2020

Desarrollo de una bebida funcional fermentada a base

de soja

NICOLE MANAGÓ Directora: Carolina Iraporda Co-director: Julio C. Caione

Licenciatura en Tecnología de Alimentos

El presente trabajo de Tesis fue desarrollado como requisito para optar el

título de grado de Licenciada en Tecnología de los Alimentos.

Agradecimientos

A la Universidad Nacional del Centro y a todos los profesores de la Facultad de Ingeniería Olavarría

por permitirme formarme y capacitarme para obtener mi título de Licenciada en Tecnología de los

Alimentos, por adaptarse con tanta predisposición a nuestras forma de cursada y haberlo hecho

posible;

Al Departamento de Ingeniería Química y Tecnología de los Alimentos por permitirme desarrollar

mi Proyecto final de Tesis brindándome sus instalaciones, materiales y medios;

A Caro e Ire por guiarme y ayudarme durante estos dos años, por su paciencia, por brindarme todo

su conocimiento y comprometerse tanto con este proyecto, por estar siempre para despejar cada

una de mis duda, contenerme cuando me desbordaba y por su enorme apoyo;

A Julio por permitirme desarrollar el proyecto dentro de las instalaciones de su laboratorio,

brindarme materiales y medios para poder llevarlo a cabo;

A mi familia por haberme inculcado de chica la importancia de estudiar y tener una profesión, por

convencerme de que todo es posible cuando no lo podía ver, por haberme ayudado y acompañado

todos estos años, por sus palabras de aliento, por su contención y por su amor infinito;

A mi amor, Agustín, por su paciencia infinita, su cariño y amor, por apoyarme en cada decisión y

contenerme todos estos años, por estar siempre y por hacer todo más especial. Por cada viaje a

Olavarría que hizo posible este logro;

A Ro, por acompañarme estos últimos años de carrera, por su hermosa amistad, sus palabras de

aliento, su paciencia, su gran ayuda y apoyo. A tu familia hermosa que siempre estuvo para mí con

enorme predisposición y cariño;

A todos mis compañeros del Lab. por su buena energía y predisposición, por permitirme acaparar

las mesadas para desarrollar mi proyecto, por bancarme siempre.

A Cele, por abrirme las puestas de su casa, por alentarme a seguir, por su contención, por sus

interminables mates;

A cada uno de mis amigos por estar siempre, por cada palabra de aliento, por celebrar siempre mis

logros y alegrase por ellos, por hacerme reír cuando lo necesitaba y también escucharme en mis

peores días. A Meli por alojarme en su casa para que pueda viajar;

A todos ustedes, ¡Muchísimas Gracias!

1

Índice

2

Índice

Página

Índice 2

Resumen 6

Introducción 8

1. Alimentos funcionales 8

1.I. Prebióticos 9

1.I.i. Inulina 10

1.I.i.a. Efectos de la inulina a nivel fisiológico 11

1.I.i.b. Aplicaciones tecnológicas de la inulina 12

1.II. Probióticos 12

1.II.i. Mecanismos de acción de los microorganismos probiótico 14

2. Alimento con probióticos 15

2.I. Bacterias ácido lácticas 16

2.II. Probióticos en matrices vegetales 19

3. Soja 20

3.I. Bebida a base de soja 22

Hipótesis 26

Objetivos 28

Materiales y Métodos 30

1. Microorganismos y condiciones de cultivo 30

2. Evaluación del crecimiento de las bacterias ácido lácticas, acidificación

y pH en MRS y extracto de soja 30

2.I. Determinación de la acidez titulable 30

3. Actividad antimicrobiana de las bacterias ácido lácticas y sus

sobrenadantes de cultivo 31

4. Desarrollo de la bebida fermentada a base de soja 31

5. Caracterización de la bebida fermentada 32

5.I. Caracterización fisicoquímica 32

5.I.a.Determinación del contenido de humedad 32

5.I.b. Determinación del contenido de cenizas 32

5.I.c. Determinación del contenido proteico 33

5.I.d. Determinación del contenido de lípidos 34

3

5.I.e. Determinación del contenido de carbohidratos 35

5.I.f. Valor energético 35

5.II. Determinación de la actividad antioxidante 35

5.III. Determinación de la actividad antimicrobiana 36

6. Resistencia de las bacterias ácido lácticas en bebidas fermentadas

sometidas a la simulación de pasaje a través del tracto gastrointestinal 36

7. Determinación de la viabilidad de las bacterias ácido lácticas en la

bebida fermentada durante el almacenamiento 37

8. Análisis estadísticos 38

Resultados y Discusión 40

1. Caracterización de bacterias ácido lácticas y crecimiento en bebida de

soja 40

2. Actividad antimicrobiana de las bacterias ácido lácticas y sus

sobrenadantes 46

3. Bebida de soja fermentada 49

3.I. Características generales de la bebida fermentada 49

3.II. Análisis composicional y valor energético 52

3.III. Actividad antioxidante de la bebida de soja fermentada 53

3.IV. Actividad antimicrobiana de la bebida de soja fermentada 54

4. Resistencia de las bacterias ácido lácticas a las condiciones

gastrointestinales simuladas 58

5. Almacenamiento de las bebidas de soja fermentadas 59

Conclusión 66

Proyecciones 68

Anexo 1 70

Información nutricional de la leche de soja en polvo Nutrilon Soya 70

Anexo 2 72

Procedimientos para la observación microscópica de bacterias 72

Anexo 3 75

4

Composición y preparación de medios de cultivo y soluciones empleadas 75

Soluciones y reactivos para técnica micro-kieldahl 80

Reactivos para la técnica Soxhlet 81

Soluciones para la simulación del pasaje a través del tracto

gastrointestinal 81

Bibliografía 84

5

Resumen

6

Resumen

Hoy en día existe una mayor conciencia por parte de los consumidores sobre la

estrecha relación entre la alimentación y la salud, reconociéndose los efectos beneficiosos

de la dieta sobre el desarrollo, la inmunidad, el crecimiento y la composición corporal,

entre otros. Esto conlleva a la demanda creciente de productos que contribuyan a un

buen estado de salud y por ende a un mayor bienestar y calidad de vida. Debido a ello, en

los últimos años se ha incrementado el interés de la industria alimentaria y el ámbito

científico por la investigación y el desarrollo de alimentos funcionales. Este tipo de

alimentos ejercen además de su función meramente nutritiva, una acción beneficiosa

sobre algunos procesos fisiológicos y/o reducen el riesgo de padecer ciertas

enfermedades. Entre los ingredientes bioactivos de mayor relevancia para la elaboración

de alimentos funcionales, se encuentran los prebióticos y los probióticos. La mayoría de

los alimentos comercializados con este tipo de componentes se basan en matrices lácteas

y por tanto ciertos sectores de la población, como los alérgicos a las proteínas de la leche,

veganos y/o intolerantes a la lactosa, no pueden consumirlos. Por ello, surge como desafío

explorar la incorporación de ingredientes prebióticos y probióticos a matrices no lácteas

para ofrecer a los consumidores una alternativa a los productos lácteos fermentados.

En el presente proyecto se desarrolló una bebida funcional fermentada a base de

soja (Glycine max L. Merr.) con la adición combinada de microorganismos probióticos,

como el Lacticaseibacillus paracasei BGP1 y Lactiplantibacillus plantarum CIDCA 8327 y

prebióticos como la inulina. Como objetivo se planteó establecer las condiciones de

elaboración del producto fermentado, el estudio de algunas de sus propiedades

funcionales y el efecto de la inulina sobre la viabilidad y la sobrevida de las bacterias en la

bebida fermentada de soja. Ambas bacterias ácido lácticas fueron capaces de fermentar la

bebida de soja. La bebida fermentada con L. plantarum presentó mayores recuentos

finales, pH más bajos, mayor porcentaje de acidez titulable, efecto bactericida frente a

cepas patógenas, mantuvo la actividad antioxidante de la bebida de soja sin fermentar y

presentó mayores porcentajes de sobrevida en el paso a través de tracto gastrointestinal

in vitro. El agregado de inulina aumentó la viabilidad de los probióticos en la matriz

durante el período de almacenamiento y se obtuvieron mejores resultados en la

simulación del pasaje a través del tracto gastrointestinal. De este modo, los resultados

obtenidos en el presente estudio contribuyen al futuro desarrollo de alimentos

funcionales basados en matrices vegetales.

7

Introducción

8

Introducción

1. Alimentos funcionales

El papel principal de la dieta es proporcionar suficientes nutrientes para cumplir

con los requisitos metabólicos, al tiempo que brindaría al consumidor una sensación de

satisfacción y bienestar. Sin embargo, el avance en investigación y tecnología ha logrado

que más allá de satisfacer las necesidades nutricionales, la dieta pueda modular varias

funciones fisiológicas y desempeñar papeles beneficiosos frente a ciertas enfermedades.

En este sentido, surge el concepto de alimento funcional (Granato et al., 2010), el que fue

utilizado por primera vez en Japón, en la década de los ochenta en referencia a los

alimentos de uso específico para la salud denominados FOSHU (Food for specific health

use), y que luego fue adoptado por otros países (Ramos et al., 2012). Actualmente, los

alimentos funcionales se definen como un alimento que es, o parece ser similar, a un

alimento convencional, que forma parte de una dieta estándar y se consume de forma

regular, en cantidades normales. Además, tiene beneficios para la salud comprobados

dado que reducen el riesgo de enfermedades crónicas específicas o afectan de manera

beneficiosa las funciones objetivo más allá de sus funciones nutricionales básicas (Bultosa,

2016). Estos alimentos pueden ser productos en los que uno o varios ingredientes son

añadidos, retirados o están presentes de forma natural y proporcionan efectos

beneficiosos en la salud de los consumidores o reducen el riesgo de padecer ciertas

enfermedades (Roberfroid, 2005). Los compuestos bioactivos se definen como

componentes de los alimentos que influyen en las actividades celulares y fisiológicas

obteniendo, tras su ingesta, un efecto beneficioso para la salud (Champagne et al., 2005).

Normalmente, estos compuestos están en cantidades muy pequeñas en los alimentos que

consumimos como parte de nuestra dieta habitual y en la mayoría de los casos, provienen

de fuentes alimentarias vegetales. Así como también, pueden añadirse de manera natural,

modificarse o mejorarse, con el fin de propiciar beneficios en la salud en cuanto a

desarrollo, defensa contra el estrés oxidativo, regulación de procesos metabólicos,

fisiología cardiovascular y gastrointestinal, rendimiento mental, cognitivo, físico y

deportivo. Entre ellos pueden mencionarse los siguientes (Lamos et al., 2018):

◆ Compuestos con actividad antioxidante: fenoles, ácidos fenólicos, antocianinas,

triterpenos, flavonoides, carotenoides, entre otros.

◆ Ácidos grasos esenciales: ácido grasos poliinsaturados como ácido linolénico,

docosahexaenoico, eicosapentaenoico (de la familia omega-3) y linoleíco (omega-

6), entre otros.

◆ Fibras vegetales: celulosa, hemicelulosa, lignina, pectinas y ceras.

9

◆ Prebióticos: fructooligosacáridos (FOS), galactooligosacáridos (GOS), inulina,

isomalto-oligosacáridos (IMO), xilo-oligosacáridos (XOS), almidón resistente y

oligosacáridos de soja (SOS), entre otros.

◆ Probióticos: Algunas especies de Lactobacillus, Bifidobacterium, Enterococcus,

Pediococcus, Propioniobacterium, entre otros.

◆ Vitaminas y minerales

1.I. Prebióticos

Los prebióticos son definidos como “sustratos que son utilizados selectivamente

por microorganismos hospedadores que confieren un beneficio para la salud” (Gibson et

al., 2017).

Para que un ingrediente alimentario o un alimento pueda considerarse como

prebiótico debe cumplir una serie de requisitos tales como (Roberfroid, 2007):

◆ Ser resistente a la acidez y a la hidrólisis por enzimas digestivas y no ser absorbido

en el tracto gastrointestinal (TGI) superior (esófago, estómago y duodeno) y, por lo

tanto llegar al colon prácticamente inalterados.

◆ Ser fermentado selectivamente por la microbiota intestinal y estimular

selectivamente el crecimiento y/o actividad de bacterias intestinales que

contribuyen a la salud y el bienestar.

◆ Ser capaz de inducir efectos fisiológicos beneficiosos para la salud.

Entre todos los componentes de los alimentos, los carbohidratos no digeribles

(oligo- y polisacáridos) son los candidatos más importantes para ser considerados

prebióticos. Estos carbohidratos pueden estar presentes de forma natural en alimentos

tales como leche, hortalizas, frutas, cereales (trigo, avena, etc.), legumbres y frutos secos,

aunque también se los puede obtener de diversas fuentes vegetales por métodos

químicos y enzimáticos para ser luego utilizados como ingredientes en formulaciones

alimentarias (Charalampopoulos y Rastall, 2012; Corzo et al., 2015).

Los carbohidratos no digeribles se clasifican en dos grupos, colónicos (fibra

alimentaria) y prebióticos (Weisstaub y Zuleta, 2013; Corzo et al., 2015). Los ingredientes

colónicos son carbohidratos que llegan al colon, sirven como sustrato para los

microorganismos que lo habitan originando energía, sustratos metabólicos y

micronutrientes esenciales para el hospedador. Dentro de este grupo se incluyen los

polisacáridos estructurales de plantas, tales como pectinas, hemicelulosas, celulosa,

gomas o algunos oligosacáridos derivados de la soja, glucooligosacáridos,

arabinooligosacáridos, etc. Entre los prebióticos más importantes se encuentran los

fructooligosacáridos (FOS), la inulina y galactooligosacáridos (GOS), mientras que los

prebióticos emergentes incluyen isomalto-oligosacáridos (IMO), xilo-oligosacáridos (XOS),

almidón resistente y oligosacáridos de soja (SOS), estos últimos aún en estudio (Heydari et

10

al., 2011; Charalampopoulos y Rastall, 2012). Los prebióticos realizan todas las actividades

mencionadas anteriormente, y además, estimulan el crecimiento selectivo de

determinadas especies beneficiosas de la microbiota intestinal, principalmente

bifidobacterias y lactobacilos (Corzo et al., 2015).

1.I.i. Inulina

La inulina se encuentra en la naturaleza como carbohidrato de reserva de diversos

vegetales siendo las principales fuentes el topinambur (Helianthus tuberosus L.) (89%),

achicoria (Cichorium intybus) (79%), dalia (Dahlia spp.) (59%), entre otras (Tabla 1).

Tabla 1: Contenido promedio de inulina en diferentes especies vegetales

(Adaptado de Madrigal y Sangronis, 2007).

FUENTE Inulina (g/100 g base seca)

Topinambur (Helianthus tuberosus) 89

Achicoria (Cichorium intybus) 79

Raíz de Dalia (Dahlia spp.) 59

Cebolla (Allium cepa L) 48

Puerro (Allium porrumL.) 37

Ajo (Allium sativum) 29

Yacón (Smallanthu ssonchifolius) 27

Espárrago (Asparragus officinalis L.) 4

Banana (Musa cavendishii) 2

Centeno (Secale cereale) 1

La inulina consiste en un polímero lineal de unidades de fructosa unidas mediante

enlaces glicosídicos de tipo β-(2→1)fructosil-fructosa, siendo el término "fructanos"

usado para denominar este tipo de compuestos. Las cadenas de fructosa tienen la

particularidad de terminar en una unidad de glucosa unida por un enlace α-(1,2) (residuo

D-glucopiranosil) pero también el monómero terminal de la cadena puede corresponder a

una unidad de fructosa (residuo D-fructopiranosil) (Figura 1) (Madrigal y Sangronis, 2007).

11

Dado que, durante la obtención de inulina de una fuente determinada, se pueden extraer

cadenas con longitudes variables, para la caracterización del compuesto obtenido se

calcula el grado de polimerización promedio (GPn) (Madrigal y Sangronis, 2007). Se refiere

en general, como inulina de “bajo grado de polimerización” cuando el GPn es menor a 10

unidades, de “alto grado de polimerización” cuando el GPn es mayor o igual a 23 y se

denominan fructooligosacáridos a los fructanos con grado de polimerización entre tres y

siete unidades (Apraez y Castillo, 2015, Shoaib et al., 2016).

Figura 1: Estructura química de la inulina (A) con una molécula terminal de glucosa (β-D-glucopiranosil) (B)

con una molécula terminal de fructosa (β-D-fructopiranosil) (Madrigal y Sangronis, 2007)

1.I.i.a. Efectos de la inulina a nivel fisiológico

Dentro de los efectos nutricionales de la inulina se destacan los siguientes (Aryana

y McGrew, 2007):

◆ Dado que no se digiere en el tracto gastrointestinal superior, no provoca un

aumento significativo del nivel de glucosa sérica, ni estimula la secreción de

insulina.

◆ Mejora la biodisponibilidad de minerales como calcio, magnesio y hierro.

◆ Estimula la actividad metabólica de bacterias beneficiosas e inhibe bacterias

dañinas en el tracto digestivo.

◆ Proporciona los beneficios para la salud normalmente asociados con la fibra

dietética, previniendo el estreñimiento y contribuyendo a la eliminación de

toxinas.

12

◆ Contribuye a reducir el colesterol en sangre y disminuir la incidencia de cáncer de

colon.

◆ Estimula el sistema inmunológico.

1.I.i.b. Aplicaciones tecnológicas de la inulina

Como ingrediente bioactivo comercial, se presenta como un polvo blanco, inodoro

y de sabor neutro. La funcionalidad tecnológica está determinada por los componentes de

la formulación donde se encuentre incluida, como así también por su grado de

polimerización (Shoiab et al., 2016). La inulina de bajo GPn se utiliza comúnmente con

fines endulzantes, mientras que la inulina de alto GPn se emplea como modificador de

textura, reemplazante de materia grasa, espesante, estabilizante de espuma y emulsiones,

entre otros usos (Franck, 2002; Shoiab et al., 2016). Además de las aplicaciones

mencionadas, la inulina se añade a menudo a alimentos que contienen microorganismos

con el objetivo de mejorar la viabilidad y resistencia de los mismos frente a condiciones

adversas del entorno como pueden ser pH extremos, la acción de las enzimas digestivas,

etc. (Casarotti et al., 2015).

1.II. Probióticos

El término probiótico define a los microorganismos vivos que, administrados en

cantidades adecuadas, confieren efectos beneficiosos para la salud del consumidor (Hill et

al., 2014). Entre los microorganismos utilizados como probióticos, los géneros

Lactobacillus y Bifidobacterium ocupan el lugar más destacado, pero también se utilizan

bacterias que pertenecen a los géneros descriptos en la Tabla 2.

13

Tabla 2: Principales especies de microorganismos utilizados como probióticos en la

industria alimentaria (Adaptado de Champagne et al., 2005)

MICROORGANISMOS PROBIÓTICOS

Lactobacillus Bifidobacterium Otras

L. acidophilus L. bulgaricus L. casei L. crispatus L. delbrueckiisubsp. L. fermentum L. johnsonii L. lactis L. paracasei L. plantarum L. rhamnosus L. reuteri L. salivarius

B. adolescentis B. bifidum B. breve B. essensis B. infantis B. lactis B. longum

Enterococcus faecalis

Enterococcus faecium

Pediococcus acidilactici

Propioniobacterium freudenreichii

Saccharomyces boulardii

Streptococcus thermophilus

Para que un microorganismo sea considerado un probiótico, debe cumplir los

siguientes requisitos (Smith, 2014):

◆ Se debe poder identificar inequívocamente el género, la especie, subespecie y la

cepa.

◆ Debe ser inocuo para la salud del consumidor, es decir ser reconocido como GRAS

(Generally Recognized As Safe). No deberá presentar o promover la traslocación

bacteriana (pasaje de bacterias del intestino más allá de los nódulos mesentéricos)

en las concentraciones en que se encuentra en el alimento.

◆ Debe ser genéticamente estable.

◆ Las cepas probióticas no deben ser portadoras de genes de resistencia a

antibióticos.

◆ Deben presentar capacidad de adherirse a la superficie de la mucosa intestinal y de

colonizar el tracto intestinal.

◆ Deben poder obtenerse a escala industrial.

◆ Deben mantenerse viables en el producto en el que se incorporan, durante la vida

útil del mismo.

◆ Deben sobrevivir al pasaje por el tracto gastrointestinal, resistiendo al pH gástrico,

las enzimas digestivas y la acción detergente e inhibidora de las sales biliares y

permanecer viable en el intestino en la concentración exigida.

14

◆ Deben ejercer efectos benéficos para la salud huésped, que hayan sido

científicamente demostrados.

1.II.i. Mecanismos de acción de los microorganismos probióticos

Dentro de los mecanismos de acción descriptos para las bacterias probióticas

podemos mencionar (Arribas et al., 2008):

◆ Competición con bacterias patógenas: Los probióticos pueden establecer una

competencia con bacterias nocivas (patógenos) tanto por los sitios de unión al

epitelio intestinal o por los sustratos disponibles, impidiendo así su desarrollo o

adhesión y de este modo, reducir las posibilidades de infecciones.

◆ Actividad antagónica frente a patógenos: Los probióticos pueden producir una

modificación del pH en el lumen intestinal, debido a la producción de ácidos

orgánicos derivados de su actividad metabólica, o bien compuestos

antibacterianos como pueden ser bacteriocinas o compuestos de bajo peso

molecular como peróxido de hidrógeno, diacetilo, dióxido de carbono entre otros y

así inhibir el desarrollo de bacterias patógenas (Hati et al., 2018).

◆ Mejora de la función de la barrera intestinal: Los probióticos pueden contribuir a

mejorar la función de barrera del epitelio intestinal mediante la inducción de la

expresión génica en favor de la proliferación celular de enterocitos y/o colonocitos,

así como por la estimulación de la síntesis de mucus y proteínas que forman parte

de las uniones estrechas, impidiendo el pasaje de potenciales factores dañinos

desde la luz gastrointestinal al medio interno (Turpin et al., 2010).

◆ Producción de vitaminas: Algunas cepas probióticas son capaces de producir

vitamina B, riboflavina, folato y cobalamina y de este modo su consumo ayudaría a

evitar posibles deficiencias vitamínicas promotoras de enfermedades graves

(Turpin et al., 2010).

◆ Digestión de nutrientes: los probióticos pueden contribuir con la digestión de

compuestos, como por ejemplo lactosa, así como también otros oligosacáridos y

proteínas, debido a la presencia de enzimas específicas (Turpin et al., 2010).

◆ Degradación de factores antinutricionales: Algunos probióticos son capaces de

descomponer factores antinutricionales que se encuentran en alimentos como las

legumbres, entre ellos por ejemplo lectinas, inhibidores enzimáticos, y quelantes

de iones metálicos aumentando la biodisponibilidad de los micronutrientes de los

alimentos (Turpin et al., 2010).

◆ Inmunomodulación: Los probióticos actúan sobre la inmunidad intestinal específica

e inespecífica. Dentro de los posibles mecanismos se encuentran la potenciación

de la actividad fagocítica, activación de células Natural Killer, producción de

inmunoglobulinas (por ejemplo IgA) y citoquinas. La IgA presente en la luz

intestinal posee la capacidad de aglutinar bacterias patógenas y virus promoviendo

15

su eliminación a través de las heces, impidiendo que dañen el epitelio intestinal

(Arribas et al., 2008).

Los mecanismos de acción pueden ser ejercidos en forma conjunta y/o

complementaria por diferentes cepas de microorganismos probióticos, es decir que una

única cepa probiótica no necesariamente cumple todas las funciones a nivel intestinal. En

la Figura 2 se ilustran los diferentes mecanismos de acción ejercidos por las bacterias

probióticas mencionados previamente.

Figura 2: Mecanismos de acción de las bacterias probióticas en el intestino (Herrera et al., 2018).

2. Alimentos probióticos

Según el Código Alimentario Argentino – Capítulo XVII – ALIMENTOS DE REGIMEN O

DIETÉTICOS – Artículo 1389 – (Res. Conj. SPReI N° 261/2011 y SAGyP N° 22/2011), con la

denominación de “Alimento con Probióticos”, se entiende aquel alimento con una carga

de células viables que deberá estar comprendida entre 106 y 109 UFC/g durante su

período de duración mínima.

Para el desarrollo de un alimento con microorganismos probióticos se deben tener en

cuenta los siguientes aspectos (Champagne et al., 2005):

◆ Selección de cepas: La selección de probióticos se basa en criterios microbiológicos

generales que se refieren a la seguridad, la funcionalidad tecnológica, el

16

rendimiento y los beneficios para la salud. En cuanto a la funcionalidad

tecnológica, debe estudiarse la posible producción de biomasa a gran escala, la

supervivencia a la congelación o liofilización, la capacidad de adaptación de las

cepas a las matrices alimentarias, así como a las etapas de elaboración a las cuales

se somete el alimento.

◆ Propiedades biológicas: El nivel de microorganismos viables en un alimento

probiótico debe mantenerse luego de su consumo y pasaje a través del tracto

gastrointestinal, para así permitir que los probióticos desempeñen su función

biológica en el intestino humano. De manera estratégica se pueden diseñar

combinaciones de cepas probióticas que permitan obtener un alimento con

funciones específicas para determinado grupo de consumidores, entre ellos niños,

adultos mayores, etc.

◆ Propiedades tecnológicas: Las características tecnológicas que deben poseer las

cepas probióticas para el desarrollo del cultivo para su comercialización consisten

en altos rendimiento de biomasa a gran escala, supervivencia al congelamiento y

secado. También, es necesario que las cepas no pierdan viabilidad durante la

elaboración o almacenamiento del producto. La viabilidad de los probióticos en la

matriz alimentaria está relacionada con factores como el pH, la temperatura de

almacenamiento, los niveles de oxígeno y la presencia de inhibidores o

microorganismos competidores (Granato et al., 2010).

2.I. Bacterias ácido lácticas

Las bacterias ácido lácticas (BAL) son un grupo heterogéneo de bacterias Gram

positivas que comparten la característica de generar ácido láctico como producto del

metabolismo fermentativo (Levin, 2003). Las BAL son anaerobias facultativas, no forman

esporas, son no móviles y carecen de la enzima catalasa. Son cocos o bacilos de longitud

variable y de grosor de 0,5-0,8 μm. Fisiológicamente son un grupo uniforme que carecen

de actividad respiratoria a causa de la ausencia de la enzima citocromo oxidasa, contienen

un grupo hemina que les permite poner en marcha la cadena respiratoria con el oxigeno

como aceptor de electrones (Huertas, 2010). Son microorganismos con una limitada

capacidad biosintética que requieren factores de crecimiento complejos como vitaminas

del grupo B, purinas, pirimidinas y aminoácidos (Hati et al., 2018). Las BAL no pueden

asimilar el nitrógeno inorgánico, pero son capaces de degradar proteínas y péptidos para

satisfacer sus necesidades de crecimiento (Shihata y Shah, 2000).

Dentro de las BAL, el género Lactobacillus está integrado por microorganismos de

carácter no patogénico, que han adquirido el status GRAS, resistentes a cambios de pH y

de amplia capacidad metabólica, constituye el principal representante de

microorganismos probióticos (Zamudio y Zavaleta, 2003).

17

Según los metabolitos finales de la fermentación de hidratos de carbono, las BAL se

pueden clasificar como homo o heterofermentativas. Las homofermentativas fermentan

la glucosa generando fundamentalmente ácido láctico con poca acumulación de otros

productos finales. En esta reacción el piruvato se reduce a ácido láctico por acción de la

enzima lactato-deshidrogenasa a través de la ruta Embden-Meyerhoff-Parmás o vía

glucolítica (Varela y Grotiuz, 2008). De esta forma se convierte 1 mol de glucosa en 2

moles de ácido láctico (Huertas, 2010) (Figura 3A) según en la siguiente reacción:

Glucosa (C6H12O6) + 2 ADP + 2 Pi → 2 Lactato (C3H6O3) + 2 ATP

En contraste, en las BAL heterofermentativas sólo la mitad de la glucosa

fermentada se convierte en ácido láctico y el resto se transforma en una mezcla de

anhídrido carbónico (CO2), ácido fórmico, ácido acético, entre otros productos. En esta

fermentación se emplea fundamentalmente la vía de las pentosas (Varela y Grotiuz, 2008)

y se convierte 1 mol de glucosa en 1 mol de ácido láctico, 1 mol de etanol y 1 mol de CO2

(Huertas, 2010) (Figura 3B), como se muestra en la siguiente reacción:

Glucosa (C6H12O6) + 2 ADP + 2 Pi → Lactato (C3H6O3) + Etanol (C2H5OH) + Dióxido de

carbono (CO2) + 2 ATP

18

Figura 3: Metabolismo (A) homofermentativo y (B) heterofermentativo, llevados a cabo por las bacterias

ácido lácticas (Rivero, 2019).

Dentro del grupo de las BAL heterofermentativas se encuentran cepas de las

especies Lactiplantibacillus plantarum y Lacticaseibacillus paracasei. A su vez, según la

temperatura óptima de crecimiento las BAL pueden clasificarse como mesófilas (con

temperaturas óptimas entre 30-35°C) o termófilas (con temperaturas óptimas entre 40-

45°C) (Huertas, 2010) siendo las especies Lactiplantibacillus plantarum y Lacticaseibacillus

paracasei, mesófilas.

Las BAL se han utilizado desde hace mucho tiempo para la fermentación de

diversos alimentos como carnes, cereales, verduras y frutas o leche, con el objetivo de

mejorar la conservación de los alimentos por medio de la acidificación o bien para el

desarrollo de sabores o texturas específicos (Champagne et al., 2005). La leche representa

una matriz beneficiosa para el desarrollo de bacterias probióticas, posicionándose como el

sustrato elegido para el desarrollo de alimentos funcionales. En particular, el yogur es una

leche fermentada con las bacterias Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y

Streptococcus salivarius subsp. termophilus y actualmente el 60% de los yogures

comerciales, se encuentran adicionados con bacterias probióticas individuales (monocepa)

o combinadas (multicepa) (Lin et al., 2004; Champagne et al., 2005). Sin embargo, se sabe

19

que la alergia a las proteínas lácteas junto con la intolerancia severa a la lactosa y el

contenido de colesterol, así como también el aumento de la práctica del veganismo o el

vegetarianismo estricto, son factores que limitan el consumo de productos lácteos. Este

hecho hace que resulte necesario el desarrollo de nuevos alimentos o bebidas probióticas

no lácteos para así poder satisfacer la demanda de los consumidores que, por cuestiones

de salud o idiosincrasia, no consumen productos lácteos. De este modo, se busca

reemplazar la leche y sus derivados por otras matrices, como por ejemplo matrices

vegetales (cereales, frutas y verduras) para el desarrollo de alimentos y bebidas con

probióticos (Granato et al., 2010).

2.II. Probióticos en matrices vegetales

Además de la respuesta a las tendencias actuales a dietas vegetarianas y veganas y

considerando también una alternativa para las personas con intolerancia a la lactosa,

existen tradiciones y razones económicas que limitan el uso de productos lácteos en

países como Japón, China y algunos países africanos, que impulsan la idea de reemplazar

los lácteos por matrices vegetales, como vehículos de microorganismos probióticos

(Granato et al., 2010). Como consecuencia, la investigación y el desarrollo de alternativas

de productos probióticos no lácteos es un área que se encuentra en constante

crecimiento. Los vegetales resultan atractivos como matrices alternativas dadas sus

propiedades nutricionales intrínsecas (por ser fuente de componentes nutricionales

fundamentales como vitaminas, fibra dietaria, minerales y fitoquímicos) a las que podrían

sumarse otras propiedades benéficas, aportadas por los microorganismos incorporados

(Castro et al., 2017). En este sentido, en la formulación de bebidas a base de vegetales con

probióticos, se debe garantizar su viabilidad, así como la bioactividad y estabilidad

fisicoquímica y sensorial del producto durante su vida útil. Por ejemplo, se han

desarrollado bebidas a base de uva adicionadas con orujo de uva (residuo de la fabricación

del vino blanco) fermentada con L. rhamnosus que presentó actividad bacteriostática

frente a bacterias patógenas responsables de enfermedades transmitidas por alimentos

(ETAs) (Dias et al., 2018). Por otro lado, se ha demostrado actividad antimicrobiana y

antioxidante aumentadas en un extracto de arándanos fermentado con B.

amyloliquefaciens, L. brevis y S. bombicola (Oh et al., 2017). También se han desarrollado

bebidas a base de vegetales como la remolacha adicionada con hojas de moringa

fermentadas con L. plantarum que mostraron actividad antibacteriana contra patógenos

transmitidos por los alimentos como B. cereus, E. coli, L. monocytogenes y Staphylococcus

aureus, y que también exhibieron actividad captadora de radicales libres (Vanajakshi et al.,

2015).

20

3. Soja

La soja es una leguminosa de ciclo anual que posee un alto valor nutricional y

representa una importante fuente de proteínas y aceites. Según el Código Alimentario

Argentino – Capítulo XI Artículo 886– (Res. Conj. SPReI N° 261/2011 y SAGyP N° 22/2011)

con el nombre de “Soya” o “Soja”, se entiende la semilla del Glycine max L. Merr. y sus

variedades. La soja, originaria del norte y centro de China, ha sido y continúa siendo un

alimento milenario de los pueblos de Oriente. Su expansión a gran escala se efectuó en la

cuarta década del siglo XX en los Estados Unidos, quien en la actualidad sigue liderando la

producción de esta leguminosa. En la Argentina, la producción se incrementó

notoriamente en los años setenta hasta alcanzar en la actualidad el tercer puesto como

productor mundial, siendo el rubro de exportación de mayor incidencia y el mayor

generador de divisas. Actualmente el cultivo ocupa una amplia zona ecológica que se

extiende por todo el país, concentrándose principalmente en la región Pampeana (Ridner,

2006). La soja, para su producción no requiere de suelos muy ricos en nutrientes, se

desarrolla en suelos neutros o ligeramente ácidos, con un pH de 6-7. Tiene una cierta

resistencia a la salinidad. Es especialmente sensible a los encharcamientos del terreno, por

lo que en los de textura arcillosa con tendencia a encharcarse no es recomendable para su

cultivo. Sin embargo, es una planta que requiere mucha agua, por lo que en los terrenos

arenosos deberá regarse con frecuencia. Su temperatura de crecimiento óptima es de 30

°C, pero puede desarrollarse adecuadamente en temperaturas comprendidas entre 20 y

30 °C (Salvagiotti, 2009). El menor costo de la proteína de soja respecto a las alternativas

de origen animal y los bajos requerimientos de suelo y clima, probablemente son las

principales razones de la gran distribución geográfica de la soja.

La soja y sus subproductos han sido ampliamente utilizados en la alimentación

humana desde hace miles de años en países asiáticos. Sin embargo, su gran difusión y el

conocimiento de sus propiedades nutricionales posicionaron a la soja y sus diversos

subproductos como alimentos ampliamente utilizados para la alimentación humana y

animal a nivel mundial. El grano de soja contiene, en promedio, un 36,5% de proteínas,

20% de lípidos, 30% de hidratos de carbono, 9% de fibra alimentaria, 8,5% de agua y 5%

de cenizas (Ridner, 2006). Además, la soja es fuente de minerales como hierro, potasio,

magnesio, zinc, cobre, fósforo, manganeso y vitaminas del complejo B (Penha et al., 2014).

Dentro de los nutrientes más importantes del grano de soja se destacan:

Proteínas y aminoácidos esenciales: La soja es la legumbre que contiene mayor

porcentaje de proteínas, de alta calidad y es de gran interés para la alimentación por sus

altos niveles de aminoácidos esenciales (Penha et al., 2014). Posee proteínas de elevado

valor biológico (cantidad de nitrógeno que aportan al cuerpo y que puede emplearse para

el mantenimiento y crecimiento) y con una gran digestibilidad (proporción de nitrógeno

que es absorbida por el organismo) (Garay, 2006).

21

Hidratos de carbono: La soja aporta 9% de fibra alimentaria, que principalmente

consiste en lignina, celulosa y hemicelulosas. La cáscara de la soja contiene la mayoría de

la fibra del grano (87%). Los hidratos de carbono de la soja se clasifican en solubles e

insolubles. Los carbohidratos hemicelulosas, celulosa, lignina, pectinas insolubles y otros

polisacáridos no digeribles, constituyen la fracción de fibra dietaria insoluble de la soja.

Los solubles son mayoritariamente oligosacáridos como galactooligosacáridos (GOS),

rafinosa, estaquiosa y verbascosa; y polisacáridos solubles, que comprende la fibra soluble

(principalmente pectinas). Los GOS, junto con la rafinosa y la estaquinosa no son

hidrolizados por las enzimas del tracto digestivo de los mamíferos, y por ello llegan

intactos al colon donde son fermentados por la microbiota, produciendo gases y, en

ciertos casos, esto conduce a la distención abdominal y flatulencias (Rinder, 2006).

Lípidos: El aceite de soja es rico en ácidos grasos poliinsaturados y se destaca por

su elevado contenido de ácido linoleico (51%) y su proporción de ácido linolénico (7 a 9

%), un ácido graso esencial precursor de los ácidos Omega 3 (ω-3), cuya función es reducir

el colesterol LDL. Ambos ácidos grasos son importantes para el crecimiento y desarrollo

del cerebro. Además, contiene ácidos grasos monoinsaturados (ω-9) y en menor

proporción ácidos grasos saturados. Otros compuestos de interés en la fracción lipídica de

la soja son los tocoferoles, los cuales actúan como antioxidantes naturales y tienen

funciones de vitamina E (Rinder, 2006).

Vitaminas y minerales: La soja contiene minerales como calcio, hierro, cobre,

fósforo y zinc, sin embargo, la biodisponibilidad de estos micronutrientes es baja debido

que también contiene fitatos, los cuales actúan como antinutrientes, quelando los

minerales y disminuyendo su biodisponibilidad. Las vitaminas son, fundamentalmente

tiamina (B1), riboflavina (B2), piridoxina (B6), niacina, ácido pantoténico, biotina, ácido

fólico, provit-A, inositol, colina y ácido ascórbico (vit-C) (Rinder, 2006).

Isoflavonas: Las isoflavonas son componentes bioactivos presentes en los

vegetales (fitoquímicos) que tienen importantes efectos beneficiosos para la salud.

Forman parte de una subclase de un grupo mayor de fitoquímicos de naturaleza fenólica,

llamados isoflavonoides. La soja y sus derivados contienen grandes cantidades de

isoflavonas que se encuentran como una mezcla compleja de conjugados de glucósidos,

siendo los más abundantes los glucósidos de genisteína y daidzeína. Dentro de los

múltiples beneficios que aportan, las isoflavonas también pueden actuar como

compuestos con actividad antioxidantes (Rinder, 2006).

La soja representa actualmente el cultivo a partir del cual se obtienen numerosos

productos alimenticios, tales como los que se describen en la Tabla 3.

22

Tabla 3: Aplicaciones del grano de soja en la alimentación humana (INTA-Rafaela)

POROTOS VERDES

Ensaladas Platos calientes Conservas - Encurtidos Sopas – Salsas Guisos - Locro - Puchero Ensaladas - Rellenos Dulces Mermeladas Tortas- Licuados

POROTOS SECOS

LECHE DE SOJA

Bebidas - Cuajada o Queso - Dulces - Flanes - Budines - Papillas - Tortas - Postres - Salsas - En polvo - Condensada

BAGAZO DE LECHE DE SOJA

Masitas - Panqueques -Croquetas - Budines - Tortillas - Pastos

Soja tostada Soja frita Como sustituto del café

HARINA DE SOJA

Pan - Pastelería - Alimentos infantiles y p/diabéticos - Salsas, pizzas, rellenos - Polvos p/helados - Bollos - Pastas alimenticias - En embutidos, sustituyendo la carne

BROTES DE SOJA Frescos - enlatados congelados

3.I. Bebida a base de soja

La bebida a base de soja, comúnmente llamada “leche de soja” hace referencia al

extracto acuoso obtenido a partir de la molienda del grano de soja crudo, y que contiene

un alto contenido de proteínas, de alto valor biológico. Además, la “leche de soja”

contiene componentes funcionales tales como vitaminas, isoflavonas, saponina,

fitosteroles, lecitina, ácido fítico e inhibidores de proteasa, que desempeñan funciones

importantes en la nutrición humana (Fakuda et al., 2017; Hati et al., 2018). Este extracto

acuoso, no contiene colesterol ni lactosa y solo una pequeña cantidad de ácidos grasos

saturados y por lo tanto puede ser consumido por personas intolerantes a la lactosa

(Wang et al., 2003). El término “leche de soja” no resulta totalmente adecuado, dado que

por definición del Código Alimentario Argentino – Capítulo VIII – ALIMENTOS LÁCTEOS –

Artículo 554 – (Res. Conj. SPRyRS N° 22 30/01/95) “con la denominación de Leche sin

calificativo alguno, se entiende el producto obtenido por el ordeño total e ininterrumpido,

en condiciones de higiene, de la vaca lechera en buen estado de salud y alimentación,

23

proveniente de tambos inscriptos y habilitados por la Autoridad Sanitaria Bromatológica

Jurisdiccional y sin aditivos de ninguna especie”; sin embargo la denominación de “leche

de soja” ha sido ampliamente difundida, y en adelante se referirá con este término al

extracto acuoso obtenido del grano de soja o sus derivados. Debido a la calidad nutricional

de la soja y sus derivados y sus efectos terapéuticos, los productos a base de soja se

encuentran en auge dentro del mercado de alimentos funcionales. De hecho, los

productos a base de soja representan una categoría de gran crecimiento en el sector

alimentario (Bhatnagar et al., 2017). Además, los productos de soja se consideran un buen

sustrato para el desarrollo de alimentos funcionales fermentados, ya que mediante la

fermentación se reducen los niveles de los carbohidratos que pueden ser responsables de

la producción de gas y molestias intestinales y además, se contribuye a aumentar la

diversidad en la población bacteriana del tracto intestinal. Durante la fermentación de la

leche de soja, muchos compuestos orgánicos se descomponen en moléculas más

pequeñas por las enzimas microbianas que luego ejercen varios efectos fisiológicos

(Fakuda et al., 2017), por ejemplo los glicósidos de isoflavonas se pueden convertir en sus

correspondientes agliconas mediante la acción de glicosidasas, mejorando su absorción en

el intestino. Además, las proteínas de soja se pueden hidrolizar mediante proteasas

microbianas, con la consecuente liberación de péptidos bioactivos que podrían ejercer

efectos antihipertensivos, antioxidantes, antiobesidad, inmunomoduladores,

antidiabéticos, hipocolesterolémicos y anticancerígenos. Por otro lado, los fitatos

presentes en la leche de soja pueden ser hidrolizados durante la fermentación mejorando

la biodisponibilidad y absorción de minerales (Fakuda et al., 2017). El sistema de

bioconversión de los componentes funcionales de la leche de soja durante la

fermentación se resume en Figura 4. Con el objetivo de utilizar bacterias ácido lácticas

para fermentar leche de soja, las cepas deberían ser capaces de emplear los azúcares u

oligosacáridos presentes en dicho medio como fuente de energía. Para poder hidrolizar

los azúcares, las bacterias deben contener una enzima llamada α-galactosidasa que actúa

hidrolizando los enlaces α-D-galactosídicos y reduce los oligosacáridos en azúcares simples

que luego son empleados como sustrato para su metabolismo (Mital y Steinkraus, 1974;

Hati et al., 2014). En particular, la fermentación de leche de soja con bacterias ácido

lácticas podría contribuir a aumentar el valor nutricional, mejorar su sabor, aumentar la

biodisponibilidad de las isoflavonas y calcio, ayudar a la digestibilidad de las proteínas

presentes, aumentar la actividad antioxidante del producto y reducir el contenido de los

oligosacáridos responsables de ocasionar problemas digestivos (Wang et al., 2006; Rekha

y Vijayalakshmi, 2008; Božanić et al., 2011; Zhao y Shah, 2014; Rani y Pradeep, 2015;

Bhatnagar et al., 2017).

24

Figura 4: Sistema de bioconversión de componentes funcionales de la leche de soja durante la fermentación

por BAL

La leche de soja se comercializa en estado líquido, en polvo o como aislado

proteico. La proteína aislada de soja se obtiene a partir de un proceso de refinación de los

concentrados o de las harinas, posee alta digestibilidad y se usa para mejorar la calidad y

cantidad de proteína en las dietas y también por sus propiedades funcionales (Pérez et al.,

2009). En el mercado existen productos a base de soja como aislados proteicos o leche de

soja, de diversas marcas, los cuales están destinados principalmente a la alimentación en

la primera infancia, como por ejemplo el polvo comercial, Nutrilon Soya (Nutricia Bagó,

Argentina). Esta fórmula infantil consiste en un aislado proteico de soja, recomendado

para lactantes desde el nacimiento. Dentro de sus componentes, cuenta con el agregado

de carbohidratos (jarabe de glucosa) y aceites vegetales (palma 35 %, girasol 25 %, canola

20 % y coco 20 %) (ANEXO 1). En el presente trabajo esta matriz fue empleada como base

para el desarrollo de una bebida funcional fermentada.

25

Hipótesis

26

Hipótesis

Es posible desarrollar una bebida fermentada a base de soja mediante la adición de

Lacticaseibacillus paracasei BGP1 o Lactiplantibacillus plantarum CIDCA 8327 en

combinación con inulina de achicoria, con actividad antioxidante y antimicrobiana,

manteniéndose la viabilidad de las cepas en el producto durante su almacenamiento

refrigerado.

27

Objetivos

28

Objetivo general El objetivo general del presente trabajo de tesis fue desarrollar una bebida

fermentada a base de soja con la incorporación de Lacticaseibacillus paracasei BGP1 o

Lactiplantibacillus plantarum CIDCA 8327 combinada con inulina de achicoria y estudiar

propiedades indicadoras de su funcionalidad.

Objetivos específicos

◆ Analizar el crecimiento de Lacticaseibacillus paracasei BGP1 y Lactiplantibacillus

plantarum CIDCA 8327 en la bebida de soja a diferentes temperaturas.

◆ Caracterizar fisicoquímicamente la bebida fermentada obtenida y determinar su

perfil nutricional.

◆ Determinar la actividad antioxidante y antimicrobiana de las bebidas fermentadas.

◆ Evaluar la sobrevida de Lacticaseibacillus paracasei BGP1 y Lactiplantibacillus

plantarum CIDCA 8327 en la bebida fermentada frente a condiciones

gastrointestinales simuladas.

◆ Evaluar la viabilidad de Lacticaseibacillus paracasei BGP1 y Lactiplantibacillus

plantarum CIDCA 8327 durante el almacenamiento refrigerado de las bebidas

fermentadas.

29

Materiales y Métodos

30

Materiales y Métodos

1. Microorganismos y condiciones de cultivo

Se utilizaron las siguientes cepas de bacterias ácido lácticas (BAL): Lacticaseibacillus

paracasei BGP1 (CLERICI-SACCO, Cadorago, Italia) y Lactiplantibacillus plantarum CIDCA

8327, aislada de gránulos de kéfir (Gangoiti et al., 2017). Los cultivos de BAL puros se

conservaron a -20 °C en medio Man, Rogosa, Sharpe (MRS) (Britania, Argentina) con leche

bovina descremada (La Serenísima, Argentina) (1:1). Las cepas fueron activadas en caldo

MRS y se incubaron en estufa para cultivo bacteriológico (40/60-H, Faeta, Argentina) a

37 °C durante 24-48 h. Se verificó la pureza de los cultivos mediante observación de

morfología macroscópica en agar MRS y microscópica mediante coloración de Gram

(ANEXO 2).

Se utilizaron los siguientes microorganismos patógenos indicadores: Escherichia

coli, Staphylococcus aureus y Salmonella sp. aisladas de cultivos bacteriológicos realizados

en el laboratorio para diagnóstico veterinario “Laboratorio 9 de Julio” ubicado en la

Ciudad de 9 de Julio. Los mismos se almacenaron a 4 °C en medios específicos para su

desarrollo: agar Mac Conkey (Britania, Argentina), Chapman (Brizuela, Argentina) y

Salmonella Shigella (Britania, Argentina), respectivamente y luego se incubaron en caldo

Nutritivo (Britania, Argentina) a 37 °C durante 24 h (ANEXO 3).

2. Evaluación del crecimiento de las bacterias ácido lácticas, grado de acidificación y pH

del medio de cultivo

Se estudió el crecimiento de BAL en MRS y en extracto de soja (Nutrilon Soya)

rehidratado según las especificaciones del fabricante. Para ello se tomó 1 mL de cultivo

crecido 24 h en MRS a 37 °C, se centrifugó (Biofuge pico, Heraeus, Alemania) (9500 xg, 10

min) y se lavó el pellet obtenido, dos veces con buffer PBS estéril (ANEXO 3). Luego, se

resuspendieron 0,5 mL del pellet en 5 mL de caldo MRS o extracto de soja estéril y se

incubaron a 37 o 42 °C, en aerobiosis. Se analizaron el número de microorganismos viables

mediante recuento en placas de agar MRS y se midió el pH cada 2 h, durante 24 h. Los

resultados se expresaron como unidades formadoras de colonia por mililitro (UFC/mL) en

función del tiempo de incubación en cada medio. Asimismo, a cada tiempo también se

evaluó la acidez titulable producida en ambos medios.

2.I. Determinación de la acidez titulable

La acidez titulable se determinó como el volumen de solución de NaOH 0,11 M

utilizado para titular 1 mL de cultivo en presencia de fenolftaleína. El resultado de acidez

titulable se expresó como porcentaje de ácido láctico (% AL), según la siguiente fórmula:

31

Dónde: 90 g/mol es el peso molecular del ácido láctico.

3. Actividad antimicrobiana de las bacterias ácido lácticas y sus sobrenadantes de

cultivo

Se evaluó la capacidad inhibitoria del crecimiento de microorganismos patógenos

indicadores, tanto de las cepas Lacticaseibacillus paracasei BGP1 y Lactiplantibacillus

plantarum CIDCA 8327 como de sus sobrenadantes de cultivo en MRS, mediante ensayo

de difusión en agar. Para ello, se colocaron gotas de 10 μL de cultivo BAL crecido 24 h a 37

°C sobre placas de agar MRS y se incubaron a 37 °C durante 24 h. Luego se colocó una

capa de 10 mL de agar nutritivo templado, inoculado previamente con 100 µL de una

solución de cada patógeno indicador en solución fisiológica ajustada a 0,5 de la escala

McFarland (ANEXO 3). Se incubaron las placas nuevamente a 37 °C durante 24 h.

Finalmente, se determinó la presencia/ausencia de halos de inhibición y se midieron sus

diámetros.

Por otro lado, se determinó el efecto antimicrobiano de los sobrenadantes de las

BAL obtenidos por centrifugación (9500 xg, 10 min) de una alícuota del cultivo en MRS

como se muestra en la Figura 5. Luego, se sembraron 30 µL de sobrenadante en pocillos

de 5 mm de diámetro generados sobre placas con 10 mL de agar nutritivo (ANEXO 3),

previamente inoculado con 100 µL de una solución ajustada a 0,5 de la escala McFarland

del microorganismo patógeno indicador. Se incubaron las placas a 37 °C por 24 h, se

determinó la presencia/ausencia de halos de inhibición y se midieron sus diámetros.

Figura 5: Obtención de sobrenadantes por centrifugación de una alícuota de cultivo de las

bacterias ácido lácticas (BAL) en MRS.

32

4. Desarrollo de la bebida fermentada a base de soja

Se utilizó extracto de soja comercial en polvo (Nutrilon Soya) que se reconstituyó

con agua destilada de acuerdo a las instrucciones recomendadas en el envase del

producto y se esterilizó en autoclave (15 min, 1 atm de sobrepresión, 121 °C). El extracto

se soja estéril se almacenó refrigerado, en envases plásticos herméticamente cerrados. En

la fermentación se utilizaron cultivos activos de las cepas de BAL para inocular 50/100 mL

de extracto de soja estéril al 1 % (aproximadamente 106 y 107 UFC/mL). El extracto

inoculado se incubó a 37 °C durante 8 h, se midió el pH, la acidez titulable y se realizaron

recuentos de microorganismos viables, siguiendo las técnicas descriptas previamente.

Posterior a la fermentación, se ajustó el pH a 4 con ácido láctico y se adicionó

inulina de achicoria (GR Beneo-Orafti, Bélgica, GPn≥10 o HP Beneo-Orafti, Bélgica, GPn>23)

al 3 % p/v. Las bebidas obtenidas con o sin inulina, se almacenaron refrigeradas, en

envases plásticos herméticamente cerrados, hasta su uso.

5. Caracterización de la bebida fermentada

5.I. Caracterización fisicoquímica

5.I.a. Determinación del contenido de humedad

Para la determinación de humedad se llenó un cristalizador de vidrio con

aproximadamente 15 g de arena calcinada con una varilla de vidrio pequeña y se secó en

estufa de circulación forzada (CHRFI, Dalvo, Argentina) a 103 ± 2 °C, luego se dejó enfriar

en un desecador y pesó (M0). Seguidamente, se colocó la muestra en el cristalizador con la

arena, se mezcló con la ayuda de la varilla y se pesó (Mi). Se llevó nuevamente a la estufa

hasta verificar peso constante (Mf) (3-5 h).

La humedad se calculó según:

Donde:

M1 = peso de la muestra húmeda (Mi - M0).

M2 = Peso de la muestra seca (Mf- M0).

5.I.b. Determinación del contenido de cenizas

Para la determinación de los elementos minerales, se realizó la destrucción de la

materia orgánica por vía seca basada en el método AOAC 942.05 (2000). El residuo

inorgánico de la bebida de soja es lo que se denominó ceniza y se expresó como

33

porcentaje en peso seco de bebida de soja. Los crisoles utilizados se colocaron en la mufla

(CDM-4007R, Estigia, Argentina) durante 30 min. Luego se colocaron en desecador

durante al menos 1 h y una vez enfriados a temperatura ambiente, se pesó cada crisol (p).

Luego se pesó con exactitud hasta el mg más próximo alrededor de 2 g de producto en

cada crisol (M). Se colocaron las muestras previamente secadas por liofilización, dentro de

crisoles, para luego llevarlos a una placa caliente bajo campana, y se elevó gradualmente

la temperatura hasta que cesó la emisión de humo y las muestras aparecieron totalmente

carbonizadas. Se sometió a la combustión de la materia orgánica hasta obtener un residuo

blanquecino, libre de carbono para lo cual se colocaron los crisoles en la mufla y se

incineró durante 3 h a 550 °C. Se sacaron los crisoles de la mufla y se colocaron en un

desecador durante al menos 1 h, hasta que enfriaron completamente. Se volvió a pesar

cada crisol con sus cenizas hasta el mg más próximo (P). Se calculó por diferencia el peso y

el porcentaje de cenizas.

Donde:

P: Peso del cristalizador más la muestra calcinada.

p: Peso del cristalizador.

M: Peso de la muestra.

5.I.c. Determinación del contenido proteico

Para la determinación del contenido proteico de la bebida de soja el método

utilizado fue Kjeldahl, empleando un digestor y destilador Büchi (AOAC, 1990;

Guiragossian, 1977). La bebida de soja seca se digirió con ácido sulfúrico concentrado

utilizando sulfato de cobre/sulfato de potasio como catalizador, para convertir el

nitrógeno orgánico en iones amonio. Se añadió álcali para liberar el nitrógeno, el que se

destiló en exceso de ácido bórico. El destilado se tituló con ácido clorhídrico para

determinar el amonio absorbido por el ácido bórico (ANEXO 3).

Digestión de la muestra

La muestra de bebida de soja seca se colocó en el tubo del digestor Büchi junto con

10 g de catalizador. Seguidamente, se añadieron 25 mL de ácido sulfúrico concentrado y

se procedió al calentamiento. Se preparó en forma paralela un blanco de reactivos. Una

vez que la solución se aclaró, se prosiguió el calentamiento por 30 min más, con lo que se

aseguró que toda la materia orgánica se encontrara oxidada. Se retiró y se dejó enfriar.

Luego se agregaron cuidadosamente 100 mL de agua.

34

Destilación

Se preparó una solución de ácido bórico al 4 % p/v, a la que se le añadió una

solución indicadora (5 mL por litro de ácido bórico al 4 % p/v). Se colocaron 50 mL de

dicha solución ácida, preparada en un Erlenmeyer de 250 mL y se situó a la salida del

condensador para recoger el amonio destilado. Se añadió a la muestra digerida, hidróxido

de sodio al 30 % para liberar el amonio, hasta que la solución tomó una coloración azul

intensa, como resultado de la formación de un complejo entre iones amonio y cobre,

indicando que la cantidad de NaOH fue suficiente para neutralizar el exceso de ácido

sulfúrico. La destilación se llevó a cabo hasta recoger aproximadamente 100 mL de líquido

en Erlenmeyer colector (3 min). Para determinar el amonio absorbido por el ácido bórico

se tituló el destilado con ácido clorhídrico 0,1 N. Paralelamente se realizó la titulación del

blanco de reactivos (ANEXO 3).

Para la determinación del contenido proteico total, primero se calculó el

porcentaje de nitrógeno (N) y luego el contenido de proteínas con la aplicación del factor

F= 6,25.

Cálculo del porcentaje de nitrógeno:

Donde:

MHCl: Molaridad del ácido clorhídrico empleado en la valoración.

Vm: mL de HCl consumidos en la titulación de la muestra

Vb: mL de HCl consumidos en la titulación del blanco

P: peso de muestra en gramos, expresado en base seca

El porcentaje de proteína bruta se determinó según el cálculo:

% Proteína bruta = % N x 6,25

5.I.d. Determinación del contenido de lípidos

La determinación de grasas totales se realizó por el método de Soxhlet utilizando

n-hexano como solvente en cantidad necesaria, siguiendo la norma IUPAC 1.122 (IUPAC,

1992). Para ello, se pesaron 5 g de leche de soja fermentada seca y se colocaron en

cartuchos de papel. El proceso de extracción se efectuó durante 6 h a ciclos de reflujo

continuos a 80 °C. Cumplido este tiempo, el solvente fue evaporado en rotavapor (R-114,

Büchi, Suiza) a 45 °C y luego, los cartuchos se colocaron en estufa a 105 °C durante 1 h.

35

El contenido de grasas totales fue determinado gravimétricamente y se expresó

como porcentaje en peso sobre base seca, según la ecuación:

Donde:

Pb+g: peso balón con grasa (g)

Pb: tara del balón (g)

Pms: peso de la muestra seca (g)

5.I.e. Determinación del contenido de carbohidratos

El contenido de hidratos de carbono se calculó como la diferencia entre 100 y la

suma del contenido de proteínas, grasas, humedad y cenizas.

5.I.f. Valor energético

El valor energético proporciona una medida de la cantidad de energía que aporta

una porción del alimento. Se calculó a partir de la suma de la energía aportada por los

carbohidratos, proteínas y grasas. Se expresó en kilocalorías (Kcal) o kilojoules (KJ) cada

100 mL de producto. Para determinar la energía que proporcionó cada nutriente, se

consideró que:

◆ 1 g de carbohidratos aporta 4 Kcal/17 KJ.

◆ 1 g de proteínas aporta 4 Kcal/17 KJ

◆ 1 g de grasas aporta 9 Kcal/37 KJ

5.II. Determinación de la actividad antioxidante

La actividad antioxidante de la bebida fermentada se evaluó siguiendo el método

de captación de radicales 2,2-Difenil-1-Picrilhidrazilo (DPPH). El DPPH es un radical libre

estable de color violeta, que al aceptar un átomo de H en presencia de compuestos

antioxidantes, se convierte en una molécula DPPH diamagnética incolora o amarillenta

(Rani y Pradeep, 2015). El análisis se realizó mediante la adición de 100 µl de diluciones

apropiadas de muestra a una solución de DPPH en etanol (100 µM). A continuación, se

midió la absorbancia a 517 nm. La absorbancia de DPPH sin antioxidante (control) se

utilizó como línea de base. La capacidad de las muestras de bebidas para captar los

radicales DPPH se calculó como porcentaje de inhibición en comparación con un blanco

que contiene etanol, después de una incubación de 30 min. El porcentaje de inhibición se

calculó según la siguiente fórmula:

36

Donde:

AM: Absorbancia de la muestra medida a 517 nm.

AB: Absorbancia del blanco medida a 517 nm.

5.III. Determinación de la actividad antimicrobiana

Se evaluó la capacidad inhibitoria del crecimiento de microorganismos patógenos

de la bebida fermentada y sus respectivos sobrenadantes, mediante el ensayo de difusión

en agar, según lo descripto en el ítem 3. Por otro lado, se estudió el crecimiento de los

microorganismos patógenos indicadores inoculados en las bebidas fermentadas con

Lacticaseibacillus paracasei BGP1 o Lactiplantibacillus plantarum CIDCA 8327. Para ello, se

adicionaron a 5 mL de bebida, 200 µL del cultivo del patógeno crecido en caldo nutritivo

(24 h a 37 °C) y se incubó 24 h a 37 °C, realizándose un recuento de microorganismos

viables inicial y luego de 24 h, en placas de agar selectivo para cada uno de los patógenos

estudiados. Se empleó Agar Salmonella-Shigella, Agar Mac Conkey y Agar Chapman para

Salmonella sp., Escherichia coli y Staphylococcus aureus, respectivamente (ANEXO 3). Los

resultados se expresaron en UFC/mL.

6. Resistencia de las bacterias ácido lácticas en bebidas fermentadas sometidas a la

simulación de pasaje a través del tracto gastrointestinal

La resistencia de las BAL en las bebidas fermentadas, frente al pasaje a través del

tracto gastrointestinal se analizó mediante un tratamiento de digestión in vitro. Para ello,

se realizaron dos incubaciones seriadas de las bebidas fermentadas (sin y con agregado de

inulina al 3 % p/v), simulando las condiciones gástricas e intestinales, según Grimound et

al. (2010) (Figura 6).

Para el ensayo se tomaron 2,5 mL de bebida fermentada y se colocaron en 2,5 mL

de solución gástrica (2X), se ajustó el pH a 2,5 y se incubó durante 90 min a 37 °C. Luego se

añadieron 5 mL de solución intestinal (2X), se ajustó el pH a 8 y se incubó, nuevamente,

180 min a 37 °C (ANEXO 3). Se realizaron recuentos de microorganismos viables al inicio y

al final del tratamiento secuencial, en placas de agar MRS (37 °C, 48 h, en aerobiosis). El

porcentaje de sobrevida se calculó según:

37

Donde:

UFCfinal: Recuento hallado luego del tratamiento secuencial.

UFCinicial: Recuento inicial en la bebida de soja fermentada.

Figura 6: Esquema del ensayo de simulación gastrointestinal sobre la bebida de soja fermentada con BAL.

7. Determinación de la viabilidad de las bacterias ácido lácticas en la bebida fermentada

durante el almacenamiento en refrigeración

Para analizar la viabilidad de las cepas Lacticaseibacillus paracasei BGP1 y

Lactiplantibacillus plantarum CIDCA 8327 en las bebidas de soja fermentadas, se

realizaron recuentos bacterianos luego de la fermentación (inicial) y cada 10 días, durante

30 días, para observar el comportamiento de las cepas durante el almacenamiento

refrigerado. La Figura 7, ilustra el procedimiento llevado a cabo para la determinación de

la viabilidad de BAL durante el almacenamiento de la bebida fermentada. Para los

recuentos bacterianos, se realizaron diluciones decimales seriadas de la bebida de soja

fermentada con L. paracasei o L. plantarum adicionada o no con inulina al 3 %,

respectivamente, almacenadas a 4 °C, y se sembraron diluciones apropiadas en placas de

agar MRS que se incubaron a 37 °C por 48 h. Además, se estudió el pH de las bebidas

fermentadas a cada tiempo.

38

Figura 7: Esquema del ensayo de viabilidad de las cepas probióticas durante el almacenamiento del

producto final.

8. Análisis estadísticos

Los ensayos fueron realizados por triplicado. Los resultados fueron analizados

mediante ANOVA y las medias obtenidas fueron comparadas mediante el test de

comparaciones múltiples LSD Fisher, empleando el software InfoStat (Versión 2018e). Los

resultados de diferencias con valores p<0,05 fueron considerados estadísticamente

significativos.

39

Resultados y Discusión

40

Resultados y Discusión 1. Caracterización de bacterias ácido lácticas y crecimiento en bebida de soja

Las bacterias ácido lácticas (BAL) son Gram positivas, no formadoras de esporas, no

móviles y catalasa negativas. Se pueden encontrar en forma de cocos o bacilos de

dimensiones variables. No contienen la enzima citocromo oxidasa por lo que carecen de

actividad respiratoria. Son anaerobios tolerantes y en medios de cultivo sólidos forman

colonias en presencia de oxígeno. La mayoría de las especies de BAL requieren

aminoácidos y vitaminas del grupo B para su crecimiento. Son quimoorganotróficos y en

general, crecen solamente en medios complejos. Pueden emplear hidratos de carbonos

fermentables o alcoholes como fuente de energía para sintetizar ácido láctico

(homofermentativos) y otros productos como acetato, etanol, CO2, formiato o succinato

(heterofermentativos) (Huertas, 2010). La especie L. paracasei está conformada por

bacilos de entre 2,0 y 4,0 μm de largo, a menudo con extremos cuadrados, no móviles y se

disponen individualmente o en cadenas. Su temperatura de crecimiento está

comprendida entre 5 y 45 °C (Collins et al., 1989). Esta especie posee un metabolismo

anaerobio facultativo, heterofermentativo, producen ácido láctico como principal

producto final de la fermentación y no generan gas a partir de la glucosa. En condiciones

de glucosa limitadas, producen ácido acético, etanol y ácido fórmico (Montecinos, 2007).

Por otro lado, la especie L. plantarum está conformada por bacilos con extremos

redondeados y dimensiones comprendidas entre 0,7 y 1,6 μm (Zapata et al., 2009) y se

presentan de forma individual o agrupada en cadenas cortas (Todorov y Franco, 2010). Es

una bacteria anaerobia facultativa, heterofermentativa y tiene la capacidad de absorber y

utilizar diversos azúcares. Fermenta generalmente hexosas a través de la vía metabólica

Embden Meyerhof Parnas y pentosas, resultando en la formación de ácido D- y L-láctico y

acético (Melgar-Lalanne et al., 2012). En la Figura 8 se puede observar la morfología de las

cepas L. plantarum CIDCA 8327 y L. paracasei BGP1, utilizadas en el presente trabajo en

preparados obtenidos a partir de cultivos líquidos, teñidos mediante coloración de Gram.

Las cepas presentaron marcadas diferencias en el modo de agrupación, mientras que no

mostraron diferencias en su morfología, observándose bacilos rectos, en ambos casos.

41

Figura 8: Fotografías tomadas con microscopio óptico (1000X) de los preparados teñidos mediante

coloración de Gram de las cepas Lactiplantibacillus plantarum CIDCA 8327 (A) y Lacticaseibacillus paracasei

BGP1 (B).

El azúcar mayoritario presente en la bebida a base de soja es sacarosa, con un

contenido que varía entre 41-67 % de los azúcares totales, seguido de estaquiosa (12-35

%), fructosa y rafinosa entre 5 y 16 % (Božanić et al., 2011). En particular, el extracto de

soja empleado en este trabajo consiste en un hidrolizado proteico con agregado de jarabe

de glucosa. Además la bebida de soja contiene proteínas de alta calidad, no contiene

colesterol, ni lactosa y solo una pequeña cantidad de ácidos grasos saturados (Wang et al.,

2003). Estas características composicionales, la califican como una matriz base

conveniente desde el punto de vista nutricional, sumado a que constituye un medio

potencialmente adecuado para el desarrollo de BAL, aspecto que permitiría obtener un

alimento funcional fermentado.

En el presente trabajo, en primera instancia, se analizó el crecimiento de las cepas

L. paracasei y L. plantarum, la modificación del pH y la acidez producida durante la

incubación a 37 y 42 °C en bebida de soja, en comparación con MRS, este último medio de

cultivo fue utilizado como control positivo de crecimiento. Los resultados de estos análisis

se muestran en las Figuras 9 y 10.

42

Figura 9: Curvas de crecimiento (UFC/mL vs. t) de Lacticaseibacillus paracasei BGP1 en bebida de soja (A) y

MRS (B) a 37 °C (∆) y 42 °C (□).

Curvas pH vs. t de Lacticaseibacillus paracasei BGP1 en bebida de soja (C) y MRS (D) a 37 °C (∆) y 42 °C (□).

Curvas Acidez titulable expresada como % de ácido láctico (g/L) vs. t de Lacticaseibacillus paracasei BGP1 en

bebida de soja (E) y MRS (F) a 37 °C (∆) y 42 °C (□).

A B

C D

E F

43

Figura 10: Curvas de crecimiento (UFC/mL vs. t) de Lactiplantibacillus plantarum CIDCA 8327 en bebida de

soja (A) y MRS (B) a 37 °C (∆) y 42 °C (□). Curvas pH vs. t de Lactiplantibacillus plantarum CIDCA 8327 en bebida de soja (C) y MRS (D) a 37 °C (∆) y

42 °C (□).

Curvas Acidez titulable expresada como % de ácido láctico (g/L) vs. t de Lactiplantibacillus plantarum CIDCA

8327 en bebida de soja (E) y MRS (F) a 37 °C (∆) y 42 °C (□).

A B

C D

E F

44

En la Figura 9 A y B se puede observar que L. paracasei BGP1 creció

satisfactoriamente en la bebida de soja a las dos temperaturas estudiadas. El conteo

máximo obtenido en bebida de soja a ambas temperaturas, fue menor que en MRS y en

ambos medios, los recuentos máximos a 37 °C fueron mayores que a 42 °C. La bebida de

soja presentó inicialmente un pH de 6,5 y luego de 24 h de fermentación disminuyó hasta

valores menores a 5,5 para ambas temperaturas. Mientras que para el mismo tiempo de

fermentación, en MRS los valores de pH obtenidos fueron menores a 3,5. Esto indica que

la actividad metabólica fermentativa de la bacteria generó productos ácidos. De acuerdo

con estos resultados, se puede observar que las diferencias en el descenso de pH se

corresponden con el aumento de la acidez titulable en la bebida de soja, ya que para el

tiempo final de fermentación (24 h), los valores de acidez obtenidos en la bebida de soja,

fueron menores a los encontrados en MRS.

Por su parte, la cepa L. plantarum fue capaz de crecer en la bebida de soja a ambas

temperaturas, alcanzando recuentos finales cercanos a 109 UFC/mL, similares a los

obtenidos en MRS (Figura 10). Los valores de pH finales obtenidos luego de 24 h de

fermentación de la bebida de soja con L. plantarum fueron cercanos a 3,5, para ambas

temperaturas y no se detectaron diferencias significativas respecto a los obtenidos en

MRS. No obstante, la acidez titulable obtenida luego de la fermentación de la bebida de

soja a 37°C, fue menor que a la obtenida en MRS, mientras que a 42°C no se registró un

incremento en la acidez titulable en ninguno de los medios analizados. Otros autores

hallaron porcentajes de ácido láctico (medido por acidez titulable) entre 0,3 y 0,5 % en

bebida de soja fermentada por 24 h a 37°C con S. thermophilus MD2, L. helveticus, L.

rhamnosus, L. rhamnosus V3, NS6 y NS4 (Hati et al., 2018). Mital y Steinkraus (1974),

hallaron que la cepa L. plantarum B-246 presentó mayor crecimiento y producción de

ácido en leche de soja que en leche de vaca a 30°C por 16-18 h debido a su capacidad para

utilizar sacarosa.

La relación entre el crecimiento de BAL y la producción de ácido láctico en bebida

de soja, se encuentra estrechamente vinculada a la capacidad de utilizar los azúcares

disponibles (Angeles y Marth, 1971; Mital y Steinkraus, 1974; Wang et al., 2002). En el

presente trabajo tanto la curva de descenso de pH de la bebida de soja como sus valores

finales alcanzados por la fermentación con L. plantarum fueron diferentes y menores,

respectivamente, que los obtenidos con L. paracasei, indicando diferencias metabólicas

entre estas cepas. Marazza et al. (2009) reportaron que el pH de leche de soja fermentada

con L. rhamnosus CRL981 disminuyo rápidamente entre las 6 y 12 h de incubación a 37 °C

y los recuentos alcanzaron valores de 8,85 log UFC/mL después de 12 h. Otros autores

demostraron que el cultivo mixto ABT5 (Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium sp., y

Streptococcus thermophilus) produjo un descenso de pH de la bebida de soja fermentada

a 42 °C hasta valores de 4,6 en un tiempo más corto que a 37 °C, estas diferencias pueden

45

deberse a las características de las BAL en el cultivo mixto cuyas temperaturas óptimas de

crecimiento serían superiores a las de las cepas utilizadas en el presente trabajo. En

contraste, Wang et al. (2002) indicaron que las cepas L. acidophilus CCRC 14079 y L.

bulgaricus CCRC 14009 no produjeron una disminución significativa del pH de la bebida de

soja cuando se fermentó 24 h a 37 °C debido a la ausencia de la enzima α-galactosidasa y

la consecuente incapacidad de fermentar los azúcares presentes en la bebida de soja.

La baja capacidad amortiguadora de pH de la bebida de soja, con respecto a otras

matrices, por ejemplo leche, fue indicada por varios autores (Farnworth et al., 2007; Wang

et al., 2009). En el presente trabajo se observó que la bebida de soja fermentada con L.

plantarum a 37 °C, presentó menores valores de pH y mayores porcentajes de acidez

titulable respecto a la bebida fermentada con L. paracasei, indicando una menor

capacidad de adaptación al medio, de esta última cepa (Figura 10). En concordancia

Božanić et al. (2011) informaron que Lactobacillus acidophilus presentó una débil

capacidad de crecimiento en bebida de soja.

A partir de las curvas de crecimiento obtenidas, se calculó la velocidad de

crecimiento de las cepas en los diferentes medios y los resultados se presentan en la Tabla

4.

Tabla 4: Velocidad de crecimiento de Lacticaseibacillus paracasei BGP1 y

Lactiplantibacillus plantarum CIDCA 8327 en MRS y bebida de soja durante la

fermentación a 37 y 42 °C.

CEPA µ MRS(h-1) µ Bebida de soja (h-1)

37°C 42°C 37°C 42°C

Lacticaseibacillus paracasei BGP1

0,45 ± 0,02Aa 0,33 ± 0,03Ba 0,32 ± 0,04Aa 0,18 ± 0,06Aa

Lactiplantibacillus plantarum CIDCA 8327

0,50 ± 0,01Ab 0,23 ± 0,03Ba 0,40 ± 0,01Aa 0,24 ± 0,06Aa

μ indica la velocidad de crecimiento (unidad). Valores promedio ± desviación estándar. Análisis de varianza

seguido de Test de comparación múltiple (LSD-Fisher). Los superíndices con letras mayúsculas indican

diferencias entre temperaturas en el mismo medio (p<0,05). Letras minúsculas indican diferencias entre

medios a igual temperatura (p<0,05).

La velocidad de crecimiento de ambas cepas en la bebida de soja a 37 °C fue mayor

que a 42 °C, sin embargo estas diferencias no fueron estadísticamente significativas. La

cepa L. paracasei no presentó diferencias en la velocidad de crecimiento en bebida de soja

en comparación con MRS a cada temperatura, mientras que la velocidad de crecimiento

46

de L. plantarum en bebida de soja a 37 °C, fue significativamente menor que en MRS

(Tabla 4).

Estos ensayos indicarían que estas cepas podrían emplearse como straters para el

desarrollo de una bebida fermentada a base de hidrolizado proteico de soja, dada la

evidencia de su capacidad de desarrollo en esta matriz empleando 37 °C, como

temperatura de incubación.

2. Actividad antimicrobiana de las bacterias ácido lácticas y sus sobrenadantes

Dentro de los beneficios que aportan los microorganismos probióticos, se

encuentra la capacidad de inhibir el crecimiento de bacterias patógenas a través de

diversos mecanismos, por ejemplo mediante el descenso de pH del medio, la competencia

por nutrientes o sitios de adhesión, la estimulación del sistema inmune y la producción de

sustancias antimicrobianas, como ácido láctico y otros ácidos de cadena corta,

metabolitos como peróxido de hidrógeno, diacetilo y bacteriocinas (Tabasco, 2009). En el

presente trabajo se evaluó la actividad antimicrobiana de las cepas L. paracasei BGP1 y L.

plantarum CIDCA 8327, así como de sus sobrenadantes de cultivo, frente a los siguientes

microorganismos patógenos indicadores Gram negativos: Escherichia coli y Salmonella sp.,

y Gram positivo: Staphylococcus aureus. Las cepas patógenas indicadoras utilizadas fueron

seleccionadas por su importancia en la industria alimentaria, siendo unas de las

principales causantes de Enfermedades Transmitidas por Alimentos (ETAs). Su presencia

en los alimentos podría deberse a su incorrecta manipulación, falta de higiene, malos

hábitos, entre otros motivos.

En el presente trabajo, mediante el método de difusión en agar, se observaron

halos traslúcidos en la zona periférica a las colonias desarrolladas por las bacterias lácticas

sobre placas de cultivo conteniendo a los patógenos. Esto indica que las BAL ejercieron un

efecto inhibitorio del crecimiento de los patógenos estudiados (Figura 11). Este efecto

podría atribuirse a alguno/s de los diversos mecanismos de acción mencionados

previamente.

47

Figura 11: Halos de inhibición del crecimiento de los patógenos: A) Staphylococcus aureus. B) Escherichia

coli. C) Salmonella sp., ejercido por las bacterias probióticas, obtenidos mediante el ensayo de difusión en

agar.

En la Tabla 5 se muestran las medidas de los diámetros de los halos de inhibición

(mm) producidos por las cepas L. paracasei y L. plantarum frente a los microorganismos

patógenos indicadores.

Tabla 5: Halos de inhibición (mm) producidos por las cepas probióticas crecidas en

caldo MRS frente a los microorganismos patógenos indicadores.

CEPAS

Halos de inhibición (mm)

Salmonella

sp.

Escherichia

coli

Staphylococcus

aureus

Lactiplantibacillus plantarum CIDCA

8327 34,2 ± 5,2A 30,6 ± 1,7A 28,1 ± 3,9A

Lacticaseibacillus paracasei BGP1 29,9 ± 1,8A 34,3 ± 5,5A 29,7 ± 3,6A

Valores promedio ± desviación estándar. Análisis de varianza seguido de Test de comparación múltiple (LSD-

Fisher). Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p>0,05).

Los resultados obtenidos indicaron que no existieron diferencias significativas

entre el efecto inhibitorio de las cepas de L. paracasei y L. plantarum frente a los tres

patógenos indicadores (p>0,05). La actividad antimicrobiana de las BAL podría deberse a

la presencia de compuestos liberados durante el proceso de fermentación, los cuales

permanecerían en los medios de cultivo, aún si los microorganismos pierden viabilidad o

bien son separados por métodos físicos. En la Tabla 6 se presentan las medidas de los

halos de inhibición producidos por los sobrenadantes obtenidos por centrifugación, de los

cultivos de las BAL en caldos MRS, frente a los patógenos indicadores. La presencia de

halos traslúcidos generados por los mismos, en el ensayo de difusión en agar evidencia un

48

efecto inhibitorio por parte de los sobrenadantes, frente al crecimiento de los patógenos

estudiados.

Tabla 6: Halos de inhibición (mm) producidos por los sobrenadantes de las

bacterias lácticas crecidas en caldo MRS frente a los microorganismos patógenos

indicadores.

SOBRENADANTES

Halos de inhibición (mm)

Salmonella

sp.

Escherichia

coli

Staphylococcus

aureus

Lactiplantibacillus plantarum CIDCA

8327 11,0 ± 1,3A 12,2 ± 0,9A 9,7 ± 0,6A

Lacticaseibacillus paracasei BGP1 12,5 ± 0,5A 12,7 ± 0,6A 8,8 ± 0,4A

Ácido Láctico 1% 7,0 ± 0,0A 9,0 ± 0,0A 8,0 ± 0,0A

Análisis de varianza seguido de Test de comparación múltiple (LSD-Fisher) entre promedios de diámetros

(mm) para cada microorganismo indicador. Medias con una letra común no son significativamente

diferentes (p>0,05).

Figura 12: Halos de inhibición del crecimiento de los patógenos: A) Staphylococcus aureus. B) Escherichia

coli. C) Salmonella sp., ejercido por los sobrenadantes de las bacterias probióticas o por el ácido láctico,

obtenidos mediante el ensayo de difusión en agar.

PARA: Lacticaseibacillus paracasei BGP1. PLANT: Lactiplantibacillus plantarum CIDCA 8327. C ácido láct:

Solución acuosa de ácido láctico 1 % p/v.

Uno de los principales metabolitos producidos por las bacterias lácticas durante su

crecimiento en MRS es el ácido láctico, alcanzando valores de 1 a 3%. Una solución de

ácido láctico al 1 % se analizó como control positivo de inhibición. Los mayores diámetros

de halos de inhibición generados por los sobrenadantes de las BAL con respecto a los

49

obtenidos con la solución de ácido láctico (Tabla 6), demuestran que la inhibición no solo

fue provocada por la acción del ácido láctico, sino que también serían responsables otros

metabolitos bacterianos presentes en el medio. De acuerdo a los resultados obtenidos, el

efecto inhibitorio de los sobrenadantes de las bacterias lácticas frente a Escherichia coli y

Salmonella sp., demostró que existe una sumatoria de efectos: por un lado, la producción

de ácido láctico y por otro lado la contribución de otros productos metabólicos con

actividad antimicrobiana en el medio, sin embargo, estas diferencias no fueron

estadísticamente significativas. En contraste, los halos de inhibición de Staphylococcus

aureus, producidos por los sobrenadantes de las BAL no presentaron diferencias

significativas con el producido por el control de ácido láctico, indicando la ausencia de

otros metabolitos con capacidad inhibitoria de este patógeno. En concordancia con los

resultados obtenidos, Zamudio y Zavaleta (2003) hallaron que los sobrenadantes de varias

cepas de Lactobacillus presentaban actividad antimicrobiana frente a E. coli y Listeria

monocitogenes, destacándose entre las especies con mayor capacidad inhibitoria a L.

plantarum CECT 748. Bao et al. (2011) reportaron que los sobrenadantes de cepas de L.

plantarum (IMAU70004, IMAU70042, IMAU40126, IMAU10156, IMAU70089, IMAU60171,

IMAU40005, IMAU10120 e IMAU60042) crecidas en MRS, ejercieron un efecto inhibitorio

del crecimiento de varias cepas patógenas acidófilas Gram positivas y Gram negativas,

atribuyendo esta capacidad a la producción de bacteriocinas. Sharma et al. (2017)

evaluaron la actividad antimicrobiana del sobrenadante de la cepa L. paracasei CD4

incubada toda la noche en caldo MRS frente a aislados clínicos de E. coli y Shigella sp.

mediante el método de difusión en agar. Los resultados mostraron efectos antibacterianos

altamente significativos contra estos patógenos y concluyeron que pudo deberse a ácidos

orgánicos y metabolitos secundarios sintetizados durante la fermentación.

3. Bebida de soja fermentada

3.I. Características generales de la bebida fermentada

A partir del análisis del crecimiento de las cepas de BAL en bebida de soja a ambas

temperaturas se seleccionaron las condiciones para la obtención de bebidas fermentadas

que se adecúen a las normativas vigentes establecidas en el Código Alimentario Argentino

para el desarrollo de un “alimento con probióticos” (CAA, Cap. XVII Art. 1389).

Para las dos BAL utilizadas en el presente trabajo se realizaron estudios

preliminares de curvas de crecimiento a 37 °C con distintos inóculos iniciales (1x105 y

1x107 UFC/mL, respectivamente), con el objetivo de analizar los tiempos de fermentación

para la obtención del producto final. Las cepas empleadas como starters fueron

previamente incubadas en caldo MRS por 24 h a 37 °C y sometidas a 2 lavados

consecutivos con PBS. Los resultados obtenidos a partir del análisis de las curvas de

50

crecimiento con diferentes inóculos iniciales, indicaron que partiendo de un inóculo inicial

de 1x107 UFC/mL, luego de 8 a 10 h de fermentación a 37 °C se alcanzó un recuento

cercano a 1x108 UFC/mL, y la velocidad de crecimiento a esta temperatura fue mayor que

a 42 °C. En base a estos resultados, se definieron las siguientes condiciones de obtención

de la bebida fermentada a base de soja: 8 h de fermentación a 37 °C, en aerobiosis, con

inóculo inicial 1x107 UFC/mL de L. plantarum CIDCA 8327 o L. paracasei BGP1 y ajuste final

de pH a 4,0 con ácido láctico (Tabla 7).

Además, el porcentaje de inulina adicionada al producto luego de la fermentación

(3% p/v) fue establecido de acuerdo al informado en por otros autores para matrices a

base de soja (Bedani et al., 2013).

Tabla 7: Condiciones estandarizadas para la elaboración de la bebida de soja

fermentada.

VARIABLES Condición

Cepas Lactiplantibacillus plantarum CIDCA 8327 o

Lacticaseibacillus paracasei BGP1

Inóculo (UFC/mL) 1x107

Tiempo (h) 8

Temperatura (°C) 37

pH 4,0

Inulina (%) 0 o 3

El producto fermentado en estas condiciones con L. plantarum presentó un valor

de pH 4, mientras que la bebida fermentada con L. paracasei presentó valores superiores

a 4,5. Rekha y Vijayalakshmi (2008) y Do Santos et al. (2019), expusieron que tanto la

estabilidad como las características organolépticas de la leche de soja fermentada

dependen del pH. Los compuestos volátiles de la leche de soja le aportan un flavor

particular indeseable, que puede ser enmascarado por los productos de fermentación de

las bacterias lácticas, especialmente compuestos como ácido láctico, acetaldehído y

diacetilo. Además, cuando el pH del producto es cercano al punto isoeléctrico (pI) de las

proteínas de soja (4-5,5) se observa la formación de coágulos que afectan negativamente

51

la apariencia del producto, mientras que a pH mayores o menores al pI, no se produce la

formación de coágulos perceptibles (Serrano y Mariela, 2015; Noguera et al., 2018). Las

bebidas fermentadas a base de soja obtenidas con ambas cepas presentaron un aspecto

líquido, blanco, homogéneo sin coágulos, ni separación de fases, con olor aceptable y

mejorado respecto al del producto no fermentado y con apariencia semejante a la de la

leche de vaca (Figuras 13 y 14). Cabe destacar que el agregado de inulina (tanto de bajo

como de alto grado de polimerización) luego de la fermentación, mantuvo la apariencia

uniforme, el olor agradable de la bebida fermentada con ambas cepas, sin producir

modificaciones perceptibles de la viscosidad. En este sentido, otros autores realizaron una

evaluación sensorial de leche de soja fermentada con cepas de L. plantarum IMAU10156 y

IMAU10120 y concluyeron que el aroma y sabor del producto fue estable en el tiempo y

que la fermentación aumentó su aceptabilidad (Bao et al., 2012). Božanić et al. (2011)

describieron que la leche de soja fermentada con cultivos mixtos de Lactobacillus,

Bifidobacterium y Streptococcus presentó brillo de porcelana y color claro, con menor olor

y sabor a porotos. En contraste a los resultados obtenidos en el presente trabajo, Marazza

et al. (2009) expusieron que la reducción del pH durante la fermentación de la leche de

soja a 37 °C durante 24 h con L. rhamnosus CRL981 produjo la coagulación y en

consecuencia un cambio de apariencia del producto fermentado. Esto indica que las

características de las bebidas fermentadas a base de soja dependerán tanto de las

condiciones de fermentación como de las características metabólicas de las cepas

empleadas como starter.

Figura 13: Apariencia de las bebidas de soja sin fermentar (A) y fermentadas durante

8 h por BAL (B). L.pa: Lacticaseibacillus paracasei BGP1; L.27: Lactiplantibacillus

plantarum CIDCA 8327.

52

Figura 14: Apariencia de las bebidas de soja sin fermentar y fermentadas durante 8 h

por BAL. L.pa: Lacticaseibacillus paracasei BGP1; L.27: Lactiplantibacillus plantarum

CIDCA 8327

En las Figuras 13 A y B se puede observar la apariencia de las bebidas de soja sin

fermentar (t=0), y fermentadas por 8 h a 37 °C con las cepas de L. plantarum y L.

paracasei. La apariencia no se ve afectada por la fermentación y no se evidenciaron

cambios de color, consistencia, ni separación de fases (Figura 14).

3.II. Análisis composicional y valor energético

Los resultados de la composición centesimal de la bebida a base de soja

fermentada y sin fermentar y sus respectivos valores energéticos se presentan en la Tabla

8. A partir del análisis composicional de las bebidas, fue posible detectar que la

fermentación produjo una disminución significativa del porcentaje de carbohidratos y

grasas totales. Se detectó además, un aumento del porcentaje de proteínas y no se

encontraron diferencias significativas en los porcentajes de cenizas entre la bebida

fermentada y sin fermentar. Por otro lado, se observó una disminución en el valor

energético como producto de la fermentación.

53

Tabla 8: Composición química y valor energético de la bebida de soja fermentada

con Lacticaseibacillus paracasei BGP1 y sin fermentar.

Bebida sin

fermentar

Bebida

fermentada

Valor energético (Kcal / KJ /100 mL) 72 / 301 57 / 236

Humedad (g/100 mL) 86,5A 87,90 ± 0,14B

Hidratos de carbono (g/100 mL) 7,7A 6,90 ± 0,03B

Proteínas (g/100 mL) 1,7A 2,10 ± 0,01B

Lípidos totales (g/100 mL) 3,8A 2,90 ± 0,02B

Cenizas (g/100 mL) 0,248A 0,243 ± 0,01A

Los resultados se presentan como porcentaje en base húmeda. Valores correspondientes a bebida sin

fermentar, son los registrados en el envase del producto por el fabricante (Nutricia-BAGO, 2019).

Análisis de varianza seguido de Test de comparación múltiple (LSD-Fisher). Medias con una letra común no

son significativamente diferentes (p > 0,05).

Según el porcentaje de ingesta diaria recomendada (IDR) por el ente regulador

nacional (CAA, Res. Conj. 149/2005 y 15/2005) con base a una dieta de 2000 Kcal / 8400

KJ, 100 mL de la bebida fermentada aportarían un 3 % del valor energético, 2 % del valor

de carbohidratos, 3 % del valor de proteínas y 5 % del valor de grasas totales. Según el

Código Alimentario Argentino – Capítulo V – NORMAS PARA LA ROTULACIÓN Y

PUBLICIDAD DE LOS ALIMENTOS – Artículo 235 quinto - (Resolución Conjunta SPReI N°

161/2013 y SAGyP N°213/2013) – la bebida fermentada desarrollada en el presente

trabajo podría declararse “bajo o reducida en grasas” ya que contiene menos de 3 g de

grasas cada 100 mL del producto listo para consumir.

3.III. Actividad antioxidante de la bebida de soja fermentada

En la Tabla 9 se pueden observar los resultados de la actividad antioxidante

obtenida para la bebida de soja sin fermentar y fermentada con las dos cepas de BAL

estudiadas.

54

Tabla 9: Medida de la capacidad de inhibición de radicales libres de DPPH de la

bebida de soja sin fermentar y fermentada con L. plantarum CIDCA 8327 y L. paracasei

BGP1.

BEBIDA DE SOJA Inhibición DPPH (%)

Lacticaseibacillus paracasei BGP1 24,35 ± 1,8A

Lactiplantibacillus plantarum CIDCA 8327 25,33 ± 1,8AB

Sin fermentar 27,34 ± 1,0B

Análisis de varianza seguido de Test de comparación múltiple (LSD-Fisher). Medias con una letra

común no son significativamente diferentes (p > 0,05).

La bebida de soja sin fermentar presentó una actividad antioxidante que se

mantuvo luego de la fermentación durante 8 h a 37 °C con L. plantarum CIDCA 8327,

mientras que con L. paracasei BGP1 disminuyó significativamente. Sin embargo, la

actividad antioxidante de las bebidas fermentadas no presentó diferencias significativas

entre sí. Otros autores encontraron que el porcentaje de inhibición de radicales libres

DPPH de la leche de soja disminuyó luego de 40 h de fermentación a temperatura

ambiente con cultivos de kéfir, sin embargo, la actividad antioxidante aumentó luego de

48 h (McCue y Shetty, 2005). Zhao y Shah (2014), hallaron que el pH de las leches

fermentada con L. acidophilus CSCC2400, L. paracasei CSCC 279, L. zeae ASCC15820 y L.

rhamnosus WQ2 incide sobre la actividad antioxidante del producto final. En particular, las

leches fermentadas que presentaron un pH de 3,85 exhibieron una capacidad

antioxidante más alta que las muestras con pH superiores a 4,15. Rani y Pradeep (2015)

hallaron que la capacidad de captación de radicales libres de la leche de soja aumentó

cuando fue fermentada con L. paracasei KUMBB005 (a 37 °C durante 48 h) con respecto a

la leche sin fermentar. Rekha y Vijayalakshmi (2008) hallaron aumentos significativos en la

actividad antioxidante de leche de soja fermentada con una combinación de bacterias y

levaduras, en comparación con la leche de soja sin fermentar. Las diferencias observadas

al contrastar los resultados obtenidos en el presente trabajo con los de otros autores,

podrían atribuirse a numerosos factores entre ellos las condiciones de fermentación

(cepa, tiempo, temperatura, etc.) y las características de la matriz.

3.IV. Actividad antimicrobiana de la bebida de soja fermentada

La actividad antimicrobiana de las bebidas de soja fermentadas o acidificada

artificialmente y sus respectivos sobrenadantes, fue evaluada mediante la técnica de

difusión en agar (Figuras 15 y 16). Los resultados obtenidos no permitieron evidenciar la

posible inhibición del crecimiento de los patógenos de estos productos, ya que se

55

observaron halos turbios alrededor de los pocillos donde se colocaron las muestras de las

bebidas o sus respectivos sobrenadantes. Por lo tanto, esta técnica no resultaría útil para

determinar la actividad antimicrobiana de estas muestras, ya que no fue posible definir si

la turbidez observada alrededor de los pocillos de siembra fue debida a una mayor

densidad de microorganismos patógenos o bien a componentes de la bebida (o sus

sobrenadantes) difundidos parcialmente a través del agar.

Figura 15: Determinación de actividad antimicrobiana de la bebida de soja mediante ensayo de difusión en

agar. A) Escherichia coli B) Salmonella sp. C) Staphylococcus aureus. PARA: Lacticaseibacillus paracasei BGP1.

PLANT: Lactiplantibacillus plantarum CIDCA 8327. C s/f: Control de bebida de soja sin fermentar. C ácido

láctico: Bebida de soja pH 4.

Figura 16: Determinación de actividad antimicrobiana del sobrenadante de la bebida de soja mediante

ensayo de difusión en agar. A) Escherichia coli B) Salmonella sp. C) Staphylococcus aureus. PARA:

Lacticaseibacillus paracasei BGP1. PLANT: Lactiplantibacillus plantarum CIDCA 8327. C s/f: Control de bebida

de soja sin fermentar. C ácido láctico: Bebida de soja pH 4.

Frente a estos resultados, se aplicó una técnica alternativa para dilucidar la

actividad antimicrobiana de las bebidas fermentadas, en la cual se analizó el crecimiento

de los patógenos inoculados en ellas. En la Figura 17 se muestran los recuentos iniciales y

finales obtenidos para cada patógeno indicador, en las bebidas estudiadas. Se observó

que la bebida de soja fermentada con L. plantarum tuvo un efecto inhibitorio significativo

56

en el crecimiento de las tres cepas patógenas luego de la incubación. En cambio, la bebida

fermentada con L. paracasei presentó actividad antimicrobiana frente a E. coli y

Salmonella sp. y no se observó dicho efecto para la cepa de Staphylococcus aureus, dado

que los recuentos finales obtenidos para este patógeno no presentaron diferencias

significativas respecto a los iniciales.

Figura 17: Recuento (Log UFC/mL) inicial (t=0 h) y final (t=24 h) en bebida de soja: fermentada (B.S.F.) con

Lacticaseibacillus paracasei BGP1 o Lactiplantibacillus plantarum CIDCA 8327, sin fermentar acidificada (B.S.

pH 4) y control sin fermentar (B.S. S/F) de A) Escherichia coli B) Salmonella sp. C) Staphylococcus aureus.

Las barras con una letra común no son significativamente diferentes (p>0,05)-

ANOVA seguido de Test de comparación múltiple (LSD-Fisher).

En la Figura 17 A se observa que la bebida de soja fermentada con las BAL ejerció

un efecto bactericida sobre E. coli. Los recuentos finales de E. coli en leche fermentada

con L. paracasei resultaron significativamente inferiores a los iniciales, mientras que no se

detectó presencia de E. coli luego de la incubación en la bebida fermentada con L.

plantarum. En contraste, tanto en la bebida de soja acidificada con ácido láctico (pH 4),

como en el control sin fermentar, los recuentos de E. coli luego de 24 h fueron mayores a

los iniciales y no presentaron diferencias significativas entre sí. Esto demuestra que el

medio es propicio para el crecimiento de dicha cepa patógena y que también puede

crecer en el medio acidificado. Por lo cual, el efecto bactericida observado sobre este

patógeno, se podría atribuir a la producción de otros metabolitos o metabolitos

secundarios derivados de la fermentación de la bebida de soja.

En la Figura 17 B se observa que en la bebida de soja fermentada con L. paracasei

el recuento de Salmonella luego de 24 h de incubación disminuyó hasta niveles del orden

de 104 UFC/mL, del mismo modo, en la bebida fermentada con L. plantarum el recuento

de Salmonella disminuyó hasta niveles no detectables. Los recuentos finales de Salmonella

en la bebida de soja acidificada con ácido láctico, luego de la incubación, demuestran un

efecto bacteriostático de este producto. Por otro lado, existen diferencias significativas

entre la capacidad inhibitoria de la bebida fermentada por las BAL, entre sí y respecto a la

bebida acidificada con ácido láctico, lo que demuestra que el efecto bactericida sobre este

57

patógeno no se debe sólo a la producción de ácido láctico, sino a la liberación de otros

productos durante la fermentación. Los recuentos finales hallados en la bebida control sin

fermentar fueron superiores a los iniciales, demostrando que este producto constituye un

medio de cultivo propicio para el desarrollo de Salmonella.

En la Figura 17 C se muestra un efecto bacteriostático frente a Staphylococcus

aureus ejercido por la bebida de soja fermentada con L. paracasei. Mientras que, la bebida

fermentada con L. plantarum presentó un efecto bactericida, dado que se observó una

disminución en el conteo hasta aproximadamente 102 UFC/mL. Los recuentos finales de

Staphylococcus aureus obtenidos luego de la incubación en la bebida acidificada con ácido

láctico, demuestran que la acidificación del medio ejerce un efecto bacteriostático. Este

hecho indicaría que la fermentación de la bebida con L. plantarum también genera otros

metabolitos que podrían contribuir al efecto bactericida. Por último, se observó que la

cepa de Staphylococcus aureus pudo desarrollarse en la bebida de soja control sin

fermentar, indicando la posible presencia de componentes que promueven el crecimiento

de este patógeno, así como la ausencia de componentes que inhiben su desarrollo.

Do Santos et al. (2019) hallaron una disminución en la densidad celular de S.

aureus y E. coli en presencia de leche de soja fermentada con gránulos de kéfir,

mostrando una inhibición parcial de estas cepas patógenas. En tanto, Hati et al. (2018)

hallaron que la leche de soja fermentada con L. helveticus V3 durante 24 h a 37 °C, mostró

inhibición contra microorganismo indicadores (S. aureus, P. aeruginosa y S. typhi).

Rodríguez et al. (2019) evaluaron la actividad antimicrobiana de una bebida de suero con

agregado de jugo y pulpa de origen vegetal fermentada a 40 °C con un cultivo mixto de

probióticos (L. delbrueckii subsp. bulgaricus, S. thermophilus, L. acidophilus y Bifidobacterium

spp.), contra E. coli, Salmonella enteritidis, S. aureus y Listeria sp. Los efectos

antimicrobianos de la bebida se evaluaron a partir de la técnica de difusión en agar y los

resultados arrojaron que presentó actividad antimicrobiana contra E. coli, Salmonella

enteritidis y Listeria sp., mientras que para el caso de S. aureus no se observó inhibición.

Con respecto a los resultados obtenidos en el presente trabajo, las bebidas

fermentadas con L. plantarum y L. paracasei presentaron actividad antimicrobiana frente

a las cepas patógenas indicadores considerando que el control sin fermentar resultó un

medio propicio para su crecimiento. Además, el efecto bactericida presentado por la

bebida fermentada con L. plantarum frente a las tres cepas patógenas y la bebida

fermentada por L. paracasei frente a las patógenas Gram negativas se puede atribuir a

metabolitos producidos por las cepas durante la fermentación con posible actividad

antimicrobiana.

58

4. Resistencia de las bacterias ácido lácticas a las condiciones gastrointestinales

simuladas

Los porcentajes de sobrevida de las cepas en la bebida fermentada sometida a las

condiciones gastrointestinales simuladas y el efecto de la adición de inulina se muestran

en la Tabla 10.

Tabla 10: Sobrevida luego del tratamiento gastrointestinal simulado, de las cepas

Lacticaseibacillus paracasei BGP1 y Lactiplantibacillus plantarum CIDCA 8327 en la bebida

de soja fermentada con adición de inulina (3 % p/v).

BEBIDA DE SOJA FERMENTADA Sobrevida (%)

Lacticaseibacillus paracasei BGP1

Sin inulina 50,7±1,9A

Inulina GR 45,2±2,6A

Inulina HP 68,8±13,1B

Lactiplantibacillus plantarum CIDCA 8327

Sin inulina 86,3±4,5A

Inulina GR 93,4±6,8A

Inulina HP 94,3±3,0A

Valores promedio ± desviación estándar. Análisis de varianza seguido de Test de comparación múltiple (LSD-

Fisher). Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p>0,05). Letras mayúsculas

indican diferencia entre los valores de sobrevida de cada cepa.

Cuando se encuentran presentes en la bebida de soja fermentada, ambas BAL

sobrevivieron a las condiciones gastrointestinales simuladas, no obstante L. plantarum

presentó mayor porcentaje de supervivencia (86,3 ± 4,5%) que L. paracasei (50,7 ± 1,9%)

lo que demuestra diferentes grados de resistencia a las condiciones de ensayo y de

adaptación a la matriz empleada. En este sentido, Grimoud et al. (2010) halló que la cepa

L. plantarum R1012 incubada en caldo MRS a 37 °C en anaerobiosis resistió a las

condiciones gastrointestinales simuladas con un porcentaje de supervivencia de alrededor

del 90 % al final del tratamiento. La adición de inulina de diferentes GPn, no presentó un

efecto significativo en la sobrevida de L. plantarum en la bebida de soja fermentada. En

contraste, la adición de inulina de alto GPn a la bebida fermentada con L. paracasei

aumentó significativamente la sobrevida de esta cepa frente a las condiciones

gastrointestinales. En concordancia con este resultado, Bedani et al. (2013) demostraron

59

que la incorporación de inulina GR al 3 % a un producto de soja fermentado con B.

animalis subsp. Lactis Bb-12 y L. acidophilus La-5, no logró mejorar la viabilidad de las

cepas luego del tratamiento gastrointestinal simulado atribuyendo la falta de protección

por parte de la inulina a su bajo GPn (≥ 10).

De los requisitos exigidos para poder nombrar probiótica a una cepa bacteriana, la

supervivencia al paso a través de sistema gastrointestinal es uno de los más importantes,

debido a que las cepas deben llegar viables al colon en una concentración determinada

para que le permita ejercer su función beneficiosa. Diversos estudios indican que el

agregado de inulina a los productos puede ejercer una función de protección a las cepas

probióticas (Grimoud et al., 2010; Bedani et al., 2013; Adebola et al., 2014). Los resultados

del presente trabajo demuestran que sólo la cepa de L. plantarum en la bebida de soja

fermentada, con y sin agregado de inulina, llegaría viable en una concentración adecuada

para poder ejercer sus beneficios en el colon según el Código Alimentario Argentino. En

cambio, la cepa de L. paracasei presentó un porcentaje de sobrevida bajo y solo con el

agregado de inulina de alto grado de polimerización se logró un aumento significativo de

su sobrevida.

5. Almacenamiento de las bebidas de soja fermentadas

Con el objetivo de evaluar la viabilidad de las BAL durante el almacenamiento

refrigerado de la bebida de soja fermentada, se realizaron recuentos a los 0, 10, 20 y 30

días, respectivamente. En la Figura 18 se puede observar la viabilidad y el efecto del

agregado de inulina a la bebida de soja fermentada con L. paracasei BGP1 durante el

almacenamiento a 4 °C.

60

Figura 18: Recuentos (UFC/mL) de Lacticaseibacillus paracasei BGP1 en la bebida

fermentada durante el almacenamiento a 4 °C.

Las barras con una letra común no son significativamente diferentes (p>0,05)- ANOVA seguido de Test de

comparación múltiple (LSD-Fisher). En minúscula se presenta el análisis entre los tiempos de

almacenamiento en cada muestra. En mayúscula se presenta el análisis comparativo de los recuentos entre

las muestras, a 30 días.

B.S: Bebida de soja; I. GR: Inulina GR; I. HP: Inulina HP

La adición de inulina a la bebida de soja fermentada contribuyó a conservar la

viabilidad de L. paracasei durante los 30 días de almacenamiento refrigerado del

producto. Los recuentos de L. paracasei obtenidos luego de 30 días de almacenamiento de

la bebida de soja fermentada adicionada de inulina no presentaron diferencias

significativas respecto a los recuentos iniciales. En cambio, la viabilidad de esta cepa

disminuyó significativamente en el producto sin inulina (control), presentando recuentos

significativamente menores a los iniciales y también menores con respecto a los hallados

en la bebida de soja con las distintas inulinas, luego de 30 días. Estos resultados se

condicen con las variaciones de pH de la bebida de soja fermentada detectados durante el

almacenamiento (Tabla 11).

61

Tabla 11: Variación del pH durante el almacenamiento a 4 °C durante 30 días de la

bebida de soja fermentada con Lacticaseibacillus paracasei BGP1

BEBIDA DE SOJA FERMENTADA

Tiempo (días)

0 10 20 30

Sin inulina 4,06±0,0A 4,08 4,09 4,02±0,1A

Inulina GR 4,04±0,1A 3,74 3,60 3,74±0,2A

Inulina HP 4,08±0,0A 3,72 3,59 3,79±0,3A

Valores promedio ± desviación estándar. Análisis de varianza seguido de Test de comparación múltiple (LSD-

Fisher). Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p>0,05).

En la bebida de soja fermentada con L. paracasei adicionada con los dos tipos de

inulina, el pH disminuyó por debajo de 4 durante el almacenamiento, evidenciando la

acidificación del producto debido a la actividad metabólica de la cepa durante el

almacenamiento, sin embargo no se encontraron diferencias significativas entre el pH

inicial y el registrado a los 30 días. El pH de la bebida de soja fermentada sin inulina

(control) tampoco presentó diferencias significativas entre el valor inicial y final,

observando que se mantuvo prácticamente constante durante los 30 días de

almacenamiento a 4 °C.

En la Figura 19 se puede observar la viabilidad de L. plantarum en la bebida de soja

fermentada sin inulina (control), y en el producto adicionado con inulina durante el

almacenamiento bajo refrigeración.

62

Figura 19: Recuentos (UFC/mL) del Lactiplantibacillus plantarum CIDCA 8327 en

la bebida fermentada durante el almacenamiento a 4 °C.

Las barras con una letra común no son significativamente diferentes (p>0,05)- ANOVA seguido de Test de

comparación múltiple (LSD-Fisher). En minúscula se presenta el análisis entre los tiempos de

almacenamiento en cada muestra. En mayúscula se presenta el análisis comparativo de los recuentos entre

las muestras, a 30 días.

B.S: Bebida de soja; I. GR: Inulina GR; I. HP: Inulina HP.

Los recuentos de L. plantarum en los las bebidas de soja fermentadas adicionadas

con inulina, luego de 30 días, fueron significativamente superiores a los hallados en el

producto sin inulina (control), al igual que lo observado para la cepa L. paracasei. Esto

demuestra que el agregado de inulina ejerce un efecto positivo en la viabilidad de estas

cepas durante el almacenamiento de las bebidas fermentadas. En contraste, Bedani et al.

(2013) demostraron que la adición de inulina no tuvo efecto sobre la viabilidad de L.

acidophilus La-5 y B. animalis Bb-12 en un producto fermentado de soja almacenado a 4

°C. Por otro lado, los recuentos de L. plantarum, en la bebida fermentada sin inulina y

almacenada, resultaron mayores que los registrados para la cepa L. paracasei, pudiendo

evidenciar que la capacidad de adaptación a esta matriz es cepa dependiente.

La bebida de soja fermentada con L. plantarum (con y sin inulina), presentó valores

de pH prácticamente contantes durante los primeros 20 días de almacenamiento y luego

de 30 días disminuyeron hasta valores de 3,3 (Tabla 12). En todos los casos se encontraron

diferencias significativas entre el pH inicial y final, pudiendo observar que la cepa siguió

acidificando la bebida de soja con y sin el agregado de inulina, durante el

almacenamiento.

63

Tabla 12: Variación del pH durante el almacenamiento a 4 °C durante 30 días de la

bebida de soja fermentada con Lactiplantibacillus plantarum CIDCA 8327.

BEBIDA DE SOJA FERMENTADA

Tiempo (días)

0 10 20 30

Sin inulina 4,02±0,1A 3,98 3,86 3,44±0,3B

Inulina GR 4,00±0,1A 3,91 3,75 3,25±0,3B

Inulina HP 4,02±0,1A 3,94 3,80 3,31±0,3B

Valores promedio ± desviación estándar. Análisis de varianza seguido de Test de comparación múltiple (LSD-

Fisher). Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0,05).

Dos Santos et al. (2019) demostraron que la viabilidad de los lactobacilos

presentes en leche de soja fermentada con gránulos de kéfir almacenada a 7 °C, aumentó

significativamente con el agregado de 3,5 % inulina (ORAFTI Beneo S/A, Mannheim,

Germany) luego de la fermentación. Además, los autores informaron que tanto el pH de la

bebida fermentada y adicionada de inulina como el control sin inulina, disminuyó

significativamente a los 14 días de almacenamiento. Bao et al. (2011) demostraron que

cepas de L. plantarum (IMAU10120, IMAU10156, IMAU40126, IMAU70004, IMAU60042 e

IMAU60171) conservaron la viabilidad en leche de soja fermentada y además, acidificaron

este producto hasta valores cercanos a 3,5 durante 28 días de almacenamiento a

temperatura de refrigeración. Aking et al. (2007) demostraron que la adición de inulina

aumentó la viabilidad de Lactobacillus acidophilus y Bifidibacterium lactis en un helado

adicionado con leche fermentada con dichas BAL y almacenado por 90 días a -18 °C. En

este sentido es importante tener en cuenta la viabilidad de las cepas en cada matriz a las

que se incorporan, y considerar que podría depender de la especie y cepa utilizada, el pH y

la concentración ácidos orgánicos en el producto final (Bernal Castro et al., 2017). Božanić

et al. (2011), analizaron la viabilidad de un cultivo mixto ABT5 en leche de soja por 28 días

a 4 °C, y hallaron que el pH de la bebida fermentada a dos temperaturas distintas (37 y 42

°C) se mantuvo constante durante todo el período de almacenamiento. Además, los

autores hallaron que de las cepas presentes en el cultivo mixto, los lactobacilos fueron los

que presentaron menos viabilidad, obteniendo recuentos finales más bajos que

bifidobacterias y estreptococos. Según Donkor et al. (2007) el agregado de inulina para la

obtención de un yogurt con probiótico, da lugar a un mayor crecimiento microbiano

durante la fermentación y a la conservación de la viabilidad durante el almacenamiento.

Aryana y McGrew (2007) hallaron que los recuentos de L. casei en un yogur disminuyeron

con el tiempo de almacenamiento, ya sea en el control o en el yogurt adicionado con

64

distintos tipos de inulina. También informaron que el pH de todos los productos al finalizar

el almacenamiento en frio había disminuido, observando que para el tipo de inulina con

cadena más corta, la disminución del pH era significativamente mayor que con los otros

tipos de inulina.

Es común encontrar en bibliografía trabajos donde se reportan productos

fermentados en los que se agrega inulina como sustrato de fermentación, donde este

compuesto interviene en el metabolismo de las cepas y además contribuye a la

conservación de su viabilidad. En cambio, en el presente trabajo la adición de inulina fue

posterior a la fermentación, por lo que el aumento de la viabilidad observado para las

cepas L. paracasei y L. plantarum en las bebidas fermentadas adicionadas con inulina

podría deberse a un efecto de protección física por parte de la este polisacárido sobre las

células bacterianas. Además, el agregado de inulina post-fermentación contribuye a

mantener parcialmente inalterada su estructura y así ejercer su efecto prebiótico a nivel

intestinal.

65

Conclusión

66

Conclusión

La incorporación de probióticos y prebióticos es una estrategia empleada en el

desarrollo de alimentos funcionales. En este sentido, fue posible obtener un producto que

responde a las características de los mismos en cuanto a las propiedades funcionales y

nutritivas, que al mismo tiempo constituye una alternativa frente a los productos lácteos

funcionales. Ambas cepas probióticas empleadas en este trabajo (Lactiplantibacillus

plantarum CIDCA 8327 y Lacticaseibacillus paracasei BGP1) fueron capaces de

desarrollarse en el hidrolizado proteico de soja utilizado y permitieron obtener un

producto fermentado con actividad antimicrobiana frente a patógenos Gram negativos y

positivos y con capacidad antioxidante conservada. En cuanto a las características

nutricionales del producto desarrollado, podría encuadrarse dentro de la categoría de

productos “reducidos en grasas”. La bebida de soja resultó una matriz favorable para

contribuir a la viabilidad de las bacterias durante el almacenamiento refrigerado del

producto fermentado, así como a su sobrevida frente a las condiciones gastrointestinales

in vitro. En particular la cepa L. plantarum CIDCA 8327 presentó las mejores características

frente a los parámetros evaluados in vitro. El agregado de inulina favoreció la viabilidad de

ambas cepas durante el almacenamiento del producto, así como también mejoró la

sobrevida de L. paracasei BGP1 frente a las condiciones gastrointestinales. En tanto, dado

que la sobrevida de L. plantarum CIDCA 8327 en la bebida de soja fermentada sometida a

dichas condiciones fue elevada, el efecto protector del agregado de inulina no fue

evidenciado. No obstante, la incorporación de inulina al producto fermentado también

contribuiría a las propiedades benéficas del producto desarrollado.

Frente a todo lo expuesto, puede aceptarse la hipótesis de trabajo planteada,

resaltando además que la cepa Lactiplantibacillus plantarum CIDCA 8327 dada su

capacidad de adaptación y resistencia, resultaría un probiótico promisorio para la

aplicación en el desarrollo de bebidas funcionales fermentadas no lácteas, dado su

capacidad de adaptación y las propiedades antimicrobianas que aportaría a los productos.

Finalmente, el agregado de inulina como ingrediente bioactivo aportaría beneficios

adicionales para la salud.

67

68

Proyecciones

69

Proyecciones

El presente trabajo conduce a plantear las siguientes proyecciones con el objetivo

de completar el estudio de las bebidas a base de soja fermentadas obtenidas:

◆ Analizar la reología de las bebidas fermentadas con ambas cepas.

◆ Evaluar la estabilidad durante el almacenamiento de la inulina incorporada a la bebida

fermentada.

◆ Analizar la vida útil de las bebidas fermentadas.

◆ Realizar un análisis sensorial del producto desarrollado.

◆ Evaluar la incorporación de ingredientes que contribuyan al desarrollo de mejoras en

los atributos sensoriales del producto fermentado.

◆ Evaluar la actividad antioxidante de las bebidas fermentadas luego de la simulación del

pasaje a través del tracto gastrointestinal.

70

Anexo 1

71

ANEXO 1

Información nutricional de la leche de soja en polvo Nutrilon Soya de Nutricia Bagó.

72

Anexo 2

73

ANEXO 2

Procedimientos para la observación microscópica de bacterias

COLORACIÓN DE GRAM

Es una herramienta fundamental para la taxonomía e identificación de bacterias.

Esta coloración permite la clasificación de las bacterias en Gram positivas y Gram

negativas según la composición de su pared celular. La diferencia de la reacción entre

bacterias Gram positivas y Gram negativas es atribuida a diferencias químicas y físicas de

su pared celular.

Reactivos:

◆ Violeta de Genciana: Solución de violeta de genciana (cristal violeta) 0.2 %,

en mezcla de Etanol / Agua.

◆ Lugol: Solución constituida por iodo bisublimado en solución de hidróxido

de sodio.

◆ Decolorante: Solución constituida por mezcla de alcohol / acetona: 70,5 /

29,5.

◆ Safranina: Solución de safranina 0.25 %, en mezcla de Etanol / Agua.

Las bacterias Gram positivas presentan una gruesa capa de peptidoglicano como

estructura fundamental por sobre la membrana citoplasmática mientras que las bacterias

Gram negativas presentan por sobre la membrana citoplasmática una delgada capa de

peptidoglicano a la que se superpone una capa de lipopolisacáridos-lipoproteína

denominada “membrana externa”. En la coloración de Gram, el violeta de genciana es

captado en la pared celular de bacterias Gram positivas y Gram negativas y luego se forma

un complejo con el lugol. El decolorante actúa extrayendo los lípidos de la membrana

externa de la pared celular de las bacterias Gram negativas lo que produce un aumento en

la permeabilidad y se pierde el complejo formado entre el violeta de genciana y el lugol. Al

agregar la safranina, las bacterias Gram negativas toman el color de este contracolorante

y se observan de color rosado. A diferencia de estas, en las bacterias Gram positivas el

agregado del decolorante produce disminución de la permeabilidad e incrementa la

retención del complejo del violeta de genciana-iodo y se observan de color violeta por la

retención del mismo.

Procedimiento:

1. Preparación de extendidos:

◆ Utilizar portaobjetos limpios y desengrasados.

◆ A partir del medio líquido con crecimiento microbiano tomar un alícuota del

mismo y depositar en el portaobjetos. Esparcir con un ansa y generar el

extendido.

74

◆ Secado de extendidos: Colocar los portaobjetos en posición horizontal

dentro de la estufa de cultivo o sobre la corriente de aire caliente de un

mechero.

◆ Fijado del extendido a la llama: se efectúa pasando 3 veces el lado del

portaobjeto que no tiene la preparación sobre la llama del mechero.

2. Coloración:

◆ Cubrir el extendido con Violeta de Genciana. Dejar actuar 20 segundos.

◆ Lavar con agua corriente durante 10 segundos.

◆ Cubrir con Lugol. Dejar actuar 30 segundos.

◆ Lavar con agua corriente durante 10 segundos.

◆ Cubrir con Decolorante. Decolorar durante 10 segundos.

◆ Lavar con agua corriente 10 segundos.

◆ Cubrir con Safranina. Dejar actuar 20 segundos.

◆ Lavar con agua corriente durante 10 segundos.

◆ Secar el extendido.

◆ Leer la coloración en el microscopio con aumento total 1000X, empleando

aceite de inmersión.

75

Anexo 3

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ANEXO 3

Composición y preparación de medios de cultivo y soluciones empleadas

CALDO MRS (Man, Rogosa, Sharpe) (BRITANIA)

Su formulación permite el adecuado desarrollo de lactobacilos y otras bacterias

acido lácticas.

Composición (en gramos por litro de agua):

PROTEOSA PEPTONA N°3 10,O EXTRACTO DE CARNE 10,0 EXTRACTO DE LEVADURA 5,0 GLUCOSA 20,0 SORBITÁN MONOLEATO 1,0 mL FOSFATO DIPOTÁSICO 2,0 ACETATO DE SODIO 5,0 CITRATO DE AMONIO 2,0 SULFATO DE MAGNESIO 0,2 SULFATO DE MANGANESO 0,05 pH FINAL: 6,5 ± 0,2

En el medio de cultivo, la proteosa peptona, el extracto de carne, el extracto de

levadura y la glucosa constituyen la fuente nutritiva ya que aportan nitrógeno, carbono,

vitaminas y minerales. El monoleato de sorbitán, las sales de sodio, magnesio y

manganeso proveen cofactores para el crecimiento bacteriano y pueden inhibir el

crecimiento de algunos microorganismos. El citrato de amonio actúa como agente

inhibitorio del crecimiento de bacterias Gram negativas.

Preparación:

Suspender 55,25 g de polvo en 1 L de agua purificada. Dejar reposar 5 min.

Calentar con agitación frecuente y llevar a ebullición durante 1 o 2 min para disolución

total. Distribuir en recipientes adecuados y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15

min.

Almacenamiento:

◆ Medio de cultivo deshidratado: 2-8°C

◆ Medio de cultivo preparado: 2-8°C

AGAR MRS (Man, Rogosa, Sharpe) (BRITANIA)

Se elabora a partir de CALDO MRS, con la incorporación del 1,5 % de agar

bacteriológico a la preparación. Se incorpora junto con el polvo, antes de llevar a

ebullición.

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El agar bacteriológico actúa como agente solidificante.

Almacenamiento:

◆ Medio de cultivo deshidratado: 2-8°C

◆ Medio de cultivo preparado: 2-8°C

AGAR BACTERIOLÓGICO (BRITANIA)

El agar-agar es unhidrocoloide obtenido a partir de algas marinas de la clase

Rhodophyceae a través de un proceso de extracción que deriva en un polvo homogéneo y

seco. Es utilizado como agente gelificante en los medios de cultivo microbiológicos.

AGAR MAC CONCKEY (BRITANIA)

Este medio se emplea para el aislamiento de bacilos Gram negativos de fácil

desarrollo, aerobios y anaerobios facultativos.

Composición (en gramos por litro de agua):

PEPTONA DE CARNE 1,5 PEPTONA DE GELATINA 17,0 TRIPTEÍNA 1,5 LACTOSA 10,0 MEZCLA DE SALES BILIARES N°3 1,5 CLORURO DE SODIO 5,0 ROJO NEUTRO 0,03 CRISTAL VIOLETA 0,001 AGAR 13,5 pH FINAL 7,1 ± 0,2

En el medio de cultivo, las peptonas aportan los nutrientes necesarios para el

desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable y la mezcla de sales

biliares y el cristal violeta son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de gran

parte de la flora Gram positiva. El agar es el agente solidificante.

Preparación:

Suspender 50 g de polvo en 1 L de agua purificada. Dejar reposar 5 min. Calentar

con agitación frecuente y llevar a ebullición durante 1 o 2 min para disolución total.

Distribuir en recipientes adecuados y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 min.

Distribuir en placas de Petri estériles.

Almacenamiento:

◆ Medio de cultivo deshidratado: 10-35°C

◆ Medio de cultivo preparado: 2-8°C

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AGAR MANITOL SALADO (CHAPMAN) (BRIZUELA)

Medio selectivo para el aislamiento de estafilococos patógenos.

Composición (en gramos por litro de agua):

POLIPEPTONA 14,0 CLORURO DE SODIO 75,0 MANITOL 10,0 ROJO DE FENOL 0,025 AGAR 13,0 pH FINAL 7,4 ± 0,2

La mayoría de los microorganismos, que no sean estafilococos, son inhibidos por la

alta concentración de cloruro de sodio. Por lo general los estafilococos coagulasa positivo

fermentan el manitol, haciendo virar el medio al amarillo.

Preparación:

Suspender 112,02 gramos del polvo en 1 litro de agua purificada. Dejar reposar 5 a

10 min a temperatura ambiente. Llevar a ebullición durante unos min agitando de vez en

cuando. Esterilizar 15 min a 121°C. Distribuir en placas de Petri estériles.

Almacenamiento:

◆ Medio de cultivo deshidratado: 10-30°C

◆ Medio de cultivo preparado: 2-8°C

AGAR SALMONELLA SHIGELLA (BRITANIA)

Medio de cultivo selectivo y diferencial utilizado para el aislamiento de Salmonella

sp. y de algunas especies de Shigella sp.

Composición (en gramos por litro de agua):

PLURIPEPTONA 5,0 EXTRACTO DE CARNE 5,0 LACTOSA 10,0 MEZCLA DE SALES BILIARES 8,5 CITRATO DE SODIO 8,5 TIOSULFATO DE SODIO 8,5 CITRATO FÉRRICO 1,0 VERDE BRILLANTE 0,00033 ROJO NEUTRO 0,025 AGAR 13,5 pH FINAL 7,0 ± 0,2

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En el medio de cultivo, la pluripeptona y el extracto de carne aportan los

nutrientes para el desarrollo microbiano. Las sales biliares y el verde brillante inhiben el

desarrollo de una amplia variedad de bacterias Gram positivas, de la mayoría de los

coliformes y el desarrollo invasor del Proteus sp. La lactosa es el hidrato de carbono

fermentable. El tiosulfato de sodio permite la formación de SH2 que se evidencia con la

formación de sulfuro de hierro. El rojo neutro es el indicador de pH y el agar es el agente

solidificante.

Preparación:

Suspender 60 g del polvo en 1 L de agua purificada. Dejar reposar 5 min y mezclar

hasta homogeneizar. Calentar con agitación frecuente y llevar a ebullición durante 1 min

para disolución total. No esterilizar en autoclave. Dejar enfriar y distribuir en placas de

Petri estériles.

Almacenamiento:

◆ Medio de cultivo deshidratado: 10-35°C

◆ Medio de cultivo preparado: 2-8°C

CALDO NUTRITIVO (BRITANIA)

Medio de cultivo utilizado para propósitos generales, para el desarrollo de

microorganismos con escasos requerimientos nutricionales.

Composición (en gramos por litro de agua):

PLURIPEPTONA 5,0 EXTRACTO DE CARNE 3,0 pH FINAL 6,9 ± 0,2

En el medio de cultivo, la pluripeptona y el extracto de carne constituyen la fuente

de carbono y nitrógeno y aportan los nutrientes para el desarrollo bacteriano.

Preparación:

Suspender 8 g del polvo en 1 L de agua purificada. Dejar reposar 5 min y calentar

con agitación frecuente, llevando a ebullición para disolución total. Distribuir en tubos u

otros recipientes apropiados y esterilizar en autoclave 121°C durante 15 min.

Almacenamiento:

◆ Medio de cultivo deshidratado: 10-35°C

◆ Medio de cultivo preparado: 2-8°C

AGAR NUTRITIVO (BRITANIA)

Se elabora a partir de CALDO NUTRITIVO, con la incorporación del 1,5 % de agar

bacteriológico y 8 g de CLORURO DE SODIO a la preparación. Se incorporan junto con el

polvo, antes de llevar a ebullición.

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El agregado de cloruro de sodio sirve para mantener el balance osmótico. El agar

bacteriológico actúa como agente solidificante.

Almacenamiento:

◆ Medio de cultivo deshidratado: 10-35°C

◆ Medio de cultivo preparado: 2-8°C

BUFFER PBS (Solución salina tamponada con fosfato)

El Buffer PBS por suosmolaridad y concentración de iones (Cl-, Na+ y K+) es muy

semejante a la del líquido extracelular de los mamíferos. Es una solución isotónica y se

emplea como vehículo para bacterias, ya que no modifica el perfil de expresión y

funcionamiento celular normal, para el lavado de células a través de centrifugación, entre

otros.

Composición (en gramos por litro de agua):

FOSFATO MONOPOTÁSICO (KH2PO4) 0,14 FOSFATO DISÓDICO (Na2HPO4) 0,79 CLORURO DE POTASIO 9,0 pH FINAL 7,4 ± 0,2

Preparación:

Diluir todas las sales en 1 L de agua purificada. Colocar en un recipiente adecuado y

esterilizar en autoclave 121°C durante 15 min.

Almacenamiento:

◆ Solución preparada y esterilizada: 4-8°C

SOLUCIÓN FISIOLÓGICA (0,85%)

Diluyente isotónico utilizado para diluir las células bacterianas con el fin de

proporcionar una concentración adecuada para observación al microscopio, determinar

recuentos de células, analizar propiedades genéticas o metabólicas, lavar las células en

preparación para su estudio o preparar inóculos normalizados, entre otros. Se utiliza de

manera sistemática como diluyente, para ajustar la turbidez de las suspensiones de

células bacterianas y así mantener la integridad y viabilidad de las células.

Composición (en gramos por litro de agua):

CLORURO DE SODIO 8,5

Preparación:

Diluir 8,5 g de la sal en 1 L de agua purificada. Distribuir en tubos u otros

recipientes apropiados y esterilizar en autoclave 121°C durante 15 min.

81

Almacenamiento:

◆ Solución preparada y esterilizada: 4-8°C

SOLUCIÓN PATRÓN DE MCFARLAND 0,5

Los patrones de McFarland se utilizan como patrones de turbidez en la preparación

de suspensiones de microorganismos. El patrón 0,5 de McFarland tiene una aplicación

especial en la preparación de inóculos bacterianos para la realización de pruebas de

sensibilidad antimicrobiana.

Composición (en mililitros cada 100 mililitros de solución):

ÁCIDO SULFÚRICO 0,18M 99,5 CLORURO DE BARIO 0,048M 0,5

Los patrones de turbidez se preparan mezclando productos químicos que generan

precipitación para formar una solución de turbidez reproducible. Los patrones de

McFarland se preparan añadiendo ácido sulfúrico a una solución acuosa de cloruro de

bario que produce la formación de un precipitado de sulfato de bario suspendido. El

patrón 0,5 de McFarland corresponde a aproximadamente una suspensión homogénea de

Escherichia coli de 1,5 x 108 UFC/mL.

Preparación y conservación:

◆ Preparar las soluciones de ácido sulfúrico y cloruro de bario con agua

purificada.

◆ Introducir los volúmenes correspondientes de cada solución.

◆ Verificar la densidad del estándar con un espectrofotómetro

◆ Distribuir en tubos tapa a rosca transparentes.

◆ Agitar vigorosamente el estándar antes de su uso para obtener una

turbidez homogénea.

◆ Verificar mensualmente la confiabilidad de los estándares.

Almacenamiento:

◆ Solución preparada:10-35 °C al abrigo de la luz.

Soluciones y reactivos para técnica micro-kjeldahl

ÁCIDO SULFÚRICO CONCENTRADO

Ácido sulfúrico de Peso específico: 1,84 y exento de nitrógeno.

CATALIZADOR

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Se prepara a partir de una mezcla al 7% de sulfato de cobre pentahidratado

(CuSO45H2O) con sulfato de potasio anhidro (K2SO4).

SOLUCIÓN DE ÁCIDO BÓRICO AL 4%

Preparación:

Pesar 40 g de HBO3y disolverlo en un volumen de agua purificada (alícuota del

volumen final) agregarlo a un matraz aforado de 1 L y enrasar con agua purificada.

SOLUCIÓN INDICADORA MIXTA

Preparación:

Se prepara a partir de la disolución de 2 g de rojo de metilo y 1 g de azul de

metileno en 1 L de etanol 96% v/v. El cambio de color de esta solución indicadora se

produce a pH 5,4. La solución indicadora se almacena en una botella color topacio en

lugar oscuro y fresco.

SOLUCIÓN DE HIDRÓXIDO SÓDICO AL 30%

Preparación:

Pesar 500gde hidróxido sódico puro y se diluyeron en 1 L de agua purificada

SOLUCIÓN DE ÁCIDO CLORHÍDRICO 0,1 N

Preparación:

El HCl grado reactivo tiene una concentración de 36.5 a 37.5%, lo que equivale a

una solución 12 N. El volumen necesario para realizar un 1 L de solución 0,1 N es de 8,33

mL de HCl fumante. Valorar la solución con solución estandarizada de NaOH y

fenolftaleína como indicador.

Reactivos para la técnica Soxhlet

HEXANO

n-hexano de grado analítico, CAS Nº110-54-3

Soluciones para la simulación del pasaje a través del tracto gastrointestinal

SOLUCIÓN GÁSTRICA

La solución gástrica se preparó con cloruro de sodio (NaCl) 125 mM, cloruro de

potasio (KCl) 7 mM, bicarbonato de sodio (NaHCO3) 45 mM y pepsina (SIGMA-Aldrich)

0,3% p/v ajustando el pH final a 2,5 con ácido clorhídrico (HCl) concentrado.

Preparación:

83

Disolver todas las sales en agua destilada y esterilizar a 121°Cpor 15 min, dejar

enfriar y luego agregar la pepsina.

Almacenamiento:

◆ Solución preparada y esterilizada: 4-8 °C por 7 días.

SOLUCIÓN INTESTINAL

Preparación:

La solución intestinal se preparó con cloruro de sodio (NaCl) 22 mM, cloruro de

potasio (KCl) 3,2 mM, bicarbonato de sodio (NaHCO3) 7,6 mM, pancreatina (SIGMA-

Aldrich) 0,1% p/v y sales biliares (SIGMA-Aldrich) 0,15% p/v, ajustando el pH a 8 con

hidróxido de sodio(NaOH).

Preparación:

Disolver todas las sales en agua destilada y esterilizar a 121 °C por 15 min, dejar

enfriar y luego agregar la pancreatina y las sales biliares.

Almacenamiento:

◆ Solución preparada y esterilizada: 4-8 °C por 7 días.

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