Detección y cuantificación automática de la frecuencia ...

Detección y cuantificación automática de lafrecuencia cardíaca en la larva del pez

cebra

Miguel Ángel Landa Jiménez

December 8, 2013Version: 1.0

Universidad Veracruzana

Centro de Investigaciones CerebralesMaestría en Inteligencia Artificial

Detección y cuantificación automáticade la frecuencia cardíaca en la larva del

pez cebra

T E S I S

que para obtener el grado de:

Maestro en Inteligencia Artificial

presenta:


Director Dr. Luis Beltrán Parrazal y Dr. Héctor GabrielAcosta Mesa

1. Revisor Dra. Consuelo Morgado ValleCentro de Investigaciones CerebralesUniversidad Veracruzana

2. Revisor Dr. Nicandro Cruz RamírezDepartamento de Inteligencia ArtificialUniversidad Veracruzana

3. Revisor Dr. Homero Vladimir Ríos FigueroaUniversidad VeracruzanaDepartamento de Inteligencia Artificial

December 8, 2013

Miguel Ángel Landa JiménezDetección y cuantificación automática de la frecuencia cardíaca en la larva del pez cebraTesis, December 8, 2013Revisores: Dra. Consuelo Morgado Valle y Dr. Nicandro Cruz Ramírez y Dr. HomeroVladimir Ríos Figueroa

Director: Dr. Luis Beltrán Parrazal y Dr. Héctor Gabriel Acosta Mesa

Universidad VeracruzanaMaestría en Inteligencia ArtificialDepartamento de Inteligencia ArtificialSebastian Camacho No. 5 Zona Centro91000

iv

Resumen

El zebrafish (Danio rerio), debido a su accesibilidad óptica y similaridad al humanoha emergido como un nuevo modelo para investigación cardíaca. En experimentosfisiológicos, tales como los llevados a cabo para examinar los efectos de productosquímicos y estrés, el latido del corazón es un indicador altamente sensible a larespuesta del pez. Aunque existen varios métodos para evaluar la frecuencia cardíacaen embriones de pez cebra, la mayoría son técnicas de trabajo intensivo, consumenmucho tiempo y requieren un operador hábil para realizar los experimentos. Usandoun microscopio invertido, una cámara web de bajo costo y técnicas de procesamientodigital de imágenes hemos desarrollado un método no invasivo para evaluar lafrecuencia cardíaca en larvas de zebrafish. La frecuencia cardíaca fue determinadamediante el análisis de la luminosidad del corazón y el análisis del espectro defrecuencias del ritmo cardíaco. El ritmo cardíaco medido con nuestro método enembriones de zebrafish a las 72 horas post fertilización fue similar al determinadopor conteo manual. Adicionalmente, nuestro método fue evaluado usando cafeína,una droga que afecta el ritmo cardíaco. Dadas las ventajas del análisis digitalde imágenes nuestro método puede ser potencialmente aplicado en estudios decardiotoxicidad.

Abstract

The zebrafish (Danio rerio) has emerged as a new model for cardiac research due toits optical accessibility and similarity to humans. In physiological experiments, suchas those carried out to examine the effects of chemicals and stress, heartbeat is ahighly sensitive indicator of the fish response. Although there are several methodsto assess heart rate in zebrafish embryos , most of the techniques are labor intensive,time consuming and require a skilled operator to perform the experiments. Using aninverted microscope, a webcam and digital image processing techniques we havedeveloped a simple, noninvasive method to assess heart rate in zebrafish larvae.

v

Heart rate was determined by quantifying the heart’s brightness changes and thefrequency spectrum analysis of heart rate signal. The heart rate measured with ourmethod in zebrafish embryos at 72 hours post fertilization was similar to the onedetermined by manual counting . Additionally, our method was evaluated usingcaffeine, a drug that affects the heart rhythm. Given the advantages of the digitalimage analysis our method can potentially be applied in studies of cardiotoxicity.

vi

Agradecimientos

• Muy especial agradecimiento al Dr. Luis Beltran y a la Dra. Consuelo Morgadopor su amistad, por asesorarme durante todo el transcurso de este trabajo, porsus valiosos consejos, por su paciencia y por todas las comidas y cenas quetuvimos.

• A Patricia Gonzalez, mi esposa y compañera, por su amor y compresión, portodos los consejos y especiamente por estar siempre conmigo.

• A mis compañeros de generación: Arturo "Rukawa", Esteban "Vampiro", Adair"Adair", Luis Rascón, Yahir "Panda", Rafael "Flash", Ana, Lupita, Limón, portodos los momentos que pasamos juntos.

• A los Doctores Héctor Acosta, Homero Ríos, Nicandro Cruz, por la revisión deltrabajo y sus comentarios.

• A mis padres por todo el apoyo que me han dado.

• Al CONACyT (Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología) por haberme dadolos recursos económicos necesarios para realizar mis estudios de posgrado.(Número de becario CONACyT 258942)

vii

Índice

1 Antecedentes 3

1.1 Pez cebra como modelo de estudio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

1.2 El pez cebra en el estudio de problemas cardíacos . . . . . . . . . . 6

1.2.1 Métodos para la detección de la frecuencia cardíaca en el pezcebra . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

Técnicas convencionales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

Técnicas basadas en análisis digital de imágenes . . . . . . . 7

2 Planteamiento del problema 11

2.1 Definición del problema . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

2.2 Hipótesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

2.3 Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

2.3.1 Objetivo Principal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

2.3.2 Objetivos específicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

2.4 Definión del proyecto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

3 Materiales y métodos 15

3.1 Mantenimiento del pez cebra . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

3.2 Obtención de los embriones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

3.3 Preparación de las condiciones experimentales . . . . . . . . . . . . 17

3.3.1 Control . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

3.3.2 Anestesiados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

MS-222 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

Agarosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

3.3.3 Anestesiados y tratamiento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

3.4 Adquisición de videos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

3.4.1 Microscopio Invertido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

3.4.2 Cámara de video . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

Software de adquisición de video . . . . . . . . . . . . . . . 21

3.5 Procesamiento de imágenes digitales . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

3.5.1 Series de tiempo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

Extracción de la señal de latidos del corazón (Serie de tiempo) 23

3.6 Análisis del espectro de frecuencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

ix

3.6.1 Procesamiento digital de señales . . . . . . . . . . . . . . . . 25Categorías importantes del procesamiento digital de señales 27

3.6.2 Análisis de frecuencia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28Transformada de Fourier . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28Espectro de Fourier . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

3.6.3 Análisis de cúmulos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30Algoritmo k-means . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31Algunos problemas de k-means . . . . . . . . . . . . . . . . 34

4 Resultados 354.1 Filmación de videos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 354.2 Series de tiempo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 364.3 Obtención de la frecuencia cardíaca . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39

4.3.1 Validación de la frecuencia cardíaca obtenida por el programa 404.3.2 Efecto de la Cafeína . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

4.4 Análisis de cúmulos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

5 Conclusiones y discusión 495.1 Discusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

5.1.1 Preparación del animal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 495.1.2 Determinación de la frecuencia cardíaca . . . . . . . . . . . 505.1.3 Análisis de cúmulos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

5.2 Conclusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 505.3 Trabajo Futuro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51

Bibliografía 53

x

Índice de figuras

1.1 Pez cebra macho y hembra. Se pueden notar las características descritasen el texto. Imagen modificada de [2] . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

1.2 Ciclo de vida del pez cebra. El pez tiene un desarrollo rápido, desdela fertilización hasta que tiene la capacidad de nadar (a los 2 días).Imagen adaptada de [8] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

1.3 Método de análisis de la frecuencia cardíaca presentado por Schwerte ysus colegas. A) Las líneas punteadas representan el perímetro del atrio(a) y ventrículo (v), para cada imagen se traza una línea que atraviesaambas regiones. B) Perfil de luminancia de la línea trazada en A. C)Detección de picos en la señal del cambio de intensidad de pixeles. D)Los círculos rojos representan los datos crudos y los círculos negrosrepresentan la señal filtrada. Imagen tomada de [27] . . . . . . . . . . 8

1.4 Diagrama mostrando el sistema experimental usado para el métodode registro de actividad cardíaca propuesto por Yoshida et. al. Imagentomada de [29] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

2.1 Esquema de trabajo propuesto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

3.1 Sistema de circulación y filtrado de los contenedores de los peces. . . 16

3.2 Hot-plate y horno de microondas. El horno fue usado para calentarinicialmente la agarosa, el hot plate se utiliza para terminar de mezclarla solución. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

3.3 Inmovilización de larva de pez cebra utilizando agarosa. . . . . . . . . 19

3.4 Comparación entre un microscopio invertido y uno convencional. Ima-gen adaptada de [38] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

3.5 Cámara Web Microsoft LifeCam Cinema . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

3.6 Interfaz del software de adquisición de videos . . . . . . . . . . . . . . 22

3.7 Imágenes de cuadros de video adquiridos . . . . . . . . . . . . . . . . 22

3.8 Extracción del valor medio de la intensidad de los pixeles. A: Cuadrodel video del cual se extrae la información. B: Señal obtenida al extraerel valor medio de la intensidad de los pixeles. . . . . . . . . . . . . . . 24

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3.9 Extracción del valor medio de la intensidad de los pixeles usando unaROI. A: Cuadro del video del cual se extrae la información, se puedeobservar la ROI abarcando el corazón y otras partes de la larva. B:Señal obtenida al extraer el valor medio de la intensidad de los pixelesdentro de la ROI. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

3.10 Extracción del valor medio de los pixeles usando una ROI. A: Cuadrodel video del cual se extrae la información, se puede observar la ROIabarcando el corazón de la larva. B: Señal obtenida al extraer el valormedio de la intensidad de los pixeles dentro de la ROI. . . . . . . . . . 26

3.11 Esquema del procesamiento digital de señales . . . . . . . . . . . . . . 26

3.12 El procesamiento digital de señales se divide en análisis y filtros. . . . 27

3.13 Análisis espectral de una señal de latidos del corazón de una larva depez cebra. La gráfica muestra que la frecuencia dominante en la señalanalizada es de aproximadamente 2.6 latidos por segundo. . . . . . . 30

3.14 Diferentes formas de dividir en clusters un conjunto de datos. Imagenadaptada de [44] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

3.15 Uso del algoritmo K-means para encontrar 3 clusters. Imagen de [44] 32

4.1 Pantalla principal del software de filmación . . . . . . . . . . . . . . . 35

4.2 Pantalla de configuración de las propiedades de la cámara . . . . . . . 36

4.3 Adquisición de la intensidad de los pixeles en un video de una larva depez cebra a 72 horas post fertilización . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

4.4 Ejemplo de serie de tiempo obtenida por el módulo de adquisición deintensidad de pixeles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

4.5 Resultado de aplicar la transformada rápida de Fourier a la señal de laFig. 4.4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39

4.6 Condición Control. La frecuencia cardíaca determinada utilizando elanálisis espectral es similar a la determinada mediante conteo manual. 40

4.7 Condición Control. Correlación lineal encontrada entre el análisisespectral y el conteo manual. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

4.8 Condición anestesiados (tricaina). La frecuencia cardíaca determinadautilizando el análisis espectral es similar a la determinada medianteconteo manual. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

4.9 Condición anestesiados (tricaina). Correlación lineal encontrada entreel análisis espectral y el conteo manual. . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

4.10 Condición anestesiados y tratamiento (Tricaina + Cafeína). La frecuen-cia cardíaca determinada utilizando el análisis espectral es similar a ladeterminada mediante conteo manual. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

4.11 Condición anestesiados y tratamiento (Tricaina + Cafeína). Correlaciónlineal encontrada entre el análisis espectral y el conteo manual. . . . . 44

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4.12 Efecto de la tricaina. En los peces tratados con tricaina, la frecuen-cia cardíaca muestra un decremento significativo (p < 0.01-Prueba tpareada). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

4.13 Efecto de la cafeína. No se encontraron diferencias significativas entrelas larvas con Tricaina y las larvas con Tricaina y Cafeína. . . . . . . . 45

4.14 Separación de los datos en 2 cúmulos. El cúmulo 1 corresponde a losdatos control y el cúmulo 2 corresponde a los datos de las condicionesexperimentales. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

Índice de figuras 1

1Antecedentes

„If we knew what it was we were doing, it wouldnot be called research, would it?.

— Albert Einstein

1.1 Pez cebra como modelo de estudioEl pez cebra Danio Rerio es un pez pequeño de aproximadamente 3cm - 5cm de largo,originario de la India y es común encontrarlo en los acuarios de todo el mundo.Los machos son delgados y con forma de torpedo con rayas negras longitudinales ygeneralmente con una coloración dorada en la cola y las aletas. Las hembras tienenpoca coloración dorada, si es que la hay, en la cola y aletas y su volumen abdominalaumenta cuando van a ovopositar (Fig. 1.1) [1].

Pez cebra Macho Pez cebra Hembra

Fig. 1.1: Pez cebra macho y hembra. Se pueden notar las características descritasen el texto. Imagen modificada de [2]

En 1981, George Streisinger introdujo al pez cebra como un modelo genéticopara estudiar el desarrollo de vertebrados [3], ya que este pez muestra variascaracterísticas que ofrecen una ventaja con respecto a otros modelos: [4, 5]

1. Los embriones de pez cebra y adultos jóvenes son transparentes, una carac-terística que facilita la observación directa de órganos internos mediante unmicroscopio.

2. Tiene un tiempo de desarrollo relativamente corto (2- 3 meses).

3. Un par de peces cebra puede producir 100-300 embriones a la semana, porlo tanto, incluso una cantidad pequeña de peces puede producir grandescantidades de embriones.

3

4. La fertilización es externa, permitiendo fácil acceso a los embriones para obser-vación y manipulación en una amplia variedad de condiciones de laboratorio.

5. Los embriones son permeables a fármacos.

6. Los órganos del pez cebra son similares a los del ser humano tanto funcional-mente como morfológicamente.

El proceso de secuenciación genómica ha mostrado que el genoma del pez cebraconserva una alta sintenia con el genoma humano, (es decir, los genes conservan lamisma posición en los cromosomas humanos y cromosomas del pez), además poseemuchos genes homólogos a los humanos.

La principal ventaja del pez cebra en comparación con el modelo vertebrado másestudiado (el ratón) es que los procesos de desarrollo más tempranos son másaccesibles, ya que el desarrollo del embrión es externo, a diferencia del ratónque se desarrolla dentro del útero [6]. Además con el ratón, los requerimientos deespacio son mucho mayores y el mantenimiento y alimentación imponen restriccioneseconómicas a proyectos a largo plazo o con múltiples poblaciones.

Debido a la transparencia del embrión y la fertilización externa, el pez cebra es unexcelente modelo para estudiar el desarrollo embrionario. El desarrollo embrionariodel pez se ha dividido en 8 periodos: cigoto, divisiones tempranas (“cleavage”),blástula, gástrula, segmentación faríngula, eclosión (“hatching”) y finalmente lalarva.

El periodo de cigoto (0–¾ horas post fertilización (hpf)) comprende desde el mo-mento de la fertilización hasta que ocurre la primera división celular, esto es aproxi-madamente 40 minutos después de la fertilización. El periodo de divisiones (”cleav-age”) tempranas (3/4–2¼ hpf) se considera a partir de la primera división celularhasta la séptima división celular. En el periodo de blástula (2¼-5¼ hpf) continúanlas divisiones celulares hasta que el cigoto toma una forma esférica. El periodo degástrula (5¼-10 hpf) se define por la presencia de movimientos morfo genéticos quepermiten la formación de las capas germinales primarias (conjunto de células a partirde las cuales se originarán los tejidos y órganos). En el periodo de segmentación(10–24 hpf) se empiezan a formar las somitas (precursores de músculo y esqueleto)desde el tronco hasta la cola. Además se empiezan a notar las formas de algunosórganos. En el periodo de faríngula (24–48 hpf) continua el desarrollo morfológicodel pez, comienza la formación de las aletas, se forma el sistema circulatorio, aparecela sensibilidad a estímulos táctiles y se diferencian las células pigmentarias. En elperiodo de eclosión (48–72 hpf) el embrión continua creciendo, se completa laorganogénesis y también se desarrolla la aleta pectoral. En el periodo de larva ya

4 Capítulo 1 Antecedentes

se ha completado la mayoría de la morfogénesis del pez y durante los siguientesdías se terminará. También durante este periodo el pez ya puede nadar y realizarbúsquedas de alimento [7].

Fig. 1.2: Ciclo de vida del pez cebra. El pez tiene un desarrollo rápido, desde lafertilización hasta que tiene la capacidad de nadar (a los 2 días). Imagenadaptada de [8]

El pez cebra es un modelo que ha sido ampliamente utilizado para el entendimientode varios fenómenos biológicos en los vertebrados.

Se ha demostrado que el pez cebra es un modelo útil para el estudio del compor-tamiento [9], prueba de fármacos [10], así como para el estudio de órganos talescomo el riñón [11], sistema olfatorio [12] y el sistema visual [13].

La utilidad que tiene este modelo en el estudio del sistema cardiovascular no hatenido comparación con otros modelos animales. Recientemente en el campo de lafarmacología y toxicología, el modelo del pez cebra y específicamente el estudio dela frecuencia cardiaca, se ha adoptado como una herramienta en el descubrimientode nuevas sustancias tanto para enfermedades cardíacas como para la detecciónde substancias contaminantes en el agua. Sin embargo, hoy en día los métodos deanálisis para estudiar los cambios en la frecuencia cardíaca, se realizan de forma

1.1 Pez cebra como modelo de estudio 5

manual o con la asistencia de software adaptado para la adquisición y análisis dedatos. Es por esto que en esta tesis se propone el desarrollo de un sistema dedetección y cuantificación automática de la frecuencia cardíaca en la larva del pezcebra.

1.2 El pez cebra en el estudio de problemascardíacos

Durante la última década, el pez cebra ha entrado al campo de la investigacióncardiovascular como un nuevo modelo; esto se debe a que el pez cebra ofrecevarias ventajas como modelo genético y embrionario para estudiar enfermedadescardiovasculares [14].

Los embriones de pez cebra son especialmente adecuados para el estudio de lafunción genética durante el desarrollo cardiovascular, porque no son completamentedependientes de un sistema cardiovascular funcional para su desarrollo [15]. Estacaracterística permite que los embriones sobrevivan la fase inicial del desarrolloembrionario y permitan el análisis de embriones con defectos cardiovascularesseveros. En contraste, los modelos de mamíferos y aves, mueren rápidamente enausencia de un sistema cardiovascular funcional.

El corazón embrionario del pez cebra a las 24 hpf es casi idéntico al corazón de doscámaras humano a las tres semanas de gestación [4]. Está dividido en 2 cámaras,atrial y ventricular con válvulas cardíacas en los límites. El corazón comienza a latiraproximadamente a 22 hpf, inicialmente como una onda peristáltica y a 36 hpf comocontracciones coordinadas de la aurícula y ventrículo [6]. El pez es particularmenteútil para estudios de la función cardíaca porque la transparencia del embrión permitela observación del corazón y los vasos sanguíneos con un microscopio. Esto permitela visualización y cuantificación de contracciones cardíacas, flujo sanguíneo, calcularel tamaño de los vasos sanguíneos, etc. [16].

El corazón del pez cebra adulto, a diferencia del de los mamíferos, es capaz deregenerarse después de la eliminación de un área de miocardio [17]. Esta caracterís-tica del corazón del pez cebra hace considerar a los investigadores que podría serposible que el corazón humano sea inducido a regenerarse de la misma manera enque lo hace el corazón del pez cebra.

El pez cebra puede ser utilizado como modelo de diferentes problemas cardíacoscomo falla cardíaca, arritmia, enfermedades cardíacas congénitas, etc. Cada uno


de estos modelos tienen parámetros importantes que son medidos durante losexperimentos.

1.2.1 Métodos para la detección de la frecuenciacardíaca en el pez cebra

Técnicas convencionales

Conteo manual Esta técnica es la más sencilla y la más imprecisa, básicamenteesta técnica se basa en observar los videos del corazón latiendo del pez y auxiliándosede un cronometro contar de forma manual, los latidos durante un determinadotiempo [18, 19]. Este método produce un valor medio durante un tiempo específico,pero la variabilidad de la frecuencia cardiaca no puede ser evaluada, ya que paraevaluar la variabilidad se requiere un registro continuo del corazón latiendo [20].

Electrocardiograma El electrocardiograma (ECG) es el registro de la actividadeléctrica generada por el corazón. Usando electrodos y un electrocardiógrafo seregistra la actividad eléctrica del corazón. Fue observado originalmente por Walleren 1889 [21] usando su mascota como fuente de la señal y un electrómetro capilarcomo dispositivo de registro. En 1903, Einthoven mejoró dicha técnica al usarun galvanómetro como dispositivo de registro y usando sujetos humanos con unavariedad de anormalidades cardiacas [22].

Numerosos artículos han demostrado la efectividad del electrocardiograma comoherramienta para la detección y cuantificación de la frecuencia cardíaca y otrosparámetros cardiovasculares en la larva del pez cebra [23, 24, 25]. Una desventajade este método es que necesita experimentadores habituados con la técnica y ademásal usar electrodos y otros aparatos se introduce estrés al pez.

Técnicas basadas en análisis digital de imágenes

Las técnicas de análisis digital de imágenes han probado ser una herramientapoderosa en el análisis de funciones cardíacas tales como análisis de la distribuciónde los eritrocitos y conteo de eritrocitos [26]. A continuación se describen una seriede investigaciones en las cuales se ha atacado el problema de la detección y mediciónde la frecuencia cardiaca en el pez cebra.

1.2 El pez cebra en el estudio de problemas cardíacos 7

En 2006 Schwerte y sus colegas desarrollaron un método para contabilizar la vari-abilidad de la frecuencia cardíaca en embriones de pez cebra [27]. En este trabajo elsistema de adquisición de imágenes utiliza un microscopio invertido (Zeiss Axiovert25 CF), el cual está conectado a una cámara digital de alta velocidad (Basler 504k).El método se puede resumir de la siguiente manera: En primer lugar se obtienenimágenes del corazón latiendo, en estas imágenes se traza una línea que iniciaafuera del tejido del corazón, atraviesa el ventrículo central y el atrio y termina enel sinus venosus. El perfil de luminancia de dicha línea para todas las imágenes esalmacenado en un archivo de texto e importado a un programa hecho en LabView,el cual realiza una detección del cambio de intensidad de cada punto a través de lalínea dibujada. Finalmente para obtener una estimación de la frecuencia cardíaca sefiltra la señal obtenida de la identificación del cambio de intensidad de los pixeles,utilizando un filtro pasa bajas con una frecuencia de paso de 0.1 Hz. Una vez que setiene la señal filtrada se realiza una detección de picos en la señal. Los picos que nopasan un umbral especificado son descartados, y finalmente las distancias de picoa pico son convertidas a la frecuencia de latido a latido. En la figura 1.3 se puedeobservar las etapas del método propuesto por Schwerte.

Fig. 1.3: Método de análisis de la frecuencia cardíaca presentado por Schwerte ysus colegas. A) Las líneas punteadas representan el perímetro del atrio (a)y ventrículo (v), para cada imagen se traza una línea que atraviesa ambasregiones. B) Perfil de luminancia de la línea trazada en A. C) Detección depicos en la señal del cambio de intensidad de pixeles. D) Los círculos rojosrepresentan los datos crudos y los círculos negros representan la señalfiltrada. Imagen tomada de [27]

En 2009 Fink y colegas presentaron un nuevo método para la detección y cuantifi-cación de parámetros de latidos de corazón en Drosophila, pez cebra y embrionesde ratones [28]. En este método se utilizan algoritmos de análisis de imágenes


digitales. Para detectar y cuantificar las contracciones del corazón, se utilizan unacombinación de dos algoritmos de detección de movimiento, el primer algoritmo,Frame Brightness, identifica los cambios en la intensidad de la luz en cada cuadro. Elsegundo algoritmo, Changing Pixel Intensity, detecta el movimiento del corazón allocalizar las áreas donde hay cambios de intensidad significativos durante cuadrosconsecutivos. Para determinar las áreas donde hay movimiento entre los cuadros,primero se calcula el cambio de brillo relativo (RBC por sus siglas en inglés) paracada pixel (p) en un cuadro (f + 1) relativo a un cuadro previo (f):

RBC = |pf+1 − pf |pf+1

(1.1)

El RBC máximo en cada cuadro representa el movimiento de una parte de lamembrana sobre un fondo más claro, o en la ausencia de movimiento, el ruido defondo. Una primera estimación del tiempo y duración de la diástole se obtiene alestablecer un umbral de movimiento para el algoritmo Changing Pixels Intensity. Lapausa en los movimientos que ocurre durante la relajación (diástole) es el intervalode diástole (DI) y el periodo cardiaco es cuantificado como el tiempo que ocurreentre 2 DI consecutivos.

Masayuki Yoshida y sus colegas presentaron un método para monitoreo de actividadcardiaca en peces [29]. Su método registra la actividad cardíaca utilizando latransmisión de una luz infrarroja a través del corazón del pez hasta un fototransistorlocalizado fuera del cuerpo del pez.

Computadora

ConversorA/DSalida

Fototransistor

Apertura

LedInfrarrojo

Bajo Alto

Fuente de alimentaciónDC

AmpAC

AmpDC

Fig. 1.4: Diagrama mostrando el sistema experimental usado para el método deregistro de actividad cardíaca propuesto por Yoshida et. al. Imagen tomadade [29]

La figura 1.4 muestra una diagrama del sistema de registro presentado por Yoshida.Un diodo emisor de luz infrarroja (SFH487; longitud de onda 880 nm) y un fototran-

1.2 El pez cebra en el estudio de problemas cardíacos 9

sistor equipado con un filtro para bloquear luz (PT381F; longitud de onda 860 nm)son colocados uno frente al otro. Un tapón de acero inoxidable con una abertura de0.5 mm se coloca frente al fototransistor para limitar la luz que entra desde el lado.La salida del fototransistor lleva a un amplificador (AB-610J) y es filtrado con unfiltro pasa bandas entre 0.08 y 30 Hz.

En 2009 Po Kwok Chan y sus colegas presentaron una técnica para medir la regulari-dad en latidos del corazón de la larva del pez cebra. Usando un microscopio y unacámara de video digital, desarrollaron un método para medir la frecuencia cardíacay regularidad de los latidos mediante los vasos sanguíneos periféricos [30]. El ritmocardíaco fue obtenido mediante un análisis espectral a través de la extracción de lascaracterísticas del ritmo cardíaco. La regularidad cardíaca fue encontrada medianteel uso de la transformada rápida de Fourier.


2Planteamiento del problema

„If you want to pick up a girl, never mentionStarcraft.

— Kim "Soulkey" Min Chul

2.1 Definición del problema

Las enfermedades del corazón representan la primer causa de mortalidad a nivelmundial [31] esto ha motivado a diversos grupos de investigación a descubrirnuevas técnicas y tratamientos que permitan prevenir, detectar y controlar estasenfermedades.

El uso de animales de laboratorio en las investigaciones biomédicas representaun elemento fundamental para investigar y comprender las causas, diagnóstico ytratamiento de las enfermedades que afectan a los humanos.

En años recientes el pez cebra ha sido uno de los modelos animales más importantespara el estudio de los vertebrados y específicamente también ha sido muy útil en elestudio de las enfermedades cardiovasculares [6].

La actividad cardíaca ha sido ampliamente usada para el monitoreo de condicionesfisiológicas y estados en el pez. En experimentos fisiológicos, tales como los llevadosa cabo para examinar los efectos de productos químicos y estrés, el latido del corazónes un indicador altamente sensible a la respuesta del pez a estresore [32] [33]. Enestudios psicológicos, como los relacionados con el condicionamiento del miedoclásico, la desaceleración cardiaca (llamada bradicardia) es una respuesta al miedocondicionado, útil para el análisis cuantitativo [34].

Existen varios métodos para evaluar la frecuencia cardiaca en los embriones de pezcebra. El método más simple pero más lento es usar un cronómetro para contarlatidos por minuto [18]. También se han usado señales de micro-presión [35], técnicade microscopia con láser doppler [20] y electrocardiografía [25]. Sin embargo estastécnicas son de trabajo intensivo, consumen mucho tiempo y requieren un operadorhábil para realizar los experimentos.

11

Es necesario encontrar nuevos métodos para poder medir las actividades cardia-cas de manera fácil, rápida, segura, pero sobre todo exacta y sin las desventajasmencionadas.

2.2 HipótesisEs posible cuantificar automáticamente la frecuencia cardíaca en las larvas de pez cebra,mediante la cuantificación del cambio en la intensidad de los pixeles en videos delcorazón.

2.3 Objetivos

2.3.1 Objetivo Principal1. Desarrollar un sistema dedicado a la detección y cuantificación automática de

la frecuencia cardíaca en la larva del pez cebra.

2.3.2 Objetivos específicos1. Obtener la señal de los latidos del corazón a partir de videos del corazón

latiendo.

2. Aplicar un análisis del espectro de frecuencias a la señal de los latidos delcorazón con el fin de obtener la frecuencia cardíaca.

3. Implementar un clasificador que de acuerdo al análisis en el espacio de fre-cuencias de la señal, determine si la larva está bajo el influjo de un fármaco ono.

12 Capítulo 2 Planteamiento del problema

2.4 Definión del proyectoSe propone un método para la detección y cuantificación automática de la frecuenciacardíaca en la larva del pez cebra. El método propuesto utilizará un algoritmo dedetección de cambios en la intensidad de los pixeles para obtener el ritmo cardíacode una manera precisa y objetiva. Además se propone realizar un análisis espectralde la señal encontrada para poder detectar adecuadamente la frecuencia cardíaca.Para llevar a cabo este proyecto se ha propuesto un esquema de trabajo que semuestra en la figura 2.1.

Fig. 2.1: Esquema de trabajo propuesto

2.4 Definión del proyecto 13

La primera etapa de este trabajo es la obtención de larvas de peces, esto consiste encolocar a dos peces cebra adultos en una cámara de cruza, dicha cámara contieneuna malla al fondo para evitar que los peces puedan comerse los huevecillos quela hembra ovoposite. Una vez que se tienen las larvas se dividen entre los gruposexperimentales que se usaran para este trabajo:

1. Control: Larvas de 72 hpf.

2. Anestesiados (Tricaina): Larvas de 72 hpf anestesiadas con tricaina.

3. Anestesiados y tratamiento (Tricaina y cafeína): Larvas de 72 hpf anestesiadascon tricaina y además en presencia de cafeína.

La siguiente etapa es la de adquisición de datos, en este caso son videos del corazónlatiendo de la larva del pez cebra. Para realizar esta etapa es necesario utilizar unmicroscopio con una cámara de video.

Posterior a la grabación de videos, se extraen las series de tiempo a partir del videodel corazón. Esta etapa consistirá en la separación de cada uno de los cuadros quecomponen el video y la selección de un área de la imagen. A partir de la medicióndel valor de la intensidad de los pixeles dentro de dicha área se construirá la señalde los latidos del corazón. Posteriormente utilizando técnicas de procesamientodigital de señales se calculará la frecuencia cardíaca.

El aprendizaje automático es una rama de la Inteligencia Artificial cuyo objetivo seenfoca en la construcción de modelos con fines descriptivos o predictivos basándoseen la información proporcionada en forma de ejemplos [36]. El análisis de cúmulos(clusters) es una de las tareas que se pueden realizar utilizando el aprendizajeautomático. Esta técnica básicamente agrupa los datos basándose en la informaciónque describe a los objetos y sus relaciones. La meta es que los objetos dentro de ungrupo sean similares unos a otros y diferentes de los objetos en otros grupos. En esteproyecto los datos adquiridos serán utilizados por algoritmos de análisis de cúmuloscomo kmeans con el fin de identificar estados fisiológicos en el pez.

14 Capítulo 2 Planteamiento del problema

3Materiales y métodos

„ No, you clearly don’t know who you’re talkingto, so let me clue you in. I am not in danger. Iam the danger! A guy opens his door and getsshot and you think that of me? No. I am the onewho knocks!

— Walter White

3.1 Mantenimiento del pez cebra

Los ejemplares de pez cebra (Danio rerio) se mantuvieron en agua no clorada a 28°C con un sistema automático de circulación. Los peces fueron expuestos a ciclos de14 horas de luz y 10 horas de obscuridad, además los machos fueron separados delas hembras. La hembra se puede identificar por su vientre abultado color plateadoy el macho por el vientre plano color amarillo. Los peces se alimentaron con artemiay hojuelas de alimento comercial (Tetrafin) para peces 2 veces al día. La densidadpoblacional de cada pecera fue estipulada de acuerdo al volumen del contenedor(Fig. 3.1).

3.2 Obtención de los embriones

Para obtener embriones se colocaron dos machos y tres hembras separados porun acrilico en una “caja de cruza”. Dicha caja tiene en la parte inferior una redque impide que los huevos fertilizados sean ingeridos. Las hembras y los machospermanecen separados por el acrilico durante 12 horas. A las 7:00 AM el acrilicoes retirado y se deja interaccionar a los machos con las hembras durante dos horas.A las dos horas, todos los animales son retirados. En la red de la parte inferiorse buscan los huevos, se recolectan en una caja de Petri con agua de acuario y seincuban a 28 °C, eliminando los huevos que no fueron fertilizados, ya que producenefectos nocivos sobre los huevos fertilizados.

15

Fig. 3.1: Sistema de circulación y filtrado de los contenedores de los peces.

16 Capítulo 3 Materiales y métodos

3.3 Preparación de las condicionesexperimentalesAntes de preparar los grupos experimentales los embriones se dejaron crecer 72horas, ya que es en ese momento donde su corazón ha terminado de desarrollarse.Para este trabajo se utilizaron 3 grupos experimentales los cuales se describen acontinuación.

3.3.1 Control

El grupo control consiste de larvas de pez cebra de 72 hpf y las larvas no tienenningún tipo de tratamiento.

3.3.2 Anestesiados

Debido a que las 72 hpf las larvas ya han desarrollado gran parte de sus músculos, esmuy difícil hacer una adquisición de videos del corazón, ya que las larvas se muevenactivamente. Es por esto que se probaron 2 métodos diferentes de inmovilización:

MS-222

La tricaína metano sulfonato (MS-222) es una fármaco usado para anestesiar osacrificar peces y otro tipo de animales acuáticos de sangre fría. Ha sido utilizadopara inmovilizar los músculos bloqueando la transmisión de impulsos nerviosos [37].La concentración de MS-222 usada fue 0.2 mg/ml y las larvas fueron expuestasal MS-222 durante 1 minuto. Después de la exposición al MS-222 la larva estáinmovilizada pero el corazón sigue latiendo.

Agarosa

La agarosa es un polisacárido que forma un gel no tóxico que es usado para inmovi-lizar a las larvas de pez cebra. El segundo método probado fue usar agarosa a 5%(0.05g de agarosa por cada 10 ml de agua) preparada con agua des-ionizada. Lamezcla es calentada hasta que la agarosa se ha disuelto completamente (aproxi-madamente a los 40 °C), para calentar la agarosa se usa un hot-plate y un horno demicroondas (Fig. 3.2).

3.3 Preparación de las condiciones experimentales 17

Fig. 3.2: Hot-plate y horno de microondas. El horno fue usado para calentarinicialmente la agarosa, el hot plate se utiliza para terminar de mezclar lasolución.

La agarosa es mantenida en un baño a 40 °C. Una pequeña cantidad de agarosa esmedida con una pipeta y agregada a un tubo de prueba. Las larvas son transferidasal tubo. Entonces usando una pipeta se toma una larva junto con un poco de agarosay se coloca en una caja de Petri (Fig. 3.3). Cuando la agarosa se enfría se solidificaen forma de gel e inmoviliza a la larva. La agarosa es permeable al agua, lo quepermite mantener a la larva viva.

Después de probar ambos métodos se decidió utilizar el MS-222 para inmovilizara las larvas en los experimentos. La agarosa parece detener completamente losmovimientos del pez, sin embargo, en ocasiones la larva muestra espasmos muscu-lares, los cuales complican la filmació de videos.

3.3.3 Anestesiados y tratamiento

Como ya se explicó en la sección anterior, la anestesia elegida para los experimentosfue la Tricaina. En este grupo experimental se busca agregar una droga a la larvade pez cebra, dicha droga debe tener efectos sobre el ritmo cardíaco. Para estegrupo experimental se seleccionó a la cafeína como droga experimental debido a lassiguientes características [37]:

1. Es la droga estimulante más consumida en el mundo.

2. Incrementa la presión arterial

3. Incrementa el ritmo respiratorio


Fig. 3.3: Inmovilización de larva de pez cebra utilizando agarosa.

4. Induce un estado de alerta

5. Los efectos tóxicos de la sobredosis de cafeína incluyen taquicardia, bradi-cardia, arritmia, hipertensión, vomito, convulsiones, coma y finalmente lamuerte.

La cafeína se agregó junto con la tricaína al momento de anestesiar al pez, por loque el pez anestesiado mostró los efectos secundarios causados por la cafeína.

3.4 Adquisición de videosLa adquisición de videos es una parte muy importante de todo el proceso experimen-tal de este trabajo, ya que representan los datos base sobre los cuales se trabajaráen las siguientes etapas. El equipo que se utilizó para la adquisición de videos estácompuesto por:

1. Microscopio Invertido

2. Cámara de video

Para obtener los videos se utilizó un microscopio invertido con una cámara de videomontada en el ocular del microscopio. La salida producida por la cámara de video

3.4 Adquisición de videos 19

es enviada hacia la computadora. Las características de cada uno de los dispositivosutilizados se describirán a continuación:

3.4.1 Microscopio Invertido

Como su nombre lo sugiere,la óptica de un microscopio invertido está al revéscomparado con la de un microscopio convencional. La fuente de luz y el condensadorestán sobre la plataforma apuntando hacia abajo. Los objetivos y la torrecilla estándebajo de la plataforma apuntando hacia arriba. En la figura 3.4 se muestra unacomparación entre un microscopio convencional y un microscopio invertido.

Fig. 3.4: Comparación entre un microscopio invertido y uno convencional. Imagenadaptada de [38]

3.4.2 Cámara de video

La cámara de video utilizada en el presente trabajo fue una Microsoft LifeCamCinema (Fig. 3.5)con las siguientes características:

1. Grabación de video en resolución 1280 x 720 pixeles a 30 cuadros por segundo.

2. Mecanismo de enfoque automático.

3. Elementos de cristal de alta precisión

4. Tecnología TrueColor con seguimiento de rostros

5. Rotación de 360 grados

6. Micrófono de banda amplia para grabación de sonido Premium.


El sensor de la Microsoft LifeCam Cinema es un Omnivision™ OV9712. El OV9712es un sensor HD 720p que ofrece video HD con una resolución de 1280x720 pixeles,operando a 30 cuadros por segundo. El OV9712 mide ¼ de pulgada y usa unaarquitectura de pixel OmniPixel3-HS™ de 3 µm. Esto permite al OV9712 operar bienen ambientes de poca luz, menores a 15lx.

Software de adquisición de video

La adquisición de videos se realizó utilizando un programa computacional (im-plementado en el lenguaje Matlab 2012a). Dicho software permitió controlar lascaracterísticas de la cámara, tales como auto enfoque, auto contraste, velocidad demuestreo, etc., la velocidad de muestreo que se usó en este trabajo fue de 30 cuadrospor segundo a una resolución de 640x480 pixeles, los videos fueron grabados enescala de grises. En la figura 3.6 se muestra una captura de la interfaz del softwareutilizado para la adquisición de videos y la figura 3.7 muestra algunos cuadros devideos adquiridos.

Fig. 3.5: Cámara Web Microsoft LifeCam Cinema

3.5 Procesamiento de imágenes digitalesUna imagen es definida como una función de dos dimensiones, f(x, y), donde xy y son coordenadas espaciales (plano) y la amplitud de f en cualquier par decoordenadas (x, y) es llamada intensidad o nivel de gris de la imagen en dicho punto.Cuando x,y, y los valores de intensidad de f son finitos, se le puede llamar a la

3.5 Procesamiento de imágenes digitales 21

Fig. 3.6: Interfaz del software de adquisición de videos

Fig. 3.7: Imágenes de cuadros de video adquiridos


imagen, imagen digital. El procesamiento de imágenes digitales se hace por mediode una computadora [39].

En este trabajo el procesamiento de imágenes digitales es usado con el fin de calcularla frecuencia cardíaca de la larva de pez cebra a partir de videos de su corazónlatiendo.

3.5.1 Series de tiempo

Una vez que se tienen los videos, el primer paso que se realizó para analizarlos fuedescomponerlos en las imágenes que conforman el video.

Una serie de tiempo es una secuencia de datos, medidos en tiempos sucesivosespaciados por intervalos uniformes de tiempo [40]. Por ejemplo, los cuadros queconforman un video son una serie de tiempo, ya que son datos medidos en tiempossucesivos y con intervalos uniformes de tiempo.

Extracción de la señal de latidos del corazón (Serie de tiempo)

Un proceso fundamental para poder obtener la frecuencia cardíaca, es tener la señalde los latidos del corazón. En las imágenes en escala de grises cada píxel de unaimagen puede ser uno de los 256 valores distintos de gris, del negro (cero) al blanco(255). En videos de las larvas de pez cebra, la intensidad de luz de los pixelesdisminuye durante las contracciones, esto es porque los músculos del corazón secontraen y la membrana celular se hace mas densa obstruyendo el paso de la luz. Alobtener el valor medio de la intensidad de todos los pixeles de un cuadro, podemosmedir que tan contraído o relajado esta el corazón. Al hacer esto para cada uno delos cuadros de un video, podemos obtener una señal que representa las contraccionesy relajaciones del corazón (Serie de tiempo).

Cuando se obtiene el valor medio la intensidad de todos los pixeles de un cuadrode video, se obtiene una señal como la de la figura 3.8 B. Sin embargo dicha señalno muestra mucha información útil, debido a que el promedio de la intensidadde todos los pixeles de la imagen, no sólo toma información del corazón sino detodo el pez. Debido a que la señal obtenida no aporta información sobre los latidosdel corazón,se optó por utilizar una selección de un área de interés (ROI por sussiglas en inglés). Al utilizar un ROI se asegura que sólo la parte que este dentro dedicha ROI será cuantificada; por lo que, si se selecciona una ROI que delimite elcorazón de la larva, podremos obtener una señal mucho más limpia que contengainformación sobre el comportamiento del corazón. La selección de la ROI es una

3.5 Procesamiento de imágenes digitales 23

Fig. 3.8: Extracción del valor medio de la intensidad de los pixeles. A: Cuadro delvideo del cual se extrae la información. B: Señal obtenida al extraer elvalor medio de la intensidad de los pixeles.

acción muy importante debido a que si la ROI es muy pequeña puede obtener muypoca información, en cambio, si la ROI es muy grande, la señal que se obtendrátendrá mucho ruido.

Como se puede ver en la figura 3.9, la ROI seleccionada delimita el área donde seencuentra el corazón de la larva, sin embargo, la ROI sigue siendo muy grande porlo que la señal muestra ruido. La ROI también abarca una gran parte de músculosque también se mueven y por lo tanto agregan ruido a la señal. En la figura 3.10 semuestra una ROI que delimita al corazón y abarca una menor cantidad de músculos,con el fin de mantener el nivel de ruido lo más bajo posible.

Como se puede ver en las figuras 3.8, 3.9, 3.10 la selección de la ROI juega un papelmuy importante para la extracción de la señal de los latidos del corazón.


Fig. 3.9: Extracción del valor medio de la intensidad de los pixeles usando una ROI.A: Cuadro del video del cual se extrae la información, se puede observarla ROI abarcando el corazón y otras partes de la larva. B: Señal obtenidaal extraer el valor medio de la intensidad de los pixeles dentro de la ROI.

3.6 Análisis del espectro de frecuencias

3.6.1 Procesamiento digital de señalesEl procesamiento digital de señales (DSP por sus siglas en inglés) ha tenido un granimpacto en nuestra sociedad. Sin DSP no habría audio y video digital; teléfonoscelulares, televisión digital y satelital; incluso redes cableadas o inalámbricas. SinDSP los científicos no tendrían herramientas poderosas para analizar y visualizar susdatos [41].

3.6 Análisis del espectro de frecuencias 25

Fig. 3.10: Extracción del valor medio de los pixeles usando una ROI. A: Cuadrodel video del cual se extrae la información, se puede observar la ROIabarcando el corazón de la larva. B: Señal obtenida al extraer el valormedio de la intensidad de los pixeles dentro de la ROI.

Fig. 3.11: Esquema del procesamiento digital de señales


El concepto básico del procesamiento digital de señales es ilustrado por el diagramaen la figura 3.11, el cual consiste de una filtro análogo, un convertidor análogo-digital (ADC por sus siglas en inglés), una señal digital, una unidad de conversióndigital-análogo (DAC por sus siglas en inglés) y un filtro de reconstrucción.

Vale la pena mencionar que muchas aplicaciones de procesamiento digital de señalesque no requieren una conversión digital – análogo, por ejemplo la adquisición dedatos, reconocimiento del habla, codificación de datos, etc. Igualmente existenaplicaciones que no requieren convertidores análogo-digital, como la síntesis detexto–habla, generadores digitales, etc.

Categorías importantes del procesamiento digital de señales

La mayoría de las operaciones de procesamiento digital de señales pueden catego-rizarse en tareas de análisis o tareas de filtro [42].

Fig. 3.12: El procesamiento digital de señales se divide en análisis y filtros.

Análisis de señales En esta tarea se buscan mediciones de las propiedades de laseñal. Generalmente son operaciones en el dominio de frecuencias.

• Análisis espectral (frecuencia, fase, etc).

• Reconocimiento del habla.

• Verificación de voz.

Filtrado de señales Esta tarea se caracteriza por una situación "señal de entrada–señalde salida". Los sistemas que realizan esta tarea son llamados filtros. General-


mente es una operación en el dominio del tiempo. Algunas aplicaciones sonlas siguientes:

• Eliminción de ruido no deseado.

• Eliminación de interferencia.

• Separación de bandas de frecuencia.

• Conformación del espectro de la señal.

3.6.2 Análisis de frecuencia

En el dominio de tiempo, la representación de señales digitales describe la amplitudde la señal en contra del tiempo de muestreo o el número de muestra. Sin embargo,en algunas aplicaciones, el contenido del dominio de frecuencias es mucho más útil.El algoritmo que transforma la señal del dominio de tiempo al dominio de frecuenciases conocida como la transformada de Fourier, o FT. La FT también establece unarelación entre la representación del domino de tiempo y la representación deldominio de frecuencia. Por lo tanto, se puede aplicar la TF para realizar análisis defrecuencia de una secuencia del dominio de tiempo [41].

Transformada de Fourier

La FT es uno de los procedimientos más comunes y poderosos en el campo delprocesamiento digital de señales. Permite analizar, manipular y sintetizar señales enformas que no son posibles usando otros métodos de procesamiento de señales.

La FT es un procedimiento matemático usado para determinar el contenido delespectro de frecuencias de una señal discreta. El origen de la transformada discretade Fourier es, desde luego, la transformada continua de Fourier, definida de lasiguiente forma:

X(f) =∫ ∞∞

x(t)e−jπftdt (3.1)

Donde x(t) es una señal continua.


Con la llegada de las computadoras digitales, se pudo llegar al desarrollo de latransformada de Fourier, definida como

X(k) =N−1∑n=0

x(n)ej2πknN =

N−1∑n=0

x(n)W knN , para k = 0, 1, . . . , N − 1 (3.2)

Donde el factor WN está definido de la siguiente forma

WN = e−j2π/N = cos(2πN

)− jsin(2πN

) (3.3)

Aunque la FT es el procedimiento más sencillo para la determinación del contenidode frecuencia de una señal en el dominio del tiempo, es terriblemente ineficiente. En1965 un artículo publicado por Cooley y Tukey describe un algoritmo muy eficientepara implementar la FT [43]. Este algoritmo es conocido como la transformadarápida de Fourier.

Espectro de Fourier

Una aplicación de la FT es la transformación de una señal digital finita x(n) alespectro en el dominio de frecuencia. Para poder realizar dicha transformación esnecesario obtener los coeficientes de Fourier. Los coeficientes de Fourier se obtienenal aplicar la FT a la señal de entrada x(n).

X(k) =N−1∑n=0

x(n)W knN , para k = 0,1,...,N-1 (3.4)

Dado a que cada coeficiente de Fourier es un número complejo, no es convenientegraficarlo contra su índice de frecuencia. Por lo tanto, la magnitud y fase de cadacoeficiente de Fourier (Espectro de amplitud y Espectro de fase, respectivamente)pueden ser determinados y graficados contra su índice de frecuencia [41]. El espectrode amplitud está definido como:

Ak = 1N|X(k)| = 1

N

√(Real[X(k)])2 + (Imag[X(k)])2, k = 0, 1, 2, ..., N - 1

(3.5)Correspondientemente, el espectro de fase está dado por:

φk = tan− 1(Imag[X(k)]Real[X(k)] ), k = 0, 1, 2, ..., N - 1 (3.6)


Además del espectro de amplitud, también se usa el espectro de poder. El espectrode poder se define como:

Pk = 1N2 |X(k)|2 = 1

N2 (Real[X(k)])2 + (Imag[X(k)])2, k = 0, 1, 2, ..., N - 1(3.7)

Aplicando la transformada rápida de Fourier a las series de tiempo obtenidas,sepuede realizar un análisis de frecuencia de dicha serie de tiempo. La frecuenciadominante resultante del análisis de frecuencias equivale a la frecuencia cardíaca.La figura 3.13 muestra el resultado de aplicar la FT a la señal de la figura 3.10 B.

Fig. 3.13: Análisis espectral de una señal de latidos del corazón de una larva depez cebra. La gráfica muestra que la frecuencia dominante en la señalanalizada es de aproximadamente 2.6 latidos por segundo.

3.6.3 Análisis de cúmulos

El análisis de cúmulos divide datos en grupos (clusters) que son significativos yútiles. Este análisis ha tomado un rol importante en una amplia variedad de camposcomo psicología, biología, estadísticas, reconocimiento de patrones, aprendizajeautomático, etc. [44]

Básicamente el análisis de cúmulos agrupa datos basándose solo en la informaciónencontrada en los datos, es decir, no se requiere información a priori. La meta esque los datos dentro de un grupo sean similares unos a otros y diferentes de losdatos dentro de otros grupos. Mientras mayor sea a similitud dentro de un grupo ymayor sea la diferencia entre grupos, mejor será la separación de cúmulos. En lafigura 3.14 se muestra un conjunto de puntos y 3 diferentes formas de separarlos encúmulos.


Fig. 3.14: Diferentes formas de dividir en clusters un conjunto de datos. Imagenadaptada de [44]

Algoritmo k-means

Las técnicas de clustering basadas en prototipos crean un nivel de particionado de losdatos. Existe un gran número de tales técnicas, pero dos de las más destacadas sonK-means y K-medoid. K-means define un prototipo en términos de un centroide, elcual es usualmente la media de un grupo de puntos, y es típicamente aplicado a losobjetos en un espacio n-dimensional. K-medoid define un prototipo en términos deun mediode, el cual es el punto más representativo en un grupo de datos. Mientrasque un centroide casi nunca corresponderá a un dato en específico, un mediode,dado su definición, debe ser un dato específico. En este trabajo utilizamos K-means,debido a que es una de las técnicas más simples y usadas dentro del análisis decúmulos.

El algoritmo k-means primero selecciona K centroides iniciales, donde K es unparámetro especificado por el usuario, es decir, el número de clusters deseados.Cada punto es asignado al centroide más cercano y cada acumulación de puntosasignados al centroide es un cluster. El centroide de cada cluster es actualizadobasándose en los puntos asignados al cluster. Se repiten los pasos de asignación y


actualización hasta que los puntos no cambien de cluster o hasta que los centroidesno cambien. A continuación se muestra el algoritmo básico de K-means.

Algoritmo 1: Algoritmo k-means básicoDatos: Datos de entradaResultado: Clasificación (Clusters)

1 Seleccionar k puntos como centroides iniciales;2 mientras Centroides cambien de lugar hacer3 Para K clusters asignar cada punto al centroide más cercano;4 Recaulcular el centroide de cada cluster;

5 fin

En la figura 3.15 se muestra un ejemplo del funcionamiento del algoritmo k-means.En el primer paso, los puntos son asignados a los centroides iniciales. Despues deque los puntos son asignados a los centroides, el centroide es actualizado. En laiteración 2, los puntos son asignados a los centroides actualizados, y los centroidesson actualizados de nuevo. En las iteraciones 2, 3 y 4, dos de los centroides semueven a los dos pequeños grupos de datos en la parte inferior de la figura. En laiteración 4, el algoritmo termina debido a que ya no ocurren más cambios, es decir,los centroides han dejado de moverse.

Fig. 3.15: Uso del algoritmo K-means para encontrar 3 clusters. Imagen de [44]

Asignar puntos al centroide más cercano Para asignar un punto al centroidemás cercano, es necesario una medida de proximidad que cuantifique la noción decercanía para datos específicos. La distancia Euclidiana (L2) es usada a menudo paradatos en el espacio euclidiano, mientras que la similitud de cosenos es más apropiadapara documentos. Sin embargo, existen otros tipos de medidas de proximidad, comola distancia de Manhattan (L1) o la distancia de Jaccard.


Generalmente, la medida de proximidad usada por K-means es relativamente simpledebido a que el algoritmo calcula repetidamente la similitud de cada punto con cadacentroide. En la siguiente tabla se muestran algunas de las funciones de proximidadque pueden ser usadas con el algoritmo k-means.

Función de proximidad Centroide Función Objetivo

Manhattan (L1) Mediana Minimizar la suma de la distancia L1 deun objeto hacia su centroide.

Euclidiana (L2) Media Minimizar la suma de la distancia L2 deun objeto hacia su centroide.

Coseno Media Minimizar la suma de la similitud decosenos de un objeto hacia su centroide.

Divergencia de Bregman Media Minimizar la suma de la divergencia deBregman de un objeto hacia su centroide.

En este trabajo se utilizó la distancia euclidiana debido a que es muy sencilla. Acontinuación se muestra la fórmula de la distancia euclidiana.

dx,y =√

(x2 − x1)2 + (y2 − y1)2 (3.8)

Para medir la calidad de un cluster se necesita una función objetivo, en este caso seutiliza la suma de errores cuadráticos. En otras palabras, calculamos el error de cadapunto, por ejemplo, su distancia euclidiana al centroide más cercano; y entonces secalcula la suma total de los errores cuadráticos. Dados dos conjuntos diferentes declusters que se produjeron por dos corridas diferentes de k-means, se prefiere el quetenga el menor error debido a que esto significa que los clusters están representandomejor los puntos. La suma de errores cuadráticos se define de la siguiente forma

E =K∑i=1

∑x∈ci

dist(ci, x)2 (3.9)

Donde dist es la distancia euclidiana entre 2 objetos en el espacio euclidiano, ci es eli-esimo cluster y x es un punto en Ci.

Complejidad de k-means Los requerimientos de espacio de k-means, son mín-imos, ya que sólo almacena los datos y los centroides. Específicamente el alma-cenamiento requerido es O((m + K)n), donde m es el número de puntos y n esel número de atributos. Los requerimientos de tiempo para k-means también sonmodestos, el tiempo requerido es (I ∗K ∗m ∗n) donde I es el número de iteracionesrequeridas para llegar a la convergencia.


Algunos problemas de k-means

Manejando clusters vacíos Uno de los principales problemas con k-means, esque el algoritmo puede generar clusters vacíos si no se almacenan puntos en uncluster durante la etapa de asignación. Si esto sucede, entonces es necesaria unaestrategia para elegir un nuevo centroide. Un enfoque generalmente usado es elegirel punto que se encuentre más alejado del centroide actual. Otro enfoque es elegirel nuevo centroide, desde el cluster que tenga mayor suma de errores cuadrados.Generalmente esto dividirá el cluster y reducirá el error promedio del clustering.

Valores atípicos Cuando se usa el criterio del error cuadrado, los valores atípicospueden tener mucha influencia en los cluster encontrados. En particular, cuando losvalores atípicos están presentes, los clusters pueden no ser tan representativos comodeberían ser. Debido a esto, es una práctica común, identificar los valores atípicos yeliminarlos.

Distribución normal El algoritmo k-means requiere que los datos a analizar ten-gan una distribución normal.

Requiere el valor de K Uno de los parametros importantes para el algoritmok-means es el valor de K, es decir, el número de cúmulos que se requieren. Sinembargo, también existen otros métodos que no requieren que se especifique unvalor para K.


4Resultados

„I do not fear computers. I fear the lack of them.

— Isaac Asimov

En esta sección se mostrarán los resultados de este trabajo. El trabajo fue dividioen módulos, tal como se muestra en la figura 2.1, por lo tanto se mostrarán losresultados individuales de cada módulo.

4.1 Filmación de videosUna vez que las larvas de pez cebra estuvieron listas, se procedió a filmarlas durante1 minuto. Dicha filmación se realizó utilizando un programa escrito en Matlab yuna cámara web. Se decidió utilizar un programa personalizado y no el softwarecomercial de la cámara ya que dicho software no permite tener un control totalsobre todas las funciones de la cámara (compensación de contraluz, brillo, contraste,velocidad de cuadros, gama, matiz, saturación, nitidez, balance de blancos), dichasfunciones pueden ser controladas en nuestro programa de filmación. En la figura 4.1se puede observar la pantalla principal del programa. En caso de que el usuario

Fig. 4.1: Pantalla principal del software de filmación

quiera cambiar algunas propiedades de la cámara, es decir, cambiar brillo, nitidez,contraste, etc; se agregarón barras de configuración para poder cambiar dichaspropiedades. En la figura 4.2 se puede observar la pantalla de configuración de las

35

propiedades de la cámara. En el software de filmación también se puede cambiar la

Fig. 4.2: Pantalla de configuración de las propiedades de la cámara

resolución del video y el espacio de color (Fig. 4.1).

4.2 Series de tiempoPara poder obtener la frecuencia cardíaca, es necesario tener una señal que nosmuestre los latidos del corazón. Como ya se mencionó en el capítulo 2, esto serealizó al medir la intensidad de los pixeles de un área específica y evaluar cómocambia la intensidad a lo largo del tiempo. Al medir la intensidad de los pixeleses importante sólo evaluar el área deseada, ya que si se realizan mediciones dezonas que no sean de interés, se obtienen señales con ruido y por lo tanto difícilesde analizar. En la figura. 4.3 se muestra una pantalla del módulo de análisis dela intensidad de los pixeles. Se puede observar que la ROI sólo abarca el área delcorazón del pez. En parte inferior de la figura se muestra la señal que se genera deacuerdo a los movimientos del corazón del pez. Una vez finalizado el análisis seobtiene una señal como la que se muestra en la figura. 4.4.

36 Capítulo 4 Resultados

Fig. 4.3: Adquisición de la intensidad de los pixeles en un video de una larva depez cebra a 72 horas post fertilización

4.2 Series de tiempo 37

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Fig.

4.4:

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4.3 Obtención de la frecuencia cardíaca

Una vez que se ha obtenido la señal de los latidos del corazón, se puede proceder ala fase de la obtención y análisis de la frecuencia cardíaca. Como se explicó en lametodología, se usó la transformada rápida de Fourier para obtener la frecuenciacardíaca. Básicamente, se aplicó la transformada rápida de Fourier a la señalobtenida en la fase de obtención de señal cardíaca (Fig. 4.4) y al obtener el espectrode frecuencias de la señal, se puede observar que la señal dominante corresponde ala frecuencia cardíaca.

Fig. 4.5: Resultado de aplicar la transformada rápida de Fourier a la señal de laFig. 4.4

En la figura. 4.5 se muestra el resultado de la transformada de Fourier. La frecuenciacardíaca es la frecuencia dominante. En este pez tomado como ejemplo, la frecuenciacardíaca es 3.09 latidos por segundo.

4.3 Obtención de la frecuencia cardíaca 39

4.3.1 Validación de la frecuencia cardíaca obtenida por elprogramaEl rendimiento cardíaco en las larvas de pez cebra (n = 66) fue evaluado utilizandoel análisis automático presentado en este trabajo y también mediante examinaciónvisual (Fig. 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 4.10, 4.11).

En la condición control, el valor medio de la frecuencia cardíaca obtenido usando elanálisis espectral fue 196.18 ± 23.38 latidos por minuto, mientras que el obtenidomediante conteo manual fue de 196.32 ± 23.16 latidos por minuto. No se en-contraron diferencias estadísticamente significativas entre los valores obtenidos(p > 0.05-Prueba t) (Fig. 4.6, 4.7).

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Fig. 4.6: Condición Control. La frecuencia cardíaca determinada utilizando elanálisis espectral es similar a la determinada mediante conteo manual.

En la condición anestesiados (tricaina), el valor medio de la frecuencia cardíacaobtenido usando el análisis espectral fue de 166.36 ± 15.84 latidos por minuto,mientras que el valor determinado mediante conteo manual fue de 166.27 ± 15.29latidos por minuto. No se encontraron diferencias significativas entre los valoresobtenidos (p > 0.05-Prueba t). (Fig. 4.8, 4.9).

Finalmente, para la condición anestesiados tratamiento (Tricaina + Cafína), el valormedio de la frecuencia cardíaca determinado mediante el análisis espectral fue


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Fig. 4.7: Condición Control. Correlación lineal encontrada entre el análisis espectraly el conteo manual.


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Fig. 4.8: Condición anestesiados (tricaina). La frecuencia cardíaca determinadautilizando el análisis espectral es similar a la determinada mediante conteomanual.

168.64 ± 10.24 latidos por minuto, y por otro lado, el valor determinado medianteconteo manual fue de 168.14 ± 10.27 latidos por minuto. No se encontrarondiferencias significativas entre los valores obtenidos (p > 0.05-Prueba t) (Fig. 4.10,4.11).

4.3.2 Efecto de la Cafeína

Para validar la efectividad de nuestro análisis automático de la frecuencia cardíaca,se utilizó como anestesia tricaina, un anestésico que disminuye la frecuencia cardíaca.También se utilizó cafeína, ya que también muestra efectos sobre el ritmo cardíaco.

La frecuencia cardíaca media de las larvas anestesiadas con tricaina, determinadaa partir del Espectro de Fourier fue de 166.36 ± 15.84 latidos por minuto, la cualfue significativamente menor a la frecuencia media de las larvas del grupo Control(Fig. 4.12).

Como ya se mencionó en el capítulo 2, la cafeína es una sustancia que puede causararritmia, taquicardia, bradicardia y otros problemas al corazón. Sin embargo, en


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Fig. 4.9: Condición anestesiados (tricaina). Correlación lineal encontrada entre elanálisis espectral y el conteo manual.

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Fig. 4.10: Condición anestesiados y tratamiento (Tricaina + Cafeína). La frecuen-cia cardíaca determinada utilizando el análisis espectral es similar a ladeterminada mediante conteo manual.


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Fig. 4.11: Condición anestesiados y tratamiento (Tricaina + Cafeína). Correlaciónlineal encontrada entre el análisis espectral y el conteo manual.

Efecto de laTricaina

Control Tricaina

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100

150

200

250

Fig. 4.12: Efecto de la tricaina. En los peces tratados con tricaina, la frecuen-cia cardíaca muestra un decremento significativo (p < 0.01-Prueba tpareada).


este caso, al combinarse con la tricaina no se encontraron diferencias significativasentre las larvas antes y después de agregar la cafeína (Fig. 4.13).

Fig. 4.13: Efecto de la cafeína. No se encontraron diferencias significativas entrelas larvas con Tricaina y las larvas con Tricaina y Cafeína.


4.4 Análisis de cúmulosEn la presente tesis el proceso de clasificación se llevó a cabo utilizando el algoritmode clustering K-means. Como se mencionó en la metodología, se utilizaron 3 gruposexperimentales para este trabajo:

• Control

• Anestesiados (Tricaina)

• Anestesiados con tratamiento (Tricaina + Cafeína)

Aunque se utilizaron 3 grupos experimentales, la finalidad del análisis de cluster fuepoder identificar larvas que tuvieran alguna droga, es por esto, que se decidió queen el análisis de cúmulos, se buscarían 2 cúmulos, Larvas sin tratamiento (Control)y larvas con tratamiento (tricaina o tricaina + cafeína).

En la figura. 4.14, se muestra el resultado de la separación de cúmulos. Se puedeobservar como el algoritmo es capaz de separar los datos en 2 cúmulos, los cualesrepresentan el cúmulo del grupo control y el cúmulo de larvas con alguna droga.

En la siguiente tabla se muestran los resultados de la separación de los cúmulosutilizando k-means:

Datos Correctos Incorrectos

Control 70% 30%

Droga 94% 6%

Otros parámetros importantes en este tipo de clasificación son los porcentajes deSensibilidad y especificidad. La sensibilidad se define como habilidad de clasificarcorrectamente un individuo como enfermo (en este caso, con droga) y la especifici-dad es la habilidad de clasificar correctamente a un individuo como sano (en estecaso, sin droga) [45].

Sensibilidad Especifidad

94% 70%

Como se puede ver, la clasificación automática funciona aceptablemente bien paradetectar las larvas con droga, sin embargo, tiene una especifidad baja, por lo tantono es confiable cuando determina que una larva no tiene droga.


Fig. 4.14: Separación de los datos en 2 cúmulos. El cúmulo 1 corresponde a losdatos control y el cúmulo 2 corresponde a los datos de las condicionesexperimentales.

4.4 Análisis de cúmulos 47

5Conclusiones y discusión

„Here ends a legend. It has been a greatexperience. I hope you won’t forget me and I’llnever forget what you and Starcraft did to me.Bye.

— Ilyes "Stephano" Satouri

5.1 Discusión

En este trabajo se presentó un método rápido (en comparación al conteo manual)para analizar funciones cardíacas en pequeños animales transparentes, como larvasde pez cebra, usando técnicas de procesamiento digital de imágenes, procesamientodigital de señales y aprendizaje automático.

5.1.1 Preparación del animal

El análisis de la función cardiaca el pez cebra requería inmovilización del animal, yaque movimientos durante la filmación hubiesen ocasionado problemas en el análisisde los datos. Por lo tanto, la inmovilización fue un paso muy importante para que laadquisición de videos fuera satisfactoria. El pez cebra generalmente es inmovilizadomediante anestesia, aquí se utilizó tricaina a una concentración de 0.2mg/ml. Conesta concentración no sólo se buscaba anestesiar al pez, sino también, causar unareducción de la frecuencia cardíaca, ya que se ha demostrado que la Tricaina enconcentraciones altas disminuye la frecuencia cardíaca y aumenta la probabilidadde muerte [46, 47].

El paso de la filmación de videos es muy importante, ya que los videos seránanalizados y a partir de ellos se obtiene la frecuencia cardíaca. En otros trabajos elposicionamiento es un paso muy importante para la preparación de la captura delvideo (Mantener la larva en posición horizontal, etc.). Sin embargo, con nuestrométodo, la orientación del pez no afecta en la determinación del cambio en laintensidad de los pixeles.

49

5.1.2 Determinación de la frecuencia cardíaca

Mediante el monitoreo del cambio en la intensidad de los pixeles fue posible generaruna señal digital que representa los latidos del corazón de la larva y usando latransformada rápida de Fourier se determinó la frecuencia cardíaca. No se encon-traron diferencias significativas entre la frecuencia cardíaca determinada por latransformada de Fourier y la determinada mediante conteo manual, esto sugiere quela frecuencia determinada por ambos métodos es equivalente. Usar la transformadade Fourier nos permitió determinar la frecuencia cardíaca rápidamente y además,mediante un proceso completamente automatizado, el cual libera al investigador dela tediosa tarea de contar los latidos para poder obtener la frecuencia cardíaca.

Para demostrar la efectividad de nuestro método automatizado se realizaron pruebascon larvas expuestas a tricaina, ya que la tricaina (en grandes cantidades), ademásde anestesiar a la larva también causa disminución de la frecuencia cardíaca. Nuestrométodo fue capaz de detectar la disminución de la frecuencia cardíaca.

5.1.3 Análisis de cúmulos

Básicamente el análisis de cluster agrupa los datos basándose en la similitud entre losellos. En este trabajo se analizaron 3 grupos experimentales: control, anestesiadosy anestesiados y tratamiento. Sin embargo, la finalidad del análisis es identificarautomáticamente, con base en el análisis espectral, las larvas que están bajo elinflujo de un fármaco y las que no lo están. Como se mencionó en la sección deresultados la separación en cúmulos mediante el algoritmo k-means tiene una muybuena sensibilidad y por otro lado, tiene una especifidad muy baja. En este trabajosólo se utilizó el algoritmo k-means para la separación de cúmulos, sin embargo,existen muchos más algoritmos así como otras técnicas de cúmulos. Una posibleforma de mejorar el porcentaje de especifidad será probar otros algoritmos decúmulos y buscar un algoritmo que logre obtener buenos porcentajes de sensibilidady especifidad.

5.2 ConclusiónEn esta tesis se presenta un método completamente automatizado para determinar lafrecuencia cardíaca en larvas de pez cebra a partir de videos del corazón de la larvay mediante técnicas de procesamiento digital de imágenes y procesamiento digitalde señales. Al obtener la series de tiempo mediante la medición de los niveles de grisen los videos, nuestro método generó la señal cardíaca de una forma no invasiva.

50 Capítulo 5 Conclusiones y discusión

Al usar la transformada de Fourier nuestro software pudo detectar la frecuenciacardíaca eficazmente, además, encontró otras frecuencias, que podrían ser útiles paradetectar arritmias. Además se presenta un clasificador que intenta identificar a laslarvas que están bajo el influjo de un fármaco y separarlas de las que no están bajo elinflujo del fármaco. También se demuestra que los resultados obtenidos con nuestrométodo son indistinguibles de los del conteo manual pero con las ventajas que ofreceel procesamiento digital de videos, como rapidez, reproducibilidad y exactitud. Estemétodo puede ser usado para la evaluación de otras drogas cardiotóxicas.

5.3 Trabajo FuturoEn esta tesis se propuso un método para detección y cuantificación automática de lafrecuencia cardíaca en la larva del pez cebra a partir de videos del corazón. Aunqueel objetivo principal fue logrado, aún existen mejoras que se pueden agregar almétodo.

En la etapa de obtención de series de tiempo, se requiere que el usuario delimiteel corazón de la larva usando un ROI, se propone como trabajo futuro agregar unmétodo de segmentación que automáticamente segmente el corazón sin necesidaddel usuario.

Los resultados presentados en la sección de análisis de cúmulos se obtuvieronmediante el algoritmo k-means. Se propone como trabajo futuro explorar otrosalgoritmos de análisis de cúmulos y también explorar con clasificadores. Esto espara examinar con que algoritmos se obtienen mejores resultados.

5.3 Trabajo Futuro 51

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Bibliografía 57

ColofónEsta tesis fue escrita en LATEX 2ε usando el estilo Clean Thesis. El diseño de este estilofue inspirado por los manuales de usuario de Apple Inc.

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Declaración

Por la presente declaro que esta tesis contiene búsqueda de literatura e investigaciónoriginal escrita por mí y que es el registro de los trabajos realizados por mí y que nose ha presentado en otra solicitud de un grado más alto. También declaro que hicetodas las citas y referencias a todo el material y resultados que no son originales deeste trabajo.

DeclarationI hereby declare that this thesis contains literature survey and original researchwritten by me, that it is the record of work carried out by me and that it has notbeen submitted in any previous application for a higher degree. I also declare that, ihave fully cited and referenced all material and results that are not original to thiswork.

Xalapa, December 8, 2013


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