Desarrollo de un enjuague bucal profiláctico en base a ... · Agentes emulsionantes ... uso de...
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS CARRERA DE QUÍMICA FARMACÉUTICA Desarrollo de un enjuague bucal profiláctico en base a aceite esencial de Zingiber officinale con actividad frente a Streptococcus mutans. Trabajo de investigación previo a la obtención del título de Químico Farmacéutico AUTOR: Navarro Villamarín Dayana Marlene TUTOR: MSc. Javier Rodrigo Santamaría Aguirre DMQ, julio, 2017
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
CARRERA DE QUÍMICA FARMACÉUTICA
Desarrollo de un enjuague bucal profiláctico en base a aceite esencial de Zingiber
officinale con actividad frente a Streptococcus mutans.
Trabajo de investigación previo a la obtención del título de Químico Farmacéutico
AUTOR: Navarro Villamarín Dayana Marlene
TUTOR: MSc. Javier Rodrigo Santamaría Aguirre
DMQ, julio, 2017
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DEDICATORIA
“Si la vida fuese fácil,
el esfuerzo no existiría;
pero como la vida es perfecta
del esfuerzo necesitamos para vivirla”
A mis padres Edgar Guillermo y Sonia Marlene…
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AGRADECIMIENTOS
Quiero agradecer a Dios por su guía y bendición en cada paso de mi vida. También a mis
padres Edgar y Sonia por su amor, paciencia y apoyo que permitió la culminación de una
etapa en mi vida profesional.
A mi tutor Javier Santamaría por todo su tiempo y conocimiento invertido, por ser más
que un profesor un amigo y consejero.
A mis profesores, gracias por compartir su sabiduría y por su vocación para formar nuevos
Químicos Farmacéuticos.
A mis amigos, porque junto a ellos viví una de las mejores etapas de mi vida, gracias por
todo su cariño y apoyo, sin ustedes las experiencias vividas en la Facultad no hubiesen sido
tan extraordinarias.
iv
DERECHOS DE AUTOR
Yo, Dayana Marlene Navarro Villamarín en calidad de autor y titular de los derechos
morales y patrimoniales del trabajo de investigación: “Desarrollo de un enjuague bucal
profiláctico en base a aceite esencial de Zingiber officinale con actividad frente a
Streptococcus mutans.”, de conformidad con el Art. 114 del CÓDIGO ORGÁNICO DE LA
ECONOMÍA SOCIAL DE LOS CONOCIMIENTOS, CREATIVIDAD E INNOVACIÓN,
concedemos a favor de la Universidad Central del Ecuador una licencia gratuita,
intransferible y no exclusiva para el uso no comercial de la obra, con fines estrictamente
académicos. Conservamos a mi favor todos los derechos de autor sobre la obra, establecidos
en la normativa citada.
Así mismo, autorizo/autorizamos a la Universidad Central del Ecuador para que realice la
digitalización y publicación de este trabajo de titulación en el repositorio virtual, de
conformidad a lo dispuesto en el Art. 144 de la Ley Orgánica de Educación Superior.
El autor declara que la obra objeto de la presente autorización es original en su forma de
expresión y no infringe el derecho de autor de terceros, asumiendo la responsabilidad por
cualquier reclamación que pudiera presentarse por esta causa y liberando a la Universidad de
toda responsabilidad
Dayana Marlene Navarro Villamarín
1720438892
v
APROBACIÓN DEL TUTOR
Yo, SANTAMARÍA AGUIRRE JAVIER RODRIGO en calidad de tutor del trabajo de
investigación titulado “Desarrollo de un enjuague bucal profiláctico en base a aceite
esencial de Zingiber officinale con actividad frente a Streptococcus mutans”, elaborado
por el estudiante NAVARRO VILLAMARÍN DAYANA MARLENE de la Carrera de
Química Farmacéutica, Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Central del
Ecuador, previo a la obtención del Grado de Químico Farmacéutico; considero que el mismo
reúne los requisitos y méritos necesarios en el campo metodológico y epistemológico, para
ser sometido a la evaluación por parte del tribunal examinador que se designe, por lo que lo
APRUEBO, a fin de que el trabajo sea habilitado para continuar con el proceso de titulación
determinado por la Universidad Central del Ecuador.
En la ciudad de Quito, a los 18 días del mes de julio de 2017.
Javier Rodrigo Santamaría Aguirre
1802467132
vi
CONSTANCIA DE APROBACIÓN DEL TRABAJO FINAL POR TRIBUNAL
El Tribunal constituido por: CARMITA REYES y DAYANA BORJA, luego de revisar
el trabajo de investigación titulado: “Desarrollo de un enjuague bucal profiláctico en
base a aceite esencial de Zingiber officinale con actividad frente a Streptococcus
mutans.” previo a la obtención del título de Químico Farmacéutico presentado por la señorita
Navarro Villamarín Dayana Marlene APRUEBA el trabajo presentado.
Para constancia de lo actuado firman:
Carmita Reyes Dayana Borja
CI: 1712862034 CI:1710993849
Javier Santamaría
CI:1802467132
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Índice de Contenidos
Introducción ............................................................................................................................ 1
Capítulo I ................................................................................................................................ 3
El Problema ............................................................................................................................ 3
Planteamiento del problema ................................................................................................ 3
Formulación del Problema .................................................................................................. 5
Preguntas de investigación .................................................................................................. 5
Objetivos de la investigación .............................................................................................. 6
Objetivo general .............................................................................................................. 6
Objetivos específicos....................................................................................................... 6
Importancia y justificación de la investigación .................................................................. 7
Capitulo II ............................................................................................................................... 9
Marco Referencial o Marco Teórico ...................................................................................... 9
Antecedentes ....................................................................................................................... 9
Fundamentación Teórica ................................................................................................... 11
Jengibre (Zingiber officinale Roscoe) ........................................................................... 11
Ensayos de Sensibilidad en Extractos Naturales ........................................................... 14
Métodos de difusión ...................................................................................................... 14
Métodos de dilución ...................................................................................................... 14
Determinación de la CMI .............................................................................................. 16
Métodos de Bioautografía ............................................................................................. 17
Generalidades de los Microorganismos de Ensayo ....................................................... 17
Patologías causadas por S. mutans ................................................................................ 18
Enjuague Bucal ............................................................................................................. 19
Solubilización de aceites esenciales .............................................................................. 21
Emulsiones .................................................................................................................... 21
Preparación de Nanoemulsiones ................................................................................... 23
Agentes emulsionantes – tensioactivos ......................................................................... 24
Caracterización de Nanoemulsiones ............................................................................. 25
Fundamentación legal ....................................................................................................... 26
Hipótesis ........................................................................................................................... 27
viii
Sistema de Variables ......................................................................................................... 27
Independientes ............................................................................................................... 27
Dependientes ................................................................................................................. 27
Capítulo III ........................................................................................................................... 29
Metodología de la investigación ........................................................................................... 29
Diseño de la investigación ................................................................................................ 29
Población y Muestra ......................................................................................................... 29
Métodos y Materiales ........................................................................................................ 30
Métodos ......................................................................................................................... 30
Materiales ...................................................................................................................... 38
Diseño experimental ......................................................................................................... 40
Análisis estadístico ........................................................................................................ 41
Matriz de Operacionalización de las Variables ................................................................ 43
Técnicas e Instrumentos de Recolección y procesamiento de Datos ................................ 43
Técnicas de Procesamiento de Datos ................................................................................ 44
Capítulo IV ........................................................................................................................... 45
Análisis y discusión de resultados ........................................................................................ 45
Etapa 1 .............................................................................................................................. 45
Pruebas preliminares ......................................................................................................... 45
Interacciones entre los componentes ............................................................................. 45
Velocidad de Agitación ................................................................................................. 46
Concentración de la solución de Emulgin CO 40 ......................................................... 47
Etapa 2 .............................................................................................................................. 48
Análisis del aceite esencial de Zingiber officinale ............................................................ 48
Determinación de la CMI del aceite esencial de Zingiber officinale por el método de macrodilución en caldo ................................................................................................. 49
Etapa 3 .............................................................................................................................. 50
Elaboración de enjuague bucal en base a aceite esencial de Zingiber officinale .............. 50
Diseño de mezclas Simplex-Centroid ........................................................................... 51
Optimización de Múltiples Respuesta ........................................................................... 52
Etapa 4: ............................................................................................................................. 54
Caracterización de la fórmula final ................................................................................... 54
Determinación del tipo de emulsión.............................................................................. 55
ix
Escaneo en Microscopio de fuerza atómica (AFM) ...................................................... 56
Estabilidad Física .......................................................................................................... 57
Control microbiológico (aerobios totales (ufc/g o mL), hongos y levaduras (ufc/g o mL) ................................................................................................................................ 58
Comprobación de la actividad antibacteriana ............................................................... 59
Capítulo V ............................................................................................................................ 62
Conclusiones y Recomendaciones ....................................................................................... 62
Conclusiones ..................................................................................................................... 62
Recomendaciones ............................................................................................................. 63
Referencias ........................................................................................................................... 64
x
Índice de Anexos
Anexo A. Árbol de problemas .............................................................................................. 69 Anexo B. Diagrama de Flujo Elaboración del Enjuague Bucal ........................................... 70 Anexo C. Fichas técnicas...................................................................................................... 71 Anexo D. Certificados Microbiología .................................................................................. 75 Anexo E. Fotografías ............................................................................................................ 81
xi
Índice de Figuras
Figura 1. GC-MS Estudio de la Universidad de Ferrara (Italia) Composición aceite esencial
de jengibre. ........................................................................................................................... 12
Figura 2. Esquema sugerido por el NCCLS para macrodilución en caldo. .......................... 16
Figura 3.Tinción gram Streptococcus mutans ...................................................................... 18
Figura 4.Métodos de Preparación de Nanoemulsiones ........................................................ 24
Figura 5. Gráfico de Contornos de la Superficie Respuesta Estimada para la optimización
en función a la Deseabilidad ................................................................................................. 53
Figura 6. Escaneo en Microscopio de fuerza atómica dilución 1:100 y 1:625 ..................... 56
Figura 7. Imagen 3D del Escaneo en Microscopio de fuerza atómica dilución 1:100 y 1:625
.............................................................................................................................................. 57
Figura 8. Estabilidad de la nanoemulsión día 30 .................................................................. 58
xii
Índice de Tablas
Tabla 1. Preparación de las diluciones ................................................................................. 32
Tabla 2. Variables de formulación ....................................................................................... 42
Tabla 3. Tratamientos establecidos para el diseño Simplex-Centroid.................................. 42
Tabla 4. Resultados Interacciones entre los componentes ................................................... 45
Tabla 5. Pruebas velocidad de agitación- Agitador magnético ............................................ 46
Tabla 6. Pruebas velocidad de agitación- Ultra Turrax ........................................................ 47
Tabla 7. Pruebas concentración de Emulgin CO 40 ............................................................. 47
Tabla 8. Resultado Análisis del aceite esencial de Zingiber officinale ................................ 48
Tabla 9. Resultado de la determinación de la CMI del aceite esencial de Zingiber officinale
.............................................................................................................................................. 49
Tabla 10. Resultados diseño experimental de mezclas Simplex-Centroid ........................... 50
Tabla 11. ANOVA modelo Lineal para el tamaño de glóbulo ............................................. 51
Tabla 12. ANOVA modelo Cuadrático para el IPD ............................................................. 51
Tabla 13. ANOVA modelo Cúbico Especial para el potencial Z ......................................... 52
Tabla 14. Parámetros Establecidos en función a la Deseabilidad ........................................ 52
Tabla 15. Valores de la Optimización en función a la Deseabilidad .................................... 53
Tabla 16. Fórmula de manufactura ....................................................................................... 54
Tabla 17. Resultados de la caracterización de la fórmula final ............................................ 55
Tabla 18. Resultados estabilidad física................................................................................. 57
Tabla 19. Resultado Control microbiológico ....................................................................... 59
Tabla 20. Diámetro de halos de inhibición de la comprobación de la actividad
antibacteriana mediante el método de difusión en agar ........................................................ 59
Tabla 21.Análisis de Varianza para la actividad antibacteriana ........................................... 60
Tabla 22. Pruebas de Múltiple Rangos para la actividad antibacteriana .............................. 60
Tabla 23. Diferencia mínima significativa (LSD) de Fisher para la actividad antibacteriana
.............................................................................................................................................. 61
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
CARRERA DE QUÍMICA FARMACÉUTICA
Desarrollo de un enjuague bucal profiláctico en base a aceite esencial de Zingiber
officinale con actividad frente a Streptococcus mutans.
AUTOR: Dayana Marlene Navarro Villamarín
TUTOR: Javier Rodrigo Santamaría Aguirre
Resumen
El jengibre (Zingiber officinale) se ha utilizado extensamente como especia y medicina
herbaria, se ha descrito que esta especie posee propiedades antimicrobianas y antifúngicas,
entre otras. En el presente estudio se desarrolló un enjuague bucal profiláctico en base a aceite
esencial de Zingiber officinale con actividad frente a Streptococcus mutans. Para ello, se
realizó la determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI) del aceite esencial, la
cual fue 6,70 mg/mL de α-Zingibereno. Luego, se procedió a la formulación empleando
distintas cantidades de agentes solubilizantes y cosolventes en base a un diseño experimental
de mezclas Simplex-Centroid y la optimización de múltiples respuestas; a partir de los datos
obtenidos se elaboró el enjuague bucal, creando una nanoemulsión, el cual mantuvo su
estabilidad física a temperatura ambiente y protegido de la luz durante 30 días. La
formulación obtenida fue efectiva frente a S. mutans, pero no superior que el producto de
referencia: clorhexidina al 0,04%; con lo que se logró obtener un enjuague bucal profiláctico
con un principio activo natural disminuyendo la posibilidad de efectos secundarios asociados
al uso de antimicrobianos químicos.
Palabras Clave: NANOEMULSIÓN, ACEITE ESENCIAL, Zingiber officinale,
ENJUAGUE BUCAL, Streptococcus mutans.
xiv
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
CARRERA DE QUÍMICA FARMACÉUTICA
Development of a prophylactic mouthwash based on essential oil of Zingiber
officinale with activity against Streptococcus mutans.
AUTHOR: Dayana Marlene Navarro Villamarín
TUTOR: Javier Rodrigo Santamaría Aguirre
Summary
Ginger (Zingiber officinale) has been widely used as a food spice and herbal medicine, it
has been described that this species possesses antimicrobial and antifungal properties,
among others. In the present study, a prophylactic mouthwash was developed based on
essential oil of Zingiber officinale with activity against Streptococcus mutans. For this
purpose, the determination of the minimum inhibitory concentration (MIC) of the essential
oil, which was 6.70 mg / mL of α-Zingiberene, was performed. Then, the formulation was
carried out using different amounts of solubilizing agents and cosolvents based on an
experimental design of Simplex-Centroid and the optimization of multiple responses;
from the obtained data the mouthwash was made, creating a nanoemulsion, which
maintained its physical stability at room temperature and protected from light for 30 days.
The formulation obtained was effective against S. mutans, but not higher than the
reference product: 0.04% chlorhexidine; finally, it was possible to obtain a prophylactic
mouthwash with a natural active principle diminishing the possibility of side effects
associated to the use of chemical antimicrobials.
Key Words: NANOEMULSION, ESSENTIAL OIL, Zingiber officinale, MOUTHWASH,
Streptococcus mutans.
1
Introducción
La Tecnología Farmacéutica ha evolucionado en estos últimos años, aportando con el
diseño y elaboración de un número cada vez mayor de nuevos productos farmacéuticos y
cosméticos en base a activos vegetales, que permiten obtener muchos beneficios entre ellos
menores efectos adversos.
El problema principal a plantearse en esta investigación es la falta de alternativas
naturales profilácticas en forma de enjuague bucal para el empleo a nivel odontológico, ya
que el uso de activos sintéticos en la elaboración de los mismos ha detonado la aparición de
resistencia en bacterias de la microflora oral y la aparición de efectos secundarios, por lo que
se denota la necesidad de desarrollar un enjuague bucal profiláctico en base a aceite esencial
de Zingiber officinale, una planta que ha sido ampliamente utilizada con fines curativos y
posee potencial antimicrobiano. El siguiente trabajo consta de 5 capítulos: el problema,
marco teórico, marco metodológico, análisis y discusiones de resultados y conclusiones y
recomendaciones, cada uno de ellos detalla cómo fue la realización del proyecto de
investigación.
En el capítulo I “El Problema” se denota la importancia del tema a investigar: la falta
de alternativas naturales para ser usadas como agente antimicrobiano en enjuagues
bucales, ha dado lugar a que el uso excesivo de antimicrobianos sintéticos, en la
elaboración de colutorios, genere efectos secundarios y resistencia bacteriana, y se plantea
el objetivo principal del estudio que es desarrollar un enjuague bucal profiláctico en base
a aceite esencial de Zingiber officinale con actividad frente a Streptococcus mutans.
En el capítulo II “Marco Teórico” se describen varios estudios donde se ha empleado
extractos del rizoma de Zingiber officinale y su aceite esencial para pruebas que denotan su
2
capacidad antibacteriana frente una diversidad de bacterias, además una revisión
bibliográfica del tema y bases legales como la Constitución del Ecuador, que fundamentan
la investigación a realizarse.
En el capítulo III “Metodología de la Investigación”, se describen los procesos para
desarrollar el colutorio: la determinación de la CMI del aceite esencial, en base a la cual se
desarrolló un colutorio empleando distintas cantidades y tipos de sistema solubilizante, la
posterior optimización de la fórmula apoyándose en un análisis estadístico en base a un
diseño experimental de mezclas y la optimización multirespuesta, y la caracterización del
producto.
En el capítulo IV “Análisis y discusiones de resultados”, se detalla los resultados de la
determinación de la CMI, la aplicación del diseño de mezclas y optimización de múltiples
respuestas para el desarrollo del enjuague bucal, la caracterización de la formulación y la
comprobación de la actividad antimicrobiana de la fórmula final junto con el diseño DBCA
aplicado; también se incluye una interpretación de los datos obtenidos en cada uno de los
estudios y diseños mencionados.
En el capítulo V “Conclusiones y Recomendaciones”, se encuentran las conclusiones
obtenidas en la investigación en base a los objetivos planteados, logrando llegar a la
resolución final que fue el desarrollo del enjuague bucal, en forma de nanoemulsión, con
actividad comprobada frente a S. mutans; además se menciona recomendaciones generadas
a partir del estudio realizado.
3
Capítulo I
El Problema
Planteamiento del problema
Las enfermedades bucales, como la caries dental cuentan con alta prevalencia en el
mundo entero, el 60%-90% de los escolares y casi el 100% de los adultos tienen caries
dental en todo el mundo (OMS, 2012). En el Ecuador según estudios realizados, se
revela que solamente el 20,1% de los escolares de 6 años están libres de caries, por lo cual
todavía existe una alta prevalencia de caries en la niñez (Raza, 2009).
La caries dental es una patología a menudo acompañada de dolor o sensación de
molestia y de hecho pude presentar complicaciones de no ser atendida y controlada, entre
ellas está la afectación de la pulpa dental y de los soportes dentales por la propagación de
la infección produciendo pérdida de piezas dentales e incluso abscesos y celulitis faciales
(MINSALUD, 2014).
Las bacterias orales pertenecen a una comunidad compleja de numerosas especies que
participan en la formación de la placa bacteriana. El concepto actual contempla que varios
microorganismos se incluyen en la patogénesis de la caries dental (estreptococos del
grupo mutans, Lactobacillus spp y Actinomyces spp) de los cuales, Streptococcus
mutans (S. mutans) es el agente más importante asociado a ella (Ojeda, 2013).
En la actualidad los tratamientos antibióticos proporcionan una herramienta útil para
controlar infecciones dentales, la mayoría de productos comerciales usados en
odontología contienen activos antimicrobianos como el triclosán, fluoruro de sodio,
clorhexidina, etc. La clorhexidina es el agente antimicrobiano más utilizado en enjuagues
bucales para la prevención de la caries dental. Sin embargo, su uso excesivo puede dar
lugar a efectos secundarios tales como, sabor desagradable, la tinción de las
4
restauraciones, decoloración de la lengua, descamación e inflamación en la mucosa oral
(Ghada, 2013). Además, al utilizar la terapia antibiótica ya sea curativa o profiláctica, es
importante tener en cuenta los posibles beneficios y efectos adversos, incluyendo el
desarrollo de especies bacterianas resistentes.
En los últimos 20 años, numerosos estudios han informado de la existencia de bacterias
orales resistentes a los antibióticos e incluso multirresistentes. Esta aparición de resistencias
en la microflora oral es casi seguro vinculada en gran parte al uso inadecuado de antibióticos,
en términos de ya sea la dosis o una indicación (Bidault, 2007). Es importante mencionar que
desde el año 2000, varios estudios han verificado la presencia de resistencia a triclosán entre
los microorganismos dérmicos, intestinales y ambientales, incluyendo algunos de relevancia
clínica (Siamak,2006). Aunque la susceptibilidad de Streptococcus mutans a clorhexidina no
ha sido estudiada ampliamente existen evidencias donde el uso de un enjuague bucal que
contenía digluconato de clorhexidina (0,2%) dio lugar a un ligero, pero transitorio cambio en
la susceptibilidad de los organismos salivales a la acción bacteriostática del agente
(Hennessey, 1973) y se ha recomendado que el seguimiento y la vigilancia son necesarios
para detectar la resistencia de Streptococcus mutans en particular a la clorhexidina
(Jarvinen,1993).
Los productos naturales son una fuente importante de nuevos medicamentos y su uso
como una medicina alternativa para el tratamiento de diversas enfermedades se ha
aumentado en las últimas décadas (Amel, 2015). El estudio y la adaptación de extractos
naturales de plantas con potencial antimicrobiano es actualmente un campo de
investigación que ha despertado un gran interés debido a que sus activos pueden presentar
menos efectos adversos.
El jengibre (Zingiber officinale) es una planta que ha sido ampliamente utilizada en
medicina China, Ayurvédica, Tibbia-Unani y en todo el mundo como planta medicinal
(Bradreldin, 2008). Se ha reportado un sinnúmero de aplicaciones medicinales de esta
5
planta entre las que se menciona su potencial antimicrobiano (Sundeep, 2016). En el
Ecuador el jengibre es una especie introducida que se cultiva en las áreas húmedas
tropicales y subtropicales del país y es utilizado en medicina tradicional principalmente
para afecciones orofaríngeas (Chankuap, 2014).
Debido al interés en la potencial actividad antimicrobiana frente a la flora oral que el
jengibre posee y su empleo en la formulación de productos farmacéuticos de uso
odontológico junto con los antecedentes mencionados anteriormente es que se plantea:
desarrollar un enjuague bucal profiláctico en base a aceite esencial de Zingiber officinale
con actividad frente a Streptococcus mutans.
Formulación del Problema
Debido a la falta de alternativas naturales profilácticas en forma de enjuague bucal para
el empleo a nivel odontológico, se desarrollará un enjuague bucal profiláctico en base a
aceite esencial de Zingiber officinale con actividad frente a Streptococcus mutans.
Preguntas de investigación
¿Cuál es la CMI del aceite esencial de Zingiber officinale frente a S. mutans?
¿Cuál es la mejor formulación de enjuague bucal que permite la solubilidad adecuada
del aceite esencial de Zingiber officinale?
¿El enjuague bucal en base a aceite de Zingiber officinale presenta estabilidad física
adecuada?
6
¿El enjuague bucal en base a aceite de Zingiber officinale presenta actividad
antibacteriana frente a S. mutans?
Objetivos de la investigación
Objetivo general
Desarrollar un enjuague bucal profiláctico en base a aceite esencial de Zingiber
officinale con actividad frente a Streptococcus mutans.
Objetivos específicos
• Determinar la CMI del aceite esencial de jengibre provisto por la Fundación
Chankuap, frente a las cepas de Streptoccocus mutans (ATCC 25175), utilizando la
técnica de dilución en caldo.
• Desarrollar un enjugue bucal que permita mantener solubilizado el aceite
esencial de jengibre.
• Verificar la actividad antibacteriana frente a las cepas de Streptoccocus
mutans (ATCC 25175) de la mejor formulación, de los enjuagues bucales
manufacturados, empleando el Método de difusión en agar.
7
Importancia y justificación de la investigación
Las enfermedades dentales tienen una alta prevalencia a nivel mundial, de ellas las
caries son una de las patologías más usuales y de esta manera constituye, tanto su
tratamiento y control, un aspecto importante en la salud pública. Padecer de caries dental
impide gozar de una buena salud dental, la cual constituye un eslabón importante en el
ámbito del bienestar bio-psico social de los individuos, ya que las evidencias muestran
una estrecha relación entre el estado de salud bucal con la salud integral, que repercute en
la calidad de vida de la población. (MSP,2009)
En el Ecuador según un estudio realizado por Raza en el 2009 indica que: “el porcentaje
de niños que tienen afectadas sus piezas dentales permanentes es de 5,3% con un CPOD
(promedio de piezas definitivas cariadas, perdidas u obturadas) de 0,07” en este estudio
se revela que aún existe una alta prevalencia de caries 79,9 % a los 6 años y 88,2% en el
grupo escolar de 6 a 15 años. La atención odontológica para tratar estas afecciones
representa una carga económica y es un hecho que pueden evitarse aplicando medidas
eficaces de prevención y promoción de la salud. Entre estas medidas el cepillado es
imprescindible para mantener una buena salud bucal y se recomienda que, para
complementarlo, es necesario añadir un enjuague bucal diario a la rutina de aseo (MSP,
2009).
Los enjuagues bucales son una medida profiláctica que permiten el control y
prevención de enfermedades bucodentales, aun así, debido a la presencia de
antibacterianos químicos en su fórmula generan efectos secundarios (Sundeep, 2016). En
el país podemos encontrar gran variedad de colutorios, pero son escasos aquellos que
emplean una alternativa natural en su fórmula. Este antecedente despierta la necesidad de
aplicar los conocimientos teóricos y aspectos prácticos pertinentes para el desarrollo de
un colutorio natural que permitan asegurar la calidad, seguridad y eficacia del mismo.
8
Cabe destacar, que el Ecuador es un país que posee una gran diversidad en especies
vegetales, muchas de las cuales poseen potenciales usos medicinales reportados; entre
ellas se encuentra el jengibre (Zingiber officinale), su cultivo constituye un trabajo
importante de las comunidades amazónicas Shuar, Achuar y Colono mestiza de Morona
Santiago al Sur del Ecuador (Chankuap, 2014); por ello fomentar el desarrollo y uso de
alternativas naturales gracias a las múltiples propiedades que plantas locales presentan,
constituye un aspecto relevante.
Después de las consideraciones anteriores y con el fin de buscar nuevas alternativas
vegetales; entre estas aquellos productos naturales que puedan ser empleados en el diseño
y desarrollo de productos farmacéuticos robustos con aplicación en el campo
odontológicos, y que además permitan su uso frecuente con un mínimo de
contraindicaciones es que este trabajo tiene importancia.
9
Capitulo II
Marco Referencial o Marco Teórico
Antecedentes
En la actualidad la búsqueda de activos naturales con potencial antibacteriano es muy
amplia; el jengibre (Zingiber officinale) se ha utilizado como medicamento desde la
antigüedad. En la Farmacopea China, los usos medicinales y las indicaciones del jengibre
incluyen un sinnúmero de padecimientos. Además, el jengibre tiene propiedades
antibacterianas, antifúngicas y anticancerosas bien reconocidas (Azizi, 2015).
El potencial antimicrobiano del jengibre se ha descrito en estudios como ¨Antibacterial
effect of Ginger and Black pepper extracts (alone and in combination) with Sesame oil on
some pathogenic bacteria¨, Neihaya (2015), donde el objetivo del estudio fue determinar la
actividad antibacteriana del extracto acuoso y etanólico de jengibre (Zingiber officinale) y
pimienta negra (Piper nigrum), solos y en combinación con aceite de sésamo (Sesamum
indicum) contra 10 tipos diferentes de bacterias. Se empleó el método de difusión de pozos
de agar. Los resultados demostraron que los extractos de jengibre (alcohólicos y acuosos)
tienen actividad bactericida, además se encontró que la solución madre de los extractos
inhibía el crecimiento de todos los aislamientos bacterianos, pero al hacer diluciones la
eficacia reducía. En este trabajo se menciona que la actividad antibacteriana del extracto de
jengibre, es causada principalmente por la presencia de terpenos y de los compuestos
fenólicos (gingerol y shogaol) aislados principalmente de la raíz de la planta.
También el efecto antibacteriano del extracto de jengibre frente a S. mutans ha sido
estudiado, Jain (2015) en el artículo ¨ Comparative Evaluation of Antibacterial Efficacy of
Six Indian Plant Extracts against Streptococcus Mutans¨, muestra la sensibilidad que esta
10
bacteria tiene frente al extracto de jengibre empleando el método de difusión de pozos en
agar y determinado concentración inhibitoria mínima (CIM); los resultados arrojados
mostraron que el extracto de disolvente orgánico de jengibre inhibió el crecimiento de
Streptococcus mutans y tenía una CMI de 12,5 mg/mL.
Otros estudios como ¨ Antimicrobial Activity of Zingiber officinale (Ginger) Oil against
Bacteria Isolated from Children Throat¨, Amel (2015), han demostrado la actividad
antibacteriana que el aceite esencial de jengibre posee; el objetivo de este estudio fue
examinar in vitro la actividad antibacteriana del aceite de jengibre contra bacterias aisladas
de la garganta de los niños. Los resultados mostraron que el aceite de jengibre tiene un efecto
antibacteriano significativo en las bacterias aisladas; la concentración de 25 μg / mL mostró
mayor actividad en bacterias ensayadas. Además, Streptococcus pyogenes fue el aislado más
sensible frente al aceite de jengibre, mostró actividad a todas las concentraciones de aceite y
mayor actividad a una concentración de 100 ug/mL, también Streptococcus viridans presentó
una sensibilidad variada frente al aceite. En este trabajo se menciona que la actividad
antimicrobiana del aceite de jengibre puede atribuirse al hecho de que contiene sustancias
antimicrobianas tales como zingiberol, zingiberina y bisaboleno.
También la actividad antimicrobiana del aceite esencial de jengibre ha sido probada frente
a otros microrganismos, Sundeep (2016) en el trabajo ¨ Comparison of antimicrobial activity
of honey and ginger essential oil on streptococcus and lactobacillus species-an invitro study
¨ evaluó la actividad antibacteriana de miel cruda, miel procesada y aceite de jengibre en
especies de Streptococcus y Lactobacillus. Los resultados mostraron que el aceite esencial
de jengibre poseía actividad antibacteriana contra especies de Lactobacillus spp. en todas las
concentraciones mientras que la actividad antibacteriana frente a las especies de
Streptococcus spp. se observó a una concentración del 50% y del 100%. Se concluyó que el
jengibre tiene una buena actividad antimicrobiana contra especies de Streptococcus y
Lactobacillus.
11
Fundamentación Teórica
Jengibre (Zingiber officinale Roscoe)
Descripción Botánica
Familia: Zingiberaceae
Nombre científico: Zingiber officinale Roscoe
Nombre común: jengibre
Tiene su origen en Asia, pertenece a la familia botánica Zingiberaceae. El jengibre o
gengibre (Zingiber officinale) es una planta rizomatosa, que alcanza 60 hasta 120 m de altura
y 45 cm de ancho. Presenta tallos engrosados o rizomas enterrados en la tierra de color
amarillo-verdoso y aproximadamente 7 cm de largo. Hojas verdes claro, estrechas, en forma
de cintas (Cañigueral, 2003).
La parte del jengibre que ha sido empleada con fines medicinales y en donde se encuentran
ciertas drogas es el rizoma desecado, que mide de 5 a 10 cm de longitud, es aplanado y
presenta ramificaciones. Las variedades más apreciadas para producción de droga son la
jamaicana y las originarias de Bengala y Australia. Sin embargo, la mayor parte de la droga
es de origen chino (Cañigueral, 2003).
Composición química
El jengibre contiene un 4-7,5% de oleoresina, en la que destacan el aceite esencial y las
sustancias picantes. El aceite esencial (1,5-3% de la droga) tiene una composición variable
según la procedencia. Los principales componentes son sesquiterpenos como: α-zingibereno,
ar-curcumeno, ß-bisaboleno, ß-bisabolona, (EE)- α-farneseno; y monoterpenos como:
alcanfor, ß-felendreno, geranial, neral y linalol. Las sustancias picantes son los gingeroles y
los sogaoles, siendo los más importantes el [6]-gingerol y el [6]-sogaol. El rizoma de jengibre
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también contiene diarilheptanoides. Otros componentes son: almidón (aproximadamente un
50%), diterpenos, ácido 6-gingesulfónico y monoacil digalactosil gliceroles (Cañigueral,
2003).
El aceite de jengibre producido en la Fundación Chankuap, declara la siguiente
composición:
Figura 1. GC-MS Estudio de la Universidad de Ferrara (Italia) Composición aceite esencial de jengibre.
(Chankuap,2008).
Propiedades Farmacológicas
Las principales acciones farmacológicas del jengibre y sus compuestos aislados incluyen
acciones inmuno-moduladoras, anti-tumorigénicas, anti-inflamatorias, anti-apoptóticas, anti-
hiperglucémicas, anti-lipídicas y antieméticas (Badreldin, 2008).
Según la European Scientific Cooperative On Phytotherapy (ESCOP), el rizoma de
jengibre está indicado en la profilaxis de náuseas, vómitos y como antiemético posquirúrgico
en intervenciones quirúrgicas menores. También es empleando popularmente como
antirreumático y ciertos metabolitos presentes en el rizoma ha mostrado actividad
antinflamatoria y analgésica. La Comisión E del Ministerio de Sanidad Alemán acepta el uso
del rizoma de jengibre como digestivo en trastornos dispépticos. Su uso también ha sido
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indicado para gripe, resfriado, faringitis, rinitis, diabetes, y prevención de las arteriosclerosis
(Cañigueral, 2003).
Las propiedades medicinales del aceite esencial de jengibre han sido ampliamente
estudiadas, por ejemplo, el aceite mostró una supresión significativa de la inflamación en el
modelo crónico de inflamación inducida por formalina en ratones de una manera dependiente
de la concentración. El porcentaje de inhibición de 54,17, 62,5 y 70,8% se demostró a dosis
de 100, 500 y 1000 mg / kg, mostrando la eficacia del aceite de jengibre como un agente
terapéutico eficaz en condiciones inflamatorias agudas y crónicas (Kottarapat,2013).
Además, se ha confirmado que el aceite de jengibre no es tóxico, se determinó que para ratas
machos y hembras después de administraciones orales subcrónicas de hasta 500 mg / kg por
día no ha habido nivel de efecto adverso observado (Kottarapat, 2011).
Propiedades antimicrobianas
La actividad antimicrobiana ha sido descrita en ensayos experimentales para los extractos
del rizoma de jengibre o para sus componentes. El extracto etanólico de jengibre demostró
tener actividad frente a E. coli a una concentración de 1000 mg/mL generando halos de
inhibición de 9 mm, a la misma concentración presentó actividad frente a Salmonella typhi
(Okpara,2005).
Otros estudios han demostrado la actividad antimicrobiana del aceite esencial de jengibre
frente a S.aureus a una concentración de 25 ug/mL; al igual presentó actividad frente a
asilados de: Streptococcus pyogenes, S. viridans, C. pseudodiphtheriticum a concentraciones
mayores que 50 ug/ mL (Amel, 2015). Muchos estudios indicaron que la potencia
antimicrobiana del jengibre, es causada principalmente por la presencia de terpenos
monoxigenados y sesqui-terpenos, compuestos fenólicos (shogaol, gingerol), que son
compuestos de fenol liposoluble y otros componentes propios del aceite esencial aislados
principalmente de la raíz de jengibre (Neihaya, 2015).
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Ensayos de Sensibilidad en Extractos Naturales
Diferentes métodos de laboratorio pueden ser usados para determinar In vitro la
susceptibilidad de bacterias a agentes microbianos, pero estos no son igualmente sensibles o
no se basan en los mismos principios, permitiendo que los resultados sean influenciados por
el método seleccionado, los microorganismos usados y el grado de solubilidad de cada
compuesto evaluado (Ramírez, 2009).
Métodos de difusión
Esta técnica se fundamenta en el método descrito por Bauer y se basa en la relación entre
la concentración de la sustancia ensayada y el halo de inhibición de crecimiento en la
superficie de una placa de agar. En esta un reservorio que contiene el extracto de planta a
analizar se pone en contacto con el medio inoculado y luego de la incubación, el diámetro
del halo de inhibición alrededor de los reservorios es medidos. Se emplean diferentes tipos
de reservorios como discos de papel filtro, porcelana o recipientes de acero inoxidable en la
superficie o en hoyos en el medio (Vanden,1991).
Los medios de cultivo más utilizados en dichas técnicas son el agar Mueller Hinton y agar
tripticasa soya, ya que sus componentes facilitan el crecimiento de diferentes cepas
bacterianas y mayor difusión de las muestras. Algunos investigadores utilizan el agar
nutritivo (Ramirez,2009).
Métodos de dilución
El método de dilución en agar o en caldo como test de susceptibilidad microbiana es
utilizado para determinar la concentración mínima bactericida (MBC) y la concentración
mínima inhibitoria (MIC). En este la muestra a probar se mezcla con un medio nutritivo, el
cual ha sido previamente inoculado con el organismo a ensayar. Después de la incubación el
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crecimiento del microorganismo es determinado por inspección visual o por métodos
turbidimétricos y es comparado con un cultivo control donde no ha sido adicionado el
extracto a probar. Finalmente se determina la concentración inhibitoria mínima (CIM) del
extracto frente al microorganismo ensayado (Vanden,1991)
Métodos de dilución en agar
La dilución en agar es un método bien establecido para la determinación de la sensibilidad
a los antimicrobianos. El agente antimicrobiano se incorpora dentro del medio con agar, de
manera tal que cada placa contenga una concentración de extracto a ensayar diferente. Luego
se examina si el microorganismo crece o no en cada una de las cajas, la principal desventaja
de este método es la cantidad necesaria de muestra a evaluar. (Ramirez,2009)
Métodos de dilución en caldo
El medio de elección para la determinación de rutina por método de dilución es el Caldo
Mueller Hinton (MHB). Existen dos variantes de este método:
Macrodilución
Se emplean tubos de hemólisis estériles, se debe preparar las sucesivas diluciones al medio
del extracto en caldo como se muestra en la Figura 2. El volumen final mínimo, requerido en
cada tubo, es de 1 mL. La CIM se determina luego de incubar, esta es la menor concentración
de extracto capaz de inhibir completamente el desarrollo bacteriano en el tubo o pocillo, el
punto final queda definido a simple vista por la falta de turbidez del caldo (NCCLS, 2012).
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Figura 2. Esquema sugerido por el NCCLS para macrodilución en caldo.
(NCCLS, 2012).
Microdilución
En este método se emplea microplacas (microdilución) que contienen concentraciones
crecientes del extracto vegetal. El organismo en estudio es inoculado en los diferentes pozos
de las microplacas y la CMI es determinada después de la incubación (Ramirez,2009).
Determinación de la CMI
La cuantificación de la actividad in vitro de los antimicrobianos se evalúa habitualmente
mediante algunas de las variantes de los métodos de dilución. La CMI se ha establecido como
"gold Standard" frente a otros métodos que evalúan susceptibilidad antimicrobiana. Se puede
realizar empleado el método de macrodilución o microdilución, se determina por turbidez
o por cambio de color con MTT el crecimiento o no del microorganismo, y el pozo que
contenga la menor concentración del agente que inhibe completamente el crecimiento define
la MIC (Ramirez,2009).
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Métodos de Bioautografía
Es un método que permite identificar actividad antibacteriana en un cromatograma. Se
ha encontrado una amplia aplicación de este método en la investigación de nuevos
antibióticos (Ramirez,2009).
El método consiste en colocar las muestras a evaluar en placas de TLC, seleccionar la
fase móvil que de mejor separación, posteriormente esta placa es llevada y colocada en
forma invertida sobre una caja de petri previamente inoculada con el microorganismo a
evaluar, se deja en la nevera para facilitar la difusión de los extractos en el medio, luego
se retira la placa y se lleva la caja a incubación según los requerimientos del
microorganismo; luego se observa el halo de inhibición donde está el compuesto activo
(Ramirez,2009).
Generalidades de los Microorganismos de Ensayo
Streptoccocus mutans
Es un coco Gram positivo, dispuesto en cadena, no móvil, catalasa negativa, productor
rápido de ácido láctico con capacidad de cambiar un medio de pH 7 a pH 4.2. Fermentador
de glucosa, lactosa, rafinosa, manitol, inulina y salicina con la producción de ácido. El
hábitat natural de Streptoccocus mutans es la boca humana. En la cavidad oral, las colonias
se adhieren muy cerca de la superficie del diente e igualmente se puede recuperar en lesiones
cariosas (Ojeda,2013).
Muchas de las especies de estreptococos orales pueden aislarse de varios sitios usando
medios selectivos como el Agar Mitis Salivarius (MS). En el agar MS, muchos estreptococos
orales muestran una morfología característica de las colonias (blanquecinas, de bordes
definidos, colonias firmes muy adherentes al medio de cultivo) lo cual permite su
diferenciación inicial. Usualmente, la placa de agar se cultiva en una atmosfera del 95% de
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nitrógeno y 5% de dióxido de carbono a 37°C por 1 o 2 días seguida de una incubación en
aire por 1 o 2 días (Ojeda, 2013).
Figura 3.Tinción gram Streptococcus mutans
(Padilla, 2015 )
Patologías causadas por S. mutans
Streptococcus mutans generalmente es conocido como patógeno dental e igualmente se
considera que causa bacteremia y endocarditis infecciosa (Gonzalez,2016).
Caries dental
De las enfermedades infecciosas que afectan a los seres humanos, la caries dental es
probablemente la más prevalente. Se describe la caries dental como un proceso dinámico de
desmineralización y remineralización, producto del metabolismo bacteriano sobre la
superficie dentaria, que con el tiempo puede producir una pérdida neta de minerales y
posiblemente resultará en la presencia de una cavidad. La complejidad de esta enfermedad
se debe a los múltiples factores que están asociados con la evolución de una población
bacteriana que pasa de una biopelícula saludable a otra patológica. Una biopelícula sana
puede estar formada por más de 700 especies bacterianas, de las cuales menos del 1% son
bacterias potencialmente patogénicas. Cambios en la homeostasis dentro de la biopelícula
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hacen que se favorezca la proliferación de especies patogénicas acidúricas y acidogénicas y
tomen posesión de la misma (Ojeda, 2013).
La caries dental es una enfermedad dental transmisible en la cual los estreptococos del
grupo mutans juegan un papel principal. Streptococcus mutans produce ácido láctico, ácido
propiónico, ácido acético y ácido fórmico cuando metaboliza carbohidratos fermentables
como la sacarosa, glucosa y fructosa. Estos ácidos circulan a través de la placa dental hacia
el esmalte poroso, disociándose y liberando hidrogeniones, los cuales disuelven rápidamente
el mineral del esmalte, generando calcio y fosfato, los cuales difunden fuera del esmalte. Este
proceso se conoce como desmineralización y conlleva al desarrollo de la caries dental (Ojeda,
2013).
Enjuague Bucal
Concepto
Desde el punto de vista cosmético, los enjuagues bucales o colutorios son soluciones que
se usan luego del cepillado con el objetivo de eliminar gérmenes y bacterias. Existen
diferentes enjuagues bucales cuyo efecto varía en función de su composición. (Padilla, 2015).
El enjuague bucal consiste en solución que suele emplearse para realizar enjuagues sin
ingerir. Se considera un vehículo para que algunas sustancias activas entren en contacto con
la superficie de los dientes y de los tejidos de revestimiento de la boca (JOHNSON &
JOHNSON , 2014).
También ha sido definido como un elemento químico antibacteriano, representado en
forma líquida para lograr ser utilizado en la cavidad bucal donde cada elemento químico
antibacteriano ha sido capaz de eliminar las bacterias, impedir su metabolismo o su
reproducción (Chica, 2015).
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Clases de Enjuague bucal
Según la American Dental Association existen dos tipos de enjuagues bucales:
Los enjuagues bucales terapéuticos cuyo fin, dependiendo de su composición, es ayudar
a reducir la placa, la gingivitis, la caries y el mal aliento (ADA, 2016).
Los enjuagues cosméticos son aquellos que pueden controlar o reducir temporalmente el
mal aliento y dejar la boca con un sabor agradable, pero no solucionan las causas del mismo,
ni reducen la placa, la gingivitis o la caries (ADA,2016).
Enjuagues Bucales Naturales
Los enjuagues naturales se han considerado como un agente líquido que intervienen sobre
la “mucosa bucal, encías y lengua”, sin que alcance la garganta (López, 2012).
Se considera que los enjuagues bucales naturales son seguros ya que contienen
ingredientes de origen natural que son inocuos incluso si son ingeridos y aunque existen
muchos tipos de enjuagues bucales que están disponibles, elegir un enjuague bucal natural
es realmente una buena alternativa (Botanical-Online, 2015).
Es conocido que el uso excesivo de colutorios a base de agentes químicos provoca la
aparición de efectos secundarios, por eso se ha documentado sobre el uso de agentes
fitoterápicos en forma de enjuague bucal con el fin de prevenir, controlar y tratar problemas
dentales (Rodríguez, 2013).
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Solubilización de aceites esenciales
La mayoría de moléculas con actividad farmacológica y aceite esenciales no se disuelven
bien en agua purificada por lo tanto se hace uso de una serie de estrategias para disolver el
fármaco. Para ello se pueden emplear técnicas como: uso de cosolventes, formar sales
solubles, formación de complejos y emplear tensioactivos (emulsiones/microemulsiones/
nanoemulsiones).
Emulsiones
Una emulsión es un sistema constituidos por dos fases liquidas inmiscibles, una de las
cuales se dispersa a través de la otra en forma de gotículas muy pequeñas. La mayoría de
emulsiones de uso farmacéutico tienen gotículas dispersas con un diámetro de 0,1- 100 um
(Aulton, 2004).
La fase dispersa es aquella que forma las gotículas y la fase continua es aquella en la que
las gotitas se encuentran suspendidas. Las emulsiones son sistemas termodinámicamente
inestables como resultado del excesos de energía libre asociada a la superficie de la gotitas
y es por ello que para estabilizarla se requiere de un componente extra, el agente
emulsificante. Las emulsiones constituyen un medio útil para entregar drogas poco
hidrosolubles por vía oral o parenteral (Gennaro, 2000).
Según Gennaro,2000 existen dos tipos fundamentales de emulsiones:
Aceite en agua (o/w): Si la fase dispersa es aceite y la fase continua es agua
Agua en Aceite (w/o): Si la fase dispersa es agua y la fase continua es aceite, o un material
oleaginoso.
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Puede existir emulsiones más complejas dependiendo de la clase de componentes con el
que se forme el sistema, entre estos pueden existir emulsiones múltiples (w/o/w ó o/w/o)
que son de gran interés para administración de fármacos de acción retardada y también están
las microemulsiones (Gennaro, 2000).
Microemulsiones
Las microemulsiones están formadas por gotas extremadamente pequeñas (5- 140 nm)
constituyen un sistema homogéneo y transparente que, al contrario de las emulsiones, son
sistemas termodinámicante estables, no se separan y por lo tanto posibilita la uniformidad de
dosis (Aulton,2004).
Se forman espontáneamente al mezclar los componentes en proporciones apropiadas, para
ello se adiciona un cosurfactante, el cual permite obtener una tensión de superficie de
contacto baja la cual es requisito esencial para su formación (Aulton,2004).
Nanoemulsiones
Las nanoemulsiones exhiben las propiedades típicas de todas las emulsiones, pero con
algunos detalles determinados. Su tamaño de gota sub-micrométrico, típicamente se halla en
el rango 20-500 nm., las hace transparentes o translúcidas dependiendo de la distribución de
tamaño. Además, poseen un aspecto similar a las microemulsiones, pero se distinguen de
ellas por el hecho de que las nano-emulsiones no son sistemas en equilibrio termodinámico,
aunque pueden tener una elevada estabilidad cinética. Debido a su pequeño tamaño de gota,
las nanoemulsiones tienen mayor área interfacial y por lo tanto se requiere una mayor
cantidad de surfactante que en las macroemulsiones para estabilizarlas, pero esta cantidad es
inferior al porcentaje de surfactante que se necesita en una microemulsión (Forgiarini,2006).
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Preparación de Nanoemulsiones
La comprensión de la física de la formación de nanoemulsiones es fundamental para el
control del tamaño de las gotitas de nanoemulsión.
Las nanoemulsiones se preparan típicamente en un proceso de dos etapas en el que se
prepara en primer lugar una macroemulsión y luego se convierte en una nanoemulsión en
una segunda etapa. (Gupta, 2015)
Existen dos métodos fundamentales para la formación de nanoemulsiones: métodos de
alta energía y métodos de baja energía.
Métodos de Alta Energía
En los métodos de alta energía la densidad de energía de entrada es del orden de 108-1010
W kg (Gupta, 2015). Los métodos más empleados son la homogeneización a alta presión
(HPH) y el ultrasonido que generan la ruptura de la macroemulsión en gotitas más pequeñas.
Métodos de Baja Energía
En los métodos de baja energía, las gotitas más pequeñas se forman cuando el sistema
experimenta una inversión de fase en respuesta a cambios en la composición o temperatura,
y pasa por un estado de baja tensión interfacial.
Dos métodos descritos son: la técnica de punto de inversión de emulsión (EIP) que induce
una inversión de fase por dilución de agua, mientras que, el segundo la aproximación de
temperatura de inversión de fase (PIT) induce una inversión de fase al enfriar la mezcla
(Gupta, 2015).
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Figura 4.Métodos de Preparación de Nanoemulsiones
(Gupta, 2015)
Agentes emulsionantes – tensioactivos
La elección del agente emulsionante depende de las propiedades y componentes de cada
producto en particular. Por conveniencia de pueden dividir en dos grupos principales: agentes
tensioactivos sintéticos o semi-sintéticos y materiales de origen natural y sus derivados
(Aulton, 2004).
Agentes tensioactivos sintéticos o semi-sintéticos
Se dividen en cuatro categorías principales, dependiendo de su inonización en soluciones
acuosas: anionicos, catiónicos, no iónicos, anfotéricos (Aulton, 2004).
Materiales de origen natural y sus derivados
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Al ser de origen natural tienen ciertas desventajas en cuanto a la variación de su
composición y son propensos a contaminación por microorganismo. Se llaman naturales
porque provienen de componentes vegetales, estos componentes pueden ser el coco, palma,
maíz, babasú, etc (Valenzuela, 2016).
Caracterización de Nanoemulsiones
La caracterización de una nanoemuslión abarca los ensayos convencionales tales como:
organolépticos, densidad y pH.
También es importante evaluar parámetros como: el tamaño de glóbulo, el índice de
polidispersión (IPD) y el potencial Z; para ello se emplea la dispersión de luz dinámica
(DLS), la cual es una técnica no invasiva y bien establecida para medir el tamaño y
distribución de tamaño de moléculas y partículas típicamente en la región
submicrométrica.El análisis de tamaño de partícula se realiza empleando esta técnica y
dependiendo de las propiedades físicas de la muestra, el rango dinámico es de 0,3 nm a 8 μm
(HORIBA Scientific, 2017).
La carga sobre la superficie de las partículas se caracteriza por DLS, midiendo el potencial
zeta de la muestra. El cual, mediante una medición de la movilidad electroforética de
partículas, da como resultado el potencial zeta de la muestra; el cual se utiliza con mayor
frecuencia como indicador de la estabilidad. Valores de potencial zeta de gran magnitud
indican que una emulsión estabilizada electrostáticamente permanecerá estable (HORIBA
Scientific, 2017).
El mismo análisis también se puede usar para medir el índice de polidispersión (IPD). Este
indica la uniformidad de una distribución de tamaños, es decir cuántos tamaños diferentes
están presentes en el medio. Las distribuciones se conocen generalmente como
"monodispersas" si la polidispersión es <0,2 (Calderón, 2015).
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Fundamentación legal
La presente investigación se basa:
Constitución de la República del Ecuador, Registro oficial 449-de-20-oct-2008
Artículo 189.
¨ Los integrantes del Sistema Nacional de Salud respetarán y promoverán el desarrollo
de las medicinas tradicionales, incorporarán el enfoque intercultural en las políticas, planes,
programas, proyectos y modelos de atención de salud, e integrarán los conocimientos de las
medicinas tradicionales y alternativas en los procesos de enseñanza–aprendizaje. ¨
Artículo 359.
¨El sistema nacional de salud comprenderá las instituciones, programas, políticas,
recursos, acciones y actores en salud; abarcará todas las dimensiones del derecho a la
salud; garantizará la promoción, prevención, recuperación y rehabilitación en todos los
niveles; y propiciará la participación ciudadana y el control social. ¨
Artículo 363.
Numeral 4:
¨ Garantizar las prácticas de salud ancestral y alternativa mediante el reconocimiento,
respeto y promoción del uso de sus conocimientos, medicinas e instrumentos. ¨
Numeral 7:
¨ Garantizar la disponibilidad y acceso a medicamentos de calidad, seguros y eficaces,
regular su comercialización y promover la producción nacional y la utilización de
medicamentos genéricos que respondan a las necesidades epidemiológicas de la población.
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En el acceso a medicamentos, los intereses de la salud pública prevalecerán sobre los
económicos y comerciales. ¨
Hipótesis
Hi: La combinación apropiada de solubilizante y cosolventes permiten obtener un
enjuague bucal a base de aceite esencial de jengibre con actividad frente a S. mutans
Ho: La combinación apropiada de solubilizante y cosolventes no permiten obtener un
enjuague bucal a base de aceite esencial de jengibre con actividad frente a S. mutans.
Sistema de Variables
Independientes
• Cantidad de solubilizante: gramos de solubilizante a utilizarse por cada 100 g
formulación
• Cantidad de cosolvente: gramos de la mezcla etanol – glicerina ( 4:1) a utilizarse por
cada 100 g formulación
Dependientes
• Tamaño de los glóbulos: tamaño de gota, que contiene la fase dispersa,
presente en la emulsión. Es medido en la escala de um y nm, para ello se utiliza
equipos como el DLS.
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• Índice de Polidispersión: indica la uniformidad de una distribución de tamaños
de gota, es decir cuántos tamaños diferentes están presentes en el medio. Se mide
empleando el equipo DLS. Valores de la polidispersión cercanos a 0 indican un
sistema ¨monodisperso¨.
• Potencial Z: El potencial Z es una medida de la magnitud de la repulsión o
atracción entre las partículas. Se mide empleando una celda con electrodos revestidos
de carbono en el DLS, los valores óptimos se encuentran en el rango de superior a +
30 mV o inferior a -30 Mv.
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Capítulo III
Metodología de la investigación
Diseño de la investigación
La investigación del presente trabajo se basa en el paradigma cuantitativo ya que se fija
en una realidad objetiva y se apoya en las técnicas estadísticas, sobre todo en el análisis
estadístico de datos. La modalidad a emplearse es explicativo por tener una relación causal y
aplicar el análisis de varianza ADEVA; el tipo de investigación a realizarse es aplicada ya
que tienen como objetivo resolver un determinado problema o planteamiento especifico y
busca la generación de conocimiento con aplicación directa a los problemas de la sociedad.
Para el efecto se desarrollará un enjuague bucal profiláctico en base a aceite esencial de
Zingiber officinale con actividad frente a Streptococcus mutans, empleando diferentes tipos
y cantidades de solubilizante, en la Planta Piloto de Tecnología Farmacéutica y Laboratorio
de Nanoestructuras de la Facultad de Ciencias Químicas - Universidad Central del Ecuador.
Población y Muestra
La población no aplica en este modelo de estudio ya que no se utilizarán sujetos, se
realizarán análisis a partir de reactivos químicos y métodos instrumentales.
La muestra está representada por las diferentes formulaciones de enjuague bucal
desarrollado, empleando diferentes tipos y cantidades de solubilizante, en la Planta Piloto de
Tecnología Farmacéutica de la Facultad de Ciencias Químicas y Laboratorio de
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Nanoestructuras- Universidad Central del Ecuador; las cuales serán sometidas a pruebas de
estabilidad física, tamaño de glóbulo e índice de polidispersión (IPD).
Métodos y Materiales
Métodos
Análisis del aceite esencial de Zingiber officinale
Apariencia visual, color, olor
Se identificó la apariencia y color del aceite visualmente, el olor mediante el olfato. Luego
se comparó con la especificación de la ficha técnica y se determinó el cumplimiento.
Densidad
El presente método se basó en: <841> PESO ESPECÍFICO (USP 39, 2016).
Se seleccionó un picnómetro de 5 mL limpio y seco. Se calibró el picnómetro mediante la
determinación de su peso y el peso de agua destilada contenida en él a 25°C.
Se ajustó la temperatura del aceite a 25 °C y se llenó el picnómetro con el aceite. Luego
se retiró todo el exceso del mismo empleando una toalla absorbente y se pesó. Finalmente,
se restó el peso de tara del picnómetro del peso llenado.
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La densidad determinada es el cociente que se obtuvo al dividir el peso del aceite
contenido en el picnómetro por el peso del agua contenida en este, y se comparó con
especificación de la ficha técnica.
Índice de refracción
El presente método se basó en: <831> ÍNDICE DE REFRACCIÓN (USP39, 2016).
Se determinó empleando el refractómetro, para ello se adaptó una cabina con un baño
María para permitir que el refractómetro se ambiente a 25 °C, al llegar a la temperatura
adecuada se colocó aproximadamente 1 mL de agua destilada tipo 1 en el lente y se enceró
el refractómetro, luego se colocó aproximadamente 1 mL de aceite en la lente y se precedió
a la determinación del índice de refracción. Finalmente se comparó con la especificación de
la ficha técnica.
Solubilidad en Alcohol
Se midió 1 mL de aceite esencial empleando una pipeta y se colocó en un tubo de ensayo,
luego se disolvió con 1 mL de etanol 96° y se comparó con la especificación de la ficha
técnica.
Determinación de la CMI del aceite esencial de Zingiber officinale por el método de
macrodilución en caldo
El presente método fue adaptado a partir de ¨MÉTODO DE DETERMINACIÓN DE
SENSIBILIDAD ANTIMICROBIANA POR DILUCIÓN¨ (NCCLS,2012)
32
La prueba se realizó en tubos de ensayo, se hicieron 10 diluciones en TSB con Tween 20
al 2% a partir de la concentración inicial (214,26 mg/mL de α-zingibereno) del aceite de
jengibre. Para ello se realizó diluciones del aceite como indica la Tabla -1. Este proceso se
hizo por duplicado.
Primero se realizó 10 diluciones seriadas, con un factor de dilución igual a 2, a partir de 1
mL de aceite esencial al cual se le agregó 1 mL del medio de cultivo con Tween 20. Luego a
la serie de diluciones elaboradas se les agregó 1 mL de inóculo estandarizado, generando otra
dilución, y se homogenizó la mezcla empleando un vórtex.
Para la estandarización se resuspendió el microorganismo en caldo TSB a partir de una
placa de agar sangre overnight (48 hs), después se ajustó a turbidez equivalente al 0.5 Mc
Farland.
Se dejó, como control, un tubo que contenga caldo sin aceite esencial más 1 mL de
inóculo estandarizado. Finalmente se tapó los tubos empleando tapas de gasa estériles.
Tabla 1. Preparación de las diluciones
Paso Concentración
(ug/mL)
Recurso Volumen
(mL)
TSB
+ Tween
20 (mL)
Concentración
intermedia
(ug/mL)
Concentración
final al agregar el
inóculo
1 214263,00 Aceite
esencial
1 1 107131,50 53565,75
2 107131,50 Paso 1 1 1 53565,75 26782,88
3 53565,75 Paso 2 1 1 26782,88 13391,44
4 26782,88 Paso 3 1 1 13391,44 6695,72
5 13391,44 Paso 4 1 1 6695,72 3347,86
6 6695,72 Paso 5 1 1 3347,86 1673,93
7 3347,86 Paso 6 1 1 1673,93 836,96
8 1673,93 Paso 7 1 1 836,96 418,48
9 836,96 Paso 8 1 1 418,48 209,24
10 418,48 Paso 9 1 1 209,24 104,62
(Navarro, 2017)
33
Incubación
Los tubos se incubaron en anaerbiosis a 35 ± 2°C durante 48 hs antes de leer la CIM. La
CIM es la menor concentración de aceite capaz de inhibir completamente el desarrollo
bacteriano en el tubo. Con el fin de verificar se trasladó una asada calibrada a 0,1 mL, de los
tubos que no presentaron turbidez aparente, a una placa de agar sangre y se incubó en
anaerbiosis a 35 ± 2°C durante 48 hs para verificar que no hay crecimiento.
Elaboración de enjuague bucal en base a aceite esencial de Zingiber officinale
Preparación de soluciones
Solución de Emulgin® CO 40
Se preparó una solución de Eumulgin® CO 40 al 13,14% empleando agua destilada tipo
1 y se dejó la mezcla en agitación constante hasta completa homogeneización.
Solución de Etanol: Glicerina
Se elaboró una solución de etanol: glicerina en relación 4:1 en peso y se mezcló por 5
minutos.
Elaboración de enjuague bucal
1. En un vaso de precipitación se pesó la solución de Eumulgin® CO 40, en ella
se dispersaron 3,56 gramos del aceite esencial de Zingiber officinale y se agitó por 5
minutos en el agitador magnético a velocidad 5.
34
2. En otro vaso se pesó la solución de etanol:glicerina y en ella se solubilizaron
0,5585 g de sacarina sódica y 0,7077 g de citrato de sodio. Se agitó por 5 minutos en
el agitador magnético a velocidad 5.
3. En un tercer vaso se pesó el agua y en ella se disolvieron 17,5 gramos de
sorbitol al 70%. Se agitó por 5 minutos en el agitador magnético a velocidad 5.
4. Sobre la solución del punto 3, se agregaron las de los puntos 1 y 2. Se agitó
por 10 minutos en el agitador magnético a velocidad 5, después se homogeneizó por
2 intervalos de 40 segundos en el Ultraturrax a velocidad 4. Finalmente, se sonicó la
mezcla por 3 minutos a una amplitud del 33% de la escala en el Utrasonido.
5. Almacenar la muestra a temperatura ambiente en un tubo de ensayo con tapa
rosca protegido de la luz.
Determinación del tamaño de glóbulo e Índice de Polidispersión (IPD)
La determinación se realizó empleando el equipo de Dispersión de luz dinámica (DLS SZ-
100) que permite medir el tamaño de glóbulo y el índice de polidispersión (IPD) de una
emulsión o suspensión.
Para ello se utilizó una celda de vidrio de 2 caras, propia del equipo. Previamente se
setearon condiciones de la medición como el índice de refracción de la muestra y del medio
de dispersión, medida que se tomó en el refractómetro.
35
Potencial Z
La determinación se realizó empleando Dispersión de luz dinámica (DLS SZ-100) que
permitió obtener la medida del potencial zeta de la emulsión, usando una celda desechable
con electrodos revestidos de carbono.
Determinación del tipo de emulsión
Se agregó 3 mL de la emulsión preparada en 2 tubos de ensayo, a continuación, se agregó
una gota de azul de metileno en un tubo y una gota de colorante rojo oleoso en otro tubo, se
dejó reposar por 5 minutos.
Se determinó el tipo de emulsión o/w ó w/o en función a la miscibilidad que presentó la
emulsión a cada colorante.
Escaneo en Microscopio de fuerza atómica (AFM)
Se realizó una dilución 1:100 y 1:625 de la emulsión con agua tipo I, se colocó una gota
de cada dilución en un cubreobjetos y se dejó secar en la estufa a 30 °C por 2 semanas.
Se colocaron las muestras secas en un portaobjetos metálico empleando una cinta doble
faz, este sistema se colocó en el portamuestras magnético del AFM. Se ajustaron parámetros
de área de escaneo, velocidad de escaneo y modo de escaneo. Finalmente se realizó un
acercamiento automático y se analizó la muestra.
Estabilidad Física
Las muestras acondicionadas en tubos de ensayo con tapa rosca, envueltos en papel
aluminio, se sometieron a una temperatura de 30°C, empleando la estufa, y a condiciones
36
ambientales por 30 días. Se midió el tamaño de glóbulo y el IPD en los días 0,1,8,14,21 y 30
utilizando el DLS.
El día 30 se midió el tamaño de glóbulo y el IPD de la formulación sin agitar y luego de
ser agitada en el vórtex por 40 segundos.
Control microbiológico (aerobios totales (ufc/g o mL), hongos y levaduras (ufc/g o
mL)
El presente método será adaptado a partir de ¨ <61> EXAMEN MICROBIOLÓGICO
DE PRODUCTOS NO ESTÉRILES: PRUEBAS DE RECUENTO MICROBIANO¨
(USP36, 2013)
Se preparó una dilución 1:10 de la muestra (enjuague bucal) en Caldo Digerido de Caseína
y Soja (TSB), con el fin de neutralizar el alcohol presente en la formulación.
En placas de Petri se agregó 1 mL de la muestra preparada y de 15 a 20 mL de Agar
Digerido de Caseína y Soja (TSA) o Agar Sabouraud Dextrosa, manteniendo la temperatura
de ambos medios a no más de 45º. Se preparó tres placas de Petri de TSA y tres de Agar
Sabouraud Dextrosa.
Se incubó las placas de TSA a una temperatura de 35±2 °C durante un período de 3 días
y las placas de Agar Sabouraud Dextrosa a condiciones ambientales durante un período de 7
días. Al finalizar los días de incubación; se contó las colonias y se determinó el cumplimiento
según la especificación establecida.
37
Comprobación de la actividad antibacteriana del enjuague bucal mediante el
método de difusión en agar
El presente método será adaptado a partir de ¨METODO DE DETERMINACIÓN DE
SENSIBILIDAD ANTIMICROBIANA POR DIFUSIÓN¨ (NCCLS,2012)
Se resuspendió el microorganismo en caldo TSB a partir de una placa de agar sangre
overnight (20 hs) y se ajustó a turbidez equivalente al 0.5 Mc Farland.
Luego se preparó y esterilizó medio de cultivo Agar Mueller Hinton enriquecido con
sangre. Se preparó 3 placas de este medio.
Una vez preparado el inoculo se tomó una cantidad con un hisopo estéril de la bacteria y
se hisopó las placas de agar sangre extendiendo sobre toda la superficie y se secó durante
unos 5 minutos.
Se perforó cada placa (cuatro veces) con un sacabocados estéril y se añadió 50 ul de las
muestras a probar dejando en reposo por 30 minutos. También se preparó un control negativo
de bacterias (solo con medio de cultivo, TSB), un control positivo con el medicamento de
referencia (Clorhexidina 0,04%) y un placebo (formulación sin aceite esencial).
Luego se procedió a tapar las placas e incubar por 48 horas a 35±2°C en atmósfera con
5% de CO2. Transcurrido este tiempo, se midió el diámetro de los halos de inhibición en
cada una de las cajas.
38
Materiales
Equipos
• Balanza analítica Mettler Toledo
• Balanza granataria
• DLS Horiba SZ-100
• Refractómetro ATAGO
• Agitador magnético IKA-WERKE Rt-5
• Ultra Turrax IKA TIOB51
• Dispersador Ultra Turrax SION-5G
• Microscopio de Fuerza Atómica Park Systems NX10
• Potenciómetro Inlab
• Centrífuga MLW
• Vórtex Fisher Scientific
• Ultrasonido ULTRASONIC PROCESSOR
• Estufa Memmert
• Picnómetro
• Cocineta
• Termómetro
• Incubadora THELCO MODEL 6
• Autoclave PBI International
• Cabina de flujo laminar FLOW 100 V
Materiales
• Placas Petri de plástico
• Porta y cubreobjetos
• Asa de inoculación
• Asa de inoculación calibrada 0,1 mL
• Hisopos
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• Tubos de ensayo estériles y no estériles
• Sacabocados
• Pipeta automática (20ul- 200ul)
• Pipetas (1 mL, 5mL, 10 mL)
• Probeta graduada
• Vasos de precipitación
• Gradilla
• Varilla de agitación
• Pera de succión
• Celda de vidrio
• Celda desechable con electrodos revestidos de carbono
• Jeringas 10 mL
• Balón aforado 100 mL
• Balón aforado 10 mL
• Agitador magnético
Materias primas y reactivos
• Aceite esencial de Zingiber officinalis de la Fundación Chankuap
• Medio Triptic Soya Broth (TSB)
• Medio Triptic Soya Agar (TSA)
• Medio Mueller Hinton Agar
• Sangre desfibrinanda
• Agua purificada estéril
• Agua Tipo I
• Streptoccocus mutans (ATCC 25175 – Código 0266P)
• Eumulgin® CO 40
• Sacarina sódica
• Citrato de sodio
• Glicerina
40
• Sorbitol 70%
• Etanol 96%
• Azul de metileno
• Colorante rojo oleoso
Diseño experimental
El presente estudio se dividió en cuatro etapas según el autor:
Etapa 1
Se realizó la investigación bibliográfica acerca del aceite esencial a usar, métodos de
análisis de la actividad antibacteriana y todo lo relacionado al desarrollo del colutorio.
Con el fin de reducir el número de variables de investigación, se llevaron a cabo pruebas
preliminares donde se hicieron ensayos sobre velocidad de agitación, concentración de la
solución de Emulgin CO 40 e interacciones entre los componentes.
Etapa 2
Se realizó el análisis del aceite esencial de Zingiber officinale y se determinó la CMI del
aceite esencial. Se empleó la técnica de dilución en caldo y se hizo 2 réplicas para obtener
un valor de CMI confiable dentro del cual se desarrolló la formulación para garantizar la
actividad antibacteriana.
41
Etapa 3
Esta etapa corresponde al desarrollo del colutorio, para ello se emplearon 3 factores que
varían en función de su cantidad: Eumulgin® CO 40, la mezcla etanol:glicerina (en relación
4:1) y agua. Se analizó el tamaño de glóbulo, IPD, y potencial Z, con el fin de determinar
cuál es la mejor formulación en base a esas características. En esta etapa de empleó el diseño
experimental de mezclas Simplex-Centroid y la Optimización de Múltiples Respuestas
diseños que fueron aplicados empleando el programa STATGRPHICS Centurion.
Etapa 4
Finalmente se efectuó la caracterización de la fórmula óptima. Para ello se realizó la
determinación de tamaño de glóbulo, polidispersión, estabilidad física, pH, densidad,
características organolépticas, control microbiológico y la verificación de la actividad
antibacteriana.
Para la verificación de la actividad antibacteriana se determinó la sensibilidad mediante el
Método de Difusión en Agar, con el fin de conocer la significancia de las medidas de los
halos se aplicó un diseño de bloques completamente al azar (DBCA) empleando el programa
STATGRPHICS Centurion.
Análisis estadístico
Se empleó el diseño experimental de mezclas Simplex-Centroid, el cual consiste de 2q -
1 corridas en todas las mezclas primarias, mezclas binarias, mezclas terciarias, etc, hasta el
diseño centroide (STAGRAPHICS, 2006). Se realizó tratamientos combinados de 3 factores
a variar (Tabla-2 y 3) y de esta manera se encontró una combinación óptima que alcance un
tamaño de glóbulo, IPD y potencial Z adecuados.
42
El tipo de modelo estadístico aproximado fue el Cúbico especial y posteriormente se
aplicó un análisis de varianza (ADEVA) junto con el error estándar de la estimación y el R-
Cuadrado ajustado para probar si el tipo de modelo se ajusta adecuadamente.
Tabla 2. Variables de formulación
Nombre Bajo Alto Unidades
Emulgin CO 40 10 40 gramos
Mezcla-
Etanol:Glicerina
30 60 gramos
Agua 20 50 gramos
Total de la mezcla 90 gramos
(Navarro, 2017)
Tabla 3. Tratamientos establecidos para el diseño Simplex-Centroid
Tratamiento Emulgin CO 40 (g) Mezcla etanol-
glicerina 4:1
(g)
Agua (g) Total (g)
1 18,45 34,42 37,13 90,00
2 14,75 48,05 27,20 90,00
3 26,33 37,22 26,45 90,00
4 31,55 32,01 26,44 90,00
5 12,03 44,55 33,42 90,00
6 19,38 40,40 30,22 90,00
7 10,88 54,73 24,40 90,00
8 23,41 43,88 22,70 90,00
9 13,12 33,19 43,70 90,00
10 22,67 33,65 33,68 90,00
(Navarro, 2017)
Posterior a la realización del diseño, con los resultados arrojados por el estudio, se
procedió a realizar la estimación de los valores óptimos. La Optimización de Múltiples
Respuestas permitió determinar las configuraciones de los factores experimentales que
cubren las características deseadas.
43
Para la verificación de la actividad antibacteriana se determinó la significancia de las
medidas de los halos aplicando un diseño de bloques completamente al azar (DBCA) junto
con el análisis de varianza ADEVA, y para determinar la homogeneidad entre grupos se
utilizó la prueba de múltiples rangos (FISHER 5%).
Matriz de Operacionalización de las Variables
Variables Dimensiones Indicadores
Tamaño de glóbulo um 0,1 – 1 um
Índice de polidispersión IPD La distribución se conoce
generalmente como
"monodispersas" si la
polidispersión es <0,3.
Potencial Z mV Superior a + 30 mV o
inferior a -30 mV
(Navarro,2017)
Técnicas e Instrumentos de Recolección y procesamiento de Datos
Se anotó los datos obtenidos (tamaño de glóbulo, IPD) así como todas las observaciones
hechas durante la experimentación en un cuaderno de laboratorio que sirvió como guía de
observación.
Los datos obtenidos fueron procesados en el programa STATGRAPHICS Centurion.
44
Técnicas de Procesamiento de Datos
Se aplicó un análisis de varianza (ADEVA) para probar si el tipo de modelo se ajusta,
donde el valor-P es asociado a probar la hipótesis nula de que el modelo no explica cualquier
variabilidad en la respuesta. Y se escogió el modelo adecuado (lineal, cúbico o cúbico
especial) en base a este estadístico y en base a los Resultados Completos del Modelo que
muestran el error estándar de la estimación y el R-Cuadrado ajustado. En general, el modelo
con el error estándar más pequeño y el R-Cuadrado ajustado más alto será el modelo
seleccionado
Posterior a la realización del diseño con los resultados arrojados por el estudio se procedió
a realizar la estimación de los valores óptimos de componentes (Optimización de Múltiples
Respuestas) que den valores adecuados de tamaño glóbulo, IPD y potencial Z.
Para la verificación de la actividad antibacteriana se realizó el análisis de varianza
ADEVA con el fin de determinar si la formulación tiene un efecto significativo sobre los
halos (sensibilidad al microorganismo) ; y para determinar la homogeneidad entre grupos
(muestras) se utilizó la prueba de múltiples rangos (FISHER 5%)
45
Capítulo IV
Análisis y discusión de resultados
Etapa 1
Pruebas preliminares
Se realizaron ensayos durante cuatro semanas en las que se determinaron interacciones
entre las variables de proceso: velocidad de agitación y tiempo de agitación, y la de
formulación: concentración de la solución de Emulgin CO 40.
Los ensayos y resultados obtenidos se describen a continuación:
Interacciones entre los componentes
Se fabricaron 4 muestras las cuales contenían todos los componentes descritos en la Tabla
16, donde se cambiaba el citrato de sodio por: ácido cítrico y benzoato de sodio, se observó
si estos excipientes provocaban algún cambio físico en la fórmula a las 24 horas de reposo.
Tabla 4. Resultados Interacciones entre los componentes
Muestra Compontes Resultado 24 horas
1 Citrato de sodio Emulsión blanca, se separan las fases
2 Ácido cítrico Emulsión blanca, se separan las fases
3 Benzoato de sodio Emulsión blanca, se separan las fases y se observa la
producción de precipitado blanco pulverulento
(Navarro,2017)
Se determinó que la presencia de benzoato de sodio genera un precipitado blanco
pulverulento en la emulsión, por lo tanto, fue retirado de la formulación. Debido a que la
presencia de ácido cítrico provocó un pH muy ácido en la emulsión, no se colocó este
excipiente.
46
Velocidad de Agitación
Pruebas con el Agitador Magnético
Con el fin de determinar la velocidad adecuada para solubilizar totalmente los
componentes sólidos de la formulación en la mezcla etanol: glicerina, y en la solución de
Emulgin CO 40, se realizaron pruebas empleando el agitador magnético.
Se iniciaron las pruebas desde la velocidad 1 observando cuál velocidad permite una
mayor solubilización de los componentes de la fórmula en 5 minutos para las premezclas, y
10 minutos para la mezcla final, con el agitador magnético disponible. Los resultados se
muestran en la Tabla 5.
Tabla 5. Pruebas velocidad de agitación- Agitador magnético
Velocidad Solubilización
en 5 minutos
Solubilización
en 10 minutos
1 Pobre Parcial
2 Pobre Parcial
3 Parcial Parcial
4 Parcial Parcial
5 Parcial Total
(Navarro,2017)
La velocidad escogida (5) permitió una solubilización completa de los componentes y no
generaba una corriente demasiado turbulenta con el agitador magnético.
Pruebas de Homogeneización con Ultra Turrax
Con el Ultra Turrax se realizaron ensayos a partir de la velocidad 2 y en intervalos dobles
de 20 y 40 segundos; para elegir la velocidad y tiempo adecuados se leía cada muestra en el
DLS, finalmente se escogió la velocidad y tiempo que generaron glóbulos más pequeños.
47
Tabla 6. Pruebas velocidad de agitación- Ultra Turrax
Velocidad Tamaño de
glóbulo (um) en 20
segundos
Tamaño de
glóbulo (um) en 40
segundos
2 >3 >3
3 >3 >3
4 >3 1-2
(Navarro,2017)
La Tabla 6 refleja los parámetros escogidos: velocidad 4 por dos intervalos de 40
segundos, estos fueron los más adecuados generando una cizalla que permitió obtener
glóbulos en el orden de los um sin inestabilizar las muestras. Es importante mencionar que
un aumento indiscriminado de la velocidad no genera necesariamente partículas más
pequeñas, pero lo sí puede provocar es una inversión de fases de la emulsión.
Concentración de la solución de Emulgin CO 40
La concentración de la solución Emulgin CO 40 se probó desde el 0,1%, la cual es la
Concentración Micelar Crítica o CMC (Matsaridou, 2012), hasta el 13% con el fin de utilizar
la menor cantidad posible del emulgente. Para seleccionar la concentración adecuada se
dejaba reposar por 24 horas las emulsiones preparadas y se medía la separación de las fases.
Tabla 7. Pruebas concentración de Emulgin CO 40
Concentración (%) mm de
separación
0,1 >3
0,3 >3
1,0 >3
3,8 >3
5,0 >3
12,2 >3
13,0 1-1,5
(Navarro,2017)
48
La Tabla 7 muestra la altura de la capa de la fase orgánica medida en el ensayo; la
concentración elegida (13%) generaba una capa menor a 3mm.
Etapa 2
Análisis del aceite esencial de Zingiber officinale
Se realizaron ensayos para la apariencia visual, color, olor, densidad, índice de refracción
y solubilidad en alcohol, se determinó el cumplimiento en base a la ficha técnica.
Tabla 8. Resultado Análisis del aceite esencial de Zingiber officinale
Análisis Especificación Resultado Cumple/ No
cumple
Apariencia visual Líquido aceitoso
transparente
Líquido aceitoso
transparente
Cumple
Color Ligeramente
amarillo
Ligeramente
amarillo
Cumple
Olor Típica nota a especia Típica nota a especia Cumple
Densidad (g/mL) 0,890-0,900 0,903 No Cumple
Índice de
Refracción
1,47-1,49 1,49 Cumple
Solubilidad en
alcohol
Completamente
soluble en alcohol 96°
Completamente
soluble
Cumple
(Navarro,2017)
Los resultados del análisis muestran que el aceite empleado en la elaboración de la
emulsión está dentro de las especificaciones físicas determinadas por el proveedor, excepto
para el caso de la densidad, parámetro que está ligeramente por sobre el límite y que puede
variar de función de la temperatura, la balanza y los implementos en general. Cabe mencionar
que este parámetro es susceptible al tiempo de almacenamiento por evaporación de
componentes.
49
Determinación de la CMI del aceite esencial de Zingiber officinale por el método de
macrodilución en caldo
El ensayo se realizó por duplicado. Se partió de la concentración 214,26 mg/ mL calculada
a partir del porcentaje de α-Zingibereno declarado en la ficha técnica del aceite; la elección
de este compuesto, para los cálculos de la CMI, se debe a que es una de los componentes al
que se le atribuye la actividad antimicrobiana y se encuentra en mayor cantidad en el aceite
esencial. Los resultados del ensayo se muestran en la Tabla 9.
Tabla 9. Resultado de la determinación de la CMI del aceite esencial de Zingiber
officinale
Dilución
Concentración
mg/ mL
Resultado crecimiento Resultado cultivo en placa
Repetición
1
Repetición
2
Repetición
1
Repetición
2
1 53,57 - - - -
2 26,78 - - - -
3 13,39 - - - -
4 6,70 - - - -
5 3,35 + +
6 1,67 + +
7 0,84 + +
8 0,42 + +
9 0,21 + +
10 0,10 + +
(Navarro,2017)
Luego de la incubación se observó la turbidez de cada una de las diluciones de aceite, la
presencia de turbidez (+) indicaba crecimiento bacteriano. Las diluciones 1-4 no mostraron
turbidez aparente por lo que una asada se sembró en placas de agar a partir de dicha
concentración. Finalmente, luego de revelar el resultado de las placas de agar se determinó
que la CMI del aceite frente a S. mutans es 6,70 mg/mL de α-Zingibereno.
50
Con el fin de conocer la cantidad exacta de aceite a usar en la formulación se realizó las
correcciones y cálculos pertinentes a partir del resultado obtenido, y se determinó que la
cantidad a usarse en la formulación es 2,79 g de aceite esencial por cada 100 mL. Se
consideró una sobredosificación del 15 % para compensar pérdidas en el proceso, en el
almacenamiento y asegurar la actividad antibacteriana, con ello la concentración final fue de
3,22 g de aceite esencial de jengibre por cada 100 mL de enjuague.
Etapa 3
Elaboración de enjuague bucal en base a aceite esencial de Zingiber officinale
Se elaboró el enjuague bucal siguiendo el proceso descrito en el Capítulo III, para ello se
aplicó el diseño experimental de mezclas Simplex-Centroid propuesto, el cual plantea la
realización de 10 formulaciones con distintas proporciones de los factores a probar, los
resultados obtenidos se muestran en la Tabla 10.
Tabla 10. Resultados diseño experimental de mezclas Simplex-Centroid
Emulgin
(g)
Mezcla
4:1
(g)
Agua
(g)
Total
(g)
Tamaño
de glóbulo
(um)
IPD Potencial
Z
(mV)
18,45 34,42 37,13 90,00 0,7 0,49 0,13
14,75 48,05 27,20 90,00 1,5 0,72 0,23
26,33 37,22 26,45 90,00 1 0,61 0,00
31,55 32,01 26,44 90,00 1,5 0,59 0,10
12,03 44,55 33,42 90,00 0,6 0,84 42,03
19,38 40,40 30,22 90,00 0,8 0,57 0,07
10,88 54,73 24,40 90,00 0,8 0,76 0,10
23,41 43,88 22,70 90,00 0,7 0,56 0,13
13,12 33,19 43,70 90,00 1,1 0,72 0,03
22,67 33,65 33,68 90,00 1,2 0,54 0,20
(Navarro,2017)
Luego se procedió a correr el diseño en el programa STATGRAPHICS Centurion y se
escogió el modelo adecuado (lineal, cúbico o cúbico especial) en base al valor P y al error
estándar de la estimación y el R-Cuadrado ajustado. En general, se escoge el modelo que
51
tenga un valor P menor a 0,05 o con el error estándar más pequeño y el R-Cuadrado ajustado
más alto.
Diseño de mezclas Simplex-Centroid
Tamaño de glóbulo
Tabla 11. ANOVA modelo Lineal para el tamaño de glóbulo
Fuente Suma de Cuadrados
Gl Cuadrado Medio
Razón-F Valor-P
Modelo Lineal 0,142382 2 0,0711912 0,60 0,5734 R-cuadrada (ajustada por g.l.) = 0,0 porciento Error estándar del est. = 0,34364
Error total 0,826618 7 0,118088 Total (corr.) 0,969 9
(Navarro,2017)
Esta Tabla muestra un análisis de varianza para el modelo lineal. Dado que el valor-P
para este modelo es mayor que 0,05, no hay una relación estadísticamente significativa entre
tamaño de glóbulo y los componentes, con un nivel de confianza del 95,0%. Es decir, este
modelo no tiene una significancia estadística al igual que los otros 2 probados en este diseño,
aun así, el modelo Lineal, que muestra la Tabla-11, presentó un error estándar más pequeño
por lo que fue seleccionado. El estadístico R-cuadrada ajustada tuvo el mismo valor en los 3
modelos probados.
Índice de Polidispersión (IPD)
Tabla 12. ANOVA modelo Cuadrático para el IPD
Fuente Suma de Cuadrados
Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P
Modelo Cuadrático 0,103955 5 0,020791 7,96 0,0332 R-cuadrada (ajustada por g.l.) = 79,4565 porciento Error estándar del est. = 0,051101
Error total 0,0104452 4 0,00261131 Total (corr.) 0,1144 9
(Navarro,2017)
Esta Tabla muestra un análisis de varianza para el modelo cuadrático. Dado que el valor-
P para este modelo es menor que 0,05, existe una relación estadísticamente significativa entre
IPD y los componentes, con un nivel de confianza del 95,0%; es decir este modelo es el que
52
mejor significancia estadística posee para explicar los datos. Este modelo posee el error
estándar más pequeño y el R-Cuadrado ajustado más alto, de los 3 modelos probados, por lo
cual fue seleccionado.
Potencial Z
Tabla 13. ANOVA modelo Cúbico Especial para el potencial Z
Fuente Suma de Cuadrados
Gl Cuadrado Medio
Razón-F Valor-P
Modelo Cúbico Especial
1481,93 6 246,988 7,43 0,0641 R-cuadrada (ajustada por g.l.) = 81,0943 porciento Error estándar del est. = 5,76399
Error total 99,6708 3 33,2236 Total (corr.) 1581,6 9
(Navarro,2017)
Esta Tabla muestra un análisis de varianza para el modelo cúbico especial. Dado que el
valor-P para este modelo es mayor que 0,05, no hay una relación estadísticamente
significativa entre Potencial Z y los componentes, con un nivel de confianza del 95,0%. Este
modelo no tiene una significancia estadística al igual que los otros 2 probados en este diseño,
aun así el modelo Cúbico Especial, que muestra la Tabla-13 , presentó un error estándar más
pequeño y el R-Cuadrado ajustado más alto, de los 3 modelos probados, por lo cual fue
seleccionado.
Luego de establecer los modelos que mejor explican cada variable respuesta, se procedió
a realizar la optimización.
Optimización de Múltiples Respuesta
Tabla 14. Parámetros Establecidos en función a la Deseabilidad
Nivel de Deseabilidad
Nivel de Deseabilidad
Respuesta Baja Alta Meta Tamaño 0,6 1,5 Minimizar
IPD 0,49 0,6 Minimizar Potencial Z 0,2 40,0 Maximizar
(Navarro,2017)
53
La Tabla 14 muestra los parámetros establecidos para la optimización de la formulación.
La meta a alcanzar se estableció en función a los indicadores de la operacionalización de
variables y los datos obtenidos para el diseño de mezclas.
Tabla 15. Valores de la Optimización en función a la Deseabilidad
Factor Bajo Alto Óptimo Respuesta Óptimo Emulgin 10,0 40,0 17,845 Tamaño 0,989751
Mezcla 4:1 30,0 60,0 34,7414 IPD 0,569502 Agua 20,0 50,0 37,4136 Potencial Z 1,87323
(Navarro,2017)
La Tabla 15 muestra la combinación de niveles de factores que maximiza la función de
‘deseabilidad’ en la región indicada. También muestra la combinación de factores a la cual
se alcanza el óptimo.
La función de deseabilidad permitió obtener un gráfico de contornos de la superficie
respuesta estimada el cual se muestra en la Figura 5.
Figura 5. Gráfico de Contornos de la Superficie Respuesta Estimada para la optimización en función a la Deseabilidad
El círculo rojo en la Figura 5, región azul, muestra la zona donde las proporciones de los
componentes permiten obtener la formulación óptima en base a la deseabilidad. Como se
Emulgin=40,0
Mezcla 4:1=60,0 Agua=50,0Emulgin=10,0
Mezcla 4:1=30,0Agua=20,0
Contornos de la Superficie de Respuesta Estimada
Deseabilidad0,0-0,10,1-0,20,2-0,30,3-0,40,4-0,5
54
puede observar el punto óptimo recae en una zona (D= 0,1-0,2) donde la deseabilidad no
alcanza su valor máximo (D=1) que indique la total conformidad con la meta deseada, esto
se debe a que en problemas de optimización multirespuesta es difícil encontrar un punto
factible donde todas las respuestas tengan su valor óptimo (Dominguez, 2006). Por ello se
estableció metas especificadas que tuvieron un grado de conformidad deseable por parte del
experimentador (Tabla 14). En base a los valores óptimos (Tabla 15) se fabricó una
formulación a la cual se realizó ajustes de pH y se sometió a sonicación, con el fin de
disminuir el tamaño de glóbulo y dar mayor estabilidad a la fórmula.
En función de lo anterior, se elaboró un enjuague bucal en base a aceite esencial de
Zingiber officinale siguiendo la fórmula declarada en la Tabla 16.
Tabla 16. Fórmula de manufactura
Nombre del material % en peso
Aceite esencial de Zingiber officinale 3,15
Eumulgin® CO 40 (solución 13,14%)
15,86
Sacrina sódica 0,49
Citrato de sodio 0,62
Glicerina: Etanol 96% 30,73
Sorbitol 15,96
Agua purificada 33,18
(Navarro,2017)
Etapa 4:
Caracterización de la fórmula final
Se realizó la determinación del tamaño de glóbulo e índice de Polidispersión (IPD),
potencial Z, pH, densidad y características organolépticas de la fórmula final. Los resultados
obtenidos se muestran en la Tabla 17.
55
Tabla 17. Resultados de la caracterización de la fórmula final
Ensayo Resultado
Tamaño de glóbulo 210,5 nm
IPD 0,189
Potencial Z -0,83 mV
pH 5,4
Densidad 1,023 g/mL
Color Blanco translucido
Sabor Dulce ligeramente picante
Olor Típica nota a especia (Navarro, 2017)
La fórmula obtenida posee un tamaño de glóbulo en el orden de los nanómetros y permite
el paso de la luz, por lo tanto, se clasifica como una nanoemulsión. El IPD obtenido nos da
una idea de la amplitud de la distribución de tamaños existentes en la nanoemulsión y al ser
menor a 0,3 categoriza a la misma como monodispersa; además da una idea de la alta
estabilidad del sistema ya que el DLS es un equipo muy sensible a la presciencia de agregados
o contaminantes en la muestra por lo que predice la tendencia de coalescer que tendrá la
nanoemulsión (Gutierrez, 2017)
El potencial Z obtenido es bajo, sin embargo, el valor del IPD está dentro de lo
especificado; como se sabe el potencial Z es una medida de la magnitud de las interacciones
electroestáticas en la nanoemulsión (Gutierrez, 2017) y en este caso, la formula incluye un
emulgente no iónico y componentes que podrían no tener un aporte de iones necesario para
generar un potencial zeta alto.
El pH obtenido es ligeramente ácido y se encuentra cerca de la recomendación dada por
la Farmacopea Británica, 2003 donde se menciona que ¨ Los enjuagues bucales pueden
contener excipientes para ajustar el pH que, en la medida de lo posible, es neutro¨.
Determinación del tipo de emulsión
El tipo de emulsión obtenida fue aceite en agua (o/w), ya que el azul de metileno se
dispersó y homogenizó fácilmente en la nanoemuslión, lo que permite deducir que la fase
dispersante de la emulsión es acuosa.
56
Con respecto al colorante rojo oleoso no presentó miscibilidad en la nanoemulsión y
formó una fase en la parte superior.
Escaneo en Microscopio de fuerza atómica (AFM)
El escaneo se realizó en un área correspondiente a 1 um x 1um de las diluciones secas de
la nanoemulsión formulada, se obtuvo los siguientes resultados:
Figura 6. Escaneo en Microscopio de fuerza atómica dilución 1:100 y 1:625
(Navarro,2017)
La Figura 6 obtenida de la dilución 1:100 (izquierda) y 1:625 (derecha) muestra la
presencia de glóbulos (color blanco) en la emulsión, estos tienen un tamaño 171,875 nm y
207,031 nm respectivamente, como se observa existe la presencia de partículas aún más
pequeñas en la nanoemulsión, estas pudieron formarse al momento de hacer la dilución
correspondiente.
57
Figura 7. Imagen 3D del Escaneo en Microscopio de fuerza atómica dilución 1:100 y 1:625
(Navarro, 2017)
La Figura 7 obtenida de la dilución 1:100 (izquierda) y 1:625 (derecha) muestra la captura
tridimensional de la nanoemulsión; en este caso se observa como la fase dispersante (acuosa)
se evaporó totalmente sin dejar una huella aparente, mientras que la fase dispersa (oleosa)
por su naturaleza dejó huellas y formó relieves en forma de picos. Con esto se confirma la
naturaleza o/w de la nanoemulsión.
Estabilidad Física
Se realizó la determinación de la estabilidad física de la nanoemulsión por un periodo de
30 días, los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 18.
Tabla 18. Resultados estabilidad física
Condiciones Ambientales 30°C
DIA nm IPD nm IPD
0 210,5 0,189 210,5 0,189
1 214,1 0,172 214,1 0,172
8 229,5 0,190 290,4 0,377
14 237,9 0,134 303,1 0,420
21 236,3 0,153 286,2 0,420
30 255,1 0,159 404,5 0,436 (Navarro,2017)
Como se observa en la Tabla 18 la nanoemulsión, a condiciones ambientales, mantuvo
su tamaño e IPD dentro de los parámetros adecuados, no se observa un crecimiento de
58
glóbulo relevante y el IPD es menor a 0,3. Además durante el tiempo que duró el ensayo no
se observó cremado, separación de fases o alguna señal de inestabilidad.
Figura 8. Estabilidad de la nanoemulsión día 30
Nota: El tubo de ensayo de la izquierda corresponde a la nanoemulsión sometida a una temperatura 30°C; el tubo de
ensayo a la derecha corresponde a la nanoemulsión bajo condiciones ambientales.
En el caso de la condición de temperatura 30°C, se observa que este factor sí tiene
influencia en la estabilidad física de la nanoemulsión, generando un crecimiento de alrededor
200 nm del tamaño inicial y además aumentando el IPD a un valor mayor de 0,3 el cual está
fuera de los parámetros adecuados. Es importante mencionar que durante el tiempo que duró
el ensayo no se observó cremado, separación de fases o alguna señal de inestabilidad en esta
condición.
Con este análisis se puede determinar que la nanoemulsión es físicamente estable
independientemente del valor de potencial Z obtenido.
Control microbiológico (aerobios totales (ufc/g o mL), hongos y levaduras (ufc/g o
mL)
Se realizó control microbiológico 18 días después de fabricada la nanoemulsión, los
resultados obtenidos se reflejan en Tabla 19.
59
Tabla 19. Resultado Control microbiológico
Ensayo Especificación para formas farmacéuticas no estériles de uso gingival
Resultado
Aerobios Totales (ufc/mL) 100 ufc/mL Ausencia
Hongos y Levaduras (ufc/mL)
10 ufc/mL Ausencia
(Navarro,2017)
La formulación cumple con los parámetros microbiológicos establecidos por la USP, no
hay presencia de bacterias aerobias u hongos y levaduras. Este resultado muestra que el aceite
esencial, además de tener actividad contra S. mutans, posee actividad conservante.
Comprobación de la actividad antibacteriana
Se realizó la comprobación de la actividad antibacteriana del enjuague bucal mediante el
método de difusión en agar. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 20, se observa
que la clorhexidina genera halos más grandes que la nanoemulsión. El placebo no generó
halo en ninguna de las repeticiones, lo que indica que la bacteria no presenta sensibilidad a
este.
Tabla 20. Diámetro de halos de inhibición de la comprobación de la actividad
antibacteriana mediante el método de difusión en agar
Repeticiones
Muestra R1 R2 R3
Clorhexidina 0,04%9 18 mm 20 mm 20 mm
Nanoemulsión (aceite esencial) 14 mm 13 mm 13 mm
Placebo 0 mm 0 mm 0 mm
(Navarro,2017)
Con los datos obtenidos se procedió a corren el diseño DBCA propuesto en el programa
STATGRAPHICS Centurion, se obtuvo los siguientes resultados:
60
Diseño experimental DBCA para la actividad antibacteriana
Tabla 21.Análisis de Varianza para la actividad antibacteriana
Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P EFECTOS PRINCIPALES A: Formulación 587,556 2 293,778 377,71 0,0000 B: BLOQUE 0,222222 2 0,111111 0,14 0,8711 RESIDUOS 3,11111 4 0,777778 TOTAL (CORREGIDO) 590,889 8
(Navarro, 2017)
Los valores-P prueban la significancia estadística de cada uno de los factores. Puesto que
el valor-P es menor que 0,05, el factor formulación tiene un efecto estadísticamente
significativo sobre tamaño de halo con un 95,0% de nivel de confianza. Es decir, cada
formulación ensayada tiene un efecto significativo sobre el halo de inhibición generado, en
consecuencia, sobre la actividad antibacteriana. Ya que el valor- P del factor de bloque
(repeticiones) es mayor a 0,05, éste no presenta un efecto significativo.
Pruebas de Múltiple Rangos
La Tabla 22 y 23 muestran los resultados de la aplicación de un procedimiento de
comparación múltiple para determinar cuáles medias son significativamente diferentes de
otras
Tabla 22. Pruebas de Múltiple Rangos para la actividad antibacteriana
Formulación Casos Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos 3 3 0 0,509175 X
2 3 13,3333 0,509175 X
1 3 19,3333 0,509175 X
(Navarro, 2017)
61
Tabla 23. Diferencia mínima significativa (LSD) de Fisher para la actividad
antibacteriana
Contraste Sig. Diferencia +/- Límites 1 - 2 * 6,0 1,99928 1 - 3 * 19,3333 1,99928 2 - 3 * 13,3333 1,99928
Nota: * indica una diferencia significativa. (Navarro, 2017)
Según la Tabla 22 se han identificado 3 grupos heterogéneos según la alineación de las
X's en columnas, lo que indica que existen diferencias estadísticamente significativas entre
aquellos niveles.
La Tabla 23 muestra las diferencias estimadas entre cada par de medias. El asterisco que
se encuentra al lado de los 3 pares indica que estos pares muestran diferencias
estadísticamente significativas con un nivel del 95,0% de confianza.
Es decir, cada formulación ensayada posee un efecto diferente; como era de esperarse la
clorhexidina muestra una mayor actividad; en cuanto a la nanoemulsión se comprueba que
esta posee actividad frente a S. muatns, la cual es menor y estadísticamente diferente a la
clorhexidina, pero tiene mayor actividad y es estadísticamente diferente que el placebo.
Esto comprueba que el aceite esencial empleado en la formulación posee actividad
antibacteriana, no los otros elementos presentes en la fórmula; sin embargo, la formulación
no exhibe mejor actividad que el medicamento de referencia clorhexidina.
62
Capítulo V
Conclusiones y Recomendaciones
Conclusiones
• Se desarrolló un enjuague bucal profiláctico en base a aceite esencial de
Zingiber officinale el cual presentó actividad frente a Streptococccus mutans. La
fórmula fue optimizada empleando el diseño de mezclas simplex centroid y se
describe en la Tabla 16.
• Se determinó la CMI del aceite esencial de jengibre comercializado por
la Fundación Chankuap, frente a las cepas de Streptoccocus mutans (ATCC 25175),
utilizando la técnica de dilución en caldo; el valor determinado fue de 6,70 mg/mL
de α-Zingibereno equivalente a 3,22 ml de aceite esencial por cada 100 ml
nanoemulsión.
• Se desarrolló un enjugue bucal que permitió mantener solubilizado el aceite
esencial de jengibre creando una nanoemulsión del tipo o/w, con un tamaño de
glóbulo de 210,5 nm, un IPD de 0,189 y un potencial Z de -0,83 mV. La formulación
mantuvo su estabilidad física a temperatura ambiente y protegida de la luz durante 30
días.
• Se verificó la actividad antibacteriana de la mejor formulación frente a las
cepas de Streptoccocus mutans (ATCC 25175), empleando el método de difusión en
agar; el enjuague bucal desarrollado fue efectivo frente al microrganismo ensayado,
pero no superior que el producto de referencia: clorhexidina al 0,04%.
63
Recomendaciones
• Realizar las pruebas in vivo y ensayos de estabilidad acelerados y largo plazo
de la formulación desarrollada con el fin de obtener un producto farmacéutico que
pueda comercializarse y constituya un aporte al desarrollo de productos
farmacéuticos naturales seguros, de calidad y eficaces a partir de materia prima local.
• Desarrollar un método que permita la cuantificación del aceite esencial de
Zingiber officinale en el enjuague bucal desarrollado.
• Realizar el escalado del proceso de manufactura para permitir la producción
del enjuague bucal a nivel industrial.
• Debido a que las pruebas sugieren que el aceite esencial de Zingiber officinale
tiene propiedades conservantes, se recomienda realizar estudios que sustenten esta
aplicación en productos farmacéuticos y cosméticos.
• Debido a las diferencias encontradas en la CMI reportada en estudios similares
(Sundeep, 2016) se recomienda desarrollar un estudio comparativo de la actividad
antibacteriana del aceite esencial de Zingiber officinale obtenido localmente, frente a
los de otras zonas geográficas.
64
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od
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70
Anexo B. Diagrama de Flujo Elaboración del Enjuague Bucal
Elaboración de Enjuague
Bucal
Pesar
Dispersar
Agitar
Agitar
Pesar
Solubilizar
Agitador magnético
(5 minutos velocidad 5)
Fin
Agitar
Pesar
Dispersar
Almacenar
Sonicar
Aceite esencial de jengibre
3,15 g
Etanol : Glicerina (4:1)
30.73 g
Sacarina sódica 0.49 g
Citrato de sodio 0.62 g
Agitador magnético
(5 minutos velocidad 5)
Agua 33.18 g
Sorbitol 15.96 g + A y B
Agitador magnético
(10 minutos velocidad 5)
CUltrasonido (3 minutos,
33%)
Temperatura Ambiente
Protegido de la luz
C
B
A
Emulgin 13.14%
15.86 g
Emulgin 13.14%
15.86 g
71
Anexo C. Fichas técnicas
Emulgin® CO40
72
73
Aceite esencial de Zingiber officinale
74
75
Anexo D. Certificados Microbiología
Certificado de Realización de los ensayos
76
Certificado de uso de instalaciones
77
Protocolo de Manejo de Desechos Infecciosos
78
Certificado de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI)
79
Certificado del Control Microbiológico
80
Certificado de la Prueba de Sensibilidad
81
Anexo E. Fotografías
Cepa S. mutans
Determinación CMI
Preparación de diluciones
Resultados
82
Estabilidad
DÍA O DÍA 8
DÍA 21 DÍA 30
83
Ensayo de sensibilidad (Difusión en Agar)
Realización del ensayo
Resultados
Halos de Inhibición
84
Acercamiento del halo de Inhibición del Placebo
Acercamiento del halo de Inhibición del la Nanoemulsión
