre otros organismos y modelos. Al respecto, se ha

demostrado que no solamente las toxinas Cry activas, sino que también fragmentos

generados a través de proteólisis in vitro causan daño a la membrana celular de

bacterias, como Micrococcus luteus, Escherichia coli, Agrobacterium tumefaciens y cepas

de Clostridia y Archaea [98–100]. También se demostró que una región pequeña de la

toxina Cry4B (hélices α1-α5), forma poros selectivos para cationes en membranas

lipídicas planas [101]. Esta información sugiere que fragmentos cortos de toxinas Cry

podrían actuar sobre las membranas celulares de una manera similar a los péptidos

biológicamente activos producidos naturalmente en el sistema inmune de los organismos

vivos.


Esta aproximación, que consiste en evaluar la actividad biológica de pequeños

fragmentos de proteínas, es una de las estrategias in silico que se utiliza para la

búsqueda de nuevos péptidos antimicrobianos [50,102]. Bajo esta metodología fue

desarrollado el péptido BTM-P1 que consiste en un fragmento alfa-helicoidal de 26

residuos, derivado del dominio I de la toxina Cry11Bb de B. thuringiensis subsp. medellín.

BTM-P1 es un péptido con actividad antimicrobiana sobre cepas de Escherichia coli,

Staphylococcus aureus y Streptococcus pneumoniae [103]. Además, sintetizado como

BTM-P1 (D) (todo como D-aminoácidos) es una forma resistente a proteasas intestinales

que tiene actividad insecticida sobre larvas de Ae. aegypti. Este péptido también produce

hemólisis en eritrocitos de rata [85,104]. De acuerdo a lo anterior, se estima que otras

fracciones helicoidales, provenientes de toxinas Cyt y Cry pueden tener actividad

insecticida sobre larvas de mosquitos.

Figura 1.3: Mecanismo de acción de toxinas Cry y Cyt sobre larvas de mosquito.


35

Las toxinas Cry y Cyt están contenidas en cristales paraesporales que producen las cepas B.

thuringiensis durante la fase de esporulación. (I) Una vez ingeridos, (II) los cristales son solubilizados

en el intestino alcalino de los mosquitos liberando protoxinas inactivas. (III) Las protoxinas solubles son

procesadas por proteasas intestinales, activando las toxinas Cry (65 kDa), y Cyt (22-25 kDa). (IV) Las

toxinas Cry se unen a los receptores Aminopeptidasa N (APN) y Fosfatasa alcalina (ALP).

Posteriormente sufren un proceso de oligomerización e inserción de las hélices hidrofóbicas del

dominio I, en la membrana de las células epiteliales del intestino medio. (V) La apertura de poros en la

membrana anula el gradiente electroquímico, generando una pérdida del potencial de la membrana

llevando al desequilibrio osmótico y lisis, con la consecuente muerte del individuo. Las toxinas Cyt no

se unen a receptores celulares sino que interactúan directamente con los lípidos insaturados de la

membrana celular lo que desencadena también la formación de poros, lisis y muerte. Las toxinas Cyt

pueden servir como punto de anclaje de las toxinas Cry en la membrana, potenciando la efectividad de

los bioinsecticidas que contienen ambas toxinas [87].

Metodologías para el diseño in silico de péptidos con actividad biológica sobre membranas

El descubrimiento de moléculas biocidas ha sido un ejercicio de ensayo y error con base

en la evaluación de compuestos bajo condiciones de laboratorio. Lo que implica algunas

limitaciones en cuanto a la diversidad química explorable, y otras asociadas a los costos,

tiempos de búsqueda, aislamiento, síntesis y purificación, previos a la evaluación in vitro

e in vivo. Al respecto, el diseño de moléculas biocidas y otras de potencial terapéutico se

han beneficiado del desarrollo de métodos computacionales los que proporcionan una

base racional para la selección de estructuras químicas acelerando el proceso de

descubrimiento y diseño de moléculas de uso potencial en la industria farmacéutica.

A su vez, los estudios genómicos, los de predicción de la correlación estructura-función,

la simulación y la dinámica molecular utilizan las bases de datos biológicas, que son

ahora herramientas estándar con información para estudiar nuevos productos en el

tratamiento de infecciones. Estas metodologías se han empleado también en el diseño

de péptidos antimicrobianos [47] y péptidos insecticidas con actividad sobre canales

iónicos [105].

La información disponible en las bases de datos especializadas en péptidos, ha permitido

desarrollar herramientas de fragmentación in silico con base en la selección de


propiedades fisicoquímicas asociadas a la secuencia de aminoácidos, como por ejemplo,

la carga, el porcentaje de hidrofobicidad, el porcentaje de anfipaticidad y el tamaño. Esta

metodología es útil cuando se dispone de información estadística suficiente para

establecer rangos para los valores de cada parámetro con los cuales las secuencias

deberían cumplir para ser seleccionadas durante la búsqueda y es aplicable en el caso

de los péptidos antimicrobianos e incluso hemolíticos [106,107], pero no de los péptidos

insecticidas, debido a que hay pocos péptidos reportados para establecer este tipo de

patrones y a las diferencias en cuanto a su mecanismo de acción.

Otra aproximación consiste en utilizar herramientas para la predicción de la actividad

biológica de péptidos utilizando métodos de clasificación con base en inteligencia

artificial. Cada base de datos propone un set de péptidos negativos que consiste

generalmente en segmentos de proteínas transmembrana y un set de péptidos positivos

a los cuales se les ha calculado una selección de parámetros fisicoquímicos que intentan

explicar la actividad biológica. El éxito del clasificador dependerá de la correcta selección

de los parámetros; por lo tanto, cada vez son más los trabajos orientados a la evaluación

de estas propiedades y a la validación los algoritmos de aprendizaje con base en redes

neuronales artificiales (ANNs), máquinas de soporte vectorial (SVM) y modelos de

matrices cuantitativas (QM) que clasifican los péptidos basados en la composición de

residuos en las regiones N-terminal y C-terminal, entre otros [47, 108,109]. Aunque no

existe un consenso claro sobre la superioridad de ningún algoritmo, es claro que de la

selección de los grupos de entrenamiento positivos y negativos, y de los descriptores

moleculares depende el éxito de estas estrategias.

Con el creciente interés en el potencial terapéutico de los péptidos, se ha extendido el

rango de blancos evaluados y por lo tanto es posible encontrar bases de datos y

predictores de actividad antibacteriana, hemolítica, anticáncer, antifúngica, y de péptidos

penetrantes [110–113]. Lo que ha expuesto un reto adicional para el uso terapéutico de

los péptidos en relación con la selectividad, y en consecuencia, actualmente se trabaja

en establecer los mejores descriptores de la relación péptido-membrana, y en reducir los

set de entrenamiento a un blanco particular [110,114].

Es a partir de estas observaciones que de manera reciente se han incorporado los

experimentos de simulación por dinámica molecular (MD), mediante los cuales se puede

37

acceder a información a nivel atómico sobre las interacciones péptido-membrana de

acuerdo a la composición lipídica de la membrana celular de interés. Con las

simulaciones atomísticas es posible obtener información como la conformación,

orientación y el ángulo de inclinación con el que los péptidos se insertan en la membrana,

así como también los residuos importantes para que el proceso de interacción ocurra

[115–117]. También se han utilizado para estudiar los mecanismos de acción de los

péptidos sobre la membrana, como la formación de poros o agregados peptídicos

implicados en la permeabilización o lisis celular [118–120]. Los métodos de simulación

seleccionados dependen de las capacidades computacionales y de la información

estructural de los péptidos para poder replicar los sistemas.

El diseño in silico de péptidos entonces, comprende cualquier metodología que apoyada

en herramientas computacionales estudia las propiedades determinantes de la actividad

biológica, y su interacción con blancos moleculares, permitiendo al mismo tiempo

proponer modificaciones estructura/composición para potenciar el efecto sobre un

blanco particular, mejorar la selectividad, u otras propiedades de interés sobre la

efectividad y eficiencia. En los capítulos siguientes se presentará el uso potencial de

estas metodologías para el estudio de péptidos insecticidas.


2. Capítulo. Actividad insecticida de análogos de BTM-P1

Introducción

En el diseño racional de péptidos de actividad vía oral es necesario establecer

estrategias que permitan generar análogos funcionales capaces de superar barreras

como la permeabilidad epitelial y la presencia de enzimas proteolíticas en el entorno

gastrointestinal. Estas estrategias se concentran esencialmente en mantener la

estabilidad conformacional y en reducir la probabilidad de degradación enzimática

mediante por ejemplo la ciclación, la introducción de aminoácidos no naturales como los

D-aminoácidos, aminoácidos metilados, o mediante la amidación de los extremos

terminales [121–124].

La anfipaticidad es una propiedad estructural que describe la manera en la que se

distribuyen los residuos hidrofóbicos e hidrofílicos y catiónicos en una conformación alfa-

hélice. La anfipaticidad se ha estudiado con el fin de mejorar la selectividad de péptidos

biológicamente activos. Por ejemplo, Kim y Cha [125] demostraron como la dispersión de

un número particular de residuos catiónicos en la región hidrofóbica mantuvo la actividad

antibacteriana sin afectar casi la potencia de péptidos antimicrobianos. En contraste se

ha postulado que la segregación de residuos catiónicos en una región determinada

puede mejorar la potencia y la selectividad por membranas compuestas por lípidos de

carga negativa [126,127]. Así mismo, se ha observado que la sustitución total o parcial

por D-aminoácidos, ha mejorado la estabilidad de péptidos que interaccionan con

membranas celulares con y sin carga, y de aquellos en los cuales los residuos

determinantes de la actividad se encuentran dispuestos espacialmente en donde el

39

cambio de quiralidad de la cadena lateral no interfiere con las interacciones hidrofóbicas

[122,128].

La carga neta positiva de los péptidos antimicrobianos supone preferencia por

membranas compuestas por fosfolípidos de carga negativa y baja afinidad por

membranas zwiteriónicas; sin embargo, se han encontrado péptidos activos sobre ambos

tipos de membrana, los cuales tienen en común una región N-terminal hidrofóbica que

parece ser importante para establecer la unión a la membrana [129]. Un ejemplo de ello

es el péptido BTM-P1, un péptido antimicrobiano sintético que mantiene una

conformación alfa-helicoidal en ambientes lipídicos. La región N-terminal es hidrofóbica y

la C-terminal polar de carga positiva, debido a la presencia de dos de los cinco residuos

de Lisina (K) que lo conforman [103]. En su forma enantiomérica BTM-P1(D) es letal para

larvas de Ae. aegypti, conservando a su vez la capacidad antimicrobiana y hemolítica,

aunque con un costo de síntesis elevado.

En este capítulo se presentan los resultados del diseño racional de análogos de BTM-P1

a partir del uso métodos bioinformáticos y de simulación por dinámica molecular (MD),

con el objetivo de estudiar cómo las variaciones en la hidrofobicidad anfipaticidad y carga

inciden en la actividad insecticida. Los péptidos fueron evaluados in vitro sobre la línea

celular C6/C36 de Ae. albopictus (ambiente libre de proteasas intestinales) y además

fueron sintetizados con modificaciones de L por D aminoácidos de Lisina para ser

evaluados sobre larvas de Ae. aegypti. Se evaluó también su capacidad hemolítica e

inmunomoduladora sobre eritrocitos y linfocitos humanos respectivamente.

Materiales y Métodos

2.2.1 Diseño de análogos de BTM-P1

Se realizó una búsqueda sobre las proteasas intestinales presentes en larvas de Ae.

aegypti, para identificar sus patrones de corte y establecer sobre la secuencia primaria

del péptido BTM-P1 los sitios con mayor probabilidad de sufrir proteólisis. Para ello, se

realizó una búsqueda en la literatura como también en la base de datos MEROPS

especializada en proteasas, disponible en (https://www.ebi.ac.uk/merops/index.shtml).

https://www.ebi.ac.uk/merops/index.shtml


Utilizando el servidor web PeptideCutter (https://web.expasy.org/peptide_cutter) [130], se

realizó un mapa de probabilidad de corte por tripsina sobre la secuencia primaria de

BTM-P1, de acuerdo con el patrón P4-P2’, donde P1 es el sitio activo, según la

nomenclatura sustrato enzima propuesta por Schechter y Berger [131,132] (Figura 3.1).

PeptideCutter utiliza un tratamiento estadístico derivado del tamaño de los cuadrados de

las matrices de Keil [133], sobre la frecuencia de corte por tripsina, arrojando los

porcentajes de probabilidad de escisión sobre cada (K) o Arginina (R) presente en BTM-

P1.

Figura 2.1: Nomenclatura de la especificidad enzima sustrato.


BTM-P1 contiene aminoácidos K distribuidos a lo largo de su secuencia en las regiones

N-terminal, media y C-terminal, por lo tanto, para el diseño de análogos, sólo se

seleccionaron péptidos que permitieran conservar la región N-terminal hidrofóbica

importante para la interacción con membranas, y la región media helicoidal, conservando

como mínimo 3 residuos de K. De esta manera fueron evaluados análogos de menor

tamaño que BTM-P1 con escisiones sobre el C-terminal únicamente. Así mismo, se

simularon y se sintetizaron análogos con modificaciones de L por D aminoácidos de K,

para los ensayos de actividad biológica sobre larvas.

Teniendo en cuenta que BTM-P1 es un péptido de actividad biológica múltiple, se evaluó

in silico, si la pérdida de residuos en C-terminal podría alterar esta actividad. Por lo tanto,

se calculó la probabilidad de que cada análogo fuera clasificado como posible

antimicrobiano [111], anticancerígeno [134], y hemolítico [112], sometiendo cada una de

las secuencias primarias, a la opción de predicción disponible en las plataformas web

especializadas en péptidos biológicamente activos. Como criterio de selección de las

https://web.expasy.org/peptide_cutter

41

plataformas, se escogieron aquellos servidores en los cuales los data set positivos fueron

construidos con base en algoritmos de inteligencia artificial por el método de máquinas

de soporte vectorial (SVM), lo que permite asignar las probabilidades de actividad

biológica de acuerdo con la variación en las propiedades de la secuencia primaria, como

la composición de aminoácidos, la composición de dipéptidos, y de perfiles binarios, y no

de acuerdo a resultados dependientes de por ejemplo, las cepas, o líneas celulares,

sobre las cuales se hayan realizado las validaciones de actividad biológica.

2.2.2 Modelamiento de estructuras mediante simulación MD y cálculo de propiedades dependientes de la estructura 3D

Se realizó un muestreo conformacional del péptido BTM-P1(L) mediante una simulación

atomística (all atom en inglés) de 2 microsegundos (μs) partiendo de una conformación

inicial extendida, construida con el módulo LeaP de AMBER [135]. Se utilizó el campo de

fuerza ff14SB de AMBER16, y dos modelos implícitos, el primero representativo de la

interfase agua-lípido con una constante dieléctrica de 20 y el segundo representativo de

un ambiente acuoso. Este muestreo se realizó con el fin de determinar si el sistema

simulado de ambiente hidrofóbico permitía obtener estructuras alfa-helicoidales más

estables que en agua, compatibles con los hallazgos in vitro de Arias y colaboradores

sobre BTM-P1 en presencia de liposomas [104]. Las estructuras obtenidas en cada

sistema fueron comparadas usando un análisis RMSD bidimensional (2D-RMSD).

De igual manera, para observar las variaciones sobre la helicidad, se procedió a simular

los péptidos análogos bajo las mismas condiciones (modelo de interfase agua-lípido) que

el péptido líder (BTM-P1), por 25 nanosegundos (ns). Se calculó el porcentaje de

helicidad de cada análogo y se realizaron diagramas DSSP (hydrogen bond estimation

algorithm) sobre la conformación secundaria promedio de cada residuo a lo largo de la

simulación.

Finalmente, se seleccionó una estructura representativa de cada péptido a partir de la

búsqueda entre las estructuras muestreadas en cada trayectoria, de aquella con la menor

energía potencial [136] y se calculó el momento hidrofóbico 3D (3D µHM) utilizando una

constante dieléctrica de 20, de acuerdo con el modelo propuesto por Reisser y cols.


[137], según el cual, se define el momento hidrofóbico de una molécula como un vector

de tres dimensiones evaluando la distribución de regiones hidrofílicas y lipofílicas. Se

obtiene el potencial electrostático de la superficie molecular con base en puntos de carga

atómicos y se utilizan valores absolutos de este potencial para describir la distribución

diferencial de parches polares y no polares de la superficie, construyendo un vector que

apunta lejos de las regiones más polares de la superficie molecular. Con esta

metodología es posible observar una probable geometría de unión péptido-membrana, y

a su vez permite una mejor interpretación de la anfipaticidad molecular comparada con

las ruedas helicales, que fueron calculadas también utilizando el servidor Heliquest,

disponible en https://heliquest.ipmc.cnrs.fr/cgi-bin/ComputParams.py.

Para la edición, visualización y análisis de las estructuras se utilizó el módulo CPPTRAJ

de AMBER16 y los programas PyMOL Version 1.2 Schrödinger, LLC, Visual molecular

dynamics (VMD) [138], y el servidor http://www.ibg.kit.edu/HM/. El detalle de los

parámetros del sistema se encuentra en el anexo B.

2.2.3 Evaluación de actividad biológica

Péptidos

Los péptidos BTM-P1(L) y BTM-P1(D) fueron sintetizados por Biomatik (Wilmington,

USA) y sus análogos P1-19, P1-22, y P1-24, en forma L o modificados con D-Lisina,

fueron sintetizados por JPT Peptide Technologies GmbH (Berlín, Alemania). Todos los

péptidos se obtuvieron con una pureza mayor al 85% y fueron reconstituidos en agua

ultrapura para los ensayos de actividad biológica. Los ensayos se llevaron a cabo en un

rango de concentraciones entre 50 µM y 3,125 µM sobre células y entre 120 y 7,5 µM

sobre las larvas, con un factor de dilución 1:2.

Evaluación de la viabilidad sobre línea celular de mosquito

Se evaluó el efecto de BTM-P1 y sus análogos sobre la línea celular C6/C36 de Ae.

albopictus, por el método de reducción de Resazurina [139]. Para ello, células en medio

de cultivo L15, (suplementado al 10% de suero fetal bovino, y HEPES 20 mM) fueron

sembradas a una densidad de 4 × 104 cells/ mL por pozo en platos de 96, e incubadas a

28°C en ausencia de C02, por 24 h. Posteriormente, el medio de cultivo fue reemplazado

https://heliquest.ipmc.cnrs.fr/cgi-bin/ComputParams.py

http://www.ibg.kit.edu/HM/

43

por 100 µL de medio fresco con cada péptido. Las células fueron incubadas nuevamente

por 24 h bajo las mismas condiciones. Luego, 20 µL de CellTiterBlue (Promega, USA)

fueron adicionados a cada pozo y la reducción celular de resazurina a resorufina fue

medida después de 3 h de incubación a 28°C, en un lector de microplacas (Multiskan

ThermoFisher Scientific, USA) a longitudes de onda de 570 y 600 nm de acuerdo con las

instrucciones del fabricante. Como controles negativo y positivo se utilizaron células sin

tratamiento en 100 µL de medio L15, o células tratadas con Triton X-100 al 0,5%. Se

construyó una curva de viabilidad celular calculando el porcentaje de células viables

mediante la ecuación, %viabilidad= (absorbancia de la muestra/absorbancia del control

negativo)*100 y se calcularon los valores de concentración inhibitoria 50 (CI50), para tres

réplicas con tres repeticiones, utilizando paquetes estadísticos en R (R Core Team,

2013).

Toxicidad sobre larvas de mosquito

Para determinar el efecto insecticida de los péptidos análogos, se dispuso de grupos de

10 larvas de Ae. aegypti de cuarto estadío (L4), las cuales fueron depositadas en una

placa de 24 pozos. Se aplicó el tratamiento con los péptidos alcanzando un volumen

final en pozo de 500 µL. Como control positivo se utilizó el péptido BTMP-1(D), el cual ha

mostrado actividad insecticida sobre larvas Ae. aegypti en estadíos L1, L2, y L3 a

concentraciones entre 5 y 10 µM [85]. Como control negativo se reemplazó el

tratamiento por agua destilada. Se realizó el conteo de individuos vivos cada hora

durante 8 h, y 24 h después del tratamiento. Se construyó una curva de mortalidad en el

tiempo a partir del porcentaje de individuos muertos/hora durante 8 h y 24 h después del

tratamiento y se calculó la concentración letal media (CL50) para la hora 24, mediante el

modelo estadístico probit [140] utilizando el paquete estadístico Ecotox 1.4.2, software R

(R Core Team, 2013).

Actividad hemolítica

La actividad hemolítica de los análogos de BTM-P1 fue evaluada sobre eritrocitos

humanos (RBCs). Muestras de sangre obtenidas de un donador adulto sano, fueron

centrifugadas a 1000 x g por 7 min a 4°C. Se descartó el sobrenadante y el pellet fue

lavado con solución salina isotónica (NaCl 0,9%). 1 mL de pellet fue resuspendido en 10


mL de solución salina. Cada tratamiento fue llevado a cabo por triplicado en tubos de

microcentrífuga con 90 µL de la suspensión de eritrocitos y 10 µL de cada péptido a la

concentración máxima evaluada sobre células (50 μM). Se utilizó como control positivo

de hemólisis una muestra de eritrocitos tratada con Triton X-100 al 0,5%, y como control

negativo, se utilizó solución salina isotónica. Las muestras fueron incubadas por 3 h en

agitación constante (90 rpm) a 37°C. A continuación fueron centrifugadas (1000 x g, por

7 min a 4°C), y 50 µL de sobrenadante fueron depositados en un microplato de 96

pozos. Para determinar la cantidad de hemoglobina liberada se leyó la absorbancia de

las muestras a una longitud de onda de 545 nm, en un lector de microplacas (Multiskan

ThermoFisher Scientific, USA). El porcentaje de hemólisis para cada muestra fue

calculado dividiendo la absorbancia de las muestras entre la absorbancia del control

positivo, multiplicado por 100.

Viabilidad y proliferación de linfocitos

Se evaluó el efecto de los péptidos sobre la viabilidad de linfocitos humanos en cultivo y

se realizó una prueba de estimulación de proliferación linfocitaria aplicando en ambos

casos la prueba de reducción de MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol), de

acuerdo con la metodología de Bounous y cols. [141] con modificaciones. Brevemente,

se colectó sangre periférica de un donador adulto sano, en tubo BD Vacutainer ® con

heparina. 5 mL de sangre fueron añadidos a un tubo cónico con 5 mL de solución salina

de Hank sin iones calcio ni magnesio. La mezcla fue transferida a un tubo cónico con 3

mL de Ficoll-Paque ® (Eppendorf, Alemania), gradiente de densidad de 1.07 g/mL, y

centrifugada (400 x g, por 20 min). Los linfocitos de la interfase fueron transferidos a tubo

cónico con 5 mL de solución salina de Hank. Se llevaron a cabo dos pasos de lavado

centrifugando a 400 x g por 10 min descartando el sobrenadante cada vez. Los linfocitos

frescos (con una viabilidad mayor al 90% determinada por tinción con azul de tripano al

4% y conteo en cámara de Neubauer), en medio RPMI 1640 suplementado al 10% con

suero fetal bovino FBS, fueron sembrados a una densidad de 1 × 105 células/mL en

pozos de microplatos de 96 y tratados con BTM-P1 o sus análogos por 24 h para

determinar el efecto de los péptidos sobre la viabilidad celular, o por 72 h para la prueba

de proliferación. La incubación se llevó a cabo a 37°C, y atmósfera de CO2 5%. En los

ensayos de viabilidad se utilizaron células sin tratamiento en medio RPMI 1640 como

control negativo y células tratadas con Triton X-100 al 0,5% como control positivo. El

45

control positivo de estimulación linfocitaria consistió en células tratadas con

Fitohemaglutinina (PHA) al 1%. En ambos casos, pasado el periodo de incubación, se

agregaron a cada pozo 10 µL de MTT (5 mg/mL) y se incubó por 3 h (37°C, CO2 5%)

para permitir la formación de cristales de formazan. Finalmente, se adicionaron 100 µL

de isopropanol ácido para disolver los cristales y proceder con la lectura de la

absorbancia a 570 nm. Se realizó una curva de viabilidad celular calculando el porcentaje

de células viables mediante la ecuación, %viabilidad= (absorbancia de la

muestra/absorbancia del control negativo)*100 y se construyó un índice de proliferación

con respecto al control (PHA) para el cual se realizó un análisis de varianza entre

concentraciones y tratamientos con respecto PHA. Todos los análisis se llevaron a cabo

utilizando los paquetes estadísticos del software R (R Core Team, 2013).

Resultados y discusión

2.3.1 Diseño de análogos de BTM-P1

De acuerdo con los hallazgos en la literatura, la tripsina representa aproximadamente el

90% de las enzimas digestivas en el intestino de Ae. aegypti, y Ae. albopictus [142–144].

Así mismo, la información depositada en la base de datos MEROPS, indica que para Ae.

aegypti existen 29 entradas sobre proteasas digestivas de la familia S1, subfamilia A,

bajo los códigos SO1.110 y SO1.130, lo que corresponde a proteasas tipo tripsina con

escisión de sustratos de amida después de R o K, en el sitio de corte P1. No se

encontraron entradas para las subfamilias tipo quimotripsina en las cuales la escisión

ocurre después de uno de los aminoácidos hidrófobos en P1, o de tipo elastasa con

escisión después de Alanina (A) en P1. No se encontraron registros de serina proteasas

para Ae. albopictus en la base de datos MEROPS.

El mecanismo de proteólisis de la tripsina es bien conocido. La enzima corta por la región

C-terminal de los residuos K y R, con un patrón de corte sobre el sitio activo P4-P2 [145].

Excepciones que limitan la acción de la tripsina tienen que ver con la presencia de ciertos

aminoácidos en las regiones P2 y P1’ [130], que no ocurren en el péptido BTM-P1. Por lo

tanto, según lo esperado, el mapa de corte de PeptideCutter arrojó probabilidades del

100% en las posiciones (K6), (K14), (K18), (K25) y del 94% en (K23). El mapa de corte se

observa en la tabla 2.1. De acuerdo con lo anterior se seleccionaron cinco péptidos


análogos y se determinó la variación en la probabilidad de actividad biológica in silico,

con respecto a BTM-P1. Tres de los péptidos fueron simulados y sintetizados en forma L-

aminoácidos o con modificaciones por D-Lisina en (k6), (k14), (k18), y (k23), para los

ensayos in vitro (Tabla 2.2).

Los resultados de actividad in silico indican que los péptidos mantienen alta probabilidad

de ser hemolíticos, sin embargo, en todos los casos es menor con respecto a BTM-P1.

También se mantienen probabilidades similares de actividad antimicrobiana y sobre

líneas celulares de cáncer (Tabla 2.3).

Tabla 2.1: Mapa de sitios de corte por tripsina sobre BTM-P1 según PeptideCutter.

Posición Sitio

6 VAPIAKYLATALAKWALKQGFAKLKS





Las posiciones P1, están resaltadas en negrilla.

Tabla 2.2: Propiedades fisicoquímicas de análogos de BTM-P1.

Código Secuencia Carga % Hidrofobicidad

47

BTM-P1(L) BTM-P1(D)

VAPIAKYLATALAKWALKQGFAKLKSVapiakylatalakwalkqgfaklks

5 57

P1-19(L)

P1-19(k3)

VAPIAKYLATALAKWALKQ VAPIAk6YLATALAk14WALk18Q

3 63

P1- 20(L) VAPIAKYLATALAKWALKQG 3 60

P1-21(L) VAPIAKYLATALAKWALKQGF 3 63

P1-22(L)

P1-22(k3)

VAPIAKYLATALAKWALKQGFA VAPIAk6YLATALAk14WALk18QGFA

3 63

P1-24(L)

P1-24(k4)

VAPIAKYLATALAKWALKQGFAKL VAPIAk6YLATALAk14WALk18QGFAk23L

4 62

Péptidos posibles de acuerdo con los cortes por tripsina sobre BTM-P1. Los péptidos en gris no fueron seleccionados para este estudio. En minúscula los residuos en forma D.

Aunque la carga neta de todos los análogos es menor que en BTM-P1 al perder uno o

dos residuos de K y hasta seis aminoácidos en el C-terminal, la distribución de la carga

resultante mejora la anfipaticidad de los péptidos de carga +3, al generar regiones

hidrofóbicas y catiónicas continuas. Además, la distribución de los residuos cargados,

suponiendo que los péptidos mantienen una conformación alfa-hélice ideal, establece un

ángulo polar de 120º (Figura 2.2), característica que está fuertemente asociada con la

potencia y la capacidad de perturbar la membrana celular en bacterias y líneas celulares

de cáncer [146–148]. El porcentaje de hidrofobicidad también es considerado un

parámetro clave en la interacción péptido membrana, el cual en el caso de los análogos

aumentó con respecto al péptido líder. Péptidos con un alto porcentaje de hidrofobicidad

presentan una mayor interacción con membranas zwiterionicas y por lo tanto tienen

actividad hemolítica [115]. En términos generales la predicción in silico determinó que los

péptidos análogos tienen una alta probabilidad de retener la actividad biológica sobre las

membranas celulares, las cuales en el caso de las células intestinales de larvas de Ae.

aegypti, a pesar de ser zwiterionicas, mantienen una disposición particular de ATPasas

vacuolares que incide en la distribución del campo eléctrico, guardando relación con la

electrofisiología de bacterias alcalófilas [149] y favoreciendo la interacción con péptidos

de carga positiva [85]. En la figura 2.3 se esquematiza la variación de la actividad de

análogos con respecto al péptido líder.


Figura 2.2: Diagramas de la rueda helical de Edmundson de BTM-P1 y péptidos análogos

De acuerdo con la escala de hidrofobicidad de Frauchere y Pliska, el algoritmo HeliQuest

examina si existen segmentos que contienen una cara hidrofóbica ininterrumpida que

contenga al menos 5 aminoácidos hidrofóbicos (A, L, V, M, P, W, Y). Luego reconoce los

residuos polares que bordean la cara hidrofóbica (azul). Por último, en reconoce si los

residuos frente a la cara hidrofóbica son polares o poco hidrofóbicos (A, D, E, G, H, K, N, Q,

R, S, T). Los círculos amarillos indican residuos hidrofóbicos, azules residuos con carga

positiva, rosado Glutamina (Q), morado Treonina (T), verde prolina (P), y gris otros

aminoácidos. La flecha indica el valor del momento hidrofóbico.

Figura 2.3: Variación en la probabilidad de actividad biológica de los análogos con respecto a BTM-P1, según los predictores web.


Las flechas indican el mismo valor de probabilidad para los dos péptidos.

49

Tabla 2.3: Probabilidad de actividad biológica de BTM-P1 y análogos predicha por los servidores web.

Código Anticancerígeno (p) Hemolítico (p) Antimicrobiano (p)

BTM-P1 0,77 0,72 0,98

P1-19 0,8 0,54 0,98

P1- 20 0,79 0,53 0,97

P1-21 0,79 0,56 0,97

P1-22 0,78 0,54 0,97

P1-24 0,78 0,59 0,98

La predicción fue realizada sobre la secuencia primaria, seleccionando siempre como ventana de

análisis el tamaño total de cada péptido, y un umbral de 0,5.(p) probabilidad

2.3.2 Estructuras 3D y propiedades

Para estudiar el efecto de las deleciones en el C-terminal sobre la helicidad de los

análogos, se evaluó un sistema de simulación mediante dinámica molecular all atom,

utilizando el péptido BTM-P1 y una aproximación al modelo de membrana implícita

comparado con el modelo de solvente implícito de agua. Como se observa en la figura

2.4, el péptido BTM-P1(L) mantiene una conformación más estable en el ambiente

hidrofóbico, lo que permitió utilizar el mismo sistema para obtener las estructuras de los

péptidos análogos conformados por L aminoácidos. En adelante, se excluyeron los

péptidos P1-20 y P1-21 debido a que presentaron la relación de probabilidad de actividad

biológica in silico menos favorable.

https://webs.iiitd.edu.in/raghava/anticp/submission.php

http://crdd.osdd.net/raghava/hemopi/

http://www.camp3.bicnirrh.res.in/prediction.php


Figura 2.4: Figura 2.4: Conformación promedio de cada residuo de BTM-P1 y sus análogos.

51

En la figura 2.5 se presentan los diagramas DSSP sobre la asignación de estructura

secundaria promedio para cada residuo durante la simulación. BTM-P1 mantiene una

conformación alfa-helicoidal entre los residuos 3 a 24, con giros de gran curvatura hacia

el C-terminal. P1-24 pierde dos aminoácidos con respecto BTM-P1 en C-terminal, pero

mantiene una región predominantemente alfa-hélice entre los residuos 4 a 18 que

equivale a un porcentaje global de helicidad del 58%. La pérdida de los aminoácidos (K23)

y (L24) en P1-22 (con respecto a P1-24), parece provocar desestabilización en la cara

apolar de la hélice, reduciendo la alfa-helicidad total a 45%, con predominancia de

hélices giro 310, o giros con grandes curvaturas hacia la región N-terminal. P1-19 se

mantuvo como una hélice estable con menos fluctuaciones entre conformaciones a lo

largo de la simulación y una helicidad similar a P1-24 (Figura 2.5, Tabla 2.4).

Figura 2.5: 2D-RMSD de cada conformación vs todas las conformaciones de BTM-P1.

Cada punto de color representa la raíz de la desviación cuadrática media de cada

conformación contra todas las demás conformaciones de la simulación. (a) BTM-P1

ambiente acuoso. (b) interfase agua-membrana.

Se calculó el µHM 3D para cada estructura con la conformación de menor energía

potencial de cada simulación (Figura 2.6). El tamaño del vector es independiente de la

carga total de la molécula e incrementa en magnitud de acuerdo a la distribución de la

carga de las superficies polares y apolares, es decir, entre menos balanceada es esta

distribución, mayor será la magnitud del vector, y por lo tanto se correlaciona con la

helicidad, siendo ambos parámetros más altos en BTM-P1>P1-19>P1-24>P1-22 (Tabla

2.4). Por lo tanto, el 3D µHM describe mejor las propiedades anfipáticas, que las


proyecciones de Edmundson con base en conformaciones helicoidales ideales, de

acuerdo con las cuales el momento hidrofóbico fue P1-24>P1-19>P1-22>BTM-P1 (Figura

2.2). Los 3D-HM están de acuerdo con los experimentos con base en MD que explican

las diferencias entre la interacción del péptido flexampina con modelos de membrana con

y sin carga, donde se encontró que la conformación cambia en relación con el tipo de

membrana; además, el tamaño del vector se incrementa cuando el péptido se encuentra

en regiones con alta hidrofobicidad y carga negativa [150]. Lo que apoya la idea de que

no solamente la composición de aminoácidos, sino que también los cambios

conformacionales inducidos por el ambiente hidrofóbico o acuoso, modifican el tamaño

del vector y con ello la posible geometría de unión con determinadas membranas [137].

Tabla 2.4: Propiedades sobre la estructura 3D de BTM-P1 y sus análogos.

Péptido Hx (%) 3D- µHM Angulo (°)

BTM-P1 87 17,4 85,2

P1-24 58 10,1 83,5

P1-22 45 6,5 60,5

P1-19 57 21 99,4

Porcentaje de helicidad (Hx); Momento hidrofóbico 3D (3D-HM). El vector indica la distribución de

las regiones polares de la superficie molecular y no la polaridad total de la molécula. Si el

potencial electrostático se da en kT/e y los vectores en Ångstroms, el vector µHM resultante tiene

una unidad de 2,56 x 10-12 Vm a temperatura ambiente. Como esta unidad no tiene ninguna

implicación física, el vector se expresa en múltiplos de kTÅ/e donde, k es la constante de

Boltzmann, T la temperatura en grados Kelvin y e la carga de electrones [137]. Ángulo medido

entre el vector y el eje Z (normal a la membrana).

53

Figura 2.6: Momento Hidrofóbico 3D y mapa de potencial electrostático de BTM-P1 y péptidos análogos

Los aminoácidos K están esquematizados por líneas en las figuras helicales. El vector se

encuentra alineado con el eje Z, normal a la membrana. La mayor población electrónica

corresponde a las regiones azules del mapa de densidad.

2.3.3 Actividad Biológica

La introducción de aminoácidos K(D) reduce el efecto hemolítico en péptidos análogos

pero no en BTM-P1.

Se realizó una prueba de hemólisis sobre eritrocitos humanos, utilizando la concentración

máxima evaluada sobre células (50 µM). Los resultados evidenciaron una reducción de la

capacidad hemolítica de los péptidos análogos con respecto a BTM-P1, siendo P1-

19(L)>P1-24(L)>P1-22(L). Los péptidos modificados con D-Lisina no causaron hemólisis

(Tabla 2.5).


Tabla 2.5: Actividad biológica de BTM-P1 y péptidos análogos.

Péptido Mortalidad Larvas CL50 (µM) (95%

I.C*)

(V) Células de mosquito

CI50 (µM) (95% I.C*)

(V) Linfocitos humanos

CI50 (µM) (95% I.C*)

Hm (%) 50 µM

BTM-P1(L) - 4,01 (3,5 - 4,4) > 50 19

BTM-P1(D) 6,96 (7,50 - 7,50) 3,40 (2,9 - 3,8) > 50 22

P1-19(L) - 6,13 (5,9 - 6,3) > 50 14

P1-19(k3) >120 17,2 (16,6 - 17,9) > 50 <1

P1-22(L) - 9,33 (8,9 - 10,8) > 50 5

P1-22(k3) >120 19,6 (18,1 - 21,2) > 50 <1

P1-24(L) - 5,18 (4,81 - 6,5) > 50 11

P1-24(k4) >120 25,2 (22,6 - 28,) > 50 <1

*IC = Intervalo de confianza, límites inferior y superior; CL50 = Concentración letal media a las 24 horas; CI50 = Concentración inhibitoria media a las 24 horas; % Hm = porcentaje de hemólisis

BTM-P1 y péptidos análogos no son inductores de proliferación linfocitaria

Los resultados de viabilidad celular sobre linfocitos muestran que los péptidos P1-22(L),

P1-22(k3) y P1-19(k3) inhibieron el crecimiento celular entre 15 y 20% aproximadamente

a la concentración máxima evaluada. Los demás péptidos en cambio, aunque inhibieron

levemente la viabilidad a concentraciones de 25 µM y 50 µM, permitieron el incremento

en el crecimiento celular por encima del 100% a las concentraciones más bajas (Figura

2.7-A). Resultados similares fueron reportados por Bacalum y Radu [151] para otros

péptidos alfa-helicoidales de actividad múltiple como, la Cecropina y la Lactoferricina, los

cuales tienen la capacidad de estimular o suprimir la respuesta proliferativa en linfocitos

de sangre periférica [152,153]. Por lo tanto, se realizó un ensayo de proliferación celular

con el fin de estudiar si BTM-P1 o sus análogos estimulan la activación de esta población

celular y se construyó un índice de proliferación con respecto al mitógeno (inductor de

proliferación celular) fitohemaglutinina (PHA). Aunque el análisis de varianza determinó

diferencias significativas acerca del efecto de los péptidos sobre los linfocitos

(F=28,97)(P<0,001), ninguno de los péptidos se acercó al umbral marcado por PHA para

ser considerado estimulante de proliferación (Figura 2.7-B).

55

a

r

Figura 2.7: Efecto de BTM-P1 y sus análogos sobre linfocitos y eritrocitos humanos.

(a). Viabilidad celular de linfocitos humanos (b). Índice de proliferación, (F=28,97)

**** (P<0,001).

Los análogos modificados por K(D) retienen la actividad insecticida sobre la línea celular

de mosquito a concentraciones mayores que BTM-P1

En la figura 2.8 se muestra el porcentaje de viabilidad celular de la línea C6/C36 después

de 24 h de tratamiento con cada péptido. BTM-P1 en ambas conformaciones (L) y (D) fue

el más activo reduciendo la viabilidad celular por debajo del 60% a la concentración

mínima evaluada (3,12 µM), mientras que las células tratadas a esta misma

concentración con los análogos en la conformación L-aminoácidos, alcanzaron entre el

70 y 80% de viabilidad y muy cerca al 100% en los tratamientos con péptidos

modificados con D-Lisina. La concentración inhibitoria media se presenta en la tabla 2.5.

P1-24 presentó el valor de CI50 más bajo (5,18 µM), siendo incluso mucho más bajo que

para P1-24(k4) el cual fue 25,2 µM. El par de péptidos más cortos P1-19 y P-19(k3),

retuvieron la actividad con valores de CI50 de 6,13 µM y 17,2 respectivamente y para P1-

22 y P1-22(k3) se calculó en 9,33 µM y 19,6 µM respectivamente.

b

r

e

s

i

d

u

o

d

u

r

a

n

t

e

l

a

s

i

m

u

l

a

c

i

ó

n


Figura 2.8: Efecto de BTM-P1 y sus análogos sobre la viabilidad de la línea celular C6/C36.

Análogos de menor tamaño y con modificaciones con D aminoácidos de K pueden

causar mortalidad de larvas de Ae. aegypti a altas concentraciones

Ninguno de los péptidos sintetizados como L-aminoácidos causó mortalidad o síntomas

evidentes de toxicidad en las larvas. En cambio, pudo observarse la muerte de individuos

a partir de la tercera hora de tratamiento con P1-19(k3) o P1-22(k3) y después de 6 h de

exposición a P1-24(k4) a la concentración máxima evaluada (120 µM) (Figura 2.9). Se

observó además una diferencia en la cinética de mortalidad de los análogos donde el

tratamiento con P1-19(k3) causó la mortalidad del 25% de los individuos a 60 µM entre la

tercera y la octava hora después de administrada la dosis (Figura 2.9d). A diferencia de

P1-24(k4) el cual se acerca a ese porcentaje sólo cuando fue administrado al doble de la

dosis (120 µM) y después de 4 h de tratamiento (Figura 2.9b), de manera similar a P1-

22(k3). El péptido líder BTM-P1(D), fue el más tóxico, con mortalidad cercana al 75% a la

concentración 7,25 µM y después de 8 h de exposición. Además ocasionó rigidez y

oscurecimiento de las larvas moribundas después de 3 h de exposición (Figura 2.9a).

Los resultados de la actividad in vitro sobre las células C6/C36 indican que el aumento en

la hidrofobicidad y la reducción de la carga mantuvieron la actividad insecticida y

hemolítica de los péptidos en forma L con valores de CI50 cercanos a los del péptido líder

BTM-P1. A pesar de que la introducción de D-aminoácidos disminuyó su efectividad

aumentando los valores de CI50, no se encontró efecto citotóxico sobre eritrocitos. Esto

es diferente a lo observado con el péptido BTM-P1(D) en el cual el cambio total de

57

quiralidad no redujo su actividad biológica. Otros estudios han demostrado que una fuerte

actividad hemolítica se correlaciona con alta helicidad e hidrofobicidad [147,154], por lo

tanto, la pérdida de helicidad que ocasiona la inserción de D-aminoácidos causa la

reducción en la actividad biológica sobre eritrocitos. Lo cual fue observado también por

Huang y cols. [154] a partir del diseño de péptidos antimicrobianos con modificaciones

parciales de L por D aminoácidos, en los cuales a mayor número de sustituciones, menor

hidrofobicidad, helicidad y citotoxicidad, pero mayor afinidad por membranas con carga

negativa. Así mismo, se ha demostrado que la propensión a formar alfa-hélices

anfipáticas es crítica para la acción membranolítica de los péptidos ([126, 146,155]). La

reducción en el tamaño de los análogos con respecto a BTM-P1 mejoró la anfipaticidad

de P1-22 y P1-19, generando regiones hidrofóbicas y catiónicas continuas para lo cual

fue necesario disminuir su carga de +5 a +3. Sin embargo, su actividad biológica sobre

células de mosquito no fue significativamente diferente a P1-24 y BTM-P1 con cargas +4

y +5 respectivamente y con la presencia de una K en la cara opuesta a la región

catiónica. Por lo tanto, la carga positiva y no la anfipaticidad se asocian con la actividad

insecticida.

Finalmente, la sustitución por D-aminoácidos de K con base en los sitios de corte por

tripsina, sobre los análogos si permitió comprobar el efecto insecticida sobre larvas de

Ae. aegypti, aunque a concentraciones mucho más altas con respecto al péptido modelo

BTM-P1(D) o a lo observado sobre la línea celular libre de proteasas intestinales. Por lo

tanto, es necesario explorar otras alternativas de administración de los péptidos para

evitar la acción proteolítica intestinal.


Figura 2.9: Mortalidad de BTM-P1 y análogos sobre larvas (L4) de Ae. Aegypti

Conclusiones

Sólo tres péptidos de estructura alfa-helicoidal han sido validados como insecticidas de

actividad vía oral (capítulo 1, tabla 1.4), de los cuales BTM-P1 es el único que ha sido

evaluado sobre Ae. aegypti. Sin embargo, debido a su amplio espectro de actividad

biológica (insecticida, hemolítico y antimicrobiano), es un desafío entender la

combinación de propiedades fisicoquímicas que le otorgan la actividad insecticida. Es por

esto que inicialmente se estudiaron propiedades estructurales dependientes de las

secuencias de aminoácidos y de la conformación 3D, que están implicadas en la

interacción con membranas biológicas y que han sido ampliamente estudiadas en otros

péptidos biológicamente activos. Estas son, anfipaticidad, hidrofobicidad y carga.

a

c

b

d

59

Encontrando una asociación preliminar entre cationicidad, helicidad y actividad

insecticida.

La introducción de métodos de simulación por dinámica molecular permitió obtener

información adicional de la relación conformación-actividad, como la helicidad y el

momento hidrofóbico, parámetros que parecen ser consecuentes con los hallazgos en los

experimentos in vitro. Esto es, que análogos de menor tamaño que BTM-P1, con alta

helicidad y momento hidrofóbico grande, conservaron la actividad insecticida sobre

células C6/C36 mejorando su selectividad al reducir la actividad hemolítica sobre

eritrocitos humanos. Sin embargo, es necesario avanzar también en estudios

experimentales desde la química y la biofísica que soporten la información estructural

que se obtuvo mediante los experimentos in silico por dinámica molecular.

Aunque las sustituciones por D-Lisina en los análogos permitió corroborar la toxicidad

sobre el modelo in vivo, estas parecen ser insuficientes para evitar la proteólisis

intestinal. Por esta razón es deseable estudiar alternativas de administración de los

péptidos como por ejemplo encapsulados, para corroborar este supuesto y al mismo

tiempo reducir la dosis necesaria para causar el efecto insecticida.


3. Capítulo. Simulación Coarse-Grain de la interacción de BTM-P1 con un modelo simplificado de membrana

Introducción

Los péptidos biológicamente activos pueden permeabilizar las membranas biológicas a

través de la formación de poros toroidales [118], poros en forma de barril [156], o

formando agregados en la superficie que las disuelve a modo de detergente [157]. Esto

se debe a la suma de las características fisicoquímicas del péptido y a la diversidad de

conformaciones y estados oligoméricos que puede adquirir de acuerdo con la

composición lipídica de la membrana. Caracterizar estas interacciones es importante, no

solamente para entender la selectividad, sino además porque esta información podría

utilizarse en la modificación de péptidos existentes o desarrollar nuevos péptidos con

otras propiedades.

En años recientes se ha implementado la simulación por dinámica molecular (MD) como

parte del diseño racional de péptidos, evaluando metodologías que faciliten el estudio de

las interacciones péptido-membrana a nivel atómico [150,158,159]. Este proceso es lento

y su observación mediante simulación all atom requiere de una escala de tiempo larga.

De tal manera que se necesita de una buena capacidad computacional, como también de

suficiente evidencia experimental sobre la estructura de los péptidos y su orientación con

respecto a la membrana. De esta manera se pueden contrastar los resultados obtenidos

mediante MD y diferenciarlos de posibles errores relacionados con el ajuste de los

parámetros de la simulación [160].

61

El método de Grano Grueso (CG) (por sus siglas en inglés) es un método meso-escala

de simulación molecular simplificado. Consiste en eliminar grados de libertad en la

evaluación de los parámetros de la simulación, agrupando los átomos en esferas según

tipos funcionales [161]. Mediante CG ha sido posible estudiar de manera cualitativa

sistemas de mayor tamaño y por períodos más largos que con la simulación all atom,

como por ejemplo, el proceso de formación de poros espontáneos por péptidos

antimicrobianos sobre modelos de membrana [119,162].

El péptido BTM-P1 (P1) es un segmento de 26 aminoácidos derivado de la toxina

insecticida Cry11Bb de Bacillus thuringiensis var. medellin. Es bactericida, hemolítico y

su forma isomérica (D) es letal para las larvas de Ae. aegypti. P1 tiende a mantener una

estructura alfa-helicoidal en presencia de liposomas compuestos por fosfatidilcolina (PC),

fosfatidiletanolamina (PE) y colesterol (Chol) [103], tres de los principales componentes

de las membranas celulares eucariotas.

En insectos, PE y PC representan alrededor del 70% del total de los lípidos de

membrana y conforman aproximadamente 65% de la porción lipídica en membranas

celulares de mamíferos [71,163]. PE y PC están presentes también en las membranas

mitocondriales [164], mientras que la cantidad de colesterol es variable entre tejidos y

organismos. Se ha postulado que la presencia de colesterol podría ejercer un factor

protector en los eritrocitos, lo que explica parcialmente la incapacidad de producir

hemólisis por péptidos antimicrobianos como la magainina 2 [165].

De acuerdo con su capacidad para permeabilizar la membrana interna mitocondrial en

modelos eucariotas (mamíferos e insectos) [85] y la interacción con liposomas, se ha

planteado que P1 permeabiliza las membranas a través de la formación de canales

iónicos de manera dependiente del potencial. Por otro lado, Arias y cols. [104] postularon

que la región C-terminal de P1 interactúa con las cabezas de los fosfolípidos aniónicos

que conforman la membrana celular bacteriana, mientras que la región N-terminal entra

en contacto con la región hidrofóbica, facilitando la inserción de la región central

helicoidal del péptido formando un poro toroidal.

Utilizando el método de simulación molecular de grano grueso Martini CG, se estudió la

capacidad de P1 para formar poros o canales iónicos sobre un modelo de membrana

compuesta por (PC-PE-ChoL), a través del autoensamblaje de moléculas del péptido P1


ubicadas de manera aleatoria en el núcleo hidrofóbico del modelo de membrana. Los

efectos de P1 sobre la membrana, fueron comparados con los de magainina-2 (MG2), un

péptido de 23 aminoácidos, catiónico y alfa-helicoidal, que está presente en la piel de la

rana africana Xenopus laevis [166]. MG2 es antibacteriano y aunque no causa hemólisis

en eritrocitos humanos, ha mostrado actividad sobre otros modelos eucariotas como

levaduras y parásitos [167]. MG2 ha sido validado como péptido insecticida sobre

individuos adultos de D. melanogaster cuando es administrado a través de inyección

intrahemocélica [78]. Sin embargo, en los ensayos in vitro de MG2 sobre la línea C6/C36,

la viabilidad celular fue superior al 94% a la concentración máxima evaluada (50 µM).

Tampoco se presentaron muertes o signos evidentes de intoxicación en larvas de Ae.

aegypti tratadas con MG2 (anexo A).

MG2 permeabiliza liposomas compuestos por fosfolípidos neutros y aniónicos como PC y

PG (fosfatidildilglicerol) a través de la formación de poros toroidales [168]. Utilizando esta

composición de lípidos representativa de una membrana bacteriana, ha sido posible

corroborar el mecanismo de formación de poros mediante simulación CG [[169]. Sin

embargo, se dispone de poca información sobre la formación de poros por MG2 en

modelos de membrana eucariotas.

Materiales y métodos

3.2.1 Configuración del sistema

Las simulaciones se llevaron a cabo utilizando el paquete GROMACS versión 5.0.7 [170],

el campo de fuerza MARTINI [171] y el modelo de agua polarizable (PW) [172]. CG

MARTINI consiste en un mapeo 4:1 en el cual, cuatro átomos pesados están

representados por un solo centro de interacción, a excepción de las estructuras en forma

de anillo, las cuales pueden ser mapeadas a una resolución de hasta 2:1. Así por

ejemplo, una esfera CG Martini representa 4 moléculas de agua.

Para la construcción del modelo de membrana se seleccionaron los fosfolípidos utilizados

en el experimento de interacción de P1 con liposomas, de acuerdo con de Segura y cols.

[103]. Esto es, proporciones (1:1:1) de 1-palmitoil-2-oleoilfosfatidilcolina (POPC), 1-

palmitoil-2-oleoilfosfatidiletanolamina (POPE) y colesterol (Chol). La estructura de P1

utilizada para las simulaciones fue la de menor energía potencial que se obtuvo a partir

63

de la simulación all atom en solvente implícito y constante dieléctrica 20, descrita

previamente (capítulo 2, sección 2.2.2.). La estructura del péptido MG2 fue descargada

de la base de datos Protein Data Bank PDB, disponible en https://www.rcsb.org/, bajo el

código PDB 2MAG. Todas las estructuras fueron mapeadas al modelo CG Martini

teniendo en cuenta las modificaciones propuestas por de Jong y cols. [173] para los

aminoácidos en combinación con el modelo de agua PW.

El ensamble de las cajas de simulación se realizó utilizando el software Packmol [174],

construyendo un modelo simplificado de membrana simétrica compuesta por 256 lípidos

por capa, y 5 o 10 péptidos MG2 o P1. Los péptidos fueron dispuestos de manera

aleatoria en el núcleo hidrofóbico de la membrana para permitir el autoensamble de

posibles poros o canales. El sistema fue hidratado adicionando 5000 moléculas de agua

y la carga neta equilibrada agregando contraiones cloruro y sodio (simulando un buffer de

NaCl 0,15 M) utilizando la herramienta genion del paquete GROMACS.

3.2.2 Condiciones de la simulación

Se siguió el protocolo de simulación propuesto por Balatti y cols. [119] con

modificaciones. Brevemente, se utilizó un tiempo de paso de 20 fs y un punto de corte

para las distancias Coulomb/Van der Waals de 1,1 nm, en un ensamble XYZ con

condiciones periódicas de frontera (PBC) (por sus siglas en inglés). La temperatura fue

acoplada a 310 Kº con un termostato Berendsen a un tiempo constante de 1 ps y la

presión con un barostato semisotropico (Parrinello-Rahman). El detalle de los demás

parámetros de producción del sistema se encuentra en la tabla II del anexo B.

Para la edición, visualización y análisis de las propiedades locales de membrana y las

trayectorias se utilizaron los programas, GROMACS [163], FATSLiM [168] y Visual

Molecular Dynamics VMD [128].

https://www.rcsb.org/


Resultados y Discusión

Mediante simulación molecular por el método CG, se estudió la interacción a diferentes

concentraciones de P1 y MG2 (Figura 3.1) con un modelo de membrana lipídica (PC-PE-

ChoL) y se observó la capacidad de los péptidos para auto ensamblarse y formar poros

en la membrana. En la tabla 3.1 se presenta la información sobre las simulaciones

realizadas.

Tabla 3.1: Resumen de las condiciones de los experimentos de simulación de magainina-2 y BTM-P1 con el modelo de membrana POPE-POPC-ChoL.

Tamaño promedio

de la caja (nm) (x,y,z)

Proporción péptido/lípido

Tiempo simulado por experimento

# simulaciones independientes

Magainina 2 11,4 x 11,4 x 12,8 5/512 2 µs 2

11,4 x 11,4 x 13,1 10/512 3 µs 4

BTM-P1

11,6 x 11,6 x 12,5 5/512 2 µs 3

12,0 x 12,0 x 11,8 10/512 2 µs 3

12,1 X 12,1 x 11,4 5/512 2 µs 2

Figura 3.1: Estructura 3D y propiedades fisicoquímicas de los péptidos simulados.

Las ruedas helicales fueron calculadas utilizando el servidor HELIQUEST

https://heliquest.ipmc.cnrs.fr/cgi-bin/ComputParams.py. (µHM), tamaño del vector del momento

hidrofóbico representado por las flechas, calculado suponiendo una conformación helicoidal ideal

de los péptidos. De acuerdo con la escala de hidrofobicidad de Frauchere y Pliska, el algoritmo

HeliQuest examina si existen segmentos que contienen una cara hidrofóbica ininterrumpida que

contenga al menos 5 aminoácidos hidrofóbicos (A, L, V, M, P, W, Y). Luego reconoce los residuos

65

polares que bordean la cara hidrofóbica (azul). Por último, en reconoce si los residuos frente a la

cara hidrofóbica son polares o poco hidrofóbicos (A, D, E, G, H, K, N, Q, R, S, T). Los círculos

amarillos indican residuos hidrofóbicos, azules residuos con carga positiva, rosado Glutamina (Q),

morado Treonina (T), verde prolina (P), y gris otros aminoácidos. La flecha indica el valor del

momento hidrofóbico

Para estimar el efecto de la concentración de P1 sobre la membrana, se realizaron

simulaciones del sistema péptido-membrana-agua, con 5, 10 y 15 moléculas de P1, cada

una por 2 µs. Con una proporción 5/512, dos moléculas de P1 se orientaron en posición

transmembrana perpendicularmente al eje Z y paralelos entre sí, es decir, con la misma

orientación de los grupos N-terminal hacia la cara interna de la membrana (Figura 3.2 a).

Esta conformación ocurrió durante los primeros 2 a 4 ns y se mantuvo a lo largo del

tiempo simulado con pequeñas fluctuaciones de posición dentro de la membrana, pero

sin alterar su orientación. Se observó además la presencia de cabezas de etanolamina

en el espacio entre los péptidos paralelos, así como el movimiento flip flop natural del

colesterol entre las capas superior e inferior (Figura 3.2b). Los 3 péptidos restantes se

traslocaron totalmente sobre la superficie de la cara externa de manera independiente y

se ubicaron en posición perpendicular sin efectos aparentes sobre la bicapa. Esta baja

concentración de péptido produjo aperturas temporales en la membrana que no fueron

suficientemente grandes para permitir el paso de moléculas de agua (Figura 3.2 c,d).

Al duplicar la concentración de péptido de 5 a 10/512, la conformación y la orientación de

algunos péptidos se mantuvo, mientras que otros se ubicaron inclinados hacia la

interfase entre el agua y la capa inferior de la membrana. En conjunto, el agregado forma

un poro dentro del cual se encontraron fosfolípidos POPE y POPC provocando que

ambas capas de la membrana se curvaran acercándose levemente entre sí, en la

configuración de un poro toroidal desordenado. En esta simulación, los péptidos

perpendiculares orientaron sus grupos C-terminal apuntando en dirección al agregado y

las regiones N-terminal hacia la capa externa de la membrana (Figura 3.3,a-f).

Finalmente, al aumentar la cantidad de péptido a 15/512, el poro se formó rápidamente

(durante los primeros 6 ns) y se observaron los mismos efectos sobre la membrana de

manera más pronunciada. En la figura 3.3, se observa la formación del poro, el agregado

y la curvatura de la membrana que no llega a desintegrarse Fotografías tomadas a los

1µs y 1,8 µs, respectivamente.


De acuerdo con lo observado en los experimentos de DM, BTM-P1 puede formar poros

toroidales desordenados. En esta conformación las cabezas de los lípidos se dirigen

hacia el núcleo hidrofóbico formando el poro, mientras que las colas de los lípidos se

empaquetan lejos de la superficie, ocasionando un cambio en la curvatura de la

membrana y el paso de moléculas de agua [118]. Este mecanismo de acción ha sido

propuesto para otros péptidos con alta proporción entre hidrofobicidad y carga como la

melitina [175].

Figura 3.2: Orientación de BTM-P1 sobre el modelo POPC-POPE-ChoL.

(a-b) Vista transversal del sistema 5/512-membrana-agua. Durante los primeros 4 ns, dos

péptidos se acomodan en posición transmembrana. (c-d) Vista longitudinal de la superficie que

muestra la formación de una apertura temporal que no es lo suficientemente grande para permitir

el paso de moléculas de agua al interior. Las moléculas de agua están representadas como

esferas de color azul, los péptidos en formato de líneas y enlaces, el colesterol (ROH) esferas

verdes, fosfolípidos (PO4) esferas rosadas de POPC y blancas de POPE. Se omiten las colas de

los lípidos y en (b) las cabezas ROH para mejor visualización. Fotografias tomadas en el tiempo

1µs.

67

Figura 3.3: Formación de un poro toroidal desordenado por BTM-P1.

Panel (a-f). Sistema 10/512. (a), vista transversal de un poro toroidal desordenado causado por

P1, que permite el paso de moléculas de agua al interior del núcleo hidrofóbico de la membrana.

(b) Se mantiene la interacción con fosfolípidos de membrana al interior del poro. (c) Cada hélice

está representada por un cilindro verde para mostrar la orientación de los péptidos en el

agregado. Las flechas azules señalan la región N-terminal. (d-f) ubicación y efecto de las hélices

sobre la capa inferior de la membrana. Panel (g-l) sistema 15/512. Evidente daño de la

membrana, mantiene la formación de un poro toroidal desordenado formado a partir de un único

agregado peptídico. Fotografías tomadas en el tiempo 1 µs.


La explicación predominante en términos de la actividad biológica de péptidos

antimicrobianos es que estos se acercan y posicionan sobre las membranas

negativamente cargadas de las bacterias a través de los residuos de carga positiva, para

luego insertarse en la membrana a través de interacciones hidrofóbicas. Sin embargo,

no existe una correlación simple entre la afinidad de la membrana y la permeabilización.

Por ejemplo, los péptidos melitina y magainina están cargados positivamente y se unen a

las membranas aniónicas con más fuerza que a las membranas neutras. Sin embargo, la

melitina permeabiliza preferentemente membranas zwiterionicas, mientras que la

magainina tiene una fuerte afinidad por membranas aniónicas [165,176]. Lo que indica

que la hidrofobicidad es un factor que se correlaciona positivamente con la toxicidad.

También, se han postulado otros factores como determinantes de la selectividad, por

ejemplo, la presencia de colesterol y la magnitud de los potenciales transmembrana

[177]. Por ejemplo, el modelo propuesto para la actividad permeabilizante de BTM-P1

sobre diferentes modelos biológicos, postula la región C-terminal del péptido como sitio

de anclaje a la membrana y la región N-terminal hidrofóbica como región de interacción

con los fosfolípidos, seguido de la permeabilización de la membrana a través de un

mecanismo dependiente del potencial eléctrico, proceso que se ve favorecido en las

células epiteliales de Ae. aegypti debido a la distribución del campo eléctrico generado

por la posición de las ATPasas vacuolares a lo largo del intestino medio [85,104].

También, en el caso de las células eucariotas que secretan péptidos antimicrobianos, la

presencia de colesterol en la membrana evita que se forme una carga en la superficie lo

suficientemente fuerte como para atraerlos sobre sí misma. Esto explicaría por qué

péptidos con una alta proporción hidrofobicidad:carga como la melitina y BTM-P1 pueden

permeabilizar diferentes tipos de membrana.

En las figuras 3.4 y 3.5, se compara la variación entre los parámetros de orden área por

lípido y espesor de la membrana al tiempo inicial de cada simulación y durante los

últimos 200 ns.

69

Figura 3.4: Área por lípido de la membrana POPC-POPE-ChoL + BTM-P1

Los paneles sobre la izquierda corresponden las áreas por lípido calculadas al tiempo 0 ns, y

sobre la derecha aquellas calculadas durante la conformación de los poros. (a) Simulación del

sistema de 5 péptidos, (b) 10 y (c) 15 respectivamente. Los valores elevados al inicio de la

simulación se deben a que los péptidos están ubicados inicialmente de manera aleatoria en el

núcleo hidrofóbico de la membrana. Luego los valores excepto alrededor de las regiones donde se

encuentran los péptidos


Figura 3.5: Espesor de la membrana de POPC-POPE-ChoL + BTM-P1.

(A) configuración 5, (B) 10 y (C) 15 moléculas de P1 respectivamente. A la izquierda el espesor a

los 0 ns de simulación, y sobre la derecha, durante la ocurrencia de los poros.

71

Una baja concentración de MG2 permeabiliza la membrana a través de la formación de

poros transitorios sin alterar de manera permanente su estructura

El mecanismo de formación de poros toroidales de MG2 mediante simulación molecular,

es un modelo clásico que ha sido estudiado especialmente sobre modelos de membrana

conformados por fosfolípidos neutros y aniónicos. De acuerdo con esta configuración a

partir de simulaciones atomísticas y CG, ha sido posible replicar el mecanismo de acción

propuesto a partir de evidencia experimental [178]. En términos generales la formación

de poros de MG2 en la simulación se ha descrito como un proceso espontáneo que

ocurre por la conformación de dímeros paralelos que forman un toroide desordenado en

el cual los péptidos están rodeados por cabezas lipídicas atraídas hacia el interior de la

bicapa [179,180].

En nuestra simulación, el sistema POPC-POPE-ChoL (fosfolípidos neutros + colesterol),

es representativo de las membranas externas eucariotas. Con 5 moléculas de MG2

disponibles en el sistema, se observó la formación de un agregado de 3 péptidos que

permitió el paso de algunas moléculas de agua hacia el núcleo hidrofóbico (Figura 3.7a).

Estos agregados se formaron después de 3 ns y se repitieron por lo menos 4 veces

durante los 2 µs muestreados. Dos péptidos se ubicaron en posición transmembrana

enlazados por sus regiones N-terminal atravesando la bicapa. Los demás se traslocaron

totalmente sobre la membrana después de 10 ns, permaneciendo en esa posición el

resto del tiempo simulado. No se observó la presencia de cabezas lipídicas en el interior

del poro transitorio o interacción particular de los péptidos con alguno de los tipos de

lípido del modelo, diferente al movimiento flip flop característico del colesterol, entre las

capas de la membrana. Lo que podría indicar que la concentración de péptido no fue

suficiente para curvar la membrana y formar un poro estable sino agregados que se

ensamblan y disgregan en repetidas ocasiones (Figuras 3.7b,c,d). Los parámetros de

orden calculados durante el último µs de simulación se presentan en la figura 3.6.

Por lo anterior, se llevaron a cabo simulaciones aumentando la concentración a 10, 15 o

20 péptidos MG2. Bajo estas condiciones, la alta concentración de péptido provocó que

la membrana se curvara durante los primeros 2 a 4 ns de simulación, sin embargo en

adelante los péptidos se traslocaron hacia la región externa de la capa superior


orientados manera paralela a la superficie sin ningún efecto sobre la membrana, pero

permitiendo paso de algunas moléculas de agua en el proceso.

Área por lípido (a) y Espesor (b). Parámetros calculados sobre el último 1 µs de simulación

algunas variaciones leves se pueden atribuir a ondulaciones del sistema y no al acercamiento

entre las cabezas lipídicas de las capas superior e inferior.

Este fenómeno de pandeo que podría estar asociado con la configuración del sistema, ha

sido observado en otras simulaciones CG de MG2 [179]. De manera reciente Su y cols.

[181], propusieron como solución la imposición de restricciones a las cabezas de los

fosfolípidos con respecto al eje Z y equilibrar la tensión con un contenido de péptidos

igual en el interior y exterior de la membrana, de esta manera pudieron observar la

formación de dímeros de MG2 en un modelo de bicapa compuesto de colesterol, un

lípido neutro saturado (dipalmitoilfosfatidilcolina; DPPC) y un lípido neutro poliinsaturado

(dilinoleyl fosfatidilcolina; DLiPC). Los dímeros se formaron en las regiones ricas en

DLiPC, y no en las regiones ChoL+DPPC.

Utilizando liposomas puros o mixtos Matsuzaki y cols. [165] encontraron que MG2 induce

baja permeabilización en liposomas con contenido de POPC, POPE, e inhibición de la

lisis en presencia de colesterol. Lo que podría explicar el comportamiento de los péptidos

durante la dinámica.

Además, la presencia de colesterol podría ser uno de los factores importantes en relación

con la actividad biológica de los péptidos sobre modelos eucariotas. De acuerdo con la

a b

Figura 3.6: Parámetros de orden de la membrana POPC-POPE-ChoL + magainina-2.

73

literatura, MG2 no causa lisis de eritrocitos y en nuestro modelo de Aedes tampoco fue

activo, a diferencia de la actividad biológica positiva sobre Saccharomyces cerevisiae

[182] en cuya membrana celular están presentes esteroles como el zimosterol y el

ergosterol, pero carece de colesterol [183]. MG2 también inhibe el crecimiento de los

estados extracelulares pero no intracelulares de especies del género Plasmodium las

cuales pueden modificar la composición lipídica de los eritrocitos del hospedero

incrementando el porcentaje de colesterol y de lípidos neutros durante la

gametocitogénesis [184,185].

(a,b), vista transversal del sistema MG2-membrana-agua (con 5 péptidos) de uno de los primeros

agregados después de 8 ns de simulación. Dos hélices se unen por sus regiones N-terminal

formando dímero que se ubica en posición transmembrana y permiten el paso de algunas

moléculas de agua. (c) la concentración no fue suficiente para formar un poro estable, si no

pequeños poros transitorios, a lo largo de la simulación.(d)péptidos traslocados a la superficie

externa de la membrana (32 ns).

Figura 3.7: Formación de poro temporal por MG2 en un modelo de membrana POPC-POPE-ChoL.


Conclusiones

Las simulaciones con el método Martini CG permitieron explorar el mecanismo de

autoensamble de poros transitorios de configuración tipo toroidal del péptido BTM-P1

sobre un modelo de membrana eucariota simplificado. Se encontró que dos hélices de

P1 ubicadas en posición transmembrana con la misma orientación N - C terminal y

paralelas entre sí, pueden permeabilizar la membrana permitiendo el paso de agua hacia

el núcleo hidrofóbico. La disposición de los péptidos dentro de la membrana sufrió

algunas fluctuaciones, pero la conformación de dos o tres hélices en posición

transmembrana se mantuvo a lo largo del tiempo simulado.

Otros autores han reportado la conformación de poros toroidales de MG2, en modelos de

membrana compuestos por POPC o mezclas de fosfolípidos neutros y aniónicos. Sin

embargo para el modelo POPC-POPE-ChoL utilizado en este estudio, solo se logró

observar la formación de agregados inestables, que permitieron el paso ocasional de

algunas moléculas de agua. Es necesario explorar otras conformaciones del sistema o

estructurar experimentos de simulación all atom que permitan detallar mejor las

interacciones de este sistema.

75

4. Capítulo. Un fragmento de la toxina Cyt2Aa1 de B. thuringiensis var. kyushuensis con actividad insecticida sobre larvas de Ae. aegypti.

Introducción

La búsqueda de secuencias con potencial actividad biológica encriptados en grandes

proteínas, es una de las estrategias más utilizadas como fuente de nuevos péptidos

[49,50,186]. En laboratorio a partir de la proteólisis enzimática se pueden generar

fragmentos peptídicos para ser evaluados sobre un blanco de interés. Así por ejemplo, a

partir de la toxina Cry11Bb de B. thuringiensis se identificó el péptido BTM-P1 el cual fue

inicialmente validado como antibacteriano y posteriormente como insecticida [98–

100,103]. Esta metodología es dispendiosa y exigente en términos de recursos y tiempo

de laboratorio, sumado a los costos de purificación y síntesis de las formas D necesarias

para validar la actividad biológica vía oral sobre mosquitos.

Se han realizado caracterizaciones estadísticas de los péptidos depositados en las bases

de datos sin establecerse un núcleo común de propiedades que sean determinantes

para la actividad biológica. Sin embargo, se ha encontrado que los péptidos

antimicrobianos tienden a ser cortos (<50 aminoácidos), catiónicos (+2 a +9), anfifílicos

(1–6) y con porcentajes de hidrofobicidad entre del 40% y el 60%. De acuerdo con estas

características se han desarrollado herramientas in silico para la segmentación de

proteínas y la búsqueda en proteínas y genomas de segmentos que cumplan con estos

parámetros [106,107,187]. La poca cantidad y baja diversidad de péptidos alfa-


helicoidales con actividad insecticida, no hace posible construir un set de péptidos

positivos con representación estadística suficiente para establecer rangos similares para

ser aplicados como criterios de búsqueda en estos sistemas.

Otra aproximación consiste en el análisis de secuencias utilizando clasificadores con

base en estrategias de inteligencia artificial. Estos clasificadores derivados de las

metodologías QSAR para el diseño de medicamentos arrojan la probabilidad de que una

secuencia pueda tener actividad biológica particular [188]. Sin embargo, a pesar de que

se le ha atribuido una alta selectividad a los péptidos antimicrobianos, está ampliamente

demostrado que estos pueden ser activos sobre diferentes blancos, es decir, pueden ser

al mismo tiempo tóxicos para bacterias, hongos, eritrocitos humanos e insectos como en

el caso de BTM-P1. A su vez, de acuerdo con el mecanismo de acción común entre los

péptidos con base en la afinidad con los lípidos de membrana, se ha planteado que estas

metodologías están prediciendo la probabilidad de interacción con membranas

biológicas, independientemente de su clasificación como antibacteriano, no hemolítico,

etc. Esta hipótesis ha comenzado a ser explorada para la construcción de nuevos

predictores [189].

Bajo este supuesto, se construyó un set de alfa-hélices del dominio I de las toxinas Cry y

Cyt de conocida toxicidad para larvas de mosquito las cuales, como parte de su

mecanismo de acción, pueden formar poros en las membranas celulares epiteliales del

intestino mediante la inserción de hélices hidrofóbicas [87]. Se utilizaron predictores de

actividad biológica antimicrobiana, anticáncer y hemolítica. El péptido con el mejor

puntaje fue evaluado como insecticida sobre la línea celular de mosquito C6/C36, larvas

de Aedes aegypti y su citotoxicidad sobre linfocitos y eritrocitos humanos. También se

estudió el efecto sobre el intestino de las larvas de Aedes utilizando el método de

marcaje immunogold y se comparó con el péptido BTM-P1(D).

77

Materiales y Métodos

4.2.1. Selección de las hélices y predicción de actividad biológica

Se seleccionaron 13 toxinas Cry y 2 Cyt de conocida actividad sobre mosquitos. Como

criterios de inclusión se tuvieron en cuenta que la toxina contara con su estructura 3D

resuelta y disponible en la base de datos PDB o con información publicada sobre la

asignación de hélices del dominio I y que además estuviera marcada como anotada

manualmente en la base de datos UniProt (https://www.uniprot.org/). Esta anotación de

secuencias fue verificada utilizando alineamiento estructural con el módulo expresso de

T-coffe (http://tcoffee.crg.cat/) y Jalview [190]. Se excluyeron del dataset las hélices 1 de

las toxinas Cry, porque de acuerdo con el mecanismo de acción de las toxinas, esta

hélice no participa en la formación de poros [87]. También se excluyeron algunas hélices

interrumpidas por loops, aquellas de tamaño mayor a 40 aminoácidos y menor a 12. El

cálculo de algunas propiedades fisicoquímicas básicas se llevó a cabo utilizando el

paquete Modlamp de Python [191].

Para la predicción de actividad se utilizaron los servidores CAMPR3 [111] para

antimicrobianos, HemoPI [112], para hemolíticos y AntiCP [113] para anticáncer. Como

criterio de selección de los predictores se escogieron aquellos que incluyeron en la

construcción de los dataset propiedades fisicoquímicas, estructurales y de composición

de aminoácidos. Así, para predecir la actividad de las hélices se utilizaron: (i)

SVM+motif(HemoPI-2) del servidor HemoPI que combina actividad hemolítica y motifs

que fueron encontrados en los péptidos hemolíticos del set de positivos. (ii) SVM+

ACP/AMP del servidor AntiCP, el cual incorpora dentro del dataset de negativos péptidos

antimicrobianos sin actividad anticáncer. (iii) el módulo SVM y el dataset único disponible

en el servidor CAMPR3. Como criterios de selección se establecieron puntos de corte

para la probabilidad de ser hemolítico menor a 0,5 y probabilidades superiores a 0,8 de

ser antimicrobiano y anti cancerígeno, teniendo en cuenta los criterios de actividad

biológica del péptido BTM-P1. Por último, se realizó un alineamiento múltiple de las

secuencias que cumplieran con los tres criterios de selección, contra los péptidos de la

base de datos APD3 (http://aps.unmc.edu/AP/main.php) para descartar que las hélices

predichas correspondieran a péptidos ya reportados.

https://www.uniprot.org/

http://tcoffee.crg.cat/

http://aps.unmc.edu/AP/main.php


El péptido con los mejores puntajes fue seleccionado para las prueba de actividad

biológica y se caracterizó su estructura en solución de 2,2,2-tri-fluoroethanol (TFE) al 30

%, por el método de dicroismo circular (CD), (en colaboración con la Fundación Instituto

de Inmunología de Colombia (FIDIC)). El modelamiento de la estructura por homología

se realizó utilizando el servidor I-Tasser https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-

TASSER/ y el diagrama de la rueda helical en el servidor HELIQUEST

https://heliquest.ipmc.cnrs.fr.

4.2.1 Evaluación de actividad biológica

Péptidos

Los péptidos BTM-P1- (D), y los conjugados con biotina BTM-P1 (D-b) y CBYH3 (D-b),

fueron sintetizados por GenScript (Nanjing, China). CBHY3- (L) y CBHY3- (D) fueron

sintetizados por Biomatik (Wilmington, USA). Los ensayos se llevaron a cabo en un rango

de concentraciones entre 50 µM y 3,125 µM sobre células y entre 150 y 75 μM (CBYH3),

siempre con un factor de dilución 1:2.

Viabilidad celular sobre línea celular de mosquito, linfocitos y eritrocitos humanos

Las pruebas de viabilidad sobre la línea celular C6/C36, linfocitos humanos y de actividad

hemolítica, se realizaron de acuerdo con la metodología descrita en la sección 2.2.3,

capítulo 2.

Toxicidad sobre larvas de mosquito

Se utilizaron larvas L4 de Ae. aegypti, de acuerdo con la metodología descrita

previamente en la sección 2.2.3, capítulo 2. El péptido BTM-P1(D) se utilizó como control

a una concentración de 7,5 μM.

Microscopía óptica

Se estudiaron los cambios histopatológicos en el intestino de larvas de cuarto estadio

después de 8 h de exposición a CBYH3(D) 125 µM y BTM-P1(D) 7,5 µM. El

https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/

https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/

https://heliquest.ipmc.cnrs.fr/

79

procesamiento de las muestras se realizó siguiendo la metodología de Silva-Zacarin y

cols. [192] con modificaciones. Se extrajeron intestinos completos y se fijaron en

paraformaldehído al 4%: glutaraldehído al 1% en solución salina tamponada con fosfato

0,1 M (pH 7,4), luego se incubaron a temperatura ambiente durante 4 h. Las muestras se

deshidrataron en una serie de etanol frío en un rango de 30% a 100% (30%, 50%, 70%,

85% y 100%) y se mantuvieron durante 40 min en cada solución. Posteriormente, las

muestras se depositaron en una solución que contenía 50% de xileno: 50% de etanol

durante 1 h, xileno 100% 1 h y luego se embebieron en parafina. Se cortaron secciones

longitudinales de 5 µm utilizando un ultramicrotomo (HM 325, Thermo Scientific ™) y se

tiñeron con solución hematoxilina-eosina de Harris. Las muestras se examinaron y

fotografiaron utilizando un microscopio Olympus (BX53) y el software cellSens.

Marcaje immunogold y microscopía electrónica de transmisión (TEM)

Se extrajeron intestinos completos provenientes de larvas de Ae. aegypti de cuarto

estadio expuestas durante 4 h a BTM-P1(Db) 7,5µM o CBYH3(Db) 125 µM (conjugados

con biotina) y se dividieron en región media anterior y media posterior, para ser se fijados

en una solución de formaldehído al 4%: 1% glutaraldehído en PBS (pH 7,4) a 4 ° C

durante toda la noche. Luego, se lavaron por 2 x 15 min en PBS suplementado con

NH4Cl para remover aldehídos, y en buffer sacarosa-maleato (ácido maleico 0,2 M,

NaOH 2N, sacarosa 3,5 M, pH 6,0) 3 x 15 min para eliminar los fosfatos. Las muestras se

deshidrataron utilizando concentraciones crecientes de metanol frío (30% -100%) durante

40 min a 4 ° C en cada solución. La región intestinal media fue embebida en resina LR-

Gold (Ted Pella, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se cortaron

secciones ultrafinas en un ultramicrotomo Leica EM UC7, se recogieron en rejillas de

níquel y se bloquearon con BSA (albúmina de suero bovino) al 1% en buffer PBS durante

1 h a temperatura ambiente. Las secciones se incubaron con anticuerpo anti-botina

(levantado en cabra) conjugado con partículas de oro de 20 nm (BBI-Solutions, Reino

Unido), a una dilución de 1:100 durante 45 min a temperatura ambiente. Como ensayo de

control, se incubaron secciones de intestino medio de larvas sin tratamiento con péptidos,

con el conjugado anti-botina. Las secciones ultrafinas se tiñeron con acetato de uranilo al

2% v/v y solución de Reynolds de citrato de plomo. Posteriormente se examinaron con un

microscopio electrónico de transmisión Tecnai F20 Super Twin TMP.


Los cortes para microscopía óptica y las fotografías de las placas se llevaron a cabo en el

Laboratorio de Patología Animal de la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad de

Antioquia. Los cortes y análisis de las muestras para microscopía TEM se realizaron en

el Centro de Microscopía avanzada de la Sede de Investigación de Universitaria SIU de

la Universidad de Antioquia.

Resultados y Discusión

Predicción de péptidos

De acuerdo con las condiciones establecidas se obtuvo un dataset de 73 hélices (Tabla

4.1) para las cuales se calcularon las propiedades fisicoquímicas convencionales en

relación con el diseño de péptidos. 42% de las hélices son de carga negativa, 21% carga

igual a 0 y 37% carga positiva. El porcentaje de hidrofobicidad fue igual o menor al 50%

en el 80% de las hélices. Los valores promedio, máximo y mínimo para cada propiedad

se muestran en la tabla 4.2. Los parámetros calculados para todo el set de datos se

encuentra en la tabla I del anexo C.

Se determinó la probabilidad de actividad biológica de cada secuencia estableciendo

como punto de corte valores de 0,8. De las 73 secuencias analizadas ocho pasaron el

punto de corte para la actividad anticáncer y seis para la actividad antimicrobiana.

Solamente dos secuencias cumplieron junto con estas condiciones, el criterio de

hemólisis menor a 0,5 (Tabla 4.3). Estas secuencias corresponden a la hélice 3 de la

toxina Cyt2Aa1 (residuos 107-122, carga neta 0, % hidrofobicidad 56) y la hélice 2 de la

toxina Cyt2Ba (residuos 74-90, carga +1, % hidrofobicidad 56). Para corroborar que estas

hélices no fueran péptidos previamente reportados, se realizaron alineamientos de

secuencia contra los péptidos disponibles en la base de datos APD3, encontrando

similitudes de apenas 30% a 35% con péptidos de actividad biológica conocida. Los

alineamientos con los péptidos con alguna similitud se muestran en la figura 4.1. El

resultado de la predicción de actividad para todas las hélices se encuentra en la tabla II

del anexo C.

La hélice 1CBY|3, en adelante denominada péptido CBYH3, fue seleccionada para los

ensayos de actividad biológica.

81

Tabla 4.1: Data set de hélices del dominio I de toxinas Cry y hélices de Cyt.

Toxina ID Secuencia

Cry1Aa PDB|1CIY|2 AGFVLGLVDIIWGIFGPSQWDAFLVQIEQLI PDB|1CIY|3 EFARNQAISRLEGLSNLYQIYAESFREWEA PDB|1CIY|4 PALREEMRIQFNDMNSALTTAIPLL PDB|1CIY|5 QVPLLSVYVQAANLHLSVLRDVSVF PDB|1CIY|6 AATINSRYNDLTRLIGNYTDYAVRWYNTGLERV PDB|1CIY|7 SRDWVRYNQFRRELTLTVLDIVALFSNY

Cry1Ac PDB|4ARX|4 NPALREEMRIQFNDMNSALTTAI PDB|4ARX|5 LLSVYVQAANLHLSVLRDVSVFGQRWG PDB|4ARX|7 DSRDWVRYNQFRRELTLTVLDIVA

Cry4Aa PDB|2C9K|2 IGFGTLIPVLFPAQDQSNTWSDFITQTKNIIK PDB|2C9K|3 ASTYISNANKILNRSFNVISTYHNHLKT PDB|2C9K|4 DVRTQIQLVHYHFQNVIPELVNS PDB|2C9K|5 NPSDCDYYNILVLSSYAQAANLHLTVLNQAVKFEAYLK PDB|2C9K|6 YYPVLTKAIEDYTNYCVTTYKKGLNLIK PDB|2C9K|7 NWNTYNTYRTKMTTAVLDLVA

Cry4Ba PDB|4MOA|3 NLIDQTVTAYVRTDANAKMTVVKDYLDQYTTKFNTWKR PDB|4MOA|4 NQSYRTAVITQFNLTSAKLRETAVYFSN PDB|4MOA|5 LLPIYAQVANFNLLLIRDGLINAQEWS PDB|4MOA|6 GDQLYNTMVQYTKEYIAHSITWYNKGLDVLRNK PDB|4MOA|7 QWITFNDYKREMTIQVLDILALF

Cry2Aa PDB|1I5P|2 ILSELWGIIFPSGSTNLMQDILRETEQFLN PDB|1I5P|3 NTDTLARVNAELIGLQANIREFNQQVDNFLN PDB|1I5P|4 LSITSSVNTMQQLFLNRL PDB|1I5P|5 YQLLLLPLFAQAANMHLSFIRDVILNADEWG PDB|1I5P|6 SAATLRTYRDYLRNYTRDYSNYCINTYQTAFRG PDB|1I5P|7 LHDMLEFRTYMFLNVFEYVSIWS

Cry3Bb PDB|1JI6|2 SFYQSFLNTIWPSDADPWKAFMAQVEVLID PDB|1JI6|3 EEYAKSKALAELQGLQNNFEDYVNALNSWKKT PDB|1JI6|4 SKRSQDRIRELFSQAESHFRNSM PDB|1JI6|5 FEVLFLPTYAQAANTHLLLLKDAQVFG PDB|1JI6|6 SSEDVAEFYHRQLKLTQQYTDHCVNWYNVGLNGL PDB|1JI6|7 TYDAWVKFNRFRREMTLTVLDLIV

Cry3A PDB|1DLC|2 FGGALVSFYTNFLNTIWPSEDPWKAFMEQVEALMD PDB|1DLC|3 ADYAKNKALAELQGLQNNVEDYVSALSSWQKN PDB|1DLC|4 NPHSQGRIRELFSQAESHFRNSM PDB|1DLC|5 FLTTYAQAANTHLFLLKDAQIYG PDB|DLC|6 EKEDIAEFYKRQLKLTQEYTDHCVKWYNVGLDKL PDB|DLC|7 SYESWVNFNRYRREMTLTVLDLIA

Cyt2Ba PDB|2RCI|1 YIAQAIRLTNTFQGAIDPLTLNFNFEKALQIANGL PDB|2RCI|2 VSVMISQIKEIIRSVLG PDB|2RCI|3 SANFWNSVVSAITNTFT

Cry8Ea PDB|3EB7|2 LVGPIVSLYSTLIDVLWPGGKSQWEIFMEQVEALIN PDB|3EB7|3 AEYARAKALAELEGLGNNYQLYLTALEEWQE PDB|3EB7|4 STRVLRDVRNRFEILDSLFTQYM PDB|3EB7|5 LLSVYAQAANLHLLLLKDASIFG PDB|3EB7|6 STTAINNYYNRQMSLIAQYSDHCVQWYRTGLDR PDB|3EB7|7 NAKQWVEYNRFRREMTLSVLDIMTL

Cry11Bb Q9ZIU51|2 PALIAVAPIAKYLATALAKWALKQGFAKLKS Q9ZIU51|4 PATAKTHFLNMSNLLIQRLPQ Q9ZIU51|5 GVSISLFTQMCTLHLGLLKDGILAG Q9ZIU51|6 PEDKDSLICQFNRYVNEYNTRMMGLYSIEF


Q9ZIU51|7 LNEALNFRNMCSLYVFPFSEA

Cry11Ba Q457301|2 LIAVAPIAKYLATALAKWAVKQGFAKLKSE Q457301|4 TGTANRLFFDTSNQLISRLPQ Q457301|5 VSISLFTQMCTFHLGLLKDGILAG Q457301|6 ADKDALICQFNRFVNEYNTRLMVLYSKEFGRL Q457301|7 LNEALNFRNMCSLYVFPFSEAW

Cry10Aa P09662|2 ANVWQDLLNIGGRPIQEIDKNIINVLTSIVTPIKNQLDK P09662|3 AKAVHDLFTTLEPIIDKDLDMLK P09662|4 IPTLPAYAQIATWHLNLLKHAATYYNIW P09662|5 NSSNYYQGYLKRKIQEYTDYCIQTYNAGLTMI P09662|6 NATWNMYNTYRLEMTLTVLDLIAIF

Cry16Aa Q45882|3 IDDVVYRFKDVNSICENNINEF Q45882|4 EVTVLPIYMQIANLHLLLLRDGMIYGDAW Q45882|5 FSDQDSFYNHVLDKTKFYINDCLNYYNTGLSNL Q45882|6 NNSWIDITRYCRFMTFYILDMISI

Cry19Aa O32307|2 VRAGLGKGLGIVSTIVGFFGGSIILDTIGLFYQISELL O32307|4 TGNLSTLVTKFTALDSDFNGAIRTV O32307|5 ELLLLPVYAQIANLHLLLLRDAQIYGDKW O32307|6 ANARDNYYQIQLEKTKEYTEYCINWYNKGLND O32307|7 WVNFNRYRREMTLTVLDIISMF

Cyt2Aa PDB|1CBY|3 ISVMVEQLKKIIQEVL PDB|1CBY|4 TSFWNSVEATIKGT

El ID corresponde al código de acceso en PDB o UniProt, seguido del número de hélice en la secuencia del dominio de cada toxina.

Tabla 4.2: Resumen propiedades fisicoquímicas del data set de hélices Cyt y Cry.

Propiedad Valor promedio Valor máximo Valor mínimo

Tamaño 27,49 39 14

Peso molecular 3187,29 4514 1545

Carga neta -0,19 5 -4

Hidrofobicidad (% 43,33 61 24

Anfipaticidad 0,39 0,85 0

Punto Isoeléctrico 6,74 11,01 3,5

Tabla 4.3: Resultados de la predicción de actividad de los péptidos seleccionados según los criterios de predicción de los servidores CAMPR3, HemoPI y AntiCP.

ID P. Anticáncer P. Hemólisis ID P. Antimicrobiano P. Hemólisis

PDB|1CBY|3 1,0 0,49 Q9ZIU51|2 0,97 0,53

PDB|1CBY|4 1,0 0,49 Q457301|2 0,96 0,54

PDB|4ARX|4 0,87 0,47 PDB|1CBY|3 0,88 0,49

Q45882|3 0,84 0,49 PDB|2RCI|2 0,86 0,49

Q457301|4 0,84 0,49 O32307|2 0,84 0,57

PDB|2RCI|2 0,82 0,49 Q9ZIU51|5 0,83 0,6

PDB|1I5P|7 0,81 0,47 - - -

PDB|1JI6|5 0,8 0,5 - - -

Resaltadas en amarillo las secuencias que cumplieron con todos los criterios de selección.

83

Figura 4.1: Alineamiento entre las secuencias seleccionadas y péptidos bioactivos reportados en la base de datos APD3.

I-tasser realiza un modelamiento estructural con base en la información depositada en la

base de datos PDB. Por lo tanto, el servidor arrojó como resultado la estructura helicoidal

que corresponde al segmento de la toxina Cyt2Aa depositada en PDB bajo el código

1CBY (Figura 4.2a). Esta conformación fue validada experimentalmente caracterizando la

estructura en solución de TFE 30% por el método de Dicroísmo Circular (DC) (Figura

4.2b). Así mismo, de acuerdo con el diagrama de la rueda helical CBYH3 tiende a

adoptar una conformación de hélice anfipática donde los residuos con carga K y E se

ubican formando un dominio opuesto al núcleo hidrofóbico (Figura 4.2c).

Ya se ha discutido previamente que la anfipaticidad y la hidrofobicidad son determinantes

para la inserción de péptidos en las membranas celulares y los residuos catiónicos para

la interacción con lípidos aniónicos. Sin embargo, los altos porcentajes de hidrofobicidad

también son una característica recurrente en otros péptidos con una carga neta igual a

cero, así como la afinidad por membranas de células bacterianas y eucariotas [193,194].

(a) modelamiento por homología del péptido CBYH3. (b) el espectro de DC del péptido CBYH3

muestra el comportamiento de una alfa-hélice. (c) diagrama de rueda helical.

Figura 4.2: Caracterización estructural el péptido CBYH3.

a b

c


CBYH3 inhibe el crecimiento celular de la línea C6/c36 pero no es hemolítico

Se determinó la actividad insecticida de CBYH3 en sus formas L y D aminoácidos a partir

de ensayos de viabilidad sobre la línea C6/C36 con el método de reducción de

resazurina. Ambas isoformas inhibieron el crecimiento celular, con valores de

concentración inhibitoria (CI50) de 29,5 μM (I.C95% [28,0 μM – 32,1μM]) para la forma L y

28,7μM (I.C95% [27,3 μM – 30,2 μM]) para la forma D. Ninguna de las isoformas fue

hemolítica a la concentración máxima ensayada sobre las células (100 μM). La viabilidad

celular del cultivo de linfocitos tratados con CBYH3 L y D, se mantuvo por encima del

80% a la concentración máxima evaluada de 100 μM (Figura 4.3).

A diferencia del tratamiento control (BTM-P1(D), 7,5 µM), el cual provoca rigidez y

oscurecimiento de todo el cuerpo en larvas moribundas, las larvas expuestas a

CBYH3(D) presentaron natación errática y excreción de gran cantidad de gránulos

fecales iniciando 3 h después del tratamiento, seguido de muertes lentas, hasta 48 h de

expuestas a dosis de 150 µM (Figura 4.3). En las larvas control mantenidas en agua

destilada, no se observaron residuos fecales ni muertes.

Los efectos histopatológicos de BTM-P1(D) y CBYH3(D) en larvas de Ae. aegypti

evidencian daños en el tejido intestinal epitelial

En las larvas de mosquito, el mesenterón o intestino medio está compuesto por una sola

capa de células epiteliales que se divide en ciegos gástricos, intestino medio anterior y

posterior (Figura 4.4). El lumen intestinal está separado del tejido epitelial por una matriz

peritrófica tipo II formada por al menos tres capas de una película tubular que se secreta

de manera constante [195,196].

85

a, viabilidad celular línea C6/C36, b, viabilidad celular de linfocitos humanos, c,

sobreviviencia de larvas de Ae. aegypti en estadio L4

Figura 4.3: Actividad biológica de CBYH3 sobre linfocitos humanos, células y larvas de mosquito

a b

b

c

b



En las larvas del grupo de control los ciegos gástricos se ven bien desarrollados y el

epitelio del intestino medio muestra una apariencia inalterada. Las microvellosidades

epiteliales, las membranas basales, el núcleo y la matriz peritrófica se observan en las

figuras 4.5a,b. El tratamiento con CBYH3(D) causó la desintegración de la estructura del

intestino y alteraciones de la matriz peritrófica (Figuras 4.5c,d). El tratamiento con BTM-

P1(D) ocasionó el colapso del tejido intestinal epitelial, la degradación del núcleo,

vacuolización del citoplasma y la pérdida de los contactos intercelulares (Figura 4.5e). La

fragilidad de la estructura no permitió realizar montajes del intestino completo debido al

daño causado por el tratamiento con BTM-P1(D).

Con el marcaje Immunogold fue posible localizar los péptidos enlazados a biotina en el

tejido del intestino utilizando anticuerpos anti biotina conjugados con oro. 4 h después del

tratamiento, los péptidos CBYH3(D) y BTM-P1(D) se encontraron asociados a la matriz

peritrófica dando como resultado pérdida de su espesor en comparación con los

tratamientos control (Figuras 4.6 a,c,e). CBYH3(D) causó hinchazón mitocondrial,

degeneración de las microvellosidades celulares del intestino medio anterior y

proyecciones citoplasmáticas hacia el espacio ectoperitrófico (Figura 4.6 d). Por su parte,

BTM-P1 (D), también se encontró asociado a las mitocondrias y a las microvellosidades

de la membrana, confirmando además los daños severos a la composición del

citoplasma (Figura 4.6 f).

La matriz peritrófica en las larvas de mosquito es una matriz acelular semipermeable de

espesor constante, sintetizada continuamente por las células del cardia. Está compuesta

por quitina, glicoproteínas y proteínas que rodean el contenido intestinal, lo que permite

Figura 4.4: Esquema del intestino de larvas de Ae. aegypti.

87

el movimiento selectivo de enzimas digestivas y pequeñas moléculas desde la luz

intestinal hasta las células epiteliales digestivas [197]. El tráfico molecular depende del

grosor y la porosidad de la membrana peritrófica, que a su vez depende de las proteínas

digestivas asociadas y de las condiciones de pH en el intestino medio del insecto. Este

trabajo no es suficiente para suponer una interacción entre péptidos y componentes de la

matriz peritrófica; sin embargo, el daño tisular causado por BTM-P1 (D) y CBYH3 (D)

mostró un aparente adelgazamiento de la matriz peritrófica, sugiriendo alteraciones en la

síntesis de sus componentes debido al daño celular. La matriz peritrófica es permeable a

partículas de 148 Da y menores [198], facilitando el paso de BTM-P1 de 2.79 kDa y

Vista general del intestino de larvas sin tratamiento(a), magnificación 200x. (b) células cilíndricas del

intestino medio posterior de larvas no tratadas, magnificación 1000x. (c) secciones del intestino

completo y (d) medio posterior de larvas a las 8 h de tratamiento con CBYH3(D) 125 µM. Se evidencia

la pérdida de la integridad de la matriz peritrófica y la densidad celular a lo largo del tejido.

Figura 4.5: Perfil histopatológico de larvas L4 de Ae. aegypti tratadas con los péptidos BTM-P1(D) y CBYH3(D).


magnificación 200x. (e) Vacuolización del citoplasma y degradación del núcleo en células de la región

media posterior a las 8 h de tratamiento con BTM-P1(D), magnificación 1000x. (CG) ciegos gástricos

(AMG), intestino medio anterior (PMG) intestino medio posterior (EP) células epiteliales (BB)

microvellosidades celulares apicales (BM) membrana basal (ECS) espacio ectoperitrófico (PM) matriz

peritrófica (Lu), lumen intestinal (N) núcleo (V) vacuolas.

El péptido CBYH3 de 1.87 kDa, puede tener un rápido acceso al espacio ectoperitrófico

donde los péptidos no pueden ser digeridos por proteasas y se favorece el contacto con

las células epiteliales a lo largo del intestino medio. Además, la evidencia histopatológica

sobre los efectos de BTM-P1(D) y CBYH3(D) indica alteraciones del intestino medio

epitelial asociadas a la desregulación de la homeostasis intestinal. Estas alteraciones

incluyen la pérdida de la integridad de la matriz peritrófica y de las microvellosidades

apicales celulares y signos claros de citotoxicidad como vacuolización e hinchazón

mitocondrial, similares a los encontrados en larvas expuestas a extractos naturales

activos por vía oral como alcaloides, acetogeninas [199–201], y toxinas Cry completas

[202].

Debido a su naturaleza modular, es posible entender una proteína como un conjunto de

péptidos naturalmente ensamblados para una función específica que en el contexto del

diseño de péptidos se pueden aislar y modificar para convertirlos en disruptores de

membrana con un espectro de actividad variable. Así por ejemplo, la hélices de las

toxinas Cyt en conjunto interactúan con lípidos de membrana no saturados, como

fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina y esfingomielina [203] y aunque no son lo

suficientemente largas para atravesar la bicapa de la membrana, se ha propuesto como

uno de sus mecanismos de acción el modelo de detergente, en el cual las toxinas se

agregan y son absorbidas en la superficie de la membrana causando defectos

específicos en el empaquetamiento de lípidos [204,205] (discutido en [206]). Aunque no

es comparable el efecto cooperativo de las hélices de la toxina completa con la acción de

un segmento particular, el estudio de las características biofísicas de las hélices

individuales podría indicar su capacidad para inducir la formación de curvaturas

Gaussianas negativas en los lípidos de membrana mediante las cuales ocurren los

procesos de permeabilización y formación de poros [189].

89

La toxicidad en mamíferos es una posible desventaja de los péptidos biológicamente

activos que deben evaluarse con respecto a su uso como insecticidas. Por lo tanto, el

ensayo de hemólisis en glóbulos rojos humanos es uno de los métodos más utilizados

para establecer la actividad citotóxica directamente relacionada con la lisis de la

membrana celular, así como para evaluar la capacidad de los péptidos para interactuar

con membranas eucariotas. BTM-P1 causa daño celular, incluida la lisis de los glóbulos

rojos, lo que está de acuerdo con su mayor hidrofobicidad y carga, mientras que CBYH3

no presentó actividad hemolítica incluso a las altas concentraciones necesarias para

causar daño celular en comparación con BTM-P1, mientras que las toxinas Cyt

completas si lo son. Por lo tanto, es razonable suponer que CBYH3 podría unirse a un

dominio lipídico particular en células de insectos, aunque también podría actuar sobre un

blanco intracelular alternativo, incluida la unión o inhibición de la síntesis de ácidos

nucleicos o actividades enzimáticas.


(a) corte ultrafino del intestino medio de larvas de mosquito sin exposición a los conjugados

péptido-biotina. Se observa la matriz peritrófica inalterada compuesta por al menos tres capas

(aumento 1,10 Kx). (b) las microvellosidades celulares apicales completas, y mitocondrias sanas,

en la región de transición entre el intestino medio anterior y posterior (aumento 5,00 Kx). (c, d)

tejido del intestino medio anterior de larvas expuestas a 125 µM de CBYH3 (D) durante 4 h. Las

flechas indican partículas de oro asociadas con la matriz peritrófica adelgazada y mitocondrias

inflamadas (aumento de 2,10 Kx). (e, f) Tejido del intestino medio anterior de larvas expuestas a

Figura 4.6: Localización de BTM-P1(D) y CBYH3(D) en el células epiteliales del

intestino medio de larvas L4 de Ae. aegypti.

91

7,5 µM de BTM-P1 (D) durante 4 h. Las flechas señalan las partículas de oro asociadas con las

mitocondrias. Nótese la pérdida de las microvellosidades apicales (aumento 2,10 Kx, 4,00 Kx).

Conclusiones

Hélices de 26 y 16 residuos aisladas de las toxinas insecticidas Cry11Bb1 y Cyt2Aa1

difieren en sus propiedades fisicoquímicas y en afinidad por los eritrocitos humanos. Sin

embargo, al mismo tiempo, son tóxicos para las larvas de Ae. Aegypti y células de Ae.

albopictus. El daño causado por los péptidos BTM-P1 y CBYH3 en las células epiteliales

del intestino medio y la membrana peritrófica sugiere que otros péptidos alfa helicoidales

cortos podrían ser potencialmente valiosos para ampliar el espectro de insecticidas

basados en péptidos naturales.

5. Conclusiones y recomendaciones

Conclusiones finales

En el desarrollo de este trabajo fue posible:

1. Diseñar análogos al péptido insecticida BTM-P1, con potencial actividad sobre células

y larvas de mosquitos y actividad hemolítica reducida. Proponiendo una metodología con

base en el uso de predictores de actividad biológica y simulación molecular para para el

estudio de propiedades fisicoquímicas dependientes de la estructura 3D.

2. La creación de un data set de hélices derivadas de toxinas insecticidas y la validación

de una de estas secuencias (péptido CBYH3) como insecticida para el modelo Aedes.

Data set que puede ser utilizado posteriormente para la validación de actividades

biológicas alternativas sobre otros organismos blanco.

3. La construcción de un modelo de interacción péptido-membrana mediante simulación

por dinámica con el método CG-Martni, que permitió corroborar la hipótesis de formación

de poros toroidales como mecanismo de acción del péptido BTM-P1.

4. La observación del daño celular causado por CBYH3 y BTM-P1 en el intestino de

larvas de mosquito.

Recomendaciones

Todavía no existe una estrategia eficaz para predecir la interrelación precisa de los

parámetros fisicoquímicos que intervienen en la interacción péptido membrana. Sin

embargo los métodos de predicción de actividad biológica permiten asignar

probabilidades a estas interacciones más allá de la categorización de acuerdo a los


parámetros convencionales de tamaño, carga e hidrofobicidad que si bien son

determinantes de la actividad biológica, no son suficientes para la búsqueda de péptidos

efectivos para blancos poco estudiados en el contexto de los péptidos alfa-helicoidales,

como el modelo Aedes. Por ejemplo, en nuestro caso, de haber considerado únicamente

estos parámetros no habríamos llegado al péptido CBYH3 en razón a su tamaño y carga

cero. Por lo tanto, es importante considerar que los predictores son indicadores de

interacción con membranas, pero esta no se correlaciona con la potencia o la

selectividad de tal manera que es necesario ampliar el panel de organismos a evaluar en

el laboratorio, antes de descartar el uso potencial de los candidatos que se obtienen con

estos métodos.

Así mismo, evidenciamos la utilidad de las herramientas bioinformáticas y de simulación

molecular para el estudio y diseño de péptidos con actividad biológica. Sin embargo, es

necesario incluir experimentos in vitro sobre medidas biofísicas para soportar los

resultados in silico en cuanto a la estructura como también reconducir la búsqueda de

nuevos péptidos de acuerdo con la composición lipídica de las membranas blanco e

incluir otras propiedades fisicoquímicas para la construcción de nuevos predictores.

A. Anexo Péptidos adicionales evaluados sobre larvas de Ae. aegypti, durante la ejecución del proyecto

Nombre Secuencia Z H L Cmax M V.cel

H1 KTLRSRNAWFGYVRKFMSFVVV 5 50 22 200 0 NA

H2 TLRSRNAWFGYVRKF 4 40 15 200 20 97

TmP1 RRALPGRAGHTPTFNVFSSAWAPAG 3 40 25 200 20 94

C47 990-1005 LKTKIQLAFALYRHRNS 4 40 17 200 10 100

C47 989-1009 LKTKIQLAFALYRHRNSIQN 4 40 20 200 10 100

C4Cb145-168 TTAVKNVKKHLNVWLKTPNQANA 4 39 23 200 10 100

C4Cb147-167 VKNVKKHLNVWLKTPNQANA 4 40 20 200 0 100

C4Cb147-168 AVKNVKKHLNVWLKTPNQANA 4 42 21 200 10 NA

C4Cb147-172 AVKNVKKHLNVWLKTPNQANARTVA 5 44 24 200 20 NA

Y IATLISWIKNKRKQRPRVAL 6 50 20 100 0 NA

K.1 IARIIRGNFLKAWRKVQKRAK 8 47 21 100 0 NA

Z.1 IGKEFKRIVQRIKDFLRNLV 4 45 20 100 10 NA

Z.2 FFRKSKWKIGKIFKRIVQRIK 9 43 21 100 10 NA

B LATLVKQWQRNMRKVLRPV 5 47 19 100 20 NA

C LRNLKGLWRNIKSLLKMVHVT 5 47 21 100 10 NA

D AKYLATALAKWALKQGFAKLKS 5 54 22 100 0 NA

E GVGIKRFKTAVNKFHVKAVK 7 45 20 100 0 NA

Microcina MRTGNAD 1 28 7 120 0 93

Indolicidina ILPWKWPWWPWRR 4 53 13 120 20 NA

Tripticina VRRFPWWWPFLRR 4 53 13 120 0 94


PW2 HPLKQYWWRPSI 2 33 12 120 0 100

Magainina 2 GIGKFLHSAKKFGKAFVGEIMNS 3 43 23 50 0 100

Lucifensina ATCDLLSGTGVKHSACAAHCLLRGNRGGYCNGRAICVCRN 4 45 40 100 0 100

PG1 VAPIAKYLAK(d)ALAKWALKQ 4 63 19 100 0 100

PG2 VAPIAKYLAKALAKWALKQ 4 63 19 100 10 100

PG3 VAPIAKYLATALAKWALKQ 3 63 19 100 0 100

PG4 VAPIAKYLAT(d)ALAKWALKQ 3 63 19 100 0 100

PG5 VAPIAKYLARALAKWALKQ 4 63 19 100 0 100

PG6 GIFSKLGRKKIKKYLAKALAKWALK 9 48 25 100 20 91

Péptidos disponibles como parte de otros proyectos desarrollados en el laboratorio de Prospección y diseño de biomoléculas, que fueron evaluados como insecticidas sobre larvas L3 y L4 de Ae.aegypti. (Z) carga, (H)% hidrofobicidad, (L) longitud, (Cmax) concentración µM máxima evaluada. (M) % de mortalidad 24 horas después de tratamiento con la Cmax. (V.cel %) Porcentaje de viabilidad sobre la línea celular C6/C36 de Ae. albopictus, a la concentración máxima evaluada 50 µM. (N.A) no evaluados sobre el modelo celular.

B. Anexo: Parámetros utilizados en los experimentos de simulación por Dinámica Molecular

Tabla I: Condiciones del sistema para la simulación all atom en solvente implícito, campo de fuerza ff14SB,AMBER16.

Medio hidrofóbico Implícito de Agua

Min

imiz

ació

n Imin=1, ntx=1

irest=0 maxcyc=2000 ncyc=1000 ntpr=100

ntwx=0 cut=999. Extdiel=20 igb=2.

imin=1 ntx=1 rest=0 maxcyc=2000 ncyc=1000 ntpr=100

ntwx=0 cut=999 igb=2

Cale

nta

mie

nto

Imin=0 ntx=1 irest=0, nstlim=300000 dt=0.002 ntf=2 ntc=2 tempi=10.0, temp0=300.0, ntpr=10000, ntwx=1000 cut=999. Ntb=0 ntp=0 ioutfm=1

restraint_wt=1.0 restraintmask=@CA'

,C,O,N,H' ntt=3 gamma_ln=2.0 nmropt=1 ig=-1 Igb=2 extdiel=20,&wt type='TEMP0' istep1=0 istep2=200000 value1=0.0 value2=300.0 &wt type='END'

Imin=0 ntx=1 irest=0 nstlim=300000 dt=0.002 ntf=2 ntc=2 tempi=10.0, temp0=300.0, ntpr=10000 ntwx=1000 cut=999. Ntb=0 ntp=0 ioutfm=1

restraint_wt=1.0 restraintmask=@CA',

C,O,N,H' ntt=3 gamma_ln=2.0 nmropt=1 ig=-1 Igb=2 type='TEMP0' istep1=0 istep2=200000 value1=0.0 value2=300.0 &wt type='END'

Pro

ducció

n

Imin=0 ntx=5 irest=1 nstlim=1000000000 dt=0.002 ntf=2 ntc=2 temp0=300.0 ntpr=1000000

ntwx=1000000 cut=999. Ntb=0 ntp=0 ntt=3 gamma_ln=2.0 ig=-1 igb=2 extdiel=20

Imin=0 ntx=5 irest=1 nstlim=1000000000 dt=0.002 ntf=2 ntc=2 temp0=300.0 ntpr=1000000

ntwx=1000000 cut=999. Ntb=0 ntp=0 ntt=3 gamma_ln=2.0 ig=-1 igb=2

about:blank

98 Diseño y evaluación de péptidos insecticidas para el control de Aedes

aegypti

Tabla II: Condiciones del sistema Péptido-Membrana para la simulación CG, campo MARTINI.

integrator = md

tinit= 0.0

dt = 0.020

nsteps = 50000000

nstxout = 50000

nstvout = 50000

nstfout = 50000

nstlog = 5000

nstenergy = 5000

nstxout-compressed = 50000

compressed-x-precision = 100

cutoff-scheme = Verlet

nstlist = 20

ns_type = grid

pbc = xyz

verlet-buffer-tolerance = 0.005

epsilon_r = 2.5

coulombtype = reaction-field

rcoulomb = 1.1

vdw_type = cutoff

vdw-modifier = Potential-shift-verlet

rvdw = 1.1

tcoupl = v-rescale

tc-grps = PW POPE POPC CHOL ION Protein

tau_t = 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

ref_t = 310 310 310 310 310 310

; Pressure coupling:

Pcoupl = Parrinello-rahman

Pcoupltype = semiisotropic

tau_p = 12.0

compressibility = 3e-4 3e-4

ref_p = 1.0 1.0

gen_vel = no

gen_temp = 310

refcoord_scaling = all

#using Lincs.

constraints = none

#Type of constraint algorithm:

constraint_algorithm = Lincs

#Do not constrain the start configuration:

unconstrained_start = no

#Highest order in the expansion of the constraint coupling matrix:

lincs_order = 4

#Lincs will write a warning to the stderr if in one step a bond rotates over

#more degrees than:

lincs_warnangle = 30

C. Anexo. Propiedades fisicoquímicas y predicción de actividad biológica de las hélices Cry y Cyt.

Tabla I. Propiedades fisicoquímicas del data set de hélices Cry y Cyt.

ID Secuencia P. Hemolítico P. Anticáncer P. Antimicrobiano

Q9ZIU51|2 PALIAVAPIAKYLATALAKWALKQGFAKLKS 0,53 0,71 0,965

Q457301|2 LIAVAPIAKYLATALAKWAVKQGFAKLKSE 0,54 0,74 0,958

PDB|1CBY|3 ISVMVEQLKKIIQEVL 0,49 1,04 0,88

PDB|2RCI|2 VSVMISQIKEIIRSVLG 0,49 0,82 0,856

O32307|2 VRAGLGKGLGIVSTIVGFFGGSIILDTIGLFYQISELL 0,57 0,72 0,838

Q9ZIU51|5 GVSISLFTQMCTLHLGLLKDGILAG 0,6 0,54 0,83

PDB|3EB7|5 LLSVYAQAANLHLLLLKDASIFG 0,51 0,74 0,777

Q457301|5 VSISLFTQMCTFHLGLLKDGILAG 0,59 0,76 0,739

P09662|2 ANVWQDLLNIGGRPIQEIDKNIINVLTSIVTPIKNQLDK 0,5 0,74 0,725

PDB|1DLC|3 ADYAKNKALAELQGLQNNVEDYVSALSSWQKN 0,16 0,76 0,534

PDB|4ARX|5 LLSVYVQAANLHLSVLRDVSVFGQRWG 0,82 0,75 0,456

Q9ZIU51|4 PATAKTHFLNMSNLLIQRLPQ 0,5 0,75 0,443

PDB|1CIY|2 AGFVLGLVDIIWGIFGPSQWDAFLVQIEQLI 0,52 0,8 0,435

PDB|2C9K|3 ASTYISNANKILNRSFNVISTYHNHLKT 0,49 0,78 0,418

PDB|4MOA|5 LLPIYAQVANFNLLLIRDGLINAQEWS 0,53 0,72 0,4


aegypti

PDB|1I5P|3 NTDTLARVNAELIGLQANIREFNQQVDNFLN 0,82 0,72 0,379

PDB|2RCI|1 YIAQAIRLTNTFQGAIDPLTLNFNFEKALQIANGL 0,5 0,73 0,375

PDB|1JI6|5 FEVLFLPTYAQAANTHLLLLKDAQVFG 0,5 0,8 0,354

PDB|2RCI|3 SANFWNSVVSAITNTFT 0,49 0,74 0,333

PDB|1JI6|3 EEYAKSKALAELQGLQNNFEDYVNALNSWKKT 0,18 0,76 0,325

P09662|4 IPTLPAYAQIATWHLNLLKHAATYYNIW 0,49 0,79 0,318

PDB|3EB7|3 AEYARAKALAELEGLGNNYQLYLTALEEWQE 0,49 0,77 0,297

O32307|5 ELLLLPVYAQIANLHLLLLRDAQIYGDKW 0,85 0,71 0,292

PDB|2C9K|2 IGFGTLIPVLFPAQDQSNTWSDFITQTKNIIK 0,51 0,71 0,257

PDB|1DLC|5 FLTTYAQAANTHLFLLKDAQIYG 0,49 0,73 0,25

Q457301|6 ADKDALICQFNRFVNEYNTRLMVLYSKEFGRL 0,45 0,75 0,233

PDB|1CIY|5 QVPLLSVYVQAANLHLSVLRDVSVF 0,82 0,75 0,228

PDB|1CIY|3 EFARNQAISRLEGLSNLYQIYAESFREWEA 0,47 0,71 0,226

O32307|4 TGNLSTLVTKFTALDSDFNGAIRTV 0,83 0,76 0,209

P09662|5 NSSNYYQGYLKRKIQEYTDYCIQTYNAGLTMI 0,48 0,71 0,205

Q45882|3 IDDVVYRFKDVNSICENNINEF 0,49 0,84 0,18

P09662|3 AKAVHDLFTTLEPIIDKDLDMLK 0,48 0,8 0,172

PDB|1DLC|4 NPHSQGRIRELFSQAESHFRNSM 0,48 0,65 0,137

O32307|6 ANARDNYYQIQLEKTKEYTEYCINWYNKGLND 0,48 0,73 0,134

PDB|4ARX|6 DAATINSRYNDLTRLIGNYTDYAVRWYNTGLERV 0,81 0,76 0,133

PDB|1CIY|6 AATINSRYNDLTRLIGNYTDYAVRWYNTGLERV 0,82 0,74 0,13

PDB|4ARX|7 DSRDWVRYNQFRRELTLTVLDIVA 0,49 0,65 0,127

PDB|2C9K|6 YYPVLTKAIEDYTNYCVTTYKKGLNLIK 0,16 0,77 0,124

PDB|3EB7|2 LVGPIVSLYSTLIDVLWPGGKSQWEIFMEQVEALIN 0,51 0,74 0,123

PDB|1I5P|6 SAATLRTYRDYLRNYTRDYSNYCINTYQTAFRG 0,49 0,76 0,119

PDB|1I5P|2 ILSELWGIIFPSGSTNLMQDILRETEQFLN 0,49 0,77 0,116

PDB|1I5P|4 LSITSSVNTMQQLFLNRL 0,49 0,69 0,102

101

PDB|1JI6|4 SKRSQDRIRELFSQAESHFRNSM 0,48 0,66 0,1

PDB|4MOA|4 NQSYRTAVITQFNLTSAKLRETAVYFSN 0,49 0,79 0,094

Q457301|4 TGTANRLFFDTSNQLISRLPQ 0,49 0,84 0,085

PDB|2C9K|5 NPSDCDYYNILVLSSYAQAANLHLTVLNQAVKFEAYLK 0,48 0,75 0,085

PDB|2C9K|4 DVRTQIQLVHYHFQNVIPELVNS 0,15 0,74 0,08

PDB|4ARX|4 NPALREEMRIQFNDMNSALTTAI 0,47 0,87 0,074

PDB|1CBY|4 TSFWNSVEATIKGT 0,49 1,02 0,072

PDB_3EB7_7 NAKQWVEYNRFRREMTLSVLDIMTL 0,49 0,73 0,072

PDB|1JI6|6 SSEDVAEFYHRQLKLTQQYTDHCVNWYNVGLNGL 0,47 0,73 0,072

PDB|1I5P|5 YQLLLLPLFAQAANMHLSFIRDVILNADEWG 0,51 0,76 0,071

Q45882|6 NNSWIDITRYCRFMTFYILDMISI 0,49 0,71 0,065

PDB_1CIY_7 SRDWVRYNQFRRELTLTVLDIVALFSNY 0,49 0,77 0,063

PDB_3EB7_6 STTAINNYYNRQMSLIAQYSDHCVQWYRTGLDR 0,48 0,76 0,06

PDB|4MOA|6 GDQLYNTMVQYTKEYIAHSITWYNKGLDVLRNK 0,49 0,68 0,058

PDB|1JI6|7 TYDAWVKFNRFRREMTLTVLDLIV 0,49 0,72 0,055

PDB|DLC|6 EKEDIAEFYKRQLKLTQEYTDHCVKWYNVGLDKL 0,48 0,75 0,052

PDB|1CIY|4 PALREEMRIQFNDMNSALTTAIPLL 0,48 0,75 0,046

PDB|4MOA|3 NLIDQTVTAYVRTDANAKMTVVKDYLDQYTTKFNTWKR 0,5 0,72 0,045

PDB|DLC|7 SYESWVNFNRYRREMTLTVLDLIA 0,48 0,63 0,042

PDB|4MOA|7 QWITFNDYKREMTIQVLDILALF 0,5 0,74 0,038

Q9ZIU51|6 PEDKDSLICQFNRYVNEYNTRMMGLYSIEF 0,44 0,77 0,036

Q45882|5 FSDQDSFYNHVLDKTKFYINDCLNYYNTGLSNL 0,48 0,76 0,036

PDB|3EB7|4 STRVLRDVRNRFEILDSLFTQYM 0,83 0,79 0,034

Q9ZIU51|7 LNEALNFRNMCSLYVFPFSEA 0,48 0,76 0,028

Q45882|4 EVTVLPIYMQIANLHLLLLRDGMIYGDAW 0,83 0,73 0,028

O32307|7 WVNFNRYRREMTLTVLDIISMF 0,49 0,7 0,027

PDB|2C9K|7 NWNTYNTYRTKMTTAVLDLVA 0,49 0,73 0,023

Q457301|7 LNEALNFRNMCSLYVFPFSEAW 0,47 0,76 0,022

103

PDB|2C9K|7 NWNTYNTYRTKMTTAVLDLVA 21 2476 1 38 0,28 8,83

P09662|4 IPTLPAYAQIATWHLNLLKHAATYYNIW 28 3284 1 50 0,27 8,77

PDB|1CIY|6 AATINSRYNDLTRLIGNYTDYAVRWYNTGLERV 33 3881 1 33 0,33 8,76

PDB|4MOA|6 GDQLYNTMVQYTKEYIAHSITWYNKGLDVLRNK 33 3964 1 30 0,55 8,62

Q457301|6 ADKDALICQFNRFVNEYNTRLMVLYSKEFGRL 32 3856 1 43 0,56 8,48

PDB|3EB7|6 STTAINNYYNRQMSLIAQYSDHCVQWYRTGLDR 33 3970 1 30 0,37 8,48

P09662|5 NSSNYYQGYLKRKIQEYTDYCIQTYNAGLTMI 32 3844 1 25 0,45 8,4

PDB|1DLC|5 FLTTYAQAANTHLFLLKDAQIYG 23 2600 0 47 0,32 7,09

PDB|3EB7|5 LLSVYAQAANLHLLLLKDASIFG 23 2471 0 60 0,27 7,09

PDB|1CIY|5 QVPLLSVYVQAANLHLSVLRDVSVF 25 2769 0 56 0,25 7,09

Q457301|5 VSISLFTQMCTFHLGLLKDGILAG 24 2565 0 54 0,25 7,06

Q9ZIU51|5 GVSISLFTQMCTLHLGLLKDGILAG 25 2588 0 52 0,24 7,06

PDB|DLC|7 SYESWVNFNRYRREMTLTVLDLIA 24 2978 0 41 0,4 6,53

PDB|4ARX|7 DSRDWVRYNQFRRELTLTVLDIVA 24 2967 0 41 0,49 6,51

P09662|2 ANVWQDLLNIGGRPIQEIDKNIINVLTSIVTPIKNQLDK 39 4386 0 41 0,46 6,51

PDB|1CBY|3 ISVMVEQLKKIIQEVL 16 1871 0 56 0,73 6,49

PDB|2RCI|1 YIAQAIRLTNTFQGAIDPLTLNFNFEKALQIANGL 35 3881 0 48 0,31 6,42

O32307|2 VRAGLGKGLGIVSTIVGFFGGSIILDTIGLFYQISELL 38 3926 0 50 0,22 6,42

PDB|1CBY|4 TSFWNSVEATIKGT 14 1541 0 35 0,35 6,35

PDB|2C9K|2 IGFGTLIPVLFPAQDQSNTWSDFITQTKNIIK 32 3595 0 40 0,34 6,31

O32307|4 TGNLSTLVTKFTALDSDFNGAIRTV 25 2642 0 40 0,24 6,31

Q45882|6 NNSWIDITRYCRFMTFYILDMISI 24 3017 0 50 0,2 6,28

PDB|2C9K|4 DVRTQIQLVHYHFQNVIPELVNS 23 2750 -1 39 0,43 6,02

PDB|2RCI|3 SANFWNSVVSAITNTFT 17 1859 0 47 0 5,88

PDB|DLC|6 EKEDIAEFYKRQLKLTQEYTDHCVKWYNVGLDKL 34 4205 -1 32 0,85 5,65

O32307|5 ELLLLPVYAQIANLHLLLLRDAQIYGDKW 29 3393 -1 55 0,38 5,39

PDB|2C9K|5 NPSDCDYYNILVLSSYAQAANLHLTVLNQAVKFEAYLK 38 4291 -1 44 0,32 5,39

PDB|1JI6|5 FEVLFLPTYAQAANTHLLLLKDAQVFG 27 3021 -1 55 0,32 5,33

PDB|1JI6|6 SSEDVAEFYHRQLKLTQQYTDHCVNWYNVGLNGL 34 4030 -2 32 0,44 5,32


aegypti

PDB|1JI6|3 EEYAKSKALAELQGLQNNFEDYVNALNSWKKT 32 3704 -1 34 0,67 5,01

O32307|6 ANARDNYYQIQLEKTKEYTEYCINWYNKGLND 32 3963 -1 25 0,6 4,95

PDB|1DLC|3 ADYAKNKALAELQGLQNNVEDYVSALSSWQKN 32 3569 -1 37 0,52 4,79

P09662|3 AKAVHDLFTTLEPIIDKDLDMLK 23 2627 -2 47 0,57 4,76

PDB|4ARX|4 NPALREEMRIQFNDMNSALTTAI 23 2636 -1 43 0,36 4,68

PDB|1CIY|4 PALREEMRIQFNDMNSALTTAIPLL 25 2846 -1 48 0,33 4,68

PDB|1CIY|3 EFARNQAISRLEGLSNLYQIYAESFREWEA 30 3592 -2 40 0,52 4,66

PDB|1I5P|7 LHDMLEFRTYMFLNVFEYVSIWS 23 2942 -2 52 0,27 4,66

PDB|4MOA|7 QWITFNDYKREMTIQVLDILALF 23 2859 -1 52 0,41 4,56

Q45882|5 FSDQDSFYNHVLDKTKFYINDCLNYYNTGLSNL 33 3954 -2 30 0,3 4,56

PDB|1I5P|5 YQLLLLPLFAQAANMHLSFIRDVILNADEWG 31 3574 -2 58 0,24 4,54

Q9ZIU51|7 LNEALNFRNMCSLYVFPFSEA 21 2466 -1 52 0,23 4,54

Q457301|7 LNEALNFRNMCSLYVFPFSEAW 22 2652 -1 54 0,22 4,54

Q45882|4 EVTVLPIYMQIANLHLLLLRDGMIYGDAW 29 3359 -2 55 0,21 4,54

Q9ZIU51|6 PEDKDSLICQFNRYVNEYNTRMMGLYSIEF 30 3678 -2 33 0,44 4,52

PDB|4MOA|5 LLPIYAQVANFNLLLIRDGLINAQEWS 27 3086 -1 55 0,22 4,38

P09662|6 NATWNMYNTYRLEMTLTVLDLIAIF 25 3008 -1 52 0,14 4,38

PDB|1I5P|3 NTDTLARVNAELIGLQANIREFNQQVDNFLN 31 3532 -2 41 0,35 4,32

PDB|3EB7|3 AEYARAKALAELEGLGNNYQLYLTALEEWQE 31 3558 -4 41 0,51 4,21

Q45882|3 IDDVVYRFKDVNSICENNINEF 22 2647 -3 40 0,38 4,11

PDB|1I5P|2 ILSELWGIIFPSGSTNLMQDILRETEQFLN 30 3466 -3 43 0,28 4,01

PDB|3EB7|2 LVGPIVSLYSTLIDVLWPGGKSQWEIFMEQVEALIN 36 4047 -3 50 0,27 4,01

PDB|1JI6|2 SFYQSFLNTIWPSDADPWKAFMAQVEVLID/ 30 3520 -3 50 0,24 3,84

PDB|1DLC|2 FGGALVSFYTNFLNTIWPSEDPWKAFMEQVEALMD 35 4056 -4 48 0,24 3,84

PDB|1CIY|2 AGFVLGLVDIIWGIFGPSQWDAFLVQIEQLI 31 3446 -3 61 0,16 3,5

Peso molecular en kDa; Porcentaje de Hidrofobicidad (%H): Porcentaje de residuos hidrofóbicos en la secuencia; punto Isoeléctrico calculado a pH 7.0; anfipaticidad magnitud de la suma vectorial de la hidrofobicidad de cada aminoácido.

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