. . . . . . . . . . . . . . . . . . .

'L'niversidad)Iutónoma Metropolitana

'L'ndadIztapalüpa Ciencias Bioliigicas y de lü

Salud

Estudio di N--cetikisteina so6re lügctzvidad ElüstoBtica en Cavados Bronquiolbaheolüres di

Sujetos Fumadoresy E@madores

servicio Socialque presenta: glijandra Hernández Pérez

96226738

Para o6tener elgrado di Lic. Bwlbgh

Asesores: M. en c. Martha Montañ0 Kamírez

M. C. José Luz's Eduardo Fhres sáenz

M. en C. Mar.tha Montañ0 Ramírez

,., ' . 1 *; . .

ESTUDIO DE N-ACETILCISTEINA SOBRE LA ACTIVIDAD

ELASTOLITICA EN LAVADOS BRONQUIOLOALVEOLARES DE

SUJETOS FUMADORES Y EXFUMADORES.

Introducción.

La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), se considera un

grave problema de salud, debido a que la mortalidad asociada a este

padecimiento se ha incrementado en los últimos años (1,2). La EPOC se

caracteriza por la presencia de obstrucción al flujo aéreo, como un fenómeno

fisiológico secundario al desarrollo de bronquitis crónica o enfisema pulmonar.

Esta obstrucción del flujo aéreo es crónica, progresiva, irreversible, lo que se

traduce clínicamente en una disnea creciente y limitación progresiva en las

actividades cotidianas de los pacientes, pudiendo originar la muerte a mediano

plazo; además puede estar acompañada por hiperreactividad bronquial. Sin

embargo, en algunos casos esta puede ser parcialmente revertida (2,4).

El enfisema pulmonar es una entidad patológica que se define

fundamentalmente mediante criterios morfológicos, de manera que la

histología tisular se observa una alteración a nivel del parénquima pulmonar,

caracterizada por un agrandamiento anormal y permanente de los espacios

aéreos dístales a los bronquíolos terminales, y acompafiado por destrucción de

las paredes y uniones alveolares, sin mostrar la presencia de fibrosis (3,4,5).

Estos cambios son el resultado de la perdida del intercambio de gases en la

zona alveolo capilar; además, la destrucción del parénquima pulmonar provoca

que los conductos aéreos se obstruyan durante la espiración, debido a la

retracción elástica del tejido (4).

El enfisema pulmonar se reconoce in vivo por la disminución de la

capacidad de difusión del monóxido de carbons y fa reducción de la densidad

1

del parénquima, esto comúnmente se observa mediante tomografía computada

de tórax (TAC). Pero el indicador fisiológico más sensible de obstrucción de la

vía aérea es la evaluación del volumen forzado en el primer segundo (VEF1)

(6).

En una serie de estudios epidemiológicos se demostró que el tabaquismo

es el factor de riesgo m i s importante para desarrollar enfisema, siendo

responsable del 85% de los casos de EPOC (7). Sin embargo, también se

conoce que el proceso ocurre muy lentamente, cuando se hace en vida el

diagnóstico de enfisema, lo cual significa que sí el sujeto fumó durante los 20-

40 años que precedieron al desarrollo de síntomas, estuvo ocurriendo un

estímulo constante de destrucción pulmonar originado por el tabaco. Se ha

caracterizado al humo derivado del cigarro como uno de los principales

promotores de un desbalance en ¡os niveles proteinasas y antiproteasas

pulmonar, lo cual se conoce como la teoría del balance proteasa-antiproteasa,

que se ha utilizado tradicionalmente para explicar la patogenia del EPOC y en el

contexto de este trabajo respecto al enfisema. El efecto del humo de tabaco

sobre la elastina del pulmón es un proceso muy complejo, y afecta diversas

etapas del metabolismo de esta proteína, así como de otros componentes de la

matriz extracelular del tejido conectivo (7).

El humo de cigarro tiene diversos efectos químicos sobre el tejido

pulmonar, uno de ellos ocurre sobre los niveles locales de los inhibidores de

proteasas ó proteinasas en el tejido pulmonar, especialmente sobre los de al-

antripsina (al-AT)(8.)

.' El humo del cigarro contiene diferentes radicales libres, tanto en su fase

gaseosa como en la fase sólida al producirse su combustión (8). En la fase de

gaseosa existen radicales inorgánicos como el óxido de nitrógeno, que es una

fuente de radicales orgánicos (8). En los radicales orgánicos están los derivados del carbono y los radicales libres de oxígeno. Estos últimos son

2

superóxido, peróxido de hidrógeno e hidroxilo, que son altamente reactivos. La

al-antitripsina puede ser inactivada in vitro por los radicales libres de oxígeno

derivados del humo de cigarro (8). El primer punto de inactivación por

oxidación de la al-antitripsina se da en el sitio activo, en el residuo de

metionina que se encuentra en la posición 358 de la secuencia primaria de esta

proteína. Disminuyendo con esto su actividad inhibitoria contra la elastasa de

neutrófilos (MMP-8), que es una de las principales metaloproteinasas de matriz

extracelular (MMPs) que intervienen en el desarrollo del enfisema pulmonar

(4,9).

Los oxidantes del humo de cigarro pueden causar daño directo a las

macromoléculas de la matriz extracelular que constituyen el tejido conectivo,

rompiendo los enlaces covalentes entre las moléculas, haciéndolas más

susceptibles a proteolisis. El humo de cigarro puede alterar el metabolismo de

la elastina pulmonar, específicamente inhibiendo la formación de los enlaces

covalentes necesarios para la formación de fibras elásticas. Algunos

experimentos in vitro sugieren que la afinidad de la enzima oxidasa de k i n a

por la tropoelastina (precursor soluble) disminuye después de la exposición al

humo de tabaco, impidiendo con esto la fibrilogénesís (10).

Los agentes oxidantes del humo de cigarro ocasionan la alteración

química de lípidos, ácidos nucleicos, proteínas, enzimas y cofactores;

investigaciones recientes han demostrado que los agentes oxidantes afectan

moléculas antioxidante del pulmón, tales como la vitamina C y la metionina

superoxido-péptido reductasa (1 1).

-1 El alquitrán del tabaco contiene más de lo1* radicales libres por gramo, la

quinona-hidroxiquinona es uno de ellos, este compuesto es semejante a los tipos radicales oxidantes de la fase de gas, este polímero presenta un activo

sistema redox que es capaz de reducir al oxígeno molecular y producir peróxido

de hidrógeno del peróxido y radicales hidroxib, lo que ocasiona un ambiente

3

altamente oxidante en el pulmón (10).

Uno de los efectos del humo del tabaco sobre las células pulmonares es la

acumulación de macrófagos alveolares metabólicamente activados. Estos

macrófagos tienen la capacidad de secretar citocinas químioatrayentes para los neutrófilos, lo que ocasiona una inmigración de estas células hacia el pulmón,

incrementando asi la producción de elastasa, la que a su vez degrada a la

elastina, que es uno de las moléculas de la matriz extracelular que se degradan

de manera muy importante en el desarrollo del enfisema (12).

Macrófaaos alveolares

En relación con las células que participan en la patogenia del enfisema, es

importante mencionar que tanto los macrófagos como los neutrófilos están

relacionados directamente con la destrucción de la elastina en el pulmón de los fumadores. (13).

En los pulmones de los fumadores existe un incremento de macrófagos

en los sitios de daño pulmonar .inducido por el humo de cigarro; la participación

de los macrófagos alveolares en el desarrollo de enfisema no se ha establecido

por completo. Sin embargo, tanto los macrófagos alveolares como el humo de

cigarro son fuentes de agentes oxidantes y radicales libres de oxigeno. Los

macrófagos también sintetizan una elastasa, diferentes de las células

polimorfonucleares, que no es una pmteasa de serina sino una

metalopróteinasa de matriz extracelular denominada metaloelastasa (MMP-

12)(9). Esta metaloelastasa sin embargo, no es inhibida por la al-AT. Las

características bioquimicas de las elastasas de l o s macrófagos alveolares no

han sido establecidas de manera exhaustiva y completa (13).

Algunas de las funciones de los macr¿%agos son: secreción de

proelastasas, elastasas activas, inactivación de la al-antitripsina, liberación de

4

radicales libres de oxígeno y otros, y estimulación de la síntesis de elastasas

por los neutrófilos, entre otras. Por otra parte, los macrófagos pueden fagocitar

elastasas de neutrófilos, mediante receptores específicos y liberarla

posteriormente (13,14).

j

En estudios en los que se analiza la degradación de la matriz extracelular

dependiente de macrófagos alveolares, se ha demostrado que estas células

degradan elastina en medio con suero, pero es necesario el contacto con la

fibra elástica para poderla degradar (15,16).

Fibras elásticas

La elastina se asocia constituyendo polimeros conocidos como fibras

elásticas, estas fibras proporcionan elasticidad, permiten la extensibilidad o

estiramiento rápido y la recuperación elástica cuando. es necesario (11).

Podemos encontrar fibras elásticas casi en todos los vertebrados, pero solo en

tejidos especializados como arterias, ligamentos y pulmón entre otros(l5). En

el intersticio pulmonar la degradación y síntesis de las fibras elásticas es un

mecanismo biológico importante. Sin embargo, un desbalance en el

metabolismo de las fibras elásticas, puede ocasionar su perdida progresiva, tal

como ocurre en el enfisema (17).

Las fibras elásticas son en realidad un componente fibrilar y se

constituyen a partir de un precursor soluble que es el que se sintetiza y se le

conoce como tropoelastina. Las fibras elásticas son las responsables de la

elasticidad bajo presiones fisiológicas en el pulmón (18), estas fibras son

forman un arreglo a manera de trenzado, en el cual coinciden en un solo punto

cuatro extremos de diferentes tropoelastinas ya polimerizadas. La elastina es

una de las proteínas más hidrofóbicas en la naturaleza, lo cual es debido a su

alto contenido de aminoácidos hidrofóbicos; un 40 */O aproximadamente. En su

composición de aminoácidos encontramos 33% de glicina, 11 a 40°/0 de prolina,

5

l0/o a 2% de 4-hidroxiprolinaf y alrededor del 40% de aminoácidos hidrofóbicos

como la alanina, valina, leucina, isoleucina y fenilalanina (18,19).

La producción de elastina disminuye con la edad de los individuos, así

como con el incremento de duplicaciones celulares, los estudios sobre la

degradación de elastina demuestra que es un proceso extremadamente lento.

Los mecanismos de degradación in vivo pueden ser divididos en dos categorías:

las enzimas que degradas a las moléculas solubles de tropoelastina ó elastina

inmadura y las enzimas que hidrolizan a las fibras elásticas en estado

polimérico 6 proteína madura. La tropoelastina es degradada por diferentes

proteinazas que incluyen elastasas, tripsina, quimiotripsina, pronasa,

termolisina, catepsina G, trombina y Kalikreina, conocidas también como

tropoelastinasas (1 1).

Actividad EIastoIítica.

Las proteinasas ó proteasas son enzimas capaces de hidrolizar los enlaces

peptídicos en las proteínas. El principal origen de estas proteasas, son las

células inflamatorias que se presentan como mecanismo de defensa tisular, en

el sitio donde ocurre alguna agresión (20). Normalmente el pulmón esta

protegido contra estas enzimas por antiproteasas, moléculas que rápidamente

se unen a proteasas e inhiben su actividad proteolítica. Varias enfermedades

pulmonares inflamatorias se caracterizan por un desequilibrio entre los niveles

de proteasas y antiproteasas (21).

La relación proteasa/antiproteasa asume por una parte que el pulmón es

protegido del daño proteolítico por inhibidores de proteasas, de modo que para

que el daño ocurra se requiere de la concurrencia de un incremento del agresor

proteolítico y/o de la disminución de los mecanismos antiproteolíticos. El origen

de la agresión proteolítica puede ser endógeno o exógeno o una combinación

de los dos como ocurre en el enfisema pulmonar.

b

El pulmón está protegido normalmente del daño proteolítico por la d - A T ,

en la actualidad conocida como el inhibidor de al-antiproteasa (API) que está

presente en los pulmones de personas sanas, es decir con niveles normales de

proteasa séricas y está reducida a un 10% en personas que tienen deficiencia

homocigótica de API. Sin embargo, ésta no es la única antiproteasa. También

existen otras como la ~-2-macroglobulina, que entra en el pulmón solamente si la permeabilidad capilar esta aumentada, el inhibidor de secreción de la

leucoproteasa (SLPI) que es secretado por las glándulas bronquiales y células

de calciformes para proteger el epitelio bronquial de la destruccihn proteolítica

(22,23). Sin embargo, existen también las elastasas que dañan al pulmón, que

provienen principalmente de los neutrófilos y macrófagos. Por lo tanto, los cambios destructivos que se observan en el enfisema pulmonar se deben a un

desequilibrio de los niveles de proteasas y antiproteasas (6,24).

En estudios del lavado bronquioloalveolar (LAB) de pacientes con

enfisema se han encontrado en aumento en e l . número de mactófagos y

neutrófilos (12,25,26) que podrían ser los responsables de daño pulmonar

observado en estos pacientes. Puesto que los neutrófilos son ricos en elastasas

y los macrófagos secretan factores quimiotácticos responsables de estimular el

aumento en número de neutrófilos, se incrementa la elastasa del neutrófilo

(26,27).

Por otro lado, se ha observado mayor número de macrófagos y

neutrófilos en fumadores comparándolo con exfumadores (28,29). Los

macrófagos sintetizan y expresan catepsina B (28), y los niveles de esta

enzima son aproximadamente tres veces más altos en macrófagos de

fumadores sanos que en no fumadores, y aproximadamente 10 veces más altos en fumadores con EPOC (28). Además, recientemente se ha demostrado

un incremento en la actividad elastolítica de los macrófagos alveolares y

pulmonares de pacientes fumadores y con enfisema pulmonar (30,31).

7

El hecho de que los macrófagos alveolares sean las células predominantes

en el espacio alveolar, los señala como una de las células principalmente

involucradas en el proceso proteolítico que se observa en el paciente con

enfisema pulmonar.

Las evidencias indican por lo tanto, que existe un desequilibrio entre

proteasas y antiproteasas, causado por efecto del humo de cigarro sobre los

macrófagos y neutrófilos alveolares para el desarrollo de enfisema pulmonar.

Este desequilibrio puede ocurrir ya sea por deficiencia o disminución de las

antiproteasas y/o por aumento de proteasas. En ambos procesos se requiere

de un incremento de la actividad oxidativa en el microambiente pulmonar.

El aminoácido N-Acetilcisteina (NAC)

Este aminoácido correctamente denominado N-acetil-L-cisteina (NAC), es

una molécula utilizada como antioxidante debido a su participación en la vía

anabólica del glutatión, especialmente en su forma reducida (GSH). EL

glutatión es una molécula intracelular, ubicua a todos los órganos. Actúa en el

mantenimiento de la integridad celular protegiendo del efecto de las diversas

moléculas oxidantes, tales como radicales libres de oxígeno. El GSH tiene

múltiples funciones, incluyendo la desentoxificación de antibióticos, síntesis de

proteínas, ácidos nucleicos, y leucotrienos. En los fluidos del LBA presenta

concentraciones altas, GSH proporciona protección al pulmón debido al daño

oxidativo 'inducido por diferentes agentes endógenos y exógenos tóxicos al

pulmón, tal es el caso del humo de cigarro. La presencia de GSH en el pulmón

ha sido asociada al incremento del daño pulmonar en diversas enfermedades.

El sistema redox del GSH se constituye por antioxidantes primaros y

secundarios, incluyendo la enzimas glutatión peroxidasa (GPX), glutatión

reductasa (GR), glutatión-S-transferasa (GST), y glucosa-6-fosfato

deshidrogenasa (G6PD). Las alteraciones en las actividades de estas enzimas

8

pueden reflejar una estado de defensa celular reducida, y pueden servir como

marcador de muchas enfermedades pulmonares. Como el GSH también

participa en la regulación de la expresión de protooncogenes y apoptosis

(muerte celular programada), el desarrollo de enfermedades tales como el

cáncer y deficiencia inmune en humanos, pueden ser abolidas a niveles

celulares elevados de GSH. La liberación exógena de GSH o su precursor el

aminoácido N-acetil-L-cisteina (NAC), esta siendo utilizada como una estrategia

quimioterapéutica (32).

Por su parte, la diversidad de las aplicaciones de N-acetil-L-cisteina

(NAC), una droga con grupo thiol, es utilizada tanto en in vivo, in vitro, así

como modelos animales. Ha sido utilizada para el estudio de los mecanismos

del estrés oxidativo; en el campo de la terapéutica, en reacciones tipo redox

con los elementos del grupo XVI, radicales de oxígeno y del azufre. Algunas de

las patologías en que ha sido Litilizado con éxito, como el cáncer pulmonar y

enfermedades hepáticas (33).

Objetivo

Estudiar el efecto de NAC sobre la actividad elastolítica en macrófagos

obtenido de lavados bronquioloalveolares en sujetos fumadores y exfumadores.

9

Metodología y Actividades Realizadas

La Clínica de tabaquismo del INER, recibe al año aproximadamente 200

fumadores nuevos que quieren dejar de fumar (31). De esta población

originalmente se utilizaría una muestra aleatoria, de 40 individuos (que

quieren dejar de fumar), 20 de ellos recibirían un tratamiento de 600 mg de

NAC tres veces al día durante cuatro semanas y 20 placebo durante el mismo

tiempo obteniéndose lavados bronquioloalveolares antes y después del

tratamiento.

Población estudiada

De la poblacihn establecida originalmente para el estudio (40 individuos

de la clínica de tabaquismo del INER), sólo' se realizaron 10 lavados

bronquioloalveolares, ya que no existieron pacientes que se sometieran

voluntariamente al estudio, por el procedimiento para 'obtener los lavados

bronquioloalveolares (LBA). Los pacientes fueron tratados con 600 mg de NAC

tres veces al día por cuatro semanas, obteniendo los lavados

bronquioloalveolares antes y después del tratamiento. Otros sujetos solo

recibieron placebo (sin tratamiento).

Los lavados bronquioloalveolares (LBA) fueron realizados en la Clínica de

Tabaquismo, del Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias.

Obtención de Macrófaqos Alveolares a Partir de LBA

El material obtenido del LBA se filtró a través de una gasa estéril, y fue

centrifugado durante 10 minutos a 1800 rpm a 4 OC. El sobrenadante se

colectó y el botón conteniendo las células se resuspendió en un ml de medio

RPMI-1640, después se mezcló con azul de tripano (solución de 10 pl de

muestra, 40 pl de Hz0 Salina y 50 pl de Azul de Tripano) para medir la

10

viabilidad de las células. La muestra fue colocada en la cámara de Neubauer,

esta cámara se observó en un microscopio de luz Carl Zeiss, contando el

número de macrófagos presentes, con el fin de ajustar a 1 X l o 6 macrófagos

por mililitro.

Calculándose el número total de macrófagos presentes en un mililitro de

medio, de la siguiente forma:

Fórmula: CTM X 10,000 = R R X mI/b

Donde:

O CTM es la cuenta total de macrófagos en la superficie vista de 1 mm2 O El recuento total de macrófagos se multiplico por 10,000 ya que l m l =

l c m 3 = 1,000 mm3 = 10,000 cuadros grandes de 0.1 mm3

R es el resultado de la multiplicación

0 ml/b son los mililitros que se utilizaran para resuspender el botón.

Determinación de la actividad elastolítica de Macrófaaos Alveolares utilizando

placas cubiertas con 3H-elastina.

Para la evaluación de la actividad elastolítica, se utilizó el método descrito

por Champan y cols. (15,16). Se prepararan placas para cultivo (Cluster

Costar) de 24 pozos con un diámetro aproximado de 14mm, con una

suspensión de elastina tritiada, colocándose en cada pozo aproximadamente

1 5 ul de elastina, las cajas se colocaron en Iz estufa por 24 hrs. a 45 O C para

que seque la elastina.

11

Una vez secada la elastina los pozos fueron lavados con una buffer salino

de fosfatos pH 7.4. Los pozos fueron cargados por triplicado con 1 x IO6

macrófagos en 1 ml de RPMI-1640 con 10% de suero fetal bovino. Para cada

ensayo se incluyo un duplicado RPMI-1640 sin células que se uso como control

para ajustar los aumentos inespecíficos de elastina radiactiva.

Las cajas fueron incubadas a 37 O C , con una mezcla gaseosa de 5-7 O/O de

COZ durante 2 hrs para con ello permitir que los macrófagos se adhieran a la

caja cubierta con H3-elastina, trascurrido este tiempo se retiro el medio

suspendido en los pozos de las cajas, eliminando así las células no adheridas,

después se adicionó medio fresco RPMI-1640 con suplemento de lo/o de

aminoácidos no esenciales y lO0/o de suero fetal bovino, se incubaron durante

72 horas, cada 24 horas el medio de cultivo fue removido y reemplazado por

medio fresco.

Para determinar la actividad elastolítica debida a la elastasa de los

macrófagos se cuantificó la elastina tritiada degradada, las muestras obtenidas

cada 24 hrs fueron centrifugadas (1500 rpm a 4OC por 5 min) en una

microfuga-E Beckman y del sobrenadante se obtuvo una alícuota de 75 pI a la

que se le adicionaron IO m1 de aquasol y se determinó la radioactividad con un

contador de centelleo liquido (Beckman LC 100C) registrándose las cuentas por

minuto (cpm).

La actividad elastolítica derivada del macrófago se expreso como pg de

elastina degradada/l x l o 6 macrófagos/24 horas. (Tablas 2 y 3)

12

Extracción de DNA.

Se obtuvieron muestras de DNA de sangre humana (aproximadamente

200), las muestras fueron proporcionadas por el banco de sangre del INER,

procesadas de la siguiente manera:

1. La sangre se depositó en tubos que contenían un

anticoagulante EDTA-K3.

2. Se centrífugo, (Centrífuga-BECKMAN), 2800 rpm por 5

minutos, para separar el suero, obteniendo así los

leucocitos.

3. Se obtuvieron alícuotas en tubos eppendorf, 500 VI por tubo

realizándose 6 tubos por muestra.

4. Se colocó en cada tubo 500 pI de buffer de Lysis (realizado

a base de detergentes), par lavar las muestras, Cada

muestra se agitó en un vortex, para que se homogenizara

la solución.

5. Estas muestras se centrifugaron (14000 rpm por un minuto)

eliminándose por decantación el sobrenádate, obteniéndose

un botón.

6. Las muestras se lavaron las veces necesarias con 1000 P I

de buffer de Lysis, agitándose y centrifugando hasta

obtener un botón totalmente blanco.

7. Una vez que se obtuvo el botón blanco, a las muestras se

les adiciono, 500pl de buffer y 50 pl de Proteinaza K.

8. Se colocaron por 24 hrs, 55 O C en la estufa.

9. Trascurrido el tiempo, se hirvieron a 93 O C por diez

minutos.

10. Finalmente fueron congeladas a 2 *C.

13

Objetivos y Metas Alcanzadas.

El objetivo planteado para este proyecto no se logro ya que no existieron

suficientes casos para el estudio, las metas alcanzadas fueron de formación

personal ya que se conocieron y aprendieron métodos y técnicas de laboratorio,

así como la forma de desarrollo en un campo de trabajo.

Resultados

Control de Pacientes

Los lavados bronquioloalveolares (LBA), se obtuvieron de los pacientes

que acuden a la clínica del INER con el objetivo de dejar de fumar. Es

importante aclarar que el estudio incluyó finalmente 10 pacientes que

voluntariamente aceptaron participar en el estudio. Sin embargo, estos fueron

ordenados 4 grupos o categorías, y no en dos grupos como se plane6 al inicio

del estudio. Por lo tanto los grupos finales de pacientes fueron:

Pacientes que dejaron de fumar + NAC 3 pacientes

Pacientes que no dejaron de fumar + NAC 1 paciente

Pacientes que dejaron de fumar + placebo 1 paciente

Pacientes que no dejaron de fumar + placebo 2 pacientes

Cuantificación de la actividad elastolitica de Macrófaaos.

En relación con los resultados obtenidos, en las tablas 1 se muestran

nombres de los pacientes que se integraron al estudio, en la tabla 2

los

se

muestran los resultados de la degradación de elastina en cpm/106 macrófagos,

así como los pg de elastina degradados en el primer lavado. La tabla 3 indica

lo mismo que en la tabla 2 pero para el segundo lavado.

14

En la tabla 4 se sumarizan los resultados de cada uno de los pacientes y

;l\-~~~trpados según el grupo al que pertenecen, tal como se indica en el panel de

derecha.

En los pacientes que dejaron de fumar + NAC (EPOC 2, EPOC 13 y EPOC

I / ) , existe una reducción en la degradación de elastina, el porcentaje para

( ,?da caso varia de l8%, 21% y 26 O/O respectivamente.

En el paciente que no dejó de fumar + NAC (EPOC3), obsen/amos una

Iducc ión de 25%, comparada con su basai.

En el grupo de pacientes que dejaron de fumar + placebo (EPOC 4), SU

l~orcentaje fue de 63%.

En el caso de los pacientes que no dejaron de fumar + placebo (EPOC 5

Y EPOC 12), se eliminó la muestra EPOC 12, ya que la lectura a las 48 hrs era

Illtry alta, lo que podía ser atribuido a un posible error en el procedimiento, en

este caso el porcentaje que se obtuvo de EPOC 5 fue de 53%.

Sumarizando y comparando en sentido estricto los porcentajes obtenidos

(fe cada grupo obtenemos:

1)acientes que dejaron de fumar + NAC 18 - 26 '/o

pacientes que no dejaron de fumar + NAC 25 O/o

pacientes que dejaron de fumar + placebo 63 %Q

pacientes que no dejaron de fumar + placebo 53 O/O

15

Se observa que en todos los pacientes la degradación de elastina

disminuyó, sin que pudiéramos aplicar alguna comparación estadísticas por la

falta de casos en cada uno de los grupos.

Si comparamos entre los grupos de pacientes que dejaron de fumar + NAC y los pacientes que dejaron de fumar + placebo, se podría suponer que el

simple hecho de dejar de fumar reduce de manera drástica la actividad

elastolítica, estamos comparando un promedió de 22% contra 6 3 %.

Considerando los casos donde no dejaron de fumar con y sin NAC

podemos decir que los porcentajes también cambian, en le primer caso (con

NAC) se obtuvo una reducción del 25 O/O y en el caso de placebo su reducción

fue del 53%, por ejemplo es este caso, podríamos decir que el NAC no tiene

ningún efecto sobre la actividad elastolítica sino al contrario ayuda a que no se

degrade elastina, ya que el porcentaje de elastina degradada en el caso de

paciente que continúan fumando sin tratamiento fue mas alta con respecto al

paciente que se le administro NAC, pero claro que estas suposiciones, no tienen

ningún fundamento por ser un solo caso, por lo que no podrirnos asegurar, nada

de lo anterior, quizás se debió simplemente a la fisiología interna del paciente o cualquier otro factor.

Cuando los pacientes dejan de fumar observamos una degradación de

elastina muy alta con respecto a los pacientes que continúan fumando, si

contrastamos los cuatro grupos, veremos que el porcentaje mayor es para las

personas que dejan de fumar y no tienen ningún tipo de tratamiento (63Oh),

por ejemplo si vemos los porcentajes obtenidos de los pacientes que no

dejaron de fumar, y atribuyéramos algún benéfico al NAC sobre la actividad

elastolítica, podemos decir (solo considerando estos casos aislados) que el NAC

no contribuye en nada a este efecto, ya que la lectura de las personas que

continúan fumando y no recibieron ningún tipo de. tratamiento reportan

degradación expresada en porcentaje mayor f53°/o), comparadas con las que

16

recibieron NAC (25%), otra posibilidad para corroborar el efecto de NAC sobre

la reducción de la actividad elastolítica seria el comparar los pacientes sanos no

fumadores con y sin tratamiento.

Prueba de viabilidad de células.

Se realizó una prueba de viabilidad de células, al tefiir con el azul de

tripano. En todos los lavados bronquioloalveolares, en el primer y segundo

caso, el promedio de viabilidad de células fue del 80%.

Tabla l. Pacientes y clave asignada a los LBA de los pacientes que

participaron en este estudio.

Nombre

Laura Elena Cruz Carranza

Silvia Romo Portillo

Isabel Reyes Ramírez

Jorge Gonzáles Torres

Luis A. Espinosa Garcia

Carlos Jiménez Gutiérrez

Javier Gómez Morales

Concepción de la Garza Hernández

Claudio Garcia Sánchez

Avelino Rey Cerro

Expediente

121613

121479

121419

121613

121572 ~~~

120700

123057

122829

123155

104140

Clave Primer LBA LBA

Clave Segundo

EPOC 1

EPOC 8 EPOC 4

EPOC 6 EPOC 3

EPOC 7 EPOC 2

No se realizo

EPOC 5 EPOC 9

EPOC 10 No se realizo I

EPOC 11 EPOC 13

EPOC 12 EPOC 15

EPOC 16

EPOC 18 EPOC 17

No se realizo

17

Tabla 2. Primer lavado bronquioloalveolar (LBA) 24, 48 y 72 horas. Se indican

las cpm y los pg de elastina degradada/106 macrófagos en las células de cada

paciente con su control.

c3 (112) E3 (1,2,3)

c10 (1,2) E10 (1,2) c11 (1,2) Ell (1,2) c12 (1) E12 (1) C16 (1,2) E16 (1,2)

C17 (1,2) E17 (1,2)

138.00, 112.00 319.00, 290.00, 312.00

91.00, 91.00 208.00, 176.00, 134.00

93.00, 92.00 224.00, 310.00, 272.00

58.00 221.00, 294.00

46.00 191.00, 191.00

140.00, 167.00 158.00, 127.00

157.00, 166.00 106.00, 202.00

96.00 119.00 106.00, 72.00 125.00, 133.00

122.00, 129.00 126.00, 118.00

189.00, 116.00, 166.00

40.00, 44.00 115.00, 94.00, 76.00

52.00, 63.00 176.00, 177.00, 168.00

61 157 96 1.40 42 95 S3 0.78

58 173 115 1.7

18

E10 (12) E 1 0 (112) c11 (1,2) Ell (1,2)

c12 (1) E12 (1)

C16 (1,2) E16 (1,2> C17 (1,2) E17 (112)

c10 (1,2) E10 (1,2)

c11 (1,2) Ell (1,2) c12 (1) E12 (1)

C16 (112) E16 (1,2)

C17 (1,2) E17 (1,2)

47.00

75.00, 70.00 73 36 0.5 71.00, 97.00 84

0.5 33 70 70.00, 70.00

75 88.00 , 61.00

186 186.00

119 67 67.00

0.55 38 75 62.00, 87.00

105 103.00, 107.00

0.4 27 64 66.00, 62.00

79 60.00, 98.00

0.9 62 99 116.00, 81.00 37 37.00

1.5 105 152 141.00, 163.00

47

""_

43.00, 46.00 45 126.00, 109.00, 122.00 I I 74 1 .O8

1

49.00, 40.00 45 68.00, 78.00, 53.00 66 7 0.30 64.00, 55.00 60

96.00, 96.00, 96.00 96 36 0.52

36.00 36 90.00, 121.00 106 70 1 .o2

40.00 40 88.00, 61.00 75 35 0.51

36.00, 36.00

36 36.00 , 36.00

60 60.00 0.35 24 36 36.00

0.45 31 67 57.00, 76.00 36 36.00, 36.00

0.57 39 75 76.00, 74.00 36

73.00, 65.00 69 33 0.48

36.00, 36.00 36 49.00, 55.00 52 16 0.23

19

Tabla 3 Segundo Lavado 24, 48 y 72 hrs

C13 (1,2)

E13 (1,2)

C15 (1,2)

E15 (1,2)

C18 (1,2)

E18 (1,2)

C13 (1,2)

E13 (1,2)

C15 (1,2)

E15 (1,2)

C18 (1,2)

E18 (1,2)

46.00 46

129.00, 129.00 129 20 0.36

114.00, 107.00 307

72.00, 106.00 89

219.00, 281.00 250 161 2.35

72.00, 106.00 89

295.00, 273.00 248 195 2.9 I I I

79.00, 79.00 79

104.00, 104.00 25 I 0.36

72.00, 106.00

239.00, 227.00

79.00, 79.00

103.00, 103.00

233 89 1 144

103 79 I 24 1 0.36

37.00 I 37 I 28 I 0.4

58.00, 88.00

78.00, 79.00 73 i 79 6 0.08

61.00, 88.00

122.00, 139.00

61.00, 88.00

116.00, 121.00

74

119 45 0.66

50.00, 50.00

54.00, 54.00

61.00, 88.00

136.00, 116.00

50.00, 50.00

65.00, 65.00

50

54 0.05 4

89 I 233 1 144 I 2.1

65 0.21 15

20

52.00

40.00

67.00, 65.00 66

86.00, 52.00 69 3 0.04 74.00, 86.00 80

67.00, 96.00 81.5 1.5 0.021

74.00, 86.00 80

89.00, 89.00 89 9 0.13 45.00, 45.00 45

51.00, 51.00 51 3 0.04

: : ~ ~ ~ , 8 ~ ~ O o O 0 1 1:s 1 3:5 1 45.00, 45.00

54.00, 54.00

Tabla 4. Degradación de 3H-elastina por 1 x106 macrófagos pulmonares

obtenidos de lavado bronquioloalveolar en sujetos tratados con y sin NAC, con

y sin haber dejado de fumar. En el panel de la derecha se indica a cual grupo

pertenece cada sujeto.

.. , .

21

Tabla 4.

l 4 2.9 ¡ 1.5 1.02 2.35 ~ 0.83 0.21 8 ~

No dejo de fumar I + NAC

P9 P9 I totales I 5.42 I totales I 3.39 I I

12 0.44 1 * 1 0.35

P9 PS

15 I 2.1 1.75 I 0.48 Placebo I

1 No dejo de fuma +

totales 4.33 totales 0.79 r l

10 0.80 1 0.4 I 0.57 --- I No determinado

22

Discusión

Para el des:-:. : d e este trabajo, inicialmente se planeó un protocolo en

el que hubiera 1 ;-UPOS de estudio, constituidos por pacientes que

voluntariamente pe-"- :teran se les practicara dos LBA, uno al inició del estudio

y otro a las c u a a - ~ sernanas. Estos individuos integrarían dos grupos de

estudio: el primew cJnstituido por pacientes fumadores activos, los cuales

deberían dejar d e &-Tlar y se les administraría tratamiento 1,800 mg de

NAC/día, admin i s t raws en 3 dosis de 600 mg cada 8 horas, durante cuatro

semanas; el otro a n l r ~ estaría constituido por sujetos que solamente dejarían

de fumar y serviria con10 un control para el primer grupo. Sin embargo existió

un par de variables ~ ~ l e no pensamos inicialmente pudieran tomar relevancia

durante el desarrollo d i r t 1 estudio, y esto debido al hecho de ser intrínsecas a los sujetos Y a S u libertad de elección para participar o no en un estudio

biomédico como el que estamos comentando. Estas dos variables fueron, que

algunos de 10s scljetos no aceptaron se les practicara el segundo LBA,

posiblemente Por Corlsiderarlo drástico ó riesgoso a su integridad física; La

segunda variable fue que ciertos pacientes reiniciaron el habito de fumar. Esto

dio como resultado el vernos en la necesidad de integrar cuatro grupos finales

de estudio, en 10s que además no fue posible incrementar el numero de casos,

de ta l Suerte que no se pudo hacer comparaciones estadísticas entre los diferentes grUPOS, que ya en sección de resultados se mencionaron.

Si se analizan los resultados tal cual se observan el la tabla 4, que el hecho dejar de fumar, es suficiente para que se disminuya la elastolisis. Sin

embargo, no podemos saber con este estudio si el uso del NAC conlleva a un

efecto que exacerbe este beneficio; Y desafortunadamente no existe algún

trabajo realizado en pacientes (in vivo) al CUE/ podamos hacer referencia para

comparar nuestros resultados. De manera que nuestro estudio no pudo llegar

corroborar O rechazar el objetivo inicialmente planteado; esto es sin conocer sí el NAC tiene un efecto coadyuvante para disminuir el efecto de dejar de fumar

23

en la elastolisis y posiblemente en frenar el efecto altamente oxidativo inducido

por el humo de cigarro, tal como se ha demostrado con diversos fenómenos a

nivel celular in vitro en diversos análisis en los que sí protege del daño

oxidativo.

Conclusión.

Podríamos especular un poco con los resultados obtenidos, ya que por !o pequeño de la muestra no podemos ser conc!uyentes de manera objetiva, por

ejemplo si comparamos ¡os cuatro casos, observamos que se presenta una

reducción en la actividad elastolítica de macróhgos pulmonares administrando

o no el medicamento.

Por las razones expuestas en los resultados podríamos decir que en los casos aquí planteados el NAC no tiene efectg alguno en la reducción de la

actividad elastolítica y que el simple hecho de dejar de fumar reduce esta

actividad, pero debe de quedar claro que es& aseveraciones no pueden ser

consideradas totalmente ciertas, ya que el grupo estudiado es muy pequeño,

para realizar pruebas estadísticas que corroboren lo antes mencionado.

Podemos considerar por las experienaas al realizar el presente, la

posibilidad de montar este estudio en un moddo animal asegurando el total de

casos para obtener resultados concluyentes de manera certera.

24

Criterios de Evaluación.

Para evaluar el presente trabajo fue necesario considerar la realización de

toda la metodología, independientemente de los casos estudiados.

Para la evaluación del Servicio Social prestado por el alumno al Instituto

Nacional de Enfermedades Respiratorias (INER), Laboratorio de Fibrosis

pulmonar, se considero el entusiasmo, desempeño y actitud por aprender

manifestado y realizado por el alumno, por los casos expuestos anteriormente

el alumno completo el tiempo reglamentado para servicio social establecido por

la Universidad Autónoma Metropolitana, con trabajo extra proyecto, tal es el

caso, con la ayuda en montaje de técnicas y modelos de experimentación,

aprendizaje de técnicas aplicadas en el estudio de fibrosis pulmonar, extracción

de muestras de DNA de sangre humana, entre otras actividades, por lo tanto

se considera el desarrollo del Servicio Social de manera altamente satisfactoria

cumpliendo con las expectativas iniciales.

25

Evaluación del Alumno

La estudiante Alejandra Hernández Pérez desarrolló un trabajo bastante

amplio desde la recepción de los lavados bronquioloalveolares (LBA), hasta la

elaboración del presente. La calidad del trabajo desarrollado fue altamente

satisfactoria por el grado de compromiso y responsabilidad que ella dedicó a su

realización. Además de desarrollar todos los aspectos contenidos en este

trabajo, ella proceso de manera primordial alrededor de 200 muestras de

sangre humana (cifra que es alta), para obtener el DNA genómico que

posteriormente se utilizo para identificar las frecuencias alélicas en relación con

el sistema HLA, en pacientes con EPOC, derivadas de fibrosis pulmonar

idiopática y de sujetos normales, entre otras actividades propias de este

laboratorio

Por lo tanto su trabajo fue altamente comprometido, responsable,

satisfactorio y desarrollado con una actitud muy positiva durante el 100 O/O del

tiempo que ella le dedicó. Podría decir que rebasó con mucho las expectativas

iniciales con su desempeño.

26

Bibliografía

l. ATS Statement. Standard for the diagnosis and care on patients with

chronic obstructive pulmonary disease. Am. J. Respir. Crit. Care Med.

1985; 152 (s~pl .) :S77-S121.

2. Siafakas, N. M . , P. Vermeire, N. B. Pride, P, Paoletii, J. Gibson, P. Howar,

J.C. Yernault, M. DeCramer, T. Higgenbottom. D. S. Postma, and J. Rees.

Optimal assement and management of chronic obstructive pulmonary

disease (COPD): a consensus statement of European Respiratory Society

(ERS): Eur. Respir. J. 1995; 8:1398-1420. 3 . Snider GL, Lucey EC, Stone P.J. Animal models of emphysema. Am. Rev.

Respir. Dis. 1986;133: 149-164.

4. Eriksson S. Emphysema before and after 1963. Historic perspectives. Ann

N y Acad. Sci. 1991; 624:l-6.

5. Snider, G.F.L., Kleinerman, J . Thurlbeck, W.M., Bengali, Z.H. The definition

of emphysema Resport of a National Heasrt, Lung, and Blood Institute,

Division of Lung Diseases Workshop. Am. Rev. Respir. Dis. 19851; 32.

6. Snider, G.L. Chronic obstructive pulmonary disease: risk factors,

patophisiology, and pathogenesis, Ann. Rev. Med. 1989; 40:411-429.

7. Peto, R.,A.D. Lopez, J . Boreham, M. Thun, and C. Hatch. Mortality from

tobacco in developed countries: Indirect estimation from national vital

statistics. Lancet 1992; 339: 1268-1278.

8. Jennings A. Constance; Cristal G. Ronald.. Inflammatory Lung Disease,

Molecular Determinants of Emphysema, Bronchitis, and Fibrosis. Chapter

SO, In: Imflammation Basic Principles and Clinical Correlates Second

edition. Edted by 1 .1 . Gallin, I.M. Goldstein and R. Snyderman. New York.

1992;983-994.

9. Hubbard RC, Crystal RG. Vulnerability of the lung to proteolytic injury. In

Crystal RG. West 38, et al. eds. The lung, Vol. 11. New York, Raven Press,

Ltd, 1991:2059-2071.

27

10. Janoff A, Pryor AW, Bengali HZ. Effects of tobacco smoke components on

cellular and biochemical processes in the lung. Workshop Summary

Maryland May 1986; 1058-1064.

11 . Starcher BC. Elastin and the lung, Thorax 1986;41-577

12. Snider GL. Ciccolella DE., Morris SM, et al. Putative role of neutrophil

elastase in the patogénesis eon enphysema Ann N y Acad Sci.

1991;624:45-59.

13. Senior M. Roberth; Kunh I11 Charles. The Pathogenesis of emphysema.

Chapter 74, In: Pulmonary Diseases and Disorders. Fishman P. Alfred.

Second edition, V01.2: 1208-1218.

14. Higgins M. Risk Factors associated with chronic obstructive lung disease.

Ann N y Acad. Sci. 1991; 624:7-17.

15. Chapman, H. G., And O.L. Stone. Comparison of human neutrophil and

alveolar macrophages elastolytic activity in vitro: relative resistance of

macrophages elastolyitic to serum and alveolar proteinase inhibitors. J. Clin. Invest. 1984; 74: 1693-1700.

16. Senior, R.M.N.L., Connelly, J. D. Cury, et al. Elastin degradation by human

alveolar macrophages: a prominent role o f metalloproteinase inhib.itors.

Am. Rev. Respir. Dis. 1989; 139:1251-1256.

17. Parks WC. Deak SB. Tropoelastin heterogeneity: Implications for protein

function and disease. Am. J. Respi. Cell. Moll. Biol. 1990; 2:399-406.

18. Mechan RP. Elastin synthesis and fiber assembly. Ann N y Acad, Sci. 1991;

624: 137-146.

19. Lasing AI. Rosenthal TB, Alex M. Demsey EW. The structure and chemical

characterization of elastic fiber as revealed by elastase and electron

microscopy. Anat. Rec. 1952; 114: 55-57.

20. Traver, GA, Cline MG, and Burrows B. Predictors of mortality in chronic

obstructive pulmonary disease. Am. Rev. Respir. Dis. 1979; 119:895.

21. Gadek, J.E., and €.R. Pacht.. The portease-antiprotease balance within

the human lung: implications for the pathogenesis of emphysema.

1968.Lung 168 (suppl):30-42

28

22. Hubbard, R.C., and R.G. Crystal.. Abtiproteasas and antioxidants:

strategies for the pharmacologic prevention of lung destruction.

Respiration. 1986; SO(Suppl): 56-73.

23. LaureII, C .B . , and S. Ericksson. The electrophoretic alpha-lglobulin patten

of serum in alpha-lantitrypsin deficiency. Sacnd J. Clin. Lab. Invest. 1963;

15: 132-140.

24. Sinder GL, Lucey EC, and Stone PJ. Animals models of emphysema. Am.

Rev. Respir. Dis. 1986; 133:149-469.

25. Stockle, R.A., And K. Ohlsson. Serum studies of leucocyte elastase

acute and chronic lung disase. Thorax 1982; 37:114-117

26. Rao NV, Wehner NG, Marshall BC, et al. Proteinase-3 (Pr-3):

polymorphonucler leukocyte serine proteinase. Ann N.Y. Acad. Sci. 199

624160-68.

in

a

11 ;

27. Janoff A, Raju L, Dearing R. Levels of elastase activity in bronchoalveolar

lavage fluds of healthy smokers an nonsmokers. Am. Rev. Respir. Dis.

1983; 127:540-544

28. Niderman MS, Fritts LL, Meriil WW, et al. Demonstration of a free

elastolytic metalloenzyme in human lung lavage fluid and its ralation to

alpha-1-antiprotease. Am. Rev. Respir. Dis. 1984; 129:943-947.

29. Abboud RT, Anwuli FO, Sansores RH, and Muller NL. Relationship of

alveolar macrophage plasminogen activator and elastase activities to lung

function and CT evidence on emphysema. Chest 1998; 113:1257-1263.

30. Eriksson S. Pulmonary emphysema and al-antitrypsin deficiency. Acta

med. Sacand. 1964; 175;197-205.

31. Sansores, M. R., M.P. Cordoba, M. Espinosa, L. Herrera, A. Ramírez, A.

Martinez, y J. Villalba. Evaluación del programa cognitivo conductual para

dejar de fumar del Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias. Rev.

Inst. Nal. Enf. Resp. Mex. 1998; 11(1):29-35.

32. Rahman Q, Abidi P, Afaq F, Schiffmann O, ossman BT, Kamp DW, Athar

M. Glutathione redox system in oxidative lung injury. Crit Rev Toxicol 1999

N0~;29(6):543-68).

29

33. Cotgreave I A . N-acetylcysteine: pharmacological considerations and

experimental and clinical applications.Adv Pharmacol 1997;38: 205-27).

30