UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MEXICOFACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZA

MANUAL DE TECNICAS BASICAS PARA EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

MODULO: APARATO DIGESTIVOCICLO ll DE LA CARRERA DE MEDICINA

DIAGNOSTICO DE AMIBIASIS

Práctica No. 16

OBJETIVOS

1.- El alumno conocerá la importancia del estudio de amibiasis como uno de los principales problemas de salud en México.

2.- El alumno conocerá la importancia del método directo para la identificación de amibiasis.

3.- El alumno conocerá los reservorios de Entamoeba hystolítica.

4.- El alumno conocerá el ciclo vital de Entamoeba hystolítica.

5.- El alumno será capaz de utilizar el método directo para la identificación de Entamoeba hystolítica.

6.- El alumno conocerá la aplicación del método directo en el diagnóstico en la práctica de campo.

7.- El alumno será capaz de identificar los trofozoítos de Entamoeba hystolítica en preparaciones con lugol parasitológico y solución salina.

8.- El alumno será capaz de identificar quistes de Entamoeba hystolítica en preparaciones con lugol parasitológico y solución salina.

9.- El alumno conocerá los medios de cultivo y sus indicaciones.

10.- El alumno será capaz de diferenciar morfológicamente a otras especies de Entamoeba hystolítica

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Introducción

Notas históricas y geográficas.- Entamoeba hystolítica fue descubierta por Locsh (1875) en las heces de un enfermo de disentería en San Petersburgo (hoy Lenningrado) Rusia, aunque Losch al hacer la autopsia de ese paciente, halló los trofozoítos de la ameba en las úlceras del colon y con las heces sanguinolentas

inoculó per rectum a un perro y le produjo disentería, no llegó a sospechar la relación de causa a efecto entre la ameba y la colitis aguda. Posteriormente las investigaciones de Kartulis (1886) en el Cairo; de Hlava (1887) en Praga y de Councilman y Lafleur (1891) en Baltimore, suministraron las pruebas clínicas y anatomopatológicas de que Entamoeba hystolítica es el agente causal de un tipo de disentería y de absceso hepático.

En 1893 Quincke y Roos descubrieron los quistes y Schaudinn en 1903 dio a la especie el nombre de Entamoeba hystolítica y la diferenció de la ameba común del colon ( Entamoeba coli). Diez años después, Walker y Sellards en las Filipinas, obtuvieron pruebas de personas voluntarias de que Entamoeba hystolítica es la causa de la colitis amebiana y que Entamoeba coli es un comensal inocuo del intestino grueso. Entamoeba hystolítica se ha encontrado en todas las poblaciones del mundo en las que ha sido buscada. Es más frecuente en los trópicos y zonas subtropicales que en los climas fríos, pero en las poblaciones carentes de higiene de las zonas templadas y subárticas la frecuencia de ésta parasitosis es tan elevada como en los trópicos.

Reservorios animales

La infección natural por Entamoeba hystolítica se observa en monos, perros y posiblemente en cerdos, pero la importancia de éstos animales como fuente de contagio para el hombre es mínima, comparada con la del mismo humano.

Morfología biología y ciclo vital

Entamoeba hystolítica pasa por las siguientes fases en su ciclo vital:

Trofozoíto.- Los trofozoítos vivos tienen dimensiones variables que fluctúan entre 10 y 60 micras de diámetro, según el grado de actividad y otras condiciones. Las amebas presentes en las heces disentéricas recién evacuadas son por lo general relativamente grandes y las presentes en las heces pastosas de portadores asintomáticos no son mayores que los trofozoítos de Endolimax nana.

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La locomoción del trofozoíto activo es bastante notable, tal como se ve en los microorganismos obtenidos de heces disentéricas, diarreicas o en amebas cultivadas.

En medio de cultivo transparente se ve, a veces cómo las amebas ascienden por las paredes del tubo. Los movimientos se deben a la formación de

prolongaciones pseudopódicas digitiformes largas o redondeadas y anchas del ectoplasma, en cuyo interior influye el endoplasma.

Aunque la dirección de los movimientos cambia con rapidez en respuesta a las variaciones del microclima, en un momento dado un pseudópodo progresa en una dirección y casi de manera instantánea se retrae, mientras se forman otros y cambia el sentido de desplazamiento.

El movimiento puede ser continuo e intermitente, tal vez parezca errático y rara vez se mantiene en línea recta. El protoplasma de Entamoeba hystolítica se diferencia en un ectoplasma externo claro y un endoplasma central finamente granulado en el que se observan a veces vacuolas digestivas; En el trofozoíto vivo ocasionalmente cabe observar el núcleo por delante del centro de la masa protoplasmática.

En microorganismos fijados con la técnica de Schaudinn y teñidos con hematoxilina férrica, puede estudiarse mejor su estructura. El núcleo es esférico y su diámetro es aproximadamente la quinta parte del de la ameba completa; contiene un pequeño cariosoma central claramente visible rodeado de un halo incoloro y fijo a la superficie interna de la membrana nuclear por un gran número de fibrillas radiadas acromáticas.

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Tapiza a ésta membrana una masa de cromatina que con frecuencia se distribuye en pequeños gránulos redondeados y a veces forma placas de mayor tamaño. La membrana en sí es delgada y el nucleoplasma es más viscoso que el endoplasma. En las heces disentéricas, las vacuolas digestivas, suelen contener hematíes en proceso de digestión, aunque no constituyen un elemento esencial

de éstas amebas. El citoplasma contiene lisosomas de superficie, partículas de glucógeno, ribosomas cristaliformes de partículas dispuestas en forma helicoidal en pilas o en bastones.

Enquistamiento

En condiciones naturales no se produce enquistamiento en los tejidos. En la luz del colon y en condiciones aún no conocidas, el trofozoíto amebiano elimina alimentos no digeridos y se condensa en una masa esférica que constituye el prequiste. Produce luego una cubierta resistente y relativamente delgada y queda formado el quiste inmaduro. En éste estadio se forma un solo núcleo similar al del trofozoíto y el prequiste.

El diámetro de los quistes oscila entre 10 y 20 micras con una media de 12 o 13 micras. Los quistes de Entamoeba hystolítica suelen ser esféricos, aunque, también pueden ser subesféricos u ovoides. Los quistes maduran por dos divisiones mitóticas consecutivas del núcleo, que dan lugar a 4 núcleos, cada uno de los cuales es una réplica del núcleo original, al iniciarse el enquistamiento.

Durante ese proceso de maduración se consume el glucógeno y los cromatoidales se hacen menos visibles o desaparecen. En raras ocasiones se encuentran hasta ocho núcleos en los quistes maduros.

El quiste es sumamente resistente a las condiciones del medio y a los jugos del tubo digestivo. Pueden sobrevivir en las heces por lo menos 8 días a temperaturas que oscilan entre 20 y 40 ºC y durante 40 días a los 2 y 6 ºC, resistiendo incluso temperaturas de congelación. Soportan las concentraciones de cloro en el agua purificada, pero pueden ser destruidos por los procedimientos de filtración y por el método de electrólisis, así como la ebullición, yodo y ácido acético.

A veces se observa el núcleo y con mayor frecuencia los cromatoidales en los quistes sin teñir. En las preparaciones frescas teñidas con yodo, el glucógeno se colorea de amarillo oscuro y cuando no se sobretiñen las preparaciones, pueden verse fácilmente los núcleos, en los que el cariosoma y cromatina periférica aparecen como puntos brillantes de luz amarilla que contrasta con el amarillo pardo más oscuro del nucleoplasma.

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En las preparaciones teñidas con hematoxilina férrica, el núcleo y los cromatoidales se tiñen de azul intenso, mientras que las vacuolas de glucógeno no se colorean. Los trofozoítos no se enquistan en las heces una vez evacuadas, en materias fecales semiformadas es posible encontrar prequistes uninucleados

binucleados o tetranucleados, mientras que en las heces formadas lo normal es encontrar quistes maduros, es decir con 4 núcleos. Los quistes con uno, dos y cuatro núcleos constituyen la forma infectante para el siguiente huésped.

Entamoeba hystolítica puede diferenciarse de Entamoeba coli por algunas características morfologías particulares. El trofozoíto de Entamoeba coli es de menor tamaño, oscila entre las 10 y 50 micras, aunque no es muy significante en la diferenciación, los trofozoítos se observan, por lo general, como una masa ovoidea con pseudópodos muy cortos y relativamente anchos, el ectoplasma tiene aspecto viscoso y no es posible diferencias del endoplasma. Los quistes de Entamoeba coli son muy pequeños, miden entre 3 y 10 micras y es muy frecuente que contengan hasta 16 núcleos esta característica es la de mayor importancia para su diferenciación con Entamoeba hystolíica.

Entamoeba Hartmanni.- También es patógena para el hombre y es capaz de producir cuadros intestinales similares a los de Entamoeba hystolítica, se le conoce como la raza pequeña de Entamoeba hystolítica. Se le identifica por el tamaño de los trofozoítos maduros que miden entre 4 y 12 micras. Los quistes también son muy pequeños entre 5 y 10 micras y poseen uno o dos núcleo.

Desenquistamiento

El desenquistamiento se ha observado “in vitro “en condiciones que se aproximan a la ameba del tubo digestivo.

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Una vez que el quiste llega a la boca y es deglutido, pasa por el estómago y penetra en el intestino delgado, sin experimentar cambios morfológicos aparentes mientras se encuentra en lugares en donde la reacción del medio es ácida pero tan pronto como el medio en que se encuentra es neutro o ligeramente

alcalino, adquiere una gran actividad, que combinada posiblemente con el efecto de los jugos digestivos, debilita la pared del quiste y permite que la ameba multinucleada (metaquiste) emerja del quiste.

De forma casi inmediata, el citoplasma se divide en tantas partes como núcleos tiene, de tal manera que cada núcleo pasa a ser el centro de un pequeño trofozoíto metaquístico. Así del proceso de desenquistamiento derivan cuatro pequeñas amébulas.

Colonización

Los trofozoítos metaquísticos de Entamoeba hystolítica no colonizan el intestino delgado, sino que son transportados con el contenido fecal hacia el ciego, donde pueden llegar a establecerse si su número es suficiente para que uno o varios de ellos entren en contacto con la mucosa o se alojen en las criptas glandulares. Una vez que las pequeñas amebas comienzan a alimentarse y crecer se transforman en trofozoítos normales y se completa el ciclo del desarrollo.

Patología

Entamoeba hystolítica es única entre las amibas parásitas del hombre por su poder invasor de los tejidos, de donde se desprende lo adecuado del nombre de la especie, variedad hystolítica. Una vez que los pequeños trofozoítos metaquísticos se han desarrollado a partir del metaquiste, su crecimiento y reproducción comienzan probablemente en el ciego, donde los datos clínicos, patológicos y experimentales con que se cuenta hasta el momento, indican que las amebas tienen la primera oportunidad de colonización.

Factores de patogenicidad.- La colonización depende de varios factores, entre los que figura el número de trofozoítos activos inicialmente, si son muchos, la posibilidad de que alguno de ellos entre en contacto con la mucosa o se aloje en las criptas glandulares durante un periodo de tiempo lo bastante largo para alimentarse y evolucionar hasta convertirse en trofozoíto de tamaño normal y multiplicarse, es relativamente grande.

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Los anatomopatólogos han encontrado en ocasiones úlceras amebianas en el colon de personas que durante su vida no habían presentado síntomas claros

de colitis. Un número apreciable de casos de hepatitis amebiana y abscesos hepáticos se desarrollan en sujetos que carecen de historia previa de colitis amebiana.

Algunas cepas de ésta ameba que tienen índice de patogenicidad bajo, en particular las que permanecen largo tiempo en una comunidad (es decir cepas homólogas), viven superficialmente en las criptas glandulares del intestino grueso erosionando la superficie de la mucosa. En condiciones favorables para el huésped se establece un equilibrio y el sujeto portador no presenta ninguna manifestación patológica característica.

De 23 voluntarios humanos infectados que se sometieron a observación durante un periodo de 9 a 14 meses, siete se curaron espontáneamente tras haber estado eliminando quistes por las heces de forma regular durante un periodo de tres semanas a dos meses (Beaver y cols.). Cuando se desarrolla un bajo umbral de resistencia como consecuencia de distintas alteraciones, es posible la invasión real de los tejidos, con la consiguiente aparición de sintomatología clínica.

Epidemiología

La amebiasis es más frecuente en regiones tropicales, climas cálidos y templados, pero más aún en áreas pobres y mal saneadas. En el ámbito mundial, está catalogada como la tercera parasitosis causante de muerte. "Alrededor del 10 a 20 % de la población mundial se considera infectada y el 10 % de ésta sufre la enfermedad, con una letalidad que oscila entre el 0.1 y 0.25 %."

En México, la Amibiasis intestinal ocupó la tercera causa de morbilidad general desde 1995 hasta 1999 con un promedio de 1,525,003 casos nuevos por cada año. En el año 2000, la amibiasis pasó a ocupar la cuarta causa de morbilidad general con 1,348,718 casos.

En el presente siglo XXl, en el año 2001, esta parasitosis ocupó la quinta causa de morbilidad general con 1,250,186 casos nuevos. En los años 2002 y 2003 la amibiasis ocupó la quinta causa de morbilidad general , en el año 2002 se presentaron 1,151,507. En el 2003, se presentaron 1,013, 535 casos nuevos.

Aunque la tendencia indica una disminución de casos por año, la amibiasis intestinal sigue siendo un gran problema de salud.

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Diagnóstico Entamoeba hystolítica

El diagnóstico de amebiasis intestinal es sugerido por el cuadro clínico y epidemiológico y se confirma mediante la demostración de la E. histolytica en las heces o los tejidos.

Las infecciones por Entamoeba histolytica que pueden ser asintomáticas o causar malestar abdominal leve, que se alterna con períodos de estreñimiento, puede producir también cuadros clínicos severos como: diarrea sanguinolenta mucoide o disentería aguda fulminante con fiebres y escalofríos que producen la muerte. La colitis fulminante se presenta principalmente en lactantes con desnutrición avanzada y el cuadro clínico es el anterior pero con datos de peritonitis por perforaciones y las ocasionadas por el estado toxiinfeccioso.

La apendicitis amibiana no se puede diferenciar de otros tipos de apendicitis por medios clínicos. El ameboma es raro en niños y se presenta con mayor frecuencia en adultos jóvenes, está caracterizado por diarrea mucosanguinolenta y se palpa un tumor abdominal.

Diagnóstico por el método directo (observación de heces fecales recientes). El método directo es el mas antiguo, probablemente ANTON VAN

LEEWENHOEK, a mediados del siglo XVII, fue de los primeros en utilizarlo, al observar y encontrar en sus propias heces fecales trofozoítos de Giardia lamblia.

El método tiene entre sus características, sencillez, rapidez, bajo costo y poco material. Con este método se examinan de inmediato las preparaciones en fresco de heces líquidas y semiformadas recientes, en busca de trofozoítos móviles y quistes.

Utilidad.- Ha sido el método indicado como excelente para búsqueda de trfozoítos, en la práctica ha demostrado su eficacia, cuando se utiliza lugol para la búsqueda e identificación de quistes, huevos y larvas.

Limitaciones.- La muestra es tan pequeña que es poco representativa.

Cultivos.- Los cultivos de Entamoeba hystolítica podrían estar indicados en los casos en que no fueran identificadas a satisfacción las formas parasitarias. Sin embargo, para que los cultivos resulten positivos, la muestra debe contener grandes cantidades de trofozoítos. Los medios de cultivo usados con mayor frecuencia son el de Cleveland-Collier y el difásico de Dobell, en anaerobiosis.

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Material método para la práctica de laboratorio.

Material- Portaobjetos de 25 x 95 mm.- Cubreobjetos de 22 x 22 mm.- Pipeta Pasteur con bulbo.- Mechero de Bunsen.- Aplicadores de madera, palillos o abatelenguas.- Muestra de materia fecal recién evacuada o cultivo de E. Hystolítica.- Microscopio compuesto.

Método1.- En un portaobjetos, se colocan separadamente una gota de solución salina y otra de lugol.2.- Con el aplicador de madera, se toma una muestra de 1 a 4 miligramos de heces y se mezcla con la solución salina, haciendo una suspensión homogénea.3.- Con el mismo aplicador, se retiran las fibras y otros fragmentos gruesos.4.- Se coloca el cubreobjetos sobre el portaobjetos con la preparación..5.- Se efectúa la misma operación en la gota de lugol.6.- Se tienen listas las preparaciones para observar al microscopio.

Trofozoítos.- Las amebas suelen mostrarse con mas facilidad en los copos sanguinolentos de moco de las heces miden entre 10 y 60 micras de diámetro, adoptan varias formas que pueden ser alargadas, ovoides en que se pueden observar los pseudópodos ondulantes o digitiformes. con la tinción de lugol toman un color amarillo pardo a café claro.

Quistes.- El diámetro de los quistes oscilan entre 10 y 20 micras. Los quistes de Entamoeba hystolítica suelen ser esféricos, aunque, también pueden ser subesféricos u ovoides En las preparaciones frescas teñidas con yodo, el glucógeno de los quistes se colorea de amarillo oscuro y cuando no se sobretiñen las preparaciones, pueden verse fácilmente los núcleos, de uno a cuatro, en los que el cariosoma y cromatina periférica aparecen como puntos brillantes de luz amarilla que contrasta con el amarillo pardo más oscuro del nucleoplasma.

Forma de reportar.- La preparación con solución salina sirve para identificar y reportar el hallazgo de trofozoítos. La preparación con lugol sirve para reportar el hallazgo de quistes huevos y larvas. Precauciones.- La materia fecal es potencialmente infectante, por lo tanto, se tendrán los cuidados necesarios para su manejo.

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En los pacientes sintomáticos, la proctoscopía permite a menudo mostrar lesiones en la mucosa. Hay que efectuar siempre una aspiración de las lesiones y un examen del material obtenido en busca de trofozoítos. El diagnóstico de amebiasis extraintestinal es más difícil.

En general el examen de las heces es negativo y rara vez puede demostrarse la presencia de trofozoítos en material purulento. En algunos casos con sospecha clínica de absceso hepático amebiano el único método de diagnóstico que tiene alguna utilidad es la administración de prueba con amebicidas. Las pruebas serológicas ofrecen resultados positivos en casi todos los enfermos con absceso hepático amebiano, y en mas del 80% de los que tienen disentería amebiana aguda. Las pruebas con mayor grado de sensibilidad que se dispone son la hemoaglutinación indirecta y la de inmunoabsorción de tipo enzimático (ELISA).

Tratamiento

Amebiasis Aguda

Metronidazol 30 a 50 mgs. por kilo por día en 3 tomas durante 7 a 10 días.Tinidazol 50 a 75 mgs. por kilo por día 1sola toma por día x 2 días.Diyodohidroxiquenoleina 30-40 mgs. por kilo por día (1800 mgs.) 3 veces al día durante 10 días

Absceso hepático amibiano

Emetina Clorhidrato 1 mg. por kilo por día sin rebasar 60 mgs. 1 inyección x 5 días.Metronidazol 30-50 mgs. por kilo por día en 3 tomas x 5-10 días.

A pesar de la importancia de la enfermedad como problema de salud pública, se cuenta con un número relativamente reducido de medicamentos para el tratamiento de la disentería y el absceso hepático amibianos. La mayoría de ellos con un margen terapéutico estrecho y con diversos efectos secundarios en el hombre. Además, han aparecido informes de resistencia de E. histolytica a algunos de los fármacos antiamibianos más usuales en la práctica médica.

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CUESTIONARTIO

1.- Mencione la utilidad del diagnóstico de amibiasis por el método directo.

2.- Describa el ciclo biológico de Entamoeba hystolítica.

3.- Describa la técnica del método directo para el diagnóstico de amibiasis.

4.- Describa la morfología del trofozoíto de Entamoeba hystolítica con la tinción de lugol.

5.- Describa las características de los quistes maduros de Entamoeba hystolítica.

EXAMENES COPROPARASITOSCOPICOS.

Práctica 17

OBJETIVOS

1.- El alumno conocerá la importancia de las enfermedades parasitarias como problema de salud social en México.

2.- El alumno conocerá la importancia del diagnóstico de laboratorio de las enfermedades parasitarias.

3.- El alumno conocerá la clasificación de los exámenes coproparasitoscópicos.

4.- El alumno será capaz de aplicar los métodos mas frecuentes para el diagnóstico parasitológico.

5.- El alumno será capaz de identificar las formas parasitarias mediante la observación al microscopio.

Justificación

En México las enfermedades parasitarias que afectan al aparato digestivo son muy frecuentes debido a las condiciones de pobreza extrema, marginación social, mal saneamiento, sin control de fauna nociva y doméstica, con pésimos métodos de eliminación de basura con depósitos urbanos y suburbanos, con un gran porcentaje de poblaciones sin agua potable. Las complicaciones como oclusión intestinal por masas de Ascaris, perforación de la pared intestinal por Entamoeba hystolítica, obstrucción del apéndice por Ascariasis o Enterobiasis, prolapso rectal y anemia por Trichuriasis y la migración a otros tejidos que pueden causar pancreatitis, colecistitis, abscesos hepáticos y Sx. De Loeffler que ponen en riesgo la vida de los enfermos.

La ascariasis es una parasitosis cosmopolita causada por Ascaris lumbricoides, nemátodo intestinal que produce cuadros clínicos con anorexia, bruxismo, dolor abdominal, diarreas, constipación, prurito nasal o anal, urticaria, perforación intestinal con afección pulmonar. La ascariasis afecta a lactantes hasta en un 20%, a un 42% de los preescolares y hasta un 41% de los escolares.

En la república Mexicana existen poblaciones en las que hasta el 98% de la población general se encuentra afectada. En el año 2005 se reportaron 173,414 casos de ascariasis a la Dirección General de Epidemiología SSA.

La amibiasis intestinal es una infección causada por Entamoeba hystolítica, protozoo invasor de la mucosa del intestino grueso que produce cuadros clínicos que se caracterizan por un síndrome diarreico con moco y sangre, acompañados de pujo y tenesmo rectal. La disentería con anemia, perforación intestinal, ameboma, absceso hepático amibiano o amibiasis extraintestinal son complicaciones que ponen en riesgo la vida. La amibiasis intestinal en México afecta al 29% de la población general.

La Enterobiasis es una parasitosis exclusiva del hombre, de distribución mundial y de las más frecuentes, se estima que afecta a más de 400 millones de personas a nivel mundial, lo que representa alrededor del 10% de la población total. En México la frecuencia es variable por estados de la República, desde el 25 % hasta el 80% de la población total, en el año 2005 se reportaron 27,151 casos a la Dirección General de Epidemiología SSA.

El estudio coproparasitoscópico es definitivo para el diagnóstico y tratamiento de las parasitosis

Exámenes coproparasitoscópicos.

Un examen coproparasitoscópico es el estudio de la materia fecal para la búsqueda e identificación de formas parasitarias.

Los métodos coproparasitoscópicos se pueden dividir en: cualitativos y cuantitativos; Los primeros se usan para saber que formas parasitarias existen y los segundos en que número se encuentran.

Los métodos cuantitativos se utilizan sobre todo en helmintiasis, uncinariasis y otras parasitosis.

Los métodos cualitativos siguen diversas rutinas para su elaboración, en función de esto habrá unos que exijan mayor manipulación que otros, como ejemplo de los primeros están los métodos de concentración y en los otros el examen directo es un buen ejemplo. Enseguida se describirán las diversas técnicas de los exámenes coproparasitoscópicos cualitativos.

EXAMENES COPROPARASITOSCOPICOS CUALITATIVOS

(1).- EXAMEN DIRECTO

Antecedentes.- Este método es el mas antiguo, por los datos históricos que se tienen en relación a los primeros microscopios, probablemente ANTON VAN LEEWENHOEK, a mediados del siglo XVII, fue de los primeros en utilizarlo, al observar y encontrar en sus propias heces fecales trofozoítos de Giardia lamblia.

El método tiene entre sus características, la sencillez y rapidez para llevarlo a cabo, además de la economía que representa ya que es el método que requiere menos material.

Utilidad.- Ha sido el método indicado como excelente para búsqueda de trfozoítos, en la práctica ha demostrado su eficacia, cuando se utiliza LUGOL para búsqueda e identificación de quistes, huevos y larvas.

Limitaciones.- La muestra es tan pequeña que es poco representativa.

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Material

a).-Reactivos

Cloruro de sodio, agua destilada, yodo cristaloide, yoduro de potasio.

b).-Soluciones

1.- Solución salina isotónica

- Cloruro de sodio....... 8.5 g.

- Agua destilada c.b.p. 1000 ml.

- Se coloca el cloruro de sodio en un matraz volumétrico y se completa el volumen.

2.- Lugol parasitológico (Solución madre)

- Yodo cristaloide........... 5 g.

- Yoduro de potasio.......... 10 g.

- Agua destilada............ 100 ml.

Se disuelve el yoduro de potasio en el agua y enseguida se agrega el yodo, agitando constantemente para que se disuelva la mayor cantidad posible, se guarda en un frasco ámbar, procurando que todo el exceso que queda en el fondo también se vacíe en el frasco, esto se hace para que la solución permanezca con la concentración deseada, durante mucho tiempo.

3.- Solución de trabajo

- Solución madre de lugol... 1 volumen.

- Agua destilada..............…. 1 volumen.

Se mezcla la solución madre con el agua destilada y se guarda la solución en un frasco gotero ámbar.

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c).-Vidriería

- Portaobjetos de 25 x 95 mm.

- Cubreobjetos de 22 x 22 mm.

- Pipeta Pasteur con bulbo.

d).-Aparatos (equipo)

- Microscopio compuesto.

- Otros: Aplicador de madera, palillos o abatelenguas.

Método

1.- En un portaobjetos, se colocan separadamente una gota de solución salina y otra de lugol.

2.- Con el aplicador de madera, se toma una muestra de 1 a 4 miligramos de heces y se mezcla con la solución salina, haciendo una suspensión homogénea.

3.- Con el mismo aplicador, se retiran las fibras y otros fragmentos gruesos.

4.- Se coloca el cubreobjetos.

5.- Se efectúa la misma operación en la gota de lugol.

6.- Se tiene lista la preparación para observar al microscopio.

Forma de reportar.- La preparación con solución salina sirve para identificar y reportar el hallazgo de trofozoítos. La preparación con lugol sirve para reportar el hallazgo de quistes huevos y larvas.

PRECAUCIONES.- La materia fecal es potencialmente infectante, por lo tanto, se tendrán los cuidados necesarios para su manejo.

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TECNICAS CUALITATIVAS DE FLOTACION

(2).- EXAMEN COPROPARASITOSCOPICO (CPS) DE FLOTACION CON SOLUCION DE SACAROSA

Utilidad.- Técnica que se utiliza en casos de emergencia, cuando no se tiene otro tipo de reactivos a la mano. Este procedimiento se puede utilizar en el campo.

Limitaciones.- La solución de sacarosa atrae moscas, provocando las molestias consiguientes.

Material

a).- Reactivos

- Sacarosa (azúcar común).- Agua de la llave (?).

b).- Soluciones

1.- Solución de sacarosa con densidad de 1.180.- Se hace un jarabe de sacarosa y se va diluyendo hasta lograr la densidad deseada.2.- Lugol parasitológico (ver método directo).

c).- Vidriería

- Frasco de 50 ml. de boca ancha.- Cubreobjetos de 22 x 40 mm.- Portaobjetos de 25 x 75 mm.

d).- Aparatos (equipo)

- Densímetro graduado de 1.100 a 1.200- Microscopio compuesto.

e).- Otros

- Abatelenguas o aplicadores de madera.

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Método

1.- Se realiza una suspensión de aproximadamente un gramo de materia fecal, en el frasco de boca ancha, con una poca de la solución de sacarosa, hasta lograr una suspensión homogénea.

2.- Se llena, agitando con el abatelenguas, el frasco hasta el tope, con la solución.

3.- Se coloca el cubreobjeto en la boca del frasco de manera que quede en contacto con la solución evitando en lo posible la formación de burbujas; se deja reposar durante 5 minutos.

4.- Se toma el cubreobjetos y se coloca sobre un portaobjetos.

5.- Se examinan todos los campos con el microscopio.

Para tinción temporal se puede utilizar lugol parasitológico.

PRECAUCIONES.- Debido a la utilización de material fecal, se deben extremar precauciones para no contaminar las zonas de trabajo.

(3).- METODO CUALITATIVO DE WILLIS

Como el, anterior es un método cualitativo de concentración por flotación simple; en este caso se usa "salmuera".

Antecedentes.- Willis en 1921, describe este método basado en la propiedad que tienen las soluciones de densidad mayor, de hacer flotar objetos menos densos; Posteriormente Otto y cols., en 1941, sustituyeron el cloruro de sodio por sulfato de zinc y disminuyeron la densidad, modificando así este método. La densidad aproximada de la solución de salmuera es de 1.200, lo que hace que la mayor parte de los huevos de helmintos floten.

Utilidad.- Por su sencillez, se puede utilizar en encuestas en el campo; se usa para la búsqueda e identificación de formas parasitarias como huevos, quistes y larvas.

Limitaciones.- Como no se filtra la materia fecal, las preparaciones pueden quedar muy sucias. La densidad tan elevada de la salmuera distorsiona las formas parasitarias y se necesita experiencia para la lectura.

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Material

a).- Reactivos- Cloruro de sodio comercial. Resulta más práctico y económico utilizar sal de cocina. b).- Soluciones1.- Solución de lugol parasitológico (ver método directo).2.- Agua de la llave (?).3.- Solución saturada de cloruro de sodio.

En un recipiente de un litro, se vierte agua hasta la mitad y se agrega suficiente cloruro de sodio para que se haga una solución sobresaturada o sea que quede con exceso de sal sin disolver en el fondo del recipiente. El sobrenadante es el que se deberá utilizar. Para acelerar la disolución, se puede calentar la mezcla y se deja enfriar; el exceso de sal cristalizará.c).- Vidriería- Frascos de vidrio de aproximadamente 50 ml. de boca ancha.- Portaobjetos de 75 x 25 mm.- Cubreobjetos de 22 x 40 mm.d).- Aparatos (equipo)- Microscopio compuesto.- Abatelenguas o aplicadores de madera.

Método

1.- Se colocan en el recipiente de vidrio, de 2 a 3 gr. de materia fecal y se añaden unos 5 ml de salmuera, homogeneizando con el abatelenguas.2.- Se va añadiendo más salmuera y se sigue agitando con el abatelenguas, hasta que es llene hasta el tope del frasco.3.- Se coloca un cubreobjetos sobre la boca del recipiente, de tal manera que quede en contacto con la suspensión y se deja reposar de 15 a 30 minutos.4.- Se toma el cubreobjetos y se coloca en un portaobjetos. ( si se desea se le puede poner a la preparación una gota de lugol parasitológico).5.- Se observa con el microscopio con el objetivo de 10X y 40X.

Precauciones.- Tener cuidado, al colocar el cubreobjetos en la boca del recipiente, para que no queden burbujas, esto dificulta la observación. El carácter infectante de la materia fecal deberá tomarse en consideración para tomar las medidas de seguridad correspondientes.

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(4) METODO DE FAUST

Se trata de un examen coproparasitoscópico cualitativo de concentración por centrifugación y flotación.

Antecedentes.- Fue en 1938 cuando Faust y cols. descubrieron su método que hasta la fecha es uno de los más utilizados. es parecido al que describe Lane en 1924, sólo que en éste se utiliza solución saturada de cloruro de sodio. Como este método es poco eficaz para quistes; Se utiliza más el método de FAUST que es muy eficaz para estas formas parasitarias.

Utilidad.- Hace una buena concentración de quistes, huevos y larvas; Es la técnica preferida por la generalidad de los laboratorios.

Limitaciones.- Es poco eficaz para huevos pesados como: Ascaris lumbricoides, Taenia sp. y Fasciola hepática.

Material

a).- Reactivos

- Sulfato de zinc (puede utilizarse sulfato de zinc industrial, si se eliminan de la solución las sales insolubles mediante filtrado previo o con la aplicación de unas gotas de ácido sulfúrico).- Agua de la llave.

b).- Soluciones

1).- Solución de sulfato de zinc con densidad de 1.180.- Sulfato de zinc 350 g.- agua de la llave 1000 ml.

Se disuelve el sulfato de zinc en el agua hasta la disolución total de la sal, se le toma la densidad, si se pasa de 1.180, se le agrega agua y se homogeiniza, si le falta, se le agregan pequeñas cantidades de la sal, hasta lograr la densidad deseada.

2).- Lugol parasitológico (ver método directo).

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c).- Vidriería

- Recipiente de vidrio de 50 ml aproximadamente.- Tubos de ensaye de 13 x 100 mm.- Embudos de vidrio de 7.5 cms. de diámetro.- Portaobjetos de 75 x 25 mm.- Cubreobjetos de 22 x 22 mm.

d).- Equipo- Centrífuga con camisas para tubos de 13 x 100 mm.- Microscopio compuesto.- Densímetro graduado de 1.100 a 1.200 grados Baum\5w\4.

c).- Otros- Gasa cortada en cuadros de 15 x 15 cm.- Gradilla.- Aplicadores de madera.- Abatelenguas.- Asa de alambre terminada en círculo de 2 a 3 mm de diámetro, formando ángulo recto con el resto del alambre y montada en un tapón de corcho o caucho.

Método

1.- Se hace una suspensión homogénea con 1 a 2 g de materia fecal y 10 ml de agua de la llave.2.- Se pasa a través de gasa colocada en el embudo y colectando la suspensión directamente en el tubo de ensaye.3.- Los tubos así preparados, se centrifugan a 2,000 revoluciones por minuto (r.p.m.) durante un minuto.4.- Se decanta el sobrenadante y se resuspende el sedimento con agua, agitando con un aplicador.5.- Se centrifuga nuevamente y se vuelve a decantar el sobrenadante.6.- Se agregan 2 a 3 ml de la solución de sulfato de zinc a los tubos y se homogeneizan perfectamente, llenando los tubos hasta 0.5 a 1 cm. por abajo de los bordes.7.- Se centrifuga a 2000 r.p.m. durante un minuto.8.- Con el asa estéril o flameada, se recoge la muestra de la película superficial, que se encuentra en el menisco, durante dos o tres ocasiones sucesivas y se deposita en un porta objetos.9.- Se agregan dos gotas de lugol parasitológico y se homogeneiza con el ángulo de un cubreobjetos y se coloca este sobre la preparación.10.- Se observa la preparación al microscopio con objetivos 10X y 40X.

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Forma de reportar.- Para reportar los hallazgos en las preparaciones, primero se escribe la fase o estadio y enseguida el nombre del parásito, el nombre del género con mayúscula y el de la especie con minúsculas, por ejemplo: quistes de Giardia lamblia; huevos de Ascaris lumbricoides, etc.

Precauciones.- Se debe verificar la densidad de la solución de sulfato de zinc periódicamente o de preferencia prepararla cada tercer día, según el volumen de trabajo diario, pues fácilmente se pierde la densidad alterándose los resultados. Después de agregar la solución de Faust, es necesario tomar inmediatamente la muestra para su lectura, pues si permanecen los tubos mucho tiempo, las formas parasitarias pueden degenerarse o sedimentarse. Dado el carácter infectante de la materia fecal, se deben tomar las precauciones pertinentes.

TECNICAS CUALITATIVAS POR SEDIMENTACION (5) METODO DE RITCHIE

El método de Ritchie es un examen CPS cualitativo de concentración por sedimentación con centrifugación.

Antecedentes.- Ritchie, en 1948, describió su método muy semejante al de Carles Barthelemy (1917), es una técnica controvertida, pues se toma como tipo para hacer comparaciones muy frecuentes con otros métodos, es quizá uno de los métodos que más referencias tenga en la literatura científica.

Utilidad.- Se utiliza para huevos, quistes y larvas, no importan la densidad que tengan, hacen muy buena concentración de éstas formas parasitarias, pues elimina bastantes detritus orgánicos con el éter, el motivo por el cuál se utiliza el formol es para mantener la integridad de las formas parasitarias que concentra, por sus características de fijador. La generalidad de los parasitólogos conoce este método como el de formol-éter.

Limitaciones.- Debido a que se utilizan varios reactivos y tubos cónicos, resulta poco económico. Las preparaciones quedan muy sucias porque con la sedimentación, aparte de concentrarse formas parasitarias, se concentran otros materiales.

Material

a).- Reactivos:- Cloruro de sodio Q.P.

- Formaldehído en solución Q.P.- Éter etílico comercial.

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b).- Soluciones

1.- Solución salina isotónica (ver método directo).

2.- Solución de Formaldehído al 10 %.

Formaldehído........... 10 ml. Agua destilada c.b.p.... 100 ml.

Se colocan los 10 ml de formaldehído en una probeta o matraz volumétrico de 100 ml y se completa el volumen a 100 ml con agua destilada.

c).- Vidriería

- Embudos de vidrio de 5 cm de diámetro.- Vasos de precipitados de vidrio de 50 ml.- Pipetas Pasteur con bulbo.- Portaobjetos de 25 x 75 mm.- Cubreobjetos de 22 x 22 mm.- Tubos cónicos para centrífuga de 15 ml.

d).- Aparatos

- Centrífuga con camisas para tubos de 13 x 100 mm.- Microscopio compuesto.

e).- Otros

- Gasa cortada en cuadros de 15 cm de lado.- Aplicadores de madera.- Gradilla.

Método

1.- Con el aplicador de madera, se colocan de 1 a 2 g de materia fecal aproximadamente, en el vaso de precipitados y se añaden 10 ml de solución salina, homogeneizando con el mismo aplicador.

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2.- Se pasa la suspensión a través de la gasa colocada en el embudo y recibiendo el contenido en el tubo cónico.

3.- Se centrifuga durante un minuto a 2,000 r.p.m.

4.- Se decanta el sobrenadante y se resuspende el sedimento con solución salina, centrifugando, decantando y resuspendiendo las veces que sean necesarias, hasta que el sobrenadante sea claro.

5.- Al último sedimento se le agregan 10 ml de formaldehído, se mezcla y se deja reposar 10 minutos.

6.- Se añaden 5 ml de éter, se tapan los tubos con tapones de caucho y se agitan enérgicamente durante 30 segundos.

7.- Se centrifuga durante 2 minutos a 1,500 rpm.

8.- Después de centrifugar, se observan 4 capas:

1a.- De éter.2a.- Tapón de restos fecales.3a.- Formaldehído.4a.- Sedimento en el fondo del tubo conteniendo los elementos parasitarios.

9.- Se introduce la pipeta Pasteur a través de las capas 1a., 2a. y 3a., hasta llegar al sedimento, se extrae una gota del mismo y se coloca sobre un portaobjetos.

10- Se le añade una gota del lugol parasitológico y con uno de los ángulos del cubreobjetos se homogeneiza, colocando este mismo sobre el portaobjetos.

11- Se observa la preparación en el microscopio con objetivos de 10X y 40X.

PRECAUCIONES.- El área de trabajo debe estar libre de mecheros encendidos, pues el éter es inflamable. Al mezclar y agitar la suspensión, después de agregar el éter, el tubo debe de taparse lentamente, para evitar que el contenido salga bruscamente hacia el exterior. Procurar mantener limpia la zona de trabajo para evitar posibles infecciones con la materia fecal.

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(6) METODO DE SEDIMENTACION EMPLEANDO COPAS

Antecedentes.- El procedimiento de decantación en copas es una técnica farmacéutica conocida desde hace muchos años en el cuál se utiliza un procedimiento físico para la separación de las mezclas.

Utilidad.- El fundamento de la sedimentación y decantación subsiguiente, se ha utilizado como método de diagnóstico para aquellas muestras de heces fecales sospechosas de contener huevos de Fasciola Hepática, el método ha demostrado ser bondadoso para otros huevos de helmintos e incluso para quistes de protozoarios. Las ventajas que tiene sobre otros, es que hace una concentración de volúmenes considerablemente grandes de materia fecal.

Material

a).- Reactivos:- Verde de malaquita.- Detergente.- Agua destilada o agua de la llave.

b).- Soluciones:

- Solución de detergente al 5 %.

Se pesan 5 g de detergente de cualquier marca y se disuelven en 100 ml de agua de la llave, el detergente que no se alcance a disolver, se sedimenta y decanta, el sobrenadante se deja en el frasco donde se guarda la solución, pues no interfiere en el proceso.

Solución de verde de malaquita al 1 %.

- Verde de malaquita 1 g.

- Agua destilada 100 ml.

Se disuelve el verde de malaquita en los 100 ml de agua y se guarda la solución en frasco con tapón esmerilado.

c).- Vidriería:

- Copas cónicas de 250 a 500 ml.- Pipetas Pasteur.- Portaobjetos de 25 x 75 mm.- Cubreobjetos de 22 x 40 mm.- Embudos de 10 cm de diámetro, de vidrio.

d).- Equipo:

- Microscopio compuesto.

e).- Otros:

- Aplicadores de madera.- Bulbos de caucho.- Gasa cortada en cuadros de 15 cm por lado.

Método

1.- En el recipiente donde se llevó la muestra al laboratorio, se homogeneiza con agua de la llave y se hace pasar a través de la gasa previamente en un embudo y recibiendo la suspensión en la copa.2.- Se colocan 5 ml de colorante y se agita con aplicador.3.- Se agregan 5 ml de la solución de detergente y se agita nuevamente.4.- Se completa el volumen de la copa y se deja reposar durante 15 minutos.5.- Se decanta el sobrenadante y se agrega más agua mezclando con el aplicador y se deja reposar 15 minutos.6.- Se decanta nuevamente el sobrenadante.7.- Con la pipeta Pasteur con bulbo, se toma del sedimento la muestra que se coloca en un portaobjetos y se pone el cubre objetos.8.- Se observa con el microscopio, usando objetivos de 10X y cambiando al de 40X, cuando sea necesario.9.- Se hacen 3 preparaciones de cada sedimento para asegurar la positividad de la muestra. Cuando se tiene suficiente práctica se puede utilizar la lupa del microscopio, sobre todo cuando se buscan huevos de Fasciola hepática.

PRECAUCIONES.- Las necesarias cuando se trabaja con material biológico infectante.

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(7) " METODO DE CARLES BARTHELEMY "

CPS de concentración por sedimentación con centrifugación.

Antecedentes.- Justamente con el método de Teleman es una de las técnicas de sedimentación más antiguas, en la actualidad se usa muy poco.

Utilidad.- Hace una buena concentración de quistes huevos y larvas.

MATERIAL:

a).- Reactivos:

- Formaldehido Q.P.- Cloruro de sodio.- Ácido cítrico cristalizado.- Agua destilada.- Éter etílico.

b).- Soluciones:

Solución salina formolada. (Carles I).

Solución de cloruro de sodio al 0.9... 9 vol.Formaldehído.......................... 1 vol.

Se mezclan ambas soluciones y se guardan en un frasco con tapón esmerilado. La densidad de la solución debe ser de 1.035.

- Solución cítrica formolada. (Carles II).

Ácido cítrico cristalizado........... 12 g.Formaldehído............................. 2 ml.Agua destilada.......................... 86 ml.

Se disuelve el ácido cítrico en el agua y luego se agrega el formaldehído, se guarda en frasco con tapón esmerilado. Esta solución deberá tener una densidad de 1.046.

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- Lugol parasitológico. (ver método directo).

c).- Vidriería.

- Tubos de ensaye de 13 x 100 mm.- Portaobjetos de 25 x 75 mm.- Cubreobjetos de 22 x 22 mm.- Pipeta Pasteur con bulbo.

d).- Equipo:

- Microscopio compuesto.- Centrífuga con camisas para tubos de 13 x 100 mm.

e).- Otros:

- Cápsula de porcelana.- Tela metálica de malla fina o gasa cortada en cuadros. de 15 cm. de lado.- Tapones de caucho.- Palillos de dientes o aplicadores de madera.

Método

1.- Suspender 1 a 2 g de materia fecal en 10 ml de " Carles l ", utilizando la cápsula de porcelana para homogeneizar.2.- Pasar la suspensión a través de la malla o gasa.3.- Centrifugar a 1,800 r.p.m. durante 1 minuto.4.- Decantar y agregar al sedimento " Carles II ", hasta llenar dos tercios del tubo.5.- Agitar con fuerza y añadir el éter hasta centímetro y medio del borde.6.- Tapar el tubo con el tapón de caucho y agitar violentamente hasta lograr la homogeneización de las sustancias que contiene.7.- Destapar con cuidado el tubo para evitar la proyección de la mezcla y centrifugar durante 30 seg. a 1,800 r.p.m.8.- Con un palillo de dientes, se rompe el tapón de las heces, grasas y otros restos, agitando ligeramente con el palillo.9.- Se vuelve a centrifugar durante otros 30 seg. a 1,800 r.p.m.

10- Se rompe nuevamente el tapón superior de restos fecales, desprendiéndolo de la pared del tubo con cuidado, ayudándose del palillo.

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11- Se decanta de una sola vez, procurando que quede una pequeña cantidad de 2 a 4 gotas líquidas junto al sedimento.12- Agregar al sedimento una gota de lugol y agitar el tubo ligeramente para homogeneizar.13- Con la pipeta Pasteur, se toma una gota de la suspensión coloreada del fondo del tubo y se coloca en el portaobjetos, colocando sobre este el cubreobjetos.14- Se observa en el microscopio con objetivos de 10X y 40X.

Precauciones.- Mientras se está trabajando, no deben de existir mecheros encendidos en el laboratorio, porque el éter es inflamable, se debe tener cuidado al destapar los tubos, sobre todo cuando éstos hayan sido tapados con caucho, pues se puede proyectar el contenido hacia el exterior. El lugar de trabajo debe ser lavado perfectamente para evitar infecciones.

(8) " METODO DE TELEMANN "

Antecedentes.- En 1908 Telemann describe su método el cuál es modificado por Rivas en 1928, quien cambió el ácido clorhídrico por ácido acético. En esta sección se describirá el original.

Utilidad.- Se usa para concentración de huevos, quistes y larvas, sobre todo para aquellas muestras que tienen elevadas concentraciones de grasas neutras y ácidos grasos libres.

Limitaciones.- No hace buena concentración de quistes, el éter es muy caro.

Material:

a).- Reactivos:- Éter etílico.- Ácido clorhídrico concentrado.- Agua destilada.

b).- Soluciones

Solución de ácido clorhídrico al 15 %.- Ácido clorhídrico concentrado 40 ml.- Agua destilada.............. 60 ml.

c).- Vidriería:- Vaso de precipitado de 50 ml.- Tubos cónicos de centrífuga de 15 ml.- Pipetas Pasteur.- Portaobjetos de 75 x 25 mm.- Cubreobjetos de 22 x 22 mm.d).- Aparatos:- Microscopio compuesto.- Centrífuga con camisas para tubos de 13 x 100 mm.e).- Otros:- Tapón de caucho.- Gasa o algodón.- Bulbo de goma.- Gradilla.

Método1.- Se coloca un fragmento de heces fecales del tamaño de un frijol ( 1 g aproximadamente) en un vaso que contenga 5 a 10 ml de ácido clorhídrico al 15 %.2.- Se homogeneiza con el aplicador.3.- Se pasa la suspensión por dos capas de gasa previamente humedecida, recibiendo el colado en el tubo de centrífuga cónico de 15 ml.4.- Se añade éter en cantidades iguales y se coloca un tapón de caucho.5.- Se agita vigorosamente y se afloja el tapón para disminuir la presión y se destapa.6.- Se centrifuga a 1,500 r.p.m. durante un minuto.7.- Se saca de la centrífuga y se observan 4 capas:1a.- Eter. 2a.- Tapón de restos fecales.3a.- Capa de ácido. 4a.- Sedimento inferior que contiene formas parasitarias.8.- Se mantiene el tubo horizontal y con un aplicador de madera y con movimientos circulares, se despega el tapón de restos fecales.9.- Rápidamente, pero con cuidado, se vierten el éter, tapón de restos fecales y la capa de ácido, de manera que quede el sedimento en el tubo.10- Se mantiene el tubo en posición horizontal, para evitar que los restos de extracto graso y de tapón fecal bajen por las paredes del sedimento.11- Se introduce un aplicador con hiposo de algodón y se limpian las paredes del tubo.12- Con el tubo vertical, se toma parte del sedimento con una pipeta Pasteur.13- Se coloca en un portaobjetos y se pone un cubreobjetos por encima de este.14- Se examina en el microscopio con objetivo seco débil 10X y seco fuerte 40X.PRECAUCIONES.- lavar cuidadosamente el área de trabajo para evitar infecciones.

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(9) " CPS POR SEDIMENTACION CON AGUA GLICERINADA "

Antecedentes.- Es un método descrito por Faust en 1945, es poco conocido, por haber tenido un éxito efímero.

Utilidad.- El agua glicerinada disminuye la tensión superficial de mezclas con diferentes soluciones, fenómeno que aquí se utiliza para detectar formas parasitarias y concentrarlas.

Limitaciones.- Se lleva mucho tiempo.

Material

a).- Reactivos:- Glicerina.- Agua de la llave.

b).- Soluciones:- Solución de glicerina.- Glicerina.......... 0.5 ml.- Agua de la llave (¿) 100 ml.

Se coloca el agua en un matraz de 125 ml., se pipetean 0.5 ml de glicerina y se vacía en el agua, enjuagando la pipeta en el agua. Se guarda en un frasco con tapón esmerilado.

- Solución isotónica (ver método directo).- Solución de lugol (ver método directo).

c).- Vidriería. - Vasos de precipitado de 250 ml.- Vasos de precipitado o matraz graduado de 250 a 500 ml.- Pipetas Pasteur con bulbo.- Portaobjetos de 25 x 75 mm.- Cubreobjetos de 22 x 22 mm.- Embudo de vidrio de 20 cm de diámetro.

d).- Aparatos:- Microscopio compuesto.

e).- Otros:- Gasas o algodón.- Abatelenguas.- Bulbo de goma.

Método

1.- Se coloca la muestra de aproximadamente 5 g de materia fecal en un vaso de 250 ml con agua glicerinada hasta la cuarta parte del vaso y se mezcla con un abatelenguas.2.- Se añade agua glicerinada hasta las tres cuartas partes del vaso.3.- Se pasa la suspensión por un embudo con dos capas de gasa o de algodón mojados y se recibe en un vaso de precipitados o matraz graduado cónico.4.- Se deja reposar por una a dos horas y se decanta el sobrenadante.5.- Se resuspende el sedimento con agua glicerinada hasta casi llenar el matraz, se homogeneiza y se deja reposar de 30 a 45 minutos.6.- Pasado el tiempo se decanta nuevamente y estos pasos se repiten hasta que el sobrenadante quede limpio.7.- Se decanta el último lavado y del sedimento se toma con pipeta Pasteur una muestra.8.- Se coloca en un portaobjetos y si está muy espesa, se puede diluir con solución salina isotónica.9.- Se coloca el cubreobjetos y se observa con el microscopio con objetivos de 10X y 40X.

Nota.- Las muestras se pueden repetir cuantas veces se desee, tomando de las capas superior, media e inferior del sedimento. Cuando se utilicen matraces de 500 ml para realizar la sedimentación, se puede duplicar o triplicar la muestra.

Precauciones.- Se debe limpiar perfectamente el área de trabajo para evitar infecciones.

(10) EXAMEN CPS DE CONCENTRACION POR SEDIMENTACION DE MUESTRAS PRESERVADAS CON MIF (MIFC)

Antecedentes.- Esta técnica fue descrita por Biaggy cols.,en 1955, es una técnica semejante a la de formol éter, pero en este caso no se está utilizando el formol porque se va a trabajar con una muestra previamente conservada.

Utilidad.- Esta técnica permite hacer una buena concentración de huevos, quistes y larvas, personas muy experimentadas en el manejo de esta técnica han descrito también la concentración de trofozoítos, aunque algunos otros investigadores señalan que éstos se pueden destruir con el éter a pesar de que hayan sido previamente fijados y conservados con el MIF.

Limitaciones.- Alto costo de los reactivos.

Material

a).- Reactivos:- Éter etílico.- Merthiolate.- Yodo.- Yoduro de potasio.- Formaldehído.- Glicerina.- Agua destilada.

b).- Soluciones:- Solución de MIF.

c).- Vidriería.- Tubos cónicos de centrífuga de 15 ml.- Pipetas Pasteur.- Portaobjetos de 25 x 75 mm.- Cubreobjetos de 22 x 22 mm.

d).- Equipo:- Microscopio compuesto.- Centrífuga con camisa para tubos de 15 ml.

e).- Otros.- Tapón de caucho.- Aplicadores de madera.- Algodón y gasa cortados en cuadros de 15 cm por lado.- Gradilla.

Método

1.- Mezclar la muestra fecal con la solución de MIF y pasarla a través de gasa humedecida en MIF a un tubo cónico de centrífuga, si no es suficiente la muestra se añade más preservador hasta aproximadamente 10 ml y se agita para homogeneizar.

2.- Se agregan 5 ml de éter, se tapa el tubo con el tapón de caucho y se agita con cuidado pero vigorosamente, durante un minuto.

3.- Después de agitar, se retira el tapón con cuidado y se centrifuga a 1,500 r.p.m. durante un minuto.

4.- Después de centrifugar, se forman 4 capas:1a.- Eter. 2a.- Restos fecales.3a.- Solución MIF. 4a.- Sedimento con las formas parasitarias.

5.- Se desprende el tapón superficial y se decantan las tres capas superiores, dejando el sedimento.

6.- Con un algodón en un aplicador de madera, se limpian las paredes del tubo.

7.- Con una pipeta Pasteur se toma la muestra de la parte superior del sedimento, se coloca en un portaobjetos y se cubre.

8.- Se examina en el microscopio con objetivos de seco débil y seco fuerte.

" EXAMENES COPROPARASITOSCOPICOS CUANTITATIVOS "

Estas técnicas son utilizadas para hacer una evaluación de la intensidad de ciertos helmintos como: Ascaris lumbricoides, uncinariasis, estrongiloidosis.

(11) " EXAMEN CUANTITATIVO DE SCOTT "

Antecedentes.- Esta técnica fue ideada y desarrollada por Scott, para cuantificar los huevos de uncinarias, es un método bastante antiguo, fue publicado en 1923, dadas las características del método, es uno de los más exitosos en encuestas epidemiológicas no solo en uncinariasis, sino en muchas helmintiasis.

Utilidad.- No obstante que fue diseñada para infecciones por uncinarias, las bondades de éste método lo han hecho popular y útil en todo tipo de helmintiasis que se requiere hacer una evaluación de la intensidad. Su fundamento es básicamente aritmético, los métodos son muy simples tomando en consideración las diluciones empleadas.

Limitaciones.- Por el hecho de hacer una dilución de un pequeño volumen de materia fecal en un volumen relativamente grande de una solución de hidróxido de sodio, las posibilidades de evaluar con éxito las helmintiasis moderadas, están sumamente disminuidas. Se utilizan además volúmenes de material fecal más pequeños de los que se utilizan en el examen directo. Por el hecho de no utilizar tinción temporal, se dificulta observar los quistes.

Material

a).- Reactivos:- Hidróxido de sodio Q.P.- Agua destilada.

b).- Soluciones:- Solución 0.1\ N de Hidróxido de sodio.- Hidróxido de sodio 4 g.- Agua destilada c.b.p....... 100 ml.

En un matraz volumétrico de un litro, se coloca el hidróxido de sodio, inmediatamente después de pesado, se agregan unos 100 a 200 ml de agua destilada y se disuelve perfectamente. Se afora el matraz a la marca. Se guarda la solución en un frasco con tapón de caucho. no se debe usar frasco con tapón esmerilado.

c).- Vidriería:- Probeta graduada de 100 con tapón esmerilado.- Pipeta de 1 a 2 ml graduada en centésimas.- Portaobjetos de 38 x 75 mm.- Cubreobjetos de 22 x 40 mm.- varillas de vidrio de 20 cm de longitud.

d).- Equipo: - Microscopio compuesto.

Método1.- En la probeta se ponen 56 ml de la solución de hidróxido de sodio.2.- Se añade la materia fecal hasta el nivel de 60 ml, ayudando se para esto con la varilla de vidrio.3.- Se añaden 15 a 20 perlas de vidrio y se tapa la probeta.4.- Colocamos uno de los dedos sobre el tapón esmerilado y tomando firmemente la probeta con el resto de la mano, se agita vigorosamente durante un minuto hasta formar una suspensión homogénea.5.- En cuanto cesa la agitación, los restos fecales y huevos comienzan a irse hacia el fondo; Se toma inmediatamente la pipeta Pasteur y se va introduciendo hasta la parte media de la suspensión.6.- Se toman 0.075 a 0.15 ml, que se colocan sobre el portaobjetos y se cubre.7.- Se observa la preparación al microscopio con objetivos de 10X y 40X.8.- Se observan absolutamente todos los campos de la preparación, contando los huevos encontrados. Para esto se sigue siempre una rutina que puede ser de arriba hacia abajo o de un lado para otro.

Forma de reportar: El número de huevos o larvas contados en todos los campos de la preparación, se multiplican por los siguientes factores, según se hayan tomado 0.075 o 0.15 mas de la suspensión y también tomando en consideración la consistencia de la muestra de la materia fecal.

HECES CENTECIMAS FACTOR.Duras 0.075 50.Pastosas 0.075 100.Líquidas 0.075 200.

Duras 0.150 100.Pastosas 0.150 200.Líquidas 0.150 400.

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El resultado se expresa en huevos o larvas por mililitro de heces, por ejemplo: Si la materia fecal es pastosa y se encontraron en todos los campos 4 huevos de uncinarias:

4 X 200 = 800 ( 200 es el factor de las heces pastosas con 0.150 centésimas).

Precauciones.- Se recomienda dada la dilución de la muestra, tomar de preferencia 0.150 de la suspensión y verificar que sean exactamente pipeteados, para no alterar el factor de dilución.

Se debe llevar con cuidado la punta de la pipeta hasta el centro y parte media de la suspensión de la probeta ya que esto hace que disminuya el error debido a la sedimentación rápida de los huevos.

Para evitar infecciones y contaminación en el laboratorio se recomienda limpieza minuciosa de la zona de trabajo.

(12) “ METODO CPS CUANTITATIVO DE FERREIRA ”.

Es un método de concentración de una suspensión de materia fecal 1:10, que tiene la característica, además, de ser cuantitativo.

Antecedentes.- Biagy y cols. Describieron en 1959, éste método en México, el cuál fue ideado y puesto en práctica por Ferreira y Abreu, basados probablemente en el método de Faust.

Utilidad.- Reúne las características de un CPS de concentración y de un cuantitativo, sirve para recuento de huevos y larvas y hace una muy buena concentración de quistes.

Limitaciones.- El equipo y material que se utiliza no se puede conseguir fácilmente en el comercio. Por otro lado, el uso del factor por el que se multiplica para obtener la cuenta final de huevos o larvas por gramo de heces, no ha sido aclarado en la descripción de la técnica.

Material

a).- Reactivos:- Sulfato de zinc Q.P. se puede usar el industrial, siempre que se eliminen las sales insolubles por filtración y adición de una gotas de ácido sulfúrico.

- Formaldehído.- Agua de la llave.

b).- Soluciones:

- Solución de sulfato de zinc con densidad de 1.92. grados baumé.- Sulfato de zinc 400 a 450 g.- Agua de la llave 1000 ml.

Se solubiliza el sulfato en el agua, se toma la densidad, si falta para el 1.192° se le agrega sulfato, si se pasa, se le agrega agua, a fin de lograr la densidad.

- Solución de formaldehído al 10 %.- Formaldehído 10 ml.- Agua de la llave c.b.p. 100 ml.

En una probeta de 100 ml se coloca el formaldehído y se completa a 100 ml con agua de la llave.

- Lugol parasitológico (ver método directo).

c).- Vidriería: - Recipiente de vidrio de boca ancha, de 50 a 100 ml.

- Tubos de 25 x 100 mm.- Portaobjetos de 25 x 75 mm.- Cubreobjetos de 22 x 40 mm.- Probetas graduadas de 100 ml.

d).- Equipo:- Balanza gramataria.- Centrífuga con camisas para tubos de 25 x 100 mm.- Microscopio compuesto.

e).- Otros:- Gradilla para tubos de 25 x 100 mm.- Tela de alambre o gasa cortada en cuadros de 15 cm por lado.- Abatelenguas.- Campana.

Método

1.- Se pesa un frasco de boca ancha con un abatelenguas.2.- Se pone materia fecal ayudándose con el abatelenguas, hasta que sean 4 g (peso del frasco con el abatelenguas más 4 g de materia fecal).3.- Se miden 36 ml de solución de formaldehído y se vacían en el frasco.4.- Se homogeneiza la materia fecal con la solución de formol hasta que quede una suspensión.5.- Se pasa la mezcla por malla o gasa previamente colocada en un embudo y se recibe la suspensión en un tubo colocado en una gradilla.6.- Se centrifuga durante un minuto a 2,000 r.p.m..7.- Se decanta el sobrenadante, se suspende el sedimento con agua y se vuelve a centrifugar bajo las mismas condiciones anteriores.8.- Se decanta nuevamente el sobrenadante y se agregan 2 a 3 ml. de la solución de sulfato de zinc, se mezcla hasta hacer una nueva suspensión.9.- Se introduce la campana de Ferreira, dando un pequeño giro.10- Se llena el tubo con más solución, procurando que tanto el menisco interno de la campana, como el externo, vayan subiendo paralelamente.11- Se centrifuga a 2,000 r.p.m. durante un minuto.12- Se saca el tubo de la centrífuga y con el pulgar y el índice se comprime fuertemente el trocito de manguera de caucho del extremo anterior de la campana y de un golpe se saca ésta del tubo.13.- Se invierte la campana sobre el portaobjetos y se homogeneiza la suspensión con el ángulo de un cubreobjetos y se coloca sobre el portaobjetos.examina la preparación con el microscopio a seco débil y seco fuerte (10X y 40X respectivamente) si es necesario

Características morfológicas de huevos de algunos parásitos

Los huevos de Ascaris lumbricoides miden en promedio 70 micras de largo por 50 de ancho; poseen una membrana externa gruesa, de color café o dorado con tinción de lugol.

Los huevos de Enterobius vermicularis embrionados, en estado infectante son ovoideos, aplanados ventralmente y convexos su dorso, miden de 50 a 60 micras de longitud por 20 a 30 de diámetro, tienen una envoltura hialina albuminosa gruesa transparente y una cápsula formada por dos capas de quitina.

Los huevos Trichuris trichiura tienen aspecto de barril, de balón de fútbol americano o de bolillo o virote, miden en promedio 52 micras de largo por 22 de ancho, poseen una envoltura gruesa, de tres capas

Los huevos de Taenia solium son esféricos, miden de 31 a 43 micras de diámetro, de color café, tienen una cápsula gruesa que contiene un embrión desarrollado, u oncósfera, que generalmente contiene 3 pares de ganchos.

CUESTIONARIO

1.- Mencione la clasificación de los exámenes coproparasitoscópicos.

2.- Describa el método cualitativo de FAUST.

3.- Describa el método cualitativo de RITCHIE.

4.- Describa el método cuantitativo de SCOTT.

5.- Describa el método cuantitativo de FERREIRA.

6.- Describa la técnica de tinción con lugol para observar al microscopio las formas parasitarias.

7.- Describa las la morfología de los huevos de Ascaris Lumbricoides.

8.- Describa la morfología de los huevos de Trichuris trichura.

9.- Describa la morfología de los huevos de Enterobius vermicularis

10.- Describa ala morfología de los huevos de Taenia solium.

CULTIVO DE ENTEROBACTERIAS EN MEDIOS SELECTIVOS

Práctica 18

OBJETIVOS

1.- El alumno conocerá los géneros y especies de la familia de las enterobacterias.

2.- El alumno conocerá la importancia de la identificación de las enterobacterias.

3.- El alumno conocerá las características morfológicas de los géneros y especies de enterobacterias que con mayor frecuencia producen infecciones intestinales.

4.- El alumno conocerá los medios de cultivo selectivos para el aislamiento primario de enterobacterias.

5.- El alumno aplicará la técnica para el aislamiento primario de enterobacterias.

6.- El alumno aplicará la técnica de tinción de Gram.

7.- El alumno identificará las características morfológicas y de tinción de las enterobacterias.

8.- El alumno conocerá las características colonias de E. Coli en el medio de cultivo agar EMB.

9.- El alumno conocerá las características coloniales de los géneros Proteus y Pseudomona en el medio de cultivo agar Mc Conkey.

10.- El alumno conocerá las características coloniales de los géneros Salmonella y Shigella en el medio de cultivo agar Mc Conkey.

Introducción

El tubo digestivo del recién nacido es completamente estéril, sin embargo, la ingesta de alimentos lleva consigo la introducción de flora bacteriana que utiliza estos alimentos para su metabolismo.

En el intestino de niños alimentados al seno materno y hasta antes de la ablactación se encuentran Streptococcus y Lactobacilos (Bifidobacterium), estos microorganismos Gram positivos producen ácidos al metabolizar carbohidratos, como glucosa y lactosa principalmente, con lo que colaboran para mantener el pH apropiado del tubo digestivo.

La lactancia artificial y la introducción de sondas e instrumental médico o quirúrgico favorece la colonización de flora que permanecerá como residente habitual del tubo digestivo. Algunas bacterias que forman parte de la flora normal son bacilos Gram negativos aerobios o anaerobios como los miembros de los géneros Bacteroides (B. Fragilis), Fusobacterium (F. nucleatum); Otros microorganismos son bacilos Gram positivos anaerobios como Clostridium perfringes.

La gran mayoría de microorganismos residentes habituales del tubo digestivo pertenecen a la familia de enterobacterias e incluyen algunas especies de los géneros Citrobacter, Enterobacter y Klebsiellas no patógenas.

En el intestino de los adultos se aíslan un gran número de microorganismos Gram negativos anaerobios o aerobios facultativos de la familia enterobacteriaceae (enterobacteriáceas) formada por un grupo heterogéneo de bastoncillos Gram negativos en la que se han incluido a mas de 20 géneros y 100 especies, entre la que se encuentran, los géneros Escherichia, Shigella, Salmonella, Enterobacter, Klebsiella, Serratia y Proteus. Algunas de estas especies forman parte de la flora normal del tubo digestivo y producen enfermedades de manera incidental, otros sin embargo, son patógenos de manera regular para el hombre ejemplo: Proteus, Salmonellas, Shigellas, etc.

La gastroenteritis aguda o diarrea infecciosa de origen bacteriano en México por décadas ha sido un gran problema de salud y junto con las diarreas de origen viral y parasitarias han ocupado el segundo lugar de morbimortalidad general. En el año 2003 ocuparon el segundo lugar de morbilidad general con 4,881,368 casos nuevos y 9,585 defunciones en este año, siendo los lactantes menores el grupo etario mas afectado.

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Los microorganismos bacterianos que con mayor frecuente se aíslan de las heces fecales de enfermos con diarrea aguda pertenecen a los géneros Shigella y Salmonella invasoras de la mucosa intestinal. Entre las bacterias productoras de enterotoxinas se encuentran Escherichia coli, Klebsiellas, Proteus y Pseudomona.

Las Enterobacteriáceas comparten algunas características morfológicas y fisicoquímicas base de su clasificación. Son bacilos Gram negativos, anaerobios o aerobios facultativos, fermentan gran cantidad de carbohidratos, poseen estructuras antigénicas complejas, producen toxinas y otros factores de virulencia. La familia de Enterobacteriáceas se caracteriza además, desde el punto de vista bioquímico por la capacidad de algunos de sus miembros de reducir nitratos a nitritos, de fermentar glucosa con producción de ácido o gas, o ambos y son negativos a la oxidasa.

Para la identificación preliminar de los géneros de esta gran familia, se recurre a la observación de las características morfológicas de sus colonias en medios selectivos y de su morfología celular por microscopía con tinción de Gram, para la identificación definitiva de género y especie se recurre a múltiples pruebas bioquímicas, la identificación de antígenos por serología y a estudios de homología del ADN.

GENERO SALOMONELLA

A la tinción de Gram, las Salmonellas tienen forma de bacilos rectos de 0.7 a 1.5 micras de diámetro por 2 a 5 de largo, son Gram negativos, móviles por tener flagelos perítricos, anaerobios facultativos.

ClasificaciónLas Salmonellas hasta 1983, se encontraban agrupadas en un solo género con 3 especies: Salmonella typhi (1 serotipo)Salmonella choleraesuis (1 serotipo)Salmonella enteritidis (más de 1500 serotipos.

Posteriormente a este género se asignó el nombre de Salmonella Arizona (género), que incluye a una sola especie con seis subespecies, clasificadas en el estudio de ADN. Sin embargo, los reportes de laboratorio, tipifican a las subespecies en serogrupos e indistintamente, se designan con el nombre del género y utilizando el nombre de la especie, adicionando o no el serogrupo, lo que indica que esta clasificación no fue del todo aceptada.

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De acuerdo a la adaptación y preferencia de las Salmonellas, a las especies de animales que le sirven de huésped existe la clasificación ecológica:

GRUPO A: Serotipos adaptados perfectamente al hombre.Salmonella typhi, parathyphi B, hirschfeldi y sendai. No tienen reservorio zoonótico, la infección de los animales es raro y accidental, el hombre es el único reservorio, la fuente de infección son las heces de personas infectadas. La transmisión de hombre a hombre es decisiva. A causa de su importancia clínica, deben identificarse tres especies, S. Typhi, S.choleraesius y S. Paratyphi A.

GRUPO B: Serotipos muy adaptados a huéspedes no humanos.Salmonella pollorum, dublin, abortus, ovis, typhisis, gallinarum, abortusequi, y cholerae suis. Infectan a pollos, gallinas, reses, caballos, carneros y cerdos.S. dublin y S. cholerae suis esporádicamente causan infección en el hombre.

GRUPO C: Serotipos no adaptados a huéspedes específicos. Más de 1700 serotipos, comparten: producción de gastroenteritis de corta duración, periodo de incubación corto, raramente invaden la sangre, fuente de infección al hombre son las heces de animales, del hombre y de productos alimenticios (huevos, carne, leche y otros productos lácteos de animales infectados.

Fuente de infección y reservorios

Agua contaminada con excremento, leche y otros productos lácteos, contaminación con excremento, pasteurización insuficiente o manipulación de alimentos inapropiada, mariscos provenientes de aguas contaminadas, huevos desecados o congelados de aves de corral infectadas o contaminadas durante su procesamiento, carnes y sus derivados, animales infectados o contaminados por excremento de roedores o seres humanos, mascotas del hogar, tortugas, perros, gatos, etc

Las Salmonellas son capaces de producir enfermedades como:

Gastroenteritis aguda.- Después de 8 a 48 horas de la ingestión se presentan nauseas, cefalea, vómito, fiebre, diarrea profusa con moco, tenesmo. Los síntomas suelen desaparecer de dos a tres días o pueden complicarse con un estado tifoso. Los hemocultivos son negativos, los coprocultivos generalmente son positivos para las Salmonellas y pueden observarse positivos aún, varias semanas después de la recuperación clínica.

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Fiebre Tifoidea.- Las Salmonellas ingeridas llegan al intestino delgado, pasan a los vasos linfáticos y a la sangre, se diseminan ocasionando septicemias mortales, se multiplican en el tejido linfoide intestinal y se excretan por las heces fecales.

Los síntomas son malestar general, cefalalgia, fiebre de predominio vespertino mayor a 39° C, diaforesis profusa, tenesmo, estreñimiento, bradicardia, mialgias y hepatoesplenomegalia. Es frecuente hallar manifestaciones clínicas de faringitis, manchas de color rubí en la piel del abdomen y tórax conocidas como roséola tifoideica. El ataque al sistema nervioso central con cefalea, vómito, confusión, delirio y convulsiones indican meningoencefalitis de mal pronóstico.

Patología

Las Salmonellas Invaden el epitelio de la mucosa intestinal multiplicándose en el íleon y colon. En la lámina propia del epitelio con microvellosidades se encuentran leucocitos polimorfonucleares, neutrófilos y macrófagos que fagocitan y lisan Salmonellas, sin embargo, algunas de ellas logran invadir algunas células del tejido linfático de las placas de Peyer y multiplicarse.

GÉNERO SHIGELLA (bacilo de Shiga)

Las Shigellas son bastoncillos Gram negativos delgados en promedio de 2 micras de longitud por 0.5 micras de diámetro, Inmóviles, anaerobios facultativos, fermentan glucosa, forman ácido a partir de los carbohidratos, rara vez produce gas.

Clasificación

La clasificación de las Shigellas se basa en sus características bioquímicas y antigénicas, los antígenos O somáticos de las Shigellas son la base de su tipificación serológica, existen mas de 40 serotipos y 4 especies patógenas para el hombre: Shigella dysenteriae, Shigella.flexneri, Shigella.boydii y Shigella.sonnei.

Patología

La dosis infectante es menor a 1000 bacterias. Shigellas invade las células epiteliales de la mucosa intestinal, por fagocitosis inducida, las bacterias son llevadas al interior de las células en una vacuola fagocítica, por lo que no hay muerte celular ni bacteriana, la multiplicación bacteriana se lleva a cabo en el citoplasma de la célula epitelial y pasan a las células adyacentes.

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Las Shigellas producen microabscesos en la pared del íleon terminal y del colon causando finalmente necrosis de la mucosa, ulceración superficial, hemorragia y formación de pseudomembranas sobre el área ulcerada. La pseudomembrana esta formada de fibrina, leucocitos y deshechos celulares, mucosa necrótica y bacterias. Conforme sede el proceso, las úlceras se llenan de tejido de granulación y se produce en ellas tejido cicatrizal.

Toxinas

Endotoxina.- Las Shigellas liberan por autolisis un lipopolisacárido tóxico para las células del epitelio de absorción contribuyendo así a la necrosis de la pared intestinal.

Exotoxina de Shigella dysenteriae tipo 1 produce una exotoxina termolábil que afecta tanto al intestino como al sistema nervioso central, es de tipo proteico y produce diarrea actuando de manera similar a la verotoxina termolábil de E. coli.

La exotoxina inhibe la absorción de azúcares y aminoácidos en el intestino delgado y produce enterocolitis hemorrágica (Disentería bacilar). La neurotoxina puede contribuir a las reacciones del sistema nervioso y a la gravedad extrema y mortal de las infecciones por Shigella dysenteriae.

ESCHERICHIA COLI

Las especies de este género se caracterizan por ser bacilos Gram negativos de 1 a 2 micras de longitud, por 0.05 micras de ancho, No capsulados, No esporulados, aerobio y anaerobios facultativos y móviles por flagelos perítricos.

Escherichia coli agrupa a especies que se subclasifican en serotipos, existen muchas variedades patógenas y cada una de las cuales presenta un mecanismo diferente de producción de la enfermedad.

Las más especies mas importantes desde el punto de vista clínico son Escherichia coli enterotoxígena (ECET), que representa una causa importante de diarrea del viajero: Escherichia coli enteropatógena o enteroadherente (ECEP), una causa de diarrea en la infancia, Escherichia coli enteroinvasora (ECEI), que causa disentería bacilar y Escherichia coli enterohemorrágica (ECEH) que produce colitis hemorrágica y se ha asociado en síndrome hemolítico

urémico(SHU) en los niños.

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Escherichia coli enterotoxígena es una causa importante de gastroenteritis bacteriana. La diarrea del viajero afecta a personas que residen en países industrializados y que visitan regiones tropicales o subtropicales sin condiciones higiénicas adecuadas. Escherichia coli enterotoxígena ECET se adquiere por vía fecal – oral por el consumo de agua no embotellada o de verduras no cocinadas.

El inóculo debe ser lo suficientemente intenso para resistir su destrucción por el ácido del estomago las manifestaciones clínicas principales son consecuencia del abundante escape de líquido a través del aparato gastrointestinal, secundario a la acción de los dos tipos de enterotoxina sobre la mucosa gastrointestinal.

La toxina termolábil activa la adenil ciclasa con el consiguiente incremento en los niveles intracelulares de adenocin monofosfato cíclico que inhibe a la bomba de sodio, bloqueando la difusión facilitada de glucosa al interior del epitelio de absorción con pérdida de sodio, potasio, cloro agua y bicarbonato del líquido intracelular, intersticial e intravascular. La toxina termoestable activa a la guanilato ciclasa con la consecuente elevación de los niveles intracelulares de guanosina monofosfato cíclico. Los elevados niveles de monofosfato cíclico estimulan la secreción de cloruro e inhiben la absorción de cloruro sódico.

Escherichia coli enteropatógena o enteroadherente.- Las cepas de ECEP se unen a las células de la mucosa intestinal produciendo pérdida de las microvellosidades de absorción. ECEP ocasionalmente es capaz de penetrar en las células de absorción produciendo generalmente diarrea de corta duración.

Escherichia coli enteroinvasora ECEI, invaden las células huésped y producen una respuesta inflamatoria significativa. Las manifestaciones son más de una disentería bacteriana con fiebre sanguinolenta en cuyas heces hay leucocitos polimorfonucleares. El tratamiento consiste en reposición hídrica y electrolítica debido a que estos microorganismos suelen ser resistentes a los antibióticos, la utilidad del tratamiento especifico es limitada.

Escherichia coli enterohemorrágica ECEH produce verotoxina, toxina que recibe este nombre por el efecto tóxico en las células vero, línea de células de riñón de mono verde africano, esta toxina produce en el hombre un tipo de diarrea grave con enterocolitis hemorrágica, con anemia hemolítica microangiopática,

trombocitopenia, síndrome urémico hemorrágico, insuficiencia renal y muerte.

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PROTEUS

Son bacilos Gram negativos de 0.4-0.8 micras de diámetro por 2 a 8 micras de longitud, móviles por flagelos perítricos, forman anillos concéntricos a partir del sitio de inoculación en los medios de cultivo, no fermentan lactosa, producen ácido y gas a partir del metabolismo de la glucosa.

Clasificación

El género Proteus agrupa cuatro especies:

Proteus vulgaris, morfológicamente presenta las características correspondientes al género, algunas cepas son hemolíticas en agar sangre, es causa frecuente de diarreas, infecciones nosocomiales, neumonía, septicemia y muerte en desnutridos y enfermos inmunocomprometidos.

Proteus mirabilis son hemolíticas en agar sangre con mayor frecuencia que P. vulgaris, causan infecciones urinarias y cálculos renales, generalmente son susceptibles a cefalosporinas, aminoglucósidos y penicilinas

Proteus myxofaciens bacteria productora de polisacáridos extracelulares a 25oC en caldo Soya tripticasa, es hemolítica en agar sangre. Afecta a desnutridos y enfermos inmunocomprometidos.

Proteus pennen: bacteria frecuentemente resistente a cloranfenicol y que se ha aislado ocasionalmente.

Estructura antigénica

El género Proteus presenta antígenos somáticos, se reconocen 17 para P. Vulgaris, 27 para P mirabilis y otros 5 compartidos por ambas especies, los antígenos flagelares (h) son 19, la reacción cruzada entre estas bacterias es frecuente por lo que la prueba de antígenos flagelares en la tipificación es limitada. El antígeno capsular (k) designado como antígeno C ha lo comparten P. vulgaris y P. Mirabilis.

Las Ricketsias tienen componentes antigénicos idénticos a los del género Proteus (antígenos OX-19, OX-2, OX-K), esta relación se utiliza para el diagnóstico del tifo, enfermedad causada por Ricketsias, en la prueba de Weil-

Félix.

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Proteus ha si considerado como una bacteria oportunista a la que se le ha mencionado como factor de patogenicidad a su capacidad de modificar el pH como consecuencia de la hidrólisis de la urea y producción de amonio.

Patología

Un 25 % de las personas son portadores asintomático. Como oportunista se encuentra en pacientes sometidos a cateterización, cirugía, instrumentación urológica, heridas y quemaduras. Puede ocurrir una autoinfección y septicemia.

En los procesos infecciosos esta involucrado en infecciones de vías urinarias, heridas, tracto respiratorio, ojos, oídos, gastroenteritis por consumo de alimentos contaminados, puede infectar el cordón umbilical conduciendo a bacteriemia y meningitis.

MEDIOS DE CULTIVO SELECTIVOS PARA EL AISLAMIENTO PRIMARIO DE ENTEROBACTERIAS EMB, MC CONKEY SS.

EMB

Medio de cultivo sólido en placas de color café oscuro a color vino. El colorante Azul de metileno del medio de cultivo inhibe moderadamente el crecimiento de bacterias Gram positivas. Método de siembra por estría cruzada.

Fórmula en Gramos por Litro de Agua Destilada

Peptona (Gelysate B-B-L)… 10.0 Sacarosa……………………… 5.0 Agar……………………………13.5 Eosina Y………………….. 0.4Azul de metileno…….…………0.065 Lactosa………………....... 5.0Fosfato Dipotásico………. 2.0

pH final 7.2 +

Morfología

Las colonias de los géneros Salmonella y Shigella forman colonias de 1 a 2 milímetros de diámetro aproximadamente, convexas de color ámbar. Mientras que las colonias de E.coli son planas de color azul obscuro con brillo metálico. Otros microorganismos entéricos forman colonias mucoides convexas de color café.

AGAR MAC CONKEY

Medio sólido en placa de color rojo a naranja. Contiene sales biliares que inhibe el crecimiento de un gran número de Gram positivos. Se siembra con técnica de aislamiento.

Fórmula en gramos por litro de Agua DestiladaGelysate ………………………17.0 Polypeptone ………………….. 3.0Lactosa ……………………… 10.0 Mezcla de Sales Biliares ….… 1.5Cloruro de Sodio …………… 5.0 Agar …………………………. 13.5Rojo Neutro …………………. 0.03 Violeta Cristal ……………… 0.001pH final 7.1 *

El Agar de Mac Conkey se puede emplear para la investigación de lo patógenos entéricos en heces y otros materiales, recomendándose hacer siembras paralelas en unos de los medios modernos y más definidos como el Agar con Desoxicolato

AGAR SS

El Agar para Salmonella y Shigellas es un medio sólido de color rojo en placas selectivo para el aislamiento de bacilos entéricos patógenos, especialmente los que pertenecen a los géneros Shigella y Salmonella. El medio es en realidad una modificación del Agar con Desoxicolato y Citrato descrito por Leifson, excepto que la inhibición de los organismos coniformes y Gram positivos se logra mejor con la mezcla de sales biliares. Se siembra con técnica de aislamiento.

Fórmula en Gramos por Litro de Agua DestiladaExtracto de carne de res………… 5.0 Polypeptone.......................... 5.0Lactosa....................................... 10.0 Mezcla de sales biliares.......... 8.5Citrato de sodio…………………... 8.5 Tiosulfato de sodio………...… 8.5Citrato férrico……………...…….... 1.0 Agar………………………..... 13.5Verde brillante…………...… 0.00033 Rojo neutro……………… 0.025pH final 7.0 +- Incúbese durante 18-24 horas

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Usos. El agar para Salmonella y Shigella puede inocularse con heces fecales, torundas rectales, orina u otros materiales que se sospeche contengan bacilos entéricos. Se recomienda inocular al mismo tiempo una placa de un medio con sales biliares puras, con menor poder inhibitorio, tal como el Agar con Desoxicolato Selenito F. Las colonias de especies que no fermentan la lactosa son incoloras, en tanto que las de coniformes u otros organismos que sí la fermentan son rosadas o rojas.

SIMMONS, AGAR CITRATADO DE

El Agar Citratado de Simmons.- Es un medio sólido de color verde, en placas o en tubos con pico de flauta, se usa para diferenciar las bacterias entéricas Gram negativas, basándose en la utilización de citrato. Técnica de siembra por estría cruzada en placas y por estría superficial en el pico de flauta y picadura en el fondo.

Fórmula en Gramos por Litro de Agua DestiladaFosfato Monobásico de Amonio ......1.0 Fosfato Dipotásico ......................1.0Cloruro de Sodio ..............................5.0 Citrato de Sodio ..........................2.0Sulfato de Magnesio .........................0.2 Agar .........................................15.0Azul de Bromotimol ........................ 0.03 pH final 6.9 +

Sólo los organismos que utilizan el citrato como única fuente de carbono crecen en Agar Citratado de Simmons. La aparición de un crecimiento visible por el desarrollo de colonias, va acompañado en general de un cambio del color verde del medio ácido, al color azul alcalino del indicador azul de Bromocresol.

AGAR SULFITO DE BISMUTO

El agar sulfito de bismuto es una modificación del medio de Wilson y Blair, para el aislamiento Salmonella typhi y otros bacilos entéricos nótese la inclusión de glucosa en la fórmula. La fermentación de glucosa produce reducción del sulfito, con formación de sulfuro de hierro y colonias negras con brillo metálico El metal pesado bismuto y el verde brillante son inhibidores del desarrollo de todas las bacterias Gram positivas y de la mayoría de las Gram negativas, excepto las Salmonellas. Algunas cepas del género Shigellas crecen bien. El medio se debe usar el mismo día que se prepara, lo cual limita su empleo general en muchos

laboratorios.

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Fórmula en gramos por litro de agua destilada.

Extracto de carne........... 5.0 g Peptona....................... 10.0 gGlucosa......................... 5.0 g Fosfato disódico............ 4.0 gSulfato ferroso............... 0.3 g Sulfito de bismuto........... 8.0 gVerde brillante............... 0.025 g Agar...............................20..0 g.Agua destilada c.s.p. pH final = 7.

La mayoría de los coliformes fermentadores de lactosa y las Shigellas son totalmente inhibidos. Las colonias de Salmonella typhi son negras con brillo metálico. La mayoría de las cepas de Salmonella enteritidis forman colonias negras y sin brillo. S. gallinarum, S. choleraesuis y S. paratyphi forman colonias verdosas.

Material para la práctica.

1 Microscopio1 Asa bacteriológica1 Mechero de BunsenPortaobjetosJuego de reactivos para tinción de Gram4 cajas de agar EMB2 cajas de Agar SS2 cajas de sulfito de Bismuto1 caja de agar verde brillante1 Cepa pura de Salmonella Typhi 1 Cepa pura de Shigella sp1 Cepa pura de Escherichia coli1 Cepa pura de Proteus sp

Procedimiento

1.- Tomar una asada del medio de cultivo que contiene la cepa pura de Escherichia coli y sembrar con técnica de aislamiento en una caja de las cajas con Agar EMB. Hacer el mismo procedimiento con las cepas de Salmonella Typhi, Shigella sp y Proteus sp.

2.- Tomar una asada del medio de cultivo que contiene Salmonella Typhi y sembrar con técnica de aislamiento en una de las cajas que contienen agar SS. Hacer el mismo procedimiento con la cepa de Shigella sp.

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3.- Tomar una asada del medio de cultivo que contiene Salmonella Typhi y sembrar con técnica de aislamiento en una de las cajas que contienen agar Sulfito de bismuto. Hacer el mismo procedimiento con la cepa de Shigella sp.

4.- Tomar una asada del medio de cultivo que contiene Salmonella Typhi y sembrar con técnica de aislamiento en una de las cajas que contienen agar verde brillante.

5.- Incubar a 37° C durante 24 horas y reportar la morfología colonial. Guardar los medios de cultivo en refrigeración para pruebas bioquímicas en la siguiente sesión.

6.- Hacer Tinciones de Gram de cada una de las cepas y reportar la morfología celular.

CUESTIONARIO

1.- Describa las características morfológicas coloniales de E. Coli en EMB.

2.- Describa las características morfológicas coloniales de Salmonella typhi. en agar SS.

3.- Describa las características morfológicas coloniales de Shigellas en agar SS.

4.- Describa las características morfológicas coloniales de Salmonella typhi en agar Mc Conkey.

5.- Describa las características morfológicas coloniales de Proteus en agar Mc Conkey.

IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIAS POR PRUEBAS BIOQUÍMICAS

Práctica 19

Objetivos

1.- El alumno conocerá el fundamento bioquímico de las reacciones positivas en los medios de cultivo sólidos TSI, SIM, LIA, MIO, Agar citratado de Simmons.

2.- El alumno conocerá el fundamento bioquímico de las reacciones positivas en el medio de cultivo líquido Caldo con urea o en el medio sólido Agar con urea de Christensen.

3.- El alumno aplicará las técnicas de siembra en tubos para los medios de cultivo sólidos TSI, SIM, LIA, MIO, Agar citratado de Simmons y agar con urea de Christensen de las colonias aisladas por resiembra, a partir del hemocultivo.

4.- El alumno aplicará la técnica de siembra en tubos para el medio de cultivo líquido Caldo con urea de las colonias aisladas por resiembra, a partir del hemocultivo.

5.- El alumno interpretará las pruebas positivas y reportará a los géneros y especies bacterianas identificadas como posibles patógenas.Para facilitar la identificación de estos bacilos entéricos patógenos, se dispone de medios de cultivo para pruebas múltiples como, TSI, SIM, MIO, LIA y de otros medios como Agar con urea, etc., que resultan ser diferenciales por algunas reacciones bioquímicas que se producen como resultado del metabolismo bacteriano específico, no solo de género, sino también de especie.

Las pruebas bioquímicas principales que pueden ser demostrables en estos medios de cultivo son:

TSI

Metabolismo o fermentación de hidratos de carbono como glucosa, sacarosa, lactosa, manitol, etc., La reacción de fermentación se evidencia por un cambio de color, de rojo normal del medio de cultivo por la adición al medio de Rojo de fenol, indicador de pH., al color amarillo que se produce por la acidificación del medio por acción de los ácidos láctico o pirúvico.

Producción de sulfuro ferroso se demuestra por el ennegrecimiento del medio de cultivo. En esta reacción se produce sulfuro ferroso a partir del aminoácido cisteína o de tiosulfato sódico que contiene el medio de cultivo. En la primera etapa el tiosulfato o la cisteína son reducidos con la participación de las enzimas cisteína o tiosulfato disulfhidrasas para formar ácido sulfhídrico (H2S) mas amoníaco (NH3), en la segunda etapa el ácido sulfhídrico (H2S) reacciona con la sal fuerte que contiene el medio de cultivo, citrato de amonio férrico, para formar sulfuro ferroso que produce un precipitado de color negro en el medio.

Producción de Indol, se produce a partir del triptófano que se encuentra en las peptonas del medio de cultivo TSI. El triptófano puede ser oxidado por la acción de enzimas bacterianas, las triptofanasas, que dan origen a tres productos indólicos, Indol, escatol y ácido indolacético en reacciones bioquímicas específicas. La desaminación del triptófano produce Indol que se demuestra adicionando unas cuantas gotas del reactivo de Kovac o de Ehrlich al medio, formándose un anillo de color rojo en la parte superior del medio de cultivo.

Movimiento bacteriano conferido por flagelos, cuando el medio SIM es inoculado por punción cuidadosamente con el asa recta, las cepas móviles crecen lejos del sitio de la inoculación.

La ureasa es una enzima bacteriana capaz de hidrolizar a la urea formando dos moléculas de amoníaco que finalmente es convertido en carbonato de amonio, estos compuestos derivados de la urea alcalinizan el medio de cultivo que cambia de color de rosa tenue (durazno) a rojo por el indicador de pH rojo de fenol.

Medios de cultivo para pruebas bioquímicas

TSI Agar con tres azúcares y hierro.- TSI es un medio de cultivo sólido en tubos inclinados con pico de flauta, el medio es de color rojo por el indicador de pH rojo de fenol, contiene lactosa en la superficie, sacarosa y glucosa en el fondo del tubo. El agar con tres azucares y hierro lo ideó Hajna para diferenciar los bacilos entéricos Gram negativos por su habilidad para atacar la glucosa, lactosa y sacarosa y liberar sulfuros.

Fórmula en Gramos por Litro de Agua Destilada

Polypeptone………………………………………………. 20.0Cloruro de Sodio ………………………………………… 5.0Lactosa……………………………………………………. 10.0Sacarosa………………………………………………….. 10.0Glucosa…………………………………………………… 1.0Sulfato de Amonio Ferroso …………………………….. 0.2Tiosulfato de Sodio……………………………………… 0.2Rojo de Fenol……………………………………………. 0.025Agar. ……………………………………………………… 13.0 pH final 7.3 +

Preparación

Se suspenden los 59.4 gramos del polvo en un litro de agua destilada. Mézclese bien y caliéntese agitando de vez en cuando. Hiérvase durante 1 ó 2 minutos para disolver. Distribúyase en tubos de ensayo, llenándolos hasta su tercera parte. Esterilícese a no más de 118°C durante 15 a 17 minutos. Los tubos se deben enfriar en posición inclinada, de tal manera que produzcan fondos profundos con pico de flauta.

Técnica de siembra.

El Agar TSI inclinado se debe inocular a partir de las colonias seleccionadas como EMB, Agar Mc Conkey o de otras fuentes apropiadas. EL cultivo se debe estriar en la porción inclinada y picar hasta un centímetro antes del fondo. Los cultivos se leen después de 18 a 48 horas de incubación a 37° C.

Metabolismo de Carbohidratos.- Fundamento.- El metabolismo bacteriano de alguno o de los tres carbohidratos da como resultado la producción de ácido pirúvico y ácido láctico (fermentación ácida), por lo que medio de cultivo se acidifica, esta acidez se evidencia por un cambio de color del medio de rojo o rosa intenso al color amarillo por la acción del indicador rojo de fenol. Si el medio se conserva alcalino no hay cambio de color, conservándose el medio de cultivo de color rojo.

Escherichia coli fermenta los tres azúcares por lo que todo el medio de cultivo, tanto el pico de flauta como el fondo, cambiarán al color amarillo.

El género Salmonella fermenta glucosa pero no lactosa, por lo que el pico de flauta permanece rojo, pero el fondo será de color amarillo.

Producción de Sulfuro ferroso en TSI

Fundamento.- Algunas bacterias son capaces de degradar aminoácidos azufrados como cisteína y metionina, o de utilizar tiosulfato como sustrato, liberando el azufre de estos compuestos para formar ácido sulfhídrico H2S en forma gaseosa gracias a la acción de enzimas bacterianas como la cisteína disulfhidrasa y tiosulfato reductasa, este medio contiene Sulfato de Amonio Ferroso y Tiosulfato de sodio, este último es el primer sustrato que utiliza la enzima tiosulfato reductasa bacteriana para formar ácido sulfhídrico incoloro el cual reacciona posteriormente con el Sulfato de Amonio Ferroso para formar sulfuro ferroso que forma un precipitado negro en el medio. Las especies del género Proteus y Salmonella producen sulfuro ferroso que se evidencia por un precipitado de color negro en el medio. E. Coli y Shigellas son negativas.

SIM

Azufre Indol y movimiento.- Medio de cultivo sólido en tubos de color ligeramente ámbar transparente. Se emplea para la determinación de la producción de sulfuro ferroso, formación de Indol y movimiento de enterobacterias.

Fórmula en gramos por litro de agua destilada.

Trypticase............................20.0 grs. Thiotone (peptonas)............ 6.1 grs.Sulfato de hierro y amonio... 0.2 grs. Tiosulfato de sodio............... 0.2 grs.Agar...................................... 3.5 grs. pH final 7.3 +

Preparación

Se suspenden los 30 gramos del material seco en un litro de agua destilada,

mézclese bien y cuando se obtenga la suspensión uniforme, caliéntese agitando de cuando en cuando y hiérvase durante un minuto o hasta su disolución. Distribúyase en tubos de ensayo, llenándolos hasta su tercera parte. Esterilícese a 121°C a 15 libras de presión durante 15 minutos.

Técnica de siembra

El Agar SIM se debe inocular por picadura en el centro hasta la mitad o un centímetro antes del fondo. Las muestras se toma de las colonias seleccionadas como EMB, Agar Mc Conkey

Sulfuro ferroso.- Fundamento.- Algunas bacterias son capaces de degradar aminoácidos azufrados como cisteína y metionina, o de utilizar tiosulfato como sustrato, liberando el azufre de estos compuestos para formar ácido sulfhídrico H2S en forma gaseosa gracias a la acción de enzimas bacterianas como la cisteína disulfhidrasa y tiosulfato reductasa. Este medio contiene Sulfato de Amonio Ferroso y Tiosulfato de sodio, este último es el primer sustrato que utiliza la enzima tiosulfato reductasa bacteriana para formar ácido sulfhídrico incoloro el cual reacciona posteriormente con el Sulfato de Amonio Férrico que contiene el medio de cultivo para formar sulfuro ferroso que forma un precipitado negro en el medio. Las especies del género Proteus y Salmonella producen sulfuro ferroso que se evidencia por el color negro del medio. Escherichia coli y Shigellas no producen H2S por lo que el medio conserva su color original.

Indol. Fundamento.- El alto contenido de trypticase (triptófano) en el medio SIM, lo hace ideal para la producción de indol. El triptófano puede ser desaminado o descarboxilado por la acción de la enzima triptofanasa que producen algunas bacterias utilizando como coenzima al fosfato de piridoxina (vitamina B6) dando origen a tres metabolitos indólicos por reacciones específicas de la enzima (indol, escatol y ácido indolacético) liberando una molécula de amoniaco. La desaminación del triptófano produce Indol. La inmediata aparición de un anillo de color rojo cuando se agregan cinco gotas del reactivo de Kovac (Alcohol amílico o butílico + Dimetilaminobenzaldehído + HCL concentrado) al medio de cultivo incubado durante 24 horas indica la presencia de Indol y se considera una prueba positiva. Escherichia coli es capaz de producir Indol por lo que al agregar 5 gotas del reactivo de Kovac, se forma un anillo rojo en la superficie del medio SIM.

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Movimiento positivo en el medio SIM.- Gracias a sus flagelos perítricos los géneros Salmonella, Proteus, Escherichia coli se desplazan alejándose de la

picadura dando un aspecto de remolino o turbidez alrededor de la picadura.

Los géneros Klebsiella y Shigella no tienen movimiento.

LIA.- Agar lisina con hierro

Medio sólido en tubos con pico de flauta de color rosa.

Determina si los miembros de la familia Enterobcteriaceae descarboxilan o desaminan la lisina.Ayuda en la identificación de especies de Salmonella la mayoría de la cuales son H2S positivas y lisina positivas.

Fórmula

Agar ...................................15.0 g Peptona de gelatina.........5.0 gExtracto de levadura.............3.0 g Glucosa............................1.0 gL-lisina.................................. 1.0 g Citrato férrico-amónico.... 0.5gTiosulfato de sodio anhidro... 0.4 g Púrpura de bromocresol.. 2.0 mgAgua destilada.................... 1000 ml pH final: 6,7 + 0,2

Fraccionar en cantidades de 4 ml. (tubos para la prueba 13 X 100 mm).Agar inclinado extremo inferior profundo, ( anaerobio) con pico de flauta corto.

Técnica de siembra

Con el asa bacteriológica recta, estriar el pico de flauta y punzar el fondo del medio dos veces. Dejar las tapas del medio de cultivo ligeramente flojas. Incubar durante 18 a 24 hrs., a 35° C.

Descarboxilación de la lisina.- Fundamento. La descarboxilación es el proceso por el cual las bacterias que poseen enzimas descarboxilasas específicas atacan a los aminoácidos en su carboxilo terminal (COOH) para formar una amina o una diamina y dióxido de carbono.

aminoácido amina dióxido de carbono

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Existen numerosas enzimas descarboxilasas utilizadas para la identificación

bacteriana, las tres mas importantes son lisina, ornitina y arginina descarboxilasas.

Estas descarboxilasas son enzimas adaptativas o inducidas y solo se activan cuando un microorganismo es cultivado en un ambiente ácido en presencia de un sustrato especifico. Los productos de la descarboxilación de estos aminoácidos cambian el pH a limites alcalinos. La descarboxilación que producen estas enzimas, esta restringida a los aminoácidos que poseen por lo menos un grupo químicamente activo distinto de una amina como (NH2) y a los aminoácidos que tienen un grupo carboxilo (COOH).

Este tipo de descarboxilación ocurre en anaerobiosis, es decir, cuando en la glicólisis se obtienen lactato y piruvato como productos finales que acidifican el medio de cultivo y activan a las enzimas descarboxilasas. La descarboxilación es irreversible no oxidativa y por lo general requiere una coenzima común, fosfato de piridoxal, que refuerza mas la actividad de las descarboxilasas. El aminoácido L-lisina es descarboxilado para formar cadaverina, una diamina y dióxido de carbono, por la acción de la enzima especifica lisina descarboxilasa.

El aminoácido L- ornitina es descarboxilado por la enzima ornitina descarboxilasa para formar la diamina putresina y dióxido de carbono.

Todos los integrantes de la familia Enterobacteriaceae causan una fermentación inicial de la glucosa con producción de ácidos que originan un cambio en el indicador de pH del púrpura al amarillo en el curso de las primeras 10 a 12 hrs. de incubación.

En respuesta a la acidez, los microorganismos que producen lisina descarboxilasa forman una amina, cadaverina, que alcaliniza al medio de cultivo, manifestándose por un nuevo viraje del indicador de pH púrpura de bromocresol, a la alcalinidad (color púrpura).

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Interpretación de la descarboxilación de la lisina

Positivo (+): El pico de flauta se observa de color púrpura (alcalino) y el extremo inferior púrpura (alcalino), puede haber producción de ácido sulfhídrico (H2S) o sin él.

Negativo (-) pico de flauta púrpura y el extremo inferior amarillo (ácido) que indica solo la fermentación de la glucosa sin descarboxilación de la lisina.

La reacción de descarboxilación en el extremo inferior (púrpura), puede enmascararse por el color negro del sulfuro ferroso a partir del H2S que producen algunas bacterias. La producción de H2S se produce en un medio alcalino (púrpura).

Producción de sulfuro ferroso.- Algunas bacterias son capaces de degradar aminoácidos azufrados como cisteína y metionina, o de utilizar tiosulfato como sustrato, liberando el azufre de estos compuestos para formar ácido sulfhídrico H2S en forma gaseosa gracias a la acción de enzimas bacterianas como la cisteína disulfhidrasa y tiosulfato reductasa, este medio contiene Sulfato de Amonio Ferroso y Tiosulfato de sodio, este último es el primer sustrato que utiliza la enzima tiosulfato reductasa bacteriana para formar ácido sulfhídrico incoloro el cual reacciona posteriormente con el Sulfato de Amonio Ferroso para formar sulfuro ferroso que forma un precipitado negro en el medio

MIO (Motility-Indole-Ornitine o Motilidad-Indol-Ornitina).- Esta prueba bioquímica permite identificar bacterias de acuerdo a su motilidad a la producción de Indol y a la descarboxilación de la ornitina.

Fórmula en gramos por litro:

Dextrosa................................................1.0 grs.Extracto de levadura.............................3.0 grs.Peptona...............................................10.0 grs.Tripteína..............................................10.0 grs.Clorhidrato de Ornitina..........................5.0 grs.Agar.......................................................2.0 grs.Púrpura de bromocresol.........................0.02 grs.pH final: 6.5 ± 0.2

Los tubos se siembran por punción con asa recta hasta un centímetro antes del fondo. Incubar por 24 horas a 37° C.

Movilidad. La movilidad se demuestra por un enturbiamiento del medio o un

crecimiento que se difunde desde la línea de inoculación, mientras en las no móviles crece a lo largo de la línea de siembra.

Indol.- Fundamento.- El triptófano que contiene el medio MIO puede ser desaminado o descarboxilado por la acción de la enzima triptofanasa que producen algunas bacterias, utilizando como coenzima al fosfato de piridoxina (vitamina B6) dando origen a tres metabolitos indólicos (indol, metilindol y ácido indolacético) y liberando una molécula de amoniaco. La desaminación del triptófano produce Indol. La inmediata aparición de un anillo de color rojo cuando se agregan cinco gotas del reactivo de Kovac (Alcohol amílico o butílico + Dimetilaminobenzaldehído + HCL concentrado) al medio de cultivo incubado durante 24 horas indica la presencia de Indol. La prueba de indol se realiza una vez que se ha determinado la movilidad bacteriana.

Descarboxilación de la ornitina.- Fundamento. La descarboxilación es el proceso por el cual las bacterias que poseen enzimas descarboxilasas específicas atacan a los aminoácidos en su carboxilo terminal (COOH) para formar una amina o una diamina y dióxido de carbono.

aminoácido amina dióxido de carbono

Existen numerosas enzimas descarboxilasas utilizadas para la identificación bacteriana, las tres mas importantes son lisina, ornitina y arginina descarboxilasas.

Estas descarboxilasas son enzimas adaptativas o inducidas y solo se activan cuando un microorganismo es cultivado en un ambiente ácido en presencia de un sustrato especifico, ornitina.

Los productos de la descarboxilación de estos aminoácidos cambian el pH a limites alcalinos. La descarboxilación que producen estas enzimas, esta restringida a los aminoácidos que poseen por lo menos un grupo químicamente activo distinto de una amina como (NH2) y a los aminoácidos que tienen un grupo carboxilo (COOH).

El aminoácido L- ornitina es descarboxilado por la enzima ornitina descarboxilasa para formar la diamina putresina y dióxido de carbono.

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Todos los integrantes de la familia Enterobacteriaceae causan una fermentación inicial de la glucosa con producción de ácidos que originan un cambio en el indicador de pH del púrpura al amarillo en el curso de las primeras 10 a 12 hrs. de incubación. En respuesta a la acidez, los microorganismos que producen ornitina

descarboxilasa forman una amina, putresina, que alcaliniza al medio de cultivo, manifestándose por un nuevo viraje del indicador de pH púrpura de bromocresol, a la alcalinidad (color púrpura).

Este tipo de descarboxilación ocurre en anaerobiosis, es decir, cuando en la glicólisis se obtienen lactato y piruvato como productos finales que acidifican el medio de cultivo y activan a las enzimas descarboxilasas.

La reacción positiva de la ornitina está dada por un color púrpura del medio debido a la fermentación de la glucosa que reduce el pH proporcionando condiciones óptimas para la decarboxilación de la ornitina de la fórmula. Si ocurre la decarboxilación de la ornitina el pH sube y el color del medio se vuelve púrpura gracias al indicador púrpura de bromocresol. Los cultivos negativos a ornitina producen un tubo amarillo que puede ser púrpura en la parte superior.

SIMMONS, AGAR CITRATADO DE

El Agar Citratado de Simmons.- Medio sólido de color verde en placas o en tubos inclinados, se usa para diferenciar las bacterias entéricas Gram negativas, basándose en la utilización de citrato.

Fórmula en Gramos por Litro de Agua DestiladaFosfato Monobásico de Amonio ................................................. 1.0Fosfato Dipotásico ......................................................................... 1.0Cloruro de Sodio ............................................................................ 5.0Citrato de Sodio ............................................................................. 2.0Sulfato de Magnesio ...................................................................... 0.2Agar ........................................................................................ 15.0Azul de Bromotimol ................................................................... 0.03

Preparación

Suspender los 24.2 gramos de polvo en un litro de agua destilada. Déjese remojar durante 5 a 10 minutos. Mezclar bien y calentar suavemente agitando de vez en cuando hasta que el medio hierva durante 1 o 2 minutos.

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Distribuyese en tubos y esterilícese en autoclave a 121°C. (15 libras de presión) durante 15 minutos. Se deja enfriar en posición inclinada, aunque también se puede emplear como medio en placas.

Técnica de siembra

Se pueden hacer cultivos en placa con técnica de aislamiento o si se prefiere el medio inclinado, se inocula estriando la superficie y picando el fondo.

Fundamento.- Solo los organismos que utilizan el citrato como única fuente de carbono crecen en el Agar Citratado de Simmons. El citrato es obtenido del citrato de sodio que contiene el medio para ser incorporado directamente al ciclo de los ácidos tricarboxílicos (Krebs) para su metabolismo y producción de energía. Esta reacción es catalizada por la citrato desmolasa o citratasa enzimas bacterianas que requieren de un medio alcalino y de cationes divalentes como magnesio para su activación.

Algunas enterobacterias son capaces de degradar las sales de amonio (fosfato monobásico de amonio) del medio para formar amoníaco (NH3) para ser utilizado como fuente nitrogenada para su metabolismo. El nitrógeno liberado en forma de amoníaco es convertido en hidróxido de amonio (NH4OH) mas fosfato orgánico, estos dos productos proporcionan las condiciones óptimas para la activación de la citratasa que obtiene al citrato y lo incorpora al ciclo de Krebs.

La aparición de un crecimiento bacteriano visible indica la utilización del citrato como fuente de carbono. De manera indirecta se comprueba por un cambio de color del medio de cultivo, del color verde normal, al color azul que indica la alcalinización del medio por el del indicador de pH, azul de bromotimol.

Los géneros Salmonella y Proteus generalmente sin citrato positivas, en cambio Klebsiella, Shigellas y E. coli son negativas.

AGAR CON UREA DE CHRISTENSEN

El Agar con urea de Christensen es un medio de cultivo sólido en tubos con pico de flauta que se utiliza para detectar la actividad de la ureasa, enzima bacteriana que hidroliza a la urea convirtiéndola en dos moléculas de amoníaco que finalmente forman carbonato de amonio.

Estos productos alcalinizan el medio de cultivo haciendo que cambie de color, de rosa tenue a rojo por la acción del indicador Rojo de fenol.

Fórmula en gramos por litro de agua destilada.

Peptona............................. 1.0 gr. Cloruro de sodio................ 5.0 grs.Fosfato monopotásico....... 2.0 grs. Glucosa .............................. 1.0 grs.Urea....................................20.0 grs. Rojo de fenol.........................0.012 grs.---------- pH final 6.8 + -----------

Preparación

Se pesan 3.87 grs. Para cada 100 ml de agua destilada y se disuelve sin calentar.Se distribuye en tubos estériles de 13 X 100 mm, en fracciones de 2 ml.Esterilizar en autoclave de 115 a 121° C a 15 libras de presión por 15 minutos.Déjense enfriar los tubos a 50° C y colocar en forma inclinada.

Técnica de siembra

Se debe estriar superficialmente con un inóculo grande, el fondo sirve como control del color, por lo que no debe puncionarse.

El Agar con urea de Christian elimina la necesidad de que los microorganismos utilicen el amoníaco como única fuente de nitrógeno para su metabolismo, la glucosa que contiene el medio permite el crecimiento de un buen número de géneros que además podrán evidenciar la producción de ureasa alcalinizando el medio de cultivo haciendo que cambie del color normal al rojo por el indicador Rojo de fenol.

La mayor parte de las especies del género Proteus dan una reacción fuertemente positiva (de 4 cruces) a las 24 hrs., de incubación. Otros géneros de bacterias paracólicas dan una pequeña reacción positiva desde las 6 primeras horas de incubación que se intensifica hasta 4 cruces hasta después de tres días. Otros géneros menos positivos a la ureasa dan una reacción leve después de 6 días.

CUESTIONARIO

1.- Mencione el fundamento de las pruebas bioquímicas en el medio deTSI.

2.- Mencione el fundamento de las pruebas bioquímicas en el medio de SIM.

3.- Mencione el fundamento de las pruebas bioquímicas en el medio de LIA.

4.- Mencione el fundamento de las pruebas bioquímicas en el medio de Citrato de Simmons.

5.- Mencione el fundamento de las pruebas bioquímicas en el medio de agar con urea de Christensen.

COPROCULTIVO

Práctica 20

OBJETIVOS

1.- El alumno conocerá la importancia del coprocultivo para la identificación de enterobacterias.

2.- El alumno conocerá la técnica de la toma de la muestra para el coprocultivo.

3.- El alumno conocerá la técnica de siembra en los medios de cultivo tetrationato y caldo Selenito.

Etiología de la diarrea infecciosa

La gastroenteritis o diarrea infecciosa aguda, es un síndrome cuya etiología puede ser viral, bacteriana o parasitaria que afecta al estómago e intestinos y se manifiesta por evacuaciones diarreicas, cólicos intestinales, náusea, vómito, fiebre y deshidratación. El desequilibrio hidroelectrolítico es la complicación principal que pone en riesgo la vida. Afecta principalmente a niños menores de 5 años.

Rotavirus, Parvovirus y Norwalk virus.- La gastoenteritis aguda es causada principalmente por virus. El agente etiológico que individualmente es la causa mas frecuente de diarrea en niños menores de 5 años es el Rotavirus. Otros tipos como Adenovirus, Astrovirus, Enterovirus, Coronavirus y Calicivirus, también pueden producir gastroenteritis.

Los microorganismos bacterianos que con mayor frecuente se aíslan de las heces fecales de enfermos con diarrea aguda pertenecen a los géneros Shigella y Salmonella invasoras de la mucosa intestinal. Entre las bacterias productoras de enterotoxinas se encuentran Escherichia coli, Klebsiellas, Proteus y Pseudomona.

El coprocultivo es el estudio de la materia fecal para la búsqueda e identificación de organismos bacterianos causantes de fiebres de origen intestinal, diarreas agudas o crónicas.

72Las muestras de heces, los raspados rectales y la obtención de bilis y material

extraído por drenaje duodenal cultivadas en medios enriquecidos y selectivos ponen de manifiesto a los agentes bacterianos causantes de diarrea infecciosa

aguda. Inicialmente debe realizarse un examen macroscópico de las heces, la consistencia, el color, la presencia de moco, pus o sangre pueden ser sugestivas

para la elección de los medios de cultivo y permiten además la toma de una muestra representativa para el cultivo.

El aislamiento primario debe incluir medios de cultivo enriquecidos tanto para enterobacterias como para bacterias Gram positivas. Caldo base con tetrationato y caldo Selenito F, Mc Conkey y EMB para enterobacterias, Agar sangre para bacterias Gram positivas

CALDO BASE CON TETRATIONATO

El caldo base con tetrationato y solución yodo yodurado es un medio enriquecido y selectivo para el aislamiento del género Salmonella. Las sales del medio y el yodo inhiben el crecimiento de Gram positivas y un gran número de Gram negativas

Fórmula en gramos por litro de agua destilada.

Polypeptone....................5.0 Carbonato de calcio.......10.0 Sales biliares.................. 1.0Tiosulfato de sodio.........30.0

Solución yodo yodurado. Yodo............................... 6.0 g. Yoduro de potasio........... 5.9 gAgua................................20 ml.

Con un hisopo estéril se recolectan uno a dos gramos de heces fecales y que se mezclan en 10 mililitros del caldo con tetrationato, dejando en hisopo en el interior del medio de cultivo. La mezcla se incuba durante 24 horas a 37° C., posteriormente se siembra en placas con medios selectivos.

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SELENITO – F.- El caldo de Selenito F en tubos es de color blanco, se emplea para aislar Salmonellas, Shigellas y Pasteurellas.

Fórmula en gramos por litro de agua destilada.Polypeptone.............................5.0 g. Lactosa.................................. 4.0 g.Fosfato de sodio....................10.0 g. Selenito ácido de sodio.......... 4.0 g.

Agréguese uno a dos gramos de heces fecales, en tubos con 10 mililitros del caldo y agite con asa bacteriológica o bien tome la muestra con un hisopo estéril y colóquela dentro del medio de cultivo. La mezcla se incuba durante 24 horas a 37° C. El crecimiento de bacilos tíficos o paratíficos es mas rápido que otros coliformes por lo que no debe de incubarse por mas tiempo. Aunque el medio Selenito F se ideó ante todo como medio enriquecido y selectivo para los miembros del género Salmonella, en el se pueden aislar los bacilos disentéricos como Shigella sonei.

CUESTIONARIO

1.- Mencione a los principales géneros bacterianos causantes de diarrea infecciosa aguda.

2.- Diga cuales son los medios de cultivo selectivos usados en el coprocultivo.

3.- Mencione la técnica de siembra en el medio líquido con tetrationato.