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  • DETECCIÓN DE RESISTENCIA EN BACILOS GRAM NEGATIVOS

    Enterobacterias

    GLORIA D. PACHECO S. Especialista de Aplicaciones Senior BDDS México

    gloria_pacheco@bd.com Cel.: 5541947702

  • Importancia de estudiar la Resistencia Bacteriana

    Ø  Amenaza Pública Mundial Ø  Microorganismos multirresistentes Ø  La diseminación hospitalaria Ø  Aumento en los costos de

    hospitalización Ø  Utilizar adecuadamente los antibióticos

    actuales y hacer un uso racional de ellos.

  • A qué nos enfrentamos en nuestra rutina?

    •  En E. coli o Klebsiella •  Cuando el fenotipo no está de acuerdo con prueba de confirmación

    de ESBL en Vitek, MicroScan, Phoenix u otro sistema de susceptibilidad automatizado (e.j. Ceftazidima es I o R pero la prueba confirmatoria de ESBL es Negativa).

    •  En cualquier Enterobacteriaceae •  Una de las Cefalosporinas de 3ª. Generación es I o R y el resultado

    de la prueba confirmatoria de ESBL no esta dispone. •  Exista un patrón de resistencia atípica a varios antibióticos (e.j. P.

    mirabilis resistente a múltiples fármacos). •  Resistente a todos los antibióticos excepto Imipenem •  Resistente a Ertapenem, Imipenem o Meropenem.

  • Guía e Interpretación (Rev. 2-21-12) – Paul C. Schreckenberger, Ph. D., Violeta Rekasius, MT(ASCP)

    Ø Método confirmatorio de Difusión en Disco para ESBLs, AmpC, K1 y KPC

    Ø  Incluye 12 discos de antibióticos: CAZ, CAZ/CLA, CTX, CTX/CLA, ATM, CRO, FOX, CTT, FEP, ERT, IMP, MEM

    Ø  Se usan placas de MH de 150 mm

    Ø  Todas las especies de Enterobacterias con patrones de susceptibilidad: ESBLs, AmpC, K1, KPC, MLB

    Método de Potenciación del Doble Disco (Test de 12 discos)

  • Método de Potenciación del Doble Disco (Test de 12 discos)

    1.   Agar MH y los sensidiscos a la temperatura ambiente

    2.   Preparar una suspensión bacteriana a 0,5 McFarland

    3.   Sembrar en 3 planos sobre la superficie del agar MH

    4.   Colocar los todos los sensidiscos sobre la placa de agar MH en

    la misma placa de agar MH y en orden especificado

    5.   Incubar durante la noche a 35 °C

    6.   Al día siguiente leer y registrar todas las zonas de inhibición.

    M02- Sección 9.2 CLSI

  • MÉTODO DE POTENCIACIÓN DEL DISCO DOBLE (TEST de 12 discos)

    2

    3

    4

    1

    5 6

    7

    8

    9

    10

    11

    12

    CTX-CLA

    ATM

    FEP

    CRO FOX CTT

    MEM

    ERT

    IMP

    CTX

    CAZ

    CAZ-CLA

    Plantilla para colocar los discos en el Test de 12 discos

  • Detección fenotípica de β-Lactamasas Bacilos Gram Negativos Entéricos

    Familia Enterobacteriacea: Ø  ESBLs Ø  AmpC Ø  K1 Ø  KPC y MLB

  • β-Lactamasas de Espectro Extendido

    ESBLs

  • ESBLs: Características funcionales •  Hidrólisis de:

    •  Penicilinas / Cefalosporinas (vía oral) •  Cefalosporinas de 3ª y 4ª Generación •  Monobactámicos

    •  No tiene actividad frente a: •  Cefamicinas (Cefoxitina Sensible) •  Carbapenems (IMP, MER, ERT)

    •  Usualmente es inhibida por: •  Clavulanato •  Sulfonas •  Avibactam (NXL-104)

    •  Plasmídicas

    Clase A (Ambler) – Grupo 2be

  • ESBLs en microorganismos diferentes de Klebsiella, E. coli y P. mirabilis

    •  La mayoría de Laboratorios no intentan detectar ESBLs en microorganismos diferentes de E. coli y Klebsiella

    •  Dos indicaciones para la prueba de ESBLs en otros microorganismos: •  ESBLs detectada en Klebsiella, E. coli y P. mirabilis •  Fenotipo sospechoso

    •  Cual prueba? •  Usar una prueba especifica (confirmatoria)

  • Test de Sinergia de Doble Disco para la detección de ESBLs

    Ceftriaxona

    Cefoxitina Ceftazidima

    Cefotaxima

    Amoxicilina-Clavulanato

  • Test de Sinergia de Doble Disco para la detección de ESBLs

    Ceftazidima

    Cefotaxima

    Ceftazidima Clavulanato

    Cefotaxima Clavulanato

    CLSI M100-S23, 2013

  • Detección de ESBLs β-Lactamasas de Espectro Extendido Para la detección de ESBLs se usan discos de Ceftazidime y Cefotaxime con y sin Ac. Clavulánico Método del disco combinado (CLSI M100-S23) E.coli con ESBLs

    11mm

    CAZ/CLAV =22 mm

    CAZ =11 mm 22 –11 = > 5mm

    ESBL

    22 mm

  • Como reconozco una ESBL en Enterobacterias

    •  Resistencia neta a Cefalotina •  Sensibilidad a IMP y/o MER •  Sensibilidad a FOX (Kl-, Pmi, Eco, Sal, Shi) •  Efecto huevo entre AMC y las C3aG •  Halos/MICs de Penicilina, C2aG, C3aG,

    C4aG y AZT afectados

  • Dificultades la Prueba de ESBLs

    •  Alto nivel de expresión de AmpC puede impedir el reconocimiento de una ESBLs

    •  Problema con especies que producen β-lactamasa AmpC inducible codificada cromosómicamente (ej. Enterobacter, Serratia, Providencia, etc.)

    •  Problema con E. coli y K. pneumoniae que adquieren plásmidos de AmpC

    •  Clavulanato puede actuar como un inductor de alto nivel de AmpC e incrementar resistencia a los antibióticos de screening, dando falsos negativos en la prueba confirmatoria de ESBLs

  • ¿Cuándo realizar el Test de los 12 Discos para detectar ESBLs?

    Para confirmar la presencia de ESBLs:

    Ø  E. coli o Klebsiella spp. con un fenotipo que no concuerde con la prueba de confirmación de ESBLs en los sistemas automatizados (por ejemplo, Ceftazidima es I o R, pero la prueba confirmatoria de ESBLs es Neg)

    Ø  Enterobacteria presente una de las Cefalosporinas 3ª I o R y no tener un resultado de confirmación de ESBLs

    Ø  Enterobacteria con un patrón atípico de resistencia (Por

    ejemplo, P. mirabilis resistente a múltiples drogas)

    Ø  Enterobacteriaceae resistente a: •  Todos los fármacos, excepto Imipenem •  Ertapenem, Imipenem o Meropenem

  • Detección de ESBLs β-Lactamasas de Espectro Extendido Método de Potenciación del Disco Doble P. mirabilis con ESBLs

    Efecto del Clavulánico indicativo de ESBLs

  • β-Lactamasas AmpC

  • β-Lactamasa tipo AmpC Clase C (Ambler) – Grupo 1

    •  Cromosómica •  Exp. Inducible / Derreprimida •  No se inhibe por:

    •  Acido Clavulánico •  Sulbactam •  Tazobactam

    •  Inhibida por: •  Oxacilina •  Cloxacilina •  Acido Borónico

    •  Variantes plasmídicas •  FOX R/I/S

  • β-Lactamasa AmpC

    M Y S P A C E

    -  Morganella -  Yersinia - Serratia - Providencia/P. aeruginosa - Aeromonas - Citrobacter freundii - Enterobacter, Hafnia

    •  Cefalosporinasa •  Hidroliza todos los antibióticos β-lactámicos excepto

    Carbapenems y Cefepime •  Algunas son inducibles •  Características de ciertos géneros:

  • E. coli con AmpC mediada por plásmidos

  • Como reconozco en Enterobacterias AmpC Plasmídica

    •  Resistencia neta a Cefalotina •  Sensibilidad a IMP y/o MER •  Resistencia o Sensibilidad a FOX (Kl-, Pmi, Eco, Sal, Shi) •  Sinergia entre APB y las C3G (y FOX) •  Halos/MICs de C3G y AZT afectados

    (bajo nivel de Resistencia) •  Halos/MICs de C4G no afectados

  • ESBLs vs. AmpCs ESBLs AmpCs

    Inhibidores (Pip/tazo, Amp/ sulbactam, Amox/clav) S R

    Cefoxitina, Cefotetan S R

    Ceftazidima Ceftriaxona R R

    Cefepime S/R S

  • S. marcescens con AmpC Cromosomal y ESBL

  • E. cloacae con AmpC Cromosomal y ESBL

  • Detección de β-Lactamasas AmpC E. coli con AmpC mediada por plásmidos- Método de Potenciación del disco doble

    No efecto clavulánico

    Cefepime (FEP) – S

    Cefoxitin (FOX) – R

    = AmpC

  • E. cloacae con AmpC Cromosomal y ESBLs positiva

    Método de Potenciación del disco doble

    Detección de β-Lactamasas AmpC

    Efecto Clavulánico entre Cefepime

    y el disco que contiene el Ácido Clavulánico

    = ESBL

    Cefepime (FEP) – S

    Cefoxitina (FOX) – R = AmpC

  • Detección de β-Lactamasas K1

    Ø  Producidas por K. oxytoca con resistencia a Ampicilina

    Ø  Hiperproducción confiere resistencia a Penicilinas, Cefuroxima, Aztreonam, Ceftriaxona pero son sensibles a CAZ y CTX

    Ø  Se usan los discos de ATM, CRO, CTX, CAZ para detectar estas Beta-Lactamasas

  • Detección de β-Lactamasas K1 Método de Potenciación del disco doble K. oxytoca con β-lactamasa cromosomal K1 , ESBL Negativo, AmpC Neg

    Ceftazidime-S

    No efecto clavulanico