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DETERMINACION DE LA MICROFLORA BACTERIANA UTERINA EN

VACAS DONANTES DE EMBRIONES

DIANA CAROLINA MÉNDEZ LEAL

TRABAJO DE GRADOPresentado como requisito parcial

Para optar al titulo de

MICROBIÓLOGA AGRÍCOLA Y VETERINARIA

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANAFACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS

CARRERA DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA Y VETERINARIABogotá D.C

31 DE JULIO 2008

DETERMINACIÓN DE LA MICROFLORA BACTERIANA UTERINA EN



----------------------------------------------- Dr. INGRID SCHULER PHdDecana académico Facultad de Ciencias

-------------------------------------------------- Dra. JANETH DEL CARMEN ARIAS MScDirectora de la carrera de Microbiología



31 DE JULIO, 2008




--------------------------------- ---------------------------------AGUSTÍN GÓNGORA ORJUELA LUZ ADIELA GÓMEZ LEAL DIRECTOR CODIRECTOR

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS


31 DE JULIO, 2008




--------------------------- ------------------------------Dr. MIGUEL ANGEL PEÑA Dr. GUSTAVO ARBELAEZ JURADO JURADO



31 DE JULIO, 2008

NOTA DE ADVERTENCIA

Articulo 23 de la resolución N0 13 de Julio de 1946 “La universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por los alumnos en sus tesis de grado”

DEDICATORIA

Me corresponde por amor a la verdad y a la fraternidad dejar constancia a manera de impronta de la incapacidad de asumir este compromiso profesional, familiar y social sin esas ansias de vuelos compartidos que permitieron itinerarios para consolidar los sueños.

A ellos que con su mirada permanente y su apoyo decidido me brindaron la posibilidad de trascender humana y profesionalmente.

A ella, Rosa Ana Leal Mendoza mi madre, que pensativa y perpleja pero también orgullosa de mis logros, me acompañó con sus plegarias al cielo para que mis ideales se hicieran realidad y pudiera terminar las primeras etapas del camino.

A él, a Luis Alejandro Méndez Castro por su espíritu de solidaridad y por sus consejos de padre bueno que me impulsaron a vislumbrar ese acto infinito del conocimiento universal.

Al doctor Agustín Góngora director de tesis por su capacidad en la creación de métodos educativos que me permitieron confrontar diferentes tipos de alteridad para lograr ese discurso pedagógico que posibilita nuevos hallazgos constructivos en pos de la verdad científica.

A ese grupo de profesionales que no tenían respuestas para todas mis dudas y temores, pero compartieron mis alegrías y tristezas,Me ofrecieron sus conocimientos y sus manos para sujetarme y no caer. Luz Adíela Gómez leal, Carlos Jairo Gómez, Andrés Torres, Manuel Martínez.

Tengo que dejar plasmado un abrazo y un beso enorme para mis cómplices de cuarto………..Liliana y Alexandra.

TABLA DE CONTENIDO

Pág.

OBJETIVOS 12

INTRODUCCION 13

JUSTIFICACION 14

1. MARCO TEORICO 15

1.1 Reproducción de la vaca 15

1.1.1 Ciclo estral 15

1.1.1.1 Fase folicular 15

1.1.1.2. proestro 15

1.1.1.2 estro – metaestro 16

1.1.1.3 diestro 17

1.1.1.4 Dinámica folicular bovina 17

1.1.1.5 Reclutamiento 17

1.1.1.6 Selección 17

1.1.1.7 Dominancia 17

1.2 Generalidades de la transferencia de embriones 18

1.3 inmunidad y estado sanitario del útero 20

1.4. Generalidades de las cepas bacterianas 21

1.4.1 Bacterias Gram positivas 21

1.4.2 Bacterias Gram negativas 21

1.4.3 Bacilos esporulados 22

2. MATERIALES Y METODOS 23

2.1 Animales experimentales y toma de muestra 23

2.2 Protocolo de superovulación de las vacas donantes 23

2.3 Obtención de los embriones y toma de muestra para cultivo 24

2.4 Identificación y clasificación de colonias 24

2.5 Análisis estadístico 25

3. RESULTADOS 26

4. DISCUSION 36

5. CONCLUSIONES 41

6. RECOMENDACIONES 42

BIBLIOGRAFIA 43

ANEXOS 50

INDICE DE TABLAS Pág.

• TABLA 1. Métodos para la determinación de la especie de microorganismo 25

• TABLA 2. Resultados obtenidos en las pruebas de identificación de bacterias gram

negativas entéricas en medios selectivos, obtenidos en los lavados uterinos de vacas donantes de embriones 26

• TABLA 3. Resultados en las pruebas de identificación de bacterias gram negativas

en medios selectivos, partiendo de los lavados uterinos de vacas donantes de embriones 27

• TABLA 4. Resultados en las pruebas de identificación de bacterias gram positivos,

en medios selectivos, a partir de los lavados uterinos de vacas donantes de embriones 28

• TABLA 5. Resultados en las pruebas de identificación de bacterias gram positivos,

en medios selectivos, partiendo de los lavados uterinos de vacas donantes de embriones 29

• TABLA 6. Clasificación general de las bacterias patógenas reconocidas, aisladas en

los lavados uterinos de vacas donantes de embriones. 30

• TABLA 7. Microflora uterina aislada de vacas donantes de embriones, de acuerdo

con la especie. 31

• TABLA 8. Categorización de bacterias, aislados de muestra útero. (William et al,

2007) 32

• TABLA 9. Descripción general por finca, edad, número de partos y número de

lavados de las vacas donantes de embriones muestreadas. 35

INDICE DE FIGURASPág.

• FIGURA 1. Protocolo de superovulacion en vacas donantes de embriones. El

tratamiento consiste en la inserción de un dispositivo liberador de progesterona conjuntamente a la administración de Benzoato de estradiol (BE) y progesterona (P4) en el día 0 (Promedio), con inicio del tratamiento súper ovulatorio en el día 4 (P), aplicación de PGF en el día 6 (P), remoción del dispositivo en el día 7 (P), aplicación de GnRH o LH en el día 8 (P), seguido de inseminación artificial en tiempo fijo 12 y 24 horas después del GnRH. El estro no se observa y la recolección de los embriones se hace en el día 15. 23

• FIGURA 2. Determinación del número de bacterias presentes en cada lavado uterino

de vacas donantes de embriones. 33

• FIGURA 3. Descripcion de la edad y numero de lavados uterinos a nivel individual

realizados en las vacas donantes de embriones objeto de estudio 34

• FIGURA 4. Preparación del técnico momentos previos a la evaluación de la

respuesta superovulatoria.

50

• FIGURA 5. Evaluación de la respuesta superovulatoria mediante palpación rectal,

momentos antes del lavado uterino. 50

• FIGURA 6. Preparación de la vaca donante la realización del lavado de embriónes. 51

• FIGURA 7. Lavado y desinfección de la región posterior de vacas donantes de

embriones, previo a la obtención de los embriones y toma de muestras para cultivo. 51

• FIGURA 8. Pasaje del catéter de Foley a través del cuello uterino y su ubicación en la

parte craneal del cuerno uterino. 51

• FIGURA 9. Inicio del lavado uterino con solución de lactato de Ringer más 5% de

Suero Fetal Bovino y recolección de los embriones en un filtro Millipore de 75 µ. 51

• FIGURA 10. Toma de muestra del lavado uterino y la inoculación en medio de

transporte BHI. 52

RESUMEN

Se determino mediante cultivo la presencia bacteriana uterina en 21 vacas donantes de embriones

de las razas, Jersey, Brahmán y Sanmartinero de 6 fincas de los municipios de Villavicencio,

Cumaral y Paratebueno que desarrollan programas de transferencia de embriones.

Las muestras para cultivo se obtuvieron al día 7 postinseminacion a partir de las primeras muestras

del lavado uterino realizado por vía transcervical y transportadas en medio BHI hasta el laboratorio

de microbiología animal de la Universidad de los Llanos. En las muestras en que observó

crecimiento bacteriano, fueron sembradas por triplicado en cajas de petri en agar nutritivo, agar

Mac Conkey y agar sangre y llevadas a incubar a 37°C por 24 horas.

Se realizo frotis con coloración de gram y clasificadas las bacterias de acuerdo con Vadillo, 1980 y

Díaz y col., 1999.

A los cultivos gram positivos se realizó repiques en medio salado de manitol y medio XLD, se

realizó además pruebas de catalasa. Contrariamente las gram negativas se les hizo repique en

medio EMB y SS y pruebas de oxidasa. Para bacterias gram positivas, adicionalmente se realizó

la prueba de coagulasa.

En todas las vacas se aislaron microorganismos potencialmente patógenos, saprofíticos y otros

que se ha demostrado ser patógenos. Es posible que en no todos los casos la microflora aislada

pudiera haber provenido del útero, sino por contaminación externa especialmente de las heces

dadas las condiciones en que se realiza el lavado uterino, el cual a pesar de contar con todas las

medidas de asepsia puede presentarse contaminación.

Se ha demostrado por otros estudio que al menos un 10-17% de las vacas pueden presentar

infección uterina patógena después de la 5 semana posparto, sin que se conozca en mayor detalle

los efectos directos que pudiera tener sobre los embriones, aunque se reconocen los efectos

indirectos ya sea por la liberación de mediadores de la respuesta inflamatoria o sobre otros

órganos como el cuerpo lúteo, por tanto se requiere mayores estudios.

Se hace necesario seguir estrictamente los protocolos sanitarios recomendados por la sociedad de

transferencia de embriones para evitar la difusión de microorganismos a las receptoras las cuales

pudieran inducir infección uterina y conllevar a muerte embrionaria.



GENERALES

• Determinar la microflora bacteriana en vacas donantes de embriones en fincas que

desarrollan programas de transferencia embrionaria.

ESPECIFICOS

• Aislar e identificar las principales bacterias encontradas en lavados uterinos de vacas

donantes de embriones.

• Contrastar los resultados obtenidos con la información existente a nivel nacional e

internacional sobre infecciones uterinas posparto.

• Generar información útil que permita a los médicos veterinarios especialistas en

transferencia de embriones aumentar los niveles de eficiencia de la técnica.

INTRODUCCION

La transferencia de embriones comenzó a ser utilizada en trabajos experimentales en 1950 y para

los años 64 la técnica se fue mejorando y se produjo el nacimiento del primer ternero; en las

últimas décadas los porcentajes de preñez se han incrementado considerablemente, es el caso de

Brasil que es pionero y produce anualmente 60.000 embriones.

Una de las alternativas que se ha utilizado para la conservación de recursos genéticos es la

transferencia de embriones, donde el riesgo de transmisión de agentes infecciosos es menor al que

ocurre por servicio natural, aunque no se descarta que la presencia de agentes infecciosos en el

útero de la donante, puedan ser transmitidos a la receptora, causando subsecuentes infecciones

que conllevarían a la perdida del embrión.

Debido a que el periodo después de la transferencia del embrión, requiere un útero normal con una

población bacteriana mínima que en general no causa ningún efecto colateral en el embrión ni en

la receptora, pero bajo efectos adversos, como son retención de placenta, distocias generan

factores que ayudan al desarrollo de infecciones uterinas.

Por tal motivo, el poder conocer los principales agentes bacterianos a nivel uterino, contribuiría a

entender las muertes embrionarias sin causa aparente, cambios fisiológicos y comportamentales

del animal, permitiendo una mayor eficiencia de la técnica de Transferencia de Embriones y por

ende desde el punto de vista productivo un mayor número de terneros al nacimiento y mayores

ganancias de la empresa ganadera, razones que justificaron la realización del presente estudio.

JUSTIFICACIÓN

El poder conocer los principales agentes bacterianos a nivel uterino, contribuiría a entender las

muertes embrionarias sin causa infecciosa aparente, permitiendo una mayor eficiencia de la

técnica de Transferencia de Embriones y por ende desde el punto de vista productivo un mayor

número de terneros al nacimiento y mayores ganancias de la empresa ganadera, razones que

justificaron la realización del presente estudio.

La biotecnología reproductiva se ha constituido en una herramienta importante dentro de los

sistemas de producción animal, hoy día se transfieren a nivel mundial mas de 600.000 embriones

al año ya sea producidos por superovulación o por la técnica de fertilización in vitro. A pesar de

que la técnica de transferencia de embriones se ha popularizado y simplificado, aun existen

muchos factores que inciden para lograr obtener mayores tasas de fertilidad. (Montaldo, 1993)

Dentro de estos factores el estado sanitario de la vaca donante juega un papel especial,

principalmente el relacionado con la salud uterina. De otro lado la Transferencia de Embriones se

ha propuesto como una herramienta importante para la conservación de los recursos genéticos

criollos colombianos, lo cuales según la FAO enfrentan una seria amenaza de extinción.

(Velásquez, 1999)

El riesgo de transmisión de agentes infecciosos a través de la Transferencia de Embriones es

menor a la que ocurre por el semen, aunque no se descarta que la presencia de agentes

infecciosos en el útero de la donante, puedan ser transmitidos a la receptora, causando

subsecuentes infecciones que llevarían a la muerte del embrión y por consiguiente infectando la

receptora (Yang et al., 1990)

1. MARCO TEORICO

Todos los esfuerzos tecnológicos en pro de mejorar sustancialmente la producción pecuaria en

cualquiera de sus formas; fija un punto de responsabilidad entre el hombre y su entorno natural.

Siendo estas nuevas técnicas de manejo reproductivo una puerta para la efectividad y la

sostenibilidad del ecosistema explotado. Es así como la transferencia de embriones es un sistema

revolucionario de reproducción, donde se asegura una mayor calidad genética de los nacimientos,

que se verá traducido en mayores niveles de producción.

1.2 REPRODUCCION DE LA VACA

1.2.1 El ciclo estral: Se define el ciclo estral como el período comprendido entre dos estros

consecutivos contiene una duración entre 19 a 21 días.

Para que se inicie la actividad reproductiva, y se presenten los ciclos estrales de normal

regularidad, la novilla debe alcanzar la pubertad la cual ocurre dependiendo de diversos factores

pero en general se presenta entre los 6-18 meses. Para su estudio, se ha dividido el ciclo estral en

4 fases: proestro, estro, metaestro y el diestro (Fraser y col, 1988)

1. Proestro: fase folicular y de regresión del cuerpo lúteo

2. Estro: fase periovulatoria

3. metaestro: fase posovulatoria

4. diestro: fase lútea

El día 0 del ciclo estral es el día del celo, en el se observan signos visibles a simple vista; sin

embargo desde el punto de vista fisiológico, la descripción se realiza a partir de la destrucción del

cuerpo lúteo y finaliza con la ovulación. (Daza, 1997)

1.2.1.1 FASE FOLICULAR

1.2.1.1.1 FASE FOLICULAR O DE REGRESIÓN LÚTEA (PROESTRO)

Este período, tiene una duración de 3 días y comienza con la regresión del cuerpo lúteo del ciclo

anterior y finaliza con la manifestación de celo. La regresión del cuerpo lúteo o luteólisis ocurre por

acción de la prostaglandina F2 alfa producida por el endometrio. Como consecuencia se presenta

una caída de los niveles de progesterona, disminuyendo la reacción negativa que dicha hormona

tenía a nivel hipotalámico y comienzan a aumentar la frecuencia pulsátil de las hormonas

gonadotróficas (FSH y LH) y se estimula el crecimiento folicular con el desarrollo de un gran

folículo y el aumento en los niveles de estradiol. Cuando los estrógenos alcanzan cierto nivel, se

estimula la receptividad al macho y comienza el período de celo o estro. (Lubos, 1983) (Katska y

col, 1984)

1.2.1.1.2 FASE PERIOVULATORIA (ESTRO Y METAESTRO) Esta fase comienza con la receptividad al macho (se deja montar por otras vacas y toros), e

involucra todos los cambios que permiten la ovulación y comienzo de la formación del cuerpo lúteo.

El estro, tiene una duración entre 3-30 horas pero en promedio es de 15±6 horas, la vaca

manifiesta inquietud, ansiedad, brama con frecuencia y pierde el apetito; en el caso de las vacas

lecheras, cae su producción. Las vacas presentan una descarga de moco con mínima viscosidad

(filante), cuyo olor atrae y excita al toro (presencia de feromonas), además de edema de la vulva,

en el útero se produce un aumento del tono miometrial, detectado fácilmente por palpación

transrectal.

Durante esta fase, los estrógenos alcanzan altas concentraciones en la sangre y un nivel umbral

que permite la estimulación del centro cíclico hipotalámico, estimulando a las neuronas

hipotalámicas a producir el pico de GnRH y en consecuencia el pico de LH. Con respecto a la FSH,

disminuye su secreción, como consecuencia de la reacción negativa estrogénica y de la inhibina,

con excepción del momento en que se produce el pico preovulatorio de LH, en que puede aparecer

un pico de FSH.

Luego de 12 a 24 horas de comenzado el celo, el sistema nervioso de la vaca se torna refractario

al estradiol y cesan todas las manifestaciones psíquicas del mismo. (De la fuente, 2001)

El período inmediato a la finalización del celo, es el metaestro (6 días). En este período ocurre la

ovulación de la vaca, a diferencia de las otras especies que lo hacen durante el celo, y comienza la

organización celular y desarrollo del cuerpo lúteo. La ovulación ocurre 28 a 32 horas de iniciado el

celo y es desencadenada por el pico preovulatorio de LH. A la ovulación sigue una hemorragia

profunda y el folículo se llena de sangre convirtiéndose en el cuerpo hemorrágico.

En la formación del cuerpo lúteo (luteinización) se producen una serie de cambios morfológicos y

bioquímicos que permiten que las células foliculares se transformen en células luteales, cambios

que finalizan al séptimo día con un cuerpo lúteo funcional (Daza, 1997)

1.2.1.1.3 FASE LUTEAL (DIESTRO) Esta fase se caracteriza por el dominio del cuerpo lúteo. El mantenimiento del cuerpo lúteo, así

como la síntesis de progesterona está ligada a la hormona LH que es progesterotrófica y

luteotrófica.

Otras hormonas que intervendrían en la síntesis de progesterona, son la FSH y la PGI2. La FSH se

uniría a receptores ubicados en el cuerpo lúteo y provocaría un aumento en la secreción de

progesterona. En lo referente a la PGI2 además de estimular a las células luteales para producir

progesterona, aumentaría el flujo sanguíneo a nivel ovárico con el efecto positivo que esto significa

sobre la síntesis y secreción de progesterona.

Si el huevo no es fecundado, el cuerpo lúteo permanece funcional hasta el día 15-17, después del

cual comienza la regresión para preparar un nuevo ciclo estral (De la fuente, 2001)

1.2.1.2 DINÁMICA FOLICULAR BOVINA Se conoce como dinámica folicular al proceso de crecimiento y regresión de los folículos antrales

que conducen al desarrollo de un folículo preovulatorio. Existirán animales con dos hasta 4 ondas

de crecimiento folicular, la duración del ciclo estral depende a su vez del numero de ondas de

crecimiento folicular que presente cada vaca.

Para describir la dinámica folicular bovina es necesario definir los términos de reclutamiento,

selección y dominancia:

1.2.1.2.1 Reclutamiento: es el proceso por el cual una cohorte de folículos comienza a madurar en

un medio con un aporte adecuado de gonadotropinas que le permiten avanzar hacia la ovulación.

1.2.1.2.2 Selección: Es el proceso por el cual un folículo es elegido y evita la atresia con la

posibilidad de llegar a la ovulación.

1.2.1.2.3 dominancia: Es el proceso por el cual el folículo seleccionado domina ejerciendo un

efecto inhibitorio sobre el reclutamiento de una nueva cohorte de folículos. Este folículo alcanza un

tamaño marcadamente superior a los demás, es responsable de la mayor secreción de estradiol y

adquiere la capacidad de continuar su desarrollo en un medio hormonal adverso para el resto de

los folículos.

La causa por la cual regresa el folículo dominante de las primeras ondas (1 de 2 ondas y 2 de 3

ondas) sería la presencia de una baja frecuencia de los pulsos de LH debido a los altos niveles de

progesterona, que provocarían una menor síntesis de andrógenos y en consecuencia una menor

síntesis de estradiol que iniciarían la atresia folicular.

Estas etapas están caracterizadas por cambios cíclicos hormonales y algunos cambios

morfológicos. La etapa más importante desde el punto de vista práctico y útil es el estro. El cual se

define como el período de receptividad sexual de la hembra en los bovinos. Esta aceptación del

macho se debe en gran parte, a los cambios bruscos de niveles hormonales sobre todo, de los

estrógenos producidos por el crecimiento del folículo. (Blood y col, 1992) (Fraser y col, 1988)

Esta conducta se considera como el verdadero "calor" o celo de la vaca, la cual desde el punto de

vista endocrino, marca el patrón fisiológico de la hembra. Sin embargo, desde otro ángulo más

práctico, el celo se caracteriza por varios síntomas o indicadores muy claros sobre la conducta del

animal, como son:

1. Inquietud, la vaca aumenta sus movimientos en un 300 o 400%.

2. El vestíbulo vaginal se torna rojo.

3. Flujo de moco cristalino, el cual se adhiere a la cola y piel de la parte trasera.

4. Intentos de montar otras vacas.

1.3 GENERALIDADES DE LA TRANSFERENCIA DE EMBRIONES

La técnica de transferencia de embriones (TE) consiste básicamente en la remoción de los

embriones desde el útero de una hembra seleccionada para luego colocarlos en receptoras que

prestaran su vientre para realizar la gestación y posterior crianza del producto obtenido, el cual

heredará las características seleccionadas en la vaca donante (Bennett, 1997).

Este procedimiento permite aumentar rápidamente la capacidad reproductiva de las hembras

consideradas superiores dentro de una raza o especie, disminuir el intervalo generacional sobre

todo cuando se practica en hembras jóvenes, aumentar el número de crías de alta selección en un

determinado intervalo de tiempo y la producción de animales genéticamente superiores o su

conservación en congelamiento para usos posteriores.

La TE se comenzó a desarrollar de forma comercial en la década del setenta y hoy en día se

practica en casi la totalidad de los países con ganaderías de alta producción, tanto de leche como

de carne, con el fin de incrementar la difusión de los genes mejorantes por vía de la hembra (De La

Fuente, 2001).

Actualmente se transfieren a nivel mundial más de 600.000 embriones al año, los cuales en la

mayor parte se realiza en los países latinoamericanos (Betteridge, 2006)

La eficiencia de los programas de selección y cruzamiento aumentan considerablemente con la

aplicación de la TE, es preciso también mencionar la posibilidad de preservar los embriones por

métodos de congelación durante décadas al igual que se ha venido haciendo con el semen. Esta

ultima técnica ofrece ventajas como la de obtener mayor eficacia y ahorro en el uso de receptoras,

facilidad en el transporte de embriones y en consecuencia la posibilidad del comercio de material

genético.

La posibilidad de “criopreservar” embriones permite la formación de reservas genómicas en forma

de bancos de embriones. Ello tiene particular importancia en la conservación de razas en peligro

de extinción, cuya producción y mantenimiento en establecimientos ganaderos son sumamente

costosas (Clement-Sengewald, et al. 1993).

Diversos genetistas afirman que si el número de vacas sometidas a TE en un hato es muy

pequeño, la Inseminación Artificial. Tiene más fuerza de progreso genético que la TE simplemente

por el hecho de incorporar un mayor número de individuos. Lo contrario sucede cuando tenemos

un número alto de vacas donadoras produciendo muchos descendientes para obtener una

intensidad de selección mayor en una población más grande. Entonces idealmente se puede

incrementar la intensidad de selección a través de la I.A. y luego acortar el intervalo generacional

con la T.E. de vacas con alto poder genético formando una base muy sólida para el desarrollo de

una ganadería pura (Vélez, 1997).

La congelación de embriones permite el mantenimiento de su viabilidad por largos períodos de

tiempo y en consecuencia, contribuye a aumentar el rendimiento en partos de un programa de

superovulación, al no tener que perder embriones cuando no se dispone del número adecuado de

receptoras (De La Fuente, 2001).

La congelación de embriones depende fundamentalmente de:

La exposición de embriones a agentes crioprotectores.

Al enfriamiento desde temperaturas fisiológicas hasta temperaturas lo suficientemente bajas

para causar un virtual cese de todas las reacciones químicas inducidas térmicamente.

El calentamiento desde la temperatura de conservación (-196°C) hasta temperaturas

fisiológicas (Leibo (1989), citado por Cabodevila (1993)). Adicionalmente se debe tener en

cuenta la importancia que tiene el tiempo que transcurre desde el momento de la colecta hasta

la congelación y la calidad del embrión.

Mazur (1970), citado por De La Fuente (2001) afirman que la congelación es un proceso físico-

químico gobernado por el calor y el transporte de sustancias entre la célula y su medio externo.

Para controlar estos factores se han utilizado una serie de compuestos crioprotectores con

características similares, generalmente se acepta que estos compuestos protegen a la célula de los

efectos dañinos de las altas concentraciones de solutos, a medida que avanza la congelación.

Inicialmente los crioprotectores se adicionaban y retiraban del embrión mediante su inclusión en

soluciones sucesivas de concentraciones crecientes y decrecientes, en la actualidad este proceso

se realiza en un solo paso, descongelando y transfiriendo los embriones de forma similar a como

se realiza una IA y con resultados de gestación semejantes.

1.4 INMUNOLOGÍA Y ESTADO SANITARIO DEL ÚTERO

La mayoría de infecciones uterinas conllevan especialmente a muerte embrionaria que en el bovino

se estima entre 20-40% (López-Gatius et al., 1996; Hanzen et al., 1999). Diversos agentes

infecciosos han sido involucrados como virus, bacterias, protozoarios, hongos y micoplasma, los

cuales pueden entrar al útero por vía hematógena o a través del semen especialmente algunos

virus como el de Diarrea Viral Bovina.

Aunque se reconoce que el riesgo de transmisión de agentes infecciosos a través de la

Transferencia de Embriones es menor a la que podría ocurrir por el semen, no se descarta que la

presencia de agentes infecciosos en el útero de la donante puede ser transmitido a la receptora,

causando subsecuentes infecciones que llevan a la muerte del embrión y por consiguiente la

transmisión a la receptora. (Yang y col, 1990)

En un reciente estudio se demostró que el Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis

puede adherirse a la zona pelúcida de los embriones, sin embargo si se siguen los procedimientos

establecidos por la Sociedad de transferencia de embriones que recomienda su lavado antes de

ser transferidos, no representa riesgo para la vaca receptora (Bielanski et al., 2006).

En general se considera que cualquier infección uterina posparto es una causa importante de

infertilidad. Diferentes bacterias han sido cultivadas durante las dos primeras semanas después del

parto en vacas lecheras, sin embargo muchas vacas eliminan estas bacterias durante las 5

semanas siguientes, aunque la mayoría de bacterias patógenas persisten en 10-17% de los

animales (Borsberry et al., 1989; Leblanc et al., 2002). La infección uterina ha sido asociada con

bajas tasas de concepción, aumento del intervalo del parto al primer servicio o concepción y mayor

descarte de vacas por falla en la concepción. (Sheldon et al., 2006).

En algunos casos de endometritis bovina se han aislado Arcanobacterium pyogenes, Escherichia

coli, Streptococcus α hemolítico y Pasteurella hemolítica (García et al., 1990; Bonnett y Martin

1995), en otros casos se han encontrado algunas especies anaerobias como Bacteroides sp,

Fusobacterium sp .y A. pyogenes (Griffin et al 1975; Bretzlaff, 1987)

1.5 GENERALIDADES DE LAS CEPAS BACTERIANAS Las bacterias se usan con múltiples propósitos, pedagógicos, investigativos, industria, control de

calidad hospitalaria y veterinaria. Por la inconsistencia en diferentes reportes en su conservación

debido a: su metabolismo, ciclo de vida, propiedades morfológicas y bioquímicas.

En el presente trabajo se evaluaron las especies más representativas de tres grupos de bacterias:

1.5.1 Bacterias Gram positivasPoseen varias características que ayudan a diferenciarlas de los microorganismos gram negativos,

debido a los elevados contenidos de glucopéptidos, ácido teicoico, algunos aminoácidos que

incluyen L-alanina, D-alanina, D-glutamico, lisina y bajos contenidos lipídicos de sus paredes

celulares, siendo el peptidoglucano el 90% de la pared. En bacterias gram positivas habitualmente

se establece el enlace de varios aminoácidos cuyo número y tipo depende de la bacteria.

En Sthaphylococcus aureus, que es la bacteria gran positiva que mejor se conoce, el puente esta

formado por cinco glicinas conectadas por enlaces peptidicos. (Brock, 2000)

Usualmente las bacterias gram positivas retienen el colorante cristal violeta de la tinción de Gram

(realizada por el medico danés Hans Christian Gram), debido a que los alcoholes y otros solventes

orgánicos no penetran en las paredes celulares deficientes en lípidos; siendo mas resistentes a

efectos de desecación, calor, luz solar y sustancias químicas. (Mattar y Melo, 1998)

1.5.2 Bacterias Gram negativasLa pared celular de esta clase de bacterias es compleja desde el punto de vista químico,

estructuralmente posee una membrana citoplasmática fosfolipídica, rodeada por una capa de

peptidoglicano que constituye solo el 10%de la pared que delimita el espacio periplasmático, así

como una pared externa que contiene elementos intercalados como lipopolisacaridos (LPS),

moléculas construidas sobre la región core y una cadena lateral.

Una propiedad biológica importante de la membrana externa de muchas bacterias Gram negativas

es que resulta habitualmente tóxica para los animales. Bacterias gram negativas patógenos para el

hombre y otros animales incluyen miembros de los géneros Salmonella, Shiguella y Escherichia

coli entre otros.

La propiedad tóxica de la membrana externa de estas bacterias es responsable de algunos

síntomas de infección a los que dan lugar; estas propiedades tóxicas se asocian a una parte de la

capa de lipopolisacarido, mas concretamente al lípido A. el uso del término endotoxina hace

alusión precisamente a este componente tóxico del LPS, es interesante destacar no obstante que

también el LPS de algunas bacterias no patógenas presenta actividad de endotoxina, por esto no

se requiere que el organismo sea patógeno para que su pared celular contenga elementos tóxicos.

(Brock, 2000)

Estos microorganismos poseen un espacio periplasmático entre la membrana citoplasmática y la

membrana externa, el cual ha demostrado contener proteínas, enzimas hidroliticas como

fosfatasas, DNAsa I, RNAsa I y penicilasas controladas por plásmidos (Brock, 2000)

1.5.3 Bacilos esporulados

Muchos miembros de los géneros Bacillus y Clostridium entre otros tienen la propiedad de formar

un cuerpo refringente intracelular llamado endoespora, sirve de protección a la desecación y

condiciones ambientales adversas, impenetrabilidad a las sustancias químicas, resistencia al calor,

sobrevivencia y diseminación de la especie.

Contiene grandes cantidades de dipicolinato cálcico, una sustancia que no se encuentra en las

células vegetativas, la cual desempeña un papel importante en la resistencia al calor de la

endospora, también contiene aproximadamente cinco veces mas aminoácidos cisteína por

miligramos del nitrógeno total, y el alto contenido de grupos de disulfuro es el que le da resistencia

a la radiación ultravioleta. (Moat y Foster, 1988)

2. MATERIALES Y METODOS

2.1 ANIMALES EXPERIMENTALES Y TOMA DE MUESTRAS

Se utilizaron 21 vacas donantes de embriones de las razas Sanmartinero, Jersey, Gyr y Brahman

pertenecientes a 6 fincas localizadas en los municipios de Villavicencio, Cumaral y Paratebueno,

que desarrollaban un programa de transferencia de embriones. Se tomó la información

correspondiente a edad del animal, numero de partos, numero de lavados, numero de embriones

viables de cada lavado.

2.2 PROTOCOLO PARA SUPER OVULACION, INSEMINACION ARTIFICIAL Y RECOLECCION DE EMBRIONES EN TIEMPO FIJO EN BOVINOS.

La selección de las vacas donantes fue hecha sobre la base de sus características genéticas y

raciales. A las vacas seleccionadas se les aplicó el protocolo descrito en la Figura 1.

Días de tratamiento

2.0 Mg BE + 50Mg P4

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Dispositivo deProgesterona

FSH

PGF

GnRH o LH(Mañana)

IATF

Recolección de embriones tiempo fijo

Figura 1. Protocolo de superovulacion en vacas donantes de embriones. El tratamiento consiste en la inserción de un dispositivo liberador de progesterona conjuntamente a la administración de Benzoato de estradiol (BE) y progesterona (P4) en el día 0 (Promedio), con inicio del tratamiento súper ovulatorio en el día 4 (P), aplicación de PGF en el día 6 (P), remoción del dispositivo en el día 7 (P), aplicación de GnRH o LH en el día 8 (P), seguido de inseminación artificial en tiempo fijo 12 y 24 horas después del GnRH. El estro no se observa y la recolección de los embriones se hace en el día 15.

2.3 OBTENCION DE LOS EMBRIONES Y TOMA DE MUESTRA PARA CULTIVO

La recolección de los embriones se realizó al 7 día pos inseminación mediante lavado no

quirúrgico. Brevemente, se realizó palpación rectal en las vacas donantes para evaluar la

respuesta superovulatoria (Figura 1-2). Seguidamente se realizó limpieza y desinfección del tren

posterior especialmente a nivel de los labios vulvares (Figura 3-4).

Luego de una exhaustiva desinfección se aplicó a nivel epidural 5 ml de lidocaína sin epinefrina,

dejando la jeringa en este sitio para posteriormente continuar con su aplicación, medida que

transcurría el lavado. El lavado de los embriones se realizó utilizando un catéter Foley de 3 vías.

(Figura 5-6). La punta del catéter fue ubicada en la parte más craneal de cada cuerno, inflado el

balón y fijado a la pared del endometrio. Se inyectó a través del catéter el medio de lavado

(Lactacto de Ringer) en dosis de 40-60 ml en cada aplicación, hasta completar un volumen de 500

ml por cada cuerno y recogido los embriones en un filtro de 75µ (Millipore).

Las muestras para cultivo microbiologico fueron obtenidas de los primeros chorros despues de

haber pasado por el filtro y recogidas en medio de transporte caldo BHI (anexo 1). Durante todo el

proceso de la toma de muestras se utilizó un mechero de alcohol para evitar la contaminacion

exógena de las muestras (Figura 7). Las muestras fueron llevadas al laboratorio de microbiología

animal de la Universidad de los Llanos y puesta en incubación a 37ºC por 24 horas.

2.4 IDENTIFICACION Y AISLAMIENTO DE COLONIAS.

Una vez se observó la presencia de crecimiento bacteriano, dado por la turbidez del medio, se

procedió a realizar las pruebas de identificación para cada microorganismo. De cada muestra se

tomó con azada curva, una cantidad suficiente para la siembra por triplicado en agar nutritivo

(anexo Nº.3), Agar Mac Conkey (anexo Nº.2) y Agar sangre (anexo Nº.4) y se incubaron las cajas

de petri a 37°C por 24 horas.

En aquellas muestras en las que se observó crecimiento bacteriano, se realizó coloración de gram

(Koneman, 1999, anexo Nº.21).Posteriormente clasificadas de acuerdo con la metodología

propuesta por Vadillo, 1980 y Díaz y ol 1999.

Con aquellos cultivos gram positivos, se hicieron repiques en medio salado de manitol (anexo Nº.5)

y medio XLD (anexo Nº. 6), y se realizó pruebas de catalasa. Contrariamente, a las gram negativas

se les hizo repique en medio EMB (anexo Nº. 8) y SS (anexo Nº. 9) y pruebas de oxidasa. Para

bacterias gram positivas, adicionalmente se les realizó la prueba de coagulasa.

TABLA 1. Métodos para la determinación de la especie de microorganismo

MICROORGANISMO MEDIO DE CULTIVOBiomasa bacteriana Agar Nutritivo anexo Nº 3Hemolisis Agar Sangre anexo Nº 4Aislamiento de coliformes, patógenos

intestinales y en muestras biológicas.

Agar Mac conkey anexo Nº2

Enterobacterias Agar EMB anexo Nº8

Agar S.S. anexo Nº 91. Medio aislamiento de

Sthaphylococcus patógeno

2. Aislamiento de Salmonella y Shigella

Agar sal manitol anexo Nº 5

Agar XLD anexo Nº 6

Se realizo la identificación de cada una de las cepas con las siguientes reacciones para cada

grupo:

o Bacterias Gram positivas: Rojo de metilo-Vojes Proskawer (anexo Nº. 16), TSI

(anexo Nº.14), LIA (anexo Nº.13), Citrato (anexo Nº.12), Agar SIM (anexo Nº.15),

Urea (anexo Nº. 17), Nitritos (anexo Nº. 18), Medios con azucares (anexo Nº. 19)

o Bacterias Gram negativas: TSI (anexo Nº.14), LIA (anexo Nº.13), Citrato (anexo

Nº.12), Agar SIM (anexo Nº.15), Rojo de metilo-Vojes Proskawer (anexo Nº.16),

Urea (anexo Nº. 17), Nitritos (anexo Nº. 18), Medios con azucares (anexo Nº.19)

2.5 ANALISIS ESTADISTICO

Los datos obtenidos se sometieron a estadística descriptiva, mediante el programa Microsoft Office

Excel.

3. RESULTADOS

3.1 CONFIRMACION DE IDENTIDAD DE LAS MUESTRAS TOMADAS A LOS ANIMALES: Se

aislaron diversos microorganismos, los mas representativos fueron en su orden Pseudomona spp,

Shigella spp, Staphylococus spp. E.coli, Klebsiella spp, Proteus spp, Archanobacterium spp y

bacillus spp. Tablas 3,4,5,6,7.

TABLA 2. Resultados obtenidos en las pruebas de identificación de bacterias gram negativas entéricas en medios selectivos, a partir de los lavados uterinos de vacas donantes de embriones

BACTERIA Escherichia coli Shigella spp Klebsiella spp Proteus sppCaracterísticas

de las colonias

en medio

Colonias

circulares

convexas, de

borde continuo o

ligeramente

ondulado, con

brillo verde

metálico.

Colonias

redondas

brillantes de

borde continuo,

mucosas de color

purpura claro o

semitraslucidas.

Colonias fucsias

claras, de

consistencia

pegajosa.

Colonias rojas

viscosas y

agrupadas.

Morfología en

tinción de

Gram

Bacilo gram

negativo

Bacilo gram

negativo

Bacilo gram

negativo

Bacilo gram

negativo

TSI A(K)/A K/A K/A A/kH2S/GAS Negativo/positivo Negativo/negativo Negativo/negativo Positivo/negativoINDOL Positivo Negativo Negativo Positivo

MOTILIDAD Negativo/positivo Negativo Negativo V+LIA K/K K/A k/A k/A

CITRATO Negativo Negativo Positivo NegativoUREA Negativo Negativo Positivo NegativoRMVP Positivo/negativo Positivo/negativo Positivo/negativo Negativo/negativo

NITRATO Negativo Negativo Negativo NegativoLACTOSA Positivo negativo Positivo Negativo

TABLA 3. Resultados de las pruebas de identificación de bacterias gram negativas, en medios selectivos, partiendo de los lavados uterinos de vacas donantes de embriones

BACTERIA Pseudomona spp

Características de las

colonias en medio

Colonias grandes,

irregulares, planas, de olor

como vino de uva y de

aspecto de vidrio

esmeriladoMorfología en tinción de

Gram

Bacilo gram negativo recto

o ligeramente curvadoCATALASA Positivo

OXIDASA Positivo

INDOL Negativo

MOVILIDAD Positivo

H2S/GAS Negativo/negativo

CITRATO Positivo

UREA Negativo

MRVP Negativo/negativo

NITRATO Positivo

MALTOSA Negativo

GLUCOSA Positivo

LACTOSA Positivo

TABLA 4. Resultados de las pruebas de identificación de bacterias gram positivos, en medios selectivos, a partir de los lavados uterinos de vacas donantes de embriones

BACTERIA Archanobacterium spp Bacillus spp.Características de las

colonias en medio

Colonias regulares pequeñas

de color gris

Colonias irregulares

cremosas opacas.Morfología en tinción de gran Bacilo gram positivo corto,

rectos o ligeramente curvos,

puede contener gránulos

metacromaticos, disposición

en empalizada.

Bacilo gram positivo o gram

variable, forman esporas

termoresistentes.

CAPSULA - Formación de capsulaCATALASA Positivo Positivo

INDOL Negativo NegativoMOVILIDAD Negativo Negativo

H2S/GAS Negativo/negativo Negativo/negativoCITRATO Negativo Positivo

UREA Negativo VMRVP Negativo/negativo Positivo/negativo

NITRATO negativo -MALTOSA Positivo -

GALACTOSA Negativo -MANITOL Negativo -LACTOSA negativo -

HEMOLISIS EN AGAR

SANGRE

No Gamma

TABLA 5. Resultados de las pruebas de identificación de bacterias gram positivas, en medios selectivos, partiendo de los lavados uterinos de vacas donantes de embriones

BACTERIA Sthaphylococcus spp.

Características de las colonias

en medio

Colonias elevadas redondas con

borde continuo, lisas brillantes

Morfología en tinción de gram Coco gram positivo

PIGMENTACION Amarillo o dorado

CATALASA Positivo

COAGULASA TUBO Positivo

OXIDASA Negativo

HEMOLISIS β-hemolítico

MR/VP Negativo/positivo

NITRATO Positivo

GALACTOSA Negativo

MANITOL Negativo

TABLA 6. Clasificación general de las bacterias patógenas reconocidas, aisladas en los lavados uterinos de vacas donantes de embriones.

BACTERIA Pseudomona sp.

Sthaphylococcus sp. Bacillus sp.

Shiguella sp.

E.coli Klebsiella Proteus Archanobacterium sp.

3016 + - + - - - - -3018 + + - - - - - -164 + + + - - - - -

307-2 + - - - - - - -526-8 + + - - - - - -159-1 + - - - - - - -1006 + + - + - - - -026-7 + - - + - - - -366-5 - + - + - - - -223 - - - + - - - -

296-2 + - - + - - - -50 - + - - - - - -

720-4 - + + - - - - -140-7 - + - - - - - -417-1 - - + - - + - -

4492-1 - - - - - + - -604-3 + - - - + - - -546-7 + - + - + - - -745-5 - + - - - - + -649-7 - - + - + - - -

100-99 - + + - - - - +

TABLA 7. Microflora uterina aislada de vacas donantes de embriones, de acuerdo con la especie.

BACTERIA PORCENTAJE

Pseudomona sp. 11/21 (52,4 %)

Sthaphylococcus sp. 9/21 (47,6 %)

Bacillus sp. 7/21 (33.3 %)

Shiguella sp. 5/21 (23,9%)

Escherichia coli 3/2 (14,2 %)

Klebsiella sp. 2/21 (9,52 %)

Proteus sp. 1/21 (4,8 %)

Archanobacterium sp. 1/21 (4,8 %)

Tabla 8. Categorización de bacterias, aislados de muestra del útero. (William et al., 2007).

Patógenos uterinos reconocidos

Patógenos uterinos potenciales

Contaminantes oportunistas uterinos

Archanobacterium pyogenes Bacillus licheniformis Clostridium perfringesPrevotella melaninogenica Enterococcus faecalis Klebsiella pneumoniaeEscherichia coli Pastereulla multicoide Micrococcus sppFusarium necroporum Sthaphylococcus aureus Especies de Sthaphylococcus

coagulasa negativoProteus spp Streptococcos no hemolíticos Providencia stuartii

Figura 2. Determinación del número de bacterias presentes en cada lavado uterino de vacas donantes de embriones.

FIGURA 3. Descripcion de la edad y numero de lavados uterinos a nivel individual realizados en las vacas donantes de embriones objeto de estudio.

TABLA 9. Descripción general por finca, edad, número de partos y número de lavados de las vacas donantes de embriones muestreadas.

nombre de la finca Raza numero del animal edad del animal numero de partos numero de lavados

Los GuadualesSan

martinera 100-99 6 años 2 partos 2Los Guaduales Gyr 1006 7 años 1 parto 1Los Guaduales Jersey 604-3 7 años 3 partos 2

El Hachón Jersey 3016 8 años 1 parto 1El Hachón Jersey 3018 11 años 2 partos 1

El Algarrobo Brahmán 026-7 11 años 4 partos 3El Algarrobo Brahmán 50 14 años 3 partos 3El Algarrobo Brahmán 366-5 12 años 4 partos naturales 3El Algarrobo Brahmán 140-7 16 años 5 partos 4El Algarrobo Brahmán 164 11 años 3 partos 3El Algarrobo Brahmán 223 14 años 3 partos naturales 5San Lorenzo Brahmán 296-2 6 años 2 partos 5San Lorenzo Brahmán 307-2 6 años 1 parto 3San Lorenzo Brahmán 526-8 10 años 5 partos 4Marruecos Brahmán 159-1 9 años 5 partos 5Vendaval Brahmán 417-1 7 años 3 partos 5Vendaval Brahmán 745-5 12 años 4 partos 5Vendaval Brahmán 649-7 11 años 5 partos 6Vendaval Brahmán 546-7 11 años 5 partos 4Vendaval Brahmán 720-4 13 años 5 partos 3Vendaval Brahmán 4492-1 16 años 8 partos 5

4. DISCUSION DE RESULTADOS

El alto número de microorganismos aislados en los lavados uterinos de vacas donantes de

embriones sugiere la existencia de una microflora uterina saprofítica la cual se considera normal.

Sin embargo la evidencia de otros microorganismos clasificados como patógenos pudiera tener

importancia en la trasmisión de estos agentes a las vacas receptoras.

Según un estudio de Vanroose y col. estos agentes infecciones están relacionados indirectamente

con muertes embrionarias, septicemias, viremias y toxemias, o directamente por afectar el medio

ambiente uterino, la muerte embrionaria es causada por patógenos sistémicos y se relaciona con

fiebre durante la infección, cuando el animal presenta estados febriles elevados la muerte

embrionaria se da por la denaturacion de las proteínas, en el caso de altas concentraciones de

prostaglandina causa luteolisis y abortos; factores como estrés elevan la concentración de

esteroides y en consecuencia se produce una baja respuesta inmune.

La infección del medio ambiente embrionario (oviductos y útero) puede ser causada por patógenos

uterinos específicos y no específicos. Existen algunos virus y bacterias que se pueden adherir

firmemente a la zona pelucida y convertirse en una fuente potencial de infección tanto para la

receptora o para el embrión en las etapas de desarrollo siguientes; en un estudio realizado por

Escobar se reportan 7 agentes específicos como patógenos potenciales en la transferencia de

embriones como son: Brucella abortus, Haemophilus somnus, Ureplasma diversum, Leptospira,

Mycoplasma bovis, Mycobacterium paratuberculosis y Campylobacter fetus subsp veneralis.

Aunque la probabilidad de que agentes patógenos se asocien sea bastante reducida si se siguen

las recomendaciones hechas por la sociedad de transferencia de embriones, debido a que es

probable que los patógenos se adhieran a la zona pelucida a que la penetren, utilizando uno de

los tratamientos mas efectivos que consisten en el lavado de los mismos antes de su transferencia

a las vacas receptoras.

Los patógenos no específicos principalmente bacterias entran al útero por infección ascendente o

por inseminación. A veces estas causan endometritis, la infección desarrolla un cuadro clínico

inflamatorio y la pérdida del embrión, en animales viejos el útero la porción vaginal del útero se

encuentra aplanada y engrosada en los pliegues y empieza a parecer cierto grado de dilatación y

deformación, siendo esta perdida de forma y simetría, una consecuencia del aumento de tejido

conectivo y de cicatrización, que puede ser confundida con cuerpos lúteos durante la palpación

rectal; esta relacionado con el aumento de biomasa microbiana en el útero debido a que no se

encuentra totalmente aséptico,

El cuadro clínico desarrolla una endometritis aguda o crónica; la aguda genera efectos directos

sobre el medio ambiente del embrión, en casos severos esta acompañado por sustancias

luteoliticas semejantes a la prostaglandina, cuando las concentraciones de la biomasa bacteriana

se elevan causa inflamación severa purulenta; en el caso de la crónica involucra cambios

funcionales y morfológicos e inflamación del útero, el deposito de capas de tejido fibroso alrededor

de las glándulas endometriales resulta en una deficiencia de las funciones glandulares, esta

deficiencia disminuye la secreción de proteínas del embrión.

Según reportes hechos por Dohmen y col. la presencia de bacterias coliformes como E. coli,

Proteus sp, Klebsiella sp, Shigella sp, están ligados a el decrecimiento en la eficiencia reproductiva

y endometritis; la presencia de agentes patógenos como Arcanobacterium sp relacionado con

endometritis aguda o crónica; y Sthaphylococcus sp, Pseudomona sp, Bacillus sp, como

microflora uterina sin causa aparente sobre el desarrollo embrionario encontrada en este estudio,

coincide con los mismos agentes reportados por William et al., 2007 (Tabla 8).

Estos reportes se correlacionaron con nuestro estudio, en este se encontraron una variedad de

microorganismos alta, equivalente a un 80% de presencia de agentes patógenos que impiden el

desarrollo del embrión, en las 21 muestras tomadas de lavado uterino se encontró una alta

incidencia de la familia Enterobacteriaceae; se encontró Shiguella (23,9%), E. coli (14,2%),

Klebsiella (9,52%) y Proteus (4,8%), reportados como patógenos uterinos reconocidos, y

potenciales y oportunistas Pseudomona (52,4%), Sthaphylococcus (47,6%), Bacillus (33,3%),

Archanobacterium (4,8%). (Tabla 7).

La presencia de algunas bacterias patógenas sugiere la posible trasmisión a las receptoras, sino se

siguen estrictamente las recomendaciones hechas por la Sociedad Internacional de Transferencia

de Embriones, siendo posible que algunas de las bacterias aisladas hayan provenido de

contaminación externa principalmente a partir de las heces dadas las condiciones en las cuales se

realiza el lavado uterino para obtener los embriones, esta correlación se muestra en la (figura 2) en

la cual se realizo una comparación entre la totalidad de animales muestreados, en caso de

presencia de 1 bacteria se reporto 6 animales que corresponden a (28,6%), con 2 bacterias que fue

el resultado mas significativo, se reporto 11 animales que corresponden a (52,4%), este resultado

esta relacionado en algunos de los animales con el número de lavados uterinos, edad del animal, y

con 3 bacterias que fue el resultado mas bajo, se reporto en 4 vacas que corresponde (19,9%).

(figura 2).

La mayoría de estos agentes bacterianos tienen factores de virulencia como la producción de

endotoxinas siendo esta una macromolécula compuesta por lipopolisacaridos, proteínas y

fosfolipidos, las endotoxinas son un inductor de liberación rápida de citokinas y prostaglandina,

además las endotoxinas tienen un efecto directo citotoxico a favor de la estabilización de la

infección.

No se conoce si estas bacterias patógenas, están en capacidad de ocasionar efectos directos

sobre el embrión adhiriéndose a la zona pelúcida, alterando los mecanismos de nutrición o si por el

contrario el efecto patógeno puede estar dado por una acción indirecta por la liberación de

endotoxinas que ocasionarían la inflamación del útero y oviducto alterando la trasmisión de señales

bioquímicas entre el embrión y el endometrio, los mecanismos de nutrición del mismo, preguntas

que tienen que ser objeto de nuevas investigaciones.

Igualmente se ha reconocido que las infecciones uterinas producidas por microorganismos

patógenos pueden ocasionar efectos sobre otros órganos como el ovario, en el cual se podrían ver

reducidos los niveles de progesterona por el cuerpo lúteo. William et al., 2007 ha podido clasificar

la microflora uterina posparto en 3 clases, 1. Patógenos uterinos reconocidos, 2. Patógenos

uterinos potenciales, 3. Contaminantes uterinos oportunistas. (ver Tabla 9)

La presencia de microorganismo uterinos depende también de los días en los cuales ha

transcurrido el posparto, por ejemplo, se conoce que durante las primeras dos semanas, gran

cantidad de microorganismos pueden ser cultivados, sin embargo después de la quinta semana

esos microorganismo han sido eliminados, aunque en un 10-17% de las vacas pueden persistir

(Sheldon et al., 2006). En este estudio la totalidad de las vacas utilizadas se encontraban con más

de 100 días posparto por lo que la presencia de estos microorganismos puede corresponder con

ese 17%.

Es posible que otra fuente de microorganismos haya provenido por contaminación externa,

especialmente de las heces del animal durante el lavado. A pesar de contar con todo el material

estéril, es difícil asegurar un lavado aséptico del útero.

La presencia de agentes patógenos, pueden ocasionar un 70% de las infecciones del tracto

urinario. En lo que respecta a la presencia de E. coli, se ha determinado que puede ocasionar la

liberación de prostaglandina F2alfa en cultivos celulares endometriales y tejidos cercanos al foco

de infección, sin embargo la endometritis depende de la patogenicidad de la bacteria. Su

establecimiento depende de las características del medio ambiente del útero, factores genéticos e

inmunidad adquirida e innata del animal.

En general, E. coli se ha asociado con problemas de diarrea, disentería, síndrome

ureico/hemolítico, infecciones del tracto urinario, septicemias, mastitis e infecciones pulmonares y

heridas); la virulencia de este microorganismo se ha estudiado a través de los años, se ha llegado

a determinar que posee diferentes tipos de virulencia que contribuyen a hacer mas potente su

patogenicidad (Santos et al, 2004).

Se ha comprobado que los animales pueden ser reservorios de E. coli entero patógeno (ECVT)

para las personas, y este se comporta como comensal en el intestino de ganado bovino y ovino,

esta cepa produce verotoxinas y proteínas en la membrana externa, controlada por el gen

cromosómico eae y recibe el nombre de intiminas, se le atribuye 70% de virulencia y resistencia a

varios antibióticos (Santos et al, 2004).

La cepa (ECET) causa colibacilosis y afecta principalmente a animales de pocos días de nacidos,

recién destetados; produce la enterotoxina STa. Son polisacáridos polipéptidos de 1900 a 5000

kda, que proporcionan cambios en la luz intestinal del animal. (Vadillo, 1980)

El género de las bacterias entéricas está relacionado con estos cambios. En el caso de Shigella

spp. Klebsiella spp. Proteus spp. y E. coli. Shigella spp. y E. coli. se parecen tanto, que pueden

recombinarse genéticamente y presentar una susceptibilidad común a algunos bacteriófagos,

Shigella es normalmente patógena para humanos y causa una gastroenteritis bacilar, en el caso de

los animales este género no es de vital importancia (Bell et al, 2007).

Otro de los microorganismos aislados fue Klebsiella, el cual hace parte de la microflora intestinal

del hombre y de los animales, éste genero posee numerosas especies pero la mas relevante es

Klebsiella pneumoniae, la cual produce infecciones en hombre y en los animales,y en la vaca

ocasiona mastitis. En cuanto a Proteus es una bacteria ampliamente distribuida en la naturaleza,

se encuentra en el suelo, agua, vegetales, y forma parte de la microflora intestinal de hombre y de

los animales (Vadillo, 1980) (Brock, 1998)

Otro de los géneros que se encontró ampliamente fue, Pseudomona aeruginosa. Son

microorganismos ecológicamente importantes, capaces de degradar compuestos solubles

derivados de material en descomposición procedente de animales y plantas; estos

microorganismos manifiestan una resistencia a la fagocitosis así como a la mayoría de antibióticos,

y se comporta como el agente etiológico primario de una infección en individuos sanos, aunque la

naturaleza no invasiva de estos, limita su capacidad de ser infecciosos.

En cuanto a su patogenicidad, esta bacteria es multifactorial, depende de los componentes de la

propia célula intra y extracelulares, como son las toxinas cuando esta desarrollando un proceso de

infección en el animal; elabora enzimas proteolíticas capaces de degradar sustratos, elastina,

caseína, colágeno, fibrina y gelatina. El conjunto de todos los mecanismos que utiliza, desempeña

un papel fundamental en lesiones vasculares, acompañadas de hemorragia, procesos necróticos,

altera el aparato respiratorio y ocasiona graves lesiones epiteliales en el tracto urinario. (Vadillo,

1980)

Por último Sthaphylococcus aureus, Bacillus cereus y Archanobacterium bovis anteriormente

llamado Corynebacterium bovis. El primero mencionado es un organismo aerobio, produce

hemolisis beta, y más tóxico que la alfa, encontramos una significancia de 14,3% donde las

características de la microflora y la presencia de altas concentraciones de la bacteria, pueden

ayudar a inmunosuprimir al animal, la mayoría de las cepas de Sthaphylococcus aureus produce

un polisacárido capsular (PC) del que existen 11 serovariedades, y en ganado bovino existen la

PC5 o el PC8; el colágeno es la principal proteína estructural de los mamíferos, y esta se

encuentra en la mayoría de los tejidos y también en forma soluble en muchos fluidos corporales, la

unión a esta proteína permite que S. aureus sea capaz de colonizar diferentes tejidos orgánicos,

tejidos lesionados y material biológico implantado (Ortega,1985)

Estudios realizados sobre S. aureus sugieren altas pérdidas económicas, debido a factores

maternales y factores internos que pueden generar síntomas como altas fiebres presentes en el

primer estado de embarazo y en muchas ocasiones el aumento de biomasa bacteriana en el útero

es debido a la falta de asepsia causando endometritis crónica como consecuencia de cambios

morfológicos y funcionales en el útero sucesivo a una inflamación. Cuando se realiza un implante

de material ajeno al organismo, esta bacteria se recubre rápidamente con proteínas del

hospedador, tales como fibronectina y fibrinógeno y su adherencia es mas fuerte (Sánchez, 1998).

Esta bacteria en ganado vacuno, produce mastitis clínica y un alto porcentaje de infecciones

intramamarias (IIM) subclínicas.

Bacillus cereus es un saprofito, y como contaminante de laboratorios; muestra mayor resistencia a

condiciones medio ambientales adversas porque forma esporas (resistentes al calor, y a

tratamientos químicos), en el muestreo fue mínima su presencia de (4.8%) seguramente

contaminante u oportunista.

Las especies del género Archanobacterium bovis comunes en el suelo y agua, residen en la piel y

las mucosas de hombres y animales, la mayoría de las especies de este género se consideran

patógenos oportunistas que invaden hospederos inmunosuprimidos, el A. bovis es un huésped

habitual de la ubre de la vaca,y a veces produce mastitis que puede conllevar a un cuadro clínico

de infección genitourinaria, en el ganado vacuno.

5. CONCLUSIONES

• Es posible que algunas de las bacterias aisladas hayan provenido de contaminación

externa principalmente a partir de las heces dadas las condiciones en las cuales se realizó

el lavado uterino para obtener los embriones.

• Existen otros riesgos que deben ser evaluados microbiológicamente como son los

componentes de origen animal utilizados en el proceso de transferencia (suero, albumina,

hormonas, enzimas) pueden contener patógenos.

• Las flora bacteriana encontrada en este estudio coincide con la clasificación hecha por

William et al., 2007. La presencia de estas bacterias puede corresponder a la persistencia

bacteriana que desarrollan entre el 10-17% de las vacas durante el posparto.

• La presencia de algunas bacterias patógenas sugiere la posible trasmisión a las receptoras

cuando no siguen estrictamente las recomendaciones hechas por la sociedad de

transferencia de embriones.

6. RECOMENDACIONES

• Se hace imperativo continuar en estos estudios con el objeto de correlacionar la presencia

de microflora patógena con efectos directos sobre el embrión, el microambiente oviductal y

uterino, las cuales podrían contrarrestar parcialmente la mortalidad embrionaria en las

receptoras.

• Se requiere iniciar nuevos estudios con el objeto de identificar la microflora bacteriana.

• utilizando métodos como el (PCR) reacción de cadena de la polimerasa más sensible y

específico para la identificación y determinación de las bacterias.

• Se deben extremar las medidas de asepsia durante los lavados uterinos y seguir

estrictamente las recomendaciones de la (IOP) Sociedad de transferencia de embriones

emitida para tal fin.

• Sería conveniente realizar cultivo bacteriológico a todas las vacas donantes de embriones

con el objeto de identificar aquellas bacterias patógenas persistentes e instaurar

tratamiento local o parenteral para disminuir la carga bacteriana antes de realizar cualquier

procedimiento de superovulación.

7. BIBLIOGRAFIA

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ANEXOS GENERALES

Figura 4. Preparación del técnico, momentos

previos a la evaluación de la respuesta

superovulatoria.

Figura 5. Evaluación de la respuesta

superovulatoria mediante palpación rectal,

momentos antes del lavado uterino.

Figura 6. Preparación de la vaca donante para la

realización del lavado de embriones.

Figura 7. Lavado y desinfección de la región

posterior de vacas donantes de embriones,

previo a la obtención de los embriones y toma

de muestras para cultivo.

Figura 8. Pasaje del catete de Foley a través del

cuello uterino y su ubicación en la parte craneal

del cuerno uterino.

Figura 9. Inicio del lavado uterino con solución

de lactato de Ringer más 5% de Suero Fetal

Bovino y recolección de los embriones en un

filtro Millipore de 75 µ.

Figura 10. Toma de muestra del lavado uterino y la

inoculación en medio de transporte BHI.

ANEXOS MEDIOS DE CULTIVO – PRUEBAS BIOQUIMICAS

CALDO BHI (OXOID)

Composición (g/litro):

infusión de sólidos de cerebro bovino 112.5Infusión sólidos de cerebro de ternera 5.0

Proteasa peptona 10.0Glucosa 2.0

Cloruro sódico 5.0Fosfato sódico 2.5

pH 7.4

Preparación:

Disolver 37 g, en un litro de agua destilada, mezclar bien y distribuir en recipientes finales,

esterilizar en autoclave a 121 ºC, 15 minutos.

Descripción:

Este medio líquido es útil para el cultivo de Streptococcos, Pneumococos, Meningococos y otros

organismos exigentes. Este medio se recomienda para hemocultivo, es útil para cultivar y

suspender Sthaphylococcus para la prueba de coagulasa. Newman empleo un medio similar para

el estudio de intoxicación alimentarías producidas por derivados de la leche.

El caldo corazón cerebro suplementado con extracto de levaduras y menadiona es superior en el

crecimiento de cinco especies de Bacteroides, que los caldos de anaerobios estándar. El examen

microscopio de los cultivos de 18 horas muestran en este medio su morfología normal, mientras

que esto no ocurre en caldos de anaerobios.

Condiciones de conservación y tiempo de vida:

El medio deshidratado debe conservarse a menos de 25 ºC y utilizado antes de la fecha de

caducidad expresada en la etiqueta.

Los tubos y frascos con el medio en la oscuridad y por debajo de 20 ºC.

ANEXO No. 2

MAC CONKEY (OXOID)

Fundamento:Es un medio diferencial para determinar patógenos intestinales en agua, productos lácteos y

muestras biológicas y coliformes, es recomendado para el aislamiento de muestras tales como

orina, heces e hisopos de heridas.

Contiene peptona como base nutriente, una sal biliar que impide el desarrollo de microorganismos

que no sean Entéricos, lactosa que es el azúcar del medio y rojo neutro como indicador de la

lactosa.


Peptona 20.0Lactosa 10.0

Sales biliares 5.0Cloruro sodico 5.0

Rojo neutro 0.075Agar 12.0pH 7.4

Preparación:Agregar 52 g a un litro de agua destilada, llevar a ebullición hasta disolución completa, esterilizar

en autoclave 121ºC por 15 min, luego se versa en cajas de petri.

Técnica:Este medio se sembró por aislamiento de la cepa que se aíslo del caldo BHI, se incubaron a 24

horas a 37ºC obteniendo colonias con las siguientes características:

organismo color observacionesEscherichia coli Rojo No mucoideAerobacter aerogenes Rosa MucoideEnterococcus sp. Rojo Diminuta redondaSthaphylococcus sp. Rosa pálida OpacaPseudomonas aeuroginosa Verde - marrón Crecimiento fluorescente

ANEXO No. 3

AGAR NUTRITIVO

Fundamento:

El agar nutritivo es un medio base utilizado en el subcultivo de organismos con fines de

mantenimiento o comprobar su pureza en subcultivos, antes de ensayos bioquímicos o serológicos.

Composición (g/L):

Polvo lab lemco 1.0Extracto de levadura 2.0

Peptona 5.0Cloruro sódico 5.0

Agar 15.0pH 7.4

Preparación:Agregar 28 gramos a un litro de agua destilada, llevar a ebullición hasta que el medio quede

homogéneo, luego autoclavar a 121ºC por 15 min.

Forma de las colonias:En el medio crece toda clase de microorganismos no exigentes en requerimiento nutritivo.

ANEXO No. 4

MEDIO AGAR SANGRE(HEMOLISIS)

FundamentoEs un medio con propiedades nutritivas que permite el crecimiento de la mayoría de

microorganismos; adecuado para el crecimiento de patógenos muy exigentes que generan

reacciones hemolíticas. (Mattar y melo, 1998)


Triptona 14Peptona 4.5

Extracto de levadura 4.5Cloruro de sodio 5.0

Agar - agar 12.5

Preparación:Suspender 40 g en un litro de agua destilada y llevar a ebullición hasta su completa disolución no

dejando que hierva el medio y constantemente revolviéndolo. Esterilizar en autoclave a 121 oC

durante 15 minutos, dejamos enfriar a 50oC y agregamos asépticamente 7% (v/v) de sangre de

cordero estéril. Versar en cajas de petri y almacenar en refrigeración hasta su uso.

Técnica:La muestra se sembró por aislamiento en duplicado, y en otras dos cajas se sembró masivo, y se

llevo a incubar a 37oC por 24 horas.

Interpretación:La hemólisis producida en glóbulos rojos de cordero puede ser:

α HEMOLISIS: cuando los eritrocitos se lisan completamente alrededor de la colonia, produciendo

un viraje a verde-marrón del medio de cultivo.

(Sthaphylococcus pneumoniae o Sthaphylococcus viridans).

β HEMOLISIS: una zona clara decolorada alrededor de la colonia, por destrucción total de los

eritrocitos puede observarse perfectamente.

(Staphylococcus pyogenes grupo B o Sthaphylococcus agalactiae).

GAMMA HEMOLISIS: no hay actividad hemolítica aparente (Sthaphylococcus viridans o

Enterococcus)

ANEXO No. 5

AGAR SAL MANITOL

Fundamento:

Medio selectivo, preparado con las recomendaciones de Chapman para el aislamiento de

Sthaphylococcus que se suponen patógenos. La mayoría de las bacterias se inhiben por la

concentración de sal, con la excepción de algunas bacterias halófilas.

Se recomienda para la detección y enumeración de los Sthaphylococcus coagulasa positivo en

leches, alimentos y otras muestras.

Composición (g/l):

Lab lemco en polvo 1.0Peptona 10.0Manitol 10.0

Cloruro de sodio 75.0Rojo de fenol 0.025

Agar 15.0pH 7.5

Preparación:

Se suspenden 111 gramos en un litro de agua destilada y se hierve hasta que el medio quede

completamente homogéneo. Se esteriliza en autoclave a 121ºC durante 15 min.

Técnica:

Se siembra el inoculo con asa curva en el medio y se incuba a 37ºC por 24 horas y si las colonias

crecen muy despacio es necesario dejar el medio nuevamente en incubadora.

Aspectos de la colonia:

Staphylococccus coagulasa positivo Colonias con zonas brillantes amarillasCoagulasa negativa Colonias rodeadas de una zona rojo purpura

ANEXO No. 6

MEDIO XLD

Fundamento:

Fue formulado por Taylor para el aislamiento e identificación de Shigella a partir de muestras

fecales.

Se fundamenta en la fermentación de la xilosa, de carboxilacion de la lisina y la producción de

sulfhídrico para la diferenciación primaria de las shigella de las salmonellas de otras bacterias no

patógenas.

La fermentación rápida de la xilosa es prácticamente constante entre las bacterias entéricas,

excepto para algunos miembros de los grupos Shigella, Providencia y Edwardsiella.

El gran nivel del acido producido por la fermentación de la lactosa y la sacarosa, impiden que los

coliformes lisina positiva revierta el pH a un valor alcalino, y los patógenos sulfhídricos no

decarboxilan la lisina.


Extracto de levadura en polvo 3.0Clorhidrato de L-lisina 5.0

Xilosa 3.75Lactosa 7.5

Sacarosa 7.5Desoxicolato de sodio 1.0

Cloruro de sodio 5.0Tiosulfato de sodio 6.8

Citrato férrico amoniaco 0.8Rojo de fenol 0.08

agar 12.5pH 7.4+ o – 0.2

Preparación:

Se suspenden 53 g en un litro de agua destilada, se calienta con agitación frecuente hasta que el

medio hierve. No se debe sobrecalentar, se lleva a autoclavar por 15 min a 121ºC.

Deja enfriar a 50ºC, pronto como el medio se haya enfriado se vierte en placas.

Técnica:

Se siembra en placas, con asa curva, de la muestra proveniente de las cajas de los primeros

medios de repique, de las colonias a estudiar, se realiza por método de aislamiento.

Se incuba a 37ºC durante 18 a 24 horas.

Aspecto de las colonias

Salmonella Colonias rojas con el centroEdwardsiella negro

Shigella Colonias rojasProteus - Providencia

ANEXO No. 7

CATALASA (MERCK)

Fundamento

La catalasa es una enzima que se encuentra en todas las células con metabolismo aerobio.

Contiene hemina como grupo activo. Esta transforma el peróxido de hidrogeno tóxico, formado

durante el proceso metabólico en agua y oxigeno.

Siendo una característica taxonómica de los microorganismos y se utiliza para su diferenciación y

identificación.

ComposiciónSolución acuosa al 3% de peróxido de hidrogeno.

Técnica:Utilizando un asa metálica tomamos una porción de la colonia a investigar y la colocamos en un

portaobjetos seco, luego agregamos una gota del reactivo de catalasa.

Interpretación:Reacción positiva: desprendimiento inmediato de gas oxigeno sobre las bacterias.

Reacción negativa: no hay desprendimiento de gas.

Reacción MicroorganismoCatalasa-positiva Aerobios, propionibacterias, Staphylococcus sp.

Enterobacterias etc.Catalasa-negativa Anaerobios, propionibacterias, Staphylococcus

sp. Streptococcos sp. etc.

ANEXO No. 8

AGAR EOSINA AZUL DE METILENO EMB (OXOID)

Fundamento:Es un medio para el aislamiento y diferenciación de organismos de tipo coniformes como:

Escherichia coli y Enterobacter, según Levine (1818 – 1820) ya que el colorante que posee el

medio inhibe muchas bacterias gram positivas, gracias a la eosina y a el azul de metileno se

evidencia la fermentación de la lactosa.


Peptona 10.0Lactosa 10.0

Fosfato dipotasico 2.0Eosina amarillenta 0.4Azul de metileno 0.065

agar 15.0

Preparación:Se disuelve 37,4 g/l, y son llevados a ebullición hasta su completa disolución, luego se esteriliza en

autoclave a 121ºC durante 15 minutos, luego se versa en cajas de petri y se refrigeran a 4ºC hasta

su uso. El medio es de color rojo pardusco.

Técnica:

Este medio se sembró por aislamiento de la cepa que se aíslo del caldo BHI, se incubaron a 24

horas a 37ºC obteniendo colonias con las siguientes características:

Escherichia coli: colonias de 2 a 3 mm de diámetro, con brillo metálico verdoso a la

luz reflejada, con centro oscuro hasta negro en luz trasmitida (OXOID, 2000)

Salmonella – Shiguella: colonias transparentes, de color ámbar (OXOID, 2000)

ANEXO No. 9

SALMONELLA – SHIGUELLA S.S.

Fundamento:Es un medio diferencial selectivo para el aislamiento de Shiguella y Salmonella de muestras

patológicas, productos alimentarios.

Los agentes Gram positivos y los coliformes son inhibidos por la acción de los componentes verde

brillante, sales biliares, tiosulfato sódico y citrato. El tiosulfato en combinación con la sal de hierro

actúa como indicador de la producción de SH2, indicado por el ennegrecimiento del centro de la

colonia.


Polvo lab lemco 5.0Peptona 5.0Lactosa 10.0

Sales biliares 8.5Tiosulfato sódico 10.0

Citrato férrico 8.5Verde brillante 1.0

Rojo neutro 0.00033citrato sódicos 0.025

Agar 15.0pH 7.0

Preparación:Agregar 63 g a un litro de agua destilada y llevar a ebullición con agitación frecuente y luego a

vapor fluente hasta disolución del agar. No se debe autoclavar. Enfriar a 50ºC y se versa en cajas

de petri estériles.

Técnica:Sembrar el medio con la muestra procedente de los medios de cultivo que utilizamos como

controles para el aislamiento de todas las colonias encontradas, se uso la técnica de aislamiento,

se incubo a 18 – 24 horas a 35ºC.

Las bacterias no fermentadoras de lactosa son incoloras, mientras que los coliformes resistentes u

otros agentes fermentadores producen colonias rojas.

Control positivoSalmonella enteritidisShigella sonnei

Control negativoEnterococcus faecalis

ANEXO No. 10

OXIDASA

Preparación

Una solución reciente de 0,5% de clorhidrato de tetrametilparafenileno diamina es el más sensible

de los reactivos disponibles.

Una solución acuosa al 0,5 % de oxalato de para-aminodimetilanalina es bastante sensible y

comparativamente estable.

Algunas firmas ofrecen tiras preparadas para la prueba de la oxidasa, sin embargo no todas ellas

son tan sensibles como los reactivos líquidos y en el caso de Pasteurella multocida, un

microorganismo patógeno muy corriente en veterinaria, puede dar reacción negativa.

Técnica

Agrega unas gotas de reactivo liquido directamente al cultivo en placas de agar sangre o extender

algunas colonias sobre una toallita de papel y se agrega el reactivo.

Las colonias que producen citocromo oxidasa, tras algunos minutos, toman un tinte

rosa y después rojo y a veces negro.

Las tiras dan una coloración rosa evidente o un color púrpura, la colonia se debe

incubar a 37ºC, ya que se retrasa la reacción cuando esta a temperatura ambiente.

ANEXO No. 11

PRODUCCION DE COAGULASA

Esta prueba es usada para la identificación de Staphylococcus patógenos mas comunes como el

Staphylococcus aureus en humanos (Sánchez, 1998)

Procedimiento:Esta prueba debe realizarse en tubo inclinado plasma humano o de conejo estéril, se prepara una

suspensión de varias colonias de un cultivo que tenga 18 a 24 horas de incubación, en 0,5 ml de

caldo nutritivo (OXOID), agregamos 1 ml de plasma fresco e incubar a 37 oC.

Interpretación:Se observa a partir de las cuatro horas siguientes para ver la formación de coágulos.

Generalmente el Staphylococcus aureus puede coagular el plasma en este tiempo, algunas veces

se demora de 8 a 16 horas. Si el tiempo se prolonga mas de un día incubando la muestra,

debemos tener en cuenta la producción de estafiloquinasa por algunas cepas, lisando el coagulo

mostrando resultados falsos negativos. (Sánchez, 1998)

PRUEBAS BIOQUIMICAS

ANEXO No. 12

AGAR CITRATO SIMMONS (OXOID)

Es utilizado para la diferenciación de bacterias gram negativas sobre la base la utilización del

citrato. Koser en 1923, desarrollo un medio líquido consistente de sales inorgánicas en las cuales

la sal de amonio fue la única fuente de nitrógeno y el citrato la única fuente de carbono para

diferenciar especialmente las cepas de Escherichia coli y Enterobacter aerogenes como parte de

las reacciones INVIC.

Fundamento:

Los organismos hábiles para utilizar el amonio dihidrogeno fosfato y el citrato de sodio como la

única fuente de nitrógeno y carbono, pueden crecer sobre este medio, producen una reacción

alcalina donde vira el color del indicador azul de bromotimol de verde (neutro) a azul turquesa

(alcalino).


Amonio dihidrogeno fosfato 1.0Fosfato dipotasico 1.0

Citrato de sodio 2.0Cloruro de sodio 5.0

Sulfato de magnesio 0.2Agar 15.0

Azul de bromotimol 0.08

Preparación:

Suspender 24,2 g de medio en un litro de agua destilada, se disuelve calentándolo; luego se

distribuyen cantidades aproximadamente 5 ml en tubos de ensayo tapa rosca y se esteriliza a 121º

por 15 min, que posteriormente se deja solidificar inclinadamente y se almacenan en refrigeración

hasta su uso.

Técnica:

Se siembra en el medio la muestra por picadura, y en la superficie se hace una estría, únicamente

crecen en este agar los microorganismos capaces de utilizar el citrato como fuente de carbono.

Si hay solo crecimiento la prueba debe interpretarse como positiva indicando que la bacteria utilizo

la fuente de carbono del citrato sódico, si el crecimiento esta acompañado por un color azul

turquesa indicara la presencia de productos alcalinos, originados por la acción de la bacteria sobre

el fosfato de amonio extrayendo su nitrógeno y convirtiéndolo en un producto fuertemente básico

que es el amonio, ocasionando un viraje del pH del medio.

Positivo Color azul turquesanegativo Color verde (neutro)

ANEXO No. 13

AGAR LISINA HIERRO (LIA) (BBL)

Fundamento:Es útil para la demostración de lisina decarboxilasa (LD) y formación de acido sulfhídrico para la

identificación de la familia Enterobacteriaceae. La lisina al ser decarboxilada por microorganismos

LD-positivos, se transforma en cadaverina, amina que en medio acido provoca el viraje del

indicador púrpura de bromocresol, en el cual la lectura es K/K. Los microorganismos LD-negativo

fermentadores de glucosa producirán un viraje a amarillo de la totalidad del medio, la lectura es

A/A.

Los géneros Proteus, Providencia y Morganella desaminan la lisina generando acido-

acetocarbonico, que forma compuestos rojizos al mezclarse con sales de hierro en presencia de

oxigeno, la lectura es R/A.


Gelatina pancreática digerida 5.0Extracto de levadura 3.0

Dextrosa 1.0L-lisina 10.0

Citrato amonio férrico 0.5Tiosulfato sódico 0.04

Púrpura de bromocresol 0.02agar 13.5

Preparación:Se suspenden 33 g de medio en un litro de agua destilada mezclado; seguidamente se caliente

bajo constante agitación hasta que se disuelva por completo y es distribuido en tubos de ensayo,

para ser esterilizados en autoclave a 121oC durante 15 minutos y dejar enfriar en posición

inclinada.

Técnica:Este medio se inocula paralelamente a TSI y es llevado a incubar por 24 horas a 37oC.

Interpretación:

Decarboxilacion de la lisina Reacción alcalina púrpura en el fondoDeaminacion de la lisina Reacción de color rojo en el medio en la parte

superiorProducción de sulfuro de hidrogeno Presencia de precipitado negroReacción negativa Púrpura en la superficie y amarilla en el fondo,

indicando la fermentación de solamente la lactosa

ANEXO No. 14

TRIPLE AZUCAR HIERRO (TSI) (OXOID)

Fundamento:El medio tiene como objetivo la diferenciación de enterobacterias; realizan o no 4 procesos

bioquímicos a saber:

Fermentación de azucares: (lactosa, sacarosa, dextrosa) cuando se fermenta un

azúcar este da un productor de carácter acido lo cual hace que el medio vire.

Formación de H2S: algunos microorganismos transforman el tiosulfato de sodio en

sulfuro de hidrogeno (H2S) el cual reacciona con las sales de hierro que tiene el

medio y forma un precipitado negro insoluble (sulfuro ferroso). Para que un

microorganismo produzca H2S necesariamente necesita un medio acido, ya que en

este medio se proporcionan los hidrogeniones (H2) que forman el H2S, razón por la

cual esta formación solo se da cuando el medio vira a amarillo (acido por la

fermentación).

Producción de CO2 (gas): algunos microorganismos no solo tienen la capacidad

de fermentar los azucares sino también de descarboxilarlos hasta CO2,

observándose desplazamiento del medio, rompimiento de este o formación de

burbujas.

Degradación aeróbica de aminoácidos: en el slant del medio hay

microorganismos que en presencia de oxigeno son capaces de desdoblar péptidos

en aminoácidos, los cuales ricos en sus grupos amina (grupo básico) viran el color

del medio a púrpura o rojizo.


Lab– lemco en polvo 3.0Extracto de levadura 3.0

Peptona 20.0Cloruro de sodio 5.0

Lactosa 10.0Sacarosa 10.0Dextrosa 1.0

Citrato férrico 0.3Tiosulfato de sodio 0.3

agar 12.0

Preparación:Se suspende 60 g en 1 litro de agua destilada y se hierve hasta disolver el medio por completo. Se

mezcla bien y es distribuido en cantidades de 5 ml aproximadamente en tubos de ensayo, luego

se esteriliza a temperaturas no superiores a 121 oC durante 15 min, se deja que el agar solidifique

manteniendo los tubos inclinados en ángulo de 45º, de forma que se forme una masa de picadura y

una superficie inclinada.

Técnica:Empleando un asa recta, se toma la muestra de la colonia de un medio selectivo, se inocula el tubo

de TSI, se lleva a incubación por 24 horas para la lectura posterior:

Identificación: Fermentación de azucares:Positivo Acido (color amarillo)Negativo Alcalino o no hay cambio (color púrpura para

alcalino o naranja para no cambio)

Fermentación de H2S:Positivo Color negronegativo No color

Producción de CO2:Positivo Gasnegativo No gas

Degradación de aminoácidos:Positivo Púrpuranegativo Cualquier otro color

ANEXO No. 15

AGAR SULFURO INDOL MOTILIDAD (SIM) (OXOID)

Es un medio utilizado para la identificación de Enterobacteriaceae sobre la base de producción de

acido sulfhídrico evidenciado por la coloración negra debido a la unión de sales ferrosas; por la

producción de indol a partir de triptófano con el reactivo kovack y por la motilidad gracias a la baja

concentración de agar que se emplea.

Fundamento:Los ingredientes del medio SIM permiten la determinación de tres actividades por las cuales las

bacterias entéricas se pueden diferenciar:

El tiosulfato de sodio y el sulfato de amonio ferroso son indicadores de la producción de sulfuro de

hidrogeno. El sulfato de amonio ferroso reacciona con el gas H2S para producir sulfuro ferroso, un

precipitado negro.

La peptona de caseína es rica en triptófano transformándola en indol; la detección de motilidad es

posible debido a que el medio semisólido, hace que se forme tras el arrastre del asa una

viscosidad indicando la presencia de motilidad de la bacteria.


Digerido pancreático de caseína 20Digerido péptido de tejido animal .1

Sulfato amonio ferroso 0.2Tiosulfato sódico 0.2

agar 3.5

Preparación:Disolver calentando 36 g de medio SIM (sulfuro indol movilidad) en un litro de agua destilada, luego

se distribuye de 5-10 ml en tubos de ensayo, y se esteriliza en autoclave a 121oC por 15 min y se

deja enfriar en posición vertical.

Técnica:Sembrar en picadura con asa recta hasta la mitad de la altura de agar, incubar a 37oC por 24

horas.

Medio SIM + reactivo Kovack INDOL Resultadopositivo Halo color cerezanegativo Halo color amarillo

MEDIO SIM MOTILIDADPositivo Propagación del cultivo a partir de la línea de

siembranegativo No crecimiento difuso

MEDIO SIM H2SPositivo Presencia de color negronegativo No presencia

ANEXO No. 16

ROJO DE METILO – VOGES PROSKAWER (MERCK)

Fundamento:Sirve para la diferenciación bioquímica del grupo Coli-Enterobacter. El principio es determinar el

tipo de fermentación (acido mixta o butielenglicolica) que siguen los microorganismos a partir de la

glucosa.

Composición Caldo RM – VP (g/litro):

Peptona de carne 7.0Glucosa 5.0

Tampón de fosfato 5.0

Preparación:Se disuelve 18 g en un litro de agua destilada, se distribuye en tupos de tapa rosca, en una

cantidad de aproximadamente 5 ml por tubo, y se lleva a esterilizar a 121ºC por 15 min.

Reactivos:

α - naftol. KOH.

Técnica:

Los microorganismos inicialmente se siembran en un medio que contenga una fuente de glucosa

(Caldo RM-VP de Merck) y son incubados de 24 a 48 horas a 37ºC, luego se divide en dos tubos

por partes iguales, uno marcado para RM y otro para VP.

Al primer tubo se le adiciona 1 a 2 gotas de rojo de metilo.

Al segundo se le agrega una gota de KOH y luego α - naftol.

Interpretación:

ROJO DE METILO

Los microorganismos son capaces de desdoblar la glucosa hasta acido piruvico (glucólisis) y a

partir del acido piruvico pueden tomar varias vías:

Unas originan ácidos fuertes como acido acético, acido butírico, acido fórmico, acido succínico,

acido propionio, otras originan compuestos organitos como alcoholes (Etílico – butírico), productos

que se llaman ácidos mixtos (ácidos + alcoholes) teniendo la particularidad de acidificar el medio,

razón por la cual cuando se agrega el rojo de metilo esta vira hacia el lado acido de color rojo.

Positivo Fermentación acido mixta (colores rojos)negativo Neutro no vira el color

VOGES PROSKAWER

Algunos microorganismos no toman la anterior vía, sino desdoblan el acido piruvico en acetoina y

butilen glicol (colores azules). Al alcalinizar el medio con KOH y O2 atmosférico convierten la

acetoina (acetil metil-carbinol) en diacetilo y este diacetilo queda libre para que al agregar α- naftol-

creatina esta lo convierta en un producto coloreado rojizo.

A estos microorganismos se les ubica dentro de la fermentación butilen glicolitica producto final de

esta vía.

Positivo Color rojonegativo No viraje del color

ANEXO No. 17

AGAR UREA (OXOID)

Fundamento:

Es un medio útil para la diferenciación de Enterobacteriaceae productoras de ureasa; al ser

hidrolizada se produce amonio que reacciona con carbonato de amonio, compuesto que vira con

rojo de fenol. (OXOID, 1999)


Peptona 1Dextrosa 1

Cloruro disodico 5Fosfato disodico 1.2

Fosfato de potasio 0.8

Mezcla de sales biliares 1.5Agar 0.012

Rojo de fenol 15agar 6.8 + (-0.1)

Preparación:Se disuelve 50 g de agar para ser mezclado con un litro de agua destilada y llevado a ebullición

hasta su completa disolución: se esteriliza 20 min en autoclave 121ºC, se enfría hasta 50ºC y se le

adiciona 5ml de solución urea estéril al 40 % en condiciones asépticas, se versa en tubos y se

enfría en posición inclinada, almacenamos en refrigeración.

Técnica:Sembrar densamente con asa recta hasta la mitad, sirviendo el fondo como control negativo, luego

se incuba a 37ºC.

Interpretación:

Reacción positiva Hidrolizan la urea para formar amoniaco virando el color del medio a rojo púrpura

Reacción negativa Se evidencia un no cambio de color

Proteus produce de manera típica una reacción positiva en 24 horas.

La reacción de los gérmenes entéricos debe observarse tras una noche de incubación; pero para

algunos gérmenes, como Brucella, puede precisarse varios días de incubación.

ANEXO No. 18

NITRITOS

Reactivos erlich

Preparar 200 ml de solución de acido acético 5 N mediante la adición de 56,8 ml de acido glacial a

143 ml de agua. Se divide en dos partes de 100 ml cada uno.

Luego se agrega 0,8 g de acido sulfanilico a 100 ml de acido 9 acético 5 N, agregamos 0,5 g de 1-

naftilamina a 100 ml.

Preparación

Añadir 2 g de agar a 25 g de medio indol nitrato y disolver en un litro de agua calentando, luego se

distribuye de 5 ml aproximadamente, en tubos tapa rosca, esteriliza en autoclave a 121ºC por 15

min, se deja enfriar los tubos en posición vertical.

Técnica

Sembrar por picadura en profundidad hasta la mitad del medio aproximadamente, luego de

incubarse se le agrega 2 gotas del reactivo erlich.

PositivoColor rojo

Pseudomonas - Bacillus pueden desnitrificar el nitrato; es decir pueden reducir

el nitrato a nitrito y este a nitrógeno gaseoso.

Cuando hay presencia de exceso de gas, desnitrificación que pueden ser

sospechosos para muestras negativas, se le agrega a estos cultivos polvo de zinc.

positiva negativaSi después de la adición de zinc en polvo,

produce un color rojo

La bacteria ha reducido los nitratos a nitrógeno

gaseoso y el organismo recibe la denominación

de nitrato positivo

ANEXO No. 19

MEDIOS CON AZUCARES

Preparación del medio

Suspender 28,5 g de medio CTA en un litro de agua destilada, se homogeniza y se distribuye en

tubos de 5 ml tapa rosca, luego se esteriliza en autoclave a 121ºC por 15 min.

Técnica

Se siembra los tubos, tomando la muestra y homogenizando la muestra continuamente para no

perder nada de esta que se encuentre adherida a el asa redonda, las reacciones se evidencian a

las 24 o 48 horas.

Interpretación

Usualmente están constituidos por agua peptonada a la que se le ha adicionado determinado

azúcar a una concentración de 1 %.

Para demostrar la fermentación se agrega un indicador (rojo neutro). El cambio de color indica la

producción de acido.

Los azucares son también incorporados en medios sólidos por ejemplo en la diferenciación de

microorganismos en las heces (Mac Conkey, S.S.) y también para la diferenciación de Neisserias.

ANEXO No. 20TINCION DE GRAM (MERCK)

La coloración de Gram, se desarrollo por Christian Gram en 1823. Las bacterias se agrupan en

Gram positivas o Gram negativas según retengan o no la violeta de genciana.

Las bacterias Gram positivas toman la violeta y no se decoloran al tratarlas con alcohol o alcohol –

acetona, las bacterias Gram negativas pierden la violeta al ser tratadas con el alcohol y se colorean

con el colorante de contraste: safranina o fushina y por lo tanto se tiñen de color rosado.

Reactivos:CRISTAL VIOLETA

Solución A: se prepara triturando 2 g de cristal violeta en mortero, agregando poco

a poco 20 ml de etanol al 95% y se guardan en un frasco ámbar.

Solución B: se disuelve 0.8g de oxalato de amonio en 80ml de agua destilada.

Solución de trabajo: en un frasco ámbar se diluyen la solución A en porciones 1:3 y

se adiciona 4 partes de la solución B; conservamos 24 horas antes de su uso se

filtra lo que se va a utilizar.

LUGOL DE GRAM

Se coloca en un mortero 1g de yodo y 2 g de yoduro de potasio, se agregan 300ml

de agua destilada poco a poco y se almacena en un frasco ámbar.

DECOLORANTEALCOHOL ACETONA

Alcohol etílico de 95º

SAFRANINAFUSCHINA DE GRAM

Solución madre: se trituran 2.5g de safranina en mortero, agregando poco a poco

100ml de etanol de 95º y se almacena en un frasco ámbar.

Solución de trabajo: en otro frasco ámbar se agrega 10ml de solución madre

filtrada, con 90 ml de agua destilada.

Técnica:Se toma una lamina portaobjeto limpia en la cual ser realiza una emulsión de la bacteria pura con

una gota de agua, se deja secar a temperatura ambiente, luego es fijada al calor en un mechero

bunsen.

Se inicia el proceso de coloración de acuerdo a los tiempos establecidos en cada laboratorio:

Se cubre la lámina con cristal violeta por 1min.

Lava con abundante agua destilada y se escurre.

Se aplica lugol durante 1min.


Se agrega alcohol acetona durante 15min.


Se adiciona por ultimo safranina por 1 min.

Lava con abundante agua destilada, se escurre y se deja secar a temperatura

ambiente.

Se observa al microscopio en 100x con aceite de inmersión.

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