resumen de las caracteristicas Morfológicas Externas de Embriones y fetos
DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO DE LA … · TIPO DE MUESTRA TÉCNICA FETOS Pulmón, riñón, hígado,...
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DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO DE LA INFECCIÓN POR EL VIRUS DE LA
RINOTRAQUEÍTIS INFECCIOSA BOVINA (IBRV)
Puede haber sospecha de la IBR por la sintomatología de la enfermedad,
basándonos en datos epidemiológicos, clínicos y lesiones, pero dado que no son
definitivos y pueden confundirse con otras enfermedades e incluso, en muchas
ocasiones presentarse sin sintomatología, se necesita un examen de laboratorio para
llegar a un diagnóstico definitivo. El diagnóstico de laboratorio se basa en la detección
del virus causante o de sus componentes y/o de los anticuerpos específicos que
induce. Se hace referencia a las técnicas de diagnóstico más utilizadas en los
laboratorios de análisis rutinarios.
Diagnóstico de la IBR en un brote sintomático
En estos casos se intentará detectar el virus a partir de las lesiones que
presenten los animales. Estas muestras serán hisopos de exudados nasales o
traqueales en el caso de sintomatología respiratoria y de hisopos genitales en los casos
de vulvovaginitis y balanopostitis.
Igualmente se puede detectar la presencia de un brote mediante la serología.
Para ello es necesario tomar muestras de sangre de los mismos animales en fase aguda
y convaleciente (21 días después aproximadamente) de la infección para observar si ha
existido seroconversión.
En el caso de animales muertos o abortos pueden recogerse las muestras de los
principales órganos (tabla 1) y conservarlas refrigeradas hasta su urgente envío al
laboratorio o incluso llevar el animal o feto entero para su necropsia en el laboratorio
(ilustración1).
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Tabla 1. Muestras de elección para el diagnóstico de la IBR.
TIPO DE MUESTRA TÉCNICA
FETOS Pulmón, riñón, hígado, bazo,
timo, parótida y placenta
Aislamiento vírico, IF, PCR
Líquidos fetales ELISA-AC, SN
Suero de la madre ELISA-AC, SN
BECERROS
NEONATOS
Pulmón, riñón, hígado, bazo y
timo
Aislamiento vírico, IF, PCR
Suero de la madre ELISA-AC
ANIMALES
MUERTOS
Pulmón, riñón, hígado y bazo Aislamiento vírico, IF, PCR
Exudado torácico ELISA-AC, SN
Otras muestras según lesiones Según muestra
ANIMALES
VIVOS
Semen, lavados traqueales,
hisopos nasales, bucales, o
genitales según lesión
Aislamiento vírico, IF, PCR
Suero de animales en fase aguda
y convaleciente
SN, ELISA-AC:
Observar seroconversión
Ilustración 1.Toma de muestras en feto bovino.
Líquidos fetales
Parótida Hígado Riñón
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Es necesario que las muestras lleguen lo menos contaminadas posibles al
laboratorio para evitar la inactivación del virus en el caso de que se intente su
aislamiento. Un buen procedimiento para la recogida de muestras en el caso de
sintomatología respiratoria, que es la más común en los brotes de IBR, es la recogida
de exudados traqueales, menos contaminados que los nasales, con objeto de
analizarlos para el herpesvirus tipo-1 (BHV-1) y bacterias. La aspiración transtraqueal
(ATT) es una técnica inofensiva para el animal, pues los únicos efectos indeseables que
pueden aparecer son una ligera hemorragia en el punto de punción o la emisión de
moco sanguinolento por la nariz, remitiendo ambos signos espontáneamente en
algunos minutos. La técnica requiere entre 10 y 15 minutos y no precisa trabajar
estérilmente, pero sí con el máximo de higiene, evitando cualquier contacto del
catéter con la piel del animal o del veterinario.
Descripción de la ATT (ilustración 2): En el caso que el animal sea muy nervioso,
previamente al inicio de la técnica, se puede tranquilizar al animal con un fármaco
sedante y aplicar anestesia local con la inyección subcutánea de 5 ml. de xilocaína en el
punto de punción. Para realizar la técnica el animal debe sujetarse adecuadamente de
tal manera que la cabeza quede en posición alta con el cuello en extensión moderada.
El lugar de la punción se sitúa en la zona media del cuello, en donde la tráquea
se palpe más fácilmente. La zona de intervención se afeita se afeita y se desinfecta con
alcohol o povidona iodada. El veterinario atraviesa primero la piel con el trócar del
catéter venoso de 75 cm. de longitud, dirigiendo el bisel de éste hacia abajo.
Posteriormente, se acerca la punta del trócar contra la tráquea, perforando
ésta perpendicularmente a su orientación, bien entre dos anillos traqueales o uno de
ellos. La extremidad del trócar se orienta en dirección al pulmón y se empuja el catéter
en la tráquea. En el caso de que el animal tosa, sobre todo, al pasar el cruce traqueo-
bronquial, se interrumpe la progresión del catéter para evitar que el mismo se retuerza
en dirección a la cavidad nasal. Cuando finalice el acceso de tos, se hará introducirá el
catéter entre 40 y 70 cm. según la edad y el tamaño del animal.
Se extrae el trócar de la tráquea y de la piel para evitar heridas si el animal se
mueve. Rápidamente se inyectan 50-60 ml. de solución fisiológica isotónica estéril con
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una jeringa estéril e inmediatamente se reaspira; de esta forma se recupera entre 1 y
10 ml. de líquido (de media 2-3 ml.). El aspecto turbio y/o mucoso del líquido, a veces
teñido de sangre, indica que la toma de muestra se ha realizado correctamente; en
caso contrario, se pueden inyectar de nuevo 50 ml. de solución y aspirar sin que
suponga riesgo para el animal. Finalmente, se retira el catéter, se trasvasa el líquido
recuperado a un tubo seco estéril y se vuelve a desinfectar la zona de punción.
Técnicas para la identificación del virus
- Aislamiento vírico:
Se realiza mediante cultivo celular, para lo que hay que disponer de líneas
celulares establecidas específicas para ello. Una vez comprobado el efecto citopático
del virus (ilustración 3), hay que identificarlo mediante neutralización con un antisuero
específico frente al BHV-1 o por la demostración directa del antígeno mediante
técnicas de inmunofluorescencia (ilustración 3)o inmunoperoxidasa con un antisuero
específico.
Ilustración 2. Toma de muestra de exudado traqueal (fotografías cedidas por Javier Diéguez).
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- Detección del antígeno vírico:
Por extensión directa de las muestras de hisopos en un portaobjetos y posterior
realización de la técnica de inmunofluorescencia directa o indirecta con un anticuerpo
específico.
- Detección del ácido nucleico mediante PCR:
Técnica desarrollada en la última década, pero aún no reconocida como prueba
oficial en el comercio internacional por su falta de estandarización. Experimentalmente
es más sensible que el cultivo e incluso es posible detectar ADN vírico en ganglios
sensoriales con infección latente. Su principal utilización es para diferenciar cepas
vacunales con el gen gE deleccionado de cepas de campo.
Es posible que en ocasiones los resultados puedan parecer contradictorios al
emplear diferentes técnicas de diagnóstico, pero es necesario indicar que éstas son
complementarias y no excluyentes (tabla 2). Así por ejemplo podemos encontrar:
– Aislamiento positivo/IFD negativo: el virus es viable porque es capaz de
multiplicarse en un cultivo celular, pero no se pudo detectar en la
fracciones de tejidos analizados.
Ilustración 3. Efecto citopático en cultivo debido al BHV-1 y demostración del agente por la técnica de inmunofluorescencia. (fotografías cedidas por Carmen Eiras).
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– Aislamiento negativo/IFD positivo: el virus no es viable, pero las
partículas virales son detectadas en los tejidos.
En ambos casos la presencia del virus estaría confirmada.
Igualmente es necesario conocer la dinámica de la infección fetal para
interpretar correctamente los resultados.
Diagnóstico del IBR en estudios epidemiológicos o en programas de
control/erradicación
En la mayoría de los casos el IBR se presenta de forma asintomática o puede
estar presente en la explotación de forma silente debido a la presencia de animales
con infección latente. En estos casos, al igual que si se quiere detectar los animales
positivos debido a la implementación de un programa de control o para comercio
internacional, las técnicas serológicas de detección de anticuerpos son las de elección.
Las principales técnicas serológicas para el diagnóstico de IBR son:
- Seroneutralización (SN):
Fue la técnica gold standard durante muchos años hasta que se desarrollaron
las técnicas inmunoenzimáticas (ELISA; enzyme-linked immunosorbent assay), siendo
Técnicas directas Ventajas Limitaciones Observaciones
Aislamiento vírico (cultivo)
- Un resultado positivo confirma la presencia del virus
- Un resultado negativo no asegura la ausencia del virus: virus no viable - Requiere laboratorio y personal especializado - Mayor tiempo de diagnóstico
- Se recomienda el cultivo de una mezcla de órganos.
Inmunofluorescencia (IF)
- Un resultado positivo confirma la presencia del virus. - Permite el diagnóstico aunque el virus no sea viable
- Un resultado negativo no asegura la ausencia de enfermedad: fracción de tejido sin peresencia del virus - Requiere laboratorio y personal especializado
- Interpretación de resultados subjetivo
PCR - Un resultado positivo confirma la presencia del virus. - Sensibilidad elevada.
- No estandarizado - Permite diferenciar cepas vacunales de cepas de campo
Tabla 2. Técnicas de diagnóstico directas para detectar el BHV-1.
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aún una de las técnicas prescritas para el comercio internacional. Aunque actualmente
ha sido sustituida en los laboratorios de diagnóstico rutinario por las técnicas de ELISA,
dado que requiere la presencia de cultivos celulares para su realización, sigue
empleándose como referencia para el desarrollo de nuevos ELISA y como prueba de
máxima sensibilidad. No permite diferenciar anticuerpos debidos a infección de campo
de los generados por vacunas marcadoras.
- ELISAs:
Actualmente las más utilizadas en los laboratorios de diagnóstico por su
sensibilidad y especificidad, sencillez y bajo precio. Es una prueba prescrita para el
comercio internacional y se han desarrollado varios tipos que permiten diferenciar
anticuerpos debidos a vacunas marcadoras de anticuerpos debidos a infección de
campo. Igualmente pueden utilizarse para el diagnóstico en leche de tanque:
o ELISA Indirecto: detecta todo tipo de anticuerpos del virus BHV-1. Es el
más sensible para utilizar en el diagnóstico de leche de tanque, pero no
permite diferenciar animales vacunados con vacunas marcadoras.
o ELISAs de bloqueo:
ELISA-gB: detecta anticuerpos frente a la glicoproteína gB del
BHV-1 que es la de mayor intensidad en la respuesta a la
infección. Es el ELISA de elección en muestras de suero por su
elevada sensibilidad. No diferencia animales vacunados con
vacunas marcadoras de los infectados con virus de campo.
ELISA-gE: detecta anticuerpos frente a la glicoproteína gE del
BHV-1. Es la única prueba que permite diferenciar anticuerpos
debidos a vacunas marcadoras en las cuales se encuentra
deleccionada la glicoproteína gE del virus, por lo que en los
animales vacunados con estas vacunas el resultado debería ser
negativo (ilustración 4).
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Para interpretar correctamente los resultados hay que tener en cuenta la
respuesta humoral a las diferentes glicoproteínas del virus (ilustración 5).
Como muestra la ilustración, la respuesta a la glicoproteína gE es de menor
intensidad y más tardía que la producida por la glicoproteína gB, de ahí la menor
sensibilidad de los ELISAs gE. En este sentido su utilización para el diagnóstico en leche
de tanque no está recomendada de cara a declarar como libre un grupo de animales
tras un resultado negativo, ya que en ocasiones no detecta prevalencias por debajo del
20% o incluso mayores. Por eso en algunos planes de control, la monitorización en
Ilustración 4. Resultados de serología según status del animal.
IBR: INMUNIDAD HUMORAL
BH
V-1-
glic
opro
teín
as
gB
gD
gC
gE
gG
Intensidad de la respuesta inmune
Anticuerpos neutralizantes después de 8 a 10 diaspost infeccion
Anticuerpos neutralizantes después de 8 a 10 dias post infeccion
Anticuerpos después de 14 a 35 (?)dias p.i.
Anticuerpos neutralizantes después de 10 a 22 dias post infeccion
Ilustración 5. Respuesta humoral de las glicoproteínas del BHV-1.
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leche de tanque se utiliza para estimar la prevalencia en un rebaño, suplementándose
con pruebas individuales en suero de grupos de animales del rebaño (Ilustración 6).
Ilustración 6. Propuesta de diagnóstico de la IBR en explotaciones de leche.
La muestra de leche de tanque tiene mayor utilidad para monitorizar
explotaciones: partiendo de un perfil serológico inicial acompañado a su vez de un
resultado de leche de tanque que se corresponda con ese perfil, se podrá ver la
evolución de la granja. En condiciones favorables los niveles de anticuerpos tenderán a
mantenerse estables o disminuir. Si una explotación se infecta, estos niveles se
elevaran; al obtener información con única muestra el coste del análisis es bajo y en un
programa de monitorización se puede hacer cada 6 meses.
La elección de un porcentaje de animales mayores de 9 meses se debe a que los
anticuerpos calostrales pueden estar presentes en animales menores de esta edad, lo
que podría dar lugar a falsos positivos. Se incluyen los animales hasta 36 meses debido
a que el grupo de animales de primer parto es el de mayor riesgo de seroconversión
debido al estrés que produce esta situación.
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Para conocer el estatus sanitarios de una granja, una opción adecuada y
sencilla es realizar análisis de anticuerpos (normalmente mediante ELISA) a una
muestra de animales de diferentes edades (perfil serológico). Una vez introducido en
una explotación, el BHV-1 se extiende rápidamente y todos o la mayor parte de los
animales inducen anticuerpos.
Ejemplos de perfiles serológicos
Explotación con infección antigua: en este caso los animales mayores de 36 meses han
tenido contacto con el virus y tienen anticuerpos; esto indica que el virus circuló hace
tres años en la granja. Por el contrario, los de menores edades son negativos, lo que
implica que actualmente no hay contagios y no hay virus circulando. Otra posibilidad
es que se haya vacunado con vacunas no marcadoras hace tres años y posteriormente
no.
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Explotación con infección activa: hay animales seropositivos en todas las edades,
incluidos los de 9-18 meses. Esto implica que el virus circuló recientemente en la
granja y es posible que aun este circulando. Otra posibilidad es que el ganadero esté
administrando vacunas no marcadoras.
En el caso de las explotaciones de carne la realización de seroperfiles por
grupos de edad permitirá conocer el estado del rebaño y localizar el grupo o grupos de
edad donde existe mayor positividad (ilustración 7).
Ilustración 7. Propuesta de diagnóstico de IBR en explotaciones de carne.
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En función de los resultados se puede plantear la posibilidad de la erradicación
mediante la eliminación de los animales seropositivos, teniendo en cuenta que todo
animal positivo a anticuerpos frente a la glicoproteína gE es un posible portador
latente (en este sentido la legislación europea considera los animales vacunados con
vacunas convencionales igual que los infectados).