descarga manual de prácticas 2014

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Revisado por:

Mtra. Adriana Patricia Rodríguez Hernández

Coordinadora de la Asignatura de Microbiología

Mtra. Adriana Pérez Soria

Mtra. Alma Laura Baires Várguez

Dra. Argelia Almaguer FloresEsp. Daniel Quezada Rivera

Mtro. Carlos Giroshi Bando Campos

Dra. Eileen Uribe-Querol

Q.F.B. Fernando J. Franco Martínez

C.D. Fernando Sánchez Hernández

M.C. Humberto Pérez Ramírez

Mtra. Isabel Martínez Sanabria

Mtro. Juan Antonio Arreguín Cano

C.D. Martha Concepción Chimal Sánchez

Dra. Santa Ponce Bravo

C.D. Víctor Manuel Mira Morales

Cuerpo colegiado de Microbiología

Lab. Leticia Cruz Fonseca

Esp. Mauricio Gilberto Gutiérrez García

C.D. Moisés Armando Flores Lides

C.D. Rosa Granados Sánchez

Personal de laboratorio

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LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO

INTRODUCCIÓN

Actualmente, el estudio de la Microbiología requiere tanto de conocimientos básicos de las

características estructurales de los diferentes microorganismos (bacterias, hongos y virus

principalmente) como de conocimientos de nuevas técnicas de biología molecular y microscópicas,

que aunadas a las técnicas tradicionales que han sido utilizadas para el estudio de los mismos, son

indispensables para su identificación fenotípica y genética.

Para poder aplicar los conocimientos de microbiología oral, se requiere que los estudiantes de

Odontología comprendan el papel que los microorganismos juegan en la presencia de

enfermedades infecciosas no sólo de cavidad bucal sino del cuerpo humano, así como la

importancia de conocer las diversas técnicas de laboratorio empleadas en el diagnóstico de

enfermedades a las que van a estar expuestos en sus quehaceres profesionales ya que como

profesionales clínicos se enfrentarán día con día a una gran variedad de infecciones buco-dentales

y maxilo-faciales.

Por otro lado, el microbioma oral humano representa un reto para el estudio de los

microorganismos, ya que habitan en ella alrededor de 700 especies residentes. Con lo cual el

estudio de de dicha microbiota es indispensable para comprender el beneficio mutuo entre la misma

y el cuerpo humano.

Para responder al desarrollo y avance de las ciencias básicas en la Facultad de Odontología, se

presenta este Manual de Prácticas de laboratorio de Microbiología, el cual se diseñó con el fin de

que los estudiantes conozcan y pongan en práctica técnicas básicas para la identificación

microbiana. Para que los alumnos, puedan adquirir la competencia que les permita entender con

más claridad los procesos microbianos, la resistencia farmacológica que han desarrollado algunos

de ellos, y remitir al paciente a un laboratorio solicitando los estudios necesarios para llegar al

diagnóstico y a la terapéutica más adecuada.

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OBJETIVOS GENERALES

Al término del desarrollo de las prácticas de laboratorio

El Alumno:

Conocerá los principios que emplea la microbiología clínica para la correcta identificación

de los microorganismos.

Sera capaz de aplicar las técnicas más usuales en el estudio de los microorganismos.

Adquirirá las habilidades necesarias para la manipulación segura de los microorganismos

en el laboratorio de microbiología.

Conocerá diversas técnicas virtuales para llevar a cabo la identificación genética de los

microorganismos.

Podrá poner en práctica los conocimientos adquiridos para aplicarlos en el diagnóstico

clínico, ordenando e interpretando los estudios microbiológicos.

Tendrá las bases dela investigación microbiológica en la rama odontológica.

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REGLAMENTO

Para realizar las prácticas los estudiantes, profesores y personal de laboratorio, deberá conocer y seguir las siguientes reglas:

1. Sólo podrán entrar al laboratorio los alumnos inscritos en la materia y grupo en el horario preestablecido, no se acepta la entrada de alumnos oyentes, acompantes ó personas ajenas al grupo.

2. Los alumnos se organizarán por equipos como el profesor a cargo se los indique.

3. El material que se utilice en cada práctica deberá solicitarse mediante vale y credencial vigente.

4. Al recibir el material, el alumno deberá revisar que se encuentre limpio y en buen estado.

5. El alumno deberá presentarse con bata larga blanca y limpia (no filipina y pijama quirúrgica), así como guantes, cubrebocas y material requerido en cada una de las prácticas.

6. Antes de realizar cada práctica, los alumnos deberán leerla y conocer su objetivo, fundamento y técnica. Asimismo, deberán traer contestado el cuestionario de la misma.

7. Es deber de todos los integrantes de equipo, tener conocimientos de la práctica, ya que se les preguntará de manera activa sobre el contenido de la misma.

8. Los resultados deberán ser siempre anotados cuidadosamente en el Manual de Prácticas conforme se vayan obteniendo.

9. La tolerancia máxima para la entrada al laboratorio la determinará el profesor a cargo.

10. Las inasistencias a las prácticas se calificarán con cero y no se podrán cambiar de fecha o reponer.

11. Cuando se abandone el laboratorio sin autorización del profesor, se considerará como inasistencia.

12. Está prohibido fumar, comer o ingerir líquidos dentro del laboratorio.

13. Cada grupo de prácticas se responsabilizará de la limpieza su mesa de trabajo y del equipo y material solicitado.

14. El orden y la limpieza deben perdurar durante el procedimiento de las prácticas. Así mismo, antes y después de cada práctica deberán limpiar la mesa de trabajo con desinfectante (proporcionado por el laboratorio) y al inicio y al término de la práctica.

15. Está prohibida la utilización de teléfonos celulares para fines ajenos de la práctica.

16. Si los alumnos utilizan dispositivos digitales para la toma de fotos ó videos durante la realización de la práctica, deberá ser por el alumno asignado por equipo y sin guantes de trabajo.

17. Los alumnos deberán colocar sus mochilas y cajas en la estantería destinada para ellas en la pared lateral.

18. Antes de ponerse los guantes, deberán quitarse todo tipo de anillos y/o joyas de manos y brazos.

19. El material que se rompa, deteriore o extravíe deberá reponerse en un máximo de 15 días por él/los alumnos responsables.

20. Etiquetar sus trabajos con número de equipo, fecha, microorganismo sembrado o teñido y en caso de ser la muestra de un compañero escribir las iníciales o nombre del alumno donante.

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21. Cuando se utilice el microscopio se tendrá especial cuidado en su manejo, el cual será demostrado en la primer práctica.

22. Los alumnos deberán presentarse al laboratorio para la revisión de sus resultados en el horario establecido para ello (el horario será publicado en la puerta de acceso al laboratorio).

23. Todas las cepas que se utilizarán en el desarrollo de las prácticas son potencialmente patógenas, por lo cual deberán manejarse estrictamente con guantes, cubrebocas y el manejo que les indique el profesor.

24. Para otorgar la calificación de las prácticas de laboratorio, se tomarán en cuenta los siguientes elementos:

a) Reporte de la práctica. b) Resolución de los cuestionarios de cada práctica. c) Evaluación de la práctica. d) Examen escrito y práctico final del laboratorio.

25. El valor del laboratorio para la calificación final será del 30%, como se indica en el programa de Microbiollogía.

26. El alumno que no acredite el laboratorio presentará automáticamente EXAMEN EXTRAORDINARIO DE MICROBIOLOGÍA.

Acuse de enterado del reglamento

He leído minuciosamente el reglamento del presente manual, aceptando los términos establecidos, de no cumplirlos aceptaré responsablemente mi expulsión del laboratorio.

Fecha: día/mes/año: _____/______/_______

Nombre de alumno(a):

Número de cuenta: Número de

lista

Grupo Equipo

Firma del alumno(a)

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TABLA DE COTEJO PARA EVALUACIÓN

El profesor a cargo debe anotar en escala del 1-10 la calificación de cada apartado, deberá firmar cada una con el promedio total por práctica.

PRÁCTICA USO DE

BARRERAS DE PROTECCIÓN

CORRECTO USO DE

MATERIAL Y EQUIPO

TRABAJO DE LABORATORIO (Cultivo, tinción

microscopía)

RESULTADOS Y OBSERVACIONES

CUERSTIONARIO Y/O

EVALUACIÓN

PROMEDIO TOTAL

I. Introducción al laboratorio y normas de bioseguridad.

Calificación y firma: Calificación y firma: Calificación y firma: Calificación y firma: Calificación y firma: Calificación y firma:

II. Descripciy manejo de equipo de laboratorio.


III. Tinción y morfología de colonia de bacterias y hongos Calificación y firma: Calificación y firma: Calificación y firma: Calificación y firma: Calificación y firma: Calificación y firma:

IV. Métodos genéticos para el estudio de microorganismos (práctica virtual). Calificación y firma: Calificación y firma: Calificación y firma: Calificación y firma: Calificación y firma: Calificación y firma:

V. Medios de cultivo, técnicas de siembra, morfología de bacterias y hongos. Calificación y firma: Calificación y firma: Calificación y firma: Calificación y firma: Calificación y firma: Calificación y firma:

VI. Estudio de Staphylococcus aureus y Streptococcus epidermidis, Streptococcus alfa, beta y gama hemolíticos. Calificación y firma: Calificación y firma: Calificación y firma: Calificación y firma: Calificación y firma: Calificación y firma:

VII. Exudado faríngeo


VIII. Prueba de actividad cariogénica (CRT bacteria) y sistema buffer. Calificación y firma: Calificación y firma: Calificación y firma: Calificación y firma: Calificación y firma: Calificación y firma:

IX. Estudio de microorganismos del surco gingival.


X. Estudio de Candida albicans


XI. Acción de los desinfectantes en el crecimiento microbiano. Calificación y firma: Calificación y firma: Calificación y firma: Calificación y firma: Calificación y firma: Calificación y firma:

XII. Antibiograma


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PRÁCTICA I INTRODUCCIÓN AL LABORATORIO Y NORMAS DE BIOSEGURIDAD.

Elaboró: CD. Víctor Manuel Mira Morales.

OBJETIVOS.

Durante el desarrollo de esta práctica, el alumno:

Conocerá los conceptos básicos sobre bioseguridad, que le permita reconocer los riesgos y métodos de prevención para los mismos en las prácticas de laborartorio.

Iniciará actividades prácticas de refuerzo a la parte teórica del programa de microbiología.

Conocerá las normas de bioseguridad que rigen a los laboratorios de microbiología, y de esa manera poder aplicarlas.

Reconocerá a qué tipo de bioseguridad es el laboratorio de microbiología de la FO, UNAM.

INTRODUCCIÓN.

Las Bacterias, virus, hongos u otros agentes infecciosos se estudian debido que pueden causar enfermedades, pueden ayudarnos a entender el mundo natural y por muchas otras razones, entre las que se incluye la posibilidad de aplicaciones industriales.

Ya que muchos agentes pueden ser patógenos para los seres humanos, animales u otras formas de vida, su utilización posee riesgos que varían dependiendo de cada agente y del modo de utilización.

Los patrones de seguridad han sido diseñados para reducir, a niveles aceptables, los riesgos inherentes a la utilización de materiales peligrosos. Se han seleccionado patrones estrictos para agentes peligrosos y menos estrictos para agentes que producen solamente problemas leves. Por tanto, los patrones de seguridad son compromisos diseñados para permitir que el trabajo necesario se realice con una exposición de mínimo riesgo, tanto para las personas que lo realizan como para las demás.

La Organización Mundial de la Salud (OMS) reconoce que la seguridad y, en particular, la seguridad biológica es una importante cuestión de interés internacional. Por lo que publicó el Manual de bioseguridad en el laboratorio en 1983. En él se alentaba a los países a aceptar y aplicar conceptos básicos en materia de seguridad biológica y a elaborar códigos nacionales de prácticas para la manipulación sin riesgo de microorganismos patógenos en los laboratorios que se encuentran dentro de sus fronteras nacionales. Actualmente ya se publicó la tercera edición del manual, donde la OMS subraya la importancia de la responsabilidad personal. Se han incluido nuevos capítulos que se ocupan de la evaluación de riesgos, el uso de las tecnologías del DNA recombinante en condiciones de seguridad y el transporte de material infeccioso. Esta edición también contiene información sobre seguridad tomada de Safety in health-care laboratories (1), que publicó la OMS en 1997. El Manual de bioseguridad en el laboratorio de la OMS clasifica a los laboratorios como sigue:

laboratorio básico – nivel de bioseguridad 1 (NB1)

laboratorio básico – nivel de bioseguridad 2 (NB2)

laboratorio de contención – nivel de bioseguridad 3 (NB3)

laboratorio de contención máxima – nivel de bioseguridad 4. (NB4)

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Las designaciones del nivel de bioseguridad se basan en una combinación de las características de diseño, construcción, medios de contención, equipo, prácticas y procedimientos de operación necesarios para trabajar con agentes patógenos de los distintos grupos de riesgo.

MATERIALES PARA LA PRÁCTICA.

INFORMACIÓN BÁSICA DE BIOSEGURIDAD

A. Definición de Peligro Biológico

En la definición de Riesgo Biológico se incluyen los agentes infecciosos o etiológicos, los materiales potencialmente infecciosos, ciertas toxinas y otros materiales biológicos peligrosos.

Peligro Biológico

Agentes Biológicos y materiales que son potencialmente peligrosos para los seres humanos, animales y/o plantas.

Entre los agentes biopeligrosos se encuentran: Ciertas bacterias, hongos, virus, Rickettsias, Chlamydia sp., parásitos, productos recombinantes, alérgenos, cultivos de células humanas y animales y los agentes potencialmente infecciosos que contengan estas células, viriones, priones y otros agentes infecciosos que se contemplan en leyes, normativas y normas.

B. Clasificación de los Agentes Infecciosos en base a su Peligrosidad (Grupos de Riesgo)

Existen diversos sistemas para clasificar los patógenos humanos y animales de acuerdo con los peligros que presenten para un individuo o una comunidad. La clasificación más utilizada en U.S.A. es la que se encuentra en las NIH Guidelines for Research Involving Recombinant DNA Molecules. Los agentes etiológicos humanos se clasifican en cuatro grupos de riesgo de los que el GR-1 es el que presenta un peligro bajo o nulo y el GR-4 representa a los agentes altamente infecciosos:

Tabla 1. Bases para la Clasificación de Agentes Biopeligrosos en Grupos de Riesgo

Grupo de Riesgo

Riesgo para el individuo y la comunidad

1 (GR-1) Agentes que no están asociados con enfermedades en humanos adultos sanos: Bacillus subtilis, Hepatitis canina, E. coli, Saccharomyces cerevisiae, virus varicela Zoster, así como algunas cultivos de célula y bacterias no-infecciosas.

2 (GR-2)

Agentes asociados a enfermedades humanas que son raramente graves y para los que se dispone, con frecuencia, de intervenciones preventivas y/o terapéuticas: Virus de hepatitis B, virus de hepatitis C, virus de la gripe, Borrelia burgdorferi, salmonella, VIH.

3 (GR-3)

Agentes asociados con enfermedades humanas graves o letales para los que se puede disponer de intervenciones preventivas o terapéuticas (elevado riesgo individual pero bajo riesgo para la comunidad). Bacillus anthracis, priones, rubula virus, virus del Nilo Occidental, virus SRAS, viruela, Mycobacterium tuberculosis, Rickettsia prowazeki, virus de la fiebre amarilla, hantavirus, y virus del dengue.

4 (GR-4)

Agentes que probablemente causan enfermedades humanas graves o letales para los que normalmente no se dispone de acciones preventivas o terapéuticas (alto riesgo individual y alto riesgo para la comunidad). Machupo virus Fiebre hemorrágica boliviana, virus de fiebre hemorrágica argentina, Marburgvirus, virus Ébola, virus de Lassa y otras enfermedades hemorrágicas, sobre todo las africanas.

http://www4.od.nih.gov/oba/guidelines.html

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Equivalencia entre Grupos de Riesgo y Nivel de Bioseguridad

La determinación del GR de un agente biológico está incluida en la determinación del riesgo de biopeligro y ayuda a asignar el nivel de bioseguridad para la contención. En general, los agentes del GR-2 se manipulan con un nivel de Bioseguridad NB-2, y los agentes del GR-3, con un NB-3. Sin embargo, la manipulación en grandes cantidades de agentes del GR-2 podría requerir unas condiciones de NB-3, mientras que algunos agentes del GR-3 podrían manipularse de forma segura a un NB-2 bajo ciertas condiciones.

C. Seguridad Biológica y Niveles de Bioseguridad

La bioseguridad es la aplicación del conocimiento, las técnicas y el equipamiento para prevenir la exposición del personal, el laboratorio y el medio ambiente a agentes potencialmente bio-infecciosos. La bioseguridad define las condiciones de contención bajo las cuales los agentes infecciosos se pueden manipular con seguridad. El objetivo de la contención es confinar los peligros biológicos y reducir la exposición, de las personas que hacen prácticas de laboratorio.

La contención se puede llevar a cabo mediante los siguientes medios:

Contención Primaria: Protección del personal y del ambiente del laboratorio mediante la utilización de buenas técnicas microbiológicas (práctica en el laboratorio) y el uso de equipos de seguridad apropiados.

Contención Secundaria: Protección del ambiente exterior al laboratorio de la exposición a materiales infecciosos mediante la combinación de el diseño de las instalaciones y los hábitos de trabajo seguros

De forma general, los cuatro Niveles de Bioseguridad definen la contención necesaria para proteger al personal y al medio ambiente

Nivel de Bioseguridad 1 (NB-1) - es el menos restrictivo.

Nivel de Bioseguridad 4 (NB-4) - requiere un laboratorio o instalaciones con contención

especial.

Tabla 2. Relación de los grupos de riesgo con los niveles de bioseguridad, las prácticas y el equipo.

Grupo de riesgo Nivel de

bioseguridad Tipo de laboratorio

Prácticas de laboratorio

Equipo de Seguridad

1 Básico Nivel 1 Enseñanza básica

investigación TMA

Ninguno trabajo en mesa de laboratorio al

descubierto

2 Básico Nivel 2 Servicios de atención primaria

diagnóstico investigación TMA y ropa; protectora, señal de riesgo biológico

Trabajo en mesa al; descubierto y CSB, para

posibles aerosoles

3 Contención Nivel 3 Diagnóstico especial

investigación

Prácticas de nivel 2 más ropa especial acceso

controlado y flujo direccional del aire

CSB además de otros medios de contención primaria para todas las

actividades

4 Contención máxima

Nivel 4 Unidades de patógenos

peligrosos

Prácticas de nivel 3 más cámara de entrada con cierre, hermético salida con ducha y eliminación

especial de residuos

CSB de clase III o trajes presurizados junto con

CSB de clase II, autoclave de doble puerta (a través de la pared), aire filtrado

TMA: técnicas microbiológicas apropiadas. CSB: cámara de seguridad biológica.

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Basándonos en la clasificación de la OMS nuestro laboratorio se encuentra clasificado en:

Nivel de Bioseguridad 1

En este nivel se trabaja con agentes que presentan un peligro mínimo o nulo para el practicante del laboratorio y para el ambiente. El acceso al laboratorio no es restringido y el trabajo se realiza por lo regular en mesas estándar de laboratorio. En este nivel no se requiere equipo especial ni tampoco un diseño específico de las instalaciones. Los practicantes de estos laboratorios son generalmente supervisados por un científico con entrenamiento en microbiología. En nuestro caso los alumnos estarán supervisados por el profesor encargado del laboratorio y por su profesor de asignatura.

D. Desinfectantes Químicos En las Tablas 3a y 3b se resumen las propiedades y las aplicaciones más importantes de los desinfectantes químicos líquidos de uso más frecuente.

BV - Bacterias Vegetativas. LV - Lipovirus. VNL - Virus no lipídicos (v) depende del virus. MB - Micobacterias. EB - Esporas

Bacterianas.

IN- Inflamable. C - Corrosivo. IR - Irritante. T – Tóxico

E. Hábitos de trabajo seguros

Objetivos:

proteger al alumno frente a la exposición de agentes infecciosos.

prevenir la contaminación ambiental.

proporcionar un lugar de trabajo seguro.

Tabla 3a. Propiedades y aplicaciones de los desinfectantes.

Desinfectante

Requerimientos prácticos (tiempo de contacto en

minutos) Adecuado para desinfección de

Lipovirus Amplio espectro BV LV VNL MB EB

Etanol 10 30 + + V

Isopropanol 10 30 + + V

Compuestos Clorados

10 30 + + + + +

Formaldehído 10 30 + + V + +

Sales de Amonio cuaternario

10 30 +

Tabla 3b. Propiedades y aplicaciones de los desinfectantes.

Desinfectante

Desinfección de Propiedades Superficie de

trabajo Vidrio IN C IR T

Etanol + + +

Isopropanol + + +

Compuestos Clorados + + +

Formaldehído + +

Sales de Amonio cuaternario + +

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Las actitudes y las acciones de los alumnos que trabajan en el laboratorio determinan su propia seguridad, la de sus compañeros y la de la facultad. El diseño y equipamiento del laboratorio únicamente contribuirán a la seguridad si se utilizan de forma adecuada.

TÉCNICA Y PROCEDIMIENTO.

1. Prácticas y Procedimientos

Vías de Infección Durante las prácticas con materiales infecciosos, en un laboratorio microbiológico, se pueden producir infecciones con más frecuencia que en otros individuos de la facultad. Se produce una infección cuando un microorganismo patógeno se introduce en el cuerpo humano en suficiente número y a través de una vía particular y sobrepasa el sistema de defensa del cuerpo. Las vías de infecciones más frecuentes adquiridas en el laboratorio son

Boca

o Comer, beber y fumar en el laboratorio

o Pipetear con la boca

o Transferencia de microorganismos a la boca mediante los dedos o utensilios

contaminados (bolígrafos, lápices)

Piel

o Inoculación accidental con una aguja hipodérmica, otros instrumentos

punzantes o vidrios

o Cortes, rasguños

Ojos

o Salpicaduras de materiales infecciosos en los ojos

o Transferencia de microorganismos a los ojos mediante dedos contaminados

Pulmones

o Inhalación de microorganismos transportados por el aire

Normas para una utilización adecuada y segura del laboratorio: El elemento clave es la actitud proactiva hacia la seguridad y la información que permita reconocer y combatir los riesgos presentes en el laboratorio. Será fundamental la realización meticulosa de cada técnica, pues ninguna medida, ni siquiera un equipo excelente puede sustituir el orden y el cuidado con que se trabaja.

1. Cualquier persona que entre al laboratorio debe entender los riesgos biológicos y otros riesgos con los que se pueden encontrar durante su trabajo normal en el laboratorio y estar entrenados en las precauciones de seguridad y procedimientos apropiados.

2. El laboratorio debe estar ordenado y limpio, y se debe minimizar el almacenamiento de

materiales innecesarios para el trabajo.

3. No se deben bloquear la parte baja de las mesas o pasillos con mochilas, u otros elementos que entorpezcan la correcta circulación.

4. Se deberá evitar el uso de accesorios colgantes que interfieran con los diversos materiales

y equipos con los que se trabaja.

5. Profesores y alumnos debe llevar perfectamente abrochada la bata la cual debe ser de manga larga y cubrir debajo de las rodillas.

6. La ropa protectora del laboratorio no debe llevarse en otras áreas fuera del laboratorio. al

retirarse del laboratorio debe envolverse la bata de tal manera que la parte exterior de esta

quede hacia adentro y meterla inmediatamente a una bolsa plástica. Dicha bata deberá

lavarse por separado metiéndola antes del lavado en una solución desinfectante (ej. agua

con cloro)

7. Debe llevarse calzado apropiado, y cerrado no deberán entrar en sandalias o huaraches o zapatos de tacón pues estos pueden condicionar a accidentes en el laboratorio.

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8. Se debe utilizar guantes de látex desechables para realizar cualquier procedimiento en el que la piel pueda entrar en contacto con colorantes, sangre, o materiales biológicos infecciosos (cepas y materiales con los que se obtengan las muestras).

9. No deberá tocar con los guantes puestos, objetos, ni superficies, tales como: teléfono,

lápices, cuadernos, bolsas de mano, o puertas, etc.

10. Los guantes deben quitarse cuidadosamente y descontaminarse junto con el resto de residuos del laboratorio antes de tirarlos.

11. Se deben lavar las manos después de quitarse los guantes, antes de salir del laboratorio y siempre después de manejar materiales que se sabe o se sospecha que son contaminantes.

12. Se debe llevar gafas protectoras cuando sea necesario proteger la cara y los ojos de salpicaduras, impacto de objetos, o sustancias nocivas.

13. No se permite comer, beber, fumar, almacenar comida, efectos personales o utensilios, aplicar cosméticos ni poner o quitar lentes de contacto, en ningún área del laboratorio.

14. No se debe correr en el laboratorio.

15. El cabello largo debe llevarse sujeto y usar gorro preferentemente de algodón. 16. Las superficies de trabajo deben estar limpias y deben descontaminarse con un

desinfectante adecuado al final de la sesión y siempre que se haya producido un derrame de materiales potencialmente peligrosos.

17. Cualquier procedimiento técnico debe realizarse de tal forma que se minimice la formación de aerosoles.

18. Todos los materiales, líquidos o sólidos, contaminados o infecciosos, deben

descontaminarse antes de reutilizarlos o desecharlos.

19. Se deben extremar las precauciones cuando se utilizan agujas y jeringas para evitar la

autoinoculación y la generación de aerosoles durante su utilización y desechado. Los

procedimientos se deben realizar en campanas de seguridad biológica.

20. Verificar las etiquetas de los reactivos, medios o colorantes que se usen.

21. Las manos deben lavarse cuidadosamente después de cualquier manipulación de

laboratorio y antes de retirarse del mismo.

22. Siempre que sea necesario proteger los ojos y la cara de salpicaduras o impactos se

utilizarán anteojos de seguridad, evitando que se reciban inóculos infectados.

23. Uso de cubrebocas: protege de eventuales contaminaciones con saliva. Con esta medida

se previene la exposición de mucosas de boca y nariz.

24. Al hacer frotis, exámenes directos, siembras en medios de cultivo y toma de muestras

deberán estar prendidos los mecheros de Bunsen.

25. Está prohibido desechar líquidos o materiales biológicos por los desagües de las tarjas.

26. No tocar con las manos y menos con la boca los medios y reactivos.

27. Todo el material, especialmente los aparatos delicados, como contador de colonias y

microscopios, deben manejarse con cuidado evitando los golpes o el forzar sus

mecanismos.

28. Los cubreobjetos y portaobjetos deben tomarse por los bordes para evitar contaminarse y

así mismo evitar alterar el frotis.

Los elementos de protección personal son un complemento indispensable de los métodos de control de riesgos para proteger al alumno y para evitar la transmisión de infecciones.

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Principios de la Bioseguridad:

1- Universalidad: Todo el personal debe seguir las precauciones estándares rutinariamente para prevenir la exposición con materiales infecciosos.

2- Uso de barreras: Comprende el concepto de evitar la exposición directa a materiales potencialmente infecciosos, mediante la utilización de materiales adecuados que se interpongan al contacto de los mismos. La utilización de barreras (ej. guantes) no evitan los accidentes de exposición a estos fluidos, pero disminuyen las probabilidades de una infección.

3- Medios de eliminación de material contaminado: Comprende el conjunto de dispositivos y procedimientos adecuados a través de los cuales los materiales utilizados en la atención de pacientes, son depositados y eliminados sin riesgo.

Elementos básicos de la bioseguridad

Los elementos básicos de los que se sirve la Seguridad Biológica para la contención del riesgo provocado por los agentes infecciosos son tres:

Prácticas de trabajo.

Equipo de seguridad (o barreras primarias).

Diseño y construcción de la instalación (o barreras secundarias).

1- Prácticas de trabajo

Prácticas de trabajo normalizadas son el elemento básico y a la vez el más importante para la protección de cualquier tipo de trabajador. Las personas que están en contacto, más o menos directo, con materiales infectados o agentes infecciosos, deben ser conscientes de los riesgos potenciales que su trabajo encierra y además han de recibir la formación adecuada en las técnicas requeridas para que el manejo de esos materiales biológicos les resulte seguro.

2- Equipo de seguridad

Se incluyen entre las barreras primarias tanto los dispositivos o aparatos que garantizan la seguridad de un proceso (como por ejemplo, las cabinas de seguridad) como los denominados equipos de protección personal (guantes, calzado, pantallas faciales, mascarillas, etc.).

3- Diseño y construcción de la instalación

La magnitud de las barreras secundarias dependerá del agente infeccioso en cuestión y de las manipulaciones que con él se realicen. Vendrá determinada por la evaluación de riesgos.

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Niveles de Bioseguridad (NB).

Niveles de bioseguridad

Agentesinfecciosos Prácticas Equipamiento de

seguridad. (Barreras primarias)

Infraestructura (Barreras secundarias)

Nivel 1 No causales de enfermedad en adultos sanos

Trabajos microbiológicos estándares

No se requieren Mesas con tarja y agua corriente

Nivel 2

Asociados con enfermedades en adultos, peligro de infección por: herida percutánea, ingestión, exposición de membranas mucosas

BSL-1 más: Acceso limitado, Señalización de peligro biológico, Manual de bioseguridad disponible, descontaminación rutinaria de desechos seleccionados

Gabinetes de seguridad Clase I o II para todas las manipulaciones de agentes que puedan causar aerosoles o derrames. Guardapolvos, guantes y mascarillas cuando se requieran

BSL-1 más: autoclave dedicada

Nivel 3

Exóticos con potencial de transmisión por aerosoles, causales de enfermedades serias o letales

BSL-2 más: Acceso controlado, Descontaminación de todos los desechos, Descontaminación de ropa de trabajo, Controles serológicos periódicos

BSL-2 para todas las manipulaciones, respiradores autónomos cuando se requieran

BSL-2 más: Separación física de pasillos y laboratorios, Puertas de acceso doble con cerradura automática, Aire viciado no recirculado, Flujo de presión negativa en el laboratorio

Nivel 4

Exóticos peligrosos con alto riesgo de enfermedad letal, infecciones transmisibles por aire y por vías desconocidas

BSL-3 más: Cambio de ropa antes de entrar al recinto, Ducha descontaminante al salir del mismo, todos los materiales descontaminados para salir del ámbito

Todos los procedimientos llevados a cabo en gabinetes Clase III, o gabinetes Clase I y II en combinación con traje completo de presión positiva

BSL-3 más: Edificio aislado o zona caliente. Sistema de circulación de aire, vacío y descontaminación dedicados.

Los niveles de bioseguridad son estándares internacionales y su clasificación está dada en función del grado de letalidad de las enfermedades.

REGLAS BÁSICAS DE HIGIENE Y SEGURIDAD EN LABORATORIOS

Las medidas de Seguridad en Laboratorios son un conjunto de medidas preventivas destinadas a proteger la salud de los que allí se desempeñan frente a los riesgos propios derivados de la actividad, para evitar accidentes y contaminaciones tanto dentro de su ámbito de trabajo, como hacia el exterior.

Las reglas básicas aquí indicadas son un conjunto de prácticas de sentido común realizadas en forma rutinaria.

Procedimientos ante emergencias:

Si ocurre una emergencia tal como: cortes o abrasiones, quemaduras, se deberá proceder:

Derrames y salpicaduras de material potencialmente infeccioso:

a. Las medidas a tomar son responsabilidad exclusiva del Laboratorio de Microbiología y bajo ningún concepto del personal de limpieza.

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b. Lavado. Primero se eliminan los restos grotescos de cristal, plástico, agar, etc., después se lava con abundante agua y un detergente acuoso y a continuación se inicia la desinfección. Hay que tener en cuenta que cualquier sustancia orgánica (agar sangre, restos de peptona, etc.) es extraordinariamente bloqueante de la capacidad oxidativa del hipoclorito sódico y de la capacidad de actuación de los iodóforos; por ello, la norma es primero limpiar y después desinfectar.

c. Desinfección. Se empleará un desinfectante preferentemente líquido. Los más útiles en el laboratorio son:

i. Hipoclorito sódico. De elección para suelos, cerámica, etc. No debe usarse en superficies metálicas. Se utiliza a la dilución pertinente para conseguir 50000 p.p.m. de cloro libre. Se vierte haciendo un círculo alrededor del derrame, o mejor sobre papel absorbente, y se deja actuar 20 minutos.

ii. Iodóforo. Se utiliza a la dilución indicada por el fabricante. Adecuado en superficies metálicas.

iii. Alcohol etílico al 70%. iv. Productos detergentes desinfectantes. Agentes como Virkon® (peróxido

tamponado con surfactante), de fácil manejo, no corrosivo, no irritante, especialmente activo en presencia de materia orgánica y que cambia de color cuando deja de ser activo.

Referencia:

Organización Mundial de la Salud (OMS). Manual de bioseguridad en el laboratorio. 3ª

Edición. Ginebra 2005. http://www.who.int/csr/resources/publications/biosafety/CDS_CSR_LYO_2004_11SP.pdf?ua=1

Acuse de enterado de las normas de bioseguridad.

He leído minuciosamente la guía de normas mínimas de seguridad que acompaña esta práctica, aceptando los términos establecidos

Fecha: d/m/a: _____/______/_______

El /La alumno/a

No. de cuenta: No. de lista

Grupo Equipo

Nombre y Firma del alumno/a

http://www.who.int/csr/resources/publications/biosafety/CDS_CSR_LYO_2004_11SP.pdf?ua=1

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OBSERVACIONES Y RESULTADOS.

Las observaciones y resultados de esta práctica se calificaran después de observar cómo trabajan los alumnos durante el desarrollo del resto de sus prácticas.

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CUESTIONARIO PREVIO A LA PRÁCTICA.

1. Completa y ordena la siguiente tabla:

2. ¿Nivel de bioseguridad al que pertenece nuestro laboratorio?

3. ¿Cuántos son y cuáles son los principios de bioseguridad?

4. ¿Cuántos y cuáles son los elementos básicos de seguridad?

5. Menciona 5 reglas básicas de higiene y seguridad en el laboratorio.

6. Menciona 5 elementos de protección personal.

7. Menciona 3 de los procedimientos ante emergencias.

Niveles de bioseguridad

Agentesinfecciosos Prácticas Equipamiento de

seguridad. (Barreras primarias)

Infraestructura (Barreras

secundarias)

Nivel __

Exóticos con potencial de transmisión por aerosoles, causales de enfermedades serias o letales

BSL-2 para todas las manipulaciones, respiradores autónomos cuando se requieran

Nivel __

BSL-1 más: Acceso limitado, Señalización de peligro biológico, Manual de bioseguridad disponible, descontaminación rutinaria de desechos seleccionados

BSL-1 más: autoclave dedicada

Nivel __

BSL-3 más: Cambio de ropa antes de entrar al recinto, Ducha descontaminante al salir del mismo, todos los materiales descontaminados para salir del ámbito

BSL-3 más: Edificio aislado o zona caliente. Sistema de circulación de aire, vacío y descontaminación dedicados.

Nivel __ No causales de enfermedad en adultos sanos

No se requieren

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RESPUESTAS.

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EVALUACIÓN DE LA PRÁCTICA.

La calificación final de esta práctica se obtendrá después de observar cómo trabajan los alumnos durante el desarrollo de sus prácticas, en conjunto con la actividad anterior.

Fecha ____________ Nombre del Alumno ___________________________________ Firma del Profesor _________________

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PRÁCTICA II DESCRIPCIÓN Y MANEJO DE EQUIPO Y MATERIAL DE

LABORATORIO.

Elaboraron: CD. Fernando Sánchez Hernández, C.D. Victor Mira y

Mtra. Adriana Patricia Rodríguez

OBJETIVOS.


Conocerá el equipo y material de uso general en el laboratorio de Microbiología.

Aprenderá el manejo y uso correcto del equipo y material que utilizará durante el desarrollo de sus prácticas.

Conocerá las partes de un microscopio ótico, así como las bases para su funcionamiento.

INTRODUCCIÓN.

Un laboratorio de Microbiología es un lugar habilitado para el manejo y estudio de microorganismos. Es importante recordar que la finalidad es determinar las características de los mismos, papa poder llegar a su identificación.

Para la realización de cultivos en el laboratorio, es indispensable contar con el siguiente material, sin embargo para cada práctica se puede especificar material adicional. A continuación se describirá el material de uso principal con algunas consideraciones:

Mechero de bunsen: deberá manipularse en un radio de 10-15cm de la llama del mechero. Al terminar de utilizarlo deberán cuidar que no se haya quedado abierta la llave de paso del gas.

Gradillas: servirán para la colocación de las asas bacteriológicas, de tubos de ensaye y porta objetos en uso.

Asas bacteriológicas: serán utilizadas para la propagación de cultivos bacterianos, con distintas técnicas de purificación.

Pizetas con agua esteril: son de gran utilidad para realizar frotis y para el lavado intermedio durante las técnicas de tinción.

Cinta: es indispensable para marcar y fijar pilas de placas de cultivo.

Marcadores: para el marcaje adecuado de las muestras.

Porta objetos y cubreobjetos: para la realización de fotis y distintas técnicas de tinción microbiológica.

Tubos de ensaye: para la realización de cultivos acuosos y dilusiones.

Cajas de Petri: para la realización de cultivos a base de Agar.

Batería de tinción:

Puente para tinción: para colocar los portaobjetos y poderlos lavar en las tarjas.

Reactivos: los determina la técnica.

Los laboratorios deberán disponer de los aparatos e instrumental necesario para el correcto desarrollo de su actividad. Entre ellos encontramos los siguientes:

Autoclave: es el método de primera elección, para esterilizar el instrumental y los materiales de uso y de desecho del laboratorio de microbiología. Tiempo de esterilización 15 libras de presión 121º C durante 15 - 20 min. para material y 2 para desechos microbiológicos.

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Estufa de incubación: es una cámara de temperatura controlada para cultivo de microorganismos. Se utiliza para facilitar el desarrollo de los microorganismos a su temperatura óptima de crecimiento (generalmente 35-37ºC).

Jarra de anaerobiosis: recipiente de acrílico de forma cilíndrica, tapa de cierre hermético. El interior tiene una base para las cajas de petri o tubos de ensaye, se emplea para brindar las condiciones atmosféricas necesarias para el desarrollo de los microorganismos anaerobios estrictos, microaeróflicos, capnofílicos y anaerobios facultativos.

Refrigerador: se utilizan para conservar tanto materiales (medios de cultivo, reactivos) como microorganismos. Generalmente están a una temperatura fija de 4ºC.

Micropipetas: instrumento de laboratorio empleado para succionar y transferir pequeños volúmenes de líquidos y permitir su manejo en las distintas técnicas analíticas. Tipos de micropipeta unicanal y multicanal. Es muy importante contar con el tamaño de puntas adecuadas parael calibre de micropipetas que se vaya a utilizar, y conocer su funcionamiento antes de utulizarlas.

Microscopios ópticos: para el adecuado manejo de los Microscopios, es indispensable considerar los siguientes apartados: adecuada transportación, limpieza, manejo adecuado de oculares (los de uso de aceite de inmersión). El desarrollo de la Microbiología como ciencia tiene su apoyo en la microscopia tanto óptica como electrónica. La primera para observar morfología, agrupación y motilidad y la segunda nos permite observar ultraestructura celular. A continuación se describirán detalles del microscopio:

Partes del sistema óptico.

OCULAR: Lente situada cerca del ojo del observador. Amplia la imagen del objetivo.

TUBO DEL OCULAR: Esta colocado en la parte superior del microscopio, donde están acoplados los oculares.

REVOLVER O DISCO GIRATORIO: Esta debajo del tubo ocular donde están acoplados los objetivos, presenta movimiento giratorio para facilitar el cambio de un objetivo a otro.

OBJETIVO: Lente situada cerca de la preparación. Amplia la imagen de ésta.

CONDENSADOR: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparación.

DIAFRAGMA: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador (Cortinilla que se puede cerrar o abrir a voluntad mediante una palanca).

FOCO: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador.

Partes del sistema mecánico.

SOPORTE: Mantiene la parte óptica. Tiene dos partes el pie o base y el brazo.

PLATINA: Superficie plana en la que se coloca la preparación sujeta mediante pinzas.

CARRO: Es un dispositivo ubicado sobre la platina cuya función es sujetar y mover la laminilla que se va a observar posee dos tornillos que permiten movimientos horizontales ( hacia delante, y hacia atrás, hacia la derecha y hacia la izquierda).

CABEZAL: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular o binocular.

TORNILLOS DE ENFOQUE: Macrométrico que aproxima el enfoque y micrométrico que consigue el enfoque correcto.

Para ver interactivo de ensamblaje del microscopio revisar la siguiente página:

http://www.olympusmicro.com/primer/java/microassembly/index.html

Transportacion y manejo del microscopio.

Al trasladarlo colocar una mano sobre la base y la otra en el brazo o columna y desplazarlo

en posición erguida. No inclinarlo ya que se pueden caer los oculares o salirse los filtros.

Es responsabilidad de los alumnos la integridad de los filtros.

Antes de usarlo, debe cerciorarse de que los lentes (objetivos, oculares, condensador y

filtro no falten y estén limpios). De no ser así reportarlo de inmediato.

http://www.olympusmicro.com/primer/java/microassembly/index.html

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Transportara el microscopio a una mesa fija, de tal modo que pueda sentarse con

comodidad para ver el ocular sin apoyarse.

Enchufar el cable del microscopio a la toma de corriente.

Se girará el revólver hasta situar el objetivo de menor aumento (el más corto) en línea con

el ocular.

Accionando el tornillo macrométrico, se subirá la platina hasta el tope. No forzar ninguno

de los elementos mecánicos, si alguno no se puede accionar convenientemente, reportar.

Colocar la preparación sobre la platina. Se debe procurar que el objeto a observar quede

centrado.

Encender la luz mediante el interruptor situado en la base.

Mirando por el ocular, cerrar el diafragma lo más posible, accionando su palanca en

sentido contrario a la manecillas del reloj. Debe observarse el campo iluminado con una

luz ni muy brillante ni demasiado tenue.

Mirando por el ocular, accionar el mando de enfoque lentamente en sentido de las

manecillas del reloj parar bajar la platina alejando la preparación del objetivo hasta que el

objeto se observe. Ajustar el enfoque mediante el tornillo micrométrico.

Moviendo la preparación, buscar una zona de observación adecuada.

Para observar con un objetivo de mayor aumento, girar el revólver al objetivo siguiente.

Para enfocar, normalmente, será necesario girar unas pocas vueltas el tornillo

micrométrico en un sentido o en el otro. Si el campo se muestra muy oscuro, abrir algo el

diafragma.

Al finalizar su trabajo bajar la platina quitar la preparación.

Colocar el objetivo de menor aumento en posición de observación.

Limpiar con papel suave y secante la platina.

Limpiar los objetivos con papel óptico sobre todo si uso aceite de inmersión.

Bajar la intensidad de la luz de la lámpara.

Apagar el microscopio.

Desenchufar y enrollar el cable para no pisarlo al transpórtalo, colocar una mano en la

base y la otra en el brazo para su devolución.

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Las observaciones y resultados de esta práctica se calificaran después de observar cómo

trabajan los alumnos durante el desarrollo del resto de sus prácticas.

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1. Mencione el equipo y material de laboratorio de uso en microbiología.

2. ¿Qué utilidad tiene la incubadora?

3. Describa todos los componentes de la incubadora.

4. ¿Qué utilidad tiene la jarra anaeróbica?

5. Explique el funcionamiento del autoclave.

6. ¿Para qué se utiliza sistema de refrigeración en Microbiología?

7. Mencione las indicaciones de utilización de una micropipeta.

8. ¿De cuantos sistemas se compone el microscopio?

9. ¿Qué es poder de resolución?

10. ¿Cuáles son los objetivos más utilizados en la práctica microbiológica?

11. ¿Por qué se llama objetivo de inmersión y en que difiere el objetivo de inmersión a los demás objetivos?

RESPUESTAS.

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PRÁCTICA III TINCIÓN Y MORFOLOGÍA DE BACTERIAS Y HONGOS

Elaboró: CD. Martha Concepción Chimal Sánchez.

OBJETIVOS.


Conocerá las diferentes técnicas de tinción para diferenciar las características microscópicas de bacterias y hongos.

Realizará la tinción más utilizada para la observación de bacterias y hongos.

INTRODUCCIÓN.

Las bacterias, hongos y protozoos se miden en micrómetros (µm), por lo que resulta necesario utilizar el microscopio óptico para poder observarlos. Estos microorganismos pueden ser clasificados basados en estructuras celulares como morfología, patrones de tinción, y observarlos al microscopio utilizando técnicas especiales o variables de acuerdo al microorganismo por ej.: Micobacterium sp.

Bacterias: son microorganismos unicelulares pertenecen al Domimio Bacteria con tamaños que van entre los 0.5 y 5 μm y presentan diversas morfologías: cocos, bacilos, espirilos y pleomorfos; son procariotas y por lo tanto a diferencia de las células eucariotas no tiene núcleo definido con una membrana. Generalmente poseen una pared celular compuesta de peptidoglicano con estructuras que las hacen diferentes. Muchas bacterias disponen de flagelos, pilis o fimbrias, cápsulas, otras presentan o no movilidad.

La observación de las estructuras de los microorganismos se facilita utilizando muestras teñidas, para ello se tiñen con colorantes que son compuestos químicos para aumentar el contraste, los colorantes pueden ser vitales, colorean células vivas y pueden añadirse directamente a este proceso se denomina técnica en fresco. Para realizar ésta observación microbiológica, podemos emplear directamente los productos patológicos o bien a medios de cultivos sólidos o líquidos.

Hongos: Pertenecen al Dominio Eukarya, son microorganismos unicelulares (levaduras) y pluricelulares (mohos), algunos pueden ser dimórficos dependiendo de las condiciones de crecimiento.

Su reproducción puede ser asexual a través de conidios o sexual por medio de esporas o por meiosis, su tamaño microscópico puede ser de 2 a 10 µm de diámetro pero también pueden tener tamaño macroscópico. Algunos hongos presentan relaciones simbióticas, saprófitas, forman parte algunos hongos de la flora normal bucal y convertirse en parásitos provocando infecciones en el hombre.

El uso de técnicas de tinción es importante en la observación e identificación de los microorganismos, utilizando en ocasiones diferentes colorantes. Una gran parte de los colorantes son efectivos después de que los microorganismos hayan sido fijados (adheridos al portaobjeto). La fijación puede ser por calor o fijación química.

Preparaciónes en fresco.

La forma más simple de preparar una muestra microbiológica para su examen microscópico es hacer una preparación en fresco. Las preparaciones en fresco sirven para observar microorganismos vivos. Existen dos técnicas:

http://es.wikipedia.org/wiki/Pared_celular

http://es.wikipedia.org/wiki/Peptidoglicano

http://es.wikipedia.org/wiki/Flagelo_bacteriano

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I.- Preparación en fresco simple: consiste en colocar una gota de líquido con una muestra de microorganismos sobre un portaobjetos y a continuación cubrirla con un cubreobjetos. En caso de que la muestra al hacer la observación al microscopio se observe que se está secando, lo que se hace es levantar el cubreobjetos y agregar más líquido y de inmediato recolocar el cubre y seguir observando.

II.- Una preparación en gota pendiente se realiza colocando una gota del material en un cubreobjetos y cubriéndolo con un portaobjetos (invertido) con una excavación central (portaobjetos excavado).

Con esta técnica se sella la preparación con vaselina alrededor de la excavación. La ventaja de esta última técnica, es que la preparación no se seca y puede ser observada durante un tiempo más largo, a diferencia de la otra forma de observación ya que el calor del microscopio puede secar la muestra y no permitir su observación o dar errores.

La preparación en fresco es el método de elección cuando se desea evitar la alteración que sufren los microorganismos en una muestra cuando ésta se somete a una fijación y a una posterior tinción. Permite observar de los la morfología, si presentan movilidad, color natural si lo tiene y tamaño real de los microorganismos.

El inconveniente de la observación en fresco es el no permitir aumentar el contraste de la preparación. Por tanto, su uso, con un microscopio óptico de campo claro, es limitado. Para observar microorganismos vivos también se utiliza alguno de los otros microscopios ópticos.

Los microscopios que se utilizan para observación de muestras microbiológicas vivas son: los microscopios compuestos de campo claro, otros son los microscopios especiales que son capaces de aumentar el contraste sin teñir, como son los microscopios de contraste de fases, el de campo obscuro y el de fluorescencia.

Frotis bacteriano.

Las tinciones aumentan artificialmente el contraste entre las células bacterianas y el medio circundante. Cuando en una tinción se utiliza un sólo colorante se denomina tinción simple, esta requiere que la muestra de estudio se someta al proceso de fijación para ser observada, ya sea en un frotis o en extensión sobre portaobjetos, lo que asegura una adecuada separación en las células y permite se distribuya de forma homogénea y posteriormente se realiza la tinción siguiendo los procedimientos adecuados.

Fijación: Sirve para inmovilizar las células bacterianas sobre el portaobjetos para que no sean arrastradas en los procesos posteriores de teñido y de lavado, aunque es inevitable que la fijación y tinción provoque la muerte de los microorganismos y altere algunas de sus características, pero si se realiza con cuidado puede disminuir los cambios. Existen dos formas de fijar a los microorganismos por calor o por químicos.

Fijación con calor: Se toma una pequeña porción de muestra del medio de cultivo sin desgarrar el medio con una ansa bacteriológica esterilizada en la flama y enfriar en un extremo del cultivo sin dañar las colonias o con un hisopo estéril, utiliza un portaobjeto, coloca una gota de solución salina o agua bidestilada y realiza una extensión, se deja secar al aire; inmediato se pasa la preparación sobre la llama de un mechero sin quemar la muestra, quedando de esta forma fijada la muestra o espécimen.

Fijación química: Útil para muestras o especímenes delicados se añade una gota del fijador al portaobjeto como puede ser ácido ósmico, tetróxido de osmio, aldehídos (formaldehido, paraformaldehído o glutaraldehido), compuestos mercuriales y crómicos, alcoholes, acetonas y dietil pirocarbonato añadiendo la muestra de microorganismos.

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Después de la fijación, se añade el colorante, que debe permanecer el tiempo suficiente en contacto con el espécimen, para que pueda ser absorbido. A continuación, se retira el exceso de colorante, normalmente lavando con agua.

Colorantes: Son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por los materiales celulares. Algunos colorantes utilizados son moléculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, como los ácidos nucléicos y polisacáridos. Colorantes catiónicos son el azul de metileno, cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son moléculas cargadas negativamente (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas proteínas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina ácida y el rojo Congo. Colorantes liposolubles los colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipídicos de la célula, usándose a menudo para teñir o identificar la localización de gránulos o depósitos de grasa. Un ejemplo de colorante liposoluble es el negro Sudán.

Mordientes: Los mordientes intensifican la tinción porque aumentan la afinidad de la célula con el colorante, algunos colorantes teñirán mejor sólo después de que la célula haya sido tratada con otra sustancia química, que no es un colorante por sí mismo. El mordiente se combina con un constituyente celular y lo altera de tal modo que ahora sí podrá atacar el colorante. Esta sustancia puede ser el ácido tánico.

Pasos de un frotis.

Con la información previa, se describirá de forma general como realizar un frotis:

1. Colocar una pequeña gota de agua o solución salina en el centro de un portaobjetos limpio, marcar con lápiz graso en un extremo las iníciales del microorganismo.

2. Encender el mechero y utilizar la flama azul, flamear el asa de siembra, tomar y acercar a la flama el medio de cultivo de donde se tomará, una pequeña cantidad del cultivo bacteriano en medio sólido con el asa bacteriológica, enfriándola en una esquina del medio sin dañar el cultivo y transferirlo a la gota de agua. Remover la mezcla con el asa de siembra hasta formar una suspensión homogénea que quede extendida no aglomerada para facilitar su secado.

3. Si la muestra se toma de un cultivo en medio líquido, no es necesario realizar los dos primeros pasos ya que basta con colocar y extender una gota de la suspensión bacteriana, que se toma con el asa de siembra esterilizada en la flama del mechero, directamente sobre el portaobjetos.

4. Esperar hasta que el líquido se evapore o acelerar su evaporación acercando el portaobjeto a la llama del mechero. En este caso hay que tener mucha precaución de no calentar demasiado el portaobjetos pues las células pueden deformarse o puede romperse el vidrio.

Una vez realizado el frotis y fijadas las bacterias, las preparaciones pueden ser observadas al microscopio, aunque carecen de contraste. Lo normal es continuar con el proceso de tinción.

Técnicas de tinción.

Existen tres tipos de técnicas de tinción: simples, diferenciales y selectivas o especiales.

Tinciones simples:

Las tinciones simples utilizan un único colorante, que siempre es de tipo básico. Se usan para incrementar el contraste, todas las células absorben el colorante y quedan teñidas del mismo color. Esta tinción simple mejora la observación de la célula completa. Se fija la muestra, se añade el colorante y se deja el tiempo adecuado para que se absorba, se retira el exceso de colorante y la

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preparación se observa al microscopio. Si se utiliza un mordiente, hay que añadirlo antes del colorante.

Tinciones diferenciales:

Las tinciones diferenciales se utilizan para distinguir diferentes tipos de microorganismos. La técnica de tinción diferencial consta de dos etapas: una tinción primaria (siguiendo el mismo método que en una tinción simple) seguida de una tinción de contraste. En la tinción de contraste se utiliza otro colorante que tiñe las células no teñidas por el primer colorante. Estas tinciones son muy útiles en microbiología. Por ejemplo, la tinción de Gram y la tinción de ácido-alcohol resistente (Ziehl-Neelsen), ambas aplicadas a bacterias. Permiten diferenciar entre grupos de bacterias que tienen distintas propiedades de tinción.

Tinciones Selectivas o especiales:

Las tinciones selectivas nos permiten observar estructuras de las células debido a su mayor afinidad por los colorantes utilizado.

Se pueden observar estructuras bacterianas como pared celular, cápsula, esporas. flagelos, material nuclear, e inclusiones como depósitos de materiales de reserva de poli-ß-hidroxibutirato, glucógeno y gránulos metacromáticos.

Tinción negativa en microorganismos con cápsula.

Pocas especies bacterianas pueden estar rodeadas de una envoltura que es una estructura de polisacáridos, llamada cápsula. Factor de virulencia de la bacteria. Protege a la bacteria de la fagocitosis y facilita la invasión, son responsables de la resistencia y de la adherencia a ciertas superficies y resistentes a la desecación. Permite la diferenciación en tipos serológicos. Está compuesta de azúcares y proteínas. No es una estructura vital para la bacteria, de modo que es posible que bajo determinadas condiciones ambientales o del propio desarrollo genere cápsula y bajo otras no lo haga. Las cápsulas constituyen un factor de virulencia de los microorganismos.

Para estudiar organismos con cápsula en el laboratorio se deben cultivar las bacterias en medios adecuados y en condiciones que favorezcan la producción de estas estructuras. Por sus características químicas no se tiñen con colorantes básicos como el cristal violeta o la safranina. Se pueden observar indirectamente mediante tinción negativa con tinta china o Nigrosina.

El colorante contiene partículas finas de carbono suspendidas en agua formado un coloide. Las partículas son grandes para penetrar a través de la matriz de la cápsula, por lo que sólo se teñirá el medio circundante y las células aparecerán sin teñir sobre un fondo de color negro. La tinta china o Nigrosina también se utiliza para observar células levaduriformes capsuladas como Criptococcus neoformans.

La tinción de cápsula se denomina tinción negativa porque tiñe el fondo de la preparación y no el microorganismo. Desde el punto de vista formal no es una tinción propiamente dicha, porque no fija los microorganismos. Se parece más a una preparación en fresco. Su realización, consiste en colocar la muestra húmeda sobre el porta objetos y mezclarla con tinta china, con un cubreobjetos se hace un barrido suave de la mezcla sin dañarla con el fin de distribuir el frotis.

Procedimiento:

Se deja secar el frotis y se observa al microscopio, la tinta cubre toda la preparación a excepción de las cápsulas. En el microscopio se observa el fondo negro y los microorganismos con cápsula sin color. La cápsula se observará como un halo transparente alrededor de la célula, que se verá de color grisáceo. Método de la tinta china para cápsula.

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1. En el centro de un portaobjetos se coloca una gota de agua, otra de tinta china o Nigrosina y un poco del cultivo de una cepa capsulada. Se mezcla suavemente sin extender.

2. Se coloca un cubreobjetos sobre la suspensión y se presiona suavemente evitando que queden burbujas.

3. Observar inmediatamente al microscopio. La cápsula se observa como una gran estructura alrededor de la célula delimitada por los pequeños fragmentos de carbón de la tinta china.

4. Llevar la preparación a un recipiente que contiene desinfectante para posteriormente su esterilización y desecho de la muestra.

Tinción de Gram

La tinción de Gram. Fue desarrollada empíricamente por Christian Gram en 1884, a pesar del tiempo transcurrido la tinción apenas se ha modificado y es uno de los primeros pasos que se realiza para cualquier identificación bacteriana. La técnica es capaz de diferenciar dos grandes grupos de bacterias: Gram positivas y Gram negativas. La diferenciación entre las bacterias Gram positivas y Gram negativas se establece en la naturaleza y características de la pared celular bacteriana.

Las bacterias Gram positivas poseen una gruesa capa de peptidoglicano que es capaz de retener al complejo colorante-mordiente (cristal violeta-yodo). Durante la decoloración con alcohol acetona se provoca una deshidratación de esta gruesa pared y se reduce la porosidad, atrapando entonces al complejo en el interior de la célula. Las bacterias Gram negativas, poseen una delgada capa de peptidoglicano no puede impedir la salida del complejo colorante-mordiente (cristal violeta-yodo) y es fácilmente teñida por el colorante secundario o de contraste.

Los dos grupos bacterianos a los que nos referimos tendrán diferente color, con el que finalmente se tiñen las bacterias. Gram positivas se observarán de color violeta o morado por el cristal violeta y no perderán esta coloración durante los pasos sucesivos. Las bacterias Gram negativas perderán la coloración inicial con los siguientes pasos y se teñirán de roja o rosa debido a la safranina.

Soluciones:

1. Primer colorante. Un colorante básico (+) catión que en contacto con las células cargadas negativamente, reacciona con ellas coloreándolas. El más utilizado es el cristal violeta o violeta de genciana.

2. Solución mordiente. Fija las tinciones y aumenta la afinidad entre el colorante y las células. Los mordientes usados tienen sales metálicas, ácidos o bases, por ejemplo: una solución diluida de yodo*.

3. Agente decolorante. Es un disolvente orgánico; alcohol acetona (1:1).

4. Colorante de contraste. Es un colorante básico de distinto color que el primer colorante, como la safranina.

Procedimiento:

1. Realizar el extendido de la muestra, colocando también una gota de agua bidestilada o

solución salina

2. Fijación del extendido

2.1. Métodos físicos: acción del calor

2.2. Métodos químicos: alcohol metílico (metanol)

3. Primer colorante: cristal violeta

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4. Mordiente: lugol

5. Decoloración: mezcla alcohol-acetona 1:1

6. Segundo colorante: safranina

* Solución de yodo: Lugol es un compuesto formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio) el cual está presente para solubilizar el yodo, actúa de mordiente, haciendo que el cristal violeta se fije con mayor intensidad a la pared de la célula bacteriana. El Yodo entra en las células y forma un complejo insoluble en solución acuosa con el cristal violeta.

Tinción de Ziehl-Neelsen.

La tinción de Ziehl-Neelsen desarrollada inicialmente por Paul Ehrlich para poner de manifiesto la presencia de los bacilos causantes de tuberculosis en muestras clínicas de pacientes es otra muy importante tinción diferencial.

La técnica es capaz de diferenciar dos grandes grupos de bacterias: Bacilos ácido alcohol resistentes (BAAR) positivas y BAAR negativas.

Las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias contienen ácidos grasos (ácidos micólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloración con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos. Por esto se denominan bacilos ácido-alcohol resistentes (BAAR). Las micobacterias como M. tuberculosis, M. marinum y otras micobacterias se caracterizan por sus propiedades de ácido-alcohol resistencia.

La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento, con el fin que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Al suspender el calentamiento y enfriar con agua, provoca una nueva solidificación de los ácidos grasos de modo que el colorante ya no puede salir de las bacterias. Por otro lado, el calentamiento aumenta la energía cinética de las moléculas del colorante lo cual también facilita su entrada a las micobacterias. Las bacterias que resisten la decoloración se observarán en el microscopio de color rojo y la que no, se observa de color azul.

Procedimiento:

1. Realizar un frotis.

2. Dejar secar en el ambiente y fijar por calor.

3. Cubrir todo el portaobjetos con fucsina fenicada.

4. Calentar suavemente con el mechero hasta la emisión de vapores.

5. El colorante no debe secarse, ni hervir, añadir más colorante si es necesario.

6. Mantener la emisión de vapores durante 5 minutos.

7. Lavar con un chorro fino de agua.

8. Decolorar con alcohol ácido

9. Lavar a chorro fino con agua

10. Cubrir el frotis con azul de metileno y dejarlo actuar durante un minuto.

11. Lavar con agua, a chorro fino, escurrir y dejar secar al aire.

12. Observar al microscopio con el objetivo de inmersión

Las bacterias Ziehl–Neelsen positivas (ZN+) o Bacilos ácido alcohol resistentes (BAAR) se observarán teñidas intensamente de color rojo y el fondo azul.

Tinción de esporas.

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Algunas bacterias son capaces de desarrollar formas de resistencia denominadas esporas como mecanismo de defensa a agresiones ambientales. Son estructuras de pared gruesa en las que el microorganismo logra soportar las condiciones desfavorables de calor, desecación, acidez, etc.

Cuando las condiciones ambientales vuelven a ser favorables las esporas vuelven a generar formas vegetativas y son formas de crecimiento activo de la célula. Por ese motivo, las endosporas son impermeables a los colorantes, por lo que cuando se hace una tinción, se observan al microscopio como formas refringentes y sin teñir.

Estas son formas latentes de células bacterianas producidas por ciertas bacterias en condiciones de ayuno. El citoplasma de la espora al ser deshidratado contiene dipicolinato de calcio siendo ácido dipicolínico el cual está relacionado con la resistencia de la espora al calor extremo. Los géneros Bacillus spp. y Clostridium spp.

son formadores de esporas.

Sin embargo, las endosporas se pueden teñir aplicando calor a la preparación previamente cubierta con una solución de colorante que en las técnicas de Shaeffer y Fulton es el verde de malaquita. El lavado con agua elimina este colorante de las células vegetativas y la aplicación de un colorante de contraste permitirá distinguir claramente a las esporas de color verde. La tinción específica de esporas requiere dos colorantes:

1. Verde malaquita: capaz de teñir las esporas en caliente.

2. Safranina: colorante de contraste que tiñe las formas vegetativas.

Las endosporas, tras la primera tinción, no perderán el colorante en el lavado con agua, y sí lo harán las formas vegetativas, que quedarán teñidas con él segundo colorante.

Emplear cultivos en fase estacionaria para dar lugar a que las bacterias produzcan las esporas. Esta tinción es delicada en su realización y para poder obtener resultados satisfactorios hay que seguir cuidadosamente las instrucciones.

MATERIAL PARA LA PRÁCTICA.

Microscopio.

Mechero de Bunsen.

Asa bacteriológica y micológica.

Puente de tinción.

Portaobjetos y cubreobjetos.

Para tinción de Gram Frasco con solución salina o agua estéril.

Frascos goteros para tinción de Gram.

Colorante de cristal violeta o violeta de genciana

Colorante de safranina

Mordiente Lugol

Decolorante alcohol-acetona

Para tinción de hongos Frasco gotero con azul de lactofenol

Porta objetos

Cubre objetos

Asa micológica

Cepas

Staphylococcus aureus.

Streptococcus pyogenes

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Candida albicans

Consumibles

Aceite de inmersión.

Gasas.

Toallas de papel.

Papel filtro o absorbente

Encendedor o cerillos.

Cinta adhesiva blanca.

Lápiz graso.


Metodología Limpiar, desinfectar el área de trabajo.

Prender los mecheros, ajustar la flama hasta presentar un cono azul bien marcado.

Identificar y organizar el material dentro del área de trabajo.

Marcar los portaobjetos con iníciales del microorganismo utilizado para la tinción.

Principios de la toma de muestra y manejo del material.

1. Evite la auto contaminación, la contaminación de los materiales y áreas circunvecinas. 2. Cuando tome la muestra de un medio sólido para que se extienda más fácilmente coloque una gota de solución salina o agua bidestilada y extender con el asa bacteriológica estéril, dejar secar y fijar. 3. Cuando se tome la muestra de un medio líquido puede tomar la muestra con el asa bacteriológica estéril, colocar en el portaobjeto sin usar agua, dejar secar al aire y fijar. 4. Para fijar la muestra caliente la laminilla en la flama del mechero tomando la temperatura con la palma de la mano para evitar el sobrecalentamiento ya que de lo contrario las bacterias serán destruidas y la tinción ya no será precisa.

TÉCNICA PARA LA REALIZAR EL FROTIS

I. Se realizará la técnica de tinción de Gram con dos géneros bacterianos Staphylococcus

aureus y Streptococcus pyogenes.

II. Se realizará la técnica en fresco con azul de lactofenol para el microorganismo Candida

albicans.

TINCIÓN DE GRAM.

Medios de cultivo con Staphylococcus aureus y Streptococcus pyogenes.

1. Preparar un frotis de cultivos de Staphylococcus aureus y Streptococcus pyogenes . Fijarlos cada uno en portaobjetos diferentes con calor y marcar en un extremo con lápiz graso las iníciales de la bacteria.

2. Cubrir el frotis con cristal violeta durante 1 minuto.

3. Lavar el frotis ligeramente con agua corriente a chorro fino.

4. Cubrir con lugol el frotis por de 1 minuto.

5. Lavar el frotis ligeramente con agua corriente a chorro fino.

6. Decolorar el frotis con alcohol-acetona hasta que el color salga ligeramente claro.

7. Lavar con agua corriente a chorro fino.

8. Cubrir el frotis con safranina durante 1-3 minutos.

9. Lavar el frotis con agua corriente a chorro fino.

10. Dejar secar el frotis al aire y observar al microscopio.

OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE HONGOS CON AZUL DE LACTOFENOL.

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EXAMEN EN FRESCO

I. Colocar una gota de azul de lactofenol en un portaobjetos

II. De la cepa en Sabouraud proporcionada por el laboratorio tomar una asada y colocarla en

el portaobjetos con el azul de lactofenol

III. Cubrir con un cubreobjetos y observar al microscopio y observar a 40X

IV. el resultado se interpreta:

a. positivo=presencia de blastoconidias y/o pseudomicelios.

b. negativo= ausencia de blastoconidias y/o pseudomicelios.


DIBUJOS DE LAS OBSERVACIONES AL MICROSCOPIO.

38


1. Mencione qué es una tinción microbiológica.

2. Escriba la clasificación de las tinciones microbiológicas.

3. Escriba cuatro sustancias que se utilizan para las tinciones.

4. ¿Cómo se clasifica a la tinción cuando se utiliza un solo tipo de colorante?

5. ¿Qué tipo de tinción se trata cuando se utilizan más de dos sustancias químicas para colorear a las bacterias, menciónelas?

6. ¿Describa cuáles son las técnicas para preparar un frotis?

7. ¿Cuáles son las precauciones que deben observarse en la realización de un frotis?

8. Describa la técnica de Gram y su fundamento.

9. Describa la técnica que debe utilizarse cuando las bacterias son ácido-alcohol resistentes

10. ¿Qué es una bacteria ácido alcohol resistente? Mencione dos nombres de bacterias y que enfermedades ocasionan

11. ¿Cuál es la tinción utilizada para mostrar estructuras bacterianas como las cápsulas? Escriba dos nombres de microorganismos con cápsula.

12. ¿Qué sustancia se utiliza en la tinción negativa?

13. ¿Cuál es la técnica de tinción que se utiliza para identificar gránulos metacromáticos?

14. ¿Cuáles son las tinciones se utilizan para observar flagelos?

15. ¿Cuáles son las tinciones se utilizan para observar hongos?

16. Dibuje las formas y agrupaciones de las bacterias que se pueden observar al microscopio óptico.

17. ¿Cuál es la morfología de las levaduras observadas al microscopio?

18. Describa la morfología que se observa en un frotis de Esherichia coli y mencionar si es hongo o bacteria.

19. ¿Cuál es la morfología bacteriana que se observa en un frotis de Staphylococcus aureus y Streptococcus pyogenes?

20. ¿Cuál es la técnica de tinción para observar Candida albicans?

RESPUESTAS.

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Fecha ____________ Nombre del Alumno ___________________________________ Firma del Profesor _________________________

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PRÁCTICA IV MÉTODOS GENÉTICOS PARA EL ESTUDIO DE LOS

MICROORGANISMOS (PRÁCTICA VIRTUAL). Elaboró: Mtra. Adriana Pérez Soria.

Mtra. Adriana Patricia Rodríguez.

OBJETIVOS:


Conocerá los métodos y técnicas para el diagnóstico genético de los microorganismos.

Conocerá el desarrollo de la investigación microbiológica básica y clínica por medio de la realización de una práctica virtual de secuenciación.

Integrará y aplicará el conocimiento adquirido con el fin de realizar una acertada identificación de los aislados bacterianos al consultar las secuencias depositadas en bases de datos genómicos de bacterias.

INTRODUCCIÓN:

Todo profesionista o estudiante de ciencias de la salud, en particular de odontología y medicina, deben de estudiar los microorganismos, las vías de entrada al hospedero, los cambios quimiofisiológicos y celulares que ocasionan así como los estados inmunitarios a los que dan lugar; el uso de sistemas profilácticos a través de medidas sanitarias y de productos biológicos, asimismo el alcance que brindan las más novedosas técnicas de laboratorio para el diagnóstico etiológico de los microorganismos causantes de enfermedades.

La correcta detección e identificación de los microorganismos presentes en muestras clínicas o de otros orígenes es imprescindible para determinar el origen de las infecciones, seguir el curso de las enfermedades y decidir los tratamientos a aplicar. Todos los puntos del proceso son importantes, desde la forma de tomar y mantener las muestras hasta su manipulación en el laboratorio.

Se puede decir que en el proceso de identificación de microorganismos se ponen en juego todos los conocimientos acumulados en Microbiología. La identificación de bacterias puede basarse en muchos caracteres pero los métodos genéticos son altamente específicos al emplear técnicas moleculares para el análisis filogenético mediante secuenciación de 16S rRNA.

Los métodos habituales para la identificación de microorganismos se basan en las características fenotípicas (morfología microscópica, tinción de Gram, características morfológicas de cultivo, pruebas de catalasa y de oxidasa, reacciones bioquímicas para detectar algunos metabolitos, utilización de algunas fuentes de carbono, etc.). Estos métodos son sencillos de realizar y son actualmente la columna vertebral en los laboratorios de microbiología clínica. La mayoría de los métodos fenotípicos estudian las propiedades metabólicas para poder identificar la mayoría de las especies cultivables, sin embargo, estos métodos tienen dificultades con algunas especies, de ahí la existencia de métodos genotípicos para la identificación de bacterias, los cuales se encuentran reservados para algunos patógenos que no puedan ser identificados por los métodos convencionales.

La principal ventaja de los métodos genotípicos es la utilización de DNA, el cual tiene una elevada conservación dentro de cada especie. La taxonomía bacteriana utiliza métodos de Biología Molecular, y al aplicarlos algunas de las especies admitidas por sus características fenotípicas están siendo reclasificadas en taxas distintos, al demostrarse que la secuencia del 16S rDNA no corresponde con la de su grupo taxonómico. Por otra parte, se están describiendo nuevos géneros y especies, al demostrarse que dentro de algunos géneros admitidos hasta ahora, se encontraban bacterias con características genómicas distintas. Una de las aplicaciones recientemente utilizadas es la detección de las especies bacterianas en las muestras clínicas y para llevar a cabo dicho estudio se emplean sondas marcadas que señalen las secuencias específicas de las especies a detectar. Este es el fundamento del método hibridación in situ fluorescente o Fluorescence In Situ

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Hibridization (FISH por sus siglas en inglés) , que utiliza sondas con un marcador fluorescente gracias al cual las bacterias pueden observarse en un microscopio de epifluorescencia. Otra técnica genética son los microarreglos (microarrays) que permiten identificar las especies mediante el uso de la tecnología de los 'chips' de DNA utilizando sondas para cada una de las especies que deseemos detectar. Sin embargo, los ejemplos de métodos genotípicos para el estudio del DNA bacteriano mayormente empleados son: hibridación DNA-DNA, reacción en cadena de la polimerasa o Polymerase Chain Reaction (PCR por sus siglas en inglés) , secuenciación de los genes del 16S y 23S rRNA, y ribotipado (Explicación breve). De los métodos citados, la secuenciación de los genes del 16S rRNA (16S rDNA) se ha convertido en el patrón de referencia (Gold Standard) de la taxonomía bacteriana.

Las desventajas de los métodos genéticos son: un costo superior y que requieren un equipo especial para el manejo de la muestra, mientras que la limitante de tales métodos está relacionada al elevado grado de conservación evolutiva del 16S rDNA que lo hace muy útil para realizar estudios genéticos a nivel de especie, o por encima de este nivel (géneros o familias). Sin embargo, no se pueden identificar adecuadamente subespecies o tipos (biotipos o serotipos). Para obviar estos problemas de la identificación a través de la secuenciación del 16S rDNA se están investigando actualmente otras secuencias como las denominadas tmRNA (10Sa RNA), constituido por un RNA pequeño, estable, y presente en unas 10.000 copias en el genoma bacteriano, codificadas por los genes del ssrRNA, de 363 nucleótidos con propiedades de tRNA y mRNA, aunque aún existen pocas secuencias disponibles, por lo que no se puede generalizar su aplicación.


El equipo y material que se requiere para el desarrollo de esta práctica es de alto costo por lo que el trabajo de laboratorio de Microbiología consistirá en realizar la secuenciación por métodos virtuales de aprendizaje.

Equipo

Proyector

Computadora con acceso a internet

ACTIVIDADES DE TAREA

Como requisitos para realizar la práctica virtual de secuenciación es necesario que el alumno además de contestar el cuestionario, haga lectura del siguiente capítulo:

Identificación bacteriana mediante secuenciación del RNAr 16S: fundamento,

metodología y aplicaciones en microbiología clínica. María del Rosario Rodicio y María

del Carmen Mendoza. Departamento de Biología Funcional. Área de Microbiología.

Universidad de Oviedo. España. http://zl.elsevier.es/es/revista/enfermedades-

infecciosas-microbiologia-clinica-28/identificacion-bacteriana-mediante-

secuenciacion-arnr-16s-fundamento-13059055-formacion-medica-continuada-2004.

DESARROLLO

Para la identificación de microorganismos mediante secuenciación del gen 16S se requiere primero de tener aislada la bacteria en cultivo para poder llevar a cabo cada una de las técnicas a continuación enlistadas.

1. Extracción de DNA

2. Amplificación del gen 16S rDNA

2.1. Montaje de reacciones de amplificación

2.2. Técnica de PCR

2.3. Electroforesis

3. Secuenciación

3.1. Secuenciación del DNA

4. Comparación con secuencias de bases genómicas

4.1. Identificación de resultados mediante herramientas informáticas

http://zl.elsevier.es/es/revista/enfermedades-infecciosas-microbiologia-clinica-28/identificacion-bacteriana-mediante-secuenciacion-arnr-16s-fundamento-13059055-formacion-medica-continuada-2004



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Para conocer los pasos y fundamentos de una secuenciación accede a las siguientes páginas de internet:

http://www.biologia.edu.ar/bacterias/identificacion/1.htm






Para hacer la práctica en un laboratorio virtual debes acceder a: http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/extraction/

http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/pcr/

http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/gel/

http://www.hhmi.org/biointeractive/vlabs/bacterial_id/

Para finalizar con la parte 4.- Identificación con herramientas informáticas, aquí tienes una ayuda de los pasos a seguir para corroborar tu identificación bacteriana.

Pasos para realizar una búsqueda bibliográfica

1º Pubmed: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi Seleccionar entre las varias opciones de búsqueda: proteínas, genomas completos, nucleótidos… etc. En nuestro caso son publicaciones y se debe de buscar en “Pubmed”. 2º En la ventana de “for”: introducir el parámetro de interés Probar resultados, por ejemplo: Nombre del autor, título de la publicación o journal.

Pasos para realizar un BLAST

1º BLAST: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ 2º Nucleotide-Nucleotide BLAST : (blastn), (en el apartado “Nucleotide”) Observar que se abre una pantalla nueva. 3º/ Abrir el documento en el que están depositadas las secuencias en formato FASTA. (“>”) y “copiar” toda la secuencia (en el escritorio: “Secuencia X”) 4º/ Volver a la ventana del BLAST y “pegar” la secuencia en la ventana “Search” Observar que pasa a otra pantalla “con una numeración”. Haz click en FORMAT 5º/ Pasado unos segundos, aparece el resultado de la búsqueda: Tratar de encontrar la siguiente información: - Microorganismo al que pertenece la secuencia “con probabilidad” - Indicar a qué pertenece esa secuencia - Quién depositó esa secuencia en el Banco de Genes







http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/extraction/

http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/pcr/

http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/gel/

http://www.hhmi.org/biointeractive/vlabs/bacterial_id/

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/

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1. ¿Qué es la microbiología clínica?

2. ¿Qué son los métodos genotípicos para la identificación de microorganismos?

3. ¿Qué es la fracción 16S rRNA y donde se encuentra?

4. ¿Qué es el gen 16S rDNA y cuál es su longitud?

5. ¿Porqué se utiliza el gen 16S rDNA para la secuenciación?

6. Explique en breve en qué consiste el método de secuenciación.

7. ¿Qué es herencia?

8. Dibuje las características ultraestructurales del DNA.

9. Explique mediante un diagrama de flujo cómo se transmite la información genética.

10. De los procesos anteriores, mencione las diferencias eucariontes y procariontes

11. ¿Qué es la replicación bacteriana?

12. Mencione los elementos que se requieren para llevar a cabo la replicación.

13. Mencione 3 tipos de mutación y describa en qué consisten.

14. Describa dos aplicaciones de la secuenciación.

15. ¿Qué es la electroforesis y para que se utiliza?

RESPUESTAS.

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Fecha ____________ Nombre del Alumno ___________________________________ Firma del Profesor _________________________

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PRACTICA V MEDIOS DE CULTIVO, TÉCNICAS DE SIEMBRA Y MORFOLOGÍA DE

BACTERIAS Y HONGOS. Elaboró: QFB. Fernando J. Franco Martínez

OBJETIVOS.


Conocerá los diferentes tipos de medios de cultivo de acuerdo a su composición química, características físicas y uso.

Realizara las diferentes técnicas de siembra en los diferentes medios de cultivo.

Describirá los aspectos más comunes de las colonias microbianas mediante observación macroscópica.

INTRODUCCIÓN.

Las bacterias están divididas en dos grupos nutricionales. El primero, son las heterótrofas que obtienen su energía química de componentes orgánicos preformados. Todos los patógenos humanos conocidos caen dentro de esta categoría. Después, existen las autótrofas, las cuales dependen de moléculas no orgánicas simples para fabricar su propio alimento. Estas son autosuficientes, proveyendo ellas mismas los nutrientes que necesitan para crecer.

Las bacterias fotosintéticas, por ejemplo, caen dentro de este grupo. Note que las bacterias clínicamente no importantes ha sido demostrado ser autótrofas.

Todo material en el cual los microorganismos encuentran nutrientes y en el que pueden reproducirse es un medio de cultivo.

Los medios de cultivo son preparados que intentan reproducir artificialmente las condiciones del habitad natural de los agentes microbianos. Sus componentes deben cumplir todas las necesidades nutriciones, esto permitirá su crecimiento y su multiplicación bajo condiciones óptimas de temperatura, pH, tensión de oxígeno y luminosidad.

Componentes que se utilizan para la elaboración de un medio de cultivo:

Agua: componente básico

Peptonas: se obtiene por hidrólisis ácida o enzimática de proteínas. Fuente fundamental

de nitrógeno, carbono y azufre.

Hidratos de carbono: glucosa, monosacáridos como fructosa, disacáridos como maltosa o

sacarosa o polisacáridos como almidón. Fuente de energía y carbono.

Extracto de carne: concentrado de productos hidrosolubles de la carne de composición

indefinida (corazón, cerebro, musculo o hígado de buey). Aporta elementos como xantina

e hipoxantina, glucógeno, ácido láctico, grasas, vitaminas, oligoelementos, etc.

Extracto de levadura: es un producto de la hidrólisis ácida o enzimática de la levadura de

pan o cerveza. Fuente importante de aminoácidos, vitaminas y factores de crecimiento.

Suero o sangre de caballo o de carnero, líquido ascítico y vitaminas: Para

microorganismos exigentes.

Cloruro de sodio: equilibra la presión osmótica del medio, evita la lisis celular.

Minerales y otras sustancias que los microorganismos no pueden sintetizar: hemina,

ácido glutámico, fósforo, calcio, hierro, manganeso, magnesio, etc.

Agentes solidificantes: se agregan para obtener medios sólidos y semisólidos. El más

utilizado es el agar (polímero obtenido de algas rojas como “Gelidium corneum”). Además

silicagel, se usa para medios definidos. La gelatina, no siempre puede usarse porque la

hidrolizan las bacterias.

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Clasificación de los medios de cultivo

Según su consistencia pueden ser:

Líquidos (caldos)

Semisólidos

Sólidos (agares)

Según su aporte nutritivo:

Usuales (contienen sustancias nutritivas mínimas para el crecimiento de las bacterias no

exigentes)

Enriquecidos (son medios usuales a los que se les añade suero, sangre o factores

esenciales como vitaminas o co-factores. Permiten el crecimiento de bacterias exigentes)

Según su utilización:

Medios de aislamiento (medios selectivos, medios de enriquecimiento y medios

selectivos diferenciales)

Medios para resiembra

Medios de identificación

Medios para antibiograma

Medios de conservación

La selección del medio de cultivo debe hacerse de acuerdo con el tipo de microorganismo que se quiera aislar, o de acuerdo al estudio que se vaya a realizar.

TECNICAS DE SIEMBRA.

Para efectuar el estudio de los microorganismos, se han diseñado diversos métodos que permiten cultivarlos bajo condicione artificiales, y manejar un solo tipo de microorganismo. Una de las técnicas más usadas en el laboratorio de microbiología consiste en transferir una muestra microbiológica de un ambiente determinado a un medio de cultivo, lo que permite obtener cultivos microbianos. Al efectuar este procedimiento, es necesario considerar que en el área de trabajo, existen muchos otros microorganismos; debido a esto, es necesario tomar precauciones para impedir que éstos penetren y contaminen los cultivos en estudio.

Para impedir la contaminación de los cultivos, es necesario tener plena conciencia de la ubicuidad de los microorganismos, lo que determina que el aíre y todas las superficies estén densamente pobladas por microorganismos, se deben tener una serie de cuidados que eliminen los riesgos de contaminación. Estos incluyen el área de trabajo, el lavado de las manos, la esterilización de todos los utensilios y medios de cultivo a emplear y realizar la transferencia del microorganismo en una zona estéril, la que se obtiene trabajando cerca de la flama del mechero. A este conjunto de procedimientos realizados para prevenir o evitar la contaminación se le llama técnica aséptica; el seguimiento cuidadoso y detallado de la misma evita accidentes tales como:

La contaminación y pérdida del cultivo en estudio

La salida y dispersión de microorganismos del cultivo, lo que ocasionaría la contaminación de utensilios, productos y del personal. Este último aspecto es particularmente importante cuando se trabaja con cultivos de microorganismos patógenos.

Con relación a la concentración del inóculo, un error frecuente del principiante consiste en tomar muestras grandes, lo que es innecesario. Una colonia de bacterias del tamaño de la cabeza de un alfiler contiene varios millones de microorganismos, es obvio que con una cantidad pequeñísima (casi invisible) que se adhiera al asa, será más que suficiente para efectuar una transferencia exitosa.

Para el sembrado de microorganismos se emplean: hisopo, pipeta (para uso microbiológico, la parte superior o boquilla debe estar protegida con filtro de algodón), pipeta Pasteur, porta asa con alambre de platino dispuesto en forma de: aguja, asa, espátula y/o gancho.

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Con las técnicas de cultivo podemos observar los caracteres culturales, que son aspecto de las colonias en placa: forma, elevación, bordes, tamaño, superficie, consistencia, color, transparencia. En medio líquido, indica el grado de crecimiento, turbiedad, formación de película (nata) en la superficie o de simple anillo en las paredes del tubo, sedimento y olor. En agar inclinado se aprecia la intensidad y forma de crecimiento, bordes, aspecto, color, consistencia y olor.

Técnicas de cultivo:

Siembra en estría simple.

Siembra en estría cruzada.

Siembra para cultivo puro.

Siembra en placa vertida.

Siembra por picadura.

Siembra en medio líquido.

De las técnicas mencionadas, se puede elegir la más adecuada, dependiendo del estudio a realizar.

Morfología colonial bacteriana

Cuando tienes un cultivo en agar (caja petri) y quieres anotar la morfología colonial de la cepa bacteriana los siguientes datos tal vez te sean de utilidad:

Generalmente se reporta la morfología colonial tal como uno la percibe, por ejemplo si se ves que las colonias bacterianas son como puntitos, pues reportas que son puntiformes, si son lisas pues reportas que son lisas, si observas que están como moco, pues reportas que están mucosas, si su color es amarillento pues reportas que son de color amarillento, si huelen a tortilla pues pones que huelen a tortilla y así sucesivamente, aun así chécate las siguientes imágenes.


Equipo:

Asa bacteriológica.

Mechero.

Gradillas.

Termómetro

Cepas

Sus placas del muestreo de aire.

Medios de cultivo.

Una placa de agar de soya tripticasa.

Una placa de agar Sabouraud con cloranfenicol

Dos placas de Agar-sangre.

Un tubo de gelosa sólida (para picadura).

Un tubo de ensayo medio líquido cerebro-corazón.

Consumibles

Cajas de Petri estériles y vacías.

Lápiz graso.

http://microbitos.files.wordpress.com/2010/06/borde1.jpg

http://microbitos.files.wordpress.com/2010/06/superficie1.jpg

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Cinta adhesiva blanca.

Cerillos o encendedor.


MUESTREO AL AIRE (Cinco días previos a esta práctica)

1. Abrir su caja de agar de soya tripticasa y agar Sabouraud en un área a elegir de la facultad

por 10 minutos aproximadamente.

2. Cerrar su caja e incubar a 37°C la placa de tripticasa soya agar por 48 horas y la de agar

Sabouraud por 5 días a 28°C.

TÉCNICAS DE SIEMBRA.

Limpiar y esterilizar el área de trabajo

Prender los mecheros, ajustar la flama hasta que esta presente un cono azul bien marcado.

Identificar y organizar el material dentro del área de trabajo.

Marcar los tubos y cajas con iniciales de la cepa a sembrar y fecha.

Nota: Siempre debe de esterilizarse y enfriarse el asa bacteriológica previa toma de la muestra de la cepa.

Siembra en estría cruzada en placa de agar sangre. Frente al mechero encendido sostener con la mano izquierda la placa de agar sangre y con el asa bacteriológica esterilizada, depositar la muestra, en uno de sus extremos. Estriar la primera mitad, girar la caja para estriar la primera sección de dicha mitad. Volver a girar la caja y estriar la otra mitad de ésta. Nuevamente girar la caja y estriar la última sección que falta, de esta manera el estriado quedará entrecruzado y el crecimiento será en toda la caja. Esterilizar el asa bacteriológica. Rotular una etiqueta, anotando en ella: la fecha de inoculación y el nombre del alumno. Pegar la etiqueta a la caja e incubar en la estufa, a temperatura de 37°C ± 2° observar a las 24 horas.

Siembra para cultivo puro en placa de agar sangre. Por la parte inferior, dividir la caja de Petri con un lápiz graso que contiene agar sangre solidificado, a la mitad y una de las mitades en cuadrante, de tal manera que queden tres secciones. Con el asa esterilizada tomar un pequeño inóculo en la forma que ya se indicó anteriormente. Destapar la caja de Petri y descargar el asa en un extremo de la sección 1. Continuar sembrando esta sección en forma de estría. Esterilizar el asa y enfriarla. Tocar un extremo de la sección 2. Sembrar en estría esta sección, procurando que las primeras estrías no toquen los extremos sembrados en la sección 1. Esterilizar el asa, enfriarla en las paredes de la caja o en el medio de cultivo, darle vuelta a la caja y sembrar la sección 3 en la misma forma en que se hizo para la sección 2. Tapar la caja, esterilizar el asa, rotular e incubar a 37° C ± 2° y observar a las 24 horas.

Siembra por picadura en tubo de gelosa sólido. Frente al mechero encendido sostener con la mano izquierda por la parte inferior un tubo de ensayo conteniendo medio de cultivo sólido. Con el asa bacteriológica recta, estéril tomar un pequeño inóculo, e introducirlo de una sola vez hasta el fondo del tubo y sin tocar las paredes. Retirar el asa en la misma dirección en que se introdujo, esterilizar el asa. Rotular una etiqueta, anotando en ella: la fecha de inoculación y el nombre del alumno. Pegar la etiqueta a la caja e incubar en la estufa, a temperatura de 37°C ± 2° observar a las 24 horas.

Siembra en medio líquido cerebro-corazón. Con el asa bacteriológica previamente esterilizada y enfriada, se toma un pequeño inóculo y se introduce en el medio líquido, se agita con movimientos de rotación varias veces para asegurar la distribución de la muestra, se saca el asa bacteriológica y se esteriliza. Rotular una etiqueta, anotando en ella: la fecha de inoculación y el nombre del alumno. Pegar la etiqueta al tubo e incubar en la estufa, a temperatura de 37°C ± 2° observar a las 24 horas.

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1. ¿Qué es un medio de cultivo?

2. ¿Cómo se clasifican los medios de cultivo?

3. ¿Cómo se clasifican los medios de cultivo de acuerdo a su consistencia?

4. ¿Cuál es la clasificación de los medios de cultivo según su utilización?

5. ¿Qué es un medio de cultivo enriquecido? Mencione tres ejemplos.

6. ¿Qué es un medio de cultivo selectivo? Mencione tres ejemplos.

7. ¿Qué es un medio de cultivo selectivo diferencial? Mencione tres ejemplos.

8. ¿Qué es un medio de cultivo de enriquecimiento? Mencione tres ejemplos.

9. Mencione que microorganismos se cultivan en cada uno de sus ejemplos mencionados anteriormente.

10. Mencione los factores de crecimiento para el desarrollo microbiano.

11. Indique si deben esterilizarse todos los medios de cultivo. Si o no y ¿por qué?

12. ¿Cuál es el pH óptimo de los medios de cultivo para el desarrollo de la mayoría de las bacterias patógenas para el hombre?

13. Describa la técnica de estría simple.

14. ¿Cuál es el objetivo de utilizar la técnica de estría simple?

15. Describa la técnica de cultivo puro y para qué se emplea.

16. ¿Qué medio de cultivo utilizaría para obtener un cultivo puro, desde el punto de vista físico y químico?

17. ¿Para qué se utiliza la técnica de picadura y cómo se realiza?

18. Describa la técnica de siembra en medio líquido.

19. ¿Cuál es el objetivo de utilizar la técnica de estría cruzada?

20. Describa y dibuje los aspectos más comunes de las diversas colonias microbianas aisladas sobre medio sólido: forma, bordes, elevación y superficie.

RESPUESTAS.

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PRÁCTICA VI ESTUDIO DE Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis Y Streptococcus ALFA, BETA Y GAMMA

HEMOLITICOS.

Elaboró: CD. Fernando Sánchez Hernández.

OBJETIVOS.


Observará las características microscópicas de Staphylococcus sp. a partir de cultivos puros.

Identificará por medio de cultivos y pruebas bioquímicas diferentes especies de Staphylococcus.

Identificará las características microscópicas de los Streptococcus a partir de cultivos puros.

Identificará por medio de cultivos y pruebas bioquímicas las diferentes especies de Streptococcus.

INTRODUCCIÓN.

El género Staphylococcus es de bacterias comensales, cuya presencia es tan común que es necesario contar con métodos de laboratorio que permitan aislarlo de tal manera que se pueda establecer su posible relación con ciertas infecciones, o bien con problemas de contaminación de materiales de uso médico como son catéteres. En diferentes productos obtenidos de pacientes, se pueden aislar a los Staphylococcus, ya sea como bacterias directamente responsables del proceso patológico, o bien como oportunistas. Se les puede cultivar a partir de pus, exudados, orina, sangre, materias fecales, materiales de biopsia, líquido cefalorraquídeo, etc.

Por lo que se refiere a métodos de aislamiento, hay que señalar que en ocasiones basta con detectar la presencia de estas bacterias como en el caso de los materiales clínicos, en tanto que en los materiales de curación, alimentos y ambiente, por lo general es necesario aplicar procedimientos cuantitativos para determinar el número de bacterias viables, es decir, capaces de formar colonias en los medios de cultivo para determinar el grado de contaminación. Se estima que un número muy reducido de Staphylococcus en alimentos es solamente un indicio de contaminación por esta bacteria. Si el número aumenta a niveles inferiores a 10,000 indica no solamente contaminación sino además descuido en el manejo del alimento, lo cual ha permitido su proliferación, en tanto que cifras superiores a ésta, representan grave riesgo de intoxicación alimentaria.

En general las especies Staphylococcus son poco exigente y de fácil desarrollo. En los medios no selectivos sus colonias son grandes y de consistencia butirosa y por lo general opacas, lisas, circulares y enteras. A veces pueden presentar bordes ligeramente ondulados, coloración amarilla o blanca. En agar sangre las colonias son más grandes y pueden ser además hemolíticas o no hemolíticas. La mayor parte de las cepas virulentas son hemolíticas, fermentan el manitol, resisten altas concentraciones de cloruro de sodio y generalmente producen pigmento dorado (Staphylococcus aureus), aunque otras cepas virulentas son blancas o carecen de pigmento. La mejor prueba de virulencia es la facultad que tienen de coagular el plasma (coagulasa positivos).

Especies de Streptococcus pueden estar presente en grandes números como componente de la flora normal, pero bajo ciertas circunstancias puede estar asociado con infecciones o ser el responsable principal de las mismas. El aislamiento de estas bacterias presenta problemas para los laboratorios bacteriológicos en vista de que ese microorganismo puede encontrarse en diferentes partes del organismo y por lo tanto mezclado a otras bacterias que entorpecen su desarrollo en los medios de cultivo, o bien enmascarar su presencia. Los estreptococos más

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importantes generalmente pueden demostrarse por la producción de hemólisis en los medios que contienen sangre, la cual facilita su detección. Otro problema importante lo constituye la identificación que se lleva a cabo por examen de sus factores antigénicos. En general, se puede decir que interesan dos grupos de Streptococcus en la práctica de aislamiento e identificación:

1. Los Streptococcus del grupo A, son beta hemolíticos, se aíslan generalmente de exudados faríngeos. Sin embargo, entre la flora existen diversos tipos de Streptococcus, los cuales pueden ser alfa o beta hemolíticos, por lo que además de la hemólisis es necesario efectuar otras pruebas para identificarlos, tales como la composición antigénica y la prueba de sensibilidad a la bacitracina.

2. Los Streptococcus, tanto alfa, beta-hemolíticos, o gama hemolíticos, pueden estar presentes en diferentes partes del organismo, especialmente la nasofaringe, la región cérvico-vaginal, el intestino, y cuando salen de su hábitat normal pueden ser responsables de procesos patológicos. Generalmente se obtienen a partir de muestras de sangre, líquido cefalorraquídeo, pus, orina, etc. En estos casos es importante decidir el valor de la presencia de éstas bacterias en la integración del diagnóstico.

En agar sangre las colonias de esta bacteria son pequeñas, elevadas, de color blanco a gris, opacas, duras y secas con un halo claro bien definido de hemólisis completa (hemólisis beta) como de 2 mm de diámetro. Tienen la característica de que al tratar de levantarlas con el “asa recta” resbalan sobre el medio. Las placas de agar sangre pueden sembrarse tanto por estría como por vaciado. En este último caso no es necesario incubar en CO₂. Una práctica muy común es la inoculación superficial por estría y en seguida, puncionar con el asa bacteriológica diversas áreas de la placa de agar sangre e incubar aeróbicamente.


Cepas

Staphylococcus aureus

Staphylococcus epidermidis.

Streptococcus beta, alfa y gamma hemolíticos.

Medios de cultivo

1 cajas de petri de agar 110

2 cajas de petri de agar sangre.

1 caja de petri con agar manitol salado.

1 tubo de solución salina estéril.

Batería de tinción para Gram

Colorante de cristal violeta

Colorante de safranina

Mordiente lugol

Decolorante alcohol-acetona

Equipo

Mechero de Bunsen.


Microscopio.

Cristalería

Pipeta Pasteur

Soluciones

H2O2 (agua oxigenada) al 30%.

Consumibles

Portaobjetos.


Aceite de inmersión

Cinta adhesiva

Lápiz graso.

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1. A partir del cultivo de S. aureus y Streptococcus sp.(elegir uno) hacer un frotis y teñirlo con la técnica de Gram y observar al microscopio.

2. Sembrar los cultivos de S. aureus y S. epidermidis en agar sangre y agar 110 e incubar a 37°C + 2°durante 24 horas y observar la hemólisis producida y viraje de color. Media placa por cepa.

3. Sembrar en agar manitol salado las mismas cepas, incubar a 27°C durante 24 horas y observar si hay un viraje de color en el medio de cultivo hacia el amarillo, la reacción será manitol positiva, la cual es producida por el Staphylococcus aureus.

4. Prueba de la Catalasa. Con el asa de siembra recoger el centro del cultivo y colocar la muestra sobre un portaobjetos limpio de vidrio, agregar con una pipeta Pasteur una gota de H2O2 (agua oxigenada) al 30% sobre el microorganismo sin mezclarlo con el cultivo, observar la formación inmediata de burbujas (resultado positivo).

5. A partir del cultivo de Streptococcus beta, alfa y gamma hemolíticos hacer un frotis y teñirlo con la técnica de Gram y observar al microscopio.

6. Sembrar los cultivos de Streptococcus beta, alfa y gamma hemolíticos en agar gelosa sangre, incubar a 37° C + 2° durante 24 horas y observar la hemólisis producida.


62


1. ¿Cuál es la tinción que se ocupa para teñir especies de Staphylococcus y Streptococcus?

2. ¿Cuál es la morfología y agrupación de los Staphylococcus?

3. ¿Qué tipos de medio de cultivo requiere Staphylococcus aureus?

4. Describa la morfología colonial de los estafilococos en agar 110 y agar sangre.

5. ¿Qué tipo de pigmento produce Staphylococcus aureus?

6. ¿Qué tipo de pigmento produce Staphylococcus espidermidis?

7. ¿Cuáles son las infecciones estafilocóccicas del tracto respiratorio?

8. Mencione cuáles son las infecciones de la piel producidas por el Staphylococcus aureus.

9. ¿Por qué los Staphylococcus presentan resistencia a las penicilinas?

10. ¿Qué otras técnicas se utilizan a parte de las de cultivo para la identificación de Staphylococcus?

11. Mencione las características morfológicas de los Streptococcus.

12. ¿Qué medios de cultivo se utilizan para el desarrollo de los Streptococcus?

13. Dependiendo de su acción hemolítica. ¿Cómo se clasifican los Streptococcus?

14. Dibuje y describa los diferentes tipos de hemolisis.

15. Describe la clasificación de Lancefield.

16. De acuerdo con los grupos designados por Lancefield, mencione el tipo principal de infección que producen y su hábitat usual.

17. ¿Qué otras técnicas se utilizan a parte de las de cultivo para la identificación de Streptococcus?

RESPUESTAS.

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PRÁCTICA VII EXUDADO FARÍNGEO.

Elaboró: Dra. Santa Ponce Bravo.

OBJETIVOS.


Aplicará las técnicas de toma de muestra que se usan para realizar un exudado faríngeo.

Realizará citología exfoliativa y siembra en medios de cultivo del raspado de exudado faríngeo.

Realizará la tinción de Gram en la citología exfoliativa del exudado faríngeo.

Identificará en la citología exfoliativa del exudado faríngeo los géneros bacterianos por su morfología, agrupación y reacción tintorial.

Realizará diversas técnicas de siembra en los medios de agar gelosa sangre, manitol salado, EMB, CHROMagar para Sthapylococcus, agar Mitis-Salivarius-Bacitracina y Biggy.

Identificará por las características morfológicas de las colonias y las reacciones bioquímicas en los medios de cultivo, los géneros bacterianos aislados del exudado faríngeo.

Determinará las implicaciones médicas del exudado faríngeo en el área odontológica.

INTRODUCCIÓN.

La flora de la región faríngea presenta problemas peculiares para el aislamiento e identificación de microorganismos, tanto por lo que se refiere a los componentes de la flora normal como a microorganismos con acción patógena. A 1352 niños de una zona de la Ciudad de México en edad preescolar, asintomáticos, se les realizo cultivo de exudado faríngeo, el cual resultó positivo en el 7.6%, reportes de estudios faríngeos reportan que alrededor del 8 al 10% de los pacientes que no presentan secuelas supurativas, el cultivo del exudado faríngeo resulta positivo. Es importante recordar que algunos microorganismos tienen capacidad patogénica definida y su presencia es un indicio claro de enfermedades en tanto que otros llamados “oportunistas” guardan una posición ambigua y pueden encontrarse tanto como componentes de la flora normal como asociados a procesos patológicos, causados por otros microorganismos que son los verdaderos responsables (por ejemplo: virus).

Actualmente podemos emplear métodos serológicos y/o exudado faríngeo para demostrar que un niño ha sido víctima de una infección por estreptococo. Los primeros definen la respuesta humoral contra distintos productos extracelulares del estreptococo como son la determinación de ASO, antidesoxirribonucleasa B (DNAasa B) y el segundo corresponde al “estándar de oro”. Los métodos utilizados deben seleccionarse de tal manera que permitan tanto el aislamiento de microorganismos Gram positivos como Gram negativos, además de detectar algunos otros agentes específicos de enfermedades.

El cultivo del exudado faríngeo es el principal procedimiento para demostrar la etiología estreptocócica de procesos infecciosos como: faringo-amigdalitis, impétigo, erisipela, fiebre escarlatina o cuando está presente una complicación no supurativa como la fiebre reumática o la glomerulonefritis.

La selección de los procedimientos de aislamiento e identificación de microorganismos, se deberá llevar a cabo de acuerdo con las necesidades y la orientación proporcionada por el clínico, de manera que permita un examen amplio de la flora faríngea. El exudado faríngeo se hace para aislar e identificar microorganismos causantes de una infección en la garganta con implicaciones en cavidad bucal. El médico puede recomendar este estudio cuando sospecha de infección por estreptococos, en faringitis o cuando las recaídas son frecuentes. El estudio ayuda a identificar la variedad de microorganismos que la provocan y de esta forma desarrollar un plan de tratamiento acorde al tipo de microorganismo involucrado.

http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/000484.htm

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Medios de cultivo.

1 caja de petri con agar sangre.

1 caja de petri con chromoagar para Staphylococcus.

1 caja de petri con agar EMB (Eosin Methylene Blue Agar)

1 caja de petri de agar Mitis-Salivarius-Bacitracina.

1 caja de petri con agar Biggy.

Batería de tinción para Gram.

Colorante de cristal violeta.

Colorante de safranina.

Mordente lugol.

Decolorante alcohol-acetona.

Equipo

Mechero de Bunsen.


Microscopio.

Incubadora de aerobiosis.

Puente de tinción.

Consumibles

Portaobjetos.


Aceite de inmersión.

Cinta adhesiva.

Lápiz graso.

Bolígrafo.

Hisopos estériles.


1. El alumno participante para la toma de muestra para el exudado faríngeo, deberá encontrarse con 4 horas de ayuno, sin beber agua y sin haber realizado en ese lapso de tiempo su higiene bucal.

2. Con el hisopo estéril se realizará raspado enérgico de la región faríngea del participante, evitando contaminar la muestra con la saliva propia de la persona.

3. Una vez tomada la muestra, con el hisopo se depositará ésta en un extremo de los medios de cultivo y se realizará con el mismo la citología exfoliativa, depositando y extendiendo la muestra sobre el portaobjetos.

4. La citología exfoliativa se fijará, se teñirá con la técnica de Gram y se observará al microscopio para identificar las características morfológicas, tintoriales y de agrupación de los géneros bacterianos aislados.

5. Con el asa bacteriológica estéril se realizará en los medios de cultivo las siguientes técnicas de siembra: estría cruzada y cultivo puro (tres y dos medios de cultivo a escoger por técnica).

6. Los medios de cultivo se incubarán a 35+ 2°C durante 24 y 72 horas, para ser observadas al término y comparar entre los medios de cultivo las características morfológicas de las colonias y la reacción bioquímica desarrollada en el mismo.

ESQUEMATICE LAS TÉCNICAS PARA LA TOMA DE EXUDADO FARÍNGEO, CITOLOGÍA

EXFOLIATIVA Y SIEMBRA.

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RESULTADOS Y OBSERVACIONES.

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1. ¿Qué características clínicas mostraba la zona faríngea del participante al momento de la toma de muestra?

2. ¿Cómo se realiza la toma de muestra para un exudado faríngeo?

3. ¿Qué es la citología exfoliativa, como se realiza?

4. ¿Cómo se realiza la siembra en los medios de cultivo del raspado de exudado faríngeo?

5. ¿Qué se observa en la citología exfoliativa del exudado faríngeo teñida con Gram?

6. ¿Cuáles son las características morfológicas, de agrupación y tintoriales de los géneros bacterianos teñidos con la técnica de Gram en la citología exfoliativa aislados en el exudado faríngeo?

7. ¿Establezca la función que tiene el realizar las diversas técnicas de siembra en los medios de agar gelosa sangre, manitol salado, EMB, cromoagar para Sthapylococcus, agar Mitis-Salivarius-Bacitracina y Biggy?

RESPUESTAS.

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PRÁCTICA VIII PRUEBA DE ACTIVIDAD CARIOGÉNICA CRT BACTERIA Y SISTEMA

AMORTIGUADOR (PRÁCTICA DEMOSTRATIVA). Elaboró: QFB. Fernando J. Franco Martínez

OBJETIVOS.


Observará la cuantificación de especies cariogénicas por medio del Test de Riesgo de Caries CTR bacteria.

Observará la relación del pH salival con la cuantificación de especies cariogénicas, por medio de la prueba de amortiguador de CTR.

INTRODUCCIÓN.

La caries dental es un proceso patológico de destrucción de los tejidos dentales, causada por microorganismos. Las pruebas de actividad de caries se han empleado durante muchos años en la investigación dental y algunas de estas se han adaptado para el uso rutinario en el consultorio dental.

Se han descrito numerosas pruebas de actividad de caries en la literatura mundial. El hecho más significativo de que se hayan elaborado innumerables pruebas, nos demuestran que los investigadores están interesados en predecir si existe susceptibilidad individual, y esto sugiere dos cosas: Que existe necesidad muy clara de que se establezca una prueba y de que los métodos que en la actualidad se emplean, ninguno es completamente satisfactorio.

Alguno de los usos propuestos para llevar a cabo una prueba exacta de la susceptibilidad a la caries son las siguientes:

Para el clínico:

Determinar la necesidad de establecer medidas de control de la caries.

Actuar como indicador de la cooperación del paciente.

Ayudar a la determinación de cuanto se deben conceder las citas de control.

Como una guía en la inserción de restauraciones costosas.

Ayudar en la determinación del pronóstico.

Actuar como una señal preventiva para el ortodoncista en la colocación de bandas.

Para el investigador:

Como ayuda en la selección de los pacientes para el estudio sobre caries.

Como ayuda en la selección de agentes potencialmente terapéuticos.

Servir como indicador de los períodos de exacerbación y de remisión.

PRUEBAS MICROBIOLÓGICAS

Las pruebas microbiológicas aportan información sobre los niveles en la saliva de las bacterias cariógenas: S. mutans y Lactobacillus sp. Actualmente existen dispositivos comercializados que permiten al clínico evaluar el nivel cuantitativo de estas bacterias en sus pacientes. Para estas determinaciones, se utilizan laminocultivos que son inoculados a partir de muestras de saliva completa estimulada y se compara la densidad de crecimiento de colonias en la lengüeta con una tabla de densidad ya establecida. Los resultados se interpretan como unidades formadoras de colonias por mililitro de saliva (UFC/ml). Se considera como paciente de alto riesgo a aquellos que presentan valores iguales o superiores a 105 UFC/ml para Lactobacillus sp. y más de 106 para los estreptococos del grupo mutans. Son de bajo riesgo de cifras inferiores a 103 UFC/ml para Lactobacillus ssp. e inferiores a 105 para S. mutans.

La evaluación microbiológica del riesgo de caries es diferente de las otras enfermedades infecciosas. Al ser un proceso multifactorial, la presencia de un gran número de bacterias cariógenas no implica necesariamente el desarrollo de lesiones, debido a que otros factores pueden compensar el ataque bacteriano como el uso de fluoruros o la correcta higiene oral.

http://www.ivoclarvivadent.com.mx/zoolu-website/media/document/510/CRT+-+Test+de+Riesgo+de+Caries

http://www.ivoclarvivadent.com.mx/zoolu-website/media/document/510/CRT+-+Test+de+Riesgo+de+Caries

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Cuantificación de Streptoccus del grupo mutans en saliva

Las evaluaciones cuantitativas Streptococcus mutans en la saliva y en la placa se realizan en el laboratorio sobre placas de agar con un medio selectivo. Se practica una dilución seriada de la muestra y una parte se coloca en la superficie del agar con una pipeta. Después de cuatro días de incubación anaerobia, se cuentan las unidades formadoras de colonias (UFC). Las bacterias tienen una apariencia morfológica distintiva y es posible diferenciarlas de diversas cepas. Se han sugerido variaciones para su adaptación y fácil empleo en el consultorio dental. Si bien estos valores no son absolutos, brindan una guía para el tratamiento de una infección producida por S. mutans. Hay procedimientos que puede realizar el odontólogo para detectar y modificar la magnitud de una infección por estos microorganismos.

La mayoría de las pruebas para el recuento de S. mutans han empleado agar mitis salivarius-sacarosa-bacitracina como medio selectivo. Que permite solo el desarrollo del microorganismo investigado.

Cuantificación de Lactobacillus en saliva

Una prueba, introducida por Hadley por primera vez en 1933, calcula el número de bacterias acidogénicas y acidúricas que se encuentran en la saliva de un paciente al encontrar el número de colonias que parecen en las placas de agar de peptona de tomate (pH 5.0) después de una inoculación con una muestra de saliva. El agar LBS (rogosa) es mucho más selectivo.

La cuenta de lactobacillos en la placa es una de la pruebas de actividad de la caries más antiguas. Su correlación con la actividad clínica de la caries se ha demostrado a través de numerosas investigaciones, sobre todo en los estudios comparativos entre pacientes con actividad cariogénica y pacientes sin actividad cariogénica, pero esto ha refutado en otras investigaciones.

Prueba de la capacidad amortiguadora

La saliva tiene una capacidad de neutralizar ácidos o mejor dicho de amortiguar las variaciones de pH. Esta capacidad está basada en varios sistemas como el sistema de fosfato y el sistema de bicarbonato-ácido carbónico. En la saliva no estimulada, la concentración de fosfato inorgánico es bastante más alta que la concentración del sistema bicarbonato-ácido carbónico. El sistema bicarbonato- ácido carbónico es el más importante en la saliva estimulada debido a su mayor concentración.

Ericsson y Bratthall desarrollaron un método sencillo para medir la capacidad amortiguadora de la saliva en el consultorio dental la tira Dentobuff. El método determina el sistema amortiguador del bicarbonato.

Es importante interpretar la prueba transcurridos exactamente los 5 minutos, ya que el color cambia con el tiempo, y por tanto puede originar resultados equívocos.

Existe tendencia a una relación inversa entre la capacidad amortiguadora de la saliva y de la actividad de caries. La saliva de aquellos individuos cuyas bocas contienen un número considerable de lesiones cariosas, con frecuencia tienen una capacidad amortiguadora al ácido mucho más baja que la de la saliva de aquellos individuos que se encuentran relativamente libres de caries.


Kits de la Técnica de CTR BACTERIA (2 por grupo)

Kits de la Técnica de amortiguador de CRT (2 por grupo)

Tubo o vaso de precipitado para depositar saliva

Mechero

Bolígrafo indeleble

Cuenta colonias

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CRT BACTERIA CRT bacteria se ha desarrollado para la determinación del número de Streptococcus mutans y de Lactobacillus en saliva con la ayuda en cada caso de un substrato selectivo.

INDICACIONES:

Diagnóstico in vitro

Superficie de agar clara: Determinación de Lactobacillus en saliva

Superficie de agar azul: Determinación de Streptococcus mutans en saliva y placa.

CONTRAINDICACIONES:

No utilizar CRT bacteria durante un tratamiento con antibióticos. Esperar al menos 14 días después de un tratamiento de dicho tipo. Si utiliza colutorios antibacterianos esperar 12 horas.

APLICACIÓN:

La utilización de este producto la puede realizar el odontólogo, higienista dental o auxiliar de profilaxis.

PROCEDIMIENTO:

1. Paciente: Estimular el flujo salival del paciente dando a masticar la pastilla de parafina adjunta.

2. Recoger la saliva en un recipiente adecuado. Consejo: Tener en cuenta al mismo tiempo la determinación del índice de flujo de saliva y la valoración de la capacidad amortiguadora de la saliva, con ayuda de CRT buffer.

3. Extarer el porta-agar del tubo de prueba 4. Colocar una tableta de NaHCo3 en la base del tubo 5. Retirar con cuidado las láminas protectoras de ambas superficies de agar, no tocar las

superficies de agar 6. Humectar completamente ambas superficies con ayuda de una pipeta, sin arañar las

mismas. 7. Dejar gotear la saliva sobrante 8. Volver a colocar el porta-agar de nuevo en el tubo y cerrarlo bien 9. Utilizar un bolígrafo indeleble para anotar la fecha y el nombre del paciente en el vial 10. Mantener el tubo verticalmente durante 48 horas y 37°C en una incubadora. 11. Después de extraer el tubo de la incubadora, comparar la densidad de las colonias de

Streptococcus mutans y de Lactobacillus con los correspondientes gráficos del cuadro modelo adjunto.

MODIFICACIÓN:

Una modificación en el proceso de la prueba posibilita, el recuentro de los Streptococcus mutans en placa:

Retirar placa con un pincel fino

Aplicar la placa sobre el agar azul, sin dañarlo; se pueden tomar hasta cuatro pruebas sin problemas.

NOTA: En caso de no depositarse suficiente saliva sobre la pastilla de NaHCO3, añadir sobre ella una pequeña cantidad de agua.

VALORACIÓN:

Un recuento de Lactobacillus y Streptococcus mutans superior a 105 UFC en saliva indica un alto riesgo de caries.

RESULTADOS:

Recuento de S. Mutans: __________________________________________ UFC

Recuento de Lactobacillus:_________________________________________UFC

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CRT BUFFER.

DESCRIPCIÓN:

CRT buffer sirve para la determinación de la capacidad amortiguadora de la saliva, y está dotado con un sistema de indicadores especiales.

INDICACIONES:

Diagnóstico in vitro

Determinación de la capacidad de amortiguación de la saliva.

APLICACIÓN:

La aplicación es profesional y la debe realizar el odontólogo, higienista dental o auxiliar de profilaxis.

ATENCIÓN:

Al menos una hora antes de la realización del test, el paciente debe:

No comer ni beber nada

No masticar chicles de ningún tipo

No fumar

No lavarse los dientes

No utilizar colutorios.

PROCEDIMIENTO:

1. Sentar al paciente en postura recta y relajada 2. Dar al paciente una cápsula de parafina para estimular la producción de saliva 3. Recoger la saliva en un recipiente calibrado. Consejo: Recoger la saliva durante un periodo de tiempo definido de 5 minutos y determinar a partir de ahí (ml. Saliva/minuto) el índice del flujo salival. Valoración en adultos: Normal ≥ 1ml Saliva/minuto. 4. Extraer la tira de la prueba CRT buffer del envase sin tocar el campo activo

amarillo. 5. Colocar la tira de prueba con el campo activo hacia arriba sobre una superficie

estable de papel secante. 6. Humectar todo el campo activo con la ayuda de una pipeta Valoración: Los colores azul y amarillo indican respectivamente una alta y baja capacidad de amortiguación de la saliva.


Saliva: _______________________________mililitros/minuto.

Color de la tira CRT buffer: ____________________________

RESULTADOS Y OBSERVACIONES.

Interpretación de resultados:

______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

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1. ¿Qué métodos se emplean para determinar la actividad cariosa?

2. ¿Cuál es la teoría de Miller?

3. ¿Qué características microscópicas tienen los Lactobacillus y Streptococcus mutans?

4. ¿Qué pH es necesario para el crecimiento de los Lactobacillus y Streptococcus mutans?

5. ¿Cuál es la fuente de energía de los Lactobacillus y Streptococcus mutans de la boca?

6. ¿Por qué el medio de Rogosa se considera selectivo?

7. ¿Qué aspecto tienen las colonias de Lactobacillus y Streptococcus mutans?

8. ¿Cómo se realizó la cuenta de las colonias de Lactobacillus y Streptococcus mutans?

9. ¿Obtendría los mismos resultados usando saliva sin diluir y diluida? ¿Por qué?

RESPUESTAS.

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PRÁCTICA IX ESTUDIO DE MICROORGANISMOS DEL SURCO GINGIVAL.

Elaboró: Dra. Argelia Almaguer Flores OBJETIVOS.


Obtendrá muestras de placa dentobacteriana subgingival y aprenderá a realizar cultivo de microorganismos anaeróbios.

Observará la diversidad de microorganismos que habitan en el surco gingival.

INTRODUCCIÓN.

Las enfermedades periodontales son infecciones que se caracterizan por la pérdida progresiva de los tejidos de soporte del diente (encía, ligamento periodontal, cemento radicular y hueso alveolar), son causadas por grupos específicos de microorganismos que colonizan la superficie dental y el espacio. Los dos cuadros patológicos principales que las caracterizan son la gingivitis y la periodontitis.

A la fecha, se reconoce que las infecciones periodontales son de origen endógeno y que ciertas especies bacterianas consideradas patógenos periodontales se encuentran también colonizando la placa dentobacteriana de sujetos sanos. Sin embargo, el grado de patogenicidad de la placa dentobacteriana se ve influenciado por el medio ambiente local, factores de virulencia de ciertos microorganismos y la cantidad e identidad de las bacterias presentes; se estima que en un surco subgingival sano las cuentas bacterianas son de 103 mientras que un surco enfermo puede tener cuentas mayores o iguales a 108.

La placa dentobacteriana está compuesta por comunidades microbianas adheridas a la superficie dental, embebidas en una matriz de exopolisacáridos y organizadas en una estructura llamada biopelícula. Esta biopelícula, también conocida como placa dentobacteriana, está compuesta por aproximadamente 500 especies bacterianas diferentes. La superficie dental provee un sustrato estable para la colonización bacteriana en la cavidad bucal. En contraste, las agregaciones bacterianas en la mucosa masticatoria y en la mucosa de carrillos, piso de la boca y paladar duro son, en general, limitadas debido al recambio y descamación de las células epiteliales que los conforman.

Formación de una Biopelícula dental

La secuencia de colonización y formación de una biopelícula dental es un proceso orquestado y altamente ordenado.

El primer evento para que comience la formación de una biopelícula es la adhesión bacteriana. Las bacterias poseen mecanismos específicos para adherirse a los tejidos o superficies. Muchas bacterias poseen componentes proteínicos en su superficie llamados: “adhesinas”, los cuales se unen de manera específica a moléculas complementarias o “receptores” que se encuentran en la superficie de los tejidos. Pocos minutos después de realizar una limpieza dental profesional, los primeros colonizadores, cocos y bacilos Gram positivos principalmente de los géneros Streptococcus y Actinomyces, se adhieren a la superficie dental por medio de moléculas específicas de adhesión bacteriana, las cuales interactúan con moléculas adheridas a la superficie dental derivadas de componentes salivales y del fluido crevicular. Estos primeros colonizadores juegan un papel muy importante en la formación de la placa dentobacteriana, ya que tienen receptores específicos para las diferentes especies bacterianas que posteriormente se coagregarán a la estructura inicialmente formada.

Los segundos colonizadores, también llamados colonizadores puente o secundarios, poseen mecanismos de adhesión tanto con los primeros colonizadores como con las especies que se coagregarán de forma tardía a la placa bacteriana. Este grupo de microorganismos está formado principalmente por especies pertenecientes a los géneros Campylobacter, Capnocytophaga, Veillonella, Fusobacterium y Prevotella entre otros. Finalmente, si la secuencia de colonización de la placa bacteriana no se ve interrumpida, un tercer grupo de microorganismos principalmente

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especies anaeróbicas Gram negativas como especies de los géneros Treponema y Porphyromonas, se unen a la biopelícula dental.

Esquema de la Placa Dentobacteriana (referencia)

Composición de la placa dentobacteriana Con el fin de ampliar y mejorar nuestro entendimiento sobre la composición y la asociación que existe entre las bacterias que conforman la placa dentobacteriana, se realizó un estudio en donde fueron analizadas muestras de placa dentobacteriana subgingival provenientes de pacientes periodontalmente sanos y con enfermedad periodontal. Las muestras fueron analizadas utilizando la técnica de “checkerboard” para hibridaciones DNA-DNA, la cual permite la identificación simultánea de múltiples especies bacterianas en un gran número de muestras que contengan mezclas complejas de microorganismos.

A continuación se mencionan los cinco complejos bacterianos descritos en dicho estudio, a los que con fines prácticos les fueron asignados colores:

Complejo amarillo: especies del género Streptococcus como Streptococcus sanguinis, Streptococcus mitis, Streptococcus oralis, Streptococcus gordonii y Streptococcus intermedius.

Complejo verde: Capnocytophaga gingivalis, Capnocytophaga ochracea, Capnocytophaga sputigena, Campylobacter concisus, Eikenella corrodens y Actinobacillus actinomycetemcomitans serotipo a.

Complejo morado: Veillonella parvula y Actinomyces odontolyticus.

Complejo naranja: Fusobacterium sp. y subespecies, Peptostreptococcus micros, Prevotella nigrescens, Prevotella intermedia, Campylobacter rectus, Campylobacter gracilis, Campylobacter showae, Eubacterium nodatum y Streptococcus constellatus.

Complejo Rojo: Tannerella forsythia (antes llamada Bacteroides forsythus), Porphyromonas gingivalis y Treponema denticola.

Especies no agrupadas: A. actinomycetemcomitans serotipo b, Selenomonas noxia y Actinomyces viscosus.

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Representación de las asociaciones entre especies bacterianas que forman la placa dentobacteriana subgingival. Los complejos amarillo, morado, verde y azul son especies consideradas primordialmente como “colonizadoras primarias”. El complejo naranja está compuesto principalmente por “colonizadores puente” y el complejo rojo por “colonizadores tardíos” (Socransky, Haffajee et al. 1998; Socransky and Haffajee 2005).

Las bacterias que conforman cada complejo se encuentran fuertemente asociadas entre sí. Como se puede observar en la figura de los complejos bacterianos, los complejos amarillo, verde y morado se encuentran más fuertemente asociados entre sí y éstos a su vez asociados al complejo naranja pero no con los miembros del complejo rojo. A su vez, los complejos también ejemplifican la secuencia de colonización, de tal manera que los miembros de los complejos amarillo y morado forman parte de los colonizadores primarios, los miembros del complejo naranja, junto con los miembros del complejo verde son colonizadores puente y finalmente los miembros del complejo rojo son colonizadores tardíos.


Instrumental clínico y material

Cureta Gracey 13/14 estéril

Rollos de algodón

Gasas

Guantes y cubrebocas para la persona que tomará la muestra

Material de Laboratorio

5 tubos de con 10 ml c/u de medio TSB (Caldo con soya tripticasa), marcados con 1, -1, -2, -3 y -4.

4 placas de petri con medio de cultivo TSA (Agar con soya tripticasa)

Pipetas Pasteur estériles, dobladas para distribuir la muestra en las placas de petri

Mechero de bunsen

Jarra de anaerobiósis

Incubadora para bacterias aerobias

Micropipetas


1. Tener la mesa del laboratorio limpia y con todo el material que se va a utilizar preparado y acomodado

2. Sentar al paciente (a quien se le va a tomar la muestra de placa subgingival) cerca del campo de trabajo

3. Hacer aislamiento relativo (con rollos de algodón) de la zona de alguno de los primeros o segundos molares inferiores y eliminar con una de las puntas de la cureta la placa supragingival

4. Tomar la muestra de la placa subgingival de la zona mesiovestibular (MV) del molar seleccionado, raspando suavemente el surco gingival con la otra punta de la cureta. NOTA: este procedimiento no debe causar sangrado ni dolor al paciente

5. Colocar la muestra tomada al tubo con TSB marcado con 1, La cureta debe de tocar perfectamente el medio de cultivo y la muestra debe de ser depositada en el medio del tubo, golpeando ligeramente las paredes del tubo con la cureta

P. gingivalis

T. forsythia

T. denticola

P. intermedia

P. nigrescens

P. micros

F. nuc. vincentii

F. nuc. nucleatum

F. nuc. polymorphum

F. periodonticum

C. gracilis

C. rectus

E. nodatumS. constellatus

C. showae

Streptococcus sp.

S. gordonii

S. intermedius

S. mitis

S. oralis

S. sanguinis

V. parvula

A. odontolyticus

E. corrodens

C. gingivalis

C. sputigena

C. ochracea

C. concisus

A. actino . a

Especies de

Actinomyces

A. actinomycetemcomitans b

S. noxia

P. gingivalis

T. forsythia

T. denticola

P. intermedia

P. nigrescens

P. micros

F. nuc. vincentii

F. nuc. nucleatum

F. nuc. polymorphum

F. periodonticum

C. gracilis

C. rectus


C. showae

P. intermedia

P. nigrescens

P. micros

F. nuc. vincentii

F. nuc. nucleatum

F. nuc. polymorphum

F. periodonticum

P. intermedia

P. nigrescens

P. micros

F. nuc. vincentii

F. nuc. nucleatum

F. nuc. polymorphum

F. periodonticum

P. intermedia

P. nigrescens

P. micros

F. nuc. vincentii

F. nuc. nucleatum

F. nuc. polymorphum

F. periodonticum

C. gracilis

C. rectus


C. showae

Streptococcus sp.

S. gordonii

S. intermedius

S. mitis

S. oralis

S. sanguinis

Streptococcus sp.

S. gordonii

S. intermedius

Streptococcus sp.

S. gordonii

S. intermedius

S. mitis

S. oralis

S. sanguinis

S. mitis

S. oralis

S. sanguinis

V. parvula

A. odontolyticus

V. parvula

A. odontolyticus

E. corrodens

C. gingivalis

C. sputigena

C. ochracea

C. concisus

A. actino . a

E. corrodens

C. gingivalis

C. sputigena

C. ochracea

C. concisus

A. actino . a

Especies de

Actinomyces

Especies de

Actinomyces


S. noxia

P. gingivalis

T. forsythia

T. denticola

P. intermedia

P. nigrescens

P. micros

F. nuc. vincentii

F. nuc. nucleatum

F. nuc. polymorphum

F. periodonticum

C. gracilis

C. rectus


C. showae

P. intermedia

P. nigrescens

P. micros

F. nuc. vincentii

F. nuc. nucleatum

F. nuc. polymorphum

F. periodonticum

P. intermedia

P. nigrescens

P. micros

F. nuc. vincentii

F. nuc. nucleatum

F. nuc. polymorphum

F. periodonticum

P. intermedia

P. nigrescens

P. micros

F. nuc. vincentii

F. nuc. nucleatum

F. nuc. polymorphum

F. periodonticum

C. gracilis

C. rectus


C. showae

Streptococcus sp.

S. gordonii

S. intermedius

S. mitis

S. oralis

S. sanguinis

Streptococcus sp.

S. gordonii

S. intermedius

Streptococcus sp.

S. gordonii

S. intermedius

S. mitis

S. oralis

S. sanguinis

S. mitis

S. oralis

S. sanguinis

V. parvula

A. odontolyticus

V. parvula

A. odontolyticus

E. corrodens

C. gingivalis

C. sputigena

C. ochracea

C. concisus

A. actino . a

E. corrodens

C. gingivalis

C. sputigena

C. ochracea

C. concisus

A. actino . a

Especies de

Actinomyces

Especies de

Actinomyces


S. noxia

P. gingivalis

T. forsythia

T. denticola

P. intermedia

P. nigrescens

P. micros

F. nuc. vincentii

F. nuc. nucleatum

F. nuc. polymorphum

F. periodonticum

P. intermedia

P. nigrescens

P. micros

F. nuc. vincentii

F. nuc. nucleatum

F. nuc. polymorphum

F. periodonticum

P. intermedia

P. nigrescens

P. micros

F. nuc. vincentii

F. nuc. nucleatum

F. nuc. polymorphum

F. periodonticum

C. gracilis

C. rectus


C. showae

P. intermedia

P. nigrescens

P. micros

F. nuc. vincentii

F. nuc. nucleatum

F. nuc. polymorphum

F. periodonticum

P. intermedia

P. nigrescens

P. micros

F. nuc. vincentii

F. nuc. nucleatum

F. nuc. polymorphum

F. periodonticum

P. intermedia

P. nigrescens

P. micros

F. nuc. vincentii

F. nuc. nucleatum

F. nuc. polymorphum

F. periodonticum

P. intermedia

P. nigrescens

P. micros

F. nuc. vincentii

F. nuc. nucleatum

F. nuc. polymorphum

F. periodonticum

C. gracilis

C. rectus


C. showae

Streptococcus sp.

S. gordonii

S. intermedius

Streptococcus sp.

S. gordonii

S. intermedius

S. mitis

S. oralis

S. sanguinis

S. mitis

S. oralis

S. sanguinis

Streptococcus sp.

S. gordonii

S. intermedius

Streptococcus sp.

S. gordonii

S. intermedius

S. mitis

S. oralis

S. sanguinis

S. mitis

S. oralis

S. sanguinis

V. parvula

A. odontolyticus

V. parvula

A. odontolyticus

E. corrodens

C. gingivalis

C. sputigena

C. ochracea

C. concisus

A. actino . a

E. corrodens

C. gingivalis

C. sputigena

C. ochracea

C. concisus

A. actino . a

Especies de

Actinomyces

Especies de

Actinomyces


S. noxia


S. noxia

81

6. Una vez colocada la muestra en el tubo 1, ésta debe de ser dispersada por medio de vortex o agitación manual vigorosa

7. Posteriormente se realizan diluciones seriadas de la muestra de la siguiente manera: tomar 1 mL del tubo 1 (con la muestra) y transferirlo al tubo marcado -1. Dispersar la muestra por medio de vortex o agitación manual vigorosa. Tomar 1 mL del tubo -1 y transferirlo al tubo marcado -2. Nuevamente, dispersar la muestra por medio de vortex o agitación manual vigorosa. Repetir este mismo procedimiento para los tubos -3 y -4.

9. Ya que todos los tubos tienen la muestra dispersada, se deben de tomar 100 µL del tubo -3 y transferirlos a una de las placas de petri (marcarla con el número -3 anaerobio) y hacer el mismo procedimiento con otra placa de petri pero marcado con el número -3 aerobio. Hacer el mismo procedimiento con la muestra del tubo -4. Es decir al final se tendrán dos placas de petri para incubación anaeróbia (-3 y -4 anaerobio) y dos placas de petri para incubación aerobia (-3 y -4 aerobio)

10. Incubar las placas anaeróbias en las jarras de anaerobiósis a 37C durante 7 días y las

aeróbias en la incubadora a 37C durante 3-5 días

11. Después del tiempo de incubación, comparar la diferente morfología de colonia de las bacterias que haya crecido en cada una de las placas (hacer un dibujo o esquema para diferenciar forma, color y tamaños de cada una de las colonias).


83


1. ¿Cuál es la importancia de la microflora bucal?

2. ¿Qué son las enfermedades periodontales y cómo se clasifican?

3. ¿Qué es la placa dentobacteriana?

4. ¿Qué son las biopelículas?

5. Mencione cinco especies de microorganismos que componen la microflora normal en la placa subgingival y supragingival.

6. Mencione tres microorganismos relacionados con las enfermedades periodontales.

RESPUESTAS.

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PRÁCTICA X ESTUDIO DE Candida albicans.

Elaboró: CD. Víctor Manuel Mira Morales OBJETIVOS.

Durante el desarrollo de la práctica, el alumno:

Identificará las características macroscópicas del género Candida, por medio de su cultivo.

Identificará las características microscópicas del género Candida por medio de observación al microscopio.

INTRODUCCIÓN.

Candida albicans

El género Candida incluye un variado número de especies, pero solamente algunas de ellas pueden ser oportunistas, sobresaliendo Candida albicans, la que dependiendo de la topografía de donde se aísle, se puede encontrar entre un 60 hasta un 85%.

En años recientes, ha aumentado el interés con respecto a las infecciones producidas por los

hongos del Género Candida en sujetos inmunosuprimidos y médicamente comprometidos. Esto ha

traído como resultado que se hayan realizado una gran cantidad de investigaciones, dirigidas hacia

la identificación de C. albicans como el principal agente involucrado en Candidiasis, una

enfermedad infecciosa la cual puede variar desde lesiones superficiales en piel y mucosas hasta

la forma sistémica diseminada. Es la micosis más común en la cavidad bucal humana.

C. albicans y otras levaduras pueden ser adquiridas a partir de una fuente endógena (originada

dentro del organismo).

Este tipo de enfermedades o infecciones son aceleradas por algún problema en el sistema inmunológico del organismo.

C. albicans es un miembro de la flora normal de las mucosas y se pueden encontrar en la boca, nariz o vagina. Cuando su crecimiento es anormal, se presentan ciertas complicaciones. Este hongo se pone de manifiesto en procesos de inmunodeficiencia o en procesos de inmunodepresión.

Factores de riesgo

Factores naturales: infecciones, diabetes, problemas endócrinos, inmunodeficiencias, etc.

Factores hormonales: presentes en la infancia, adolescencia y vejez, como: mala alimentación, dieta alta en carbohidratos, falta de vitaminas, etc.

Factores mecánicos: Prótesis dental, uso prolongado de antibióticos, etc.

C. albicans suele presentarse como una célula oval levaduriforme de 2 a 4 micras, con paredes finas; sin embargo, en tejidos infectados también se han identificado formas filamentosas de longitud variable, con extremos redondos de 3 a 5 micras de diámetro y pseudomicelios, que son células alargadas de levadura que permanecen unidas entre sí.

Anteriormente se consideraba la utilización de la técnica de coloración de Gram, para observar a este hongo al microscopio; la cuál para las bacterias es adecuada, pero para los hongos, no se debe emplear, por las características propias de la pared de los hongos.

Recordemos que dicha pared es más compleja que la de las bacterias ya que posee diferentes constituyentes químicos como son polisacáridos, proteínas, lípidos y otras sustancias y generalmente cuentan con alrededor de 9 capas.

86

Dichas capas impiden que el colorante se elimine, por lo que puede leerse como Gram+ o Gram-.

Características del género Cándida:

Nomenclatura y jerarquización:

Clase: Deuteromycetes.

Subclase: Blastomycetidiae

Orden: Criptococal

Familia: Criptocaceae

Género: Candida

Especies: albicans, dubliniensis, tropicalis, stellaoidea, krusei, parapsilosis, pseudotropicalis, guillermondii, famata y zeylanoides


Cepa de Candida sp. En cultivos puros en cajas Petri

Medios de cultivo:

1 placa con medio Sabouraud

1 placa con harina de arroz

1 placa de CHROMagar Candida

Medio aclarante:

KOH al 20%

Medio colorante:

Azul de lactofenol

Cristalería:

Portaobjetos

Cubreobjetos

Equipo:

Asa bacteriológica

Mechero

Gradilla

Microscopio

Consumibles:

Abatelenguas

Hisopos

Cerillos

Para la tipificación del género Candida existen diversos procedimientos que se debe realizar:

1. Obtención delraspado de mucosa bucal 2. Examen directo con KOH al 20 % observar al 40X 3. Cultivo: en Sabouraud, o CHROMagar

Aunque puede haber pequeñas diferencias entre la morfología colonial de las especies de Candida, por lo regular es similar.

Se desarrollan en medio de Sabouraud agar en un tiempo de 48 a 72 hrs a 25°C, dando colonias limitadas, planas cremosas, opacas, generalmente lisas, aunque algunas veces se presentan rugosas, de color blanco o blanco amarillento, rara vez pueden dar tonalidades rosas (Candida guillermondi)

4. Identificación de especie

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a. Formación de tubo germinativo b. Formación de clamidoconidia. c. Siembra en CHROMagar Candida d. PCR

De los cuales utilizaremos la siguiente secuencia de pruebas:


1) Raspado bucal a. se hará en dos individuos de cada equipo. b. Raspar con un abatelenguas la zona a estudiar c. el raspado pasarlo a un porta objetos d. se debe realizar el mismo procedimiento para los dos individuos

2) Examen directo a. Colocar una gota de KOH al 20% a cada muestra tomada y posteriormente colocar el

cubre objetos b. calentar las muestras al mechero (para acelerar el aclarado) c. observarlas las muestras en un microscopio con el aumento de 40X. d. el resultado se interpreta:

i. positivo = presencia de blastoconidias y pseudomicelios ii. negativo= presencia solo de blastoconidias

a. En personas sanas, se deben observar las blastoconidias. b. En pacientes con candidosis se observaran blastoconidias y pseudomicelios

Anotar los resultados en la sección de resultados.

3) Cultivo de cepa

(Proporcionada por el laboratorio):

a. Resiembra de la cepa en agar Sabouraud por el método de estría cruzada

b. La siembra se debe hacer por estría simple para aislar en la mitad de cada placa por cepa y purificarlas cepas ya que va a ser usada para la toma de cepa para hacer la prueba formación de clamidoconidia en otro grupo y para tomar colonias para hacer examen en fresco.

c. Acudir a ver tus cultivos y observar las características propias de la colonia y anotar tus resultados.


Desarrollan en medio de Sabouraud agar en un tiempo de 24 a 48 h a 37°C, dando colonias limitadas, planas cremosas, opacas, generalmente lisas, aunque algunas veces se presentan rugosas, de color blanco o blanco amarillento, rara vez pueden dar tonalidades rosas.

4) Identificación de especie

a. Cultivo En CHROMagar Candida.

Tomar muestra a 2 individuos del equipo con hisopo estéril y hacerla descarga

directa en el medio.

La siembra se debe hacer por estría simple con el asa bacteriológica para aislar y

purificar las cepas en la mitad de cada placa.

Observar las características propias de la colonia.

Debes acudir a ver tus cultivos y anotar tus resultados.


Se desarrollan en medio de CHROMagar Candida en un tiempo de 24 a 48 h a 37°C, dando colonias limitadas, planas cremosas, opacas, generalmente lisas, aunque algunas veces se presentan rugosas, y con un color diferente para cada una de las especies. Las colonias de C. albicans presentan un color verde claro a mediano, C. dubliniensis produce un color verde oscuro,

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las colonias de C. tropicalis presentan un color azul verdoso a azul metálico y las colonias de C. krusei presentan un color rosa claro con un borde blancuzco. Es posible que otras especies de levaduras produzcan su color natural (crema) o presenten un color rosa o malva de claro a oscuro (por ejemplo, Candida [Torulopsis] glabrata y otras especies). Una ventaja adicional del medio es la fácil detección de cultivos mixtos de levaduras, debido a los diferentes colores que presentan sus colonias.

a. Formación de clamidoconidia

a. Tomar colonias de la placa de Sabouraud y resembrarlas en medio de harina de Arroz con tween 80 al 1%.

1. Incubar por 48 a 72 h a temperatura ambiente. 2. Colocarle un cubre objetos a la colonias y observar la caja directo al microscopio 3. Observar la presencia de clamidoconidias = C. albicans o C. dubliniensis.

a. En este medio solo Candida albicans y C. dubliniensis tienen la capacidad de formar esta estructura.

Por lo que su presencia nos indica que se trata de una de estas especies.

Los resultados se leen a las 48 o 72 h.

La lectura se hace sobre la propia caja de petri, ya que el medio es traslucido.

Observaciones y resultados:

Deberás anotar y hacer dibujos de lo que vez en cada uno de los procedimientos que se realizaron.

De las cajas deberás registrar:

(1) tamaño (2) forma (3) consistencia (4) bordes (5) color

De las observaciones al microscopio deberás registrar:

1. nombre de las estructuras que se observan 2. forma de cada una de estas estructuras 3. diagnostico de laboratorio en base a lo que observas.

89


91


1. ¿Por qué el Sabouraud se emplea en el diagnóstico de laboratorio de hongos?

2. ¿En que difieren las paredes celulares de los hongos y de las bacterias?

3. Explica porque no se puede usar la técnica de Gram para ver los hongos.

4. describe que es el pleomorfismo y en que hongos se presentan

5. describe que es el dimorfismo y en que hongos se presentan

6. menciona las especies de Candida que pueden estar implicadas en la candidiasis bucal

RESPUESTAS.

92

EVALUACION DE LA PRCTICA.


93

PRACTICA XI ACCIÓN DE LOS DESINFECTANTES EN EL CRECIMIENTO

MICROBIANO. Elaboró: Dra. Santa Ponce Bravo

Mtra. Adriana Patricia Rodríguez Hernández

OBJETIVOS.

Durante el desarrollo de esta práctica:

Determinará la acción antimicrobiana del glutaraldehido al 2%, con la prepararación indicada por el fabricante como esterilizante de material quirúrgico y dental.

Determinará la acción antimicrobiana del hipoclorito de sodio al 10%, como dilución propuesta con mecanismo de desinfección.

Determinará la acción antimicrobiana del alcohol isopropílico al 70%, como dilución propuesta con mecanismo de desinfección.

Determinará la efectividad del uso de controles negativos y positivos en estudios de efectividad antimicrobiana.

Determinará las implicaciones de bioseguridad y control de infecciones en la preparación de las diluciones propuestas por el fabricante en el área odontológica como: bactericidas o bacteriostáticos.

INTRODUCCIÓN.

La industria química día con día se ha preocupado por la elaboración de sustancias empleadas en la desinfección de diversos lugares como: hospitales, quirófanos, clínicas, salas de espera, sitios públicos y el hogar. Muchos de los desinfectantes son ocupados en una gran diversidad de áreas, pero todos ellos son aplicados a diferentes concentraciones, la mayoría de las diluciones se realizan sin seguir las instrucciones del fabricante, que previamente ha llevado a cabo una serie de pruebas para ofrecerlos con un promedio de efectividad bactericida o bacteriostática del 90 al 99%.

Esta efectividad depende, no solo de la concentración que tenga la dilución, sino también de la limpieza de la superficie, el tipo de contaminantes, la calidad del vehículo, la temperatura, el almacenamiento, por lo anterior, nos percatamos que la gran diversidad de variables a controlar en la población abierta no son considerados.

Por lo antes mencionado, es necesario que el alumno identifique, determine y establezca la función de las sustancias químicas empleadas en odontología a diferentes concentraciones, y las relacione por su efecto como bacteriostático o bactericida sobre su instrumental odontológico.


Glutaraldehído (esterilizante de material quirúrgico y dental) Hipoclorito de sodio (Uso comercial) Alcohol isopropílico (Uso comercial)

Diluciones

1 recipiente plástico (de cierre hermético) con glutaraldehído al 2%

(para preapración previa a la prpactica)

Nota: leer técnica y realizar procedimiento previo a la práctica.

1 recipiente plástico con hipoclorito de sodio al 10%.

1 recipiente plástico con alcohol isopropílico al 70%.

Medios de cultivo.

6 cajas de petri con agar sangre.

Cepa bacteriana pura de :

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Fusobacterium nucleatum.

Equipo.

Mechero de Bunsen.

Incubadora.

Material

Asa bacteriológica

1 probeta.

Consumibles.


Cinta adhesiva.

Lápiz graso.

Instrumental y material por equipo.

3 Recipientes plásticos con cierre hermético (cajas para instrumental) Uno proporcionado por los alumnos y dos por el laboratorio.

3 instrumentos de uso odontológico preferentemente romos sin lavar ni esterilizar (uno de ellos en caja con cierre hermético y solución de glutaraldehido).

2 instrumentos de uso odontológico estériles y empaquetados.

6 hisopos estériles en empaque individual.


1. Se preparará una dilución de glutaraldehido al 2%, siguiendo las instrucciones del fabricante (preparación previa a la práctica por equipo)

2. Colocar en una caja con cierre hermético, la solución de glutaraldehido con uno de los instrumentos que se haya usado para la inspección clínica. Hacer el cálculo para que la solución permanezca por lo menos 10H antes de llegar a la práctica. Levar la caja cerrada con el instrumental a la práctica de laboratorio.

3. En el laboratorio se prepararán las diluciones de hipoclorito de sodio y alcohol isopropílico a concentraciones del 10% y 70% respectivamente, siguiendo las instrucciones del fabricante (proporcionado por el laboratorio). Sumergir dos instrumentos sucios en las diferentes soluciones desinfectantes y esperar 10 minutos.

4. Sacar el instrumental de las tres soluciones teniendo cuidado de no tocar con las manos las puntas activas y con un hisopo frotar dichas partes. Sembrar por estría cruzada en la mitad de una placa de agar por solución (tres placas individuales).

5. Con hisopos por separado (2), frotar las puntas activas de dos instrumentos estériles y sembrar por estría simple en la mitad de las dos placas de agar provenientes de los sembrados previos de las diluciones de hipoclorito de sodio y alcohol isopropílico (marcarlas como placas control negativo).

7. Con una asa bacteriológica, tomar un inóculo de la placa del cultivo puro de F. nucleatum, y sembrar la mitad de la placa restante (proveniente del sembrado de la solución de glutaraldehido) y marcarla como placa control positivo.

8. Las placas inoculadas de las diluciones de hipoclorito de sodio y alcohol isopropílico, se incubarán a 35+ 2°C durante 72 horas, para ser observadas en estos dos lapsos de tiempo y al término comparar el crecimiento bacteriano.

9. La placa proveniente de la dilución de glutaraldehido y cultivo puro de F. nucleatum se incubará a 35+ 2°C durante 72 horas en jarras de anaerobiosis para ser observadas en estos dos lapsos de tiempo y al término comparar el crecimiento bacteriano.

95

Esquematice el procedimiento de diluciones y sembrado.

96


(Anotar los resultados en una tabla)

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1. Defina bactericida.

2. Defina bacteriostático.

3. ¿Qué es el glutaraldehido y cuáles son sus funciones?

4. ¿Qué es el hipoclorito de sodio y cuáles son sus funciones?

5. ¿Qué es el alcohol isopropílico y cuáles son sus funciones?

6. ¿Cómo se prepararon las diferentes diluciones?

7. ¿Por qué es necesario realizar las diluciones a las concentraciones establecidas por el fabricante?

8. ¿Cuál es el tiempo y la concentración de las diferentes sustancias empleadas que son bactericidas o bacteriostáticas?

9. ¿Para qué se realiza la siembra posterior al tiempo de permanecer en las diferentes soluciones?

10. ¿Con qué fin se realiza el sembrado del control negativo?

11. ¿Con qué fin se realiza el sembrado del control positivo?

RESPUESTAS.

99

EVALUACION DE LA PRÁCTICA.


100

PRÁCTICA XII ANTIBIOGRAMA

OBJETIVOS.


Comprenda la importancia del antibiograma en el tratamiento certero de las enfermedades infecciosas.

Observe los efectos de los diferentes antimicrobianos sobre las bacterias Gram positivas y Gram negativas.

INTRODUCCIÓN.

La necesidad de controlar el crecimiento bacteriano ha sido vital desde que bacterias Gram positivas y Gram negativas patógenas fueron descubiertas como las responsables de producir enfermedades infecciosas. De aquí que el tratamiento de dichas enfermedades dependa de sustancias biológicas o químicas que inhiban o destruyan a dichos microorganismos.

Cuando las sustancias mencionadas solamente inhiban el crecimiento bacteriano se llamarán bacteriostáticas y cuando maten a la célula bacteriana se llamarán bactericidas.

Los antimicrobianos pueden ser de amplio o reducido espectro, según que actúen sobre gran número de microorganismos o sobre un número reducido de ellos.

Las bacterias en forma natural pueden ser sensibles o resistentes a determinado antimicrobiano; sin embargo algunas bacterias que eran sensibles han adquirido por medio de sistemas enzimáticos o por mutación la facultad de resistir la acción de algunos agentes antibacterianos.

La actividad bacteriostática o bactericida puede determinarse in vitro mediante técnicas de dilución en medio líquido, en medio sólido o por técnicas de gradiente de difusión, como Epsilón- test (Etest). Todas estas técnicas requieren una rigurosa estandarización del medio de cultivo, del inóculo bacteriano, de la temperatura, de la atmósfera y del tiempo de incubación y finalmente de los criterios de lectura.

El antibiograma es una técnica usada en el laboratorio de microbiología para determinar si una bacteria en estudio, es sensible o resistente a determinado antimicrobianos. Los resultados se reportan como altamente sensible, medianamente sensible o resistente.

La acción de los antimicrobianos sobre las bacterias puede ser afectada por varios factores, que influyen en el desarrollo de la técnica y en la lectura final.

Hay que considerar que hay varias causas por las que un antimicrobiano puede ser efectivo in vitro e ineficaz in vivo.

Revisar siguiente link: http://www.microbelibrary.org/images/spencer/spencer_cellwall.html


Cepas

Cultivo de Sthaphylococcus aureus

Cultivo de Escherichia coli.

Medios de cultivo

Dos placas de Agar de Mueller-Hinton.

Material

Sensidiscos para Gram positivos y Gram negativos.


2 Pinzas estériles

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Consumibles

2 hisopos estériles

Cinta adhesiva.

Lápiz graso.



Nota: El procedimiento es el mismo para ambos microorganismos aquí usados, excepto por la selección de los sensi-discos.

1. Introduzca un hisopo estéril al tubo conteniendo un crecimiento de toda la noche de la bacteria que va a ser probada (ya sea S. aureus ó E. coli)

2. Quite el exceso del fluido por torsión del hisopo contra el interior de la pared del tubo.

3. Transfiera los microorganismos por rayado de la superficie horizontalmente de la placa de Mueller-Hinton, en líneas espaciadas no muy separadas.

4. Haga girar la misma placa aproximadamente 60° a la derecha y vuelva a rayar usando el mismo hisopo.

5. Por último, gire la placa otros 60° a la derecha y haga una tercera línea de rayado. La superficie de rayado deberá ser totalmente cubierta por un “césped” uniforme de bacterias.

6. Elimine el hisopo usado en un contenedor.

7. Reponga la tapa de la placa y déjela por 10 min. Para que se absorba el exceso del inóculo.

8. Con pinzas estériles tome los sensi-discos seleccionados y colóquelos sobre la superficie inoculada haciendo una ligera presión.

9. Incube las placas en posición invertida a 35° C por no más de 24 hrs, anote los resultados.


102

RESULTADOS

Los resultados pueden ser interpretados como resistencia (R), o sensibilidad (S) al antimicrobiano, si el organismo es sensible habrá una zona de inhibición de crecimiento alrededor del disco; si la bacteria es resistente habrá crecimiento alrededor del disco Llenar la siguiente tabla.

1. Microorganismo usado:

Antimicrobiano Gram +

Concentración del disco

Diámetro de zona (mm)

Resultados (R o S)

2. Microorganismo usado:

Antimicrobiano Gram +

Concentración del disco

Diámetro de zona (mm)

Resultados (R o S)

104


1. Explique en qué consiste un antibiograma

2. Describa la técnica de difusión

3. Describa la técnica de microdilución

4. Describa la técnica de disco-difusión agar

5. Describa la técnica de Epsilón-Test

6. Defina los términos, antimicrobiano, antibiótico y quimioterapéutico.

RESPUESTAS.

105



106

BIBLIOGRAFÍA.

1. Brock TD, et al. Biología de los microorganismos. 12ª edición, Addison-Wesley, CIB. Edic.

Madrid. 677 pp. Medellín. Colombia, 2009.

2. CDC y NIH. Bioseguridad en Laboratorios de Microbiología y Biomedicina 4ª Edición,

Español, PDF 196 Pp.

3. Guillem Prats Microbiología clínica Ed. Medica Panamericana Hispanoamericana. 6ta Edic. 956

pp México D.F. 2006.

4. Jawetz, Melnick, & Adelberg's. Medical Microbiology, 26ed. Mc Graw Hill 2012.

5. Koneman Elmer W., Diagnóstico microbiológico Texto y atlas a color. Editorial médica

panamericana, México, D.F. 1992.

6. Liébana, J. Microbiología oral. Ed. Mc Graw-Hill-Interamericana. 2ª ed, 2002.

7. Lodish, H., A. Berk, et al. 5ª. Edición. Biología Celular y Molecular. Buenos Aires, Argentina,

Médica-Panamericana. Moderna. México. 476 pp, 2005.

8. Organización Mundial de la Salud (OMS). Manual de bioseguridad en el laboratorio. 3ª

Edición. Ginebra 2005.

9. Sherris. Microbiología Médica, 5a edición, Editorial. McGrawHill, 2011.

Sitios Web:

http://bcs.whfreeman.com/lodish7e/.

http://www.who.int/csr/resources/publications/biosafety/CDS_CSR_LYO_2004_11SP.pdf?

ua=1

http://www.fcen.uba.ar/shys/planprot/indice

http://www.cdc.gov/od/ohs/pdffiles/bmbl4_spanish

http://www.ua.es/va/centros/facu.ciencies/seguridad

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ (Centro de Información Biotecnológica de EEUU)

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed (Base de datos de

publicaciones científicas)

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Taxonomy (Identificación del grupo

taxonómico al que pertenece una especie)

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/ (BLAST frente a GenBank o Banco de datos genético

mundial)

http://www.semicro.es/ (Sociedad Española de Microbiología)

http://www.inab.org/ (Instituto Nacional de Bioinformática)

http://www.redgb.org (Red Nacional de Genómica Bacteriana)

http://www.cect.org/ (Colección española de cultivos tipo)

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/static/eub_g.html

http://www.genome.jp/kegg/kegg2.html

http://pathmicro.med.sc.edu/virol/herpes.htm

http://www.biologia.edu.ar/viruslocal/diagnostico%20viral.htm



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