Determinacion de biomasa_microbiana

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DETERMINACIÓN DE LA BIOMASA MICROBIANA

DETERMINACIÓN DE

LA BIOMASA

MICROBIANA

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I. INTRODUCCIÓN

Biomasa es un termino general que se refiere a los M’os presentes en un sistema.

Cantidad

células personas masa de

seres vivos

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I. INTRODUCCIÓN

La determinación de la biomasa es una de las variables más importantes de un bioproceso

su determinación nos lleva a la comprensión de la eficiencia del mismo.

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I. INTRODUCCIÓN

Es una variable

clave para establecer:

Consumo de

nutrientes

Calculo de balance de masas de cualquier proceso

biológico.

Tasas de producción

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I. INTRODUCCIÓN

• Existen 2 métodos principales de estudiar

poblaciones microbianas en la naturaleza:

MÉTODO DIRECTO

MÉTODO INDIRECTO

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Observación de los organismos

En el microscopio óptico

Conteo del número de M’os

A. MÉTODO DIRECTO

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• Requiere de preparaciones puras sin ningún tipo

de partículas que puedan interferir en los

resultados y:

Se refiere básicamente a la medida de la masa

celular.

A. MÉTODO DIRECTO

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A. MÉTODO DIRECTO

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• La cantidad total de biomasa presente en una

muestra puede medirse:

En términos de peso seco por unidad de

volumen.

PESO SECO

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PESO SECO

Los componentes volátiles de las células pueden perderse en el secado.

La muestra seca puede recobrar humedad durante el pesado.

DESVENTAJAS

Se puede determinar M’os activos y no, material inerte, materia orgánica y polímeros extracelulares.

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• Se obtiene a partir de una muestra ensuspensión que es pesada luego de laseparación de las células por filtración ocentrifugación.

PESO HÚMEDO

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PESO HÚMEDO

Técnica útil para grandes volúmenes

de muestra

El diluyente queda atrapado en el

espacio intercelular y contribuye al peso

total de la masa.

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MÉTODOS INDIRECTOS

Actividad metabólica

Consumo de un nutriente

característico

Métodos turbidimétricos

Espectrofotométricos

Nefelométricos

Determinación nitrógeno total

B. MÉTODOS INDIRECTOS

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B. MÉTODOS INDIRECTOS

Medidas de turbidez

Los métodos turbidimétricos de análisis tienen como fundamento:

La formación de partículas de pequeño tamaño que causan la dispersión de la luz

cuando una fuente de radiación incide sobre dichas partículas.

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El grado de dispersión de la luz (o turbidez de la

solución) es proporcional al número de partículas que se encuentran a su

paso, lo cual depende de la cantidad de analito

presente en la muestra.

B. MÉTODOS INDIRECTOS

Medidas de turbidez

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• Se trata de una serie de patrones de turbidez

previamente calibrados.

B. MÉTODOS INDIRECTOS

Escala de Mc Farland

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• Se basa en la capacidad de:

1% de Cl2Ba

Cantidades crecientes de SO4H2

al 1%

Precipitado de BaSO4

B. MÉTODOS INDIRECTOS

Escala de Mc Farland

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Su utilidad es la de poder elaborar suspensiones bacterianas,

Ajustadas a un patrón y valorar su

concentración

B. MÉTODOS INDIRECTOS

Escala de Mc Farland

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• Se caracteriza por su precisión, sensibilidad y su

aplicabilidad a moléculas de distinta naturaleza

(contaminantes, biomoléculas, etc.) y,

Estado de agregación (sólido, líquido, gas).

B. MÉTODOS INDIRECTOS

Espectrofotometría

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• Las principales ventajas de la

espectrofotometría son:

Sensibilidad relativa elevada.

Facilidad para realizar mediciones rápidas.

Grado de especificidad relativamente elevado.

B. MÉTODOS INDIRECTOS

Espectrofotometría

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• Los espectros de absorción se miden mediante

un instrumento denominado espectrofotómetro.

B. MÉTODOS INDIRECTOS

Espectrofotometría

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• El espectrofotómetro, mide la absorbancia, A,

que se define por:

T= transmitancia

D.O. = A = -logT/100

Mide la densidad óptica (D.O.), es decir la absorbancia.

B. MÉTODOS INDIRECTOS

Espectrofotometría

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II. OBJETIVOS

• Lograr determinar la biomasa Microbiana, a

través de diversos métodos.

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III. MATERIALES Y MÉTODOS

• Métodos directos: determinación del pesohúmedo y peso seco

Materiales:

Levadura de panificación “Fleishmann”

Agua destilada

Pipetas de 5ml

Tubos de ensayo

Balanza analítica

Centrifuga

Estufa

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III. MATERIALES Y MÉTODOS

• Métodos directos: determinación del peso

húmedo y peso seco

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III. MATERIALES Y MÉTODOS

• Peso Seco:

Tomar muestras de 5 mL de la solución inicial y

colocar en 3 tubos de ensayos previamente pesados.

Luego llevar los tubos a la centrifuga y hacerlo girar

a 4 000 rpm, por un tiempo de 10 minutos.

Luego pesar cada tubo de ensayo en la balanza

analítica y anotar los pesos.

Posteriormente, llevar los tubos a estufa, a una Tº de

105 ºC por un tiempo promedio de 3 horas.

Pasado el tiempo anotar, los pesos y luego obtener

un promedio. (Anexo 1).

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III. MATERIALES Y MÉTODOS

Por ultimo expresar los datos en la siguiente

formula.

Fuente: Arnáiz,C,Determinación De La Biomasa En Procesos Biológicos. Sevilla

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III. MATERIALES Y MÉTODOS

• Peso Húmedo:

Tomar muestras de 5 mL de la solución inicial y

colocar en 3 tubos de ensayos previamente

pesados.

Llevar los tubos a la centrifuga, donde se hacen

girar a 4 000 r.p.m., por un tiempo de 10

minutos.

Luego pesar cada tubo de ensayo en la balanza

analítica, anotamos los pesos y luego promediar

(Anexo 1).

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III. MATERIALES Y MÉTODOS

Por ultimo expresar los datos en la siguiente

formula.

Fuente: Arnáiz,C,Determinación De La Biomasa En Procesos Biológicos. Sevilla

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Figura 01: Metodología de peso seco y húmedo

Fuente: Google Imágenes

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III. MATERIALES Y MÉTODOS

• Métodos indirectos: determinación de turbidez a través

de la Escala de McFarland y espectrofotometría Materiales:

cepa de E. coli

Agar Nutritivo

Solución Salina 0.85%

BaCl2 1%

H2SO4 1%

Agua destilada estéril

Tubos de ensayo

Pipetas

Espectrofotómetro

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III. MATERIALES Y MÉTODOS

• Métodos indirectos: determinación de

turbidez a través de la Escala de McFarland

y espectrofotometría

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III. MATERIALES Y MÉTODOS

• Nefelométria de McFarland:

Agregar los reactivos a los tubos rotulados de

manera apropiada (1 a 10) en las cantidades que

se indican a continuación:

Estándares de sulfato de bario

Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

BaCl2 1%(ml) 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0

H2SO4 1%(ml) 9.9 9.8 9.7 9.6 9.5 9.4 9.3 9.2 9.1 9

Densidad aprox. De

células (x108/ml3 6 9 12 15 18 21 24 27 30

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III. MATERIALES Y MÉTODOS

Sellar los tubos y rotular. El precipitado de BaSO4

suspendido corresponde aproximadamente a la

densidad de células homogéneas de

Escherichia coli por mililitro.

Luego, se toma una alícuota de la muestra de

bacterias.

Se inocula en un tubo contenido de solución

salina fisiológica (0,85%) y se procede a

comparar el tubo con los de la escala estándar y

obtener los resultados de la densidad.

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Figura 02: Escala de Mc Farland

Fuente: Google Imágenes

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III. MATERIALES Y MÉTODOS

• Espectrofotometría:

En el espectrofotómetro establecer laabsorbancia a 546 nm de longitud de onda, decada uno de los tubos de la escala deMacFarland.

Con estos datos, teniendo en cuenta lasconcentraciones celulares correspondientes acada tubo y mediante el uso de un papelmilimetrado semilogarítmico establezca unacurva patrón de número de bacterias con relacióna la absorbancia.

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III. MATERIALES Y MÉTODOS

Prepare diluciones seriadas de la muestrabiológica en SSF. Para ello, utilice los tubos de15x125mm y las pipetas estériles. Realice lassiguientes diluciones: 10-1, 10-2,10-3,10-4,y 10-5.

Establezca la absorbancia de las diluciones y através de la curva patrón determine el número debacterias presentes en cada dilución y teniendoen cuenta el factor de dilución del tubo trabajado,establezca el número de bacterias por mililitro.

Promediando estos datos, determine el númerode bacterias presente en la muestra.

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Figura 03: Espectrofótometro

Fuente: Google Imágenes

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III. MATERIALES Y MÉTODOS

Adicional a esto realice una siembra

incorporación de las muestras en una placa con

agar nutritivo, incubarlas a 37ºC por horas;

realice un recuento y compare si los resultados

obtenidos concuerdan con lo esperado.

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Figura 04: siembra por incorporación

Fuente: propia

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Gracias por su

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