Detección de Salmonella en

alimentosAguirre Coria Claudia Corona Leo Lizbeth Sandra Olvera Rodríguez Carlos Flores Juárez Geovani Espinosa Monsalvo Maribel

Objetivo:

Conocer las técnicas más comunes para la detección de estos microorganismos patógenos.

Medios que se utilizaran:• Agua peptonada.• Caldo lisina desoxicolato XLD.• Agar verde Rapapport Vassiliadis.• Agar xilosa brillante.

Medios para la identificación

bioquímica.

• Agar triple azúcar hierro TSI.• Agar lisina descarboxilasada LIA.• Agar citrato de Simmons.• Caldo urea.

Procedimiento

1.-Preenriquecimiento:

Transferir 25g o 25ml del matraz con 225ml de agua peptonada, incubar a 35º C durante 24 h.

Agua peptonada

•Asegura a mantener el pH durante 24horas, lo que sumado al período de incubación permite el incremento de células que son sensibles a la disminución del pH. •A éstos medios se les puede adicionar sustancias que contrarresten las sustancias inhibidoras que están presentes en algunos alimentos; asimismo se debe asegurar el pH que es un factor muy importante para el crecimiento de Salmonella.

2.-Enriquecimiento:

Transferir 0.1ml del cultivo anterior a un tubo con 9.9ml de caldo Rapapport Vassiliadis. Incubar 24 h a 42 º C.

Caldo Rapapport Vassiliadis

• Las peptonas proporcionan los nutrientes necesarios para el desarrollo del microorganismo.

• El cloruro de sodio ayuda a mantener el equilibrio osmótico. • El verde de malaquita y el cloruro de magnesio, favorecen el

crecimiento de Samonella. • El fosfato de potasio controla el pH del medio.

3.- Aislamiento:

Sembrar por estría simple dos placas de agar XLD Y BGA. Incubar 24 h a 37 º C.

Precipitado negro en el centro de las colonias

agar XLD

Las colonias típicas de Salmonella son

traslúcidas, ligeramente rojas a rosa con halo rojo

brillante.

• La presencia del desoxicolato de sodio es el agente que inhibe a los microorganismos Gram positivos.

• La xilosa es fermentada por casi todos los microorganismos entéricos a excepción de Shigella.

• La lactosa y la sacarosa inducen la producción de ácido por los coliformes.

• El tiosulfato de sodio y el citrato férrico de amonio constituyen el sistema indicador de la formación de ácido sulfhídrico produciendo un precipitado negro en el centro de las colonias.

• Escherichia coli, Klebsiella, Enterobacter y algunas especies Proteus pueden utilizar mas de un carbohidrato y producen colonias amarillo brillante.

• El género Salmonella desarrolla colonias rojas con centro negro por la producción de ácido sulfhídrico.

• Shigella, Providencia, y algunas especies Proteus no utilizan ningún carbohidrato y desarrollan colonias traslucidas. Citrobacter desarrollas colonias amarillas con centro negro.

Agar xilosa lisina desoxicolato XLD

Agar verde brillante BGA

• Medio selectivo para el aislamiento de Salmonella (excepto S. Tyfhi y Shigella)• La selectividad de este medio, se basa en la concentración del

verde brillante, que inhibe las bacterias Gram positivas y la gran mayoría de los Gram negativos.

• La lactosa y la sacarosa permiten diferencia la flora acompañante lactosa positiva y lactosa negativa-sacarosa positiva, basándose en características de Salmonella de no degradar dichos carbohidratos.

• Las colonias típicas de Salmonella son traslúcidas, ligeramente rojas a rosa con halo rojo brillante.

• Los organismos fermentadores de lactosa y sacarosa que desarrollan en el medio se diferencian fácilmente por la formación de colonias amarillo verdosas rodeadas de una zona amarillo verdosa intensa.

4.- Identificación bioquímica:

Seleccionar al menos 2 colonias típicas sospechosas que se encuentren bien aisladas de cada placa. Transferir con un asa cada colonia seleccionada a la siguiente serie de tubos.

• Agar TSI: Sembrar por picadura en el fondo y por estría en la superficie.

• Agar LIA: Sembrar por picadura en el fondo y por estría en la superficie.

• Agar Citrato de Simmons: Sembrar por picadura el fondo y por estría el la superficie.

• Caldo urea: Inocular el caldo.

Incubar todos los tubos de pruebas bioquímicas a 35o C por 24 h. comprobar los resultados de las pruebas con la tabla de

resultados de los microorganismos enteropatógenos.

Agar triple azúcar de hierro TSI

• Para diferenciación de Enterobacterias basándose en las capacidad para utilizar la glucosa, lactosa y sacarosa los cual permite el reconocimiento y exclusión del genero Proteus. Se puede observar formación de sulfuros.

• La fermentación de la lactosa y sacarosa se observa en la superficie y de la glucosa en el fondo, con formación de ácido que se manifiesta por cambio de color del indicador Rojo de fenol que vira de anaranjado rojizo a amarillo.

• La combinación del citrato férrico de amonio y tiosulfato de amonio permite la detección de sulfuro de hidrogeno por la formación de un precipitado negro.

Agar lisina descarboxilasa LIA

• La peptona de gelatina funciona como soporte de crecimiento, el extracto de levadura proporciona la fuente de vitaminas necesarias y la dextrosa el carbohidrato fermentable.

• En este medio se observa la fermentación de glucosa, producción de ácido sulfhídrico, la descarboxilación u desaminación de la lisina.

• Los microorganismos tienen enzima descarboxilasa, descarboxilan el aminoácido lisina a cadaverina (amina primaria, liberando CO2) , debido a la alcalinidad, el pH se modifica con los siguientes resultados: La prueba se considera POSITIVA si la coloración en el fondo se observa morada o violeta-púrpura.

• NEGATIVA si la coloración en el fondo es amarilla y la superficie permanece del color del medio, ya que solo hay fermentación de glucosa.

• La desaminación de la lisina a ácido cetocarbónico, este forma compuestos pardo-rojizos en el pico de flauta del medio con la sal de hierro y por la acción del oxigeno.

• La formación del ácido sulfhídrico da una coloración negra debida al sulfuro de hierro producido.

Agar Citrato de Simmons

• Para la identificación de Enterobacterias, basándose en el citrato como única fuente de carbono.

• El cloruro de sodio mantiene el equilibrio osmótico del medio.

• Cuando las bacterias utilizan el citrato, el medio se alcaliniza y cambia de color inicial verde (neutro), que esta dado por la presencia de azul de bromotimol a color azul (alcalino, prueba positiva)

• La reacción negativa se manifiesta por la ausencia de crecimiento y no hay cambio de color.

Caldo urea• Utilización de urea como fuente de

carbono.• La enzima ureasa hidroliza la urea en

amoniaco y anhídrido carbónico, ante la variación del pH por la alcalinización el indicador Rojo Fenol, vira de amarillo claro a ligeramente rosado o rosa mexicano.

• Se utiliza solamente para la detección de la ureasa en especies del género Proteus.

• Si los nutrientes suministrados por el extracto de levadura se consumen antes que la bacteria muestre crecimiento no podrá determinarse con exactitud su capacidad de hidrolizar urea.

• Pero si es capaz de hidrolizar la urea, pero no utilizar el amoniaco como fuente de nitrógeno, no se produce crecimiento y puede dar un falso negativo.

Caldo Rapapport Vassiliadis

FORMULA EN GRAMOS POR LITRO DE AGUA DESTILADA

• Cloruro de magnesio hexahidratado. 29.0• Peptona de caseína. 4.0• Cloruro de sodio. 8.0• Peptona de soya. 1.0• Fosfato monobásico. 0.4• Verde de malaquita. 0.036

Agar xilosa lisina desoxicolato XLD

FORMULA EN GRAMOS POR LITRO DE AGUA DESTILADA

• Agar. 13.5• Citrato férrico.

0.8• Cloruro de sodio. 5.0• Desoxicolato de Na. 2.5• Extracto de levadura 3.0• Lactosa.

7.5

• L-Lisina. 5.0• Rojo fenol. 0.085• Sacarosa. 7.5• Tiosulfato de Na. 6.8• Xilosa. 3.5

Agar verde brillante BGA

FORMULA EN GRAMOS POR LITRO DE AGUA DESTILADA

• Agar. 20.0• Cloruro de Na. 5.0• Extracto de carne.3.0• Lactosa. 10.0

• Peptona especial. 10.0• Rojo de fenol. 0.08• Sacarosa. 10.0• Verde brillante. 0.0125

Agar triple azúcar de hierro TSI

FORMULA EN GRAMOS POR LITRO DE AGUA DESTILADA

• Agar. 13.0• Cloruro de Na. 5.0• Dextrosa. 1.0• Lactosa. 10.0• Peptona especial. 20.0

• Rojo de fenol. 0.025• Sacarosa. 10.0• Sulfato de hierro y

amonio. 0.2• Tiosulfato de Na. 0.2

Agar lisina descarboxilasa LIA

FORMULA EN GRAMOS POR LITRO DE AGUA DESTILADA

• Agar. 13.5• Citrato férrico de amonio. 0.5• Dextrosa. 1.0• Extracto de levadura. 3.0• L-Lisina. 10.0• Peptona de gelatina. 5.0• Púrpura de bromocresol. 0.02• Tiosulfato de Na. 0.04

Agar Citrato de Simmons

FORMULA EN GRAMOS POR LITRO DE AGUA DESTILADA

• Agar. 15.0• Azul de bromotimol. 0.08• Citrato de Na. 2.0• Cloruro de Na. 5.0• Fosfato dihidrogenado de amonio. 1.0• Fosfato dipotásico. 1.0• Sulfato de magnesio. 0.2

Caldo urea

FORMULA EN GRAMOS POR LITRO DE AGUA DESTILADA

• Extracto de levadura. 0.10• Fosfato monopotásico. 9.10• Fosfato disódico. 9.50• Rojo de fenol. 0.01• Urea. 20.0