DIAGNOSIS OF SWINE INFLUENZA of... · ไข้หวัดใหญ่สุกร (swine...

39
มาตรฐานสินค้าเกษตร มกษ. 10050-2556 THAI AGRICULTURAL STANDARD TAS 10050-2013 การชันสูตรโรคไข้หวัดใหญ่สุกร DIAGNOSIS OF SWINE INFLUENZA สานักงานมาตรฐานสินค้าเกษตรและอาหารแห่งชาติ กระทรวงเกษตรและสหกรณ์ ICS 11.220 ISBN ________________

Transcript of DIAGNOSIS OF SWINE INFLUENZA of... · ไข้หวัดใหญ่สุกร (swine...

Page 1: DIAGNOSIS OF SWINE INFLUENZA of... · ไข้หวัดใหญ่สุกร (swine influenza) ที่มีสาเหตุจากไวรัสอินฟลูเอนซา

มาตรฐานสนคาเกษตร

มกษ. 10050-2556

THAI AGRICULTURAL STANDARD

TAS 10050-2013

การชนสตรโรคไขหวดใหญสกร

DIAGNOSIS OF SWINE INFLUENZA

ส านกงานมาตรฐานสนคาเกษตรและอาหารแหงชาต

กระทรวงเกษตรและสหกรณ

ICS 11.220 ISBN ________________

Page 2: DIAGNOSIS OF SWINE INFLUENZA of... · ไข้หวัดใหญ่สุกร (swine influenza) ที่มีสาเหตุจากไวรัสอินฟลูเอนซา

มาตรฐานสนคาเกษตร

มกษ. 10050-2556

THAI AGRICULTURAL STANDARD

TAS 10050-2013

การชนสตรโรคไขหวดใหญสกร

DIAGNOSIS OF SWINE INFLUENZA

ส านกงานมาตรฐานสนคาเกษตรและอาหารแหงชาต

กระทรวงเกษตรและสหกรณ

50 ถนนพหลโยธน เขตจตจกร กรงเทพฯ 10900

โทรศพท 0 2561 2277 โทรสาร 0 2561 3357

www.acfs.go.th

ประกาศในราชกจจานเบกษา ฉบบประกาศและงานทวไป เลม ตอนท

วนท .............................พทธศกราช

Page 3: DIAGNOSIS OF SWINE INFLUENZA of... · ไข้หวัดใหญ่สุกร (swine influenza) ที่มีสาเหตุจากไวรัสอินฟลูเอนซา

(2)

คณะกรรมการวชาการพจารณามาตรฐานสนคาเกษตร

เรอง การชนสตรโรคระบบทางเดนหายใจในสกร

1. นายนรนดร เอองตระกลสข ประธานกรรมการ

กรมปศสตว

2. นายพลายยงค สการะเศรณ กรรมการ

กรมควบคมโรค กระทรวงสาธารณสข

3. นายชยศร มหนตชยสกล กรรมการ

ส านกงานมาตรฐานสนคาเกษตรและอาหารแหงชาต

4. นางสาวณฐวด ภมรานนท กรรมการ

ส านกควบคมปองกนและบ าบดโรคสตว กรมปศสตว

5. นางสจรา ปาจรยานนท กรรมการ

สถาบนสขภาพสตวแหงชาต กรมปศสตว

6. ผชวยศาสตราจารยคมกฤช เทยนค า กรรมการ

คณะสตวแพทยศาสตร จฬาลงกรณมหาวทยาลย

7. รองศาสตราจารยกจจา อไรรงค กรรมการ

คณะสตวแพทยศาสตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร

8. นายกฤษฎากรณ พรงเพราะ กรรมการ

คณะสตวแพทยศาสตร มหาวทยาลยเชยงใหม

9. นายจ าลอง มตรชาวไทย กรรมการ

คณะสตวแพทยศาสตร มหาวทยาลยเทคโนโลยมหานคร

10. นายวทวช วรยะรตน กรรมการ

คณะสตวแพทยศาสตร มหาวทยาลยมหดล

11. นายเกยรตภม พฤกษะวน กรรมการ

สมาคมผเลยงสกรแหงชาต

12. นายรชฎ ตนตเลศเจรญ กรรมการ

สมาคมเวชศาสตรชนสตรทางสตวแพทยไทย

13. นายวลาส วบลยศรกล กรรมการ

สมาคมสตวแพทยควบคมฟารมสกรไทย

Page 4: DIAGNOSIS OF SWINE INFLUENZA of... · ไข้หวัดใหญ่สุกร (swine influenza) ที่มีสาเหตุจากไวรัสอินฟลูเอนซา

14. ศาสตราจารยรงโรจน ธนาวงษนเวช กรรมการ

ผทรงคณวฒดานการชนสตรโรคในสกร

15. นางสาวสคราญมณ กระจางวงษ กรรมการและเลขานการ

ส านกก าหนดมาตรฐาน

ส านกงานมาตรฐานสนคาเกษตรและอาหารแหงชาต

Page 5: DIAGNOSIS OF SWINE INFLUENZA of... · ไข้หวัดใหญ่สุกร (swine influenza) ที่มีสาเหตุจากไวรัสอินฟลูเอนซา

(3)

โรคไขหวดใหญสกร (swine influenza) เปนโรคระบบทางเดนหายใจในสกรทมสาเหตจากไวรสไขหวดใหญ

ชนดเอ ซงมความเสยงของการแพรกระจายโรคมาสมนษย กอใหเกดความสญเสยทางเศรษฐกจ และเปน

ปญหาดานสาธารณสข นอกจากนการเปลยนแปลงทางพนธกรรมของไวรสเกดเปนสายพนธยอยของไวรส

สงผลตอความถกตองและแมนย าในการวนจฉยโรค ดงนนคณะกรรมการมาตรฐานสนคาเกษตรจงเหน

ควรจดท ามาตรฐานสนคาเกษตร เรอง การชนสตรโรคไขหวดใหญสกร เพอใชเปนแนวทางปฏบตส าหรบ

หองปฏบตการเพอการชนสตรโรคไขหวดใหญสกร และเปนคมอเพอประกอบการรบรองมาตรฐาน

ฟารมสกรตอไป

มาตรฐานสนคาเกษตรน ก าหนดขนโดยใชเอกสารตอไปนเปนแนวทาง

ขอมลจากผลการศกษาโครงการการศกษาวธการชนสตรโรคไขหวดใหญสกร ของส านกงานมาตรฐานสนคา

เกษตรและอาหารแหงชาต

World Organisation for Animal Health (OIE). 2010. Chapter 2.8.8. Swine Influenza. Manual of

Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. Paris, France.

Page 6: DIAGNOSIS OF SWINE INFLUENZA of... · ไข้หวัดใหญ่สุกร (swine influenza) ที่มีสาเหตุจากไวรัสอินฟลูเอนซา
Page 7: DIAGNOSIS OF SWINE INFLUENZA of... · ไข้หวัดใหญ่สุกร (swine influenza) ที่มีสาเหตุจากไวรัสอินฟลูเอนซา

มกษ. 10050-2556

มาตรฐานสนคาเกษตร

การชนสตรโรคไขหวดใหญสกร

1. ขอบขาย

มาตรฐานสนคาเกษตรน ก าหนดรายละเอยดทส าคญเกยวกบการชนสตรทางหองปฏบตการ เพอชนสตรโรค

ไขหวดใหญสกร (swine influenza) ทมสาเหตจากไวรสอนฟลเอนซา ชนดเอ ชนดยอยเอช 1 และเอช 3

(influenza virus type A, subtype H1 and H3)

2. นยาม

ความหมายของค าทใชในมาตรฐานสนคาเกษตรน มดงตอไปน

2.1 การชนสตรโรค (diagnosis) หมายถง การตรวจสอบหาหลกฐาน สาเหต หรอขอเทจจรง เพอประกอบ

การวนจฉยโรค

2.2 โรคไขหวดใหญสกร (swine influenza) หมายถง โรคตดตอเฉยบพลนของระบบทางเดนหายใจในสกร

ทมสาเหตจากไวรสอนฟลเอนซา ชนดเอ ชนดยอยเอช 1 และ เอช 3 หรอในมาตรฐานนเรยกวาไวรสไขหวดใหญ

สกร

2.3 สกร (swine) หมายถง สตวในวงศ Suidae เปนสตวเลยงลกดวยน านม มกบค ทงทเปนสตวเลยงและ

ทเปนสตวปา

2.4 ชดควบคมผลบวก (positive control set) หมายถง ชดทดสอบทมเชอมาตรฐาน เพอใชดผลเปรยบเทยบกบ

ตวอยางทตองการตรวจ

2.5 ชดควบคมผลลบ (negative control set) หมายถง ชดทดสอบทไมมเชอมาตรฐาน เพอใชดผลเปรยบเทยบ

กบตวอยางทตองการตรวจ

2.6 หองปฏบตการชวนรภย หรอหองปฏบตการปลอดภยทางชวภาพ (biosafety laboratory) หมายถง

หองปฏบตการทสามารถปองกนอนตรายจากการสมผสกบวตถชวภาพ เชน เชอโรค เลอด เนอเยอ สารพนธกรรม

Page 8: DIAGNOSIS OF SWINE INFLUENZA of... · ไข้หวัดใหญ่สุกร (swine influenza) ที่มีสาเหตุจากไวรัสอินฟลูเอนซา

มกษ. 10050-2556 2

สารพษ ทอาจปนเปอนอยในหองปฏบตการนนๆ โดยตองมขนตอนปฏบตการทปลอดภย เพอลดความเสยงตอ

การสมผสและปองกนการแพรกระจายของวตถชวภาพดงกลาว

3. การชนสตรโรค

การชนสตรโรคไขหวดใหญสกรโดยใชวธทางหองปฏบตการ ไดแก พยาธวทยา วทยาภมคมกน วทยาไวรส

และชววทยาระดบโมเลกล ซงเปนวธทระบอยในคมอการชนสตรโรคและการใชวคซนในสตวบก (Manual of

Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals) ขององคการโรคระบาดสตวระหวางประเทศ

(The World Organisation for Animal Health; OIE) หรอวธทมความไวและความจ าเพาะเทยบเทาหรอดกวา

และไดรบการเผยแพรในวารสารทางวชาการ โดยมการปรบวธการชนสตรโรคใหเหมาะสมกบไวรสทพบใน

ประเทศไทย

ไวรสไขหวดใหญสกรทสงผลกระทบตอระบบการผลตสกร และอาจกออนตรายตอสขภาพมนษย (ภาคผนวก ก)

และเปนไวรสทมความเสยงสงในการแพรกระจายของเชอภายในหองปฏบตการ ดงนนการชนสตรโรคไขหวดใหญ

สกร ควรด าเนนการในหองปฏบตการชวนรภย ซงมความพรอมทงสถานท เครองมอเครองใช วสดอปกรณ

และระบบการปฏบตงาน รวมทงบคลากรมความรความช านาญเกยวกบการปฏบตงานทดในหองปฏบตการ

(good laboratory practices)

3.1 การชกตวอยาง

ใหเปนไปตามภาคผนวก ข

3.2 การเกบและน าสงตวอยาง

การเกบตวอยางตองมวธและปรมาณทเหมาะสม และน าสงหองปฏบตการโดยเรวทสด การเกบและน าสงตวอยาง

ทถกวธจะมผลท าใหการชนสตรโรคทางหองปฏบตการมความถกตองขน ตวอยางทใชในการชนสตรโรค

ไขหวดใหญสกรสามารถเกบจากสกรมชวตทปวยหรอสงสยวาตดเชอโดยการปายกวาดโพรงจมก (nasal swab)

หรอเกบตวอยางเลอด สวนสกรหลงตายใหเกบตวอยางเนอเยอปอด

3.2.1 การเกบตวอยางจากสกรมชวต

3.2.1.1 สงคดหลงจากระบบทางเดนหายใจ ส าหรบน าไปตรวจหาไวรส (virus identification) โดยใชไมปาย

(swab) ปายกวาดสงคดหลงจากเยอเมอกในโพรงจมกของสกรทแสดงอาการปวย ภายใน 24 - 48 ชวโมง

Page 9: DIAGNOSIS OF SWINE INFLUENZA of... · ไข้หวัดใหญ่สุกร (swine influenza) ที่มีสาเหตุจากไวรัสอินฟลูเอนซา

มกษ. 10050-2556

3

(ภาคผนวก ค) หลงจากนนใหจมลงในน ายาเกบรกษาไวรส (viral transport media) หรอน ายาเกบรกษา

ไวรสอนๆ ทผสมยาปฏชวนะ (ภาคผนวก ง ขอ ง.2)

การเกบไมปายทปายกวาดตวอยาง อาจเกบรวมกนในน ายาเกบรกษาไวรสไดจ านวน 5 ตวอยาง

ตอหลอด ใหน าตวอยางสงหองปฏบตการทนทหรอภายในเวลา 24 ชวโมง โดยเกบตวอยางในภาชนะ

ทปดสนทปองกนการแพรกระจายของเชอ และเกบรกษาทอณหภม 4 องศาเซลเซยส (°C) (หรอ 2 - 8°C)

ไมควรแชแขงตวอยางทสงตรวจ

3.2.1.2 ซรม ส าหรบการตรวจทางวทยาภมคมกน โดยเกบเลอดจากเสนเลอดด าทคอ (jugular vein)

3 - 5 มลลลตร (ml) และเกบตวอยางซรมค (paired sera) หางกน 10 - 21 วน เพอดผลการเพมขนของ

ระดบภมคมกน

3.2.2 การเกบตวอยางจากสกรหลงตาย

3.2.2.1 ใหเกบเนอเยอปอดโดยเฉพาะทมหลอดลมฝอยทไมเกดการเสอมสลายตวเองหลงตาย (post mortem

autolysis) โดยเลอกเกบทงบรเวณรอยตอทปกตและทมรอยโรค ประมาณชนละ 3 - 4 กรม (g) ใสถงเกบ

ตวอยาง 2 ชน ตดฉลากและระบขอมลใหชดเจน เกบรกษาทอณหภม 0 - 4 °C น าสงตวอยางสงหองปฏบตการ

โดยเรว ภายใน 24 ชวโมง ตองไมน าเนอเยอปอดทเกบจากสกรแตละตวมารวมกนในถงเกบตวอยางเดยวกน

3.3 การชนสตรโรคไขหวดใหญสกร

การชนสตรโรคไขหวดใหญสกร ตองด าเนนการในหองปฏบตการชวนรภย โดยแบงออกเปน 2 ลกษณะ คอ

(1) การตรวจหาไวรส (virus identification) โดยเพาะแยกเชอในไขไกฟกหรอเซลลเพาะเลยง และตรวจหา

แอนตเจนหรอสารพนธกรรมของไวรส ตองตรวจหาคณสมบตการจบกลมของเมดเลอดแดงดวย

haemagglutination test (HA test ) เพอยนยนวาเปนไวรสอนฟลเอนซา ชนดเอ หรอเชอชนดอนทมคณสมบต

เชนเดยวกน กอนท าการเพาะแยกเชอไวรส ทงนหากผลการตรวจ HA test เปนบวกใหด าเนนการตรวจยนยน

ดวยวธอนๆ เชน haemagglutination inhibition test (HI test) เพอตรวจหาการยบยงการจบกลมของ

เมดเลอดแดง (ภาคผนวก จ) หรอตรวจหาสารพนธกรรมของไวรสดวยวธทางชววทยาระดบโมเลกล ไดแก

วธ reverse transcription- polymerase chain reaction (RT-PCR) (ภาคผนวก ฉ) หรอ real-time RT-PCR

เปนตน

อาจตรวจหาแอนตเจนในชนเนอหรอตวอยางทสงตรวจ โดยวธ fluorescent antibody test หรอ

immunohistochemistry (ภาคผนวก ช) หรอใชวธอนทองคการโรคระบาดสตวระหวางประเทศรบรอง

Page 10: DIAGNOSIS OF SWINE INFLUENZA of... · ไข้หวัดใหญ่สุกร (swine influenza) ที่มีสาเหตุจากไวรัสอินฟลูเอนซา

มกษ. 10050-2556 4

(2) การตรวจทางวทยาภมคมกน เพอวดระดบแอนตบอด (antibody) ตอโปรตน haemagglutinin

ซงมความจ าเพาะตอไวรสชนดยอยทใชในการทดสอบ เชน HI test เพอดระดบแอนตบอดทเพมขน นอกจากน

อาจใชวธ agar gel immunodiffusion test, indirect fluorescent antibody test, virus neutralization test หรอ

enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) ตามทองคการโรคระบาดสตวระหวางประเทศรบรอง

3.3.1 วธการตรวจหาไวรส

3.3.1.1 การเตรยมตวอยางเพอใชในการเพาะแยกไวรส

(1) น าตวอยางสงคดหลงจากระบบทางเดนหายใจ (ขอ 3.2.1.1) มาเขยาในหลอดปนเหวยงอยางแรง

แลวปนเหวยงทความเรว 1,500 - 1,900 g (acceleration due to gravity) นาน 15 -30 นาท ทอณหภม 4°C

(2) ตวอยางทเปนเนอเยอปอด (ขอ 3.2.2) ใหเลอกตดชนเนอปอดทมรอยโรคบรเวณทตดหลอดลมฝอย

ประมาณ 1 g ตดเปนชนเลกๆ น าไปบดในโกรงบดโดยใชทรายละเอยดชวยในการบด ใส PBS 5 - 10 ml

คนใหเขากน น าไปปนเหวยงทความเรว 1,500 -1,900 g นาน 15 - 30 นาท ทอณหภม 4°C

(3) น าสวนใส (supernatant) ใสยาปฏชวนะ เชน เจนทาไมซน (gentamycin) 100 ไมโครกรม/มลลลตร

(g/ml) หรอ เพนนซลลน (penicillin) (10,000 ยนต/มลลลตร (units/ml): สเตรปโทไมซน (streptomycin)

10,000 units/ml และฟงจโซน (2% fungizone) 250 มลลกรม/มลลลตร(mg/ml) ทงไวทอณหภม 4°C นาน 1 ชวโมง เพอก าจดแบคทเรยทอาจปนเปอน หรอก าจดแบคทเรยในสวนใสดงกลาวดวยวธอน เชน

กรองเอาแบคทเรยออกดวยเยอแผนกรอง (membrane filter) ขนาด 0.22 ไมโครเมตร (m) (อาจมผลท าให

จ านวนไวรสนอยลง)

(4) ดดสวนใสเกบไวทอณหภม 4°C จนกวาจะน าไปใชในการเพาะแยกไวรสในไขไกฟกหรอเซลลเพาะเลยง

หรอหากตองการเกบตวอยางนานกวา 24 ชวโมง ใหเกบไวทอณหภม -70°C

3.3.1.2 การเพาะแยกและเพมจ านวนไวรส ในไขไกฟก

(1) ใชไขไกฟกอาย 10 -11 วน จ านวน 3 - 4 ฟอง ตอ 1 ตวอยาง ในการเพาะแยกไวรส

(2) ฉดสารละลายตวอยางเขาถงแอมเนยน (amniotic sac) และถงแอลแลนทอย (allantoic sac) (ภาพท ฎ.5)

ขนาด 0.1 - 0.2 ml

(3) บมทอณหภม 35 - 37°C นาน 3 - 4 วน ตรวจการตายของตวออนในไขไกฟกทก 24 ชวโมง

ไขฟกทตวออนตายภายใน 24 ชวโมงแรกใหคดออก

Page 11: DIAGNOSIS OF SWINE INFLUENZA of... · ไข้หวัดใหญ่สุกร (swine influenza) ที่มีสาเหตุจากไวรัสอินฟลูเอนซา

มกษ. 10050-2556

5

(4) น าไขไกฟกทตวออนตาย หรอเมอครบก าหนดการบมภายหลงการฉดไวรส แชเยนทอณหภม 4°C นาน

12 ชวโมง หรอแชแขงทอณหภม -20 °C นาน 1 ชวโมง

(5) เกบของเหลวจากไขไกฟก ไปปนเหวยงทความเรว 1,500 - 1,900 g นาน 10 - 20 นาท ทอณหภม 4°C

น าไปทดสอบคณสมบตการจบกลมของเมดเลอดแดงดวย HA test (ภาคผนวก จ ขอ จ.2)

(6) หาก HA test ใหผลบวกใหตรวจยนยนดวยวธอนตอไป เชน RT- PCR (ภาคผนวก ฉ)

(7) หาก HA test ใหผลลบ ใหน าของเหลวจากไขไกฟก ไปท าซ า (second passage) ในขนตอนท (1) - (6)

อกครงหนง

3.3.1.3 การเพาะแยกและเพมจ านวนไวรสในเซลลเพาะเลยง

เซลลเพาะเลยงตอเนองทนยมใชคอ Madin Darby Canine Kidney (MDCK) สวนเซลลเพาะเลยงอน

ทสามารถใชได เชน เซลลเพาะเลยงตอเนองจากปอดมง (mink lung cell line) เซลลเพาะเลยงปฐมภมจาก

ไตสกร (primary porcine kidney cells) การเพาะแยกเชอไวรสไขหวดใหญสกรดวยเซลลเพาะเลยงนนจะตอง

เตมสารละลาย trypsin ในอาหารเลยงเซลลดวย เพอชวยในการยอยแยกโปรตน haemagglutinin เปน HA1

และ HA2 กอนท HA1 จะจบกบตวรบบนผวเซลลตอไป

(1) การเพาะเลยงและเพมจ านวนเซลล ใหน า MDCK มาเพาะเลยงในจานอาหารส าหรบเลยงเซลลขนาด

24 หลม โดยใหมปรมาณเซลลไมนอยกวา 106 cell/ml ในอาหารส าหรบเลยงเซลล (minimal essential medium;

MEM) ทม 5% Fetal Bovine Serum (FBS) (ภาคผนวก ง. ขอ ง.4) ใสหลมละ 1 ml

(2) น าเขาตบมทอณหภม 37°C, 5% CO2 นานประมาณ 48 ชวโมง จนเซลลโตเตมท มลกษณะแผขยายเปนชนเดยว (confluent monolayer) จนเตมพนทหลม หรอประมาณรอยละ 80 ของพนทหลม

(3) น า confluent monolayer มาลางดวย PBS หรอ MEM 3 ครง ครงละ 0.5 ml และดดน าลาง

ออกใหหมด

(4) เตมสารละลายไวรส 0.2 - 0.3 ml โดยเจอจางสารละลายดวย PBS เปน 1:1, 1:2 และ 1:3

ควรท าซ าอยางนอย 2 ซ า ในแตละความเขมขน น าเขาตบมทอณหภม 37°C, 5% CO2 นาน 45 - 60 นาท

(5) ดดสารละลายบน confluent monolayer ทง

(6) เตมอาหารเลยงเซลล ทมสวนผสมของ MEM, และ trypsin 1 g/ml หลมละ 1 ml น าเขาตบมท

อณหภม 37°C, 5% CO2

Page 12: DIAGNOSIS OF SWINE INFLUENZA of... · ไข้หวัดใหญ่สุกร (swine influenza) ที่มีสาเหตุจากไวรัสอินฟลูเอนซา

มกษ. 10050-2556 6

(7) สงเกตการเกด cytopathic effect (CPE) ทกวน เปนเวลา 5-7 วน

(8) หากไมพบ CPE ใหเกบเซลลพรอมอาหารเลยงเซลล โดยการแชแขงทอณหภม -70°C จนแขงตวและน าออกมาละลายทอณหภม 0 - 4°C ท าซ า 2 - 3 รอบ แลวน าไปท าซ า (second passage) โดยผานเซลล

เพาะเลยงในขนตอนท (4) - (7) อกครงหนง เพอยนยนการพบไวรสและน าไปตรวจดวยวธอนตอไป เชน HA

test หรอ RT- PCR

หากตองการทราบปรมาณไวรส อาจใชการตรวจปรมาณไวรสโดยการไทเทรต (ภาคผนวก ซ)

และยอมดวยเทคนค immunoperoxidase monolayer assay (IPMA) (ภาคผนวก ฌ)

(9) การแปลผล ใหพจารณาจากการเกด CPE ของเซลลเพาะเลยง รวมกบการตรวจยนยนดวยวธอน

3.3.2 การตรวจทางวทยาภมคมกน

การตรวจหาภมคมกนหรอระดบแอนตบอดทางวทยาภมคมกน เปนการวดระดบภมคมกนตอโปรตน

haemagglutinin ซงมความจ าเพาะตอไวรสอนฟลเอนซา ชนดเอ ชนดยอยตางๆ ทใชในการทดสอบ สามารถใช

ประโยชนในการระบถงการตดเชอไวรสไขหวดใหญสกรชนดยอยเอช1 และ เอช 3 ได ในกรณทไมมการใชวคซน

ไขหวดใหญสกร วธทางวทยาภมคมกนทใชเปนมาตรฐาน คอ HI test โดยเกบตวอยางซรมคหางกน 10 - 21 วน

เพอดระดบแอนตบอดทเพมขน หากระดบแอนตบอดจากการตรวจซรมครงท 2 สงกวาครงแรก 4 เทา แสดงวาม

การตดเชอไวรสไขหวดใหญสกร ชนดยอยนนๆ

Page 13: DIAGNOSIS OF SWINE INFLUENZA of... · ไข้หวัดใหญ่สุกร (swine influenza) ที่มีสาเหตุจากไวรัสอินฟลูเอนซา

มกษ. 10050-2556

7

ภาคผนวก ก

วทยาการระบาด พยาธก าเนด และอาการของโรคไขหวดใหญสกร

(ขอ 3)

ก.1 วทยาการระบาด

โรคไขหวดใหญสกร (swine influenza) เกดจากการตดไวรสอนฟลเอนซา (influenza virus) จดอยในวงศ

Orthomyxoviridae กลมไวรสอนฟลเอนซา ชนดเอ ซงมสารพนธกรรมเปน RNA สายเดยว (single-stranded

RNA) ปกตมรปรางกลม แตถาเลยงผานเซลลเพาะเลยงนานๆ จะมรปรางเปนเสน มเสนผาศนยกลางประมาณ

80 - 120 นาโนเมตร (nm) โครงสรางของไวรสประกอบดวยเปลอกหมชนนอกสด (envelope) เปนไขมน

ทผวนอกของเปลอกหมมไกลโคโปรตนยนออกมา 2 ชนด คอ ฮแมกกลตนน (haemagglutinin) มรปราง

เปนแทง และนวรามนเดส (neuraminidase) มรปรางเหมอนดอกเหด ถดเขามาจากเปลอกหมเปนชนของ

รางแหโปรตน (matrix protein; M) ม 2 ชน คอ M1 และ M2 โดยชน M2 อยถดจากเปลอกหม ลกษณะเปน

โครงสรางบางๆ ประกอบดวยโมเลกลของโปรตนประมาณ 20-60 โมเลกลตอไวรออน (virion) ถดไปเปน

ชนของ M1 ซงหอหมโครงสรางเชงซอนของไรโบนวคลโอโปรตน (ribonucleoprotein complexes; RNP

complexes) ไว RNP complexes ประกอบดวยกรดไรโบนวคลอก (ribonucleic acid; RNA) เปนโครงสรางทบรรจ

จโนมของไวรสอนฟลเอนซาไว จโนมของไวรสม 8 ทอน (segments) แตละทอนประกอบดวย ribonucleic acid,

nucleoprotein และ acidic polymerase (PA) มจโนมท าหนาทในการถอดรหส และเพมจ านวน ของ ribonucleic

acid คอ basic polymerase 1 (PB1) และ basic polymerase 2 (PB2) นอกจากนยงพบโปรตนทเรยกวา

non-structural proteins (NS) ไดแก NS2 พบไดในไวรสอนฟลเอนซาทกไวรออน สวน NS1 ตรวจพบไดเฉพาะ

ในเซลลทมการตดเชอไวรสอนฟลเอนซาเทานน ไวรสไขหวดใหญมจโนมทง 8 ทอน เปนกรดไรโบนวคลอก

สายเดยว ทมประจเปนลบ (negative single-stranded RNA) การทมจโนมแยกกนเปนทอนๆ หลายทอน

ท าใหเกดการแลกเปลยนสารพนธกรรมในชวงเวลาทมการเพมจ านวนในเซลลเจาบาน (host cell) ได ซงอาจ

ท าใหเกดไวรสสายพนธใหมได

การจ าแนกสายพนธชนดยอย (subtype) ของไวรสอนฟลเอนซา จ าแนกตามคณสมบตการเปนแอนตเจนของ

ไกลโคโปรตนฮแมกกลตนนและนวรามนเดส (glycoproteins of haemagglutinin and neuraminidase) ปจจบน

พบวาม haemagglutinin glycoproteins ไมนอยกวา 17 ชนด1/ และ neuraminidase glycoproteins 9 ชนด

1/

Tong S, Li Y, Rivailler P, et al. 2012. A distinct lineage of influenza A virus from bats. available at:

< www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1116200109> [Accessed 20 April 2012].

Page 14: DIAGNOSIS OF SWINE INFLUENZA of... · ไข้หวัดใหญ่สุกร (swine influenza) ที่มีสาเหตุจากไวรัสอินฟลูเอนซา

มกษ. 10050-2556 8

ทกสายพนธชนดยอยพบไดในนกน า (waterfowl) ซงนกน าเปนแหลงรงโรคทส าคญในวงจรการระบาดของ

ไวรสไขหวดใหญ ในสตวเลยงลกดวยน านมอน ทสามารถพบไวรสอนฟลเอนซาชนดยอยตางๆ ได เชน

พบชนดยอยH1N1, H2N2 และ H3N2 ในมนษย ชนดยอย H3N8 และ H7N7 ในมาสวนในสกร

พบมรายงานการระบาดของชนดยอย H1N1, H3N2 และ H1N2 ทงนมรายงานการระบาดของโรคไขหวด

ใหญสกรครงแรกเมอป พ.ศ. 2461 ทประเทศสหรฐอเมรกา โดยพบสกรจ านวนมากแสดงอาการคลายโรค

ไขหวดใหญในมนษย ประกอบกบในชวงเวลาดงกลาวมการระบาดของโรคไขหวดใหญในมนษยอยางรนแรง

และสามารถวนจฉยแยกไวรสอนฟลเอนซาชนดยอย H1N1 (classical H1N1) ไดในป พ.ศ. 2473 ตอมาม

รายงานการระบาดของไวรสอนฟลเอนซาในสกรเปนครงคราวและกระจายตามประเทศตางๆ ทวโลก ทงไวรส

ชนดยอย H1N1 และ H3N2 ตงแตป พ.ศ. 2518 จนถงปจจบน พบวาการระบาดของโรคไขหวดใหญสกร

มความถมากขนและกระจายไปตามพนทตางๆ ทวโลก รวมทงทวปเอเชย

ในประเทศไทยพบการระบาดของไวรสอนฟลเอนซาในสกรทง 3 สายพนธชนดยอย ไดแก ชนดยอย H1N1

H1N2 และ H3N2 โดยตรวจพบชนดยอย H3N2 ไดครงแรกเมอป พ.ศ. 2521 จากนนสามารถแยกไวรส

ชนดยอย H1N1 ไดในป พ.ศ. 2531 สวนไวรสชนดยอย H1N2 นนเพาะแยกไดในป พ.ศ. 2548

จากการศกษาพยาธก าเนดของไวรสชนดยอย H1N1 และ H3N2 ทแยกไดจากสกรในประเทศไทยในป

พ.ศ. 2548 พบวาไวรสสามารถกอใหเกดพยาธสภาพเฉพาะทระบบทางเดนหายใจ โดยสกรแสดงอาการคลาย

ไขหวดใหญในมนษย เชน ไอ จาม มไข เบออาหาร นอกจากนยงพบวาสกรปวยสามารถขบเชอไดเพยง

1 - 3 วน หลงไดรบเชอเทานน เมอวเคราะหสายพนธกรรมของจโนมทง 8 จโนมของไวรสไขหวดใหญสกรท

ระบาดในประเทศไทย พบวามการผสมระหวางสายพนธจากอเมรกาและสายพนธจากยโรป ท าใหเกด

ความหลากหลายของพนธกรรมของไวรสอนฟลเอนซาในสกรในประเทศไทย

ในตนป พ.ศ. 2552 ไดมการระบาดของไวรสอนฟลเอนซา ชนดเอ human pandemic H1N1 2009

(pH1N1) ในมนษยทวโลก โดยพบวาสารพนธกรรมของไวรสมาจากการแลกเปลยนพนธกรรม ของไวรสทม

ตนก าเนดมาจากสกร สตวปก และมนษย นอกจากนยงพบการแพรกระจายไปยงสกรในหลายประเทศรวมทง

ในประเทศไทย โดยพบรายงานการเพาะแยกเชอไดจากสกรทงในฟารมและในงานแสดงสกรในประเทศ

สหรฐอเมรกา มการพบการคงอยของไวรส pH1N1 และ ไวรสไขหวดใหญสกร ในฟารมสกรแหงหนงใน

ภาคตะวนตกของประเทศไทย เปนเวลานานถง 4 เดอน และยงพบการแลกเปลยนพนธกรรมของไวรส

สายพนธใหม pH1N1 กบไวรสสายพนธประจ าถนในสกรของไทยดวย แตยงไมพบการระบาดไปยงพนทอนๆ

และพบวาไวรสลกผสมครงนท าใหสกรแสดงอาการทางระบบทางเดนหายใจเพยงเลกนอย และไมท าใหสกร

ปวยถงตาย อยางไรกตามจากขอมลดงกลาวแสดงวาในประเทศไทยเองกมการระบาดของโรคและมความเสยง

ตอการเกดไวรสไขหวดใหญสายพนธใหม ซงไมอาจทราบไดวาในอนาคตจะเกดการระบาดเปนวงกวาง ดงเชน

ไวรสไขหวดใหญสายพนธใหม pH1N1 หรอไม จงควรตระหนกวาไวรสไขหวดใหญนน มโอกาสกลายพนธได

ดงนนการส ารวจ การวนจฉย และการเฝาระวงโรคไขหวดใหญ สกรในประเทศไทย จงมความจ าเปนอยางยง

Page 15: DIAGNOSIS OF SWINE INFLUENZA of... · ไข้หวัดใหญ่สุกร (swine influenza) ที่มีสาเหตุจากไวรัสอินฟลูเอนซา

มกษ. 10050-2556

9

ซงสอดคลองกบขอแนะน าขององคการอนามยโลกทใหความส าคญในการส ารวจโรคไขหวดใหญชนดเอ

ทงในมนษยและสตวอนๆ โดยเฉพาะในสกร เพอเปนการควบคมโรคอบตใหมและโรคอบตซ าทอาจ

แพรกระจายมายงมนษย ดงเชนการระบาดของไวรส pH1N1

ก.2 พยาธก าเนด

สกรปวยตดเชอไวรสไขหวดใหญสกรเรมจากระบบทางเดนหายใจ เขาสเซลลเยอบผวดานในของจมก ทอลม

และหลอดลม โดยไวรสเกาะบนซเลย ตอจากนนไวรสจะเพมจ านวนในเซลลเยอบผวดงกลาว ภายใน

16 ชวโมงหลงไดรบเชอ ท าใหเซลลเยอบผวหลอดลมตายเปนหยอมๆ พบถงลมปอดบางสวนแฟบ และม

เลอดเขามาเลยงทปอดมากขน การตายของเซลลเยอบผวหลอดลมจะขยายบรเวณกวางจากการแพรกระจาย

ของไวรสไปยงเซลลดงกลาว หลงจากนนจะพบสงซมเยมขน (exudate) ภายในหลอดลม ถงลมปอดแฟบเปน

บรเวณกวางขน ปอดสวนหนา (apical lobes) และปอดสวนขางหวใจ (cardiac lobes) มสแดงคล า ภายใน

24 ชวโมง และหลงจากตดเชอ 72 ชวโมง รอยโรคดงกลาวจะคอยๆ หายไปและสภาพของปอดจะกลบ

เปนปกต การตดเชอไวรสในสกรสวนมากจะเกดเฉพาะทบรเวณระบบทางเดนหายใจ แตอาจตรวจพบ

เชอในกระแสเลอดได และมกเพาะแยกเชอไดจากเยอบผวโพรงจมกของสกรทไดรบเชอในวนแรก สกรทไดรบ

เชออาจไมแสดงอาการหรอแสดงอาการอยางรนแรงมากหรอนอย ขนอยกบปจจยหลายอยาง เชน ชองทาง

การตดเชอ (route of infection) ภมคมกนทไดรบจากแม สายพนธชนดยอยของไวรส การจดการ

สภาพแวดลอมของฟารมสกร และเชอแบคทเรยแทรกซอน

ไวรสไขหวดใหญสกรทง 3 สายพนธชนดยอย (H1N1, H3N2 และ H1N2) ท าใหเกดรอยโรคทาง จลพยาธวทยา

ทคลายกน หรอพบการอกเสบตดเชอของโรคระบบทางเดนหายใจ ดงน พบเซลลเยอบผวหลอดลมและ

หลอดลมฝอย (bronchi and bronchioli) ถกท าลายและเกดการตาย โดยตรวจพบลกษณะของเซลลเยอบ

หลอดลมฝอยแบนลง (Jung et al., 2005) ภายในหลอดลมทอกเสบมสงซมเยมขน (exudative bronchitis)

และปอดอกเสบแบบ interstitial pneumonia พบสงคดหลงปนเซลลทลอกหลด (desquamated cells)

และพบการเพมจ านานของเซลลอกเสบชนดนวโทรฟล (neutrophills) ในหลอดลมและถงลมปอดในชวงแรก

ตอมาจะพบมเซลลอกเสบชนดโมโนไซต (monocytes) เขามาแทนทในเนอเยอปอดเปนสวนใหญ และมเลอดเขา

มาเลยงในเนอเยอปอด รวมกบมการขยายตวของหลอดเลอดในปอด และระยะตอมาจะพบเซลลอกเสบชนด

ลมโฟไซต (lymphocytes) ฮสตโอไซต (histiocytes) และพลาสมาเซลล (plasma cells) เขามาแทรกทผนงของถง

ลมปอดมากขน ตามล าดบ

ก. 3 อาการ

การสงเกตอาการของสกรปวยรวมกบการพจารณารปแบบของการระบาดของโรคในฟารมมกพบวาสกรปวย

แสดงอาการของโรคระบบหายใจแบบเฉยบพลนหรอแสดงอาการคลายโรคไขหวดใหญในมนษย ลกษณะ

Page 16: DIAGNOSIS OF SWINE INFLUENZA of... · ไข้หวัดใหญ่สุกร (swine influenza) ที่มีสาเหตุจากไวรัสอินฟลูเอนซา

มกษ. 10050-2556 10

การระบาดของโรคในฝงสกรจะเปนไปอยางรวดเรว โดยพบอตราการปวยสงถง 100% ในขณะทอตราการตาย

ต า (1- 4%)

อาการ มไข ตาอกเสบ บวม มขตา ไอ จาม มน ามกใส ซม (ภาพท ฎ.1) เบออาหาร ท าใหอตราการเพมน าหนก

ลดลง บางครงอาจพบสกรทองเสยรวมดวย ลกสกรหลงหยานมมกนอนสมกน สวนแมสกรทองอาจแทงได

เนองจากมไขสง

ระยะฟกตวของโรค 1 - 3 วน

ระยะเวลาแสดงอาการ 3 - 7 วน สวนใหญไมเกน 5 วน ถาไมมเชออนแทรกซอนสกรจะคอยๆ หายเปนปกต

ในตางประเทศมรายงานสกรอาจแสดงอาการปวยนานถง 15 วน เนองจากสภาพอากาศและสงแวดลอม

ระยะเวลาการกระจายตวของโรคในฟารม โรคนแพรกระจายไดอยางรวดเรวทวโรงเรอนภายใน 7 - 14 วน

ระยะเวลาการขบเชอ สกรปวยจะขบเชอปนมากบสงคดหลงจากทางเดนหายใจ เชน น ามกและเสมหะ

จากการทดลองในประเทศไทย พบสกรขบเชอไดนานถง 4 วน แตในตางประเทศอาจนานถง 15 วน

Page 17: DIAGNOSIS OF SWINE INFLUENZA of... · ไข้หวัดใหญ่สุกร (swine influenza) ที่มีสาเหตุจากไวรัสอินฟลูเอนซา

มกษ. 10050-2556

11

ภาคผนวก ข

การชกตวอยาง

(ขอ 3.1)

ข.1 การชกตวอยางหรอเกบตวอยางโดยวธปายกวาดโพรงจมก (nasal swab)

การชกตวอยางจะพจารณาจากสถานภาพสตวในฟารม ดงน

- หากสกรในฟารมเรมแสดงอาการของโรคระบบทางเดนหายใจ ใหชกตวอยางจากสกรทแสดง

อาการปวยอยางนอย 20 ตว

- ฟารมทเคยพบการระบาดของโรคภายในเวลา 30 วน แตไมพบสกรแสดงอาการของโรคระบบ

ทางเดนหายใจในวนทเขาไปเกบตวอยาง ใหชกตวอยางจากสกรทสงสยอยางนอย 20 ตว

- หากตองการส ารวจโรคเพ อยนยนวาไมมการระบาดของโรคภายในฟารมซ งมประวตพบ

การระบาดมากกวา 30 วน และในวนทเขาไปเกบตวอยางไมพบสกรแสดงอาการของโรคระบบทางเดน

หายใจ ใหชกตวอยางตามตารางท ข.1

Page 18: DIAGNOSIS OF SWINE INFLUENZA of... · ไข้หวัดใหญ่สุกร (swine influenza) ที่มีสาเหตุจากไวรัสอินฟลูเอนซา

มกษ. 10050-2556 12

ตารางท ข.1 การชกตวอยางโดยวธปายกวาดโพรงจมกเพอยนยนวาไมมการระบาดของโรคภายในฟารม

จ านวนสกร

ในฟารม (ตว)

จ านวนตวอยางทตองชกเมอคาดวามการแพรกระจายของโรคในระดบตางๆ (ตว)

Detection 1% of shedding Detection 5% of shedding

(99% confidence) (95% confidence) (99% confidence) (95% confidence)

> 10,000 459 299 90 59

5,000 429 283 90 59

3,000 399 272 90 59

2,000 374 261 90 59

1,000 315 231 83 56

500 240 188 77 53

400 214 172 74 52

300 182 150 70 50

200 140 120 63 46

100 83 75 48 38

50 50 50 33 25

25 25 25 20 18

ทมา: ดดแปลงจาก FAO Guideline for surveillance of pandermic H1N1/2009 and other influenza

viruses in swine population.

Page 19: DIAGNOSIS OF SWINE INFLUENZA of... · ไข้หวัดใหญ่สุกร (swine influenza) ที่มีสาเหตุจากไวรัสอินฟลูเอนซา

มกษ. 10050-2556

13

ภาคผนวก ค

วธเกบตวอยางปายกวาดโพรงจมก

(ขอ 3.2.1)

ค.1 อปกรณและวธการเกบตวอยาง

ค 1.1 อปกรณในการเกบตวอยางปายกวาดโพรงจมก

- หลอดทดลอง พรอมฝาเกลยว ขนาด 3 - 5 ml

- ไมปายกวาดโพรงจมกควรเปน Dacron หรอ rayon หรอ polyester swab ทปราศจากเชอ ในกรณจ าเปน

อาจใช cotton swab ชนดทไมมสารเรองแสงและสารฟอกขาว โดยมกานยาวขนาด 15 เซนตเมตร (cm) และควรแยก

กานไมออกทนท เนองจากจะท าใหรบกวนการวนจฉยโรคได

ค 1.2 วธการเกบตวอยาง

ค.1.2.1 จบสกรใหอยในทาเงยหนาและยกจมกสง ถาเปนลกสกรหยานมอาจจบสกรใหยนดวย 2 ขาหลง

โดยหนหนาออกจากผจบ อาจใชบวงรดจมก (snare) ชวยบงคบ (ภาพท ฎ.2)

ค.1.2.2 เชดจมกดานนอกใหสะอาด เพอปองกนการปนเปอน

ค.1.2.3 สอดกานไมปายกวาดโพรงจมกดานทมส าลเขาโพรงจมกสกรโดยเงยกานไมปายกวาดโพรงจมกขน

พรอมเอยงเขาสสวนกลางของโพรงจมก (dorsal-medial direction) จากนนจงคอยๆ ปายกวาดรอบๆ

เยอเมอกโพรงจมก จะไดสงคดหลงและเซลลเยอบโพรงจมกมากทสด ควรใชไมปายกวาดหนงอนเกบตวอยาง

จากโพรงจมกสกร ทงสองขาง ความลกของการสอดกานไมจะแตกตางตามอายสกร

- ลกสกรอาย 0 - 4 สปดาห สอดกานไมปายกวาดลก 1 cm

- สกรหยานมอาย 4 - 7 สปดาห สอดกานไมปายกวาดลก 2 cm

- สกรขนทอายกวา 7 สปดาห สอดกานไมปายกวาดลก 3 - 4 cm

- พอแมพนธสกร สอดกานไมปายกวาดลกมากกวา 4 cm ตามความเหมาะสม

ค.1.2.4 จมไมดานทใชปายใน transport medium ทนท และแยกหรอหกกานไม ใหต ากวาปากหลอดทดลอง

เพอใหสามารถปดฝาหลอดทดลองได และปดฝาใหสนท

ค.1.2.5 ตดฉลาก และเขยนระบรายละเอยดตวอยางทหลอดใหชดเจน เชน รหสสกร อายสกร อาการ วนท

เกบตวอยาง ทตงฟารม จากนนน าตวอยางไปแชเยนทอณหภม 2 – 8°C ทนท และ รกษาอณหภมตลอด

ระยะเวลาจนถงหองปฏบตการ และควรสงถงหองปฏบตการภายใน 24 ชวโมง หลงเกบตวอยาง

Page 20: DIAGNOSIS OF SWINE INFLUENZA of... · ไข้หวัดใหญ่สุกร (swine influenza) ที่มีสาเหตุจากไวรัสอินฟลูเอนซา

มกษ. 10050-2556 14

ภาคผนวก ง

การเตรยมอปกรณและสารเคม

(ขอ 3.2.1, ขอ 3.3.1.3)

ง.1 การเตรยม PBS ใชส าหรบ transport medium

NaCl 8 g

KCl 0.2 g

Na2HPO4 1.15 g

KH2PO4 0.2 g

(1) เตมน ากลนใหครบปรมาตร 1 ลตร (L)

(2) น าไปท าใหปราศจากเชอดวย autoclave

ง.2 การเตรยม transport medium

(1) PBS, pH 7.4 หรอ Eagle's minimal essential medium (MEM)

(2) bovine serum albumin (BSA) 1%

(3) ยาปฏชวนะ เชน penicillin G (2x106 U/l), streptomycin (200 mg/l), gentamicin (250 mg/l)

(4) แบงใสหลอดทดลอง หลอดละ 1 - 2 ml ตอไมปายหนงตวอยาง

ง.3 อปกรณและสารเคมทจ าเปนในการเพาะแยกไวรสไขหวดใหญสกรดวยเซลลเพาะเลยง

- biological safety cabinet class II

- T-75 หรอ T-25 tissue culture flasks

- 24 well tissue culture plates

- Eagle's minimal essential medium (MEM)

- bovine serum albumin fraction V, 7.5% solution

Page 21: DIAGNOSIS OF SWINE INFLUENZA of... · ไข้หวัดใหญ่สุกร (swine influenza) ที่มีสาเหตุจากไวรัสอินฟลูเอนซา

มกษ. 10050-2556

15

- fetal bovine serum (FBS)

- trypsin-EDTA

- trypsin, tosyl phenylalanyl chloromethyl ketone (TPCK) treated (type XIII from bovine

pancreas)

- gentamicin reagent solution

- penicillin-streptomycin

ง.4 การเตรยมอาหารส าหรบเลยงเซลล MDCK

(1) เตรยมจาก working MEM 500 ml (การเตรยม working MEM ขนอยกบค าแนะน าของแตละผผลต)

(2) เตม FBS 25 ml (จะได 5% FBS in MEM)

(3) เตม penicillin-streptomycin 5 ml

ง.5 การเตรยมอาหารส าหรบเพาะแยกไวรส

(1) เตรยม working MEM 500 ml (วธเตรยม working MEM ขนอยกบค าแนะน าของแตละผผลต)

(2) เตม BSA 25 - 50 ml (จะได 5% ถง 10% BSA in MEM)

(3) เตม penicillin-streptomycin 5 ml

(4) เตม TPCK-trypsin stock 0.5 ml (จะท าใหไดความเขมขนสดทายเปน 2 g/ml)

ง.6 การเตรยม TCPK-trypsin stock 2 g/ml

(1) ละลาย TPCK-trypsin 20 mg ดวยน ากลนหรอน าเกลอ 10 ml (ขนอยกบค าแนะน าของผผลต)

(2) กรองดวยกระดาษกรองขนาด 0.22 m

(3) แบงใสหลอดขนาด 1.5 ml เกบทอณหภม -20°C

ง.7 เครองมอและอปกรณทจ าเปนในการตรวจดวย HI test

- centrifuge and centrifuge tubes

Page 22: DIAGNOSIS OF SWINE INFLUENZA of... · ไข้หวัดใหญ่สุกร (swine influenza) ที่มีสาเหตุจากไวรัสอินฟลูเอนซา

มกษ. 10050-2556 16

- incubator

- V-bottom microtitration plates

- deep well microtitration plates

- water bath 56°C

- single channel and multichannel pipette

- pipette tips

- biological safety cabinet

- reagent reservoirs

ง.8 การเตรยม 10x PBS, pH 7.4 ส าหรบการตรวจ HA และ HI test

Na2HPO4 12.30 g

NaH2PO4 1.80 g

NaCl 85.00 g

(1) ผสมสารเคมกบน ากลน (sterile deionized water) ปรมาตร 1000 ml ใหละลายเขากน

(2) กอนน าไปใช ใหผสม ในสดสวน 10 X PBS กบ sterile deionized water ในอตราสวน 1 : 9

(3) ปรบ pH ใหได 7.4 ± 0.1

Page 23: DIAGNOSIS OF SWINE INFLUENZA of... · ไข้หวัดใหญ่สุกร (swine influenza) ที่มีสาเหตุจากไวรัสอินฟลูเอนซา

มกษ. 10050-2556

17

ภาคผนวก จ

การชนสตรโรคไขหวดใหญสกรดวยวธทางวทยาภมคมกน

(ขอ 3.3, ขอ 3.3.1.2, ขอ 3.3.2)

จ.1 การเตรยมเมดเลอดแดงไก 0.5%

(1) เจาะเลอดไกทโตเตมวยอยางนอย 3 ml ใสในสารละลายอลซเวอร (Alsever’s solution) อตราสวน 1:1

กลบหลอดขนและลงเบาๆ ใหเขากน เพอไมใหเลอดแขงตว

(2) ปนเหวยงท 800 g นาน 10 นาท คอยๆ ดดสวนใสทง

(3) ลางเมดเลอดแดง 3 ครงดวย PBS ปรมาตร 10 เทาของเมดเลอดแดง กลบหลอดขน-ลงเบาๆ ใหเขากน

น าไปปนเหวยงท 800 g นาน 10 นาท

(4) ดดสวนใสทง

(5) เตม PBS ปรมาตร 10 เทาของเมดเลอดแดง กลบหลอดขน-ลงเบาๆ เพอใหสารละลายผสมกน

(6) ท าซ าขอ (3) ถง (5) อก 2 รอบ

(7) น าไปปนเหวยงทความเรว 800 g นาน 10 นาท

(8) ดดสวนใสทง จะไดเมดเลอดแดงทเปน packed red blood cells สามารถเกบไวทอณหภม 4oC นาน

1 สปดาห

(9) เมอจะน าไปใชใหเตรยมเมดเลอดแดงความเขมขน 0.5% โดยผสมเมดเลอดแดงจากขอ (8) 500 µl

กบ PBS ปรมาตร 10 ml เขยาเบาๆ ใหเขากน เกบทอณหภม 4°C ไมเกน 1 สปดาห หากพบวาเมดเลอด

แดงแตกใหเตรยมใหม และผสมเมดเลอดแดงใหเขากนทกครงกอนน าไปใชงาน

จ.2 Haemagglutination test (HA test) เพอทดสอบคณสมบตการจบกลมของเมดเลอดแดง

โปรตนฮแมกกลตนนบนผวของไวรสไขหวดใหญสกรสามารถเขาจบกบตวรบทจ าเพาะบนผวเมดเลอดแดงได

ท าใหเกดปฏกรยาการเกาะกลมของเมดเลอดแดง ซงสามารถน าหลกการนมาใชในการตรวจหาไวรส

ไขหวดใหญสกรได โดยมกใชในการตรวจสอบหลงจากการเพาะแยกไวรส เนองจากการเกดปฏกรยานตอง

อาศยไวรสจ านวนมากและอาจเกดผลบวกเทยมไดสง เพราะนอกจากไวรสไขหวดใหญแลวยงมไวรสและ

Page 24: DIAGNOSIS OF SWINE INFLUENZA of... · ไข้หวัดใหญ่สุกร (swine influenza) ที่มีสาเหตุจากไวรัสอินฟลูเอนซา

มกษ. 10050-2556 18

แบคทเรยบางชนดสามารถเกดปฏกรยานไดเชนกน และตองอานผลภายใน 30 - 45 นาท เพราะถาตงไวนาน

กวา 45 นาท จะเกดผลลบเทยมเนองจากการตกตะกอนของเมดเลอดแดง วธ HA มรายละเอยด ดงน

(1) ใส PBS ใน plate ชนด 96 well ทกหลม หลมละ 50 l โดยใชไมโครไปเปต

(2) เตมสารละลายจากของเหลวจากไขฟกหรอไวรสจากเซลลเพาะเลยง ในแถวแรก หลมละ 50 l

ตวอยางละ 2 - 4 หลม ดดสารละลายขน-ลงเพอใหผสมกนด

(3) ท าสารละลายเจอจาง 2 เทา (2 fold dilution) โดยดดสารละลายจากแถวแรก 50 l ใสใน

แถวท 2 ผสมใหเขากน แลวดดไปใสในแถวถดไปเรอยๆ จนถงแถวรองสดทายใหดดสารละลายทง (แถวสดทาย

เปนชดควบคมผลลบ (negative control))

(4) เตมเมดเลอดแดงไก 0.5% ทเตรยมไว (ขอ จ.1) ทกหลม หลมละ 50 l

(5) เคาะเบาๆ เพอใหสารละลายผสมกน ตงไวทอณหภมหอง เปนเวลาประมาณ 45 นาท

(6) อานผลทนท หลมทใหผล HA บวกจะพบมการจบกลมของเมดเลอดแดงอยางสมบรณทกนหลม

(ภาพท ฎ.6)

วนจฉยใหหลมทมความเจอจางของแอนตเจนสงสดทใหผลบวกมคาเปน 1 เอชเอ ยนต (HA unit, HAU)

จ.3 Haemagglutination inhibition test (HI test) เพอทดสอบคณสมบตยบยงการจบกลมของเมดเลอดแดง

เปนวธตรวจหาแอนตบอดในซรมทถกปองกนไมใหสามารถจบกบโปรตนฮแมกกลตนน (haemagglutinin)

บนผวของไวรส กบตวรบบนผวเมดเลอดแดง (virus-erythrocyte complexes) ท าใหไมเกดปฏกรยาการเกาะ

กลมของเมดเลอดแดง สกรจะสรางแอนตบอดตอไวรสไขหวดใหญสกรหลงการตดเชอ 5 - 7 วน โดยม

ปรมาณสงสดหลงจากตดเชอ 3 - 6 สปดาห และคงอยในกระแสเลอดนาน 3 - 6 เดอน สวนแอนตบอดท

ไดรบจากแมจะอยไดนาน 4 - 8 สปดาห ทงนขนอยกบแอนตบอดทไดรบทางนมน าเหลอง (colostrum)

การตรวจดวยวธนมขอดคอสามารถตรวจในขณะทสกรมชวตและสะดวกในการเกบตวอยางเลอด และสามารถ

ท าไดงายในหองปฏบตการทวไป แตจะตองเกบซรมค หางกน 10 - 21 วน เพอดการเพมขนของระดบ

แอนตบอด อกทงแอนตบอดตอโปรตนฮแมกกลตนน ของไวรสไขหวดใหญสกรมความจ าเพาะในแตละ

สายพนธ จงสามารถใชจ าแนกชนดของสายพนธไวรสไขหวดใหญชนดยอยได ดงนนในการตรวจสอบดวยวธน

จงตองใชไวรสทกสายพนธในการทดสอบ HI test แตละครง มรายละเอยด ดงน

(1) เจอจางไวรสแอนตเจนใหมความเขมขน 4 HAU/25 l หรอ 8 HAU/25 l โดยใช PBS (0.01 M,

pH 7.2 ถง pH 7.4) ตองท า back titration เพอตรวจยนยนความเขมขนของแอนตเจน

Page 25: DIAGNOSIS OF SWINE INFLUENZA of... · ไข้หวัดใหญ่สุกร (swine influenza) ที่มีสาเหตุจากไวรัสอินฟลูเอนซา

มกษ. 10050-2556

19

(2) เตม PBS ปรมาตร 25 l ลงในทกหลมของไมโครเพลท (ชนด 96 หลม) ทมกนหลมเปน

รปตววหรอตวย

(3) เตมตวอยางซรมแตละตวอยางปรมาตร 25 l ในหลมท 1 ของแตละแถว ท าซ าสามชดตอ

หนงตวอยาง

(4) ท าสารละลายเจอจาง 2 เทา (2 fold dilution)

(5) เตมไวรสแอนตเจนมาตรฐานจากขอ (1) (แอนตเจนชดควบคมผลบวก) ปรมาตร 25l ทกหลม

(6) ส าหรบหลมทไมไดใชทดสอบใหเตม PBS ปรมาตร 50 l เพอทดสอบการตกตะกอนของ

เมดเลอดแดง

(7) ปดไมโครเพลท และบมทอณหภมหองนาน 10 - 30 นาท

(8) เตม 0.5% เมดเลอดแดง ปรมาตร 50 l ลงในทกหลม เขยาใหเขากน

(9) ปดไมโครเพลท และบมทอณหภมหองนาน 30 - 60 นาท หรอเมอเมดเลอดแดงในหลมควบคม

ผลบวกรวมกลมกนเปนเมดกระดม

(10) การอานผล หลมทใหผล HI เปนบวก แสดงวามการยบยงการจบกลมของเมดเลอดแดง โดยจะพบวา

เมดเลอดแดงจบกลมคลายเมดกระดม หรอเมอเอยงเพลทแลวพบวามอตราการไหลของเมดเลอดแดงเทากบ

การไหลของเมดเลอดแดงในหลมควบคมผลบวก

(11) การแปลผล ถาไดระดบ HI titre เทากบหรอมากกวา 1:40 เมอใชแอนตเจนเทากบ

4 HAU/ 25 l หรอ 8 HAU/ 25 l แสดงวามแอนตบอดตอไวรสไขหวดใหญสกร ชนดยอยนนๆ

หรอกรณเกบซรมเพอยนยนการตดเชอควรท าซรมค 2 ครง หางกน 10 - 21 วน จะมคา HI titer

เพมขนมากกวา 4 เทา หาก HI titer ต ากวา 1:40 แสดงวาสกรไมไดปวยดวยโรคไขหวดใหญสกร

หมายเหต:

1. เพอยนยนความถกตองของผลการทดสอบ จะตองมซรมชดควบคมผลบวก และซรมชดควบคม

ผลลบดวยทกครง

2. ในซรมปกตจะม non-specific inhibitors ทท าหนาทปองกนการแขงตวของเลอดหรอการเกาะกลม

ของเมดเลอด ซงจะรบกวนการตรวจท าใหเกดผลบวกเทยม (false positive) ดงนนจงตองใส receptor

destroying enzyme เพอก าจด non-specific inhibitors กอนท าการตรวจ ทงน WHO แนะน าใหอานคาบวกท

1:40 ขนไป จ าเปนตองก าจด non-specific haemagglutination กอน โดย

Page 26: DIAGNOSIS OF SWINE INFLUENZA of... · ไข้หวัดใหญ่สุกร (swine influenza) ที่มีสาเหตุจากไวรัสอินฟลูเอนซา

มกษ. 10050-2556 20

(1) เตรยม receptor-destroyed enzyme (RDE) ใหไดความเขมขน 100 units/ml ดวยการเจอจาง

RDE 1 สวน ในสารละลาย calcium saline 10 สวน (1/10 dilution) หรอขนอยกบค าแนะน าของ

ผผลต

(2) ผสมซรมทใชอางอง (reference serum ส าหรบ H1N1, H1N2 และ H3N2 isolates) 50 l กบ RDE

200 l บมทอณหภม 37°C นาน 12 - 18 ชวโมง ในอางน าควบคมอณหภม (water bath)

(3) เตมสารละลาย 2.5% sodium citrate ปรมาตร 150 l บมทอณหภม 56°C เปนเวลา 30 นาท

(4) น าซรมจากขอ (2) ปรมาตร 200 l ผสมกบ PBS 25 l

(5) เตมเมดเลอดแดงความเขมขน 50% ปรมาตร 50 l เขยาและบมทอณหภมหอง เปนเวลา 30 นาท หรอ

บมทอณหภม 4°C ขามคน

(6) น าไปปนเหวยงทความเรว 800 g ทอณหภม 4°C นาน 10 นาท

Page 27: DIAGNOSIS OF SWINE INFLUENZA of... · ไข้หวัดใหญ่สุกร (swine influenza) ที่มีสาเหตุจากไวรัสอินฟลูเอนซา

มกษ. 10050-2556

21

ภาคผนวก ฉ

การชนสตรโรคไขหวดใหญสกรดวยวธทางชววทยาระดบโมเลกล

(ขอ 3.3, ขอ 3.3.1.2, ขอ 3.3.1.3)

การชนสตรโรคดวยวธชววทยาระดบโมเลกลน แบงออกเปน 2 ขนตอน คอ

(1) การสกด RNA ดวยวธมาตรฐานทวไป หรอใชชดสกด RNA ส าเรจรป ทพสจนแลววามความไว และ

ความจ าเพาะใกลเคยงหรอเทยบเทากบวธมาตรฐาน

(2) การตรวจพสจนพนธกรรมไวรสไขหวดใหญสกรดวยวธ RT-PCR ประกอบดวยการสราง cDNA และการ

เพมจ านวน DNA เปาหมาย สามารถใชชดปฏกรยาในขนตอนเดยว (one step RT-PCR) หรอแยกท า

การสราง cDNA กอน (ภาคผนวก ญ) แลวน า cDNA ทไดมาเพมจ านวนดวยปฏกรยา PCR

ฉ.1 การสกด RNA มวธการดงน

(1) น าตวอยางปายจมกหรอปอดทผานการเตรยมตวอยางตามขอ 3.3.1.1 แบงตวอยางมา 250 l แลว

เตม Trizol LS 750 l ใชไปเปตดดขน-ลง เพอใหสารละลายรวมกน

(2) น าตวอยางขอ (1) มาบมทอณหภมหอง เปนเวลา 5 นาท

(3) เตมคลอโรฟอรม 200 l ในตวอยาง ผสมใหเขากน โดยเขยาเปนเวลา 15 - 20 วนาท

(4) บมตวอยางทอณหภมหอง เปนเวลา 15 นาท

(5) ปนเหวยงทความเรว 10,000 รอบตอนาท ทอณหภม 4oC เปนเวลา 15 นาท

(6) เตม isopropanol 500 l ผสมใหเขากน

(7) บมทอณหภมหอง นานอยางนอย 10 นาท

(8) ปนเหวยงทความเรว 10,000 รอบตอนาท ทอณหภม 4oC เปนเวลา 15 นาท และดดสวนทเปน

สารละลายทง

(9) ลางตะกอนดวย ethanol 75% ในสดสวน 1 l ตอ 500 l

Page 28: DIAGNOSIS OF SWINE INFLUENZA of... · ไข้หวัดใหญ่สุกร (swine influenza) ที่มีสาเหตุจากไวรัสอินฟลูเอนซา

มกษ. 10050-2556 22

(10) ปนเหวยงทความเรว 10,000 รอบตอนาท ทอณหภม 4oC เปนเวลา 15 นาท และดดสวนทเปน

สารละลายทง

(11) ตงทงไวทอณหภมหอง เปนเวลาประมาณ 20 นาท หรอจนกวาตะกอนแหง

(12) ละลายตะกอนใน diethylpyrocarbonate (DEPC)-treated water ปรมาตร 40 l น าไปใชในขนตอน

สราง cDNA ทนทหรอเกบไวทอณหภม -70oC จนกวาจะน าไปตรวจวนจฉยตอไป

หมายเหต: อาจใชชดสกด RNA ส าเรจรป ตามวธของผผลตจ าหนาย (manufacturer instruction)

ฉ.2 การสราง cDNA และการเพมจ านวน DNA ในขนตอนเดยว

ใชชดปฏกรยา one strep RT-PCR ของ Access Quick™ RT-PCR Kit (Promega, USA) โดยมล าดบเบสของ

primers ทใชในปฏกรยาจาก 5´– 3´ ดงน

(1) เตรยมสารละลาย master mix ลงในหลอดขนาด 0.5 ml หลอดละ 22 l ดงตารางท ฉ.1

ตารางท ฉ.1 สวนประกอบสารละลาย PCR Master mix

สารเคม ความเขมขน ปรมาตร

RNAse free water 8.0 l

Master mix 2X 12.5 l

Primer MF 25 pmol/l 0.5 l

Primer MR 25 pmol/l 0.5 l

AMV Reverse Transcriptase 0.5 l

Total (l) 22.0 l

Page 29: DIAGNOSIS OF SWINE INFLUENZA of... · ไข้หวัดใหญ่สุกร (swine influenza) ที่มีสาเหตุจากไวรัสอินฟลูเอนซา

มกษ. 10050-2556

23

ตารางท ฉ.2 ตวอยาง primers ทใชในการทดสอบโรคไขหวดใหญสกร

ทศทาง

(direction)

ล าดบเบส

(base sequence)

ขนาด DNA ทไดจาก

พซอาร

(PCR-product size)

(base pair:bp)

ระดบ

ความจ าเพาะ

(specificity

level)

Forward (MF)2/

Reverse (MR)2/

5´-TGATCTTCTTGAAAATTTGCAG-3´

5´-TGTTGACAAAATGACCATCG-3´ 276 bp

M gene

(Influenza A)

หมายเหต: primers ทออกแบบมาจากสวนของยน M ใชตรวจยนยนวาเปนไวรสไขหวดใหญชนดเอ

หากตองการจ าแนกสายพนธชนดยอยตองใช primers ทออกแบบจ าเพาะกบยน HA และ NA

(2) เตม viral RNA จากขนตอนการสกดตวอยางละ 3 l ปดฝาหลอด PCR แลว

(3) น าหลอดเขาเครอง thermocycler โดยตงโปรแกรม ดงน

ขนท 1 Reverse transcription 48 °C 45 นาท

ขนท 2 Initial PCR activation 94°C 3 นาท

ขนท 3 Denaturation 94 °C 20 วนาท

ขนท 4 Annealing 55 °C 20 วนาท 35 รอบ

ขนท 5 Extension 72 °C 30 วนาท

ขนท 6 Final extension 72 °C 10 นาท

2/Payungporn S, Phakdeewirot P, Chutinimitkul S, et. al. 2004.Single-Step Multiplex Reverse

Transcription– Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) for Influenza A Virus Subtype H5N1

Detection.Viral Immunology; Vol. 17. No. 4: 588-593.

Page 30: DIAGNOSIS OF SWINE INFLUENZA of... · ไข้หวัดใหญ่สุกร (swine influenza) ที่มีสาเหตุจากไวรัสอินฟลูเอนซา

มกษ. 10050-2556 24

(4) ระหวางทเครองพซอารก าลงท างานใหเตรยม 1.5% agarose gel ใน TBE buffer ละลายใหเขากนดวยใช

ไมโครเวฟทความรอนระดบกลางหรอ 300 - 600 วตต นานประมาณ 3-5 นาท จากนนน าไปเทใสถาดพมพทม

จ านวนหลมเพยงพอกบจ านวนตวอยางท จะตรวจสอบ รอใหเจลเยนและแขงดแลวจงน าไปวางบนเครอง

electrophoresis chamber ทม TBE buffer อยในระดบททวมแผนเจล

(5) น า PCR product 10 l ทผสมกบ 6X loading dye 2 l มาหยอดในเจลทเตรยมไว โดยใชแถวแรกของ

เจลเปน DNA marker (100 bp)

(6) น าไปแยกขนาดของ PCR product ดวยเครอง gel electrophoresis 100 โวลต เปนเวลา 45 - 60 นาท

(7) ยอมแผน agarose gel ดวย ethidium bromide 2 g/ml ในน ากลน นาน 15 นาท หรออาจใชสารเรองแสง

ส าหรบยอม DNA (florescence dye)

(8) อานดวยเครอง visible-UV gel transmission เพอตรวจหาขนาดของ PCR product

(9) การแปลผล ถาเชอททดสอบเปนไวรสไขหวดใหญสกร ชนดเอ โดยจะเหนแถบเรองแสงของ DNA

(ภาพท ฉ.1) ตามขนาด primers ทใชตามตารางท ฉ.2

marker +ve -ve

ภาพท ฉ.1 ภาพแสดงผลการชนสตรเชอไขหวดใหญสกรดวยเทคนค RT-PCR โดยใช primers

ทออกแบบใหจ าเพาะตอยน M ใหผลบวกโดยได PCR product 276 bp

Page 31: DIAGNOSIS OF SWINE INFLUENZA of... · ไข้หวัดใหญ่สุกร (swine influenza) ที่มีสาเหตุจากไวรัสอินฟลูเอนซา

มกษ. 10050-2556

25

ภาคผนวก ช

Immunohistochemistry (IHC)

(ขอ 3.3)

ช.1 หลกการ

วธนใชตรวจหาแอนตเจนของไวรสไขหวดใหญสกรจากชนเนอทฝงในบลอคพาราฟน เหมาะส าหรบการศกษา

แบบยอนหลง เนองจากสามารถเกบบลอกพาราฟนไดเปนระยะเวลานาน แตมขอจ ากด คอ ความสามารถใน

การตรวจขนกบแอนตบอดทใช ถาใชแอนตบอด monoclonal anti-influenza A (neucleoprotein) จะตรวจ

แอนตเจนไวรสอนฟลเอนซา ชนดเอ ไดทกสายพนธชนดยอย สวนการจ าแนกสายพนธไวรสชนดยอยตองใช

เทคนคอนรวมดวย เชน เทคนค PCR เปนตน ทงนคณภาพของชนเนอมผลตอความไวในการตรวจ เนองจาก

ตองคงสภาพชนเนอดวยฟอรมาลน จงอาจท าใหเกดบดบงแอนตเจนของไวรสในชนเนอ

ช.2 วธการตรวจหาแอนตเจนของไวรสไขหวดใหญโดยเทคนค immunohistochemistry

(1) การเกบชนเนอ ตองตดชนเนอหนา 0.5 – 1 cm และแช 10% buffered formalin นานไมเกน

24 ชวโมง น าไปฝงบลอกพาราฟน

(2) ใชความรอนละลายพาราฟนออกจากชนเนอ ทตด (tissue section) หนาไมเกน 4 µm โดยแชในไซลนและ

จมในแอลกอฮอล 100%, 95%, 80% และ 70% ตามล าดบ ลางดวยน าประปาและน ากลน

(3) ท าใหแอนตเจนออกมา (antigen retrieval) ดวยเอนไซม proteinase K 0.1% ทอณหภม 37°C นาน 10 นาท

(4) ลางดวย PBS 3 ครงๆ ละ 5 นาท ตอจากนน block non-specific endogenous peroxidase ดวย 3% H2O2

ใน absolute methanol นาน 10 นาท ทอณหภมหอง

(5) ลางดวย PBS 3 ครงๆ ละ 5 นาท

(6) block non-specific binding ดวย bovine serum albumin 1% ใน PBS ทอณหภม 37°C นาน 30 นาท

(7) ลางดวย PBS 3 ครงๆ ละ 5 นาท

(8) ท าปฏกรยากบ monoclonal anti-NP influenza A antibody ตามความเขมขนและเวลาทเหมาะสม

(9) ลางดวย PBS 3 ครงๆ ละ 5 นาท

Page 32: DIAGNOSIS OF SWINE INFLUENZA of... · ไข้หวัดใหญ่สุกร (swine influenza) ที่มีสาเหตุจากไวรัสอินฟลูเอนซา

มกษ. 10050-2556 26

(10) น าไปท าปฏกรยาตอกบ biotinylate rabbit anti- mouse IgG ความเขมขน 1:400 ทอณหภม

37°C นาน 30 นาท

(11) ลางดวย PBS 3 ครงๆ ละ 5 นาท

(12) น าไปท าปฏกรยากบ envision polymer (Envision Polymer DAKO, Denmark) ทอณหภม 37°C นาน 30 นาท

(13) ลางดวย PBS 3 ครงๆ ละ 5 นาท

(14) ท าใหเกดสดวย DAB 0.05% (3,3´-diaminobenzidine tetrahydrochloride 0.01 M Tris-HCL,

pH 7.6) (Sigma, USA) 30 - 60 วนาท

(15) ลางดวยน ากลน 1 นาท

(16) ยอมทบดวยส Mayer’s hematoxylin นาน 45 วนาท

(17) ลางดวยน าประปาไหลผาน 5 นาท

(18) ดงน า (dehydrate) ออกจากชนเนออยางรวดเรวโดยจมในแอลกอฮอลล 70%, 80%, 95% และ

100% ตามล าดบ แลวปดทบดวยแผนสไลด

(19) การอานผล เมอพบนวเคลยสของเซลลทตดเชอมสน าตาลเขมแสดงวาใหผลบวก หากภายใน

นวเคลยสไมตดสดงกลาวแสดงวาใหผลลบ

(20) การแปลผล พบแอนตเจนของไขหวดใหญสกรยอมตดสน าตาลแดง บงบอกถงการตดเชอไขหวดใหญ

สกรในชนเนอดงกลาว

ขอควรปฏบต

ตองท าใหชนเนอมความชมชนตลอดเวลาใน moist chamber

Page 33: DIAGNOSIS OF SWINE INFLUENZA of... · ไข้หวัดใหญ่สุกร (swine influenza) ที่มีสาเหตุจากไวรัสอินฟลูเอนซา

มกษ. 10050-2556

27

ภาคผนวก ซ

วธการตรวจหาปรมาณไวรสไขหวดใหญสกรโดยการไตเตรท (ขอ 3.3.1.3)

(1) น าเซลล MDCK มาเพาะเลยงในจานอาหารส าหรบเลยงเซลลขนาด 24 หลม โดยใหมปรมาณเซลล

ไมนอยกวา 106 cell/ml ในอาหารส าหรบเลยงเซลล (minimal essential medium; MEM) ทม 5% fetal

bovine serum (FBS) ใสหลมละ 200 µl

(2) น าเขาตบมทอณหภม 37°C, 5% CO2 นานประมาณ 48 ชวโมง จนเซลลแบงตวและแผขยาย

ออกเปนเซลลชนเดยวจนเตมพนทหลม หรอประมาณ 80% ของพนทหลม (confluent monolayer)

(3) เตรยมสารละลายตวอยางไวรส ทมความเขมขน 1:10, 1:102, 1:10

3, 1:10

4, 1:10

5 จนถง

ความเขมขนทตองการ ดวย MEM และ trypsin 1 µg/ml ในหลอดทดลอง เกบทอณหภม 4°C หรอตงบนน าแขงระหวางรอเตรยมลางเซลลเพาะเลยง

(4) ดดอาหารเลยงเซลลในขอ (1) ทง และลางเซลลดวย PBS หรอ MEM 3 ครงๆ ละ100 µl ตอหลม

(5) เตมสารละลายไวรสในขอ (3) ลงบนเซลล confluent monolayer หลมละ 100 µl โดยแตละความ

เขมขนควรท าซ า 3 หลม ถง 4 หลม (หลมทไมไดเตมสารละลายไวรส ใหเตม MEM และ trypsin 1 µg/ml

เพอเปนชดควบคมผลลบ)

(6) น าเขาตบม 5% CO2 ทอณหภม 37°C สงเกตการเกด CPE ทกวน เปนเวลา 5 วน

(7) น าไปตรวจสอบดวยวธ immunoperoxidase monolayer assay (IPMA) และค านวณคาไวรสไตเตอร

โดยวธ Reed and Muench, 1938

(8) อาจน าสารละลายไวรสไปตรวจสอบดวยวธ HA test หรอ real time RT- PCR ตอไป

Page 34: DIAGNOSIS OF SWINE INFLUENZA of... · ไข้หวัดใหญ่สุกร (swine influenza) ที่มีสาเหตุจากไวรัสอินฟลูเอนซา

มกษ. 10050-2556 28

ภาคผนวก ฌ

วธการยอม immunoperoxidase monolayer assay (IPMA)

(ขอ 3.3.1.3)

(1) น าเพลทเลยงเซลลทไดท าการเพาะแยกเชอไวรสตามขอ 3.3.1.3 รนอาหารเลยงเซลลทง และคงสภาพ

เซลลดวย 4% ฟอรมาลนทเจอจางดวย 0.5% Phosphate Buffered Saline Tween-20 (PBST) หลมละ 100 µl ตงไวทอณหภมหอง 30 นาท

(2) รนฟอรมาลนทง แลวลางดวย 0.5% PBST หลมละ 100 µl ถง 200 µl ลาง 3 ครง ครงท 3 ใหแชทงไว

5 นาท

(3) เตมแอนตบอดทจ าเพาะตอไวรสไขหวดใหญ (anti-influenza A nucleoprotein monoclonal antibody)

อตราสวน 1:2000 เจอจางดวย 0.5% PBS ทม 1% BSA (เตรยมใหมทกครง) ใสหลมละ 50 µl ตงไวทอณหภมหอง 60 นาท

(4) รนสารละลายทง แลวลางดวย 0.5% PBST ท าเหมอนขอ (2)

(5) เตม anti-mouse IgG conjugate ในอตราสวนทเหมาะสมตามค าแนะน าของผผลต เจอจางดวย

0.5% PBST ทม 1% BSA (เตรยมใหมทกครง) ใสหลมละ 50 µl ตงไวทอณหภมหอง 60 นาท

(6) รนสารละลายทง แลวลางดวย 0.5% PBST ท าเหมอนขอ (2)

(7) เตม substrate หลมละ 100 µl มสวนประกอบดงน

AEC: acetate buffer: 30% H2O2 ในอตราสวน 1 µl : 19 µl : 20 µl (ปรมาตรนใชกบตวอยาง

ทงหมด 2 เพลท) ตงไวทอณหภมหอง 60 นาท

(8) อานผลเปนบวกเมอพบวาภายในนวเคลยสตดสน าตาลแดง โดยเปรยบเทยบกบชดควบคมผลบวก

หากไมตดสภายในนวเคลยสแสดงวาใหผลลบ

(9) การแปลผล มการตดเชอไขหวดใหญสกรภายในเซลลเพาะเลยงเมอพบนวเคลยสตดสน าตาลแดง

Page 35: DIAGNOSIS OF SWINE INFLUENZA of... · ไข้หวัดใหญ่สุกร (swine influenza) ที่มีสาเหตุจากไวรัสอินฟลูเอนซา

มกษ. 10050-2556

29

ภาคผนวก ญ

การสราง cDNA (ภาคผนวก ฉ)

การสงเคราะห cDNA (reverse transcription) มวธการดงน

(1) ใช RNA 1 ไมโครกรม (g) เปน RNA ตนแบบ

(2) สงเคราะห cDNA สายแรก (first strand cDNA) โดยสภาพทเหมาะสมของปฏกรยาตองการ

สวนผสมปรมาตร 20 l ซงมสวนประกอบดงน

ตารางท ญ.1 สวนประกอบสารละลาย RT Master mix

สารเคม ความเขมขน

Hexamer primer 144R 0.75 ไมโครโมลาร (M)

dNTPs 1 มลลโมลาร (mM)

M-MLV (Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase) 2.5 Unit

MgCl2 5 mM

PCR buffer (10 mM Tris/HCl. pH 8.3, 50 mM KCl)

Total volume 20 l

(3) น าตวอยางเขาเครอง thermocycler ในขนตอนการเพมอณหภม

(4) ตงอณหภมท 42°C นาน 15 นาท ใหเกดปฏกรยา reverse transcription ของ RNA ตนแบบ ใหเปน

cDNA สายแรก จากนนใหเพมอณหภมเปน 100°C นาน 5 นาท เพอยบยงปฏกรยาของเอนไซม

reverse transcriptase และปรบอณหภมของสารละลายลงมาท 5°C กอนน าไปเพมจ านวน DNA ดวย PCR ตอไป

Page 36: DIAGNOSIS OF SWINE INFLUENZA of... · ไข้หวัดใหญ่สุกร (swine influenza) ที่มีสาเหตุจากไวรัสอินฟลูเอนซา

มกษ. 10050-2556 30

ภาคผนวก ฎ

ภาพประกอบการชนสตรโรคไขหวดใหญสกร

ภาพท ฎ.1 (ก) แสดงสกรปวยดวยโรคระบบทางเดนหายใจแบบเฉยบพลน

(ข) ภาพการอกเสบทตา (ค) ภาพน ามกใสทจมก

Page 37: DIAGNOSIS OF SWINE INFLUENZA of... · ไข้หวัดใหญ่สุกร (swine influenza) ที่มีสาเหตุจากไวรัสอินฟลูเอนซา

มกษ. 10050-2556

31

ภาพท ฎ.2 ภาพแสดงการเกบตวอยางไขหวดใหญสกรจากสงคดหลงภายในโพรงจมกดวยวธปายกวาด

โพรงจมก (nasal swab)

ภาพท ฎ.3 ภาพแสดงการเกบตวอยางเลอดจากลกสกร

Page 38: DIAGNOSIS OF SWINE INFLUENZA of... · ไข้หวัดใหญ่สุกร (swine influenza) ที่มีสาเหตุจากไวรัสอินฟลูเอนซา

มกษ. 10050-2556 32

ภาพท ฎ.4 (ก) และ (ข) ภาพแสดงบรเวณทควรเกบตวอยางเนอเยอปอด (วงกลม)

ภาพท ฎ.5 ภาพแสดงต าแหนงทใชเพาะแยกและเพมจ านวนไวรสในไขไกฟก

ทมา: http://wenliang.myweb.uga.edu

(ก) (ข)

Page 39: DIAGNOSIS OF SWINE INFLUENZA of... · ไข้หวัดใหญ่สุกร (swine influenza) ที่มีสาเหตุจากไวรัสอินฟลูเอนซา

มกษ. 10050-2556

33

ภาพท ฎ.6 (ก) ภาพแสดงลกษณะการจบกลมของเมดเลอดแดงทใหผลบวกและ (ข) ลกษณะของเมดเลอด

แดงรวมกนคลายเมดกระดมทใหผลลบใน HA test

ภาพท ฎ.7 ภาพแสดงแสดงคา HI titer ท 1: 1280 ซงพบเมดเลอดแดงทรวมกน

คลายเมดกระดม (ชองสเหลยมท 9)

ภาพท ฎ.8 ภาพแสดงการยอมดวยเทคนค immunoperoxidase monolayer assay (IPMA)

(ก) พบเซลลยอมตดสน าตาลแดงในนวเคลยส แสดงวามการตดไวรสไขหวดใหญสกร

(ข) ไมพบเซลลยอมตดสน าตาลแดงทนวเคลยสแสดงวาเปนเซลลปกต