DETERMINACIN DE BIOMASAI. INTRODUCCINLa determinacin de la biomasa es una de las variables ms importantes en un bioproceso, ya que su determinacin nos lleva a la comprensin de la eficiencia del mismo. Se trata de una variable clara para establecer las tazas de produccin, de consumo de nutrientes y el clculo de los balances dems de cualquier proceso biolgico.Los mtodos clsicos de determinacin de biomasa son mtodos directos que se basan en el nmero de clulas o en el peso celular. Los mtodos de enumeracin celular, son mtodo de observacin, basados en propiedades fsicas o en la actividad biolgica. Actualmente hay un gran inters en mtodos alternativos de determinacin de la biomasa. Estos mtodos son indirectos y estiman algn componente celular o alguna actividad metablica especifica. No requieren el examen visual de los organismos ni su incubacin.II. OBJETIVOS

Objetivo General:

Determinar la concentracin de clulas por conteo en cmara Neubauer. Expresndolas en unidades de clulas/mL.Objetivo Especfico: Reconocer la tcnica de contaje en Cmara Neubauer. Comparar estadsticamente los valores de concentracin obtenidos; de manera general y manera aleatoria, mediante los mtodos de variabilidad y desviacin estndar.

III. FUNDAMENTO TERICOBiomasa es un trmino general que se refiere a los microorganismos presentes en un sistema. A la vez tambin se puede referir como la cantidad de clulas, de personas o masa de seres vivos. El objetivo de la biomasa es la reproduccin de clulas.La determinacin de biomasa es una de las variables ms importantes en un bioproceso, ya que su determinacin nos lleva a la comprensin de la eficiencia del mismo. Se trata de una variable clara para establecer las tazas de produccin, de consumo de nutrientes y el clculo de los balances dems de cualquier proceso biolgico. Una variedad de anlisis estn disponibles para la determinacin de Biomasa de muestras biolgicas (en nuestro caso de la levadura Saccharomyces cerevisae).A. Mtodos directos de determinacin de biomasa: Se basan en el nmero de clulas o en el peso celular, dentro de estos mtodos podemos distinguir a los siguientes:

1. Mtodos gravimtricos (Peso Seco)La cantidad total de biomasa presente en una muestra puede medirse en trminos de peso seco por unidad de volumen, ya sea como slidos en suspensin totales (SST) o slidos en suspensin voltiles (SSV). Las clulas se separan del lquido bien por centrifugacin bien por filtracin. Se expresan en g.m.s/mL.

2. Mtodos espectrofotomtricos.Se basan en la existencia de una relacin directa entre el nmero total de microorganismos presentes en una muestra y su valor de turbidez. Tras la determinacin de la turbidez de la suspensin celular mediante espectrofotometra, el resultado se expresa en unidades de absorbancia. 3. Mtodos microscpicos de recuento celular en cmarasEl recuento de microorganismos se realiza en la cuadrcula central de la cmara y se multiplica por la profundidad, obtenindose el nmero de microorganismos por unidad de volumen (nmero de clulas/ml, generalmente).

a. CMARA DE NEUBAUER. Es una cmara de contaje adaptada al microscopio de campo claro o al de contraste de fases. Se trata de un portaobjetos con una depresin en el centro, en el fondo de la cual se ha marcado con la ayuda de un diamante una cuadrcula como la que se ve en la imagen. Es un cuadrado de 3 x 3 mm, con una separacin entre dos lneas consecutivas de 0.25 mm. As pues el rea sombreada y marcada L corresponde a 1 milmetro cuadrado. La depresin central del cubreobjetos est hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de forma que cuando se cubre con un cubreobjetos ste dista de la superficie marcada 0.1 milmetro, y el volumen comprendido entre la superficie L y el cubreobjetos es de 0.1 milmetro cbico, es decir 0.1 microlitro.Conteo en cmara de Neubauer, Esta cmara se utiliza para conteo celular. Limpie la cmara y la laminilla de cuarzo suavemente con alcohol. Revise la laminilla de cuarzo que no debe estar desbordada o quebrada. Coloque la laminilla de cuarzo sobre la cmara en forma vertical, este debe quedar centrada. Proceda a llenar la cmara. Este paso es muy importante y definitivo en la distribucin de las clulas. Es recomendable llenarla con micropipeta pequea o con una jeringa ya que la cmara se llena con una gota. El llenado debe ser continuo en un solo intento. La cmara no puede quedar seca esto se detecta porque en las esquinas del recuadro de llenado se ven porciones secas. Tampoco se debe inundar, la apariencia en la cmara es de lquido abundante en las terminaciones del recuadro.Figura 1. Conteo por Cmara Neubauer. Representacin de la cuadricula 10 X.

IV. MATERIALES Y MTODOS

B. Metodologa

Con una jeringa se tomar una cantidad de la solucin previamente preparada la cual se encuentra en un tubo de ensayo en dilucin a la 10 -1 y se dejar caer unas gotas en la cmara de Neubauer. Se colocar la laminilla cubreobjetos sobre la portaobjetos en la zona central, para apreciar una zona cuadriculada. Con la ayuda de una jeringa se obtendr una pequea muestra del tubo de ensayo, y se colocar en el borde del cubreobjetos. Se dejar que la solucin ingrese a la cmara por capilaridad, sin que pase a los canales laterales. Una vez que la muestra ingrese por la cmara de Neubauer, se dejar reposar, y posteriormente, se colocar en el microscopio. Se realizar la cuantificacin de clulas en las zonas de los cuadrados ms pequeos de 0.05 mm. tomando precauciones para evitar contar dos veces la misma clula u omitir alguna. Se contarn las clulas que estn dentro de los cuadrados las que se noten bien y las clulas que estn en el lado superior y lado izquierdo de cada cuadrado de 4 x 4. Luego de calcular las clulas en los cuadrados intermedios, extremos y los determinados al azar, se deber calcular el nmero de clulas/ mL (por cuadrado), y por medio de la siguiente frmula, se determin el nmero de clulas por mililitro. A la vez se deber calcular la desviacin estndar de las 25 celdas. Luego tomaremos 5 celdas al azar de la cual deberemos calcular su variabilidad (coeficiente) y su desviacin estndar para luego hacer una comparacin.

PROCEDIMIENTO1 mL1 mL1 mL1:1001:1,0001:10,0001:100,000 Agita el cultivo, usa una pipeta cuenta gotas para transferir 1 mL de cultivo a una probeta de 10 mL; agrega 9 mL de agua de la llave y vaca en un tubo de ensayo. Este procedimiento diluye el cultivo por un factor de 10. Observa la muestra diluida en el microscopio, si todava hay demasiadas clulas repite el proceso de dilucin tan frecuente como sea necesario en tanto multipliques el factor de dilucin por 10 cada vez.

V. RESULTADOS Y DISCUSIONES

Tabla 1. Conteo de Clulas en Cmara Neubauer

Tabla 2. Concentracin de las clulas en las 25 celdas, Desviacin estndar y coeficiente de Variacin 0.004

Tabla 3. Al azar 5 Clulas de las 25 celdas de la Cmara Neubauer

V. CONCLUSIONES Se determin la biomasa expresada en clulas/ml en una solucin de levadura.

Se aprendi el mtodo de recuento en la cmara de Neubauer. Las rutas metablicas entre las levaduras son idnticas, sugiriendo la conformacin de un grupo metablico idntico.

VI. RECOMENDACIONES

El margen de error en los clculos debe ser mnimo.

Jos Vctor Becerra Cotrina Ecologa