Practico de Laboratorio determinacin de salmonella en alimentos

Practico de Laboratorio determinacin de salmonella en alimentos

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Introduccin:De acuerdo con el reglamento sanitario de los alimentos la sola presencia de Salmonella en un alimento es considerada como causa de rechazo.El fundamento del mtodo para la deteccin en alimentos se basa en que la presencia deSalmonella est en menor nmero que el de la flora acompaante especialmente en alimentos sin tratamiento previo como lo es el alimento a ser analizado (carne molida cruda) En este laboratorio los mtodos realizados fueron convencionales para su recuperacin consideran todos estos factores permitiendo recuperar Salmonella mediante procesos de pre enriquecimiento y enriquecimiento en las etapas preliminares y posterior siembra en agares selectivos, realizacin de pruebas bioqumicas para su comprobacin.

Objetivo general: El presente procedimiento tiene como objetivo describir la metodologa llevada a cabo por el Laboratorio de Microbiologa para realizar la deteccin, aislamiento e identificacin de Salmonella spp. En muestras de alimento carne molida de la carnicera ubicada en sector de franke llamada el rancho de don mati

Objetivos especficos: Realizar la deteccin, aislamiento e identificacin de Salmonella spp. En muestras de alimentos. Con distintas tcnicas Realizar tcnica de pre enriquecimiento no selectivo en caldo Realizar tcnica de enriquecimiento selectivo en caldo Realizar aislamiento en agar selectivo Realizar tcnicas bio qumicas para la La confirmacin de Salmonella spp.

Marco terico

Familia Enterobacteriaceae. Aunque los miembros de este gnero son capaces de moverse por medio de flagelos pertricos, existen variantes no mviles, S. enterica serovar Pullorum y S. enterica serovar Gallinarum, as como cepas no mviles debido a la presencia de flagelos disfuncionales. Las especies de Salmonella son quimio organtrofas, con habilidad para metabolizar nutrientes por las vas fermentativa y respiratoria. Las bacterias crecen ptimamente a 37C y pueden catabolizar la D-glucosa y otros carbohidratos con produccin de cido y gas. Estos microorganismos son oxidasa negativos y catalasa negativos, crecen en citrato como nica fuente de carbono, generalmente producen cido sulfhdrico, descarboxilan la lisina y ornitina, y no hidrolizan la urea. La mayora de estas caractersticas se utilizan para la identificacin bioqumica de cepas aisladas de Salmonella.

De acuerdo con la definicin contempornea, una cepa de Salmonella tpica produce cido y gas a partir de la glucosa en el agar hierro tres azcares, pero no es capaz de utilizar lactosa y sacarosa en ste medio, o en medios slidos selectivos tales como verde brillante, xilosa lisina desoxicolato y/o entrico de Hekten. Las especies tpicas de Salmonella producen en agar hierro lisina, una rpida reaccin alcalina por la descarboxilacin de la lisina y generan cadaverina. La variabilidad gentica observada en este microorganismo ha originado mutaciones, e intercambio intra e intergenrico de plsmidos lo cual ha reducido los biotipos tpicos de Salmonella. En muestras clnicas y de alimentos se han encontrado biotipos lac+ y/o sac+; biotipos que no descarboxilan la lisina, que incluso hidrolizan la urea, que producen indol y que crecen rpidamente en KCN. Esta situacin ha llevado a reevaluar el esquema de identificacin del gnero, e especies

La dosis infectiva en humanos flucta entre 1 a 10 clulas. La composicin qumica del alimento es otro factor determinante en la salmonelosis adems de la heterogeneidad inmunolgica en la poblacin humana y la virulencia de las cepas infectivas. Un denominador comn de los alimentos involucrados, es la presencia de un alto contenido de grasa en alimentos como el chocolate, el queso y la carne. Se ha sugerido que las clulas de Salmonella englobadas en las micelas lipdicas pueden resistir el efecto ltico de los cidos gstricos. Las infecciones por Salmonella en humanos pueden originar varias condiciones clnicas, incluyendo fiebre entrica (tifoidea), enterocolitis e infecciones sistmicas por microorganismos no tifoides. La fiebre entrica es una infeccin grave asociada con las cepas tifoidea y paratifoidea, las cuales estn particularmente bien adaptadas para invadir y sobrevivir en los tejidos del husped. Las manifestaciones clnicas de la fiebre entrica aparecen despus de un periodo de incubacin de 7 a 28 das y pueden incluir diarrea, fiebre prolongada con variaciones en la misma, dolor abdominal, dolor de cabeza, y debilitamiento. El diagnstico de la enfermedad radica en la deteccin del agente infectivo en etapas tempranas en la sangre o en heces al inicio de la sintomatologa clnica. El tratamiento incluye el uso de cloramfenicol, ampicilina, o trimetroprim con sulfametoxasol para eliminar la infeccin sistmica. En pases subdesarrollados como el nuestro, el uso indiscriminado de estos antibiticos ha originado la existencia de cepas resistentes que causan altas tasas de mortalidad cuando se presenta un brote de este tipo. La infeccin en humanos con Salmonella spp. no tifoide provoca enterocolitis, sta aparece de 8 a 72 h despus de tener contacto con el patgeno invasivo. La condicin clnica es auto limitante y la evacuacin de heces tpicas diarreicas no sanguinolentas y dolor abdominal se presentan a los 5 das. El tratamiento solo implica reemplazo de fluidos o electrolitos. El uso de antibiticos est contraindicado ya que prolonga la sobrevivencia y la excrecin intermitente del microorganismo.

Fundamento La presente tcnica para la deteccin de Salmonella en alimentos, describe un esquema general que consiste de 5 pasos bsicos: Pre enriquecimiento, es el paso en donde la muestra es enriquecida en un medio nutritivo no selectivo, que permite restaurar las clulas de Salmonella daadas, logrando de esta manera una condicin fisiolgica estable. Enriquecimiento selectivo, se logra a partir de un medio de cultivo que conjunte dos condiciones, por un lado debe incrementar las poblaciones de Salmonella y por otro inhibir otros microorganismos presentes en la muestra. Seleccin en medios slidos, este punto se deriva directamente del anterior y se utilizan medios selectivos, que restringen el crecimiento de otros gneros diferentes a Salmonella y que permitan el reconocimiento visual caracterstico de colonias sospechosas. Identificacin bioqumica, este paso permite la identificacin genrica de los cultivos de Salmonella y la eliminacin de cultivos sospechosos falsos.

I. Procedimiento de laboratorio Materiales 1Balanza 1Vortex Placas petri estrilPipetas de 1 y5 ml estriles1Asa Tubos de ensayo con tapa rosca y estriles 1 frasco shott 500 ml estrilEstufa de incubacin a 35cy 42c Medios de cultivos a ser utilizados Agua peptonada tamponada PH =7,2Caldo rappaport vassiliadis( CRV)Caldo selenito cistina (CSC) Agar xilosa lisina-desoxicolato (XLD)Agar salmonella -shigella (SS)Agar TSIAgar LIA

II. Preparacin de la muestra 1 paso.- pre enriquecimiento no selectivo Se procede a pesar 25g de la muestra y homogenizamos con 225 ml de agua peptonada tamponada lo cual quiere decir que tiene PH 7,2 Homogenizamos la muestra para que se mescle con el agua y luego se incuba por 18 a 24 horas a temperatura de 35c

2 paso.- enriquecimiento selectivo La muestra se toma del la estufa de incubacin y se agita suavemente se trasfiere 1ml a 10 ml de caldo selenito cistina se incuba a temperatura de 35c por 24horas etiquetando el tubo de ensayo Se toma otro tubo de ensayo estril y se le agrega 0,1ml de la muestra en 10ml de caldo rappaport vassiliadis se etiqueta y se incuba por 24 horas a t de 42c

Caldo rappaport

Caldo selenito cistina

3 paso.- Aislamiento en agar selectivo

Observamos los tubos de ensayo y procedemos a agitar para luego aislar en agar

Caldo rappaport se observa como el color azul se redujo en presencia de bacterias Caldo selenito cistina esta de color medio rojo y turbio se procede a realizar las siembras en los agares XLD y SS

3 Paso.- aislamiento en agar selectivo

Agar ___________ salmonella shigella SS CSC Se aslan en placas en siembra en superficie CRV Agotando el inoculo Resultado: Colonias trasparentes u opacas con o sin centro oscuro

Agar ________ xilosa- lisina desoxicolato (XLD ) CSC CRVResultado: Colonias trasparentes con o sin centro oscuro Se incuban por 24 a 48 horas a t de 35c las placas

4 paso.-Pruebas bio qumicas Se selecciona colonias sospechosas de cada una de las placas de los agares selectivos Se procede a inocular cada una de las colonias en los agares en tubos TSI y agar LIA tocando suavemente el centro de las colonias identificada con el asa en punta y se inocula el tubo en profundidad y en superficie sin flamear se inocula el tubo con agar LIA pinchando dos veces en profundidad y a ser las estras en superficie Se procede a incubar por los medios a tde 35c por 48horas Interpretacin de las pruebas bio qumicas y resultados AGAR TSI AGAR LIA

MICRO ORGANISMO

TSIGASH2SLIAGASH2S Salmonella

A/AA/A +++-K/KA/K++++Salmonella sppSalmonella spp

Agar TSI inoculado con colonia del agar SS interpretacin A/A Produccin de gas por desplazamiento del medio y negativo en H2S Agar LIA inoculado con colonia del agar SS resultado K/K Purpura sobre purpura con produccin de H2S y gas porque se produce ruptura y desplazamiento del medio

Agar TSI que fue inoculado del agar XLD el medio queda total mente negro dando A/A positivo en H2S y positivo en produccin de gas por desplazamiento del medio Agar LIA inoculado de las colonias del agar XLD queda fondo negro y superficie amarilla A/K dando positivo en produccin de H2S y ruptura del medio producto del gas

Conclusin de los resultados Las pruebas dan positivas se encuentran salmonella .las mayoras de las especies de salmonella dan reacciones positivas indicando produccin de gas y tambin algunas cepas de salmonella tpicas dan fondo amarillo con o sin produccin de H2S en negreciendo el medio Interpretacin:Las cepas de Salmonella tpica producen:En TSI: y fondo cido (amarillo) con o sinProduccin de H2S (ennegrecimiento del agar)En LIA: La mayora de los cultivos de Salmonella producen H2S en LIA. Algunos cultivos que no son Salmonella producen un color rojo ladrillo en LIA.Deben ser retenidos para confirmacin bioqumica y serolgica los cultivos que dan: Fondo alcalino (violeta) en LIA sin importar la reaccin en TSI cido (amarillo) en TSI.Descartar como no Salmonella los cultivos que dan fondo cido en LIA y picde flauta y fondo cidos en TSI.

Conclusin:

En este practico quedo clara mente al descubierto que el proceso de manipulacin y de conservacin no se toma en cuenta en el local de venta de la muestra analizada comprada en la carnicera del sector de franque Muchos de los alimentos que se llevan a la mesa pueden estar contaminados y ser un riesgo para nuestra salud y para la de nuestras familias, por esta razn, es indispensable que se lleven a cabo por las entidades correspondientes como lo es el servicio de salud las fiscalizaciones as estos locales y realicen los anlisis correspondiente a estos locales de alimentos realicen anlisis microbiolgicos a la mercanca como lo es la carne en especial la carne molida El anlisis microbiolgico no mejora la calidad del alimento, sino que permite valorar la carga microbiana, sealando los posibles puntos de riesgo de contaminacin o multiplicacin microbiana, para Muchos de los alimentos no pasan por un anlisis microbiolgico por lo que se convierten en un riesgo para la salud, debido a que pueden ocasionar enfermedades como, Salmonella y (Staphilococcus aureus) entre otras.

Bibliografa:http://www.fao.org/ag/agn/agns/jemra_riskassessment_ecoli_es.ashttp://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Pagogenosnorm.Salmonella_17364.pdfhttp://solutions.3m.com.pe/3MContentRetrievalAPI/BlobServlet?lmd=1365689968000&locale=es_PE&assetType=MMM_Image&assetId=1361583924433&blobAttribute=ImageFile

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