Desarrollo de métodos (bio)electroquímicos que faciliten ...

Universidad Nacional de Rosario

Facultad de Ciencias Bioquiacutemicas y Farmaceacuteuticas

Desarrollo de meacutetodos (bio)electroquiacutemicos que

faciliten la determinacioacuten de analitos de intereacutes en el

campo de la Salud y las fuentes de energiacutea renovables

Tesis para optar por el tiacutetulo de

DOCTOR EN CIENCIAS QUIacuteMICAS

Presentada por

Lic Pablo Luis Faccendini

Directora de Tesis

Dra Claudia M Lagier

2014




Licenciado en Biotecnologiacutea Pablo Luis Faccendini


Esta Tesis es presentada como parte de los requisitos para optar al grado

acadeacutemico de Doctor en Ciencias Quiacutemicas de la Universidad Nacional de Rosario y

no ha sido presentada previamente para la obtencioacuten de otro tiacutetulo en esta u otra

Universidad La misma contiene los resultados obtenidos en investigaciones llevadas a

cabo en Instituto de Quiacutemica Rosario dependiente de la Facultad de Cs Bioquiacutemicas y

Farmaceacuteuticas durante el periacuteodo comprendido entre el 1 de abril de 2009 y el 18 de

febrero de 2014 bajo la direccioacuten de la Dra Claudia Marina Lagier

Iacutendice

i

Iacutendice

1 Resumen vi

1 Summary viii

Publicaciones x

Abreviaturas y Siacutembolos xii

2 Introduccioacuten 1

21 Toxoplasmosis 1

211 Generalidades 1

212 Toxoplasma gondii 2

213 Diagnoacutestico 4

2131 Meacutetodos de diagnoacutestico 4

2132 Importancia del correcto diagnoacutestico en la embarazada 6

2133 Diagnoacutestico en la embarazada 6

2134 Ensayo de inmunoadsorcioacuten ligado a enzima 7

21341 Esquema de captura o tipo ―Sandwich 7

2135 Obtencioacuten de antiacutegenos para diagnoacutestico 9

214 Prediccioacuten de epiacutetopes reconocidos por ceacutelulas B 10

22 Tuberculosis 13

221 Generalidades 13

222 Mycobacterium tuberculosis 13


23 Biodiesel 16

231 Determinacioacuten de glicerol libre en biodiesel 16

24 Marco teoacuterico de las teacutecnicas electroquiacutemicas utilizadas 18

241 Cronoampreometriacutea 20

242 Teacutecnicas voltameacutetricas 21

2421 Voltametriacutea de barrido lineal 22

2422 Voltametriacutea ciacuteclica 23

Iacutendice

ii

243 Teacutecnicas de pulso 24

2431 Voltamperometriacutea onda cuadrada VOC 24

25 Biosensores 27

251 Superficie de bioreconocimiento en biosensores 28

252 Biosensores amperomeacutetricos 29

253 Biosensores de uso cliacutenico 29

2531 Biosensores para evaluacioacuten de infeccioacuten toxoplaacutesmica 32

254 Biosensores para cuantificacioacuten de glicerol 32

3 Objetivos 37

31 Objetivos generales 37

32 Objetivos Particulares 37

4 Materiales y meacutetodos 39

41 Reactivos y medios de cultivos 39

411 Reactivos 39

412 Medios de cultivos 40

42 Cepas bacterianas 40

43 Bacterioacutefagos 41

44 Plaacutesmidos 41

45 Reaccioacuten en cadena de la polimerasa 41

46 Electroforesis de ADN en geles de agarosa 42

47 Minipreparacioacuten de ADN plasmiacutedico 42

48 Purificacioacuten del producto de amplificacioacuten 43

49 Prueba de expresioacuten de proteiacutenas de fusioacuten a TRX y a ―cola

de histidinas 43

410 Expresioacuten y purificacioacuten preparativas de antiacutegenos recombinantes 43

411 Separacioacuten de proteiacutenas mediante SDS-PAGE 44

412 Cuantificacioacuten de proteiacutenas 44

413 Reaccioacuten de conjugacioacuten biotina-antiacutegeno 44

Iacutendice

iii

414 Revelado cromogeacutenico de la reaccioacuten de conjugacioacuten 45

415 Mediciones espectrofotomeacutetricas 45

416 Ensayos de inmunoabsorcioacuten ligados a enzima con deteccioacuten

fotomeacutetrica 45

4161 Esquema A 46

4162 Esquema B 46

417 Reaccioacuten de color para determinacioacuten cuantitativa de glicerol por meacutetodo

espectrofotomeacutetrico 47

418 Determinacioacuten de glicerol remanente en cultivos de micobacterias 47

4181 Determinacioacuten de glicerol remanente en cultivos de micobacterias

con y sin fago D29 y ensayos controles respectivos 48

419 Instrumental electroquiacutemico 48

4191 Electrodos de trabajo 48

41911 Bioelectrodo para evaluacioacuten de infeccioacuten toxoplaacutesmica 48

41912 Electrodos para cuantificacioacuten de glicerol 49

4192 Limpieza de electrodos 50

4193 Determinacioacuten del aacuterea real del electrodo 50

41931 Medicioacuten de la adsorcioacuten de oxiacutegeno 50

41932 Voltametriacutea ciacuteclica de ferricianuro de potasio 51

420 Medidas electroquiacutemicas 51

4201 Mediciones amperomeacutetricas para evaluacioacuten de infeccioacuten

toxoplaacutesmica 51

4202 Mediciones amperomeacutetricas para cuantificacioacuten de glicerol 52

42021 Amperometriacuteas con tip de oro 52

42022 Amperometriacuteas con electrodos de pasta de C 52

4203 Voltamperometriacutea de onda cuadrada 53

421 Funcionalizacioacuten de nanotubos de carbono 53

422 Programas de prediccioacuten de epiacutetopes lineales reconocidos por ceacutelulas B 54

Iacutendice

iv

4221 Base de datos de proteiacutenas 54

4222 Programas utilizados 54

423 Anaacutelisis de Datos 54

424 Caacutelculos estadiacutesticos y disentildeo experimental 55

5 Resultados y discusioacuten 57

51 Evaluacioacuten de antiacutegenos recombinantes de T gondii 57

511 Antiacutegeno P30 57



52 Marcado de antiacutegenos recombinantes de T gondii 60

53 Inmunoensayos 61

531 Inmunoensayos con deteccioacuten fotomeacutetrica 61

5311 Evaluacioacuten del esquema A 61

5312 Esquema B 62

532 Inmunoensayos con deteccioacuten amperomeacutetrica utilizando los antiacutegenos

recombinantes 66

54 Determinacioacuten de la actividad electroquiacutemica del glicerol en medio

acuoso 67

55 Cuantificacioacuten de glicerol en medios acuosos complejos 71

551 Evaluacioacuten del modelo propuesto por medio de lecturas

espectrofotomeacutetricas 72

5511 Evaluacioacuten de la sentildeal con la concentracioacuten de glicerol 76

5512 Optimizacioacuten de condiciones para disminuir el costo operativo 78


5521 Evaluacioacuten de glicerol remanente en cultivos axeacutenicos de M

smegmatis 79



Iacutendice

v

553 Biosensor amperomeacutetrico a base de pasta de carbono viacutetreo

modificada 81

554 Desarrollo de un biosensor a base de pasta de carbono viacutetreo y

nanotubos de carbono 83

5541 Ensayos de cuantificacioacuten de glicerol con el bioelectrodo

desarrollado utilizando teacutecnicas de pulso 86

56 Validacioacuten de meacutetodos 88

6 Experimentos Auxiliares 94

61 Comparacioacuten de programas de prediccioacuten de epiacutetopes lineales reconocidos

por ceacutelulas B 94

62 Puesta a punto de ensayos de inmunoabsorcioacuten ligados a enzima con

deteccioacuten fotomeacutetrica 95

621 Bloqueante a utilizar 96

622 Esquema A 97

623 Esquema B 98

63 Ensayos electroquiacutemicos 99

631 Determinacioacuten del aacuterea real de un electrodo 99

6311 Meacutetodo de la adsorcioacuten de O2 99

6312 Voltametriacutea ciacuteclica a distintas velocidades 99

632 Cubierta del biosensor selectivo para glicerol y soluciones

amortiguadoras 100

633 Ensayos preliminares de voltametriacuteas de onda cuadrada 100

6331 Seleccioacuten de un meacutetodo apropiado para establecer la liacutenea

de base 101

7 Conclusiones 104

8 Bibliografiacutea 106

Resumen

vi

1 Resumen

Este trabajo de Tesis se orientoacute al desarrollo de meacutetodos analiacuteticos alternativos a los

hoy vigentes que faciliten la determinacioacuten de compuestos de intereacutes tanto para

diagnoacutestico cliacutenico como para la industria de combustibles alternativos Se realizaron

aportes para tres situaciones de relevancia diagnoacutestico de toxoplasmosis tuberculosis y

evaluacioacuten de calidad de biodiesel

La toxoplasmosis es una parasitosis causada por Toxoplasma gondii que afecta a

humanos sin generar complicaciones excepto cuando los infectados son

inmunodeprimidos o mujeres embarazadas que no cursaron previamente la enfermedad

En este caso el paraacutesito puede atravesar placenta generando infeccioacuten congeacutenita del

feto pudiendo producirle graves consecuencias que pueden llegar a la muerte Una de

las teacutecnicas de diagnoacutestico utiliza el ensayo de inmunoadsorcioacuten ligado a enzima

permitiendo la deteccioacuten de anticuerpos especiacuteficos contra el paraacutesito los cuales son

indicadores de existencia de infeccioacuten No obstante para detectar toxoplasmosis aguda

al diacutea de hoy se carece de una estandarizacioacuten confiable principalmente en la

preparacioacuten del antiacutegeno Por ello en este trabajo se procuroacute identificar regiones donde

se codificaraacuten algunos marcadores de fase aguda que concentraraacuten una alta proporcioacuten

de determinantes antigeacutenicos para luego clonarlas expresarlas como proteiacutenas

recombinantes marcarlas con biotina y asiacute utilizarlas como sistema de revelado de

anticuerpos especiacuteficos contra proteiacutenas de T gondii Los inmunoensayos aquiacute

presentados proponen una metodologiacutea que permitiraacute en un futuro distinguir sueros

provenientes de individuos con infeccioacuten aguda de aquellos con infeccioacuten croacutenica o no

infectados

La tuberculosis es una enfermedad infecto-contagiosa causada por la bacteria

Mycobacterium tuberculosis Su diagnoacutestico se basa en una serie de estudios que

finaliza con la identificacioacuten del agente etioloacutegico en cultivos obtenidos a partir de

esputo Esta identificacioacuten puede demorar aproximadamente dos meses debido al

prolongado tiempo de replicacioacuten de la micobacteria Esto conlleva la potencialidad de

contagio a individuos sanos y un compromiso importante de la salud del infectado

Uacuteltimamente se han desarrollado teacutecnicas indirectas de deteccioacuten de M tuberculosis

utilizando el bacterioacutefago D29 capaz de infectar especiacuteficamente micobacterias Es una

metodologiacutea donde se facilita la replicacioacuten del fago en la muestra proveniente del

paciente para luego evaluar el tiacutetulo de fagos liberados infectando un cultivo testigo de

Resumen

vii

Micobacterium smegmatis micobacteria de replicacioacuten raacutepida Siendo el glicerol fuente

de carbono en cultivos de micobacterias se planteoacute determinar su concentracioacuten

remanente como meacutetodo de evaluar integridad de M smegmatis establecieacutendose asiacute una

medida indirecta de la previa presencia de M tuberculosis en la muestra problema

Ademaacutes el glicerol es el principal subproducto en la elaboracioacuten del biodiesel y su

concentracioacuten es indicativa de la calidad del combustible transformaacutendose en analito

relevante para la industria de energiacuteas alternativas a la derivada del petroacuteleo

Se desarrollaron y validaron dos meacutetodos amperomeacutetricos de cuantificacioacuten de

glicerol a) Con electrodo de oro en NaOH 01 M aplicable a medios acuosos (LD 10

microM intervalo lineal 0024 a 200 mM) b) Con bioelectrodo de pasta de C modificada

con glicerol deshidrogenasa aplicable a medios complejos como cultivos bacterianos

(LD 20 M intervalo lineal 0060 a 175 mM)

Resumen

viii

1 Summary

This Thesis work was oriented to the development of analytical methods alternative

to those currently used to facilitate the identification of compounds of interest for both

clinical diagnosis and the alternative fuel industry Contributions of relevance to three

situations were performed Diagnosis of toxoplasmosis tuberculosis and the assessment

of biodiesel quality

Toxoplasmosis is a parasitic disease caused by Toxoplasma gondii which does not

bring complications in people except when the infected individual is an

immunocompromised patient or pregnant women who have not previously suffered

from the illness In this case the parasite can cross the placenta producing congenital

infection of the fetus and potentially causing serious consequences including death

One of the techniques used to its diagnosis is the enzyme-linked immunosorbent assay

allowing the detection of parasite-specific antibodies which are indicators of the

infection However this technique aimed to detect acute toxoplasmosis nowadays lacks

of reliable standardization particularly in the preparation of the antigen Therefore this

study focused on identifying regions encoding several markers of acute phase which

highly concentrated antigenic determinants to clone and express them as recombinant

proteins subsequently label them with biotin and thus use them as developing system of

specific antibodies against T gondii proteins The immunoassays presented here

propose a methodology which will allow in the future distinguishing sera from

individuals with acute infection of those with chronic infection or uninfected

Tuberculosis is an infectious and contagious disease caused by the bacterium

Mycobacterium tuberculosis Its diagnosis is based on a series of studies which

eventually identify the etiologic agent in cultures obtained from sputum This

identification can take about two months due to the extensive mycobacteria replication

time This leads to the potential contagion of healthy individuals and a major

commitment to the health of the infected patient Recently indirect M tuberculosis

detection techniques have been developed They use D29 bacteriophage which is able

to specifically infect mycobacteria The methodology allows phage replication in the

patientrsquos sample and then evaluates the number of released phages by infecting a

control culture of Mycobacterium smegmatis a short-term replicable mycobacteria As

glycerol is the carbon source commonly used in mycobacteria culture this work

proposes determining its residual concentration as a method of evaluating integrity of

Resumen

ix

M smegmatis thus establishing an indirect measurement of the previous presence of M

tuberculosis in the sample

Furthermore glycerol is the main by-product in biodiesel production and its

concentration is an indicator of the fuel quality becoming a relevant analyte to the

energy industry alternative to that derived of petroleum

Two amperometric methods for glycerol quantitation were developed and

validated a) Using a gold electrode in 01 M NaOH medium useful for simple aqueous

solutions (LD 10 microM linear range from 0024 to 200 mM) b) using a carbon paste

bioelectrode modified with glycerol dehydrogenase useful for complex media such as

bacterial cultures (LD 20 microM linear range 0060 to 175 mM)

Publicaciones

x

Publicaciones

Los resultados parciales del presente trabajo de Tesis han dado lugar a las

siguientes publicaciones

Trabajos en revistas internacionales

1- Costa J G Faccendini P L Sferco S J Lagier C M Marcipar I S

Evaluation and comparison of the ability of online available prediction programs to

predict true linear B-cell epitopes Protein amp Peptide Letters (2013) 20(6)724-30

2- Faccendini P L Ribone M E Lagier C M Selective application of two

rapid low-cost electrochemical methods to quantify glycerol according to the sample

nature Sensors and Actuators B (2014) 193 142ndash 148

Trabajos en congresos

1- Muntildeoz A Faccendini P L Ribone M E Lagier C M Oxidacioacuten

electroquiacutemica de polialcoholes sustrato de sistemas enzimaacuteticos bacterianos Estudio

de las condiciones para su cuantificacioacuten V Congreso Argentino de Quiacutemica Analiacutetica

Bahiacutea Blanca Noviembre de 2009

2- Costa J G Faccendini P L Carral L Kaufer F Lagier C M Marcipar I

S Evaluacioacuten de dos regiones de la Proteiacutena P35 de Toxoplasmama gondii para el

diagnostico de fase aguda de la toxoplasmosis Ascochinga Coacuterdoba Octubre de 2010

3- Costa J G Faccendini P L Lagier C M Marcipar I S Modelado y

prediccioacuten de los epiacutetopes del antigeno P22 de Toxoplasma gondii 2do Congreso de

Bioinformaacutetica y Biologiacutea Computacional Coacuterdoba Mayo de 2011

4- Faccendini P L Costa J G Ribone M E Marcipar I S Lagier C M

Ensamblado de un bioelectrodo econoacutemico para la deteccioacuten de glicerol en medios

altamente complejos 6deg Congreso Argentino de Quiacutemica Analiacutetica Santa Fe

Septiembre de 2011


Desarrollo y optimizacioacuten de un meacutetodo para la cuantificacioacuten de glicerol en matrices

complejas 6deg Congreso Argentino de Quiacutemica Analiacutetica Santa Fe Septiembre de 2011

Publicaciones

xi

6- Costa J G Perotti J Faccendini P L Lagier C M Mancipar I S

Optimization of the acute toxoplasmosis immunodiagnostic during the pregnancy

Workshop Fronteras en Biociencias Ministerio de Ciencia Tecnologiacutea e Innovacioacuten

Productiva Embajada Alemana Ciudad Autoacutenoma de Buenos Aires Abril de 2012

7- Costa J G Perotti J Faccendini P L Dure A Carral L Kaufer F Lagier

C M Mancipar I S Evaluacioacuten de diferentes regiones de las proteiacutenas p22 p30 y p35

para diagnoacutestico de la fase aguda de la toxoplasmosis XXV Reunioacuten Anual de la

Sociedad Argentina Protozoologiacutea 2012 Ciudad Autoacutenoma de Buenos Aires Agosto

de 2012

8- Costa J G Faccendini P L Sferco S J Lagier C M Mancipar I S

Comparison of the ability to predict true linear B-cell epitopes by on-line available

prediction programs 3er congreso de la sociedad argentina de bioinformaacutetica y biologiacutea

computacional Paranaacute Septiembre de 2012


Desarrollo de un sistema electroquiacutemico para evaluar infeccioacuten toxoplaacutesmica 7deg

Congreso Argentino de Quiacutemica Analiacutetica Mendoza Octubre de 2013

Abreviaturas y Siacutembolos

xii


AD Aglutinacioacuten Directa

ADN Aacutecido desoxiribonucleico

Ac(s) Anticuerpo(s)

Ang(s) Antiacutegeno(s)

D Coeficiente de difusioacuten

DHA 13 dihidroxiacetona

DMSO Dimetil sulfoacutexido

DO Densidad oacuteptica

DT Dye Test con azul de metileno (Reaccioacuten de Sabiacuten Feldman)

EDTA Aacutecido etilendiaminotetraaceacutetico

ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay (Ensayo de inmunoadsorcioacuten ligado

a enzima)

F Constante de Faraday

Frecuencia

GlDH Glicerol deshidrogenasa

HAI Hemoaglutinacioacuten indirecta

HEPES Aacutecido 4-(2-hydroxietil)-1-piperazina etano sulfoacutenico

HRP Horse radish peroxidase (Peroxidasa de raacutebano picante)

I Corriente eleacutectrica

IFI Inmunofluorescencia indirecta

IgA Inmunoglobulina A

IgG Inmunoglobulina G

IgE Inmunoglobulina E

IgM Inmunoglobulina M

IgM-IFI Inmunofluorescencia indirecta de IgM (Prueba de Remington)

IPTG Isopropil- -D-tiogalactopiranoacutesido

ISAGA Ensayo aglutinante de inmunoabsorcioacuten

LB Medio Luria-Bertani

LC Liacutemite de cuantificacioacuten

LD Liacutemite de deteccioacuten

MWCNT Multi-walled carboacuten nanotubes (Nanotubos de carbono de paredes

muacuteltiples)


xiii

N nuacutemero de moles de especie reducida u oxidada

OMS Organizacioacuten Mundial de la Salud

P35 Antiacutegeno de superficie de T gondii de 35 kDa de peso

PBS Phosphate buffer salin (Solucioacuten tampoacuten fosfato salino)

PCR Polimerasa chain reaction (Reaccioacuten en cadena de la polimerasa)

pET32a Vector plasmiacutedico

Q Carga eleacutectrica circulante

SAG1 Surface antigen 1 (Antiacutegeno de superficie 1 o antiacutegeno P30 de T gondii)


SDS Dodecil sulfato de sodio

TB Tuberculosis

TRX Tioredoxina

VBL Voltametriacutea de barrido lineal

VC Voltametriacutea ciacuteclica

VPD Voltametriacutea de pulso diferencial

Introduccioacuten

Introduccioacuten

1

2 Introduccioacuten

21 Toxoplasmosis

211 Generalidades

La toxoplasmosis es una enfermedad causada por el paraacutesito protozoario

Toxoplasma gondii que infecta animales herbiacutevoros carniacutevoros y omniacutevoros dentro de

los cuales se encuentra el hombre Estaacute ampliamente extendida por todo el mundo y su

incidencia y prevalencia variacutean mucho seguacuten las zonas geograacuteficas los haacutebitos

alimentarios el tipo de trabajo la higiene ambiental y la presencia o no de gatos

infectados (Atias 1998 Martiacuten-Hernaacutendez 2004) Es una zoonosis que afecta a los

humanos a traveacutes de formas infectivas producidas durante el ciclo bioloacutegico que se

desarrolla uacutenicamente en gatos y otros feacutelidos Dependiendo de la localizacioacuten

geograacutefica entre 15 y 85 de la poblacioacuten adulta mundial presenta infeccioacuten croacutenica

(Fuentes y col 2001)

Usualmente la principal viacutea de transmisioacuten de esta parasitosis es la oral por

ingestioacuten de carnes crudas o poco cocidas contaminadas con quistes o por la ingestioacuten

de ooquistes presentes en agua o alimentos contaminados con heces de gato Son menos

frecuentes las viacuteas de transmisioacuten parenteral respiratorias mucosal (conjuntival)

cutaacutenea y por transfusioacuten de sangre o trasplante de oacuterganos La transmisioacuten por viacutea

transplacentaria puede ocurrir cuando la embarazada padece la primoinfeccioacuten durante

el curso del embarazo aunque se han descripto casos raros de infeccioacuten congeacutenita por

toxoplasmosis materna anterior al embarazo (Martiacuten-Hernaacutendez 2004 Centers of

Diseases Control and Prevention (CDC) paacutegina web a)

Durante la infeccioacuten pueden distinguirse dos etapas A) Aguda Al breve tiempo de

ingerir ooquistes esporulados eacutestos se transforman en taquizoiacutetos ingresan a la ceacutelula

del hueacutesped y comienzan a dividirse en forma asexual hasta que la ceacutelula se lisa

liberando asiacute la progenie y ocasionando la parasitemia Posteriormente el taquizoiacuteto

evoluciona a bradizoiacuteto cuya multiplicacioacuten es lenta Se produce la invasioacuten de los

oacuterganos por viacutea linfaacutetica o hemaacutetica siendo los oacuterganos maacutes comprometidos los

muacutesculos esqueleacutetico y cardiacuteaco asiacute como cerebro y ojos B) Croacutenica En la medida que

evoluciona la defensa del hueacutesped desaparecen los paraacutesitos extracelulares limitaacutendose

la divisioacuten intracelular y quedando las formas resistentes principalmente en el sistema

nervioso central y muacutesculo esqueleacutetico Por lo general esta etapa es latente pero puede

Introduccioacuten

2

activarse por la ruptura de los quistes tisulares (Fuentes y col 2001 Trabattoni y col

2008)

212 Toxoplasma gondii

El Toxoplasma gondii es un paraacutesito intracelular obligado Su ubicacioacuten

taxonoacutemica se detalla en la Tabla 21

Tabla 21 Ubicacioacuten taxonoacutemica del T gondii

Reino Protista

Sub-reino Protozoa

Phylum Apicomplexa

Clase Sporozoea

Sub-clase Coccidea

Orden Eucoccidiia

Sub-orden Eimeriina

Familia Sarcocystidae

Sub-familia Toxoplasmatinae

Geacutenero Toxoplasma

Especie gondii

Durante el ciclo de vida del T gondii se distinguen tres formas a) los taquizoiacutetos

b) los bradizoiacutetos (o quistes tisulares) y c) los ooquistes Los taquizoiacutetos (o trofozoiacutetos)

son la forma proliferativa y de reproduccioacuten raacutepida dentro de la ceacutelula del hueacutesped

durante la fase aguda que posteriormente deviene en la formacioacuten de un pseudoquiste

Tiene forma de medialuna y mide de 4 a 7 μm de ancho Estaacute recubierto por un sistema

de membranas constituido por una membrana doble interna y una externa interrumpida

en dos puntos El taquizoiacuteto es afectado por anticuerpos (Acs) especiacuteficos y faacutermacos y

se destruye en condiciones ambientales adversas como congelamiento-

descongelamiento desecacioacuten y bajo pH (por ejemplo el de los jugos gaacutestricos) Los

quistes tisulares son redondeados de pared elaacutestica miden de 10 a 200 μm y pueden

contener hasta 3000 paraacutesitos denominados bradizoiacutetos Estas formas no son afectadas

por Acs ni faacutermacos pero pueden ser destruidos por calentamiento congelamiento-

descongelamiento y por desecacioacuten Cuando estos quistes son ingeridos los bradizoiacutetos

resistentes son liberados por la accioacuten gaacutestrica y pueden invadir la mucosa

gastrointestinal Los ooquistes son estructuras ovoides de 10 a 12 μm de diaacutemetro y son

eliminadas en la materia fecal del gato Recieacuten emitidos no son infectivos pero bajo

condiciones de temperatura humedad y presencia de oxiacutegeno esporulan tornaacutendose

Introduccioacuten

3

infectivos y resistentes por maacutes de un antildeo en el suelo y dos antildeos en el agua (Atias

1998 Perotti 2007)

La Fig 21 describe el ciclo de vida del paraacutesito Los uacutenicos hueacutespedes definitivos

conocidos de T gondii son miembros de la familia Felidae (por ejemplo gatos

domeacutesticos) Los ooquistes no esporulados son liberados en las heces del felino Los

ooquistes tardan entre 1 y 5 diacuteas en esporular en el ambiente y volverse infectivos Los

hueacutespedes intermediarios se infectan al ingerir tierra agua o plantas contaminadas con

los ooquistes Los ooquistes se transforman en taquizoiacutetos al breve tiempo de ser

ingeridos Estos taquizoiacutetos se localizan en los tejidos musculares y el sistema nervioso

y evolucionan a bradizoiacutetos formando los quistes tisulares (hiacutesticos) Los felinos se

infectan luego de ingerir la carne de hueacutespedes intermediarios que poseen quistes

tisulares o por ingestioacuten de los ooquistes esporulados Los animales de caza y los

criados para consumo humano tambieacuten pueden infectarse por ingestioacuten de ooquistes

esporulados En el hueacutesped humano los paraacutesitos forman quistes en los tejidos y suele

encontrarse generalmente en el muacutesculo esqueleacutetico el miocardio cerebro y ojos donde

pueden permanecer durante toda la vida del hueacutesped (Paacutegina web del CDC)

Figura 21 Ciclo de vida de T gondii El hueacutesped definitivo son miembros de la familia Felidae los

demaacutes hueacutespedes (incluido el hombre) se infectan accidentalmente y no son necesarios para completar el

ciclo de vida del paraacutesito Adaptado de httpwwwdpdcdcgovdpdxHTMLToxoplasmosishtm

Introduccioacuten

4

213 Diagnoacutestico

Puesto que las infecciones por T gondii en individuos inmunocompetentes son por

lo general asintomaacuteticas o presentan siacutentomas imperceptibles su diagnoacutestico se basa

principalmente en pruebas de laboratorio La toxoplasmosis no suele generar

complicaciones excepto en 2 situaciones cuando se infectan individuos

inmunodeprimidos y cuando se infectan por primera vez mujeres embarazadas En este

uacuteltimo caso el paraacutesito puede infectar al feto atravesando la placenta y generando la

infeccioacuten congeacutenita Las probabilidades de dantildear al feto o al nintildeo luego de nacer

dependeraacuten del trimestre en que suceda la infeccioacuten (Atias 1998 Martiacuten-Hernaacutendez

2005) Tanto en inmunocomprometidos como en el recieacuten nacido la infeccioacuten puede

producir graves consecuencias Es por ello que en estos casos asiacute como en la

embarazada el diagnoacutestico cobra particular relevancia (Remington y col 1995)

2131 Meacutetodos de diagnoacutestico

La infeccioacuten puede diagnosticarse por meacutetodos directos que consisten en la

identificacioacuten de las estructuras parasitarias (por un estudio histopatoloacutegico para lo cual

es necesario realizar biopsias puncioacuten de ganglios o cortes histoloacutegicos) o la

identificacioacuten de ADN del paraacutesito (a traveacutes de una reaccioacuten en cadena de la

polimerasa PCR) Tambieacuten se pueden realizar cultivos tisulares e inoculacioacuten al

peritoneo de ratoacuten pero este meacutetodo presenta la desventaja de involucrar el manejo de

paraacutesitos vivos y el uso de animales de laboratorio (Perotti 2007)

Los meacutetodos alternativos son las pruebas indirectas a saber

Intradermoreaccioacuten de Frenkel Evaluacutea la inmunidad celular Es una reaccioacuten

cualitativa tardiacutea y presenta resultado positivo a partir de la cuarta semana de infeccioacuten

aunque se han reportado casos de pacientes en los que llevoacute varios meses hasta dar

positiva Se utiliza con fines epidemioloacutegicos (Jirovec amp Jindrich 1961 Rodriacuteguez

Acar y col 2008)

Reaccioacuten de Sabiacuten Feldman o dye test con azul de metileno (DT) Es el meacutetodo

de referencia de la OMS Evaluacutea la inmunidad humoral y mide la cantidad total de Acs

que es capaz de destruir taquizoiacutetos viacutea activacioacuten del complemento Es un meacutetodo

cuantitativo y presenta valores positivos a partir de la primera o segunda semana de

infeccioacuten Tiene la desventaja de requerir taquizoiacutetos vivos y animales para su cultivo

por lo que soacutelo laboratorios de referencia llevan adelante este meacutetodo (Perotti 2007

Durlach y col 2008)

Introduccioacuten

5

Reaccioacuten de inmunofluorescencia indirecta (IFI) Evaluacutea la cantidad de Acs que

se unen a toxoplasmas inactivados La reaccioacuten se evidencia con Acs anti-IgG humana

marcados con isocianato de fluoresceiacutena y observando al microscopio de fluorescencia

Si bien no se trabaja con organismos vivos la necesidad de un microscopio de

fluorescencia y la subjetividad del operador limitan el uso de este meacutetodo Se han

informado resultados falso-positivos debidos a Acs anti-nucleares (Durlach y col

2008)

Aglutinacioacuten directa (AD) En este ensayo se produce una aglutinacioacuten visible con

toxoplasmas tratados con formol Se detecta fundamentalmente IgMs especiacuteficas

Hemoaglutinacioacuten indirecta (HAI) Se utilizan antiacutegenos (Angs) de T gondii con

los que se sensibiliza gloacutebulos rojos que en presencia de Acs especiacuteficos producen una

aglutinacioacuten visible como un botoacuten rojo En general es utilizado para determinar

incidencia o seroprevalencia en una regioacuten pero no se recomienda para la deteccioacuten de

la infeccioacuten aguda (Durlach y col 2008)

Fijacioacuten del complemento Se detectan Acs que activan el sistema del

complemento en presencia de Angs de T gondii La reaccioacuten se evidencia con el

sistema hemoliacutetico hemolisina-gloacutebulos rojos de carnero Resultados positivos aparecen

en forma maacutes tardiacutea que en el DT (Perotti 2007)

Western blot Se evaluacutea la presencia de Acs especiacuteficos a Angs que han sido

separados por electroforesis en un gel de poliacrilamida y transferidos a una membrana

Generalmente no es utilizada como teacutecnica de diagnoacutestico debido a su difiacutecil

estandarizacioacuten (Durlach y col 2008)

Prueba de Remington (IgM-IFI) Se sigue el mismo esquema que en IFI pero se

sustituyen el conjugado anti-IgG por uno anti-IgM lo que permite detectar infeccioacuten

aguda Acs anti-nucleares y el factor reumatoide pueden producir resultados falso-

positivos y los Acs tipo IgG pueden producir resultados falso-negativos (Perotti 2007)

Ensayo aglutinante de inmunoabsorcioacuten (ISAGA) Permite la deteccioacuten y dosaje

de Acs IgA IgE IgG e IgM especiacuteficos contra el paraacutesito Este meacutetodo posee mayor

sensibilidad en relacioacuten al IgM-IFI y al ensayo de inmunoadsorcioacuten ligado a enzima

(ELISA) de IgM para la deteccioacuten de infecciones congeacutenitas pero tiene la desventaja

que pueden detectarse IgM especiacuteficas luego de un antildeo de la primoinfeccioacuten Esto

dificulta la interpretacioacuten de un resultado positivo si se desea determinar la antiguumledad

de la infeccioacuten (Durlach y col 2008)

Introduccioacuten

6

Ensayo de inmunoadsorcioacuten ligado a enzima (ELISA) Permite la deteccioacuten de

Acs especiacuteficos contra el paraacutesito Se evidencia la reaccioacuten con una enzima ligada a Acs

o Angs (dependiendo del disentildeo del inmunoensayo ver maacutes adelante en punto 2134)

que transforma un reactivo auxiliar en un producto coloreado o fluorescente Es un

meacutetodo cuantitativo que utiliza un espectrofotoacutemetro o fluoroacutemetro lo que permite

hacer medidas maacutes objetivas y raacutepidas (Perotti 2007) Auacuten asiacute este meacutetodo aplicado a

la deteccioacuten de la toxoplasmosis de fase aguda carece de una estandarizacioacuten confiable

principalmente en la preparacioacuten del Ang

2132 Importancia del correcto diagnoacutestico en la embarazada

A pesar de toda la bateriacutea de ensayos arriba descritos disponibles para el

diagnoacutestico de la toxoplasmosis el de la infeccioacuten aguda en la mujer embarazada sigue

siendo problemaacutetico porque este diagnoacutestico se deduce a partir de los datos de las

concentraciones relativas de los distintos isotipos de las inmunoglobulinas especiacuteficas

En efecto la existencia y concentracioacuten de IgM IgA e IgG especiacuteficas contra T gondii

es muy dependiente de la respuesta inmune del individuo infectado Considerando que

el tratamiento para prevenir la transmisioacuten al feto consiste en administrar drogas

antiparasitarias que tienen efectos nocivos sobre el nonato auacuten en estos diacuteas se trabaja

en mejorar este diagnoacutestico ya que no se cuenta con un meacutetodo confiable como para

prevenir por un lado los dantildeos que suelen sufrir los recieacuten nacidos de madres con

primoinfeccioacuten no diagnosticada y por otra parte los efectos perjudiciales en los fetos

de las embarazadas incorrectamente diagnosticadas y medicadas Por ello es que en este

trabajo se intentoacute desarrollar nuevas metodologiacuteas de diagnoacutestico de la infeccioacuten

toxoplaacutesmica aguda utilizando teacutecnicas electroquiacutemicas

2133 Diagnoacutestico en la embarazada

El correcto diagnoacutestico de la infeccioacuten aguda en la embarazada incluye la

utilizacioacuten de teacutecnicas especiacuteficas y sensibles asiacute como tambieacuten la aplicacioacuten de un

esquema de seguimiento adecuado El diagnoacutestico generalmente es realizado por

serologiacutea Para determinar si la paciente cursa una infeccioacuten aguda se determinan los

tiacutetulos de los anticuerpos IgG IgA e IgM (Arcavi y col 1997) y se interpretan prima-

facie seguacuten

1 IgG IgA IgM negativas ausencia de infeccioacuten

2 IgG e IgA positivas IgM negativa infeccioacuten croacutenica

3 IgG IgA e IgM positivas posible infeccioacuten aguda

Introduccioacuten

7

2134 Ensayo de inmunoadsorcioacuten ligado a enzima

Los ensayos del tipo ELISA consisten en la deteccioacuten de un antiacutegeno o un

anticuerpo inmovilizado sobre un soporte soacutelido y mediante anticuerpos que directa o

indirectamente producen una reaccioacuten La prueba recurre al empleo de antiacutegenos o

anticuerpos conjugados a una enzima (marcados) que por reaccioacuten con su sustrato

producen una especie coloreada cuya concentracioacuten puede ser medida

fotomeacutetricamente Este ensayo tiene las ventajas de ser versaacutetil robusto simple en su

realizacioacuten y emplear reactivos relativamente econoacutemicos El uso de una fase soacutelida que

retiene el analito de intereacutes proporciona una elevada sensibilidad mientras que la

elevada especificidad del ensayo viene dada por la gran selectividad de los anticuerpos

por su antiacutegeno Las configuraciones maacutes sencillas para estos ensayos son el directo y el

indirecto ambas esquematizadas en la Fig 22

Antiacutegeno IgG conjugada a enzima

Bloqueante IgG humana Reactivo de color

Directo Indirecto

Figura 22 Esquemas que representan los ELISA directo (izquierda) e indirecto (derecha)

21341 Esquema de captura o tipo ldquoSandwichrdquo

Cuando los anticuerpos que desean detectarse son del isotipo IgM suele tenerse el

inconveniente que el isotipo IgG frecuentemente estaacute en mayor concentracioacuten que el

IgM y presenta una mayor afinidad por el antiacutegeno Por lo tanto las IgG suelen

dificultar la deteccioacuten de las IgM en suero cuando se sigue un esquema de ELISA

indirecto con anticuerpos anti-IgM humana (Ac-a-IgMh) marcados Es por esto que

suele optarse por un esquema de captura o tipo saacutendwich en el cual se aumenta la

sensibilidad del ensayo incorporando un eslaboacuten maacutes en el inmunocomplejo adsorbido

En este trabajo se ensayaron dos alternativas de captura o tipo saacutendwich En la

primera alternativa que sigue un esquema claacutesico (A) se adsorbieron los Ac-a-IgMh

Introduccioacuten

8

sobre la superficie de la placa de poliestireno Las placas asiacute sensibilizadas se

enfrentaron al suero a ensayar capturando selectivamente una porcioacuten de las IgM de la

muestra Luego se los enfrentoacute al antiacutegeno de intereacutes ligado a biotina que se une a las

IgMh especiacuteficas para dicho Ang previamente capturado Finalmente se buscoacute revelar

con enzima peroxidasa de raacutebano picante (HRP) conjugada a streptavidina esta uacuteltima

forma un complejo estable con biotina De esta forma se aumenta la cantidad de Ac que

se desean detectar adsorbido sobre la placa seleccionando el tipo de anticuerpo que se

adsorbe En la Fig 23 se muestra el esquema del ensayo tipo A

IgM Antiacutegeno ligado a biotina streptavidina conjugada a HRP

Bloqueante IgG anti-IgM Reactivo de color

Figura 23 Esquema de ensayo ELISA tipo captura claacutesico A Un anticuerpo anti IgMh captura una

porcioacuten de las IgM presentes en el suero humano una porcioacuten de estas IgM capturadas son especiacuteficas

para antiacutegeno de T gondii y se revela su presencia por medio del antiacutegeno recombinante ligado a biotina

streptavidina ligada a HRP adicionando el sustrato de la enzima y un cromoacutegeno actuando como

cosustrato

La segunda alternativa que denominamos tipo B sale del esquema tradicional de

los ELISA Se adsorbe el antiacutegeno recombinante sobre la superficie de la placa de

poliestireno enfrentaacutendola luego al suero a ensayar Asiacute se captura selectivamente las

inmunoglobulinas que reconocen al antiacutegeno Luego se expone la placa al mismo

antiacutegeno recombinante pero ligado a biotina que se uniraacute a los anticuerpos especiacuteficos

para dicho Ang previamente capturados Finalmente se revela con HRP conjugada a

streptavidina que forma un complejo estable con biotina De esta forma se aumenta la

cantidad de Ang marcado en mayor proporcioacuten para IgM que para IgG dada la

Introduccioacuten

9

multivalencia de este isotipo de inmunoglobulina En la Fig 24 se muestra el segundo

esquema que fue el que brindoacute los resultados maacutes promisorios

Antiacutegeno (Ang) Bloqueante Ang ligado a biotina Reactivo de color

IgM a-Ang IgG a-Ang streptavidina conjugada a HRP

Figura 24 Esquema de ensayo ELISA de captura tipo B El antiacutegeno expuesto en la placa captura la

porcioacuten de las IgM e IgG especiacuteficas presentes en el suero humano Haciendo uso de la polivalencia de

las IgM su presencia se revela con el antiacutegeno conjugado a biotina streptavidina ligada a HRP

adicionando el sustrato de la enzima y un cromoacutegeno actuando como cosustrato

2135 Obtencioacuten de antiacutegenos para diagnoacutestico

El diagnoacutestico de rutina de la toxoplasmosis se basa en la deteccioacuten seroloacutegica de

anticuerpos en el paciente Los antiacutegenos utilizados en estas pruebas seroloacutegicas son

generalmente proteiacutenas derivadas de ceacutelulas T gondii que se propagan en el ratoacuten o el

cultivo de ceacutelulas El cultivo y el mantenimiento de este paraacutesito es laborioso lento y

caro (Lau amp Fong 2006) El uso de antiacutegenos nativos de taquizoitos es difiacutecil de

estandarizar y con frecuencia produce reacciones positivas falsas (Hiszczyntildeska-Sawicka

y col 2005) Por lo tanto ha habido intentos de producir antiacutegenos a traveacutes de medios

maacutes seguros tales como tecnologiacutea de ADN recombinante La mayoriacutea de estos

esfuerzos se han centrado en los principales antiacutegenos de superficie del paraacutesito como el

antiacutegeno de superficie 1 (SAG1 del ingleacutes Surface antigen 1) y el antiacutegeno de superficie

2 (SAG2 del ingleacutes Surface antigen 2) (Lau amp Fong 2006) En estudios recientes se ha

estado evaluando que la presencia de IgM e IgG anti P35 seriacutea un mejor indicador de

infeccioacuten reciente que la evaluacioacuten de IgM utilizando taquizoitos enteros en ensayos

del tipo ELISA (Lu y col 2006) En efecto con la nueva tecnologiacutea de ADN

Introduccioacuten

10

recombinante es posible obtener cualquier proteiacutena contaacutendose ademaacutes con ventajas

como la posibilidad de seleccionar porciones especiacuteficas de un Ang para evitar

reacciones inespeciacuteficas ligar distintas porciones que naturalmente corresponden a otras

proteiacutenas para aumentar la sensibilidad del ensayo agregar secuencias aminoaciacutedicas

que faciliten la posterior purificacioacuten y estandarizacioacuten de la proteiacutena a utilizar

(Hiszczyntildeska-Sawicka y col 2005) A la postre todo el proceso resulta maacutes

econoacutemico seguro y confiable que la purificacioacuten de Angs a partir del microorganismo

nativo puesto que no requiere la manipulacioacuten de microorganismos patoacutegenos ya que

la expresioacuten de las proteiacutenas recombinantes se lleva adelante en microorganismos no

infectivos de raacutepido crecimiento (Babaie y col 2013)

Por lo arriba expresado debe seguirse un esquema para seleccionar cuales deben de

ser las proteiacutenas que conviene utilizar acorde al diagnoacutestico que se pretende abordar y

ello demanda un trabajo racional de seleccioacuten de antiacutegenos generalmente

inmunodominantes No obstante escoger tales proteiacutenas no es tarea sencilla por cuanto

la verificacioacuten del grado de bondad del Ang seleccionado exige una ardua tarea

experimental siendo conveniente acotar el nuacutemero de Angs alternativos a evaluar Un

modo de encarar esto es procurar predecir el grado de antigenicidad en base a la

secuencia aminoaciacutedica lo cual puede realizarse computacionalmente

214 Prediccioacuten de epiacutetopes reconocidos por ceacutelulas B

Los programas de prediccioacuten definen el grado de antigenicidad por medio de una

puntuacioacuten (score) en algunos casos para cada epiacutetope y en otros para cada residuo

amino aciacutedico En este uacuteltimo se puede definir una regioacuten antigeacutenica cuando varios

residuos con alta puntuacioacuten son adyacentes en la estructura primaria Por otra parte el

nuacutemero de epiacutetopes o regiones antigeacutenicas que los programas de prediccioacuten encuentran

depende de un umbral que es configurado por el usuario

En la actualidad los inmunoensayos para determinar anticuerpos son realizados

utilizando regiones antigeacutenicas definidas ya sea como moleacuteculas uacutenicas mezcla de

varios componentes o como antiacutegenos de fusioacuten multiepiacutetope (Camussone 2009) El

desarrollo de herramientas informaacuteticas para predecir de forma fiable la antigenicidad

de los epiacutetopes puede reducir el costoso y prolongado trabajo experimental requerido

para identificar las regiones de intereacutes (Namrata amp Rajat 2010) Al momento de

identificar estas regiones antigeacutenicas suele contarse soacutelo con la estructura primaria de

las proteiacutenas en estudio desconocieacutendose su estructura terciaria en la mayoriacutea de los

Introduccioacuten

11

casos De aquiacute que la prediccioacuten de epiacutetopes lineales es el meacutetodo maacutes utilizado para

seleccionar epiacutetopes putativos

Desde el informe inicial de Hopp y Woods en 1981 (Hopp amp Woods 1981) varios

procedimientos se han hecho populares para detectar epiacutetopes lineales reconocidos por

ceacutelulas B a partir de la estructura primaria de una proteiacutena El rendimiento de estos

programas auacuten no ha logrado una eficiencia oacuteptima seguacuten lo declarado por sus propios

autores (Kolaskar amp Tongaonkar 1990 Saha y col 2005 Saha amp Raghava 2006

Larsen y col 2006 Davydov amp Tonevitskii 2009)

La literatura sobre las aplicaciones de estos programas estaacute orientada

principalmente a identificar posibles vacunas (Namrata amp Rajat 2010) Por lo tanto la

sensibilidad (probabilidad de obtener un positivo entre los verdaderos positivos) y la

especificidad (probabilidad de obtener un negativo entre aquellos negativos verdaderos)

son los indicadores maacutes utilizados para evaluar la calidad de estos programas ya que un

uacutenico epiacutetope puede ser crucial para lograr una respuesta inmunoprotectora Al mismo

tiempo suele omitirse el valor predictivo positivo (VPP) que es la proporcioacuten de

muestras que dan positivo el ensayo siendo verdaderos positivos o sea es la capacidad

para encontrar los epiacutetopes reales de una proteiacutena (ver el recuadro 1) Sin embargo la

fiabilidad del epiacutetope predicho es maacutes importante que su sensibilidad para reducir el

nuacutemero de experimentos confirmatorios de su utilidad diagnoacutestica Es entonces

importante diferenciar ambos paraacutemetros ya que los programas de prediccioacuten pueden

realizar predicciones de baja sensibilidad pero al mismo tiempo si los epiacutetopes reales

fueron predichos la prediccioacuten presenta un alto VPP

Recuadro 1

Los casos posibles en un ensayo son

Verdaderos

positivos

Verdaderos

negativos

Ensayo

positivo A B

Ensayo

negativo C D

BA

A positivo predictivoValor

DB

D dadEspecifici

CA

A adSensibilid

Introduccioacuten

12

La falta de estudios comparativos entre los programas de prediccioacuten en la literatura

actual impide que los usuarios hagan la mejor eleccioacuten Por ello como trabajo inicial se

intentoacute evaluar los distintos programas disponibles en la red en cuanto a su capacidad

para predecir positivamente epiacutetopes

Introduccioacuten

13

22 Tuberculosis

221 Generalidades

La tuberculosis (TB) humana es una enfermedad infecto-contagiosa causada por la

bacteria Mycobacterium tuberculosis La infeccioacuten por M tuberculosis suele ser

asintomaacutetica en personas sanas dado que su sistema inmune es capaz de controlar la

bacteria No obstante en condiciones de desnutricioacuten o inmunocompromiso la

enfermedad suele ser grave La TB es una enfermedad vinculada a la pobreza que

puede afectar a adultos joacutevenes en edad productiva

La enfermedad se transmite por el aire de una persona a otra a traveacutes de gotiacuteculas

que portan bacterias Cuando una persona con infeccioacuten activa en pulmones o garganta

tose estornuda habla o canta las personas cercanas pueden respirar las bacterias

liberadas e infectarse

La enfermedad suele afectar los pulmones pero tambieacuten puede involucrar otros

oacuterganos como rintildeones columna vertebral y cerebro Los siacutentomas de la TB pulmonar

activa son tos a veces con esputo sanguinolento dolor toraacutecico debilidad peacuterdida de

peso fiebre y sudoracioacuten nocturna Si no se trata adecuadamente puede ser mortal La

mayoriacutea de las muertes por TB se producen en los paiacuteses en viacuteas de desarrollo (Paacutegina

web del CDC b)

La Organizacioacuten Mundial de la Salud (OMS) estima en 2000 millones a los

infectados por M tuberculosis que anualmente hay 9 millones de nuevos infectados y

que mueren casi 2 millones de personas al antildeo por causa de esta enfermedad (Paacutegina

web de la OMS)

222 Mycobacterium tuberculosis

Esta micobacteria tambieacuten conocida como Bacilo de Koch es una bacteria aacutecido-

alcohol resistente frecuentemente incolora y es aeroacutebica estricta Es muy resistente al

friacuteo la congelacioacuten y la desecacioacuten y por el contrario es muy sensible al calor la luz

solar y la luz ultravioleta Su replicacioacuten es muy lenta (una divisioacuten cada 16 a 20 horas)

y ante circunstancias adversas puede entrar en estado latente pudiendo retrasar su

multiplicacioacuten desde algunos diacuteas hasta varios antildeos El reservorio natural de M

tuberculosis es el hombre tanto el individuo infectado asintomaacutetico como el enfermo

con infeccioacuten activa Su clasificacioacuten taxonoacutemica se detalla en la Tabla 22

Introduccioacuten

14

Tabla 22 Ubicacioacuten taxonoacutemica de M tuberculosis

Reino Bacteria

Phylum Actinobacteria

Clase Actinobacteria

Sub-clase Actinobacteridae

Orden Actinomycetales

Sub-orden Corynebacterineae

Familia Mycobacteriaceae

Geacutenero Mycobacterium

Especie tuberculosis


El diagnoacutestico de la infeccioacuten tuberculosa se basa en una serie de estudios que se

inicia con placas radiograacuteficas pulmonares y la prueba de la tuberculina que pone de

manifiesto un estado de hipersensibilidad del hueacutesped frente a proteiacutenas de M

tuberculosis Esta sensibilidad se adquiere o bien por infeccioacuten con el bacilo o por

vacunacioacuten con cepas no infectivas (vacuna BCG) En una segunda etapa la infeccioacuten

activa es confirmada por identificacioacuten del agente etioloacutegico en cultivos obtenidos a

partir de la muestra bioloacutegica remitida al laboratorio Auacuten cuando la conjuncioacuten de los

meacutetodos de anaacutelisis vigentes permite un diagnoacutestico certero de la TB humana es

frecuente que se requiera de un prolongado tiempo de espera hasta la confirmacioacuten de la

infeccioacuten activa por cuanto ello depende del lento proceso de replicacioacuten del bacilo

Esto conlleva que exista potencialidad de contagio a individuos sanos y se comprometa

maacutes la salud del infectado

En los uacuteltimos antildeos se han desarrollado teacutecnicas de deteccioacuten de M tuberculosis

que involucran al bacterioacutefago D29 (en adelante fago) capaz de infectar

especiacuteficamente micobacterias (Park y col 2003 Mc Nerney y col 2004) Esta

metodologiacutea se basa en procesar la muestra del paciente sospechada de contener M

tuberculosis ponerla en contacto con el fago e incubarla para permitir su replicacioacuten

Finalmente se evaluacutea el tiacutetulo de los fagos liberados infectando un cultivo testigo de M

smegmatis (micobacterias de raacutepido crecimiento susceptibles al fago) y contando las

placas de lisis que se obtienen Esta novedosa metodologiacutea si bien indirecta y

preliminar permite reducir considerablemente los tiempos de diagnoacutestico puesto que se

trabaja con especies de crecimiento raacutepido Sin embargo al utilizar el conteo de placas

de lisis como eje central para el diagnoacutestico de infeccioacuten activa se recae en largos

Introduccioacuten

15

periacuteodos de incubaciones que podriacutean evitarse si se contase con otro meacutetodo de evaluar

la integridad celular de M smegmatis

Por lo arriba expuesto es que en este trabajo se intento desarrollar una nueva

metodologiacutea de verificacioacuten de lisis de micobacterias utilizando teacutecnicas

intriacutensecamente raacutepidas como son las electroquiacutemicas que en un futuro podriacutean

facilitar el diagnoacutestico de infeccioacuten tuberculosa

Introduccioacuten

16

23 Biodiesel

El grave impacto de la utilizacioacuten de combustibles derivados del petroacuteleo en el

medio ambiente la limitada disponibilidad de petroacuteleo crudo y sobre todo la

inestabilidad de los mercados del petroacuteleo han estimulado actualmente la propagacioacuten

de combustibles liacutequidos alternativos (Monteiro y col 2008) La organizacioacuten

American Society for Testing and Materials ASTM define biodiesel como una mezcla

de eacutesteres monoalquiacutelicos de aacutecidos grasos de cadena larga derivados de aceites

vegetales o grasas animales (American Society for Testing and Materials paacutegina web)

El biodiesel puro generalmente no se utiliza como combustible sino que suele

encontrase en mezcla con diesel de petroacuteleo El biodiesel es clasificado utilizando la

notacioacuten Bxx donde xx indica el porcentaje en volumen de contenido de biodiesel en el

liacutequido Asiacute B100 es biodiesel puro B50 contiene 50 en volumen de biodiesel B5

contiene 5 en volumen etc Las mezclas comerciales maacutes comunes son B2 B5 y B20

El biodiesel se obtiene a partir de la transesterificacioacuten de gliceroliacutepidos con

alcoholes de cadena corta como el etanol o el metanol siendo el glicerol el principal

subproducto en la elaboracioacuten de este combustible junto a productos menores como

mono y diacil gliceroles o aacutecidos grasos libres La masa de glicerol generada equivale

aproximadamente al 10 en peso del total del combustible producido siendo eacuteste uno

de los contaminantes frecuentes

231 Determinacioacuten de glicerol libre en biodiesel

La presencia de glicerol es indicativa de la calidad del biodiesel transformaacutendose

en un analito de intereacutes para la creciente industria de energiacuteas alternativas a la derivada

del refinamiento del petroacuteleo

Los meacutetodos quiacutemicos maacutes simples para cuantificar glicerol se basan en su

oxidacioacuten a formaldehiacutedo utilizando peryodato Luego el formaldehiacutedo formado se

determina cuantitativamente por diversos meacutetodos ya sea basados en reacciones

especiacuteficas evaluando los productos por diferentes metodologiacuteas o por titulacioacuten con

NaOH valorado (Lapenaite y col 2007)

La norma ASTM-D 6584 establece un meacutetodo basado en cromatografiacutea gaseosa

que permite la determinacioacuten en simultaacuteneo de glicerina libre y total (glicerol maacutes

mono di y trigliceacuteridos) No obstante este procedimiento no es aplicable a los eacutesteres

metiacutelicos de aceites vegetales obtenidos a partir de aceites laacuteuricos tales como aceite de

Introduccioacuten

17

coco o de palma quedando restringido el meacutetodo soacutelo para un grupo de biodiesels

particulares

En cuanto a los meacutetodos cromatograacuteficos tienen la desventaja de ser poco

amigables con el medio ambiente dado el profuso uso de solventes orgaacutenicos que son

potencialmente contaminantes a veces se tornan laboriosos y utilizan instrumental e

insumos caros

Considerando lo expresado arriba en este trabajo se ha planteado cuantificar

glicerol utilizando una metodologiacutea esencialmente econoacutemica simple y no

contaminante como lo son las teacutecnicas electroquiacutemicas convencionales

Introduccioacuten

18

24 Marco teoacuterico de las teacutecnicas electroquiacutemicas utilizadas

Los meacutetodos electroquiacutemicos de anaacutelisis estudian el analito de intereacutes mediante la

medicioacuten de los paraacutemetros fiacutesicos como potencial eleacutectrico yo corriente en una celda

electroquiacutemica El proceso fundamental en las teacutecnicas electroquiacutemicas es la

transferencia de electrones entre especies redox y la superficie del electrodo (Bard amp

Faulkner 2001) Este puede describirse con la siguiente reaccioacuten

O + ne- R [21]

Para reacciones reversibles y raacutepidas el potencial sigue la ley de Nernst

[22]

siendo y las actividades de las especies reducida y oxidada en la interfaz

electrodosolucioacuten respectivamente

La corriente que circula por la celda es la carga transportada por unidad de tiempo y

puede expresarse como

[23]

De acuerdo a las leyes de Faraday la carga circulante (Q) es proporcional a los

moles de especie reducida u oxidada (N) El factor de proporcionalidad es la carga del

electroacuten (n) por la constante de Faraday (F)

[24]

Combinando las Ecs 23 y 24 obtenemos

[25]

A medida que avanza la reaccioacuten se consume la especie electroactiva esto

produce un gradiente de concentracioacuten entre el seno de la solucioacuten y las inmediaciones

del electrodo donde la especie es electrotransformada y consecuentemente asociado se

Introduccioacuten

19

generaraacute un transporte de masa por difusioacuten Si el proceso estaacute bajo control difusional

la primera ley de Fick permite describir el flujo de partiacuteculas en funcioacuten de la posicioacuten

ec 26 y la segunda ley de Fick lo describe en funcioacuten de la variacioacuten de la

concentracioacuten de la especie electroactiva en funcioacuten del tiempo ec 27

[26]

[27]

donde D es el coeficiente de difusioacuten de la especie en estudio El gradiente de

concentracioacuten se generaraacute soacutelo para la especie electroactiva que se transforma en la

superficie del electrodo y su transporte de masa se verificaraacute en direccioacuten ndashx es decir

hacia el electrodo si se define x = 0 en la superficie Luego considerando la reaccioacuten de

reduccioacuten ec 21 el flujo J corresponderaacute al nuacutemero de partiacuteculas de O que cambian de

posicioacuten en direccioacuten -x con el tiempo por unidad de aacuterea y puede expresarse como

[28]

Combinando las ecs 26 27 y 28 obtenemos la expresioacuten combinada de las leyes

de Fick para una especie que estaacute reaccionando sobre un electrodo de aacuterea A

[29]

o directamente

[210]

Reemplazando en la ec 25 obtenemos una expresioacuten para la corriente (I) que

circula por la celda en la que se lleva a cabo la reaccioacuten ec 21 sobre un electrodo

uniformemente accesible de aacuterea A y cuando el transporte de masa es exclusivamente

controlado por difusioacuten

[211]

expresioacuten que indica que la corriente es directamente proporcional al gradiente de

concentracioacuten generado por efecto de la reaccioacuten electroacutedica

Introduccioacuten

20

Para un sistema en estado estacionario en el cual la velocidad de transformacioacuten de

la especie electroactiva es igual a la de transferencia de masa y suponiendo que la

reaccioacuten cumple las condiciones de rapidez y reversibilidad (Ec de Nernst) podemos

llegar a describir la relacioacuten entre la corriente circulante por la celda y el potencial al

cual se lleva adelante la reaccioacuten por

[212]

donde KR y KO son constantes que dependen del aacuterea del electrodo de trabajo y los

coeficientes de difusioacuten de las especies reducida y oxidada respectivamente e Il es la

corriente liacutemite

Se define como potencial de media onda al potencial al cual el valor de corriente es

la mitad del valor de corriente liacutemite y queda expresado por la siguiente ecuacioacuten

[213]

Tomando esta definicioacuten y operando en la ec 212 se arriba a la expresioacuten que

describe la corriente como funcioacuten del potencial de electrodo

ndash [214]

ecuacioacuten que corresponde a una funcioacuten sigmoidea por lo tanto al realizar un barrido

de potencial desde un potencial al cual no existe reaccioacuten electroacutedica hacia un potencial

al cual es posible reducir la especie electroactiva hasta alcanzar el estado estacionario la

corriente variaraacute con el potencial siguiendo la forma de una curva sigmoidea

Durante la ejecucioacuten del presente trabajo se utilizaron diversas teacutecnicas

voltamperomeacutetricas cronoamperometriacutea voltametriacutea de barrido lineal voltametriacutea

ciacuteclica y voltametriacutea de onda cuadrada Se pasa a comentar brevemente cada una de

ellas

241 Cronoampreometriacutea

En esta teacutecnica se estudia como variacutea la corriente que circula por la celda en

funcioacuten del tiempo transcurrido mientras el electrodo de trabajo es sometido a un

Introduccioacuten

21

determinado potencial Al aplicar un pulso de potencial se modifica el equilibrio de la

reaccioacuten redox ec 21 se pasa de un potencial inicial donde no ocurre reaccioacuten

electroacutedica a un potencial donde las especies pueden intercambiar electrones en la

interfaz electrodosolucioacuten favoreciendo la reaccioacuten en uno u otro sentido dependiendo

del potencial aplicado Esto da lugar a una corriente liacutemite difusional que variacutea en

funcioacuten del tiempo Para un electrodo uniformemente accesible esta corriente estaacute

descripta por la ec 211 Fijando las condiciones de contorno correspondientes al

experimento en cuestioacuten

t = 0 C0 = Cinfin (no hay reaccioacuten en el electrodo)

t ge0 lim C = Cinfin

t ge0 C0 = 0

donde C0 y Cinfin son las concentraciones de la especie electroactiva en la interfaz

electrodosolucioacuten y en el seno de la solucioacuten respectivamente Es posible entonces

resolver la ecuacioacuten diferencial de la segunda ley de Fick donde la solucioacuten viene dada

por la denominada ecuacioacuten de Cottrell

[215]

donde Id(t) es la corriente controlada por difusioacuten

En este trabajo se utilizoacute esta teacutecnica porque permite cuantificar glicerol utilizando

diferentes electrodos de trabajo seguacuten el medio especiacutefico donde se encuentre disuelto

242 Teacutecnicas voltameacutetricas

Todas las teacutecnicas voltameacutetricas tienen en comuacuten que el potencial eleacutectrico al que

se somete el electrodo de trabajo variacutea en funcioacuten del tiempo En todos los casos se

realiza un barrido lineal de potencial que va desde el potencial inicial (Ei) hasta un

potencial final (Ef) Este barrido se realiza a una velocidad constante que es el cociente

entre el salto (discreto) de potencial y el tiempo de duracioacuten de ese salto La forma en

que se realiza el barrido de potencial es lo que diferencia a una teacutecnica voltameacutetrica de

otra

Introduccioacuten

22

2421 Voltametriacutea de barrido lineal

En esta teacutecnica se realiza un barrido desde un potencial inicial (Ei) al cual no existe

proceso de transferencia de electrones en la interfaz electrodosolucioacuten y soacutelo podraacute

apreciarse corriente debida a procesos no faraacutedicos hasta un potencial final (Ef) En la

medida que el potencial aumenta alcanza un valor al cual ocurre la reaccioacuten electroacutedica

comenzando un flujo de carga debido a procesos faraacutedicos En la Fig 25 se muestra el

perfil del potencial en funcioacuten del tiempo utilizando el modo normal (en peldantildeos) para

el caso de los experimentos realizados con el instrumento utilizado en el presente

trabajo (Eco Chemie 2000)

Figura 25 Perfil de potencial en funcioacuten del tiempo Si bien el potencial es una variable continua un

potenciostato real solo puede establecer variaciones discretas de potencial de aquiacute que en lugar de

observar una ―rampa se observe una escalera

Para una reaccioacuten de reduccioacuten reversible ec 21 a medida que el potencial

aumenta se incrementaraacute la corriente siguiendo la forma de una sigmoidea (seguacuten la ec

21) Sin embargo cuando la velocidad de transporte de masa por difusioacuten de la especie

O sea menor que la velocidad de consumo por la reaccioacuten electroacutedica no seraacute posible

alcanzar el estado estacionario y la corriente llegaraacute a un maacuteximo Ip De aquiacute en maacutes la

corriente comenzaraacute a decaer con t12

tal como lo describe la ecuacioacuten de Cottrell ec

215 En la Fig 26 se muestra el perfil de corriente que se obtienen en experimentos

voltameacutetricos claacutesicos

t

Salto de potencial

Duracioacuten del salto

E

Introduccioacuten

23

Figura 26 Perfiles de corriente en funcioacuten del potencial para experimentos voltameacutetricos de barrido

lineal Liacutenea azul la velocidad de barrido es lo suficientemente baja establecieacutendose un estado

estacionario Liacuteneas verde negra y roja la velocidad de barrido es alta y se origina un pico de corriente

La corriente de pico crece proporcionalmente a la raiacutez cuadrada de la velocidad de barrido

El maacuteximo de corriente tambieacuten denominado corriente de pico se puede obtener a

partir de la ecuacioacuten de Randles-Sevcik (Bard amp Faulkner 2001)

[216]

siendo la temperatura 25 degC y donde A estaacute en cm2 D en cm

2 s

-1 C en mol cm

-3 y en

V s-1

2422 Voltametriacutea ciacuteclica

En esta teacutecnica se realiza un barrido desde un potencial inicial (Ei) a un primer

veacutertice de potencial (Ev1) y a partir de alliacute se invierte la direccioacuten de barrido hasta

llegar a un segundo veacutertice de potencial (Ev2) el cual puede coincidir con el Ei El perfil

de potencial en funcioacuten del tiempo que se obtiene utilizando el instrumento con el que

se trabajoacute y de acuerdo a lo indicado por el fabricante se esquematiza en la Fig 27

(izquierda) y el perfil de corriente en funcioacuten del potencial para una reaccioacuten reversible

se esquematiza en la Fig 27 (derecha)

Idif

IP

Introduccioacuten

24

Fig 27 Perfil de potencial en funcioacuten del tiempo (izquierda) Perfil de corriente en funcioacuten del

potencial para una reaccioacuten redox reversible (derecha)

En este trabajo se realizaron experimentos de voltametriacutea ciacuteclica para identificar la

presencia de mediadores redox que presentando reacciones electroacutedicas reversibles

permitieran la regeneracioacuten del cofactor de la enzima glicerol deshidrogenasa (GlDH)

Esta teacutecnica tambieacuten se utilizoacute para calcular las aacutereas de los electrodos de trabajo de

modo tal de normalizar la sentildeal obtenida con la superficie del electrodo utilizado

Ademaacutes se utilizoacute para cuantificar glicerol e identificar los potenciales de oxidacioacuten del

mismo

243 Teacutecnicas de pulso

Las teacutecnicas de pulso surgieron vinculadas a la polarografiacutea de corriente continua

la teacutecnica voltameacutetrica cuya particularidad es utilizar un electrodo de goteo de mercurio

Este grupo de teacutecnicas se ha ido diversificando a medida que se fueron haciendo maacutes

complejos tanto los esquemas de potenciales aplicados a los electrodos de trabajo

como las medidas de intensidades de corrientes (Bard amp Faulkner 2001)

2431 Voltamperometriacutea onda cuadrada VOC

Esta teacutecnica tiene varias ventajas entre las que se encuentran su excelente

sensibilidad (se han registrado liacutemites de deteccioacuten directa del orden de 10-8

M) la

eliminacioacuten de las corrientes de fondo y la rapidez con que se lleva a cabo el

experimento completo ya que se puede trabajar a velocidades de barrido de potencial

auacuten superiores a 1 V s-1

(Bard amp Faulkner 2001)

El perfil de potencial aplicado al electrodo de trabajo en funcioacuten del tiempo en la

VOC se presenta en la Fig 28 Consta de una onda cuadrada simeacutetrica con una

amplitud Ep superpuesta a una escalera de potencial con escalones o saltos de

potencial Es (Fig29) donde el pulso hacia adelante de la onda cuadrada coincide con

el escaloacuten de potencial de la escalera

E

I

Introduccioacuten

25

La utilizacioacuten de la teacutecnicas voltamperomeacutetricas de pulso presentan la ventaja de

permitir realizar un barrido de potencial donde la especie electroactiva se oxida

raacutepidamente produciendo una sentildeal analiacutetica No es necesario trabajar durante periacuteodos

prolongados de tiempo a los elevados potenciales donde se establece la corriente liacutemite

controlada por difusioacuten como lo requiere la teacutecnica amperomeacutetrica

Figura 28 Perfil de potencial aplicado al electrodo de trabajo en la VOC en funcioacuten del tiempo En

liacutenea cortada se indica cual es la escalera de potencial a la cual se le sobreimprime la onda cuadrada Se

indican resaltados ( ) los tiempos durante los que se realizan las lecturas de corriente En un ciclo se

realizan las lecturas de corrientes alta y baja Adaptado de Bard amp Faulkner 2001

Figura 29 a) Onda cuadrada simeacutetrica b) Perfil de potencial en funcioacuten del tiempo de una escalera

de potencial

a)

b)

E

E

E

t

Amplitud de la

onda cuadrada EP

Periacuteodo de la onda

Salto o escaloacuten

de potencial ES

Medida

alta

Medida

baja

t


de potencial ES

t

Amplitud de la

onda cuadrada

EP


Introduccioacuten

26

El potensiostato registra la corriente durante la medida alta y la medida baja de un

ciclo La diferencia de estas corrientes es la corriente neta Ineta que se grafica en

funcioacuten del potencial de la escalera de potencial correspondiente a ese ciclo (liacutenea

cortada Fig 28) Para sistemas reversibles se obtiene una curva como se observa en la

Fig 210 donde se indican las corrientes de la medida alta de la medida baja y neta

que resulta en un pico de corriente La corriente de pico neta IP n observada en la VOC

es proporcional a la concentracioacuten de la especie electroactiva en el seno de la solucioacuten y

se centra alredewdor del potencial de la cupla redox

Figura 210 Voltamperograma de onda cuadrada tiacutepico para un sistema reversible la corriente neta

Ineta se obtiene por la diferencia entre la corriente registrada al finalizar el pulso I medida alta y la

corriente registrada previamente al nuevo pulso I medida baja

La frecuencia ( f ) de la onda cuadrada medida en Hz se define como

1f [217]

Siendo el periacuteodo de la onda cuadrada medido en segundos que a su vez es dos

veces el tiempo del pulso Pt por lo tanto tenemos que

P2

1

tf [218]

Luego

ft

2

1P [219]

Los valores de frecuencia pueden variar desde unos pocos Hz hasta varios miles

dependiendo de las condiciones particulares del caso La velocidad de barrido v queda

definida como el producto del salto de potencial ES por la frecuencia f

fSEv [220]

Introduccioacuten

27

Las velocidades de barrido en los experimentos de VOC se obtienen modificando la

frecuencia de la onda cuadrada ya que el salto de potencial suele ser un valor fijo

Se demostroacute que para cuplas redox controladas por difusioacuten los paraacutemetros de la

VOC maacutes adecuados son E = 50n mV y Es = 10n mV (Osteryoung y Osteryoung

1985)

Cuando se aplica un pulso de potencial en las cercaniacuteas del potencial de la cupla

redox las corrientes faradaicas aumentan significativamente conforme se oxida o se

reduce la especie electroactiva Estas corrientes decaen con el tiempo seguacuten la ecuacioacuten

de Cottrel ya expresada anteriormente como ec [215]

Si consideramos t como tP se observa que la disminucioacuten del tiempo del pulso

implica mayor corriente Luego a medida que se aumenta la frecuencia aumenta la

velocidad de barrido y disminuye el tiempo del pulso Para sistemas reversibles se

predice que la intensidad tiene una dependencia lineal con la raiacutez cuadrada de la

frecuencia (Osteryoung y Osteryoung 1985)

21 fBAnIp [221]

La eleccioacuten de la frecuencia adecuada es de suma importancia A frecuencias muy

altas aumentan significativamente las corrientes capacitivas perdiendose resolucioacuten lo

que impone un liacutemite al aumento de la frecuencia

25 Biosensores

En muchas determinaciones de analitos en muestras bioloacutegicas se necesitan pasos

previos a la evaluacioacuten propiamente dicha que permiten eliminar o enmascarar las

potenciales interferencias Sin embargo el pretratamiento de la muestra puede llevar a

una disminucioacuten de la concentracioacuten del analito ya sea por peacuterdidas en las etapas

consecutivas del anaacutelisis o por transformacioacuten del analito provocando errores por

defecto en la determinacioacuten (Lagier amp Verdini 2000) Cuando la evaluacioacuten de la

concentracioacuten del analito se utiliza con fines cliacutenicos tal resultado erroacuteneo puede

conducir a un diagnoacutestico incorrecto Es por ello que en la actualidad el desarrollo de

nuevas metodologiacuteas analiacuteticas tiende no soacutelo a acortar los tiempos de anaacutelisis

previnieacutendose asiacute las peacuterdidas por degradacioacuten del analito sino que ademaacutes procura

permitir la ejecucioacuten del anaacutelisis sin pasos separativos previos

En los uacuteltimos antildeos se ha avanzado en el desarrollo de biosensores ya que estos

dispositivos presentan ventajosas caracteriacutesticas que los convierten en herramientas

Introduccioacuten

28

prometedoras de anaacutelisis (Belluzo y col 2008) Los biosensores se pueden definir como

dispositivos analiacuteticos compuestos por dos componentes principales

1- Una superficie selectiva denominada bioreceptor o superficie bioreactiva (SBR)

generalmente de origen bioloacutegico o sinteacutetica biomimeacutetica la cual en contacto con la

muestra es capaz de interaccionar de manera especiacutefica con el analito (Vo-Dinh amp

Allain 2003) Este elemento es el que aporta la especificidad del dispositivo

2- Un transductor fiacutesico-quiacutemico encargado de producir una sentildeal que es funcioacuten

de la interaccioacuten entre el analito y la SBR (Vo-Dinh amp Allain 2003) Eacuteste es el

elemento que aporta la sensibilidad al dispositivo

Los biosensores pueden ser clasificados de acuerdo a la sentildeal fiacutesico-quiacutemica que

produce el transductor de acuerdo a

Sentildeal Biosensor

Cambio de temperatura Termomeacutetrico

Cambio en paraacutemetro eleacutectrico Electroquiacutemico

Cambio en propiedades de la luz Oacuteptico

Cambio de masa Piezoeleacutectrico Acuacutestico

(Adaptado de Vo-Dinh amp Allain 2003)

De los distintos tipos de biosensores los electroquiacutemicos han sido tradicionalmente

los maacutes desarrollados y usados debido a sus ventajas con respecto a otros biosensores

tales como la generacioacuten de una respuesta electroacutenica directa que permite una raacutepida

respuesta mayor simplicidad operativa versatilidad para la miniaturizacioacuten y bajo

costo Actualmente gracias al avance de la tecnologiacutea de los semiconductores y la

serigrafiacutea pueden ser producidos masivamente Dependiendo del paraacutemetro fiacutesico

medido por el detector los biosensores electroquiacutemicos pueden a su vez subdividirse en

conductimeacutetricos potenciomeacutetricos y amperomeacutetricos (Vo-Dinh amp Allain 2003)

251 Superficie de bioreconocimiento en biosensores

La SBR es un sistema bioloacutegico o biomimeacutetico que reacciona bioquiacutemica o

quiacutemicamente con el analito En la actualidad existe una gran diversidad de elementos

bioloacutegicos o derivados de ellos que son utilizados como SBR

Los mismos van desde moleacuteculas simples a sistemas complejos (Vo-Dinh amp Allain

2003) Asiacute la SBR puede contener antiacutegenos anticuerpos aacutecidos desoxiribonucleicos

(ADN) aacutecidos ribonueleicos (ARN) enzimas receptores de membrana tejidos

Introduccioacuten

29

microorganismos completos o compuestos sintetizados ―ad-hoc que emulan especies

bioloacutegicas como pueden ser estructuras biomimeacuteticas y poliacutemeros molecularmente

impresos (Vo-Dinh amp Allain 2003)

252 Biosensores amperomeacutetricos

De los biosensores electroquiacutemicos los amperomeacutetricos suelen presentar mayores

sensibilidades (Iost y col 2011)

En la Fig 211 se esquematiza un biosensor amperomeacutetrico El analito presente en

la muestra compleja reacciona selectivamente con la SBR lo que desencadena la sentildeal

analiacutetica en el transductor fiacutesico-quiacutemico

En este caso particular el transductor es un electrodo de trabajo que integra una

celda de tres electrodos El mismo estaacute sometido a un potencial eleacutectrico (con respecto a

un electrodo de referencia) y la sentildeal analiacutetica es la corriente eleacutectrica que circula por la

celda utilizando un contraelectrodo de gran aacuterea En estas condiciones la maacutexima

intensidad de corriente eleacutectrica que se observa estaacute limitada exclusivamente por la

reaccioacuten de oacutexido-reduccioacuten que ocurre en la superficie del electrodo de trabajo

Figura 211 El electrodo de trabajo es sometido a un potencial eleacutectrico en su superficie tiene lugar

la reaccioacuten de oacutexido-reduccioacuten Dicha reaccioacuten ocurre o no o bien transcurre a velocidades diferentes en

presencia o ausencia del analito de intereacutes

253 Biosensores de uso cliacutenico

En el caso de muestras para el diagnoacutestico cliacutenico de infecciones el analito a

determinar puede ser alguna de las moleacuteculas generadas por el individuo infectado

como respuesta a la presencia del agente infeccioso por ej los anticuerpos (Acs)

especiacuteficos o el agente infeccioso iacutentegro o partes del mismo En muchos casos la sola

presencia de Acs especiacuteficos es por siacute misma indicativa de infeccioacuten Hay casos en que

Introduccioacuten

30

la presencia de Acs no es per-seacute indicativa de infeccioacuten riesgosa Dos ejemplos de esta

situacioacuten son el de la toxoplasmosis y la tuberculosis

En el caso de la toxoplasmosis la deteccioacuten de Acs anti-T gondii es soacutelo de

trascendental importancia en embarazadas porque si la infeccioacuten ha sido adquirida

durante el embarazo el feto estaacute en riesgo de contagiarse y puede padecer lesiones

severas (Dunn y col 1999 Montoya amp Liesenfeld 2004) Por el contrario si se trata

de infeccioacuten croacutenica no es necesario exponer a la embarazada (y al feto) a medicacioacuten

innecesaria evitaacutendose con ello los riesgos que devienen del uso de los faacutermacos

especiacuteficos utilizados durante el tratamiento de la infeccioacuten (Freij amp Sever 1999)

Debido a la incertidumbre que acompantildea la deteccioacuten de los anticuerpos hasta hoy

utilizados con este fin se ha propuesto realizar pruebas utilizando antiacutegenos

recombinantes del paraacutesito Se ha evaluado el desempentildeo de antiacutegenos recombinantes

sintetizados por teacutecnicas de biologiacutea molecular en forma individual o mezclados para

evaluar la avidez de Acs IgG (Beghetto y col 2003) Se observoacute que utilizando el

fragmento del antiacutegeno MIC3 en este ensayo los iacutendices de avidez permitieron

determinar la antiguumledad de la infeccioacuten con mayor grado de certeza que empleando

homogenado total de paraacutesito resultando MIC3 un buen marcador para el diagnoacutestico

de infecciones agudas (Beghetto y col 2003) La proteiacutena recombinante P35 tambieacuten

fue propuesta como marcador seroloacutegico para diferenciar infeccioacuten aguda de croacutenica ya

que evidencioacute sensibilidades del 853 para sueros agudos y una especificidad del 98

respecto de sueros croacutenicos (Parmley y col 2000) No obstante y a pesar de haberse

descrito moleacuteculas para el diagnoacutestico de toxoplasmosis aguda no existe un acuerdo

sobre su efectividad por lo que se requiere de la evaluacioacuten de nuevos antiacutegenos para

este fin En general el uso de una sola moleacutecula recombinante no brinda suficiente

sensibilidad habieacutendose demostrado que el empleo de varios antiacutegenos recombinantes

la mejora (Pinon y col 2003) Se ha observado tambieacuten que una mezcla de moleacuteculas

no produce los mismos resultados que cuando se utilizan en forma separada (Silveira y

col 2001) Se ha postulado que esta diferencia se debe a las distintas caracteriacutesticas

fisicoquiacutemicas entre las moleacuteculas de una mezcla que impide la inmovilizacioacuten

homogeacutenea en las superficies de captura utilizadas en los inmunoensayos Por lo tanto

resulta muy factible que un ensayo que utilice una combinacioacuten o fusioacuten en una sola

moleacutecula de estos antiacutegenos recombinantes marcadores de infeccioacuten reciente pueda

mejorar el diagnoacutestico diferencial tal como ha sido demostrado para el diagnoacutestico de

otras infecciones (Camussone y col 2009)

Introduccioacuten

31

En el caso de la tuberculosis la mayoriacutea de los individuos de la poblacioacuten han

recibido la vacunacioacuten reglamentaria por inoculacioacuten de una cepa de micobacterias

inofensivas generando Acs anti-Mycobacterium tuberculosis (M tuberculosis) Por

ello estos Acs suelen estar presentes en casi toda la poblacioacuten De aquiacute que la deteccioacuten

de Acs anti-M tuberculosis no demuestra infeccioacuten activa de riesgo Por tal motivo el

indicador por excelencia de infeccioacuten activa es la evidenciacioacuten del patoacutegeno en la

muestra No obstante las muestras suelen poseer una extremadamente baja cantidad de

M tuberculosis lo que dificulta su deteccioacuten directa Por ello es preciso utilizar alguacuten

paso amplificador del analito a censar Dado el largo tiempo de replicacioacuten del

microorganismo los cultivos realizados para su replicacioacuten insumen periacuteodos

prolongados Siguiendo los trabajos de Park y col y McNerney y col (Park y col

2003 McNerney y col 2004) se formuloacute la siguiente hipoacutetesis de trabajo Sistemas

enzimaacuteticos presentes en M smegmatis permitiriacutean metabolizar sustratos electroactivos

a distintas velocidades de reaccioacuten dependiendo de la integridad del microorganismo

Siendo este el caso seriacutea posible distinguir entre cultivos de M smegmatis que han sido

lisados por el fago especiacutefico D29 de aquellos cultivos en que dichas micobacterias

estaacuten iacutentegras Si soacutelo existiera lisis cuando la muestra ensayada contiene organismos

filogeneacuteticamente emparentados como M tuberculosis que permitiesen la

amplificacioacuten selectiva del fago D29 previamente a la infeccioacuten del cultivo testigo de

M smegmatis la evaluacioacuten electroquiacutemica del sustrato metabolizable por el

microorganismo deberiacutea permitir evidenciar presencia o ausencia de M tuberculosis La

seleccioacuten del fago D29 se justifica porque es capaz de infectar micobacterias de

crecimiento raacutepido como M smegmatis y las de crecimiento lento como M tuberculosis

(Park y col 2003)

El glicerol es corrientemente utilizado como principal fuente de carbono en cultivos

de micobacterias siendo degradado eficientemente por sus sistemas enzimaacuteticos que

utilizan mecanismos redox En este trabajo nos hemos planteado detectar este

polialcohol como analito de intereacutes ya que su consumo estaraacute preferencialmente

vinculado a la presencia de micobacterias aptas para tal degradacioacuten Por este motivo

proponemos utilizar un bioelectrodo con una SBR que contenga una enzima cuyo

sustrato sea glicerol

Introduccioacuten

32

2531 Biosensores para evaluacioacuten de infeccioacuten toxoplaacutesmica

En el presente trabajo se propuso un biosensor para evaluacioacuten de infeccioacuten

toxoplaacutesmica utilizando un electrodo de oro policristalino macizo sobre el cual se

adsorbioacute un antiacutegeno recombinante y se siguioacute un esquema ELISA del tipo indirecto

con deteccioacuten de IgGh En la Fig 212 se muestra el esquema que se siguioacute para este

inmunoensayo

Proteiacutena recombinante IgG a-IgGh conjugada a HRP

Bloqueante IgG humana ferrocenometanol

Figura 212 Sobre la superficie del electrodo se fija la proteiacutena recombinante que capturaraacute los

anticuerpos especiacuteficos si estaacuten presentes en el suero El revelado se realiza con un segundo anticuerpo

especiacutefico para IgG humana marcado con HRP que en presencia de H2O2 oxida el mediador FcMe que

se reduce sobre la superficie del electrodo generando la sentildeal analiacutetica

254 Biosensores para cuantificacioacuten de glicerol

La determinacioacuten de glicerol ha ido ganando importancia en las uacuteltimas deacutecadas

debido al uso del mismo en varias industrias como la farmaceacuteutica automotriz

alimenticia y textil entre otros El compuesto es un producto importante de la

fermentacioacuten en la mayoriacutea de las bebidas alcohoacutelicas y su concentracioacuten es un

paraacutemetro uacutetil para el seguimiento del proceso fermentativo (Goriushkina y col 2010)

Tambieacuten es un componente no deseable del biodiesel y su concentracioacuten es un indicador

de la calidad del combustible (Monteiro y col 2008)

Se han desarrollado numerosas metodologiacuteas para llevar adelante la cuantificacioacuten

del glicerol que incluyen teacutecnicas espectrofotomeacutetricas yo espectrofluoromeacutetricas

(Bondioli amp Bella 2005 Silva amp Rocha 2010 Lima y col 2012) incluidos los basados

Introduccioacuten

33

en enzimas (Kronka y col 2001 Li y col 2001) los electroquiacutemicos (Tehrani amp

Ghani 2012 Gamella y col 2008 Wu amp Cheng 2005) y los cromatograacuteficos estos

uacuteltimos han sido oficialmente recomendado por la AOAC como los meacutetodos 96809

97210 (AOAC 2005) Sin embargo a pesar de que estos meacutetodos permiten determinar

con eficacia de glicerol en presencia de muchos compuestos que interfieren esta teacutecnica

se considera que es ecoloacutegicamente desfavorable debido a la utilizacioacuten de solventes

nocivos para el medio ambiente e intriacutensecamente onerosa debido a los altos costos de

los mismos (Gamella y col 2008)

Por un lado las propuestas espectrofotomeacutetricas que utilizan enzimas se basan en el

uso de sistemas o bien de una o varias enzimas relativamente caras que se eliminan

despueacutes de que se han utilizado en una uacutenica determinacioacuten En estos casos a menudo

son consumidos las enzimas yo cofactores caros como nicotinamida adenina

dinucleoacutetido (NAD+) o adenosina 5-trifosfato (ATP) a menudo son consumidos

(Kronka y col 2001 Li y col 2001 Wu amp Cheng 2005) Como un ejemplo la

propuesta de Li para determinar glicerol en matrices complejas se basa en el uso de tres

enzimas a saber glicerol quinasa (GK) piruvato quinasa (PK) y lactato

deshidrogenasa (LDH) ademaacutes de utilizar ATP y NAD+ (Li y col 2001) Este meacutetodo

produce buenos resultados en teacuterminos de sensibilidad y especificidad pero consume 1

U de GK 15 U de PK 22 U de LDH 2x10-6

moles de ATP y 33x10-7

moles de

NAD+ por determinacioacuten Por lo tanto el costo derivado por anaacutelisis es considerado

caro sobre todo cuando se debe analizar un elevado nuacutemero de muestras

Por otro lado se han propuesto herramientas versaacutetiles notables para cuantificar

glicerol como ser la basada en tecnologiacutea de biosensores en particular los basados en

meacutetodos amperomeacutetricos (Ghica amp Brett 2006 Gamella y col 2008) De hecho los

biosensores amperomeacutetricos proporcionan suficiente sensibilidad y selectividad para

permitir la determinacioacuten del analito junto con una velocidad apropiada para completar

el anaacutelisis En efecto los biosensores amperomeacutetricos que utilizan enzimas como

componente bioloacutegico para el reconocimiento dan lugar a una selectividad significativa

debido a su capacidad de reaccionar especiacuteficamente con su sustrato Este uacuteltimo es a

menudo el analito de intereacutes por lo que puede ser cuantificado de manera eficiente auacuten

ante la presencia de otros componentes similares estructuralmente que pueden hallarse

en la muestra (Belluzo y col 2008) Los dispositivos construidos con enzimas a

menudo pueden ser reutilizados y por lo tanto el costo por determinacioacuten puede ser

Introduccioacuten

34

reducido significativamente en comparacioacuten con los meacutetodos espectrofotomeacutetricos

mencionados anteriormente

Se han desarrollado varios biosensores utilizando enzimas que tienen como sustrato

al glicerol (Gamella y col 2008) En los disentildeos utilizados se utilizan diversas enzimas

que reaccionan especiacuteficamente con el glicerol en un primer paso y se censa un

producto de esta reaccioacuten En otros disentildeos se encuentran involucradas maacutes de una

enzima donde la segunda o tercer enzima utiliza como sustrato algunos de los

productos de la primera o segunda reaccioacuten y finalmente se censa un producto de la

uacuteltima reaccioacuten enzimaacutetica Algunos disentildeos que aparecieron en literatura al momento

de iniciar este trabajo de tesis fueron detallados por Pingarroacuten y colaboradores (Gamella

y col 2008) y se encuentran resumidos en la Tabla 23 al final de este capiacutetulo y se

corresponden a los esquemas evaluados al momento de iniciar este trabajo de tesis

Todos los disentildeos descriptos al momento presentan la desventaja de ser onerosos

tanto por el disentildeo en siacute como por el costo operativo devenido del consumo de elevadas

cantidades de reactivos caros

Sobre la base del modelo propuesto por Tuntildeoacuten-Blanco y colaboradores (Aacutelvarez-

Gonzaacutelez y col 2000) se comenzaron los ensayos para construir un bioelectrodo

selectivo para glicerol La propuesta contempla en primer lugar disminuir la cantidad

de enzima Glicerol deshidrogenasa En segundo lugar proponemos utilizar la coenzima

NAD(H) en forma soluble e introducir un mediador electroquiacutemico distinto al utilizado

previamente En el trabajo citado se generaba una cupla cataliacutetica por oxidacioacuten

electroacutedica del NAD+ presente en un electrodo de trabajo de pasta de C modificada En

nuestro caso el mediador soluble permite reoxidar la coenzima para cerrar el ciclo

cataliacutetico siguiendo el esquema de la Fig 213

Figura 213 Esquema de reacciones que ocurren en la celda DHA 13 dihidroxiacetona GlDH

gliceroldeshidrogenasa NAD(H) nicotinadenina dinucleoacutetido

glicerol

DHA

GlDHox

GlDHred NAD+

NADH Mediador ox

Mediador red

e- Electrodo

Introduccioacuten

35

Tabla 23 Biosensores selectivos para gicerol Las filas 1 a 10 son un extracto parcial del trabajo de

Gamella y col 2008 En las filas 11 y 12 se incluyen los disentildeos propuestos por Šefčovičovaacute y col

2008 y Goriushkina y col 2010

Electrodo Enzima Mediador Potencial

1 Pt GKGPOx - + 650 mV vs AgAgCl

2 Al GlDH Fe(CN)6 + 400mV vs ECS

3 Barras de grafito

espectroscoacutepico GlDH Complejo de Os + 200 mV vs AgAgCl

4 Serigraacutefico (SPE) pGlyDH N-(4-hidroxibenzilideno)-

4-ferrocenilanilina + 400 mV vs AgAgCl

5 Carboacuten Viacutetreo a) GlDHDP

b) GKGPOxHRP

a)Fe(CN)63-

b)Fe(CN)64-

a) + 350 mV vs AgAgCl

b) - 300 mV vs AgAgCl

6 SPE modificado con

ZrO2 y azul meldola GlDH Azul meldola + 100 mV vs AgAgCl

7 SPE modificado azul

de Prusia

GlDH Tt NADH

Ox Azul de Prusia - 50 mV vs AgAgCl

8 Pasta de carbono GlDH Producto de la electro-

oxidacioacuten del NAD+ + 150 mV vs AgAgCl

9 Flim de carbono a) GPOx

b)GKGPOx Poli (rojo neutro) - 350 mV vs ECS

10 Au a)GlDHDP

b) GKGPOxHRP Tetra thiafulvaleno


b) 0 mV vs AgAgCl

11 Carboacuten Viacutetreo GlDHDP Fe(CN)63- + 350 mV vs AgAgCl

12 Platino serigraacutefico Gox - + 300 mV vs electrodo

intriacutenseco

Tabla 23 Continuacioacuten

Muestra

Rango dinaacutemico

Lineal (M) Sensibilidad

(mA M-1

cm-2

)

Liacutemite de

deteccioacuten (M) Estabilidad

Desde Hasta

1 Mosto de uva 2 10-6

10-3 - 5 10

-7 Hasta 1 mes

2 Jugo de uva 10-6

2 10-3

- 10-6 -

3 Vino 1 10-6

2 10-4

32 1 10-6

80 actividad inicial luego

de 20 horas

4 Vino - - - - actividad enzimaacutetica decae

rapidamente

5 Fermento

anaeroacutebico

1 10-5

1 10-5

10-3

1 10-3

a) 620

b) 142 -

sentildeal inicial luego de

uso continuo a) 60 a 90

hs b) 70 16 hs

6 Fermento de

jugo de uva 10

-51 10

-4 - 10

-6 -

7 - 10-5

1 10-3

- 10-6 -

8 Jarabe 997 10-7

10-4

162 cm2 43 10-7


de 3 diacuteas

9 Vino 10-5

147 10-4

a) 101

b) 079

a) 4 10-6

b) 15 10-5



diacuteas b) 62 8 diacuteas

10 Vino 10

-6

4 10-7

2 10-5

1 10-5

a) 207

b) 250

a) 4 10-7

b) 31




11 Fermento - - - 11 10-6

-

12 Vino 10

-5

2 10-6

25 10-2

64 10-3

-

10-5

2 10-6 -

Objetivos

Objetivos

37

3 Objetivos

31 Objetivos generales

Desarrollar metodologiacuteas electroquiacutemicas que permitan identificar analitos de

intereacutes tanto para el diagnoacutestico cliacutenico como para la industria de combustibles

alternativos

32 Objetivos particulares

a) Obtener bioelectrodos que exhiban una corriente cataliacutetica diferencial al efectuar

inmunoensayos con muestras confirmadas positivas o negativas para infeccioacuten aguda

por T gondii

b) Desarrollar un meacutetodo electroquiacutemico que permita la cuantificacioacuten de glicerol

en medio acuoso para determinarlo por ejemplo luego de su extraccioacuten en

combustibles alternativos

c) Evidenciar electroquiacutemicamente la ocurrencia de lisis de M smegmatis por fagos

D29 indicadores de la presencia de micobacterias patoacutegenas emparentadas

provenientes de individuos padeciendo infeccioacuten tuberculosa

Materiales y Meacutetodos


39

4 Materiales y meacutetodos

41 Reactivos y medios de cultivos

411 Reactivos

Todos los reactivos utilizados fueron de grado analiacutetico salvo que se indique lo

contrario Los aacutecidos aceacutetico sulfuacuterico niacutetrico clorhiacutedrico y percloacuterico las sales KCl

Na2HPO4 KH2PO4 NiSO4 CuSO45H2O y la sal disoacutedica del aacutecido etilen diamino tetra

aceacutetico (EDTA) dimetilsulfoacutexido (DMSO) imidazol tris base las enzimas peroxidasa

de raacutebano picante EC 11117 (tipo VI) (HRP) y glicerol deshidrogenasa de

cellulomonas EC 1116 (GlDH) acrilamida (adecuada para electroforesis) NNprime-(12-

dihidroxietilen) bisacrylamide (97) ditiotreitol (DTT) Coomasie blue G-250 alcohol

isopropiacutelico β-mercaptoetanol 33-diaminobenzidina tetrahidrocloruro (DAB)

nicotina adenina dinucleoacutetico (NAD) los desoxinucleoacutetidos trifosfato dATP dGTP

dCTP y dTTP reactivo de Folin-Ciocalteu glicina albuacutemina seacuterica bovina (ASB)

peptona de carne extracto de levadura fueron suministrados por Sigma-Aldrich El

polvo de carbono viacutetreo (esfeacuterico diaacutemetro de partiacutecula entre 2 y 12 microm pureza

9999+) fue suministrado por Aldrich El polvo de carbono grafito (pureza gt 99) fue

provisto por Fisher Scientific Dimetilformamida (DMF) 1 1rsquo-carbonil-diimidazol las

sales tartrato de sodio y potasio MgCl2 CaCl2 NaCl Na2CO3 NaHCO3 K2CO3

KHCO3 K3Fe(CN)6 K4Fe(CN)6 (NH4)2SO4 (NH4)2S2O8 (gt98) dodecil sulfato de

sodio (Farmacopea Unioacuten Europea) (SDS) NaOH KOH NNNprimeNprime-

tetrametiletilendiamino (Temed) azul de bromofenol (Farmacopea Unioacuten Europea)

xilencianol (para electroforesis) etanol absoluto fueron suministrados por Merck El

H2O2 y el glicerol fueron provistos por Cicareli El isopropil-β-D-1-

tiogalactopiranoacutesido (IPTG) fue suministrado por Promega La enzima ADN polimerasa

de Thermus aquaticus EC 2777 (polimerasa Taq) y los oligonucleoacutetidos fueron

suministrados por InvitrogenTM

Argentina La enzima peroxidasa de raacutebano picante

ligada a estreptavidina (HRP-EAV) fue provista por Abcam El ester biotin n-

hidroxisuccinimida fue provisto por Thermo Scientific La ampicilina (Farmacopea

Argentina) fue provista por laboratorios Klonal La aluacutemina para pulido (tamantildeo de

partiacutecula 03 microm) fue provista por Metrohm El anticuerpo de cabra anti IgG humana

ligado a HRP fue provisto por Zymed El Tween-20 fue provisto por Anhedra

No se detallan los reactivos contenidos en los equipos comerciales utilizados

disponibles en las paacuteginas web de los respectivos proveedores


40

412 Medios de cultivos

Para el crecimiento de cepas de Escherichia coli (E coli) se utilizoacute el medio de

cultivo Luria-Bertani (LB) compuesto por 10 g L-1

peptona de carne 5 g L-1

extracto de

levadura y 10 g L-1

NaCl En los casos requeridos se suplementoacute este medio con el

antibioacutetico ampicilina (100 g mL-1

) Para la preparacioacuten de medios soacutelidos se agregoacute

agar en concentracioacuten final de 15 g L-1

Para el crecimiento de ceacutelulas de M smegmatis se utilizoacute el medio de cultivo

Middlebrook 7H9 provisto en forma anhidra por Difco y fue suplementado con NaCl

CaCl2 yo glicerol en concentraciones variables de acuerdo a los requerimientos del

ensayo analiacutetico ulterior la composicioacuten del medio provisto por Difco se detalla en la

siguiente tabla

Tabla 41 Caldo Middlebrook 7H9 (Difco) composicioacuten en g L-1

del medio liacutequido recieacuten preparado

(NH4)2SO4 050

Na2(HPO4) 250

K(H2PO4) 100

Citrato de sodio 010

MgSO4 005

CaCl2 0005

ZnSO4 0001

CuSO4 0001

Citrato feacuterrico amoacutenico 004

Aacutecido l-glutaacutemico 050

Piridoxina 0001

Biotina 00005

42 Cepas bacterianas

Las cepas bacterianas utilizadas y sus caracteriacutesticas relevantes se detallan en la

siguiente tabla


41

Tabla 42 Cepas bacterianas utilizadas

Cepa Caracteriacutesticas

Escherichia

coli (E coli)

BL21 (DE3)

E F- ompT hsdS (rB-mB-) [lon] (DE3 immP21 int- lacI+

lacUV5lacZT7 ARN polimerasa) Contiene el gen de la T7

ARN polimerasa bajo el control del promotor lacUV5 El gen de

la ARN polimerasa estaacute integrado en el cromosoma bacteriano

desde (DE3) y su expresioacuten se induce por IPTG (Stratagene)

M smegmatis

mc2155

Mycobacterium smegmatis MC2155 es un organismo

aerobio quimioorganotrofo en forma de barra no moacutevil

patoacutegeno de humanos Esta bacteria fue inicialmente aislada de

esmegma humano Esta cepa es un mutante de M smegmatis Es

faacutecilmente transformable con vectores plasmiacutedicos usando

electroporacioacuten

43 Bacterioacutefagos

Se utilizoacute el bacterioacutefago D29 que infecta especiacuteficamente micobacterias Los

trabajos especiacuteficos de infeccioacuten de micobacterias fueron realizados en el Departamento

de Microbiologiacutea de la Facultad de Ciencias Meacutedicas (UNR) bajo la supervisioacuten del Dr

Ricardo Morbidoni

44 Plaacutesmidos

El plaacutesmido utilizado y sus caracteriacutesticas relevantes se detallan en la siguiente tabla

Tabla 43 Plaacutesmido utilizado

Plaacutesmido Caracteriacutesticas

pET32a

5900 pares de bases resistencia ampicilina promotor T7lac Produce

proteiacutenas fusionadas a 6 histidinas y a la proteiacutena tiorredoxina (TRX)

de 204 kDa lo que permite su purificacioacuten en columna de NTA-Ni2+

Este vector fue utilizado como sistema de expresioacuten en la cepa BL21

(DE3) de E coli

45 Reaccioacuten en cadena de la polimerasa

Las reacciones se llevaron a cabo en un volumen total de 25 μL conteniendo

solucioacuten de amplificacioacuten comercial suplementada con MgCl2 para alcanzar una

concentracioacuten final de MgCl2 25 mM y 02 mM de cada uno de los desoxinucleoacutetidos

trifosfato dATP dGTP dCTP y dTTP 20 pmoles de cebador directo y reverso y 1 UI

de polimerasa Taq Se empleoacute un termociclador BOECO (Germany) y se inicioacute la

reaccioacuten con un paso de desnaturalizacioacuten a 95 ordmC durante 5 min La amplificacioacuten de

los fragmentos se realizoacute en 30 ciclos de a) desnaturalizacioacuten 1 min a 95degC b)


42

hibridizacioacuten 1 min a la temperatura oacuteptima para cada par de cebadores c) extensioacuten

72degC 15 min por cada Kpb amplificado finalmente se realizoacute un paso de extensioacuten

durante 10 min

Para la reaccioacuten de amplificacioacuten de la secuencia codificante de la proteiacutena se

disentildearon oligonucleoacutetidos cebadores especiacuteficos (ver maacutes adelante) En el disentildeo de los

mismos se introdujeron sitios de restriccioacuten apropiados para el posterior clonado del

fragmento en vectores de clonado o expresioacuten

Como molde se utilizoacute aproximadamente 003 g de ADN plasmiacutedico

Como cebadores se utilizaron los oligonucleoacutetidos (provistos por Invitrogen)

P22C directo 5- GGATCCACCACCGAGACGCCAGC -3

P22C reverso 5- GAATTCTTGCCCGTGAGAGACACAG -3

46 Electroforesis de ADN en geles de agarosa

Los fragmentos de ADN (ADN plasmiacutedico productos de PCR) fueron separados

mediante electroforesis en geles de agarosa de distinta concentracioacuten (08 a 2) seguacuten

el tamantildeo de los fragmentos a separar Se utilizoacute el sistema de tipo submarino La

solucioacuten reguladora tris-aceacutetico-EDTA (TAE) 05 X se utilizoacute como solucioacuten de

electroforesis y para la preparacioacuten de geles A estos uacuteltimos se les agregoacute el agente

intercalante bromuro de etidio en una concentracioacuten final de 03 g mL-1

antes de su

gelificacioacuten Previo a la siembra las muestras se mezclaron con solucioacuten de siembra

compuesta por 0025 (mv) azul de bromofenol 0025 (mv) xilencianol y 30

(vv) glicerol en una proporcioacuten 51 en volumen de muestra solucioacuten de siembra

Como marcadores de peso molecular se utilizaron Ladder 100 pb PB-L (Productos Bio-

Loacutegicos) La corrida electroforeacutetica se realizoacute a un potencial constante de 100 V con

una fuente BIO-RAD modelo 3000xi Luego de la electroforesis el ADN se visualizoacute

por fluorescencia en un transiluminador de luz ultravioleta Fotodyne y las imaacutegenes se

digitalizaron con una caacutemara FUJIFILM modelo FinePix A120

47 Minipreparacioacuten de ADN plasmiacutedico

El ADN plasmiacutedico se preparoacute a partir de cultivos celulares de E coli conteniendo

los plaacutesmidos de intereacutes seguacuten el meacutetodo de lisis alcalina o bien utilizando los equipos

comerciales ―WIZARDreg

PLUS SV Minipreps DNA purification system (Promega) El

resultado de la preparacioacuten se evaluoacute realizando una electroforesis en gel de agarosa de

una aliacutecuota de la misma


43

48 Purificacioacuten del producto de amplificacioacuten

La purificacioacuten de aacutecidos nucleicos a partir de geles de agarosa se realizoacute utilizando

el equipo comercial ―GFXTM Gel Band Purification Kit (Amersham GE Healthcare)

seguacuten las especificaciones del fabricante El resultado de la purificacioacuten se evaluoacute

realizando una electroforesis en gel de agarosa de una aliacutecuota de la elusioacuten obtenida

49 Prueba de expresioacuten de proteiacutenas de fusioacuten a TRX y a ldquocolardquo de histidinas

Se cultivaron clones de las cepas de E coli BL21 (DE3) transformadas con el

vector pET32a (con el inserto correspondiente) haciendo distintas diluciones 175

1100 y 1200 de un cultivo saturado en 2 mL de LB fresco (suplementado con

ampicilina a 100 μg mL-1

) y cultivando a 37 ordmC con agitacioacuten vigorosa (180 rpm) hasta

una densidad oacuteptica a 630 nm (DO630nm) aproximada de 05 unidades Se indujo la

expresioacuten de la proteiacutena recombinante con IPTG (concentracioacuten final 1 o 01 mM)

durante 3 4 o 12 hs a 37 ordmC y con agitacioacuten vigorosa Posteriormente se cosecharon las

ceacutelulas centrifugando a 3000 rpm durante 10 min Finalmente se lisaron las ceacutelulas con

pulsos de ultrasonido utilizando un sonicador analoacutegico Sonifierreg S450A y se

separaron las fracciones soluble e insoluble del extracto por centrifugacioacuten a 18000 g

durante 20 min

410 Expresioacuten y purificacioacuten preparativas de antiacutegenos recombinantes

Se cultivoacute la cepa de E coli transformada con el vector pET32a con el inserto

correspondiente haciendo una dilucioacuten 1100 de un cultivo saturado en dos porciones

de 150 mL de LB suplementado con ampicilina (100 microg mL-1

) y cultivando a 37ordm C

hasta una DO630nm 05 Se agregoacute IPTG hasta concentracioacuten final oacuteptima 1 mM para

el Ang P35B o 01 mM para el Ang P22C y se indujo el tiempo oacuteptimo 4 h para el Ang

P35B o 12 h para el Ang P22C a 37ordm De esta manera se obtuvo la proteiacutena de fusioacuten

en forma soluble Se cosecharon las ceacutelulas por centrifugacioacuten y se lavaron con solucioacuten

tampoacuten fosfato (Na2HPO4 10 mM NaCl 05 M pH 8) Luego se las resuspendioacute en 20

mL de solucioacuten de lisis (Na2HPO4 50 mM NaCl 05 M pH 8) Las ceacutelulas se lisaron

por sonicado aplicando pulsos de 30 s de duracioacuten hasta clarificacioacuten del medio en

hielo Se separoacute la fraccioacuten soluble de la insoluble por centrifugacioacuten a 18000 g y 4 ordmC

La fraccioacuten soluble se congeloacute durante 24 h a -20 ordmC y se descongeloacute en hielo luego se

centrifugoacute nuevamente a 18000 g y 4 ordmC Este paso se repitioacute dos veces

Posteriormente se realizoacute una separacioacuten cromatograacutefica de afinidad con una columna


44

de 5 mL empacada manualmente con resina Ni Sepharosetrade High Performance en

condiciones nativas elusioacuten con imidazol 250 mM seguacuten las especificaciones del

proveedor (GE Healthcare) En los sucesivos pasos se recogieron aliacutecuotas y se verificoacute

la purificacioacuten visualizando por electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida

(SDS-PAGE)

411 Separacioacuten de proteiacutenas mediante SDS-PAGE

Se utilizaron geles de 12 y de 15 de acrilamidabisacrilamida 291 Las

muestras se sembraron en geles desnaturalizantes mezclaacutendolas 21 con solucioacuten de

siembra 2 X compuesta por Tris-HCl pH 68 125 mM SDS 4 β-mercapto etanol 5

vv(alternativamente se usoacute DTT 200 mM) glicerol 20 y azul de bromofenol 02

Las corridas electroforeacuteticas se hicieron en solucioacuten Tris-glicina-SDS (Tris base 302

g L-1

glicina 144 g L-l SDS 1 g L

-1) Los geles fueron tentildeidos con azul brillante de

Coomasie G-250

412 Cuantificacioacuten de proteiacutenas

Se utilizoacute el meacutetodo propuesto por Lowry (Lowry y col1951) seguacuten el siguiente

protocolo un volumen de muestra cuya concentracioacuten de proteiacutena se desea determinar y

uno o dos testigos de albuacutemina (conteniendo tiacutepicamente de 5 a 25 microg de proteiacutenas

totales) se disolvieron en 040 mL de agua destilada y se mezclaron con 150 mL de

reactivo C preparado inmediatamente antes de usar El reactivo C se preparoacute mezclando

una parte de tartrato de sodio y potasio 2 mv una parte de CuSO4 1 mv y 100

partes de solucioacuten tampoacuten carbonato 2 mv e hidroacutexido de sodio 01 N Se dejoacute

reaccionar la mezcla durante 15 min a temperatura ambiente y luego se adicionoacute 0150

mL de reactivo de Folin-Ciocalteu diluido 13 con agua destilada inmediatamente antes

de usar Se dejoacute reposar durante 45 min y se leyoacute la absorbancia a 660 nm

413 Reaccioacuten de conjugacioacuten biotina-antiacutegeno

Previo a la reaccioacuten de conjugacioacuten el antiacutegeno P35B purificado se llevoacute a una

concentracioacuten final de 2 mg mL-1

(como miacutenimo) en solucioacuten tampoacuten carbonato de

sodio 01 M (pH 85) usando las membranas de poro controlado Amicon Ultra-4

(Millipore Co) seguacuten las instrucciones del proveedor Se disolvieron 20 mg del eacutester

biotinil-n-hidroxisuccinimida (BNHS) en 590 microL de DMSO e inmediatamente despueacutes

se mezclaron 80 microL de esta solucioacuten con 800 microL de solucioacuten de Ang


45

Al antiacutegeno P22C purificado se lo llevoacute a una concentracioacuten final de 20 mg mL-1

(como miacutenimo) en solucioacuten tampoacuten carbonato de sodio 01 M (pH 85) usando las

membranas de poro controlado mencionadas Se disolvieron 25 mg BNHS en 590 microL

de DMSO e inmediatamente despueacutes se mezclaron 120 microL de esta solucioacuten con 100

mL de solucioacuten de Ang Se incuboacute 4 h a temperatura ambiente con agitacioacuten suave Se

eliminaron los restos de eacutester hidrolizado y se cambioacute la solucioacuten tampoacuten carbonato por

PBS 1 X pH 74 haciendo lavados reiterados y reteniendo el Ang en las membranas de

poro controlado

414 Revelado cromogeacutenico de la reaccioacuten de conjugacioacuten

El antiacutegeno marcado con biotina respectivo fue retenido en membrana de

nitrocelulosa sembrando 1 L del mismo sobre la membrana Se procedioacute a bloquear

los sitios activos de la membrana con leche descremada disuelta al 5 mv en PBS pH

74 durante 1 h Se realizaron 3 lavados con PBS pH 74 de 1 min cada uno Se incuboacute

la membrana con la enzima peroxidasa de raacutebano picante ligada a streptavidina (HRP-

EAV) disuelta en PBS pH 74-leche descremada al 1 mv Posteriormente se

realizaron 3 lavados con PBS pH 74 de 1 min cada uno Finalmente se reveloacute la

presencia de la enzima HRP con el reactivo de color recieacuten preparado seguacuten 5 mg de

33-diaminobenzidina tetrahidrocloruro (DAB) se disolvieron en 500 microL de DMSO y se

llevoacute a 100 mL de volumen final con PBS pH 74 A esta solucioacuten se le agregaron 100

microL de H2O2 10 voluacutemenes inmediatamente previo a su utilizacioacuten

415 Mediciones espectrofotomeacutetricas

Para las medidas de absorbancia (Abs) a longitudes de onda especiacuteficas o la

realizacioacuten de espectros de absorcioacuten ultravioleta-visible se utilizoacute el espectrofotoacutemetro

Beckman DU 640 Como celda se utilizoacute una cubeta de cuarzo de 1 cm de paso oacuteptico

416 Ensayos de inmunoabsorcioacuten ligados a enzima con deteccioacuten fotomeacutetrica

Como soporte soacutelido se utilizaron microplacas Microlon 600 high binding Greiner

Bio One provistas por GBO Argentina Para las lecturas de Abs se utilizoacute un lector de

microplacas PowerWave XS (BioTek) o alternativamente se utilizoacute el lector ELx808

Absorbance Microplate Reader (BioTek) Los ensayos preliminares se detallan en la

secioacuten 6 Experimentos Auxiliares


46

4161 Esquema A

Sobre las microplacas de ELISA Microlon 600 high binding Greiner Bio One se

depositaron 100 microL de anticuerpo de captura (IgG de conejo anti IgM humana) provisto

por Dakko diluido 11000 en PBS pH 74 Se incubaron 48 h a 37 degC Luego se

realizaron 3 lavados con PBS Tween 20 al 005 (PBS-T) de 1 min cada uno Se

procedioacute al bloqueo de los sitios libres de la placa con 100 microL leche descremada

comercial (marca Milkaut) al 1 mv en PBS durante 30 min a 37 degC y se realizaron 3

lavados con PBS-T de 1 min cada uno Luego se incubaron con suero humano (muestra

incoacutegnita) 1100 en PBS con leche descremada al 1 mv durante 1 h a 37 degC y se

realizaron 3 lavados con PBS-T de 1 min cada uno Se realizaron distintas incubaciones

con los antiacutegenos P22C y P35B conjugados a biotina Luego de tres lavados con PBS-T

se incubaron con la enzima HRP-EAV en una dilucioacuten 12000 durante 1 h a 37degC

Posteriormente se realizaron 3 lavados con PBS-T para finalmente revelar utilizando

50 microL de solucioacuten comercial de 33prime55prime-tetrametilbenzidina (TMB) sustrato de la

enzima HRP que da coloracioacuten azul en el medio de reaccioacuten pasando a amarillo y

permaneciendo estable el color cuando se detiene la reaccioacuten acidificando el medio con

H2SO4 05 M

4162 Esquema B

Sobre las microplacas de ELISA comerciales se depositaron 500 ng de Ang P22C

disueltos en 100 L de solucioacuten carbonato pH 96 incubando 1 h a 37 degC Se realizaron

3 lavados con PBS Tween 20 al 005 (PBS-T) de 1 min cada uno Se bloquearon los

sitios libres de la placa con 100 microL leche descremada 1 mv en PBS durante 30 min a

37 degC Luego se realizaron 3 lavados con PBS-T de 1 min cada uno Se incubaron con

suero humano (muestra incoacutegnita) 1100 en PBS con leche descremada al 1 mv

durante 1 h a 37 degC Luego se realizaron 3 lavados con PBS-T de 1 min cada uno Se

realizoacute una incubacioacuten con el antiacutegeno P22C conjugado a biotina Luego de tres lavados

con PBS-T se incubaron con la enzima HRP-EAV en una dilucioacuten 12000 durante 1 h

a 37degC Posteriormente se realizaron 3 lavados con PBS-T Finalmente se reveloacute con

50 microL de solucioacuten comercial de TMB y se detuvo la reaccioacuten acidificando el medio con

50 microL H2SO4 05 M


47


espectrofotomeacutetrico

Se llevaron a cabo dos tipos de ensayos diferentes Por un lado se utilizoacute el meacutetodo

enzimaacutetico con un equipo comercial provisto por Wiener Lab TG GPO PAP AA (liacutenea

liacutequida) ensayando muestras de aliacutecuotas del medio Middlebrook 7H9 suplementadas

con glicerol en lugar de suero humano Por otro lado se realizaron reacciones de color

que se llevaron a cabo en un volumen final de 100 mL que resultoacute de la mezcla de 950

microL de reactivo A y 50 microL de muestra la cual consistioacute en medio de cultivo de

micobacterias Middlebrook 7H9 suplementado con distintas cantidades de glicerol En

los blancos de reaccioacuten se realizoacute un agregado de medio de cultivo Middlebrook 7H9

sin glicerol de igual volumen que en los otros dos casos para mantener las mismas

condiciones que en las otras reacciones

El reactivo A se preparoacute inmediatamente antes de ser usado mezclando los

reactivos necesarios seguacuten se indica en la siguiente tabla

Tabla 44 Mezcla de reactivos necesaria para preparar 950 microL de reactivo A (necesario para 1 reaccioacuten)

Los voluacutemenes necesarios para un nuacutemero n de reacciones se obtuvieron multiplicando por n

los voluacutemenes de esta tabla

Reactivo Volumen para una

reaccioacuten ( L)

Solucioacuten Tampoacuten carbonato

0125 M pH 105 815

K3Fe(NC)6 10-2

M 100

(NH4)2SO4 10 M 10

NAD+ 10

-2 M 25

Enzima GlDH 2 mg mL-1

1

Las reacciones se llevaron a cabo en tubos de Khan cerrados con parafilm para

evitar evaporacioacuten de liacutequido y en bantildeo termostatizado a 37 ordmC La lectura de

absorbancia se realizoacute cuando se cumplioacute una o dos h de iniciada la reaccioacuten seguacuten la

necesidad del ensayo Los experimentos se realizaron por triplicado


Procedimiento seguido a medios de cultivos Middlebrook 7H9 se los suplementoacute

con glicerol a concentracioacuten 0025 mv y se cultivaron cantidades iguales de ceacutelulas

de M smegmatis algunos medios se conservaron sin adicionar micobacterias en


48

condiciones de esterilidad Se tomaron aliacutecuotas de estos cultivos a distintos tiempos Se

centrifugaron a 12500 rpm durante 5 min para separar las ceacutelulas del sobrenadante y a

estos uacuteltimos se los congeloacute a -20ordmC para su posterior anaacutelisis

Se realizaron determinaciones de glicerol con la teacutecnica fotomeacutetrica propuesta Se

realizaron reacciones de color por triplicado a las muestras e independientemente se

hizo un blanco de reaccioacuten y 2 testigos cuyas concentraciones fueron de 001 y 004

mv

4181 Determinacioacuten de glicerol remanente en cultivos de micobacterias con y sin

fago D29 y ensayos controles respectivos


con glicerol a 0025 mv y se cultivaron cantidades iguales de a) ceacutelulas de M

smegmatis b) ceacutelulas de M smegmatis infectadas con fago D29 c) fagos D29 d)

algunos medios se conservaron sin adicionar micobacterias ni fagos en condiciones de

esterilidad Se tomaron aliacutecuotas de estos medios inmediatamente despueacutes de realizados

los inoacuteculos (tiempo 0) a las 2 h y a las 4 h de iniciados los cultivos Se centrifugaron a

12500 rpm durante 5 min para separar las ceacutelulas del sobrenadante y a estos uacuteltimos se

los congeloacute a -20 ordmC para su posterior anaacutelisis A estas muestras se les realizaron

determinaciones del glicerol remanente con la teacutecnica fotomeacutetrica propuesta Se

realizaron reacciones de color por triplicado a cada muestra utilizaacutendose como testigos

los medios en condiciones de esterilidad

419 Instrumental electroquiacutemico

Para los experimentos electroquiacutemicos se utilizoacute un analizador electroquiacutemico

Autolab (Eco Chemie) con amplificador electromeacutetrico diferencial PGSTAT 30 Se

utilizoacute una celda convencional de tres electrodos

4191 Electrodos de trabajo

41911 Bioelectrodo para evaluacioacuten de infeccioacuten toxoplaacutesmica

Se utilizaron electrodos macizos tipo ―banderita de oro de aproximadamente 1

cm2 de aacuterea geomeacutetrica El ensamblado se realizoacute de acuerdo al siguiente protocolo los

electrodos limpios se sumergieron durante 14 h en una solucioacuten de aacutecido 3 mercapto

propanosulfoacutenico preparada inmediatamente antes de usar disolviendo 22 mg en 12 mL

de H2SO4 0021 M (desoxigenenada con burbujeo de N2) en atmoacutesfera de N2 a


49

temperatura ambiente (TA) Luego de enjuagar con agua destilada se sumergieron en

una solucioacuten de Ang recombinante P22C 02 mg mL-1

(PBS pH 74) durante 1 h a TA

Luego de un lavado con PBS se bloquearon los sitios libres no modificados con el Ang

sumergiendo los electrodos en solucioacuten de caseinato de sodio 01 mg mL-1

(preparada

inmediatamente antes de usar) 30 min a 37 degC Los electrodos se lavaron con PBS

Tween-20 05 mv y se sumergieron en una dilucioacuten 1200 de suero humano (muestra

incoacutegnita) en PBS durante 30 min a 37 degC Se lavaron con PBS Tween-20 05 y

finalmente se incubaron en una dilucioacuten 11500 de anticuerpos de conejo anti IgGh-

HRP Los biosensores asiacute ensamblados se guardaron en PBS pH 74 a 4degC hasta su

utilizacioacuten

41912 Electrodos para cuantificacioacuten de glicerol

Como electrodos de trabajo se utilizaron oro platino plata carbono viacutetreo pasta

de carbono (viacutetreo y grafito) y pastas de carbono modificadas

Los electrodos metaacutelicos y de carbono viacutetreo fueron provistos por Metrohm

(numero de cataacutelogo 612043XX) consistentes en barras del material de 3 mm de

diaacutemetro embutidas en un armazoacuten aislante

Las pastas de carbono utilizadas se enumeran a continuacioacuten indicando los

porcentajes en masa de cada componente respectivamente

a) Pasta A carbono viacutetreo aceite mineral (7030)

b) Pasta B carbono viacutetreo aceite mineral GLDH (68302)

c) Pasta C carbono viacutetreo aceite mineral GLDH MWCNT (5830210)

Las pastas se prepararon mezclando los componentes en mortero de aacutegata durante

15 a 20 min hasta obtener una mezcla homogeacutenea a la vista Cuando se utilizoacute enzima

GlDH se dispersoacute en aceite mineral primero y luego se mezcloacute con el polvo de carbono

viacutetreo Cuando se utilizaron NTC (MWCNT nanotubos de carbono de pared multiple)

se dispersoacute primero la enzima luego los NTC y finalmente el polvo de carbono viacutetreo

Asiacute preparadas se empaquetaron firmemente en un armazoacuten de tefloacuten (diaacutemetro 3 mm)

y se friccionoacute firmemente sobre un papel liso apoyado en un vidrio para eliminar el

exceso de pasta y pulir la superficie expuesta del electrodo

Cuando se utilizaron electrodos de pasta de carbono con las pastas B se realizoacute una

cubierta de poli-(o-fenilendiamino) que inmovilizara la enzima Una vez empaquetada

la pasta en el armazoacuten de Teflon se sumergioacute en una solucioacuten de o-fenilendiamino 5 x

10-4

M en solucioacuten tampoacuten carbonato 01 M (pH 10) Se burbujeoacute N2(g) para eliminar el


50

O2(g) de la solucioacuten y dejar una atmoacutesfera libre de O2(g) Para electropolimerizar se

realizoacute un barrido de potencial ciacuteclico desde -051 V a + 069 V a 50 mV s-1

Finalmente se enjuagoacute con solucioacuten amortiguadora carbonato 01 M (pH 10)

4192 Limpieza de electrodos

Los electrodos de oro macizo policristalino tipo ―banderita se sumergieron en

solucioacuten ―pirantildea (H2SO4 concentrado peroacutexido de hidroacutegeno 30 en una relacioacuten 31)

durante 30 min a 80ordmC Luego se los enjuagoacute con abundante agua destilada En caso de

limpieza maacutes rigurosa previo al tratamiento con solucioacuten ―pirantildea se los colocoacute a la

llama directa hasta rojo vivo (Ribone y col 2006)

Los electrodos de oro policristalino macizo insertos en una barra de tefloacuten (Tips de

Au) se limpiaron siguiendo el siguiente protocolo desengrase frotaacutendolo sobre tela de

pulido humedecida con DMSO Lavado con abundante agua destilada Pulido con

suspensioacuten acuosa de aluacutemina (diaacutemetro promedio de partiacutecula 03 microm) sobre tela de

pulido Lavado con abundante agua destilada Sonicado durante 5 min en sonicador

Cole-Palmer 8890 Luego de un enjuague con abundante agua destilada se sumergieron

en HNO3 9 M durante 1 min a 60 ordmC Finalmente se lavaron con abundante agua

destilada

4193 Determinacioacuten del aacuterea real del electrodo

Para la determinacioacuten del aacuterea real de los electrodos metaacutelicos se utilizaron dos

metodologiacuteas in-situ

41931 Medicioacuten de la adsorcioacuten de oxiacutegeno

Se asume que el oxiacutegeno se quimioadsorbe en una capa monoatoacutemica antes de la

evolucioacuten de 02 con una correspondencia de uno-a-uno con los aacutetomos metaacutelicos de la

superficie El valor de la carga asociada a la reduccioacuten de la monocapa de oacutexido en

superficies de oro policristalino que se utilizoacute fue de 390plusmn10 microC cm-2

(Trasatti amp Petrii

1991)

Se realizaron VCs en H2SO4 a 50 mVs-1

y se midioacute la carga correspondiente al pico

de desorcioacuten de O2 sobre la superficie del electrodo y este valor se dividioacute por el valor

de referencia


51

41932 Voltametriacutea ciacuteclica de ferricianuro de potasio

Registrando VCs a varias velocidades de barrido de potencial conociendo el

coeficiente de difusioacuten del ioacuten su concentracioacuten en la celda y midiendo la corriente de

pico a cada velocidad de barrido es posible determinar el aacuterea real del electrodo de

trabajo utilizando la ecuacioacuten de Randles Sevcik ec[216] (Belluzo y col 2008)

[216]


2 s

-1 C en mol cm

-3 y

en V s-1

420 Medidas electroquiacutemicas

Todos los potenciales fueron medidos y referidos al electrodo de AgAgCl (KCl

300 M) que se utilizoacute como electrodo de referencia Como contraelectrodos se

utilizaron dos tipos uno de oro de superficie mayor a 5 veces la superficie del electrodo

de trabajo cuando se utilizaron electrodos metaacutelicos como electrodos de trabajo y una

barra de carbono viacutetreo cuando se utilizaron electrodos de pasta de C como electrodos

de trabajo En todos los casos las soluciones se burbujearon con N2 durante 1 min para

desplazar el O2 disuelto y se mantuvieron en atmoacutesfera de N2 durante las

determinaciones

Las voltametriacuteas ciacuteclicas se realizaron equilibrando el sistema al potencial de inicio

Para muestras conteniendo glicerol y utilizando electrodos de oro se realizaron

barridos desde -030 V hasta 060 V a distintas velocidades de barrido Cuando se

utilizaron electrodos de platino se realizaron barridos desde -080 V hasta 020 V a

distintas velocidades de barrido Cuando se utilizaron electrodos de pasta de carbono o

pasta de carbono modificada se realizaron barridos de potencial desde -040 V hasta

100 V Las corrientes que se informan son las intensidades de pico obtenidas trazando

una liacutenea de base recta desde los extremos del pico de corriente utilizando algoritmos

propios del programa General Purpose Electrochemical System (GPES)

4201 Mediciones amperomeacutetricas para evaluacioacuten de infeccioacuten toxoplaacutesmica

Las amperometriacuteas realizadas con el bioelectrodo para evaluacioacuten de infeccioacuten

toxoplaacutesmica se llevaron adelante en solucioacuten PBS (pH 74) FeMe 3 mM El potencial

de trabajo fue de 008V Se registroacute la corriente de base hasta que se estabilizoacute y una


52

vez estable (usualmente a los 250 s) se adicionoacute el sustrato de la enzima (H2O2)

concentracioacuten en celda 18 mM y se registroacute la corriente final (500 s) La corriente

cataliacutetica se evaluoacute como la diferencia entre la corriente final y la de base

4202 Mediciones amperomeacutetricas para cuantificacioacuten de glicerol

42021 Amperometriacuteas con tip de oro

Las amperometriacuteas con tip de oro se realizaron en medio NaOH 01 M a potencial

constante (01 V) y a temperatura ambiente (20 a 25 ordmC) El sistema se preacondicionoacute

aplicando un potencial de 05 V se dejoacute equilibrar y se registroacute la corriente de base en

esas condiciones (generalmente a los 50 s) Luego se adicionoacute la muestra de forma de

lograr la concentracioacuten final de analito deseada La corriente fue registrada y se midioacute

una vez que se estabilizoacute (aproximadamente a los 400 s) La corriente cataliacutetica se

evaluoacute como la diferencia entre la corriente final y la de base

42022 Amperometriacuteas con electrodos de pasta de C

Las amperometriacuteas donde se utilizoacute la pasta de carbono B se realizaron en solucioacuten

tampoacuten carbonatobicarbonato de potasio 100 mM (NH4)2SO4 25 mM K3Fe(CN)6

1mM NAD+ 05 mM pH 105 Se trabajoacute a potencial constante 038 V y a temperatura

ambiente (25 ordmC) El sistema se preacondicionoacute aplicando el potencial de trabajo

correspondiente durante 50 s una vez iniciada la lectura de corriente se dejoacute equilibrar

y se registroacute la corriente de base en esas condiciones usualmente a los 300 s Luego se

adicionoacute la cantidad necesaria de muestra de forma de lograr la concentracioacuten final de

analito deseada La corriente fue registrada y se midioacute una vez que se estabilizoacute

(aproximadamente a los 500 s) La corriente cataliacutetica se evaluoacute como la diferencia

entre la corriente final y la de base

Las amperometriacuteas donde se utilizoacute la pasta de carbono C se realizaron en solucioacuten

tampoacuten carbonatobicarbonato de potasio 100 mM (NH4)2SO4 25 mM NAD+ 05 mM

pH 105 a potencial constante 051 V y a 25 ordmC El sistema se preacondicionoacute aplicando

el potencial de trabajo correspondiente durante 50 s una vez iniciada la lectura de

corriente se dejoacute equilibrar y se registroacute la corriente de base en esas condiciones

usualmente a los 300 s Luego se adicionoacute la cantidad necesaria de muestra de forma

de lograr la concentracioacuten final de analito deseada La corriente fue registrada y se

midioacute una vez que se estabilizoacute (aproximadamente a los 200 s del agregado) La

corriente cataliacutetica se evaluoacute como la diferencia entre la corriente final y la de base


53

Cuando el tiempo de equilibrado no fue suficiente para que la corriente de base se

estabilizara se recurrioacute a realizar correcciones de liacutenea de base A tal fin se llevaron a

cero las corrientes de base aplicando los algoritmos que ofrece el programa GPES

versioacuten 49 provisto por Eco Chemie BV

4203 Voltamperometriacutea de onda cuadrada

Los experimentos de voltamperometriacutea de onda cuadrada se realizaron en solucioacuten


pH 105 y a 25 ordmC Los valores de escaloacuten de potencial utilizados fueron de 5 y 10 mV

Los valores de amplitud de pulso fueron de 25 y 50 mV Las frecuencias utilizadas

fueron de 8 10 20 30 40 60 y 70 Hz Especiacuteficamente se evitoacute utilizar 50 Hz

(frecuencia de la tensioacuten alterna de la liacutenea de alimentacioacuten) Los barridos de potencial

se realizaron desde -03 V hasta 10 V

Una vez registrado el blanco con medio Middlebrook 7H9 y se hicieron dos

agregados secuenciales de solucioacuten estaacutendar de glicerol 100 M obtenieacutendose una

concentracioacuten final de 25 y 50 mM respectivamente en la celda

421 Funcionalizacioacuten de nanotubos de carbono

Previo a la utilizacioacuten de los nanotubos de carbono se procedioacute a funcionalizarlos

realizando una carboxilacioacuten oxidativa Se siguioacute una comunicacioacuten personal del Dr

Joseacute Manuel Pingarroacuten del Departamento de Quiacutemica Analiacutetica Facultad de Ciencias

Quiacutemicas Universidad Complutense de Madrid A saber se pesaron aproximadamente

2 mg de MWCNT y se dispersaron en 2 mL en una mezcla de aacutecido sulfuacuterico aacutecido

niacutetrico 31 con agitacioacuten ultrasoacutenica durante 5 h Luego se diluyoacute la mezcla al 110

vertieacutendola suavemente en agua destilada enfriada en bantildeo de hielo para evitar

proyecciones Se eliminoacute el exceso de aacutecido centrifugando a 14000 rpm durante 30

min descartando el sobrenadante y dispersando el precipitado en agua destilada con

agitacioacuten ultrasoacutenica durante 30 min Esta operatoria se repitioacute 9 veces hasta que la

dispersioacuten de MWCNT en agua tuvo un pH cercano a la neutralidad (70 05) Los

MWCNT se secaron en desecador con sulfato de cobre anhidro y aplicando vaciacuteo al

sistema


54

422 Programas de prediccioacuten de epiacutetopes lineales reconocidos por ceacutelulas B

4221 Base de datos de proteiacutenas

Se creo manualmente una base de datos para mejorar la exactitud de los resultados

Las proteiacutenas fueron seleccionadas de la base de datos de BciPep (Saha y col 2005)

HIV Molecular Immunology Database (disponible en httpwwwhivlanlgovcontent

immunologyindexhtml) o tomadas de la literatura VP1 (Wang y col 2011) proteiacutena

N (El-Manzalawy y col 2008) y Gliadina (Sweredoski amp Baldi 2009) El criterio de

seleccioacuten fue la confirmacioacuten experimental previa mediante ensayos de puntos de

inmunoadsorcioacuten ligado a enzima (ELIspot) o mediante el uso de paneles

multiespeciacuteficos de anticuerpos monoclonales que reconocen epiacutetopes lineales (Shin y

col 2005) Como resultado se seleccionaron 11 proteiacutenas de las que se obtuvieron un

total de 65 epiacutetopes lineales reconocidos por ceacutelulas linfociacuteticas tipo B

4222 Programas utilizados

Se utilizaron algunos programas para predecir los epiacutetopes lineales disponibles en

liacutenea gratuitamente Todos estos programas utilizan algoritmos matemaacuteticos con escalas

de propensioacuten yo datos experimentales de antigenicidad A menos que se indique lo

contrario cada programa se ejecutoacute utilizando los paraacutemetros por defecto Los

programas utilizados fueron AAPPred (Davydov amp Tonevitskii 2009) ABCpred

(Saha S amp Raghava 2006) BcePred (Saha y col 2005) BepiPred (Larsen y col

2006) y Antigenic (Kolaskar amp Tongaonkar 1990)







423 Anaacutelisis de Datos

Los liacutemites de deteccioacuten (LD) y cuantificacioacuten (LC) se calcularon siguiendo las

sugerencias de Armbruster amp Pry (Armbruster amp Pry 2008) modificando la cantidad

de replicados utilizados para la obtencioacuten de los desviacuteos estaacutendar habieacutendose utilizado

10 reacuteplicas El caacutelculo del LD se realizoacute a partir del valor de corriente del blanco IB maacutes


55

33 veces el valor del desviacuteo estaacutendar de la corriente leiacuteda (DSn1) de la muestra con

menor concentracioacuten de glicerol medida seguacuten

[41]

El valor del LC se calculoacute como

[42]

siendo m la pendiente de la curva de calibracioacuten

La capacidad de discriminacioacuten entre dos concentraciones diferentes de los

meacutetodos propuestos se evaluoacute como el error asociado a la estimacioacuten de la

concentracioacuten Ec calculada como

Nm

EE r

c

1

[43]

siendo Er el error relativo

424 Caacutelculos estadiacutesticos y disentildeo experimental

Para los caacutelculos estadiacutesticos se utilizaron los programas SigmaStat 32 (Sigma Plot

90 u 110) o Microcal Origin 80 en forma indistinta Para los caacutelculos de EJCR (regioacuten

eliacuteptica de confianza conjunta) se utilizoacute el programa Matlab con rutinas disentildeadas ―ad-

hoc

Resultados y Discusioacuten


57

5 Resultados y discusioacuten

Para la obtencioacuten de antiacutegenos especiacuteficos de fase aguda de la toxoplasmosis se

comenzoacute seleccionando un conjunto de proteiacutenas denominadas P30 P22 y P35

mencionadas en la literatura como antiacutegenos de fase aguda (Harning y col 1996

Parmley y col 2000 Lu y col 2006) Sobre la base de estos estudios iniciales se

intentoacute identificar por medio de caacutelculos teoacutericos que regiones de estas proteiacutenas

conteniacutean mayor nuacutemero de epiacutetopes De este modo en la etapa siguiente se procurariacutea

expresarlos en forma soluble para su posterior utilizacioacuten en inmunoensayos Al

momento de seleccionar un programa de todos los disponibles ―on line verificamos

que eacutestos no informaban el valor predictivo positivo VPP Por ello se inicioacute un trabajo

de identificacioacuten del programa que predijera maacutes fidedignamente los epiacutetopes La

buacutesqueda se realizoacute comparando los resultados arrojados por 5 programas a los que se

solicitoacute prediccioacuten de epiacutetopes pertenecientes a 11 proteiacutenas cuyos epiacutetopes lineales

habiacutean sido perfectamente establecidos experimentalmente (Costa y col 2013) Se

analizoacute cuaacutel de ellos presentaba el mayor VPP (ver punto 61 seccioacuten Experimentos

Auxiliares) y para predecir epiacutetopes lineales se trabajoacute con este programa que resultoacute

ser AAPred

El anaacutelisis de los Ang seleccionados permitioacute identificar en P35 dos regiones que

concentraban los determinantes antigeacutenicos a las cuales se las denominoacute P35A y P35B

Los Ang P30 y P22 presentaban los determinantes antigeacutenicos distribuidos

homogeacuteneamente por lo tanto al momento de disentildear su clonado se tuvieron en cuenta

criterios que faciliten la expresioacuten y solubilidad mas allaacute de la antigenicidad

51 Evaluacioacuten de antiacutegenos recombinantes de T gondii

511 Antiacutegeno P30

El antiacutegeno de superficie 1 de T gondii SAG1 tambieacuten denominado proteiacutena P30

se ha identificado como antiacutegeno de fase aguda (Harning y col 1996) por lo cual se

procuroacute obtenerlo en forma soluble Sobre la base de ensayos previos realizados en el

LTI se continuoacute con la obtencioacuten y purificacioacuten de dos porciones del antiacutegeno P30

denominadas P30L y P30C (seccioacuten 410 Materiales y Meacutetodos) Luego de la cosecha

y lisis de las bacterias se separaron las fracciones soluble e insoluble del extracto se

tomaron aliacutecuotas de ambas y se analizaron por SDS-PAGE Los Angs buscados soacutelo se


58

obtuvieron como proteiacutenas precipitadas en cuerpos de inclusioacuten en la fraccioacuten insoluble

Por ello se discontinuoacute el trabajo con las fracciones de P30


El antiacutegeno de superficie 2 o antiacutegeno P22 de T gondii (Gen Bank ndeg M33572) ha

sido tambieacuten identificado como antiacutegeno de fase aguda (Parmley y col 1992 Lau amp

Fong 2006) En el presente trabajo se procuroacute amplificar la regioacuten del gen que

permitiese expresar la proteiacutena recombinante en forma soluble El producto de

amplificacioacuten se resolvioacute en un gel de agarosa tentildeido con bromuro de etidio como se

observa en la Fig 51

Figura 51 Gel de agarosa tentildeido con bromuro de etidio en transiluminador UV En PCR1 se observan los

productos de amplificacioacuten obtenidos utilizando cebadores especiacuteficos para la regioacuten P22C donde se

sentildeala el fragmento de tamantildeo esperado Control (-) muestra la misma mezcla de reaccioacuten pero sin ADN

molde MPM indica el marcador de peso molecular y el tamantildeo de los fragmentos se indica sobre la

derecha

Se aisloacute y purificoacute el fragmento de intereacutes utilizando un equipo comercial detallado

en el punto 48 seccioacuten Materiales y Meacutetodos En un paso posterior se ligoacute al vector

pET32a y con la construccioacuten resultante se transformaron ceacutelulas competentes de E

coli Las ceacutelulas transformadas se seleccionaron crecieacutendolas en medio LB con

ampicilina Se verificaron las condiciones para la expresioacuten en forma soluble (punto

410 seccioacuten Materiales y Meacutetodos) encontraacutendose que las condiciones oacuteptimas eran

01 mM IPTG y 12 h de incubacioacuten con agitacioacuten vigorosa

Para la induccioacuten preparativa se siguioacute el protocolo detallado en la seccioacuten 410 de

Materiales y Meacutetodos La Fig 52 muestra la fotografiacutea de un gel de poliacrilamida

luego de la tincioacuten donde se analizaron aliacutecuotas de todos los extractos obtenidos en los

distintos pasos separativos de la proteiacutena P22C


59

Figura 52 Gel de poliacrilamida tentildeido con azul brillante de Coomassie En cada calle se sembraron 1

microL de muestra EC indica el extracto crudo P1 muestra la fraccioacuten insoluble del lisado celular P2 la

fraccioacuten insoluble luego del congelamiento-descongelamiento del extracto centrifugado FT muestra el

extracto que pasoacute por la columna Con L se indican las calles con las fracciones de lavados sucesivos con

tampoacuten imidazol 0 mM 20 mM 50 mM y 100 mM respectivamente E muestra las fracciones de

elucioacuten con solucioacuten imidazol 250 mM Las fracciones de elucioacuten recolectadas fueron de 15 mL cada

una


El antiacutegeno de superficie P35 de T gondii (Gen Bank ndeg AF01275) se ha

identificado como antiacutegeno de fase aguda y distintas porciones del mismo presentan

diferentes desempentildeos en su uso diagnoacutestico (Lu y col 2006) Sobre la base de

ensayos previos realizados en el LTI se continuoacute con la obtencioacuten y purificacioacuten de las

dos porciones del antiacutegeno P35 denominadas P35A y P35B

Se ensayoacute la expresioacuten del antiacutegeno P35A (punto 49 seccioacuten Materiales y

meacutetodos) y soacutelo se obtuvo como cuerpos de inclusioacuten en la fraccioacuten insoluble Si bien

fue posible disolver las proteiacutenas recombinantes en urea 8 M al dializar volviacutean a

precipitar

El antiacutegeno P35B se pudo obtener en forma soluble y las condiciones oacuteptimas

encontradas para la induccioacuten del mismo fueron IPTG 1 mM y 4 h con agitacioacuten

vigorosa La Fig 53 muestra una imagen del gel de poliacrilamida luego de la corrida

electroforeacutetica y su tincioacuten Se observoacute que una banda de la fraccioacuten soluble estaba

sobreexpresada en los cultivos inducidos


60

Figura 53 Gel de poliacrilamida al 12 en condiciones desnaturalizantes Se muestra lo obtenido para

aliacutecuotas de dos cultivos no inducidos 1 y 2 y dos inducidos 3 y 4 Con P se designan las fracciones

insolubles en la solucioacuten de lisis y con SN las fracciones solubles Las bandas que se observan del MPM

corresponden a fragmentos de 19445 KDa 28829 KDa 36545 KDa 49491 KDa 80664 KDa

103035 KDa Se indica la banda sobreexpresada de tamantildeo esperado

Para la induccioacuten preparativa del antiacutegeno P35B se siguioacute el protocolo descripto en

el punto 410 seccioacuten Materiales y Meacutetodos En la Fig 54 se muestra un gel de

poliacrilamida luego de la tincioacuten donde se analizaron aliacutecuotas de todos los extractos

obtenidos en los distintos pasos separativos


microL de muestra P1 fraccioacuten insoluble del lisado celular P2 fraccioacuten insoluble luego del congelamiento-

descongelamiento del extracto centrifugado FT muestra el extracto que pasoacute por columna L calles con

las fracciones de lavados sucesivos con tampoacuten imidazol 20 mM 50 mM y 100 mM respectivamente E

fracciones de elucioacuten con solucioacuten imidazol 250 mM Las fracciones recolectadas fueron de 15 mL cada

una

En consecuencia se continuoacute el trabajo con P35B y se descartoacute transitoriamente la

utilizacioacuten del Ang P35A

52 Marcado de antiacutegenos recombinantes de T gondii

Para los ensayos tipo ELISA de captura especiacuteficos para IgM se propuso utilizar

como sistema revelador la enzima HRP-EAV que se une especiacuteficamente a biotina En

consecuencia se procedioacute a marcar los Ang solubles obtenidos con biotina

P35B

P1 P2 P3 P4 MPM

Inducido No Inducido

SN1


SN2 SN3 SN4


61

La reaccioacuten de conjugacioacuten se realizoacute siguiendo el protocolo mencionado en el

punto 413 seccioacuten Materiales y Meacutetodos La conjugacioacuten se evidencioacute con la reaccioacuten

de color indicada en el inciso 413 En la Fig 55 se muestra la membrana de

nitrocelulosa sobre la que se fijaron las proteiacutenas P22 y P35B luego del revelado

cromogeacutenico con la enzima HRP conjugada a streptavidina Las reacciones de

conjugacioacuten se llevaron adelante por separado

Figura 55 Membranas de nitrocelulosa evidenciando las proteiacutenas P35B conjugada (izquierda) y P22C

conjugada (derecha)

53 Inmunoensayos

Estudios preliminares (ver punto 62 seccioacuten Experimentos Auxiliares) con los

antiacutegenos recombinantes obtenidos permitieron verificar por ELISA indirecto que sueros

confirmados positivos arrojaban resultados positivos mientras que los sueros negativos

daban el ensayo negativo Se procedioacute entonces a evaluar la capacidad de los antiacutegenos

obtenidos para discriminar sueros de pacientes con infeccioacuten aguda de sueros provenientes

de pacientes con infeccioacuten croacutenica

531 Inmunoensayos con deteccioacuten fotomeacutetrica

Como se anticipoacute en la introduccioacuten se realizaron ELISA siguiendo dos

alternativas de captura En la primera alternativa que denominamos A se procuroacute

capturar selectivamente la maacutexima cantidad de Ac del isotipo que se deseaba detectar

(IgMh) adsorbiendo sobre la placa un anticuerpo ―ad-hoc (Ac-a-IgMh) En la segunda

alternativa que denominamos B se buscoacute capturar con el Ang recombinante la maacutexima

cantidad de Ac especiacuteficos independientemente del isotipo que se tratara En el paso

siguiente del esquema B se tomoacute ventaja de la mayor valencia de las IgM respecto de

las IgG para el revelado

5311 Evaluacioacuten del esquema A

Sobre placas de ELISA se capturaron los Acs IgMh revelaacutendose la presencia de los

especiacuteficos con los antiacutegenos obtenidos marcados con biotina y uniendo a estos uacuteltimos la

enzima HRP-EAV En los ensayos preliminares (ver punto 622 seccioacuten Experimentos

Auxiliares) se identificoacute la cantidad de antiacutegeno marcado y las diluciones de HRP-EAV

oacuteptimas a utilizar para revelar la presencia de IgM especiacutefica capturada En la Tabla 51 se


62

muestran los valores de absorbancia a 450 nm obtenidos para el panel de 9 sueros

ensayados Se utilizaron 5 g de P22C-biotina por pocillo y 100 L de HRP-EAV en

dilucioacuten 12000

Tabla 51 Absorbancias a 450 nm obtenidas en los ELISA siguiendo el esquema de captura A descrito

maacutes arriba

Placa 1 Placa 2

Agudos

0100 0158

0311 0273

0140 0165

Croacutenicos

0281 0322

0256 0278

0260 0226

Negativos

0217 0168

0235 0179

0409 0354

Sin suero

0135 0134

0143 0114

0126 0100

Sin suero

Sin

P22cBiotina

0071 0050

0070 0037

0047 0040

Los resultados obtenidos con ambos antiacutegenos fueron desalentadores (los resultados

obtenidos con P35B biotina no se informan) ya que no se hallaron diferencias

significativas entre los valores de absorbancia obtenidos con sueros de pacientes

agudos croacutenicos y negativos

5312 Esquema B

En base a los resultados obtenidos en la seccioacuten anterior se orientaron los ensayos

realizando los ELISA siguiendo un esquema no claacutesico al que denominamos B

Debido a la baja sensibilidad que presentaron los Angs conjugados a biotina para

detectar los Acs especiacuteficos pensamos en hacer una primera etapa de concentracioacuten de

los Acs especiacuteficos en la placa para luego revelar con el Ang conjugado a biotina Esto

se hizo adsorbiendo antiacutegeno recombinante sobre la superficie de la placa de


inmunoglobulinas que reconocen al antiacutegeno ya sean IgM o IgG Luego se expone la

placa al mismo antiacutegeno recombinante pero ligado a biotina que se uniraacute a los

anticuerpos especiacuteficos para dicho Ang previamente capturados Finalmente se revela


63

con HRP conjugada a streptavidina que forma un complejo estable con biotina De esta

forma se aumenta la cantidad de Ang marcado en mayor proporcioacuten para IgM que para

IgG dada la multivalencia de este isotipo de inmunoglobulina En la Fig 56 se

reproduce el esquema B que fue el que brindoacute los resultados maacutes promisorios







Buscando diferenciar sueros de pacientes en fase de infeccioacuten aguda (agudos) de

sueros provenientes de pacientes sin infeccioacuten (negativos) En la Tabla 52 se muestran los

valores de absorbancia a 450 nm obtenidos

Tabla 52 Absorbancias a 450 nm obtenidas en los ELISA siguiendo el esquema de captura B

Ang

Sueros P35B 05ug P35B 001ug P22C 05ug P22C 001ug

Agudos 2131 1567 0335 0296

1849 1311 065 0413

Negativos 176 1350 0282 0327

1025 1676 0262 0325

Sin suero 1658 1658 0174 0149

1812 1504 0130 0144

Sin Ang

conjugado

0055 004 0041 0045

0057 0042 0039 004


64

Este ensayo exploratorio demostroacute que los antiacutegenos P22C y P35B pueden ser usados

potencialmente en la deteccioacuten de toxoplasmosis aguda realizando inmunoensayos con el

esquema B propuesto en el presente trabajo Por ello siguiendo este esquema de trabajo se

exploraron cuales eran las condiciones oacuteptimas (ver punto 623 seccioacuten Experimentos

Auxiliares) Asiacute se establecioacute la dilucioacuten de la enzima HRP-EAV (12000) la cantidad de

P22C biotina (5 microg por pocillo) y se acotaron los valores de P22C adsorbidos inicialmente

en la placa entre 500 y 50 ng Finalmente se realizaron tres ensayos en paralelo donde se

evaluoacute la cantidad de antiacutegeno adsorbido inicialmente en la placa y se amplioacute el panel de

sueros Los resultados obtenidos se muestran en la Fig57

Figura 57 Absorbancias a 450 nm para los ELISA realizados con el esquema B (A) 50 ng de Ang P22C

(B) 200 ng de Ang P22C (C) 500 ng de Ang P22C Con se indican los sueros provenientes de

pacientes con infeccioacuten aguda (Agudos) con los provenientes de pacientes con infeccioacuten croacutenica

(Croacutenicos) y con los de pacientes sin infeccioacuten (Negativos) Con la liacutenea roja ( ) se indica el valor

de media menos tres desviacuteos estaacutendares de los agudos (AbsA ndash 3 DSA) y con la liacutenea verde ( ) el valor

de media maacutes tres desviacuteos estaacutendares de los croacutenicos (AbsC +3 DSC)


65

En las tres condiciones evaluadas se obtiene una separacioacuten de las sentildeales obtenidas al

ensayar sueros provenientes de los pacientes con infeccioacuten aguda (Agudos) de los sueros

provenientes de pacientes con infeccioacuten croacutenica (Croacutenicos) y los pacientes sin infeccioacuten

(Negativos)

Los resultados obtenidos con P35B no resultaron alentadores debido al elevado ruido

de fondo (altos valores de absorbancia de los blancos) Por lo tanto los ensayos

electroquiacutemicos se iniciaron soacutelo con P22C

Mijak y colaboradores (Hiszczyntildeska-Sawicka y col 2005) sentildealan que ya se ha

demostrado la utilidad del Ang SAG2 para detectar IgG en el suero de pacientes con

toxoplasmosis aguda y croacutenica (Parmley y col 1992) destacando que en los resultados

presentados por ese mismo grupo en otra publicacioacuten (Li y col 2000a) soacutelo se examinaron

un reducido nuacutemero de sueros provenientes de pacientes con infeccioacuten aguda con

resultados tanto positivos como negativos Tambieacuten sentildeala que Maine y colaboradores

(Aubert y col 2000) no obtuvieron resultados satisfactorios con este antiacutegeno

recombinante realizando ELISA indirecto Los resultados obtenidos en este trabajo con

ELISA utilizando el esquema A han confirmado lo sentildealado por Mijak y col sobre el

desempentildeo de este Ang El anaacutelisis que estos autores hacen se orienta a que el uso de estos

antiacutegenos recombinantes debe contemplar necesariamente el uso combinado de otros Angs

Por otro lado en el presente trabajo se han presentado resultados que permitiriacutean

complementar esta visioacuten incorporando otro esquema para la deteccioacuten de sueros de

infectados agudos Si bien es necesario ampliar el nuacutemero de sueros para validar el ensayo

los resultados son promisorios Hemos propuesto que las diferencias obtenidas en los

ELISA de captura siguiendo el esquema B pueden deberse a dos mecanismos no

excluyentes entre si y que podriacutean estar actuando en conjunto Por un lado estaacute la

multivalencia que presentan las IgM respecto de las IgG que generariacutea una amplificacioacuten

selectiva de acuerdo al isotipo Por otro lado independientemente del isotipo capturado el

Ang de fase aguda brindariacutea la sensibilidad y especificidad necesaria al ensayo

identificando Acs de fase aguda Resta pues esclarecer si esto es asiacute fehacientemente o si

hay alguacuten otro mecanismo actuando concomitante que permita explicar las diferencias

observadas aquiacute entre sueros de fase aguda y de infectados croacutenicos


66


recombinantes

Los bioelectrodos se ensamblaron como se describe en el inciso 41911 de

Materiales y Meacutetodos Al realizar los inmunoensayos con las diluciones pertinentes de

suero humano (muestra incoacutegnita) en caso de suero de paciente infectado (+) estaraacuten

presentes los anticuerpos IgG anti-P22 (analito de intereacutes) Cuando se sumergen en una

dilucioacuten de anticuerpos anti-IgG h conjugado con HRP (segundo anticuerpo marcado) eacuteste

quedaraacute retenido en el electrodo y frente al agregado del sustrato de la enzima (H2O2)

sobre PBS conteniendo el mediador FcMe se genera la especie que seraacute electro-reducida

sobre el electrodo al potencial de trabajo 008 V (vs AgAgCl ver inciso 420 2) A los

fines de claridad en la Fig 58 se reformula el esquema de funcionamiento del biosensor

previamente esquematizado (Fig 212) para el caso particular aquiacute detallado donde el

Ang es la proteiacutena P22C



Figura 58 Sobre la superficie del electrodo se fija la proteiacutena P22C que capturaraacute los anticuerpos especiacuteficos

si estaacuten presentes en el suero El revelado se realiza con un segundo anticuerpo especiacutefico para IgG humana

marcado con HRP que en presencia de H2O2 oxida el mediador FcMe que se reduce sobre la superficie del

electrodo generando la sentildeal analiacutetica

En la Fig 59 se muestran tres amperogramas representativos obtenidos cuando se

ensayaron sueros confirmados (+) sueros confirmados (-) y blancos (sin suero alguno)

Los valores de corrientes se corrigieron por los valores de aacuterea reales determinados

mediante voltametriacutea ciacuteclica a distintas velocidades de soluciones de ioacuten ferricianuro

(punto 41932 seccioacuten Materiales y Meacutetodos)


67

Figura 59 Amperometriacuteas comparativas con bioelectrodos ensamblados con la proteiacutena P22C

En la Tabla 54 se resumen los resultados de los ensayos sobre muestras confirmadas

positivas negativas y blanco

Tabla 54 Valores promedios de la corriente cataliacutetica diferencial obtenidas utilizando bioelectrodos

ensamblados con el antiacutegeno P22C

DS desviacioacuten estaacutendar

Las diferencias en las sentildeales registradas fueron estadiacutesticamente significativas

verificaacutendose la potencialidad del uso de esta metodologiacutea para discriminar entre sueros de

pacientes infectados con T gondii de sueros de pacientes no infectados Los ensayos

electroquiacutemicos preliminares informados permiten pensar en el desarrollo de un biosensor

amperomeacutetrico A futuro seriacutea deseable poder establecer un biosensor electroquiacutemico

basaacutendonos en el esquema B de los ELISA presentados en este trabajo de Tesis que

permita la discriminacioacuten entre sueros de pacientes cursando infeccioacuten aguda de sueros de

pacientes con infeccioacuten croacutenica

54 Determinacioacuten de la actividad electroquiacutemica del glicerol en medio acuoso

Si bien desde hace varios antildeos se ha estudiado la oxidacioacuten electrocataliacutetica de

polialcoholes auacuten no existe acuerdo acerca del procedimiento maacutes conveniente para su

cuantificacioacuten electroquiacutemica asiacute como tampoco ha sido posible identificar un uacutenico

mecanismo que deacute cuenta de los productos obtenidos luego de la reaccioacuten electroacutenica

(Kahyaoglu et al 1984 Kwon amp Koper 2010)

Muestra j = Icaacuterea

( A cm-2

)

DS

( A cm-2

)

Positivos -0455 0026

Negativos -0150 0021

Sin suero -0052 004


68

Con el fin de encontrar el electrodo y las condiciones maacutes convenientes para

realizar la cuantificacioacuten del glicerol se realizaron ensayos exploratorios de

voltametriacuteas ciacuteclicas utilizando electrodos de carbono viacutetreo pasta de C (grafito y

viacutetreo) Au Pt y Ag Los medios ensayados fueron HClO4 01 M solucioacuten tampoacuten de

fosfato salino (PBS) pH 72 90 120 NaCl al 08 mv y NaOH 01 M El intervalo

de concentracioacuten de glicerol utilizado fue de 100 x 10-5

M hasta 01 M

En estos ensayos iniciales las maacuteximas sentildeales se obtuvieron con electrodos de Au

en medio alcalino (NaOH 01 M) coincidiendo con lo descripto por Lamy (Kahyaoglu

et al 1984) A modo ilustrativo en la Fig 510 se observan dos voltametriacuteas ciacuteclicas

para electrodos de oro y de platino en medio alcalino

Figura 510 Voltamperogramas tiacutepicos para soluciones de glicerol 10-2

M en soluciones de base fuerte

(NaOH 01M) utilizando electrodos de trabajo de Au (izquierda) y Pt (derecha)

En una etapa posterior se verificoacute que las sentildeales obtenidas Ip respondiacutean

proporcionalmente a la concentracioacuten de glicerol Se realizoacute una curva de calibracioacuten en

el intervalo de concentraciones de 50 x 10-4

a 10 x 10-2

M Todas las mediciones se

hicieron por triplicado La Tabla 55 muestra las medias de las corrientes de pico

obtenidas para cada concentracioacuten ensayada con su correspondiente desviacuteo estaacutendar La

corriente de pico se midioacute tomando una liacutenea de base recta a un valor de potencial de

010 V plusmn 005 V usando algoritmos propios del programa GPES 49

Tabla 55 Valores medios de corriente obtenidos por voltametriacutea ciacuteclica para la oxidacioacuten del

glicerol en medio alcalino (NaOH 01 M) sobre electrodos de oro

[Glicerol]

(mM)

Ip

(microA cm-2

)

DS Ip

(microA cm-2

)

050 18 032

100 28 038

200 74 041

500 17 035

750 262 055

100 347 053

-50E-05

00E+00

50E-05

10E-04

15E-04

20E-04

25E-04

-0400 -0200 0000 0200 0400 0600 0800

E(V)

i(A

)

-40E-06

00E+00

40E-06

80E-06

12E-05

16E-05

-1000 -0800 -0600 -0400 -0200 0000 0200 0400

E(V)

i(A

)


69

En la Fig 511 se presenta la dependencia de la corriente de pico

voltamperomeacutetrica con la concentracioacuten de glicerol Las barras de error corresponden a

las desviaciones estaacutendar de cada medida realizada por triplicados independientes Se

ajustaron estos valores a una recta con el meacutetodo de los miacutenimos cuadrados y se obtuvo

la siguiente ecuacioacuten

[51]

donde IpA estaacute en microA cm-2

y [glicerol] en mM El valor de coeficiente de regresioacuten

(R2) obtenido fue de 09980

Figura 511 Dependencia de la corriente de pico voltamperomeacutetrica con la concentracioacuten de glicerol en

medio alcalino (NaOH 01 M) Se muestran los valores promedios de tres medidas independientes Las

barras de error se corresponden a los desviacuteos estaacutendares

En estas condiciones de trabajo el pico de corriente oxidativa tiene dependencia

lineal con la concentracioacuten de glicerol En funcioacuten de estos resultados se orientoacute la

buacutesqueda hacia una metodologiacutea que permitiese determinar al glicerol en

concentraciones de 10-5

M o menores Para esto iniciamos ensayos con teacutecnica

amperomeacutetrica

Se realizaron los ensayos amperomeacutetricos como se describe en el punto 4202 de la

seccioacuten Materiales y Meacutetodos La Fig 512 muestra el resultado de una amperometriacutea

tiacutepica para una solucioacuten de glicerol


70

t s

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450

I A

0

2

4

6

Figura 512 Amperometriacutea tiacutepica de una muestra con glicerol (concentracioacuten en celda 1 mM) Se dejoacute

estabilizar la corriente para una solucioacuten de NaOH 01 M y a los 50 segundos se realizoacute el agregado de la

muestra con glicerol y se midioacute la corriente hasta los 400 segundos

Se ensayaron soluciones de glicerol cuya concentracioacuten en la celda electroliacutetica

fueron desde 001 mM hasta 5 mM Como blanco se utilizoacute solucioacuten de NaOH 01 M

La corriente cataliacutetica se midioacute como la diferencia entre la corriente final y la inicial

(punto 4202 seccioacuten Materiales y Meacutetodos) A este valor de corriente se lo dividioacute

por el valor de aacuterea real del electrodo medida anteriormente esta densidad de corriente

(IcA) se tomoacute como la sentildeal analiacutetica En la Tabla 56 se muestran las medias de las

sentildeales obtenidas para cada concentracioacuten de glicerol ensayada con su correspondiente

desviacuteo estaacutendar

Tabla 56 Valores medios de densidades de corriente obtenidos por amperometriacutea para la oxidacioacuten de

glicerol en medio alcalino (NaOH 01 M)

[Glicerol]

(mM)

Ic A

( A cm-2

)

DS

( A cm-2

)

0000 0447 0029

0010 0763 0016

0025 1098 0068

0050 1510 0055

0100 285 049

0250 609 036

0500 1245 033

0750 1730 0097

100 2361 0099

150 3445 033

175 3997 020

200 4613 045


71

En la Fig 513 se presenta la recta de regresioacuten lineal obtenida a partir de los

valores promedio de densidades de corriente para soluciones de glicerol en el intervalo

de concentraciones de 0025 mM y 2 mM Las barras de error corresponden a las

desviaciones estaacutendares de cada medida La ecuacioacuten de la recta obtenida por el meacutetodo

de miacutenimos cuadrados fue

[52]

Donde IcA estaacute en microA cm-2

y [Glicerol] en mM el valor del coeficiente de

regresioacuten (R2) obtenido fue de 09950

[Glicerol] mM

000 025 050 075 100 125 150 175 200

I cA

m

A c

m-2

0

10

20

30

40

50

Figura 513 Curva de calibracioacuten obtenida para glicerol en medio alcalino (NaOH 01 M) con la teacutecnica

amperomeacutetrica Se muestran los valores promedios de tres medidas independientes para cada solucioacuten

Las barras de error que se muestran corresponden al DS de cada punto

Las cifras de meacuterito para esta teacutecnica resultaron ser

Liacutemite de deteccioacuten 10 M

Liacutemite de cuantificacioacuten 24 M

Liacutemite de discriminacioacuten 10 M

Intervalo de linealidad 0024 mM ndash 200 mM

55 Cuantificacioacuten de glicerol en medios acuosos complejos


bacterianos siendo degradado eficientemente por sistemas enzimaacuteticos que utilizan

mecanismos redox Por lo tanto se comenzoacute a estudiar la posible cuantificacioacuten

electroquiacutemica de este alcohol intentando detectar concentraciones del orden 10-5

M o


72

menores para poder asiacute evidenciar su consumo en medios de cultivos bacterianos que

contienen glicerol como nutriente El meacutetodo amperomeacutetrico con electrodo de oro no

fue lo suficientemente selectivo para glicerol cuando este se encontraba en matrices

complejas (no se muestran los resultados) por lo tanto al momento de cuantificarlo en

medios de cultivos bacterianos tuvimos que optar por otra metodologiacutea

Sobre la base del trabajo de Tuntildeoacuten-Blanco y col (Aacutelvarez-Gonzaacutelez et al 2000)

se busco desarrollar un biosensor selectivo para este analito

Para verificar la funcionalidad del modelo propuesto se realizaron ensayos

espectrofotomeacutetricos La coenzima NAD(H) en su forma reducida (NADH) presenta un

maacuteximo de absorcioacuten a 340 nm ausente en la forma oxidada (NAD+) Puede apreciarse

en la Fig 514 que el mediador electroquiacutemico Fe(CN)63-

presenta un maacuteximo de

absorcioacuten a 420 nm ausente en la forma reducida Fe(CN)64-

En un primer ensayo se

verificoacute espectrofotomeacutetricamente que la longitud de onda escogida podiacutea utilizarse

para el seguimiento de la reaccioacuten En una serie de ensayos posteriores se monitoreoacute la

reaccioacuten enzimaacutetica en presencia y ausencia del mediador electroquiacutemico haciendo uso

de estas propiedades espectrales

Figura 514 Espectros de absorcioacuten UV-visible para las especies Fe(CN)33-

1 mM y Fe(CN)34-

1 mM

Ambas especies fueron disueltas en solucioacuten tampoacuten carbonato pH 105 Puede apreciarse claramente que

el maacuteximo de absorcioacuten a 420 nm presente en el Fe(CN)63-

se encuentra ausente en el Fe(CN)64-

La

velocidad de barrido fue 1200 nm min-1


espectrofotomeacutetricas

El primer ensayo para validar el modelo propuesto fue seleccionar la longitud de

onda oacuteptima para el seguimiento espectrofotomeacutetrico A tal fin se llevaron adelante dos

0

025

05

075

1

125

15

175

2

225

25

275

260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500

Longitud de onda (nm)

Ab

sorb

an

cia

Ferricianuro 1 mM

Ferrocianuro 1 mM


73

reacciones a) glicerol disuelto en medio 7H9 coenzima Fe(CN)63-

y enzima GlDH y

b) glicerol disuelto en medio 7H9 coenzima Fe(CN)63-

pero sin la enzima GlDH En

ambos casos se realizoacute un barrido espectral de 320 a 480 nm registraacutendose la

absorbancia a una velocidad de barrido de 1200 nm min-1

cada 10 min Ambas

reacciones se llevaron a cabo en solucioacuten tampoacuten carbonato pH 105 En la Fig 515 se

muestran los barridos espectrales obtenidos para cada reaccioacuten y en ella puede

apreciarse que la mayor diferencia se presenta a la longitud de onda prevista (420 nm)

Figura 515 Espectros de absorcioacuten UV-visible para mezclas de reaccioacuten (A) En presencia de enzima

GlDH (B) Sin enzima GlDH Barrido espectral cada 10 min

Para elucidar si el consumo de Fe(CN)63-

observado se correspondiacutea

cuantitativamente con el NADH generado y en consecuencia con el glicerol

consumido se tuvieron en cuenta las siguientes reacciones

glicerol + Fe(CN)63-

DHA + Fe(CN)64-

(1)

glicerol + NAD+ NADH + DHA (2)

Se realizaron series de 3 reacciones en paralelo a saber a) blanco de reaccioacuten (BR)

con enzima GlDH NAD+ y Fe(CN)6

3- en ausencia de glicerol donde se siguioacute la

absorbancia a 420 nm b) reaccioacuten (1) con enzima GlDH NAD+ Fe(CN)6

3- y glicerol

donde se siguioacute la desaparicioacuten de Fe(CN)63-

a 420 nm c) reaccioacuten (2) con enzima

GlDH NAD+ y glicerol donde se siguioacute la aparicioacuten de NADH a 340 nm Debe tenerse

en cuenta por un lado que el NAD+ es reducido a NADH en la reaccioacuten (2) no se

regenera mientras que en la reaccioacuten (1) se regenera por la presencia del anioacuten

Fe(CN)63-

Esto implica que si bien ambas reacciones se lentifican con el paso del

tiempo a causa del consumo de glicerol (y acumulacioacuten de DHA) la reaccioacuten (2) se

lentifica maacutes que la (1) porque se consumen tanto el glicerol como el NAD+

y se

acumulan ambos productos de reaccioacuten (DHA y NADH) Los resultados pueden verse

en la Fig 516

A

0

015

03

045

06

075

09

105

12

135

15

320 340 360 380 400 420 440 460 480


Ab

sorb

an

cia

t = 0

t = 10 min

t = 20 min

t =30 min

t = 40 min

t = 50 min

t = 60 min

B

0

015

03

045

06

075

09

105

12

135

15

320 340 360 380 400 420 440 460 480


Ab

sorb

an

cia

t = 0 min

t = 10 min

t = 20 min

t = 30 min

t = 40 min

t = 50 min

t = 60 min

GlDHNAD+

GlDH


74

Figura 516 Absorbancias registradas a 420 nm durante las reacciones descriptas en el texto A) Blanco

de reaccioacuten (BR) y reaccioacuten (1) B) Reaccioacuten (2) C) Segmento inicial de la curva representada en

B) a partir de la cual se calculoacute el valor liacutemite de la velocidad inicial de reaccioacuten Se muestra un

experimento representativo de un original y replicado

Se asumioacute que la reaccioacuten (1) transcurre a una velocidad constante en las

condiciones en que se llevoacute a cabo El anaacutelisis estadiacutestico demuestra que hay una ligera

tendencia a la no linealidad evidenciada por la distribucioacuten de los residuos No

obstante siendo las variancias iguales se consideroacute que no hay un alejamiento

significativo de la linealidad Por ello en los caacutelculos de variacioacuten de la concentracioacuten

de coenzima a lo largo del tiempo de reaccioacuten se tuvo en cuenta el cambio que se

produciriacutea si la velocidad de reaccioacuten se mantuviera constante e igual a la velocidad

inicial Para el caso del NAD+ consumido (o NADH generado) en la reaccioacuten (2)

tenemos

[53]

Asumiendo que en el intervalo de concentraciones de trabajo se cumple la ley de

Beer la ec [53] puede reescribirse como

[54]

Si la velocidad de la reaccioacuten enzimaacutetica se mantiene aproximadamente igual a la

velocidad inicial por la regeneracioacuten de la coenzima se puede admitir que la velocidad

A

05

056

062

068

074

08

086

092

098

104

11

0 600 1200 1800 2400 3000 3600

tiempo (s)

Ab

s 4

20

nm

B

0

004

008

012

016

02

024

028

032

036

04

044

048

0 600 1200 1800 2400 3000 3600tiempo (s)

Ab

s 3

40

nm

C

y = 00004405x

R2 = 09983921

0

0035

007

0105

014

0175

021

0 60 120 180 240 300 360 420 480

tiempo (s)

Ab

s 3

40

nm R

2 = 09984


75

de reaccioacuten es constante (reaccioacuten de orden cero para los reactivos) pudieacutendose expresar

la ec [54] en la siguiente forma

b

k

tb

tk

tb

Abs

nmNADHnmNADHnmNADH

nm

340340340

340 [55]

donde k es la constante de velocidad para esa reaccioacuten en unidades de absorbancia por

unidad de tiempo (s-1

) y se obtiene como la pendiente del segmento lineal de la curva de

la Fig 516 B presentado en la Fig 516 C

La variacioacuten de concentracioacuten total de coenzima se obtiene multiplicando el valor

de velocidad por la variacioacuten de tiempo total

[56]

siendo los valores de los paraacutemetros y variables en cuestioacuten

εNADH 340nm = 6220 M-1

cm-1

Δt = 3600 s

b = 1 cm

k = 44 x 10-4

s-1

resultando

[57]

La variacioacuten de concentracioacuten del mediador seraacute

[58]

nmCNFe 420)( 36

= 1080 M-1

cm-1

ΔAbs420nm = 052

que reemplazando en la ec [58] arroja

M [59]

La variacioacuten de absorbancia observada en el blanco de reaccioacuten a lo largo de una

hora fue de 00046 unidades de absorbancia que representa menos del 1 de la

variacioacuten total observada en la reaccioacuten (1) Estos resultados permiten verificar que en

las condiciones de reaccioacuten el Fe(CN)63-

reducido a Fe(CN)64-

equivale

cuantitativamente al NADH generado en la reaccioacuten enzimaacutetica de acuerdo a la

siguiente estequiometriacutea


76

2 Fe(CN)63-

+ NADH 2 Fe(CN)64-

+ NAD+ [510]

Lo mostrado corrobora la factibilidad del disentildeo de un biosensor de una sola

enzima con un mediador soluble econoacutemico

5511 Evaluacioacuten de la sentildeal con la concentracioacuten de glicerol

Para verificar si la sentildeal analiacutetica muestra dependencia con la concentracioacuten de

glicerol se realizaron 6 reacciones en paralelo registraacutendose la absorbancia a 420 nm

cada un minuto durante dos horas Se realizoacute un blanco de reaccioacuten sin glicerol y cinco

reacciones con concentraciones crecientes de glicerol Como muestras se utilizaron el

medio de cultivo de micobacterias Middlebrook 7H9 suplementado con glicerol a

distintas concentraciones En la Tabla 57 se presentan las concentraciones de glicerol

en las mezclas de reaccioacuten y en las muestras La Fig 517 muestra la absorbancia a 420

nm para las seis reacciones

Tabla 57 Concentraciones de glicerol en las mezclas de reaccioacuten

Reaccioacuten [glicerol] en mezcla

de reaccioacuten (mM) [glicerol] en muestra

(mM)

Blanco 0 0

Muestra 1 11 22

Muestra 2 082 16

Muestra 3 055 11

Muestra 4 027 55

Muestra 5 011 22


77

Figura 517 Absorbancia a 420 nm de las mezclas de reaccioacuten descriptas en el texto ( ) 11 mM de

glicerol ( ) 082 mM de glicerol ( ) 055 mM de glicerol (o) 027 mM de glicerol (-) 011 mM de

ccedilglicerol ( ) blanco de reaccioacuten

Habiendo verificado la dependencia de la sentildeal analiacutetica con el analito de intereacutes se

procedioacute a determinar el intervalo dinaacutemico lineal Para ello se realizaron las reacciones

de color como se describe en el apartado 417 de la seccioacuten Materiales y meacutetodos Cada

reaccioacuten se hizo por triplicado En la Fig 518 se muestran resumidos los resultados

obtenidos

[Glicerol] mM

000 005 010 015 020 025 030 035 040

Ab

s 42

0 n

m

00

02

04

06

08

10

Figura 518 Curva de calibracioacuten para glicerol utilizando el meacutetodo colorimeacutetrico Se muestran los

valores promedios de tres medidas independientes Las barras de error corresponden a los desviacuteos

estaacutendares

La recta de regresioacuten que se obtuvo a partir de estos valores fue

Abs420nm = 0946 ndash 238 [glicerol] [511]

02

03

04

05

06

07

08

09

1

0 1200 2400 3600 4800 6000 7200

tiempo (s)

Ab

s 4

20

nm


78

cuyo coeficiente de regresioacuten (R2) fue 09980 En el intervalo de concentraciones de

0025 a 027 mM la respuesta fue lineal

5512 Optimizacioacuten de condiciones para disminuir el costo operativo

Se verificoacute la posibilidad de cuantificar glicerol en medio Middlebrook 7H9

optimizando las concentraciones de reactivos y los tiempos de reaccioacuten para obtener la

maacutexima sentildeal con la mezcla maacutes econoacutemica posible Se ensayaron distintas

concentraciones de cofactor NAD+ a utilizar y 2 tiempos de reaccioacuten para una curva de

calibrado de 6 puntos consistente en un blanco y cinco estaacutendares de glicerol todos por

triplicado

Para verificar la factibilidad de disminuir la concentracioacuten de cofactor soluble sin

alterar significativamente la sensibilidad del meacutetodo se utilizoacute un disentildeo experimental

con un modelo de superficie de respuesta Como factores se tomaron la concentracioacuten

de cofactor y el tiempo de reaccioacuten Los niveles seleccionados en base a ensayos

previos fueron concentracioacuten de cofactor (NAD+) 01 mM 023 mM 037 mM y 05

mM tiempo 1 y 2 h Las respuestas que se evaluaron fueron la pendiente de una recta

de regresioacuten calculada a partir del meacutetodo de miacutenimos cuadrados y el coeficiente de

regresioacuten lineal correspondiente En la Tabla 58 se muestran los niveles parametrizados

y los valores de las respuestas obtenidas

Tabla 58 Disentildeo experimental factores parametrizados y respuestas obtenidas

Cada uno de los estaacutendares indicados en la Tabla 58 se correlaciona con una curva

de calibrado realizada En la Tabla 59 se informan los valores de concentracioacuten de

glicerol de las soluciones utilizadas para las reacciones de color y la concentracioacuten

correspondiente en la mezcla de reaccioacuten

Estaacutendar [NAD+] Tiempo Pendiente R2

4 1 -1 068 08790

7 03333 1 227 09962

8 1 1 184 09621

5 -1 1 159 09931

3 03333 -1 083 09590

2 -03333 -1 1 09850

6 -03333 1 244 09863

1 -1 -1 071 09914


79

Tabla 59 Valores de concentracioacuten de los estaacutendares utilizados para los ensayos de optimizacioacuten



(mM)

Blanco 0 0

Muestra 1 0010 02

Muestra 2 0025 05

Muestra 3 0050 10

Muestra 4 0075 15

Muestra 5 010 20

La ecuacioacuten de ajuste propuesta por el modelo de superficie de respuesta para la

pendiente fue

tBNADAm ][421 [512]

donde A y B son los coeficientes del modelo que se calculan a partir de la forma de la

superficie de respuesta e indican la dependencia de la pendiente (m) con la

concentracioacuten de cofactor ([NAD+]) y el tiempo de reaccioacuten (t) respectivamente El

anaacutelisis de los resultados indica que de los dos coeficientes solo B es significativo y su

valor es 062 mientras que A es un coeficiente no significativo Esto significa que la

pendiente de la recta de calibrado no muestra dependencia con la concentracioacuten de

cofactor NAD+ utilizado

Por otra parte el coeficiente de correlacioacuten no mostroacute dependencia con ninguno de

los factores elegidos Esto indica que el modelado de la funcioacuten deseabilidad global

queda reducido al de una sola respuesta la pendiente de la recta de calibrado y a un

uacutenico factor significativo que es el tiempo de reaccioacuten En base a estos resultados

pudimos establecer un uso miacutenimo de cofactor soluble


5521 Evaluacioacuten de glicerol remanente en cultivos axeacutenicos de M smegmatis

Primeramente se evaluoacute si podiacutea evidenciarse el consumo de glicerol por parte de

M smegmatis en un cultivo axeacutenico es decir conteniendo soacutelo este microorganismo

Para ello se realizaron cultivos de la micobacteria como se describe en el punto 418 de

la seccioacuten Materiales y Meacutetodos y se determinoacute el glicerol remanente haciendo uso del

meacutetodo fotomeacutetrico presentado previamente El anaacutelisis de la variancia de los valores de

absorbancia registrados y posteriormente se realizoacute un ensayo de comparaciones

muacuteltiples utilizando las pruebas de Tukey y de Bonferroni Se detectaron diferencias

estadiacutesticamente significativas en las absorbancias de las muestras del medio con M


80

smegmatis a las 2 y 3 h de iniciados los cultivos respecto de aquellos medios

conservados en esterilidad

5522 Determinacioacuten de glicerol remanente en cultivos de micobacterias con y

sin fago D29 y ensayos controles respectivos

En una segunda serie de ensayos nos propusimos ver si habiacutea consumo diferencial

de glicerol entre cultivos de M smegmatis y cultivos de la micobacteria infectados con

el fago D29 siguiendo el protocolo descripto en el punto 4181 de la seccioacuten Materiales

y Meacutetodos En la Fig 519 se muestran los valores de absorbancia a 420 nm de las

muestras mencionadas Sobre este conjunto de datos nuevamente se realizoacute un anaacutelisis

de la variancia y ensayos de comparaciones muacuteltiples utilizando las pruebas de Tukey y

de Bonferroni

Los resultados obtenidos indican que todos los medios de cultivo a los cuales no se

le inoculoacute bacterias y aquellos medios donde se inoculoacute bacterias pero fueron

centrifugados inmediatamente despueacutes del inoacuteculo (muestras a t= 0) no mostraron

diferencias estadiacutesticamente significativas en los ensayos de comparaciones muacuteltiple

realizados Esto permite concluir que el agregado de fago y la incubacioacuten a 37 ordmC no

producen modificaciones significativas per se en las reacciones de color Por ello es

posible afirmar que en el futuro podraacuten simplificarse los controles a un uacutenico testigo

de concentracioacuten inicial conocida sin necesidad de tomar una muestra del cultivo

inmediatamente despueacutes del inoacuteculo o de la adicioacuten de fagos a los controles negativos

del ensayo

En este ensayo preliminar pudimos observar que las diferencias de absorbancia

resultaron estadiacutesticamente significativas entre los medios de cultivo donde crecieron

ceacutelulas de M smegmatis y los medios donde crecieron ceacutelulas de M smegmatis

infectadas con fago D29 tanto a las 2 como a las 4 h de iniciados los cultivos Este

resultado indicoacute que la hipoacutetesis de trabajo planteada era apropiada y en consecuencia

seriacutea factible desarrollar un meacutetodo para verificar la integridad de micobacterias en un

cultivo de las mismas


81

Bla

nco

Med

io 0

025

00

25

+ F

ago t

= 0

00

25

C

eacutelula

s t

= 0

00

25

Ceacutel

ula

s +

Fag

o t

= 0

00

25

+ F

ago t

= 2

00

25

Ceacutel

ula

s t

= 2

00

25

Ceacutel

ula

s +

fag

o t

= 2

00

25

fa

go t

= 4

00

25

Ceacutel

ula

s t

= 4

00

25

Ceacutel

ula

s +

fag

o t

= 4

Abs

420 n

m

03

04

05

08

Figura 519 Absorbancias a 420 nm registradas para las muestras descritas Se indica concentracioacuten

inicial de glicerol en mv y tiempo de incubacioacuten a 37 ordmC El blanco corresponde al de la reaccioacuten de

color sin glicerol

553 Biosensor amperomeacutetrico a base de pasta de carbono viacutetreo modificada

En funcioacuten de los resultados previos se procedioacute al ensamblado de un biosensor

amperomeacutetrico siguiendo el esquema de reaccioacuten presentado previamente que se

reproduce en la figura 520

Figura 520 Esquema de reaccioacuten propuesto para biosensor amperomeacutetrico selectivo para glicerol La

coenzima reducida NADH se regenera a su forma oxidada NAD+ reaccionando con el Fe(CN)6

3- que se

reduce a Fe(CN)64-

Este uacuteltimo se reoxida electroquiacutemicamente sobre la superficie del electrodo

completando el ciclo cataliacutetico

Utilizando electrodos de pasta de carbono B (punto 41912 seccioacuten Materiales y

Meacutetodos) se realizaron amperometriacuteas siguiendo el protocolo descrito en el punto 4202

glicerol

DHA

GlDHox

GlDHred NAD+

NADH Mediador ox

Mediador red

e- Electrodo


82

de la seccioacuten Materiales y Meacutetodos En la Fig 521 se muestra un amperograma tiacutepico

obtenido

Tiempo s

100 200 300 400 500

I

nA

0

20

40

60

80

100

Figura 521 A) Amperograma tiacutepico obtenido con un electrodo de trabajo de pasta de carbono B

trabajando a un potencial de 038 V Se agregaron 50 L de medio 7H9 suplementado con glicerol

usualmente a los 300 s de iniciada la lectura de corriente cuando eacutesta se estabilizoacute B) Agregados

sucesivos de 50 microL de medio 7H9 suplementado con glicerol 20 mM sobre 200 mL de la misma

solucioacuten

En la Fig 522 se presenta la recta de regresioacuten obtenida a partir de los valores

promedios de corrientes para soluciones de glicerol en el intervalo de concentraciones

de 0062 mM y 175 mM Las barras de error corresponden a las desviaciones estaacutendar

de cada medida La ecuacioacuten de la recta obtenida por el meacutetodo de miacutenimos cuadrados

fue

[513]

donde Ic estaacute en nA y [Glicerol] en mM el valor del coeficiente de regresioacuten (R2)

obtenido fue de 09982






Tiempo s

0 500 1000 1500 2000

I

nA

0

50

100

150

200


83

[Glicerol] mM

000 025 050 075 100 125 150 175 200

Ic

nA

0

50

100

150

200

Figura 522 Recta de calibracioacuten para glicerol utilizando el meacutetodo amperomeacutetrico descrito en el texto

Se muestran los valores promedios de corrientes liacutemite corregidas y las desviaciones estaacutendares de 3

lecturas independientes

Una vez que se preparoacute la pasta de carbono viacutetreo modificada con la enzima esta

resultoacute estable durante 10 semanas sin peacuterdida de actividad enzimaacutetica siempre que se

mantuviese seca a 4 degC Una vez que se ensambloacute el biosensor con el poliacutemero

electrodepositado pudo utilizarse durante al menos 8 horas consecutivas con una

peacuterdida de sensibilidad insignificante En efecto los cambios observados en las sentildeales

registradas de forma consecutiva se encontraron dentro del error intriacutenseco del meacutetodo

propuesto La estabilidad de un mismo biosensor durante diacuteas sucesivos se evaluoacute

realizando medidas de la misma solucioacuten y evaluando la relacioacuten sentildealruido la cuaacutel

disminuyoacute un 15 del valor original al tercer diacutea y un 50 al quinto diacutea de uso


nanotubos de carbono

Para reducir los tiempos de anaacutelisis se procuroacute disminuir el periacuteodo de

estabilizacioacuten de la corriente modificando el esquema original propuesto para el sensor

Para esto se modificoacute la pasta de carbono con nanotubos de carbono de paredes

muacuteltiples (Rubianes amp Rivas 2003) Seguacuten trabajos previos esta estrategia permite

disminuir el sobrepotencial asociado a la electrooxidacioacuten de la coenzima NADH

evitaacutendose el uso de un mediador soluble (Musameh 2002) Previo a su utilizacioacuten los

NTC fueron funcionarizados por carboxilacioacuten oxidativa siguiendo el protocolo

especificado en el punto 421 de la seccioacuten Materiales y Meacutetodos


84

En la Fig 523 (derecha) se muestran las voltametriacuteas que se obtuvieron utilizando

un electrodo de trabajo relleno con pasta B (pasta de carbono viacutetreo modificada con

enzima GlDH al 2 en masa)

Figura 523 Voltamperogramas ciacuteclicos utilizando bioelectrodos de pasa de carbono B con GlDH

(derecha) y pasta C con GlDH y MWCNT (izquierda) En liacutenea puntuada se muestran las voltametriacuteas de

la solucioacuten NAD+ 05 mM (NH4)2SO4 25mM K2CO3 KHCO3 01 M pH 105 (blanco) En liacutenea

continua las voltametriacuteas de las mismas soluciones con el agregado de glicerol en concentracioacuten final 25

mM La velocidad de barrido fue 50 mV s-1

Se marcan los picos de corriente observados y el potencial de

pico

El sobrepotencial asociado a la electroxidacioacuten de la coenzima NADH en el

electrodo de pasta de carbono B es 70 mV menor que el informado por Wang y col Ep

= 082V sobre electrodos de carbono viacutetreo (Musameh 2002) Esta diferencia podriacutea

deberse a los distintos pH de trabajo o bien a alguna diferencia en las cualidades de la

superficie del electrodo

En la Fig 523 (izquierda) se muestran los resultados obtenidos con los electrodos

de pasta C pasta de carbono modificada con GlDH al 2 y con MWCNT al 10 en

masa En este caso vemos que el sobrepotencial asociado a la electroxidacioacuten de NADH

es 0180 V menor Ep = 057 V que el observado para la pasta B Esta diferencia

podemos atribuirla a las cualidades diferentes de las superficies del electrodo debida a la

presencia de los MWCNT Es de destacar que Wang y col en la oxidacioacuten del NADH

sobre la superficie de carbono viacutetreo modificado con MWCNT observaron dos

procesos oxidativos uno principal con un Ep de 033 V y otro secundario con Ep de

057 V que aparece como hombro del primero (ver Fig 524 reproducida de Wang y

col)

Ep = 075 V


85

Figura 524 Reproducido de Musameh y col 2002 Voltamperogramas correspondientes a una solucioacuten 5

mM de coenzima NADH en solucioacuten tampoacuten fosfato 005 M pH 74 utilizando electrodos de trabajo de

pasta de carbono viacutetreo sin modificar (A) y modificado con MWCNT (B) Velocidad de barrido 50 mV s-1

En el voltagrama B puede apreciarse el pico principal y el secundario que aparecen como hombro del

primero

En este trabajo soacutelo se pudo identificar un uacutenico proceso oxidativo a 057 V Si bien

auacuten estamos investigando posibles causas que hayan originado esta diferencia es de

esperar que el pH sea un factor determinante ya que la oxidacioacuten de NADH a NAD+

involucra la perdida de un H+ Por otra parte en los voltagramas realizados con pasta C

se registroacute un importante aumento de las corrientes capacitivas (18 μA) en relacioacuten a

las voltametriacuteas donde se utilizaron electrodos de pasta sin MWCNT Este mismo

efecto pero en menor magnitud (55 μA) tambieacuten fue registrado por Wang y

colaboradores al trabajar con electrodo de carbono viacutetreo modificado con MWCNT

(Musameh 2002) Los resultados obtenidos por Wang y colaboradores y los de este

trabajo de Tesis se muestran comparativamente en la Tabla 510

Tabla 510 Resultados obtenidos por Musameh y col 2002 y los correspondientes a este trabajo

Musameh y col

2002 Este trabajo

Electrodo de

trabajo Cv

C v +

MWCNT Pasta B Pasta C

V barrido 50 mV s-1 50 mV s

-1

pH 74 105

Ep (V) 082 033

057 075 057

Aumento de la

I cap (μA) - 55 - 18


86

Con estos resultados preliminares comenzamos los ensayos amperomeacutetricos para

cuantificar el glicerol remanente en los medios de cultivos de micobacterias Se llevaron

adelante distintos ensayos y nuevamente el inconveniente principal al que nos

enfrentamos fue que la respuesta no era estable en el tiempo En la Fig 525 se muestra

un amperograma obtenido con un bioelectrodo de pasta C y realizando agregados

sucesivos de un estaacutendar de glicerol 20 mM disuelto en medio Middelbrook 7H9

Con este nuevo esquema de trabajo no se logroacute acortar los tiempos de estabilizacioacuten

de la corriente Los algoritmos de correccioacuten de corriente de base que estaacuten

incorporados al programa GPES tampoco permitieron solucionar este inconveniente

Por este motivo se optoacute por utilizar teacutecnicas voltameacutetricas de pulso que en principio

permitiriacutean evitar este inconveniente

Tiempo s

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900

I A

0

1

2

3

4

Figura 525 Amperograma obtenido con un bioelectrodo de pasta de carbono C trabajando a 05 V vs

AgAgCl A t=200 s de iniciada la lectura se agregaron 50 L de medio 7H9 y posteriormente se

realizaron agregados sucesivos de 50 L de medio 7H9 suplementado con glicerol 20 mM

5541 Ensayos de cuantificacioacuten de glicerol con el bioelectrodo desarrollado

utilizando teacutecnicas de pulso

Las teacutecnicas voltameacutetricas de pulso presentan la ventaja de permitir trabajar durante

tiempos muy reducidos en la zona de potencial donde la especie electroactiva cambia

su estado de oxidacioacuten produciendo la sentildeal analiacutetica

Se optoacute por ensayar la voltametriacutea de onda cuadrada para los futuros ensayos de

cuantificacioacuten y los experimentos preliminares procuraron establecer los valores maacutes

convenientes de los paraacutemetros relevantes de la teacutecnica como la amplitud de pulso el

escaloacuten de potencial y la frecuencia (punto 633 seccioacuten Experimentos Auxiliares)


87

En una segunda serie de ensayos se buscoacute observar la dependencia de la corriente

de pico con la concentracioacuten de glicerol Para esto se realizaron ensayos

independientes En este esquema de trabajo surgioacute un inconveniente respecto del criterio

de medida de la corriente de pico ya que en ensayos independientes no se pudo

establecer una liacutenea de base comuacuten a todos los voltamperogramas

Se ensayaron distintos criterios para determinar una liacutenea de base apropiada como

se detalla en el punto 6331 de la seccioacuten Experimentos Auxiliares y en la Fig 526 se

muestran los voltamperogramas corregidos siguiendo el criterio elegido

Figura 526 Voltamperogramas de onda cuadrada (corregidos) obtenidos utilizando electrodos de pasta

de carbono viacutetreo modificada con GlDH y MWCNT Se muestran los voltagramas de las soluciones

blanco (helliphelliphelliphellip

) glicerol 5 mM (mdash mdash) 125 mM (mdashmdash) 25 mM (diamsdiamsdiams) 36 mM (- - -) y 50 mM (mdash bull mdash)

En la Fig 527 se muestran la dependencia de la corriente de pico con la

concentracioacuten de glicerol obtenida a partir de experimentos exploratorios uacutenicos para

cada concentracioacuten Resta a futuro repetir los experimentos para establecer el error

asociado a la metodologiacutea el intervalo dinaacutemico lineal y el liacutemite de deteccioacuten


88

Figura 527 Dependencia de la corriente de pico registrada en la VOC en funcioacuten de la concentracioacuten de

glicerol en la celda electroquiacutemica

56 Validacioacuten de meacutetodos

De los meacutetodos desarrollados se seleccionaron aquellos dos que dieron resultados

maacutes fiables meacutetodo amperomeacutetrico utilizando un electrodo de trabajo de oro y el

meacutetodo amperomeacutetrico utilizando el biosensor con GlDH con mediador soluble Se

realizaron ensayos en paralelo con un meacutetodo alternativo ampliamente utilizado en

particular se utilizoacute un equipo comercial que utiliza tres enzimas y deteccioacuten

espectrofotomeacutetrica (Wiener lab) La Fig 528 muestra la concentracioacuten nominal versus

concentracioacuten predicha obtenida por las tres metodologiacuteas ensayando diferentes

diluciones de muestra y graficaacutendose el valor medio de 3 medidas independientes

Nominal mM

00 02 04 06 08 10

Pre

dic

ho

mM

00

02

04

06

08

10

Equipo comercial

Tip Au

Biosensor

Recta identidad

Figura 528 Concentracioacuten nominal vs predicha para las dos metodologiacuteas propuestas en este trabajo de

tesis y un meacutetodo enzimaacutetico disponible comercialmente

0

05

1

15

2

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

[Glicerol] (mM)

Ip (

uA

)


89

Es evidente que los meacutetodos propuestos se correlacionan adecuadamente con la

recta identidad En la Fig 529 se muestran las tres regiones eliacutepticas de confianza

conjuntas (EJCR) para la pendiente y ordenada al origen En este caso puede apreciarse

que las tres elipses contienen el punto (0 1) lo que indica una buena correlacioacuten entre

los meacutetodos propuestos en el presente trabajo y un meacutetodo disponible comercialmente

Pendiente

08 09 10 11 12

Ord

enad

a al

ori

gen

-06

-04

-02

00

02

04

06

Equipo comercial

Tip Au

Biosensor

Punto (1 0)

Figura 529 Regiones eliacutepticas de confianza conjuntas para dos metodologiacuteas presentadas en este trabajo

de Tesis y un meacutetodo enzimaacutetico disponible comercialmente

En la Tabla 511 se presentan distintas metodologiacuteas publicadas en la literatura

actual en las que se referencia la cuantificacioacuten de glicerol ya sean biosensores

electroquiacutemicos u otra metodologiacutea El anaacutelisis de la Tabla 511 permite ver que la

determinacioacuten de glicerol en medios alcalinos sin presencia de interferentes puede ser

llevada a delante con metodologiacuteas econoacutemicas Debe ser considerado que cuando se

realiza la determinacioacuten de glicerol en muestras de biodiesel dicha cuantificacioacuten

requiere extraer el analito de la matriz como puede verse en los meacutetodos maacutes

recientemente propuestos (Bondioli amp Bella 2005 Silva amp Rocha 2010 Lima y col

2012 Tehrani amp Ghani 2012 Maruta amp Paixao 2012 Lourenccedilo amp Stradiotto 2009

Stradiotto y col 2009) Ya sea que se utilice deteccioacuten espectroscoacutepica o

electroquiacutemica siempre se requiere la extraccioacuten previa a la determinacioacuten del analito

Incluso la propuesta de Fernaacutendez Band y col que es el uacutenico meacutetodo que hace una

diferencia notable al comparar las cifras de meacuterito (LD 04 microM tiempo de anaacutelisis 4

min) implica un pretratamiento de la muestra (Lima y col 2012)


90

Tabla 511 Comparacioacuten de meacutetodos para cuantificar glicerol propuestos recientemente Adaptado de

Faccendini y col 2014

Meacutetodo (Tratamientos

previos) LD

(microM)

Rango de

linealidad

(M)

Muestra

ensayada

Tiempo de

anaacutelisis

(min)

Reactivos o

accesorios

onerosos Referencia

Espectrofotomeacutetrico

(Extraccioacuten del analito) 22

4 times 10-5

a

2 times10-4

Biodiesel 20 - Bondioli amp

Bella 2005 Espectrofotomeacutetrico


5 times 10minus5

a

5 times 10minus4

Biodiesel 20 a 30 - Silva amp Rocha

2010

Espectrofluoromeacutetrico


1 times 10minus6

a

5 times 10minus4

Biodiesel 4 - Lima y

col2012


multienzimaacutetico No

informa 2 times 10

minus2 a

1 times 10minus1

Jugo de cantildea 5 GK GPO

ATP Kronka y col

2001


multienzimaacutetico 8

8 times 10minus6

a

25 times 10minus4

Suero

Humano 10

GK PK

LDH ATP

NAD+

Li y col 2001

Electroquiacutemico VPD


5 times 10minus4

a

12 times 10minus2

Biodiesel 15 - Tehrani y

Ghani 2012 Electroquiacutemico VC


33 times 10minus5

a

17 times 10minus3

Biodiesel 30 FIA Maruta y

Paixao 2012

Electroquiacutemico VC


33 times 10minus5

a

17 times 10minus3

Biodiesel 20 Cartucho de

C18

Lourenccedilo amp

Stradiotto

2009 Electroquiacutemico

amperomeacutetrico

(Extraccioacuten del analito)

No

informa 16 times 10

minus4 a

16 times 10minus3

Biodiesel 60 - Stradiotto y

col 2009

Electroquiacutemico VL

VPD amperomeacutetrico


23 times 10minus5

a

23 times 10minus4

Solucioacuten

Acuosa

pH=13 5

MWCNT

funcionalizad

os con Ag

Pop y col 2011

Electroquiacutemico

amperomeacutetrico


25 times 10minus5

a

20 times 10minus3

Solucioacuten

Acuosa

pH=13 8 -

Este Trabajo

de Tesis

Electroquiacutemico

amperomeacutetrico


5 times 10minus5

a

23 times 10minus2

Solucioacuten

Tampoacuten

Fosfato

5

(estimados) GO

Goriushnika y

col 2010

Biosensor

amperomeacutetrico 04

10 times 10minus6

a

10 times 10minus4

Jarabe de

cantildea 15

(estimados) GlDH NAD+

Aacutelvarez-

Gonzalez y

col 2000

Biosensor


1 times 10minus6

a

2 times 10minus5

Vino 3 GlDH DP

NAD+ Gamella y

col 2008

Biosensor


1 times 10minus6

a

1 times 10minus5

Vino 3 GK GPO

HRP ATP Gamella y

col 2008 Biosensor


5 times 10minus6

a

1 times 10minus4

Vino 5 GK GPO

ATP Ghica amp Brett

2006

Biosensor


70 times 10minus5

a

18 times 10minus3

Caldo

Middlebrook 10

GlDHb

NAD+ Este Trabajo

de Tesis

Del mismo modo el enfoque de Tehrani y Ghani que utilizan un electrodo de grafito

modificado con nanopartiacuteculas de nickel trabajando a pH = 13 realizan una extraccioacuten

previa de glicerol a partir de muestras de biodiesel (Tehrani amp Ghani 2012) En este


91

caso el LD fue de 33 microM mientras que en este trabajo de Tesis utilizando el mismo

medio hemos conseguido un LD de 10 microM empleando electrodos de oro policristalino

Maruta y Paixao han propuesto recientemente un meacutetodo amperomeacutetrico usando un

electrodo de cobre que trabaja a 065 V vs AgAgCl adaptado en un sistema de FIA

(Maruta amp Paixao 2012) mientras que Lourenccedilo y Stradiotto informaron sobre un

meacutetodo electroquiacutemico que requiere la extraccioacuten acuosa del glicerol a partir de la

muestra y la purificacioacuten adicional por elucioacuten a traveacutes de un cartucho de C18 seguida

de una concentracioacuten por evaporacioacuten y finalmente un anaacutelisis mediante VC (Lourenccedilo

amp Stradiotto 2009) Tambieacuten otras propuestas informan sobre la determinacioacuten de

glicerol por amperometriacutea haciendo uso de electrodos modificados tales como

electrodos de diamante dopados con boro y modificados con nanopartiacuteculas de niacutequel

(Stradiotto y col 2009) y electrodos compuestos de nanotubos de carbono de pared

muacuteltiple funcionalizados con plata (Pop y col 2011) Si bien ambos meacutetodos se

presentan como uacutetiles se requieren diferentes pasos operativos para eliminar posibles

interferencias tales como otros alcoholes que podriacutean ser oxidados a los potenciales de

trabajo 065 V o 130 V (vs AgAgCl) respectivamente En este sentido nuestros

resultados obtenidos por amperometriacutea usando electrodos de oro en medio alcalino

acuoso (pH = 13) estaacuten en el mismo orden que los obtenidos por Pop y colaboradores

utilizando LSV (Pop y col 2011) sobre electrodos compuestos de nanotubos de

carbono de pared muacuteltiple funcionalizados con plata Efectivamente este uacuteltimo y

nuestra metodologiacutea mostraron las mejores cifras de meacuterito entre los meacutetodos

electroquiacutemicos de bajo costo que no consumen enzimas

Los meacutetodos enzimaacuteticos espectrofotomeacutetricos aunque no son laboriosos presentan

la desventaja del consumo relativamente elevado de enzima cada muestra necesita la

adicioacuten del costoso reactivo bioloacutegico ya que no puede ser reutilizado Tambieacuten los LD

de los meacutetodos espectrofotomeacutetricos enzimaacuteticos informados son generalmente

superiores a los que presentan los biosensores Puede antildeadirse que estos uacuteltimos

presentan generalmente el intervalo dinaacutemico lineal maacutes amplio en comparacioacuten con

otros enfoques ya sean electroquiacutemicos o espectrofotomeacutetricos Soacutelo la metodologiacutea de

flujo discontinuo con deteccioacuten fluoromeacutetrica propuesta por Fernaacutendez Band y col

(Lima y col 2012) muestra una sensibilidad en el mismo orden que el maacutes bajo de los

biosensores

En el anaacutelisis de los biosensores que se muestran en la Tabla 511 hay que destacar

que el propuesto por Pingarroacuten y col (Gamella y col 2008) muestra el LD y tiempo de


92

anaacutelisis total maacutes bajo Para evaluar costos operativos se presenta en la Tabla 512 un

resumen comparativo de la cantidad y concentracioacuten de los reactivos onerosos

consumidos por biosensor o por anaacutelisis entre la propuesta de Pingarroacuten y col y la del

biosensor aquiacute propuesto

Tabla 512 Comparacioacuten entre el meacutetodo enzimaacutetico que mejores cifras de meacuterito presenta y el propuesto

en el presente trabajo de Tesis Adaptado de Faccendini y col 2014

GlDH

bisosensor Diaforasa

biosensor tetratiofulvaleno

biosensor NAD

+ por

anaacutelisis

Gamella y

col 2008 75 U 162 U 15x10-6

M 5x10-3

M Este Trabajo

de Tesis 23 U - - 5x10-4

M

Podemos afirmar que nuestra propuesta es menos costosa hecho importante a ser

evaluado cuando se va a analizar un gran nuacutemero de muestras Mediante la reduccioacuten de

la cantidad de GlDH el LD se elevoacute desde 04 hasta 20 microM aunque es adecuado auacuten

para detectar cambios de concentracioacuten de glicerol en el orden de 15 microM Al mismo

tiempo evitando el uso de diaforasas el tiempo total de anaacutelisis se extendioacute de 3 a 10

min En conjunto los resultados presentados confirman que los cambios introducidos a

los biosensores informados previamente en la literatura tales como el uso de soacutelo una

enzima en baja proporcioacuten la sustitucioacuten del mediador redox por el ferricianuro soluble

y trabajar con el cofactor NAD+ soluble proporciona un sistema fiable de bajo costo

para cuantificar el glicerol

Experimentos Auxiliares


94

6 Experimentos Auxiliares


por ceacutelulas B

AAPPred BcePred ABCPred BepiPred y Antigenic se ejecutaron en liacutenea En la

Tabla 61 se muestran los VPP medios (ver definicioacuten en seccioacuten Materiales y Meacutetodos

pag 11) que se obtuvieron al predecir epiacutetopes lineales reconocidos por ceacutelulas B de

todas las proteiacutenas enumeradas en la Tabla 62

Los resultados obtenidos indican que BcePred es el uacutenico programa de los

evaluados que muestra un VPP inferior al obtenido con la prediccioacuten al azar Tambieacuten

se obtuvo que soacutelo dos de los programas estudiados AAPPred y ABCpred predijeron

epiacutetopes con un VPP significativamente mayor al valor de VPP de un procedimiento de

identificacioacuten aleatoria Estos dos programas produjeron predicciones con valores

maacuteximos de 862 y 786 de VPP respectivamente

Tabla 61 Valores predictivos positivos promedio que se obtuvieron con cada uno de los programas

predictores con los que se trabajoacute

Programa

VPP

promedio

AAPPred 691

ABCPred 628

BcePred 309

BepiPred 453

Antigenic 419

Aleatorio 382

En base a estos resultados se trabajoacute con el programa AAPPred y se identificaron

las regiones que concentraban el mayor nuacutemero de epiacutetopes reconocidos por ceacutelulas B

de las proteiacutenas P22 P30 y P35 con el fin de expresar estos Angs como proteiacutenas

recombinantes y utilizarlos en el desarrollo de meacutetodos de diagnoacutestico de la

toxoplasmosis aguda


95

Tabla 62 Base de datos experimental proteiacutenas seleccionadas para este estudio Se indican el nombre de

la proteiacutena el coacutedigo de acceso NCBI la longitud total (en residuos de amino aacutecidos) el

nuacutemero de epiacutetopes reales determinados experimentalmente y la localizacioacuten de los epiacutetopes o

regiones antigeacutenicas Proteiacutenas tomadas de base de datos (A) BciPep (B) VIH Inmunologiacutea

Molecular base de datos o tomado de la literatura (veacutease el nuacutemero de referencia 17 para VP1

16 para la proteiacutena N y 18 para gliadina)

Proteiacutena

Coacutedigo

NCBI

Nordm de

residuos

Cantidad de

epiacutetopes

Localizacioacuten de los epiacutetopes o regiones

antigeacutenicas

MPT70 (A) NP_217391 193 2 31-70 100-120

MSP-1 (A) BAF622801 1693 3 29-39 1594-1611 1644-1662

Exotoxina

A (A) NP_249839 638 8

297-313 324-333 354-387 412-421 510-522

528-539 557-593 596-638

GAG1 (A) P20873 504 10

11-25 113-122 142-156 176-214 216-268

280-308 312-321 330-367 406-416 428-448

Gp160 (A) NP_057856 856 13

30-141 161-191 211-231 252-281 294-344

346-413 424-511 525-558 561-615 639-701

724-747 761-778 822-855

Pr55 (B) NP_579876 132 2 11-38 51-78

Rev (B) NP_057854 116 4 5-15 32-51 70-91 96-116

VP1 (17) ABC87248 781 12

31-41 55-65 85-95 151-161 292-392 316-326

493-500 529-539 547-554 571-578 667-707

712-722

Gliadin

(18) A27319 296 3 31-72 165-176 237-264

Proteiacutena N

(16) AAP13445 422 6 1-6 45-61 153-192 211-223 225-235 354-412

Proteasa

(B) CAB66012 99 2 1-7 36-47


deteccioacuten fotomeacutetrica

Previo al inicio de los ELISA de captura iniciamos una serie de pruebas preliminares

con el propoacutesito de

a) Diferenciar sueros de pacientes infectados de sueros de individuos sin infeccioacuten De

este modo se pretende verificar la potencial utilidad en diagnoacutestico de los antiacutegenos

propuestos corroborando que los procesos quiacutemicos llevados a cabo como por ej la

conjugacioacuten no eliminaron epiacutetopes claves


96

b) Minimizar la sentildeal en los ensayos sin suero (blanco de reactivos) es decir

disminuir el ruido de fondo asociado a interacciones inespeciacuteficas

A tales fines se realizaron ELISA indirectos utilizando los antiacutegenos recombinantes

obtenidos (marcados y sin marcar) adsorbidos sobre la placa se utilizaron sueros

tipificados y se reveloacute la presencia de IgG humana revelando con anticuerpos de cabra anti

IgG humana Los resultados obtenidos se detallan en la siguiente tabla

Tabla 63 Valores de absorbancia a 450 nm obtenidos en ELISA indirectos con deteccioacuten de IgGh con

conjugado anti IgG humana-HRP

Sueros P22C P22C-

biotina P35B

P35B -

biotina

Positivos

2 gt3 26 1900

3 2900 2 gt3

gt3 gt3 26 gt3

Negativos

13 1000 11 0800

06 0500 09 0700

11 1600 1 1000

Si bien los valores de absorbancia leiacutedos en todos los pocillos resultaron elevados

los sueros confirmados positivos dieron los valores maacutes altos de absorbancia mientras

que los sueros negativos dieron los valores maacutes bajos Las diferencias observadas entre

sueros confirmados positivos y sueros confirmados negativos permitieron asumir que

los antiacutegenos obtenidos son de posible utilidad en diagnoacutestico Ademaacutes no se

detectaron diferencias significativas entre los valores de absorbancia obtenidos

utilizando antiacutegenos marcados de aquellos obtenidos con los no marcados

permitieacutendonos pensar que la conjugacioacuten llevada a cabo no eliminoacute epiacutetopes claves

Los elevados valores de absorbancia obtenidos en este ensayo junto a otros estudios

preliminares sugieren que existe una elevada adsorcioacuten inespeciacutefica

621 Bloqueante a utilizar

Se ensayaron diversos agentes bloqueantes para minimizar las interacciones

inespeciacuteficas encontradas durante los experimentos preliminares y asiacute evitar las altas

sentildeales obtenidas en los ensayos control realizados sin suero (blanco de reactivos) y con

sueros confirmados negativos (blancos de muestra) Sobre placas comerciales de

poliestireno se procedioacute al bloqueo total con el agente bloqueante a ensayar y

posteriormente se realizoacute una incubacioacuten con y sin antiacutegeno P22C por duplicado

Finalmente se reveloacute con la enzima HPR-EAV que se une especiacuteficamente a biotina En

la Tabla 64 se muestran los valores de absorbancia a 450 nm


97

Tabla 64 Valores promedio de absorbancia a 450 nm obtenidos en los ensayos de bloqueo

450 nm Sin P22cBiot Con P22cBiot

Sin Bloqueante ------- 1162

Leche 1 0066 01445

Caseinato 1 00725 02425

Gelatina 1 00725 03925

BSA 1 00625 0192

BSA 1 Tween 002 00615 01515

En base a estos resultados se continuoacute con el uso de leche descremada como agente

bloqueante

622 Esquema A

Cuando se realizaron ELISA siguiendo el esquema A se ensayaron dos diluciones

de la HRP-EAV 12000 y 15000 Por otro lado se ensayaron distintas masas de

antiacutegenos P22C y P35B conjugados a biotina con los que se intentoacute revelar presencia

de IgM especiacuteficas Especiacuteficamente se ensayaron 2 02 y 002 g por pocillo de P35B

biotina y 5 2 02 y 002 g por pocillo de P22C biotina Con esto se buscoacute encontrar

las cantidades oacuteptimas de reactivos para poder llevar adelante estos ensayos A modo

ilustrativo en la Tabla 65 se muestra un ensayo representativo siguiendo el esquema A

Se informan solamente los valores de absorbancia a 450 nm obtenidos para sueros

provenientes de pacientes con infeccioacuten croacutenica (croacutenicos) aguda (agudos) y de

pacientes sin infeccioacuten (negativos)

Tabla 65 Valores de absorbancia a 450 nm obtenidos en ELISA siguiendo el esquema A Se muestran 3

cantidades de antiacutegeno revelador utilizadas 2 02 y 002 microg En este ensayo la dilucioacuten de la

enzima HRP-EAV fue 15000 y se utilizaron 100 microL por pocillo

Antiacutegenos

Sueros

P22C biotina ( g) P35B biotina ( g)

2 02 002 2 02 002

Negativos 0576 0294 0155 1071 0681 0566

0543 0335 0176 1079 0769 023

Croacutenicos 0469 0246 0135 103 069 0299

0514 0215 0111 0914 0567 0196

Agudos 0331 0181 0109 081 0574 0168

0555 0254 0139 0789 0391 0169


98

623 Esquema B

Cuando se realizaron ELISAs siguiendo el esquema B se ensayaron distintas masas

de antiacutegeno P22C y P35B absorbidas sobre las microplacas comerciales a saber 500

200 50 10 o 5 ng (disueltos en 100 L de solucioacuten tampoacuten carbonato pH 96) En todos

los casos se incuboacute 1h a 37 degC

Para la incubacioacuten con la proteiacutena conjugada a biotina se ensayaron 2 y 5 ug por

pocillo En la Tabla 66 se resumen los resultados obtenidos

Tabla 66 Valores de absorbancia a 450 nm obtenidos en ELISA siguiendo el esquema B Se muestran

los resultados obtenidos para dos cantidades distintas de antiacutegeno de captura (P22C) 10 y 50

ng junto a 2 cantidades de antiacutegeno revelador (P22C-biotina) utilizadas 2 y 5 microg En este

ensayo la dilucioacuten de la enzima HRP-EAV fue 12000 y se utilizaron 100 microL por pocillo

2 microg P22C biotina 5 microg P22C biotina

Masa de P22C

(ng)

Muestras

50 10 50 10

Agudos 0393 0303 0553 0450

0273 0335 0793 0367

Croacutenicos 0230 0398 0316 0345

0284 0291 0444 0493

Negativos 0392 0210 0380 0380

0286 0292 0314 0350

Sin suero 0367 0468 0415 0411

0327 0358 0468 0536

Sin Prot conjugada a

biotina ni sueros

0102 0087 0128 0079

0131 0095 0116 0104

Los resultados obtenidos indicaron que para lograr una mejor discriminacioacuten de las

muestras es conveniente utilizar mayor cantidad de masa de antiacutegeno de captura (P22C)

depositada en el pocillo Por otro lado 5 microg de antiacutegeno revelador (P22C-biotina) por

pocillo contribuyoacute a aumentar la discriminacioacuten entre las muestras sin incrementar

significativamente el ruido de fondo


99

63 Ensayos electroquiacutemicos

631 Determinacioacuten del aacuterea real de un electrodo

6311 Meacutetodo de la adsorcioacuten de O2

Se realizaron barridos de potencial como se indica en el punto 41931 de la

seccioacuten Materiales y Meacutetodos La Fig 61 muestra un voltamperograma tiacutepico obtenido

Con el valor de la carga asociada a la desorcioacuten del oacutexido de oro pudo determinarse el

valor de aacuterea electroactiva del electrodo de trabajo utilizado como se indica en el punto

41931

E V

04 06 08 10 12 14 16

I

A

-15e-5

-10e-5

-50e-6

00

50e-6

Figura 61 Voltamperograma ciacuteclico tiacutepico obtenido con electrododos de oro en medio H2SO4 05 M

velocidad de barrido 50 mV s-1

Se indica en color turquesa el pico de desorcioacuten del oacutexido de oro la carga

(Q) obtenida del aacuterea encerrada en la curva se utilizoacute para determinar el aacuterea real de los electrodos de oro

previamente a los ensayos

6312 Voltametriacutea ciacuteclica a distintas velocidades

Se realizaron barridos de potencial a distintas velocidades como se indica en el

punto 41932 de la seccioacuten Materiales y Meacutetodos La Fig 62 muestra los voltagramas

tiacutepicos obtenidos en (A) y en (B) la dependencia de la corriente de pico Ip con la raiacutez

cuadrada de la velocidad de barrido Con el valor de la pendiente de la recta obtenida

por regresioacuten lineal pudo determinarse el valor de aacuterea electroactiva del electrodo de

trabajo utilizado como se indica en el punto 41932 habieacutendose utilizado un

coeficiente de difusioacuten del Fe(CN)63-

de 0762 cm2 s

-1 (Sawyer amp Roberts 1974)


100

E V

-02 -01 00 01 02 03 04 05 06

I

A

-20e-4

-10e-4

00

10e-4

20e-4

Figura 62 A) Voltametriacuteas ciacuteclicas de Fe(CN)63 1 mM en medio KCl 01 M a distintas velocidades de

barrido utilizando como electrodo de trabajo el biosensor amperomeacutetrico para evaluacioacuten de infeccioacuten

toxoplaacutesmica La flecha indica la direccioacuten de barrido B) Dependencia de Ip (en valores absolutos) con la

raiacutez de la velocidad de barrido el valor de pendiente de la recta de regresioacuten se utilizoacute para determinar el

aacuterea real del electrodo de trabajo

632 Cubierta del biosensor selectivo para glicerol y soluciones amortiguadoras

Se ensayaron distintos poliacutemeros para cubrir el biosensor de pasta de carbono B

utilizamos poliacutemeros de 4-vinilbenzilimine copolimerizados con cloruro de 4-

vinilbencil-trietilamonio y sulfonato de vinilfenilo (portadores de carga neta positiva y

negativa respectivamente) Si bien los poliacutemeros permitiacutean operar con complejos de

hierro utilizados como mediadores redox (Fe(CN)63-

y ferrocenometanol) no resultaron

uacutetiles en el ensamblado del biosensor por el elevado ruido de fondo que generaron

Se evaluaron distintas soluciones amortiguadoras de pH como fosfatos y

amoniacuteacoamonio Se optoacute por las soluciones de carbonato porque estas resultaron maacutes

sencillas de preparar y manipular que las amoniacales y presentaron mayor capacidad

reguladora en el pH oacuteptimo de la enzima GlDH que las de fosfato

633 Ensayos preliminares de voltametriacuteas de onda cuadrada

Los ensayos preliminares de voltametriacutea de onda cuadrada consistieron en

establecer los valores maacutes convenientes de la amplitud de pulso el escaloacuten de potencial

y la frecuencia para los futuros ensayos de cuantificacioacuten Se realizaron los voltagramas

en tres series de ensayos a seis valores de frecuencia 10 20 30 40 60 y 70 Hz

Los valores de salto de potencial ( ES) y amplitud de pulso ( E) utilizados en las

tres series de ensayos realizados se resumen en la siguiente tabla

(velocidad barrido)12 V12 s-12

006 008 010 012 014 016 018 020 022 024

Ip

A

40e-5

60e-5

80e-5

10e-4

12e-4

14e-4

16e-4

18e-4

20e-4


101

Tabla 67 Valores de salto de potencial y amplitud de onda cuadrada utilizados en los ensayos

voltameacutetricos

Serie 1 Serie 2 Serie 3

ES (mV) 5 5 10

E (mV) 25 50 50

En las 3 series de ensayos se observoacute que al aumentar la frecuencia la corriente de

pico no se incrementaba y el pico de corriente se deformaba aumentando

considerablemente el ruido Las mejores relaciones sentildealruido en las tres series de

ensayos se obtuvieron trabajando a 10 Hz Por su parte cuando se utilizoacute un escaloacuten de

potencial de 10 mV el pico de corriente se deformoacute levemente por lo que se optoacute por

trabajar con un ES = 5 mV Cuando la amplitud del pulso fue 50 mV se obtuvieron

mayores intensidades de corriente sin deformacioacuten de pico escogieacutendose en

consecuencia este valor En la Fig 63 se muestran los voltamperogramas obtenidos en

los ensayos de la serie 2 a una frecuencia de 10 Hz

Figura 63 Voltagramas de onda cuadrada obtenidos utilizando bioelectrodos de pasta de carbono viacutetreo

modificada con GlDH y MWCNT En liacutenea clara se muestra el voltagrama de la solucioacuten NAD+ 05 mM

(NH4)2SO4 25 mM K2CO3 KHCO3 100 mM pH 105 con medio Middelbrook 7H9 Superpuestos se

detallan los voltagramas de la misma solucioacuten luego del agregado de glicerol 100 M para llevar a

concentracioacuten final 25 mM (- - -) y 50 mM (____

)

6331 Seleccioacuten de un meacutetodo apropiado para establecer la liacutenea de base

Se buscoacute establecer una liacutenea de base para corregir los voltagramas obtenidos

utilizando algoritmos presentes en el programa GPES Se intentoacute con algoritmos de

correccioacuten que permiten establecer una liacutenea polinoacutemica ad-hoc para cada voltagrama

utilizando entre 2 y 5 puntos de la curva experimental Sin embargo las sentildeales

corregidas presentaban picos de corrientes con valores de ancho a la altura media Wfrac12

entre 0180 y 0220 V valores que resultan elevados comparados con 0123 Vn el valor

de referencia para este paraacutemetro en VOC donde n es el nuacutemero de electrones


102

intercambiados en la reaccioacuten Finalmente a cada VOC se les restoacute la VOC del blanco

buscaacutendose el pico de corriente con un algoritmo de buacutesqueda semiautomaacutetica del

programa GPES con una liacutenea de base recta y marcando manualmente el inicio y final

del pico establecieacutendose los mismos valores de potencial de inicio y finalizacioacuten del

pico de corriente en todos los voltamperogramas De este modo se obtuvieron picos

cuyos Wfrac12 eran proacuteximos al valor teoacutericamente predicho

Conclusiones

Conclusiones

104

7 Conclusiones

1- Se pudo encontrar cual de los programas de libre acceso para predecir epiacutetopes

lineales reconocidos por ceacutelulas B es el maacutes conveniente al momento de seleccionar

antiacutegenos con fines diagnoacutesticos

2- Se pudieron clonar expresar en forma soluble y marcar con biotina fragmentos

de antiacutegenos de toxoplasmosis de fase aguda que presentan alta concentracioacuten de

determinantes antigeacutenicos

3- Se verificoacute la utilidad de los antiacutegenos obtenidos para su posterior uso en el

ensamblado de bioelectrodos para diagnoacutestico de infeccioacuten aguda de toxoplasmosis

4- Se pudo cuantificar glicerol en muestras sencillas con un electrodo versaacutetil de

oro policristalino por medio de una metodologiacutea amperomeacutetrica a 01 V en medio

NaOH 01 M y con un tiempo de anaacutelisis de 8 min liacutemite de deteccioacuten 10 microM y un

intervalo de linealidad de 0024 a 200 mM

5- Se pudo cuantificar glicerol en medios de cultivo de micobacterias El meacutetodo

consiste en una amperometriacutea que emplea un bioelectrodo selectivo para glicerol

compuesto de pasta de C modificada con glicerol deshidrogenasa y lleva un tiempo de

anaacutelisis de 10 min liacutemite de deteccioacuten 20 microM y un rango de linealidad de 0060 a 175

mM Este meacutetodo podriacutea en un futuro ser uacutetil para identificar muestras de pacientes con

tuberculosis activa en un menor tiempo de anaacutelisis al actualmente empleado

6- Los meacutetodos para cuantificar glicerol aquiacute presentados fueron validados frente

a un equipo enzimaacutetico disponible comercialmente

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Licenciado en Biotecnologiacutea Pablo Luis Faccendini


Esta Tesis es presentada como parte de los requisitos para optar al grado

acadeacutemico de Doctor en Ciencias Quiacutemicas de la Universidad Nacional de Rosario y

no ha sido presentada previamente para la obtencioacuten de otro tiacutetulo en esta u otra

Universidad La misma contiene los resultados obtenidos en investigaciones llevadas a

cabo en Instituto de Quiacutemica Rosario dependiente de la Facultad de Cs Bioquiacutemicas y

Farmaceacuteuticas durante el periacuteodo comprendido entre el 1 de abril de 2009 y el 18 de

febrero de 2014 bajo la direccioacuten de la Dra Claudia Marina Lagier

Iacutendice

i

Iacutendice

1 Resumen vi

1 Summary viii

Publicaciones x



21 Toxoplasmosis 1

211 Generalidades 1










22 Tuberculosis 13




23 Biodiesel 16







Iacutendice

ii



25 Biosensores 27






3 Objetivos 37





411 Reactivos 39










de histidinas 43





Iacutendice

iii




fotomeacutetrica 45

4161 Esquema A 46

4162 Esquema B 46























Iacutendice

iv











53 Inmunoensayos 61



5312 Esquema B 62


recombinantes 66


acuoso 67








smegmatis 79



Iacutendice

v


modificada 81












622 Esquema A 97

623 Esquema B 98






amortiguadoras 100



de base 101

7 Conclusiones 104


Resumen

vi

1 Resumen






















infectados











Resumen

vii













Resumen

viii

1 Summary

































Resumen

ix











Publicaciones

x

Publicaciones
























Septiembre de 2011




Publicaciones

xi









de 2012









xii




Ac(s) Anticuerpo(s)









a enzima)


Frecuencia


















muacuteltiples)


xiii











TB Tuberculosis

TRX Tioredoxina




Introduccioacuten

Introduccioacuten

1

2 Introduccioacuten

21 Toxoplasmosis

211 Generalidades






























Introduccioacuten

2


2008)





Reino Protista

Sub-reino Protozoa

Phylum Apicomplexa

Clase Sporozoea

Sub-clase Coccidea

Orden Eucoccidiia

Sub-orden Eimeriina




Especie gondii


















Introduccioacuten

3


1998 Perotti 2007)


















Introduccioacuten

4


























Acar y col 2008)







Durlach y col 2008)

Introduccioacuten

5







2008)



























Introduccioacuten

6






























facie seguacuten




Introduccioacuten

7















Directo Indirecto












Introduccioacuten

8















cosustrato









Introduccioacuten

9
























Introduccioacuten

10


































Introduccioacuten

11























Recuadro 1


Verdaderos

positivos

Verdaderos

negativos

Ensayo

positivo A B

Ensayo

negativo C D

BA


DB

D dadEspecifici

CA

A adSensibilid

Introduccioacuten

12





Introduccioacuten

13

22 Tuberculosis

221 Generalidades
















web del CDC b)




web de la OMS)










Introduccioacuten

14


Reino Bacteria

































Introduccioacuten

15







Introduccioacuten

16

23 Biodiesel
































Introduccioacuten

17


particulares




insumos caros




Introduccioacuten

18







O + ne- R [21]


[22]





[23]




[24]


[25]




Introduccioacuten

19





[26]

[27]







[28]



[29]

o directamente

[210]





[211]



Introduccioacuten

20






[212]






[213]



ndash [214]








ellas




Introduccioacuten

21











t ge0 C0 = 0





[215]











otra

Introduccioacuten

22






















t

Salto de potencial


E

Introduccioacuten

23







[216]


2 s

-1 C en mol cm

-3 y en

V s-1









Idif

IP

Introduccioacuten

24









mismo










M) la










E

I

Introduccioacuten

25











de potencial

a)

b)

E

E

E

t

Amplitud de la

onda cuadrada EP



de potencial ES

Medida

alta

Medida

baja

t


de potencial ES

t

Amplitud de la

onda cuadrada

EP


Introduccioacuten

26













1f [217]



P2

1

tf [218]

Luego

ft

2

1P [219]




fSEv [220]

Introduccioacuten

27





1985)










21 fBAnIp [221]




25 Biosensores














Introduccioacuten

28

































Introduccioacuten

29

























Introduccioacuten

30



































Introduccioacuten

31
























(Park y col 2003)








Introduccioacuten

32






inmunoensayo


















Introduccioacuten

33





















moles de















Introduccioacuten

34



























glicerol

DHA

GlDHox

GlDHred NAD+

NADH Mediador ox

Mediador red

e- Electrodo

Introduccioacuten

35







3 Barras de grafito





b) GKGPOxHRP

a)Fe(CN)63-

b)Fe(CN)64-






de Prusia

GlDH Tt NADH






10 Au a)GlDHDP



b) 0 mV vs AgAgCl



intriacutenseco


Muestra

Rango dinaacutemico


(mA M-1

cm-2

)

Liacutemite de


Desde Hasta


10-3 - 5 10

-7 Hasta 1 mes

2 Jugo de uva 10-6

2 10-3

- 10-6 -

3 Vino 1 10-6

2 10-4

32 1 10-6


de 20 horas


rapidamente

5 Fermento

anaeroacutebico

1 10-5

1 10-5

10-3

1 10-3

a) 620

b) 142 -



hs b) 70 16 hs

6 Fermento de

jugo de uva 10

-51 10

-4 - 10

-6 -

7 - 10-5

1 10-3

- 10-6 -

8 Jarabe 997 10-7

10-4

162 cm2 43 10-7


de 3 diacuteas

9 Vino 10-5

147 10-4

a) 101

b) 079

a) 4 10-6

b) 15 10-5




10 Vino 10

-6

4 10-7

2 10-5

1 10-5

a) 207

b) 250

a) 4 10-7

b) 31




11 Fermento - - - 11 10-6

-

12 Vino 10

-5

2 10-6

25 10-2

64 10-3

-

10-5

2 10-6 -

Objetivos

Objetivos

37

3 Objetivos




alternativos




por T gondii









39



411 Reactivos

































40





extracto de

levadura y 10 g L-1









siguiente tabla



(NH4)2SO4 050

Na2(HPO4) 250

K(H2PO4) 100


MgSO4 005

CaCl2 0005

ZnSO4 0001

CuSO4 0001



Piridoxina 0001

Biotina 00005



siguiente tabla


41



Escherichia

coli (E coli)

BL21 (DE3)






M smegmatis

mc2155











Ricardo Morbidoni

44 Plaacutesmidos




pET32a





(DE3) de E coli










42



durante 10 min
















antes de su

















43


















durante 20 min


















44





(SDS-PAGE)







g L-1



Coomasie G-250





















45








poro controlado
























46

4161 Esquema A
















H2SO4 05 M

4162 Esquema B














47



















reaccioacuten ( L)


0125 M pH 105 815

K3Fe(NC)6 10-2

M 100

(NH4)2SO4 10 M 10

NAD+ 10

-2 M 25


1










48







mv


























49






(preparada






utilizacioacuten























10-4



50

















destilada










1991)




de referencia


51






[216]


2 s

-1 C en mol cm

-3 y

en V s-1









determinaciones















52


































53





























sistema


54

































55



[41]


[42]





Nm

EE r

c

1

[43]






hoc



57

















ser AAPred
















58














derecha













59







una










precipitar







60















una







P35B

P1 P2 P3 P4 MPM


SN1


SN2 SN3 SN4


61








conjugada (derecha)

53 Inmunoensayos























62



dilucioacuten 12000


maacutes arriba

Placa 1 Placa 2

Agudos

0100 0158

0311 0273

0140 0165

Croacutenicos

0281 0322

0256 0278

0260 0226

Negativos

0217 0168

0235 0179

0409 0354

Sin suero

0135 0134

0143 0114

0126 0100

Sin suero

Sin

P22cBiotina

0071 0050

0070 0037

0047 0040





5312 Esquema B












63















Ang


Agudos 2131 1567 0335 0296

1849 1311 065 0413

Negativos 176 1350 0282 0327

1025 1676 0262 0325

Sin suero 1658 1658 0174 0149

1812 1504 0130 0144

Sin Ang

conjugado

0055 004 0041 0045

0057 0042 0039 004


64

















65




(Negativos)




























66


recombinantes
























67






















( A cm-2

)

DS

( A cm-2

)



Sin suero -0052 004


68







M hasta 01 M











a 10 x 10-2








[Glicerol]

(mM)

Ip

(microA cm-2

)

DS Ip

(microA cm-2

)

050 18 032

100 28 038

200 74 041

500 17 035

750 262 055

100 347 053

-50E-05

00E+00

50E-05

10E-04

15E-04

20E-04

25E-04

-0400 -0200 0000 0200 0400 0600 0800

E(V)

i(A

)

-40E-06

00E+00

40E-06

80E-06

12E-05

16E-05

-1000 -0800 -0600 -0400 -0200 0000 0200 0400

E(V)

i(A

)


69






[51]












amperomeacutetrica





70

t s

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450

I A

0

2

4

6














[Glicerol]

(mM)

Ic A

( A cm-2

)

DS

( A cm-2

)

0000 0447 0029

0010 0763 0016

0025 1098 0068

0050 1510 0055

0100 285 049

0250 609 036

0500 1245 033

0750 1730 0097

100 2361 0099

150 3445 033

175 3997 020

200 4613 045


71






[52]




[Glicerol] mM

000 025 050 075 100 125 150 175 200

I cA

m

A c

m-2

0

10

20

30

40

50














M o


72




















1 mM y Fe(CN)34-

1 mM




La






0

025

05

075

1

125

15

175

2

225

25

275

260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500


Ab

sorb

an

cia

Ferricianuro 1 mM

Ferrocianuro 1 mM


73


y enzima GlDH y





cada 10 min Ambas











DHA + Fe(CN)64-

(1)






3- y glicerol






Fe(CN)63-




y se


en la Fig 516

A

0

015

03

045

06

075

09

105

12

135

15

320 340 360 380 400 420 440 460 480


Ab

sorb

an

cia

t = 0

t = 10 min

t = 20 min

t =30 min

t = 40 min

t = 50 min

t = 60 min

B

0

015

03

045

06

075

09

105

12

135

15

320 340 360 380 400 420 440 460 480


Ab

sorb

an

cia

t = 0 min

t = 10 min

t = 20 min

t = 30 min

t = 40 min

t = 50 min

t = 60 min

GlDHNAD+

GlDH


74













tenemos

[53]



[54]



A

05

056

062

068

074

08

086

092

098

104

11

0 600 1200 1800 2400 3000 3600

tiempo (s)

Ab

s 4

20

nm

B

0

004

008

012

016

02

024

028

032

036

04

044

048

0 600 1200 1800 2400 3000 3600tiempo (s)

Ab

s 3

40

nm

C

y = 00004405x

R2 = 09983921

0

0035

007

0105

014

0175

021

0 60 120 180 240 300 360 420 480

tiempo (s)

Ab

s 3

40

nm R

2 = 09984


75



b

k

tb

tk

tb

Abs

nmNADHnmNADHnmNADH

nm

340340340

340 [55]







[56]


εNADH 340nm = 6220 M-1

cm-1

Δt = 3600 s

b = 1 cm

k = 44 x 10-4

s-1

resultando

[57]


[58]

nmCNFe 420)( 36

= 1080 M-1

cm-1

ΔAbs420nm = 052


M [59]






equivale




76

2 Fe(CN)63-

+ NADH 2 Fe(CN)64-

+ NAD+ [510]















(mM)

Blanco 0 0

Muestra 1 11 22

Muestra 2 082 16

Muestra 3 055 11

Muestra 4 027 55

Muestra 5 011 22


77








obtenidos

[Glicerol] mM

000 005 010 015 020 025 030 035 040

Ab

s 42

0 n

m

00

02

04

06

08

10



estaacutendares



02

03

04

05

06

07

08

09

1

0 1200 2400 3600 4800 6000 7200

tiempo (s)

Ab

s 4

20

nm


78









triplicado
















4 1 -1 068 08790

7 03333 1 227 09962

8 1 1 184 09621

5 -1 1 159 09931

3 03333 -1 083 09590

2 -03333 -1 1 09850

6 -03333 1 244 09863

1 -1 -1 071 09914


79




(mM)

Blanco 0 0

Muestra 1 0010 02

Muestra 2 0025 05

Muestra 3 0050 10

Muestra 4 0075 15

Muestra 5 010 20


pendiente fue

tBNADAm ][421 [512]
























80











de Bonferroni










del ensayo









81

Bla

nco

Med

io 0

025

00

25

+ F

ago t

= 0

00

25

C

eacutelula

s t

= 0

00

25

Ceacutel

ula

s +

Fag

o t

= 0

00

25

+ F

ago t

= 2

00

25

Ceacutel

ula

s t

= 2

00

25

Ceacutel

ula

s +

fag

o t

= 2

00

25

fa

go t

= 4

00

25

Ceacutel

ula

s t

= 4

00

25

Ceacutel

ula

s +

fag

o t

= 4

Abs

420 n

m

03

04

05

08



color sin glicerol







3- que se

reduce a Fe(CN)64-





glicerol

DHA

GlDHox

GlDHred NAD+

NADH Mediador ox

Mediador red

e- Electrodo


82


obtenido

Tiempo s

100 200 300 400 500

I

nA

0

20

40

60

80

100





solucioacuten





fue

[513]








Tiempo s

0 500 1000 1500 2000

I

nA

0

50

100

150

200


83

[Glicerol] mM

000 025 050 075 100 125 150 175 200

Ic

nA

0

50

100

150

200
























84










pico















col)

Ep = 075 V


85





primero












Musameh y col

2002 Este trabajo

Electrodo de

trabajo Cv

C v +



-1

pH 74 105

Ep (V) 082 033

057 075 057

Aumento de la

I cap (μA) - 55 - 18


86












Tiempo s

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900

I A

0

1

2

3

4














87


















88












Nominal mM

00 02 04 06 08 10

Pre

dic

ho

mM

00

02

04

06

08

10

Equipo comercial

Tip Au

Biosensor

Recta identidad



0

05

1

15

2

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

[Glicerol] (mM)

Ip (

uA

)


89






Pendiente

08 09 10 11 12

Ord

enad

a al

ori

gen

-06

-04

-02

00

02

04

06

Equipo comercial

Tip Au

Biosensor

Punto (1 0)


















90




previos) LD

(microM)

Rango de

linealidad

(M)

Muestra

ensayada

Tiempo de

anaacutelisis

(min)

Reactivos o

accesorios

onerosos Referencia



4 times 10-5

a

2 times10-4




5 times 10minus5

a

5 times 10minus4


2010



1 times 10minus6

a

5 times 10minus4


col2012



informa 2 times 10

minus2 a

1 times 10minus1


ATP Kronka y col

2001



8 times 10minus6

a

25 times 10minus4

Suero

Humano 10

GK PK

LDH ATP

NAD+

Li y col 2001



5 times 10minus4

a

12 times 10minus2




33 times 10minus5

a

17 times 10minus3


Paixao 2012



33 times 10minus5

a

17 times 10minus3


C18

Lourenccedilo amp

Stradiotto


amperomeacutetrico


No

informa 16 times 10

minus4 a

16 times 10minus3


col 2009




23 times 10minus5

a

23 times 10minus4

Solucioacuten

Acuosa

pH=13 5

MWCNT

funcionalizad

os con Ag

Pop y col 2011

Electroquiacutemico

amperomeacutetrico


25 times 10minus5

a

20 times 10minus3

Solucioacuten

Acuosa

pH=13 8 -

Este Trabajo

de Tesis

Electroquiacutemico

amperomeacutetrico


5 times 10minus5

a

23 times 10minus2

Solucioacuten

Tampoacuten

Fosfato

5

(estimados) GO

Goriushnika y

col 2010

Biosensor


10 times 10minus6

a

10 times 10minus4

Jarabe de

cantildea 15


Aacutelvarez-

Gonzalez y

col 2000

Biosensor


1 times 10minus6

a

2 times 10minus5

Vino 3 GlDH DP

NAD+ Gamella y

col 2008

Biosensor


1 times 10minus6

a

1 times 10minus5

Vino 3 GK GPO

HRP ATP Gamella y

col 2008 Biosensor


5 times 10minus6

a

1 times 10minus4

Vino 5 GK GPO

ATP Ghica amp Brett

2006

Biosensor


70 times 10minus5

a

18 times 10minus3

Caldo

Middlebrook 10

GlDHb

NAD+ Este Trabajo

de Tesis





91
































biosensores




92







GlDH



biosensor NAD

+ por

anaacutelisis

Gamella y

col 2008 75 U 162 U 15x10-6

M 5x10-3

M Este Trabajo

de Tesis 23 U - - 5x10-4

M













94



por ceacutelulas B













Programa

VPP

promedio

AAPPred 691

ABCPred 628

BcePred 309

BepiPred 453

Antigenic 419

Aleatorio 382





toxoplasmosis aguda


95







Proteiacutena

Coacutedigo

NCBI

Nordm de

residuos

Cantidad de

epiacutetopes


antigeacutenicas

MPT70 (A) NP_217391 193 2 31-70 100-120

MSP-1 (A) BAF622801 1693 3 29-39 1594-1611 1644-1662

Exotoxina

A (A) NP_249839 638 8

297-313 324-333 354-387 412-421 510-522

528-539 557-593 596-638

GAG1 (A) P20873 504 10

11-25 113-122 142-156 176-214 216-268

280-308 312-321 330-367 406-416 428-448

Gp160 (A) NP_057856 856 13

30-141 161-191 211-231 252-281 294-344

346-413 424-511 525-558 561-615 639-701

724-747 761-778 822-855

Pr55 (B) NP_579876 132 2 11-38 51-78

Rev (B) NP_057854 116 4 5-15 32-51 70-91 96-116

VP1 (17) ABC87248 781 12

31-41 55-65 85-95 151-161 292-392 316-326

493-500 529-539 547-554 571-578 667-707

712-722

Gliadin

(18) A27319 296 3 31-72 165-176 237-264

Proteiacutena N

(16) AAP13445 422 6 1-6 45-61 153-192 211-223 225-235 354-412

Proteasa

(B) CAB66012 99 2 1-7 36-47










96









Sueros P22C P22C-

biotina P35B

P35B -

biotina

Positivos

2 gt3 26 1900

3 2900 2 gt3

gt3 gt3 26 gt3

Negativos

13 1000 11 0800

06 0500 09 0700

11 1600 1 1000





















97




Leche 1 0066 01445

Caseinato 1 00725 02425

Gelatina 1 00725 03925

BSA 1 00625 0192

BSA 1 Tween 002 00615 01515


bloqueante

622 Esquema A














Antiacutegenos

Sueros


2 02 002 2 02 002

Negativos 0576 0294 0155 1071 0681 0566

0543 0335 0176 1079 0769 023

Croacutenicos 0469 0246 0135 103 069 0299

0514 0215 0111 0914 0567 0196

Agudos 0331 0181 0109 081 0574 0168

0555 0254 0139 0789 0391 0169


98

623 Esquema B












Masa de P22C

(ng)

Muestras

50 10 50 10

Agudos 0393 0303 0553 0450

0273 0335 0793 0367

Croacutenicos 0230 0398 0316 0345

0284 0291 0444 0493

Negativos 0392 0210 0380 0380

0286 0292 0314 0350

Sin suero 0367 0468 0415 0411

0327 0358 0468 0536


biotina ni sueros

0102 0087 0128 0079

0131 0095 0116 0104







99








41931

E V

04 06 08 10 12 14 16

I

A

-15e-5

-10e-5

-50e-6

00

50e-6














de 0762 cm2 s



100

E V

-02 -01 00 01 02 03 04 05 06

I

A

-20e-4

-10e-4

00

10e-4

20e-4


























006 008 010 012 014 016 018 020 022 024

Ip

A

40e-5

60e-5

80e-5

10e-4

12e-4

14e-4

16e-4

18e-4

20e-4


101


voltameacutetricos


ES (mV) 5 5 10

E (mV) 25 50 50















)










102







Conclusiones

Conclusiones

104

7 Conclusiones





















Bibliografiacutea

Bibliografiacutea

106

8 Bibliografiacutea











265-279



1450ndash1453





1150




1771-1773










Bibliografiacutea

107





153-157







b) httpwwwcdcgovTB





(2009) 43 166-174



17 286



Lancet (1999) 353 1829





68 75-87





Bibliografiacutea

108







1570




Acta (2008) 609 201-209




















89



Bibliografiacutea

109




54072864-8



29(10)1489-1492




132-138





















96

Bibliografiacutea

110





(2004) 15181-190











4 743ndash746


(2010) 131(2) 153-168




101A-110A











Bibliografiacutea

111










(2003) 5 689ndash694


Genomics (2005) 6 79-76









83 559-564




2627-2633



0-444-51958-0





(2012) 70 153-157

Bibliografiacutea

112






Appl Chem (1991) 63(5) 711-734



Chem (2000) 48 2812



8493-1116-1 eBook ISBN 978-0-203-00899-7








Iacutendice

i

Iacutendice

1 Resumen vi

1 Summary viii

Publicaciones x



21 Toxoplasmosis 1

211 Generalidades 1










22 Tuberculosis 13




23 Biodiesel 16







Iacutendice

ii



25 Biosensores 27






3 Objetivos 37





411 Reactivos 39










de histidinas 43





Iacutendice

iii




fotomeacutetrica 45

4161 Esquema A 46

4162 Esquema B 46























Iacutendice

iv











53 Inmunoensayos 61



5312 Esquema B 62


recombinantes 66


acuoso 67








smegmatis 79



Iacutendice

v


modificada 81












622 Esquema A 97

623 Esquema B 98






amortiguadoras 100



de base 101

7 Conclusiones 104


Resumen

vi

1 Resumen






















infectados











Resumen

vii













Resumen

viii

1 Summary

































Resumen

ix











Publicaciones

x

Publicaciones
























Septiembre de 2011




Publicaciones

xi









de 2012









xii




Ac(s) Anticuerpo(s)









a enzima)


Frecuencia


















muacuteltiples)


xiii











TB Tuberculosis

TRX Tioredoxina




Introduccioacuten

Introduccioacuten

1

2 Introduccioacuten

21 Toxoplasmosis

211 Generalidades






























Introduccioacuten

2


2008)





Reino Protista

Sub-reino Protozoa

Phylum Apicomplexa

Clase Sporozoea

Sub-clase Coccidea

Orden Eucoccidiia

Sub-orden Eimeriina




Especie gondii


















Introduccioacuten

3


1998 Perotti 2007)


















Introduccioacuten

4


























Acar y col 2008)







Durlach y col 2008)

Introduccioacuten

5







2008)



























Introduccioacuten

6






























facie seguacuten




Introduccioacuten

7















Directo Indirecto












Introduccioacuten

8















cosustrato









Introduccioacuten

9
























Introduccioacuten

10


































Introduccioacuten

11























Recuadro 1


Verdaderos

positivos

Verdaderos

negativos

Ensayo

positivo A B

Ensayo

negativo C D

BA


DB

D dadEspecifici

CA

A adSensibilid

Introduccioacuten

12





Introduccioacuten

13

22 Tuberculosis

221 Generalidades
















web del CDC b)




web de la OMS)










Introduccioacuten

14


Reino Bacteria

































Introduccioacuten

15







Introduccioacuten

16

23 Biodiesel
































Introduccioacuten

17


particulares




insumos caros




Introduccioacuten

18







O + ne- R [21]


[22]





[23]




[24]


[25]




Introduccioacuten

19





[26]

[27]







[28]



[29]

o directamente

[210]





[211]



Introduccioacuten

20






[212]






[213]



ndash [214]








ellas




Introduccioacuten

21











t ge0 C0 = 0





[215]











otra

Introduccioacuten

22






















t

Salto de potencial


E

Introduccioacuten

23







[216]


2 s

-1 C en mol cm

-3 y en

V s-1









Idif

IP

Introduccioacuten

24









mismo










M) la










E

I

Introduccioacuten

25











de potencial

a)

b)

E

E

E

t

Amplitud de la

onda cuadrada EP



de potencial ES

Medida

alta

Medida

baja

t


de potencial ES

t

Amplitud de la

onda cuadrada

EP


Introduccioacuten

26













1f [217]



P2

1

tf [218]

Luego

ft

2

1P [219]




fSEv [220]

Introduccioacuten

27





1985)










21 fBAnIp [221]




25 Biosensores














Introduccioacuten

28

































Introduccioacuten

29

























Introduccioacuten

30



































Introduccioacuten

31
























(Park y col 2003)








Introduccioacuten

32






inmunoensayo


















Introduccioacuten

33





















moles de















Introduccioacuten

34



























glicerol

DHA

GlDHox

GlDHred NAD+

NADH Mediador ox

Mediador red

e- Electrodo

Introduccioacuten

35







3 Barras de grafito





b) GKGPOxHRP

a)Fe(CN)63-

b)Fe(CN)64-






de Prusia

GlDH Tt NADH






10 Au a)GlDHDP



b) 0 mV vs AgAgCl



intriacutenseco


Muestra

Rango dinaacutemico


(mA M-1

cm-2

)

Liacutemite de


Desde Hasta


10-3 - 5 10

-7 Hasta 1 mes

2 Jugo de uva 10-6

2 10-3

- 10-6 -

3 Vino 1 10-6

2 10-4

32 1 10-6


de 20 horas


rapidamente

5 Fermento

anaeroacutebico

1 10-5

1 10-5

10-3

1 10-3

a) 620

b) 142 -



hs b) 70 16 hs

6 Fermento de

jugo de uva 10

-51 10

-4 - 10

-6 -

7 - 10-5

1 10-3

- 10-6 -

8 Jarabe 997 10-7

10-4

162 cm2 43 10-7


de 3 diacuteas

9 Vino 10-5

147 10-4

a) 101

b) 079

a) 4 10-6

b) 15 10-5




10 Vino 10

-6

4 10-7

2 10-5

1 10-5

a) 207

b) 250

a) 4 10-7

b) 31




11 Fermento - - - 11 10-6

-

12 Vino 10

-5

2 10-6

25 10-2

64 10-3

-

10-5

2 10-6 -

Objetivos

Objetivos

37

3 Objetivos




alternativos




por T gondii









39



411 Reactivos

































40





extracto de

levadura y 10 g L-1









siguiente tabla



(NH4)2SO4 050

Na2(HPO4) 250

K(H2PO4) 100


MgSO4 005

CaCl2 0005

ZnSO4 0001

CuSO4 0001



Piridoxina 0001

Biotina 00005



siguiente tabla


41



Escherichia

coli (E coli)

BL21 (DE3)






M smegmatis

mc2155











Ricardo Morbidoni

44 Plaacutesmidos




pET32a





(DE3) de E coli










42



durante 10 min
















antes de su

















43


















durante 20 min


















44





(SDS-PAGE)







g L-1



Coomasie G-250





















45








poro controlado
























46

4161 Esquema A
















H2SO4 05 M

4162 Esquema B














47



















reaccioacuten ( L)


0125 M pH 105 815

K3Fe(NC)6 10-2

M 100

(NH4)2SO4 10 M 10

NAD+ 10

-2 M 25


1










48







mv


























49






(preparada






utilizacioacuten























10-4



50

















destilada










1991)




de referencia


51






[216]


2 s

-1 C en mol cm

-3 y

en V s-1









determinaciones















52


































53





























sistema


54

































55



[41]


[42]





Nm

EE r

c

1

[43]






hoc



57

















ser AAPred
















58














derecha













59







una










precipitar







60















una







P35B

P1 P2 P3 P4 MPM


SN1


SN2 SN3 SN4


61








conjugada (derecha)

53 Inmunoensayos























62



dilucioacuten 12000


maacutes arriba

Placa 1 Placa 2

Agudos

0100 0158

0311 0273

0140 0165

Croacutenicos

0281 0322

0256 0278

0260 0226

Negativos

0217 0168

0235 0179

0409 0354

Sin suero

0135 0134

0143 0114

0126 0100

Sin suero

Sin

P22cBiotina

0071 0050

0070 0037

0047 0040





5312 Esquema B












63















Ang


Agudos 2131 1567 0335 0296

1849 1311 065 0413

Negativos 176 1350 0282 0327

1025 1676 0262 0325

Sin suero 1658 1658 0174 0149

1812 1504 0130 0144

Sin Ang

conjugado

0055 004 0041 0045

0057 0042 0039 004


64

















65




(Negativos)




























66


recombinantes
























67






















( A cm-2

)

DS

( A cm-2

)



Sin suero -0052 004


68







M hasta 01 M











a 10 x 10-2








[Glicerol]

(mM)

Ip

(microA cm-2

)

DS Ip

(microA cm-2

)

050 18 032

100 28 038

200 74 041

500 17 035

750 262 055

100 347 053

-50E-05

00E+00

50E-05

10E-04

15E-04

20E-04

25E-04

-0400 -0200 0000 0200 0400 0600 0800

E(V)

i(A

)

-40E-06

00E+00

40E-06

80E-06

12E-05

16E-05

-1000 -0800 -0600 -0400 -0200 0000 0200 0400

E(V)

i(A

)


69






[51]












amperomeacutetrica





70

t s

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450

I A

0

2

4

6














[Glicerol]

(mM)

Ic A

( A cm-2

)

DS

( A cm-2

)

0000 0447 0029

0010 0763 0016

0025 1098 0068

0050 1510 0055

0100 285 049

0250 609 036

0500 1245 033

0750 1730 0097

100 2361 0099

150 3445 033

175 3997 020

200 4613 045


71






[52]




[Glicerol] mM

000 025 050 075 100 125 150 175 200

I cA

m

A c

m-2

0

10

20

30

40

50














M o


72




















1 mM y Fe(CN)34-

1 mM




La






0

025

05

075

1

125

15

175

2

225

25

275

260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500


Ab

sorb

an

cia

Ferricianuro 1 mM

Ferrocianuro 1 mM


73


y enzima GlDH y





cada 10 min Ambas











DHA + Fe(CN)64-

(1)






3- y glicerol






Fe(CN)63-




y se


en la Fig 516

A

0

015

03

045

06

075

09

105

12

135

15

320 340 360 380 400 420 440 460 480


Ab

sorb

an

cia

t = 0

t = 10 min

t = 20 min

t =30 min

t = 40 min

t = 50 min

t = 60 min

B

0

015

03

045

06

075

09

105

12

135

15

320 340 360 380 400 420 440 460 480


Ab

sorb

an

cia

t = 0 min

t = 10 min

t = 20 min

t = 30 min

t = 40 min

t = 50 min

t = 60 min

GlDHNAD+

GlDH


74













tenemos

[53]



[54]



A

05

056

062

068

074

08

086

092

098

104

11

0 600 1200 1800 2400 3000 3600

tiempo (s)

Ab

s 4

20

nm

B

0

004

008

012

016

02

024

028

032

036

04

044

048

0 600 1200 1800 2400 3000 3600tiempo (s)

Ab

s 3

40

nm

C

y = 00004405x

R2 = 09983921

0

0035

007

0105

014

0175

021

0 60 120 180 240 300 360 420 480

tiempo (s)

Ab

s 3

40

nm R

2 = 09984


75



b

k

tb

tk

tb

Abs

nmNADHnmNADHnmNADH

nm

340340340

340 [55]







[56]


εNADH 340nm = 6220 M-1

cm-1

Δt = 3600 s

b = 1 cm

k = 44 x 10-4

s-1

resultando

[57]


[58]

nmCNFe 420)( 36

= 1080 M-1

cm-1

ΔAbs420nm = 052


M [59]






equivale




76

2 Fe(CN)63-

+ NADH 2 Fe(CN)64-

+ NAD+ [510]















(mM)

Blanco 0 0

Muestra 1 11 22

Muestra 2 082 16

Muestra 3 055 11

Muestra 4 027 55

Muestra 5 011 22


77








obtenidos

[Glicerol] mM

000 005 010 015 020 025 030 035 040

Ab

s 42

0 n

m

00

02

04

06

08

10



estaacutendares



02

03

04

05

06

07

08

09

1

0 1200 2400 3600 4800 6000 7200

tiempo (s)

Ab

s 4

20

nm


78









triplicado
















4 1 -1 068 08790

7 03333 1 227 09962

8 1 1 184 09621

5 -1 1 159 09931

3 03333 -1 083 09590

2 -03333 -1 1 09850

6 -03333 1 244 09863

1 -1 -1 071 09914


79




(mM)

Blanco 0 0

Muestra 1 0010 02

Muestra 2 0025 05

Muestra 3 0050 10

Muestra 4 0075 15

Muestra 5 010 20


pendiente fue

tBNADAm ][421 [512]
























80











de Bonferroni










del ensayo









81

Bla

nco

Med

io 0

025

00

25

+ F

ago t

= 0

00

25

C

eacutelula

s t

= 0

00

25

Ceacutel

ula

s +

Fag

o t

= 0

00

25

+ F

ago t

= 2

00

25

Ceacutel

ula

s t

= 2

00

25

Ceacutel

ula

s +

fag

o t

= 2

00

25

fa

go t

= 4

00

25

Ceacutel

ula

s t

= 4

00

25

Ceacutel

ula

s +

fag

o t

= 4

Abs

420 n

m

03

04

05

08



color sin glicerol







3- que se

reduce a Fe(CN)64-





glicerol

DHA

GlDHox

GlDHred NAD+

NADH Mediador ox

Mediador red

e- Electrodo


82


obtenido

Tiempo s

100 200 300 400 500

I

nA

0

20

40

60

80

100





solucioacuten





fue

[513]








Tiempo s

0 500 1000 1500 2000

I

nA

0

50

100

150

200


83

[Glicerol] mM

000 025 050 075 100 125 150 175 200

Ic

nA

0

50

100

150

200
























84










pico















col)

Ep = 075 V


85





primero












Musameh y col

2002 Este trabajo

Electrodo de

trabajo Cv

C v +



-1

pH 74 105

Ep (V) 082 033

057 075 057

Aumento de la

I cap (μA) - 55 - 18


86












Tiempo s

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900

I A

0

1

2

3

4














87


















88












Nominal mM

00 02 04 06 08 10

Pre

dic

ho

mM

00

02

04

06

08

10

Equipo comercial

Tip Au

Biosensor

Recta identidad



0

05

1

15

2

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

[Glicerol] (mM)

Ip (

uA

)


89






Pendiente

08 09 10 11 12

Ord

enad

a al

ori

gen

-06

-04

-02

00

02

04

06

Equipo comercial

Tip Au

Biosensor

Punto (1 0)


















90




previos) LD

(microM)

Rango de

linealidad

(M)

Muestra

ensayada

Tiempo de

anaacutelisis

(min)

Reactivos o

accesorios

onerosos Referencia



4 times 10-5

a

2 times10-4




5 times 10minus5

a

5 times 10minus4


2010



1 times 10minus6

a

5 times 10minus4


col2012



informa 2 times 10

minus2 a

1 times 10minus1


ATP Kronka y col

2001



8 times 10minus6

a

25 times 10minus4

Suero

Humano 10

GK PK

LDH ATP

NAD+

Li y col 2001



5 times 10minus4

a

12 times 10minus2




33 times 10minus5

a

17 times 10minus3


Paixao 2012



33 times 10minus5

a

17 times 10minus3


C18

Lourenccedilo amp

Stradiotto


amperomeacutetrico


No

informa 16 times 10

minus4 a

16 times 10minus3


col 2009




23 times 10minus5

a

23 times 10minus4

Solucioacuten

Acuosa

pH=13 5

MWCNT

funcionalizad

os con Ag

Pop y col 2011

Electroquiacutemico

amperomeacutetrico


25 times 10minus5

a

20 times 10minus3

Solucioacuten

Acuosa

pH=13 8 -

Este Trabajo

de Tesis

Electroquiacutemico

amperomeacutetrico


5 times 10minus5

a

23 times 10minus2

Solucioacuten

Tampoacuten

Fosfato

5

(estimados) GO

Goriushnika y

col 2010

Biosensor


10 times 10minus6

a

10 times 10minus4

Jarabe de

cantildea 15


Aacutelvarez-

Gonzalez y

col 2000

Biosensor


1 times 10minus6

a

2 times 10minus5

Vino 3 GlDH DP

NAD+ Gamella y

col 2008

Biosensor


1 times 10minus6

a

1 times 10minus5

Vino 3 GK GPO

HRP ATP Gamella y

col 2008 Biosensor


5 times 10minus6

a

1 times 10minus4

Vino 5 GK GPO

ATP Ghica amp Brett

2006

Biosensor


70 times 10minus5

a

18 times 10minus3

Caldo

Middlebrook 10

GlDHb

NAD+ Este Trabajo

de Tesis





91
































biosensores




92







GlDH



biosensor NAD

+ por

anaacutelisis

Gamella y

col 2008 75 U 162 U 15x10-6

M 5x10-3

M Este Trabajo

de Tesis 23 U - - 5x10-4

M













94



por ceacutelulas B













Programa

VPP

promedio

AAPPred 691

ABCPred 628

BcePred 309

BepiPred 453

Antigenic 419

Aleatorio 382





toxoplasmosis aguda


95







Proteiacutena

Coacutedigo

NCBI

Nordm de

residuos

Cantidad de

epiacutetopes


antigeacutenicas

MPT70 (A) NP_217391 193 2 31-70 100-120

MSP-1 (A) BAF622801 1693 3 29-39 1594-1611 1644-1662

Exotoxina

A (A) NP_249839 638 8

297-313 324-333 354-387 412-421 510-522

528-539 557-593 596-638

GAG1 (A) P20873 504 10

11-25 113-122 142-156 176-214 216-268

280-308 312-321 330-367 406-416 428-448

Gp160 (A) NP_057856 856 13

30-141 161-191 211-231 252-281 294-344

346-413 424-511 525-558 561-615 639-701

724-747 761-778 822-855

Pr55 (B) NP_579876 132 2 11-38 51-78

Rev (B) NP_057854 116 4 5-15 32-51 70-91 96-116

VP1 (17) ABC87248 781 12

31-41 55-65 85-95 151-161 292-392 316-326

493-500 529-539 547-554 571-578 667-707

712-722

Gliadin

(18) A27319 296 3 31-72 165-176 237-264

Proteiacutena N

(16) AAP13445 422 6 1-6 45-61 153-192 211-223 225-235 354-412

Proteasa

(B) CAB66012 99 2 1-7 36-47










96









Sueros P22C P22C-

biotina P35B

P35B -

biotina

Positivos

2 gt3 26 1900

3 2900 2 gt3

gt3 gt3 26 gt3

Negativos

13 1000 11 0800

06 0500 09 0700

11 1600 1 1000





















97




Leche 1 0066 01445

Caseinato 1 00725 02425

Gelatina 1 00725 03925

BSA 1 00625 0192

BSA 1 Tween 002 00615 01515


bloqueante

622 Esquema A














Antiacutegenos

Sueros


2 02 002 2 02 002

Negativos 0576 0294 0155 1071 0681 0566

0543 0335 0176 1079 0769 023

Croacutenicos 0469 0246 0135 103 069 0299

0514 0215 0111 0914 0567 0196

Agudos 0331 0181 0109 081 0574 0168

0555 0254 0139 0789 0391 0169


98

623 Esquema B












Masa de P22C

(ng)

Muestras

50 10 50 10

Agudos 0393 0303 0553 0450

0273 0335 0793 0367

Croacutenicos 0230 0398 0316 0345

0284 0291 0444 0493

Negativos 0392 0210 0380 0380

0286 0292 0314 0350

Sin suero 0367 0468 0415 0411

0327 0358 0468 0536


biotina ni sueros

0102 0087 0128 0079

0131 0095 0116 0104







99








41931

E V

04 06 08 10 12 14 16

I

A

-15e-5

-10e-5

-50e-6

00

50e-6














de 0762 cm2 s



100

E V

-02 -01 00 01 02 03 04 05 06

I

A

-20e-4

-10e-4

00

10e-4

20e-4


























006 008 010 012 014 016 018 020 022 024

Ip

A

40e-5

60e-5

80e-5

10e-4

12e-4

14e-4

16e-4

18e-4

20e-4


101


voltameacutetricos


ES (mV) 5 5 10

E (mV) 25 50 50















)










102







Conclusiones

Conclusiones

104

7 Conclusiones





















Bibliografiacutea

Bibliografiacutea

106

8 Bibliografiacutea











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1450ndash1453





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Genomics (2005) 6 79-76









83 559-564




2627-2633



0-444-51958-0





(2012) 70 153-157

Bibliografiacutea

112






Appl Chem (1991) 63(5) 711-734



Chem (2000) 48 2812



8493-1116-1 eBook ISBN 978-0-203-00899-7








Iacutendice

ii



25 Biosensores 27






3 Objetivos 37





411 Reactivos 39










de histidinas 43





Iacutendice

iii




fotomeacutetrica 45

4161 Esquema A 46

4162 Esquema B 46























Iacutendice

iv











53 Inmunoensayos 61



5312 Esquema B 62


recombinantes 66


acuoso 67








smegmatis 79



Iacutendice

v


modificada 81












622 Esquema A 97

623 Esquema B 98






amortiguadoras 100



de base 101

7 Conclusiones 104


Resumen

vi

1 Resumen






















infectados











Resumen

vii













Resumen

viii

1 Summary

































Resumen

ix











Publicaciones

x

Publicaciones
























Septiembre de 2011




Publicaciones

xi









de 2012









xii




Ac(s) Anticuerpo(s)









a enzima)


Frecuencia


















muacuteltiples)


xiii











TB Tuberculosis

TRX Tioredoxina




Introduccioacuten

Introduccioacuten

1

2 Introduccioacuten

21 Toxoplasmosis

211 Generalidades






























Introduccioacuten

2


2008)





Reino Protista

Sub-reino Protozoa

Phylum Apicomplexa

Clase Sporozoea

Sub-clase Coccidea

Orden Eucoccidiia

Sub-orden Eimeriina




Especie gondii


















Introduccioacuten

3


1998 Perotti 2007)


















Introduccioacuten

4


























Acar y col 2008)







Durlach y col 2008)

Introduccioacuten

5







2008)



























Introduccioacuten

6






























facie seguacuten




Introduccioacuten

7















Directo Indirecto












Introduccioacuten

8















cosustrato









Introduccioacuten

9
























Introduccioacuten

10


































Introduccioacuten

11























Recuadro 1


Verdaderos

positivos

Verdaderos

negativos

Ensayo

positivo A B

Ensayo

negativo C D

BA


DB

D dadEspecifici

CA

A adSensibilid

Introduccioacuten

12





Introduccioacuten

13

22 Tuberculosis

221 Generalidades
















web del CDC b)




web de la OMS)










Introduccioacuten

14


Reino Bacteria

































Introduccioacuten

15







Introduccioacuten

16

23 Biodiesel
































Introduccioacuten

17


particulares




insumos caros




Introduccioacuten

18







O + ne- R [21]


[22]





[23]




[24]


[25]




Introduccioacuten

19





[26]

[27]







[28]



[29]

o directamente

[210]





[211]



Introduccioacuten

20






[212]






[213]



ndash [214]








ellas




Introduccioacuten

21











t ge0 C0 = 0





[215]











otra

Introduccioacuten

22






















t

Salto de potencial


E

Introduccioacuten

23







[216]


2 s

-1 C en mol cm

-3 y en

V s-1









Idif

IP

Introduccioacuten

24









mismo










M) la










E

I

Introduccioacuten

25











de potencial

a)

b)

E

E

E

t

Amplitud de la

onda cuadrada EP



de potencial ES

Medida

alta

Medida

baja

t


de potencial ES

t

Amplitud de la

onda cuadrada

EP


Introduccioacuten

26













1f [217]



P2

1

tf [218]

Luego

ft

2

1P [219]




fSEv [220]

Introduccioacuten

27





1985)










21 fBAnIp [221]




25 Biosensores














Introduccioacuten

28

































Introduccioacuten

29

























Introduccioacuten

30



































Introduccioacuten

31
























(Park y col 2003)








Introduccioacuten

32






inmunoensayo


















Introduccioacuten

33





















moles de















Introduccioacuten

34



























glicerol

DHA

GlDHox

GlDHred NAD+

NADH Mediador ox

Mediador red

e- Electrodo

Introduccioacuten

35







3 Barras de grafito





b) GKGPOxHRP

a)Fe(CN)63-

b)Fe(CN)64-






de Prusia

GlDH Tt NADH






10 Au a)GlDHDP



b) 0 mV vs AgAgCl



intriacutenseco


Muestra

Rango dinaacutemico


(mA M-1

cm-2

)

Liacutemite de


Desde Hasta


10-3 - 5 10

-7 Hasta 1 mes

2 Jugo de uva 10-6

2 10-3

- 10-6 -

3 Vino 1 10-6

2 10-4

32 1 10-6


de 20 horas


rapidamente

5 Fermento

anaeroacutebico

1 10-5

1 10-5

10-3

1 10-3

a) 620

b) 142 -



hs b) 70 16 hs

6 Fermento de

jugo de uva 10

-51 10

-4 - 10

-6 -

7 - 10-5

1 10-3

- 10-6 -

8 Jarabe 997 10-7

10-4

162 cm2 43 10-7


de 3 diacuteas

9 Vino 10-5

147 10-4

a) 101

b) 079

a) 4 10-6

b) 15 10-5




10 Vino 10

-6

4 10-7

2 10-5

1 10-5

a) 207

b) 250

a) 4 10-7

b) 31




11 Fermento - - - 11 10-6

-

12 Vino 10

-5

2 10-6

25 10-2

64 10-3

-

10-5

2 10-6 -

Objetivos

Objetivos

37

3 Objetivos




alternativos




por T gondii









39



411 Reactivos

































40





extracto de

levadura y 10 g L-1









siguiente tabla



(NH4)2SO4 050

Na2(HPO4) 250

K(H2PO4) 100


MgSO4 005

CaCl2 0005

ZnSO4 0001

CuSO4 0001



Piridoxina 0001

Biotina 00005



siguiente tabla


41



Escherichia

coli (E coli)

BL21 (DE3)






M smegmatis

mc2155











Ricardo Morbidoni

44 Plaacutesmidos




pET32a





(DE3) de E coli










42



durante 10 min
















antes de su

















43


















durante 20 min


















44





(SDS-PAGE)







g L-1



Coomasie G-250





















45








poro controlado
























46

4161 Esquema A
















H2SO4 05 M

4162 Esquema B














47



















reaccioacuten ( L)


0125 M pH 105 815

K3Fe(NC)6 10-2

M 100

(NH4)2SO4 10 M 10

NAD+ 10

-2 M 25


1










48







mv


























49






(preparada






utilizacioacuten























10-4



50

















destilada










1991)




de referencia


51






[216]


2 s

-1 C en mol cm

-3 y

en V s-1









determinaciones















52


































53





























sistema


54

































55



[41]


[42]





Nm

EE r

c

1

[43]






hoc



57

















ser AAPred
















58














derecha













59







una










precipitar







60















una







P35B

P1 P2 P3 P4 MPM


SN1


SN2 SN3 SN4


61








conjugada (derecha)

53 Inmunoensayos























62



dilucioacuten 12000


maacutes arriba

Placa 1 Placa 2

Agudos

0100 0158

0311 0273

0140 0165

Croacutenicos

0281 0322

0256 0278

0260 0226

Negativos

0217 0168

0235 0179

0409 0354

Sin suero

0135 0134

0143 0114

0126 0100

Sin suero

Sin

P22cBiotina

0071 0050

0070 0037

0047 0040





5312 Esquema B












63















Ang


Agudos 2131 1567 0335 0296

1849 1311 065 0413

Negativos 176 1350 0282 0327

1025 1676 0262 0325

Sin suero 1658 1658 0174 0149

1812 1504 0130 0144

Sin Ang

conjugado

0055 004 0041 0045

0057 0042 0039 004


64

















65




(Negativos)




























66


recombinantes
























67






















( A cm-2

)

DS

( A cm-2

)



Sin suero -0052 004


68







M hasta 01 M











a 10 x 10-2








[Glicerol]

(mM)

Ip

(microA cm-2

)

DS Ip

(microA cm-2

)

050 18 032

100 28 038

200 74 041

500 17 035

750 262 055

100 347 053

-50E-05

00E+00

50E-05

10E-04

15E-04

20E-04

25E-04

-0400 -0200 0000 0200 0400 0600 0800

E(V)

i(A

)

-40E-06

00E+00

40E-06

80E-06

12E-05

16E-05

-1000 -0800 -0600 -0400 -0200 0000 0200 0400

E(V)

i(A

)


69






[51]












amperomeacutetrica





70

t s

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450

I A

0

2

4

6














[Glicerol]

(mM)

Ic A

( A cm-2

)

DS

( A cm-2

)

0000 0447 0029

0010 0763 0016

0025 1098 0068

0050 1510 0055

0100 285 049

0250 609 036

0500 1245 033

0750 1730 0097

100 2361 0099

150 3445 033

175 3997 020

200 4613 045


71






[52]




[Glicerol] mM

000 025 050 075 100 125 150 175 200

I cA

m

A c

m-2

0

10

20

30

40

50














M o


72




















1 mM y Fe(CN)34-

1 mM




La






0

025

05

075

1

125

15

175

2

225

25

275

260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500


Ab

sorb

an

cia

Ferricianuro 1 mM

Ferrocianuro 1 mM


73


y enzima GlDH y





cada 10 min Ambas











DHA + Fe(CN)64-

(1)






3- y glicerol






Fe(CN)63-




y se


en la Fig 516

A

0

015

03

045

06

075

09

105

12

135

15

320 340 360 380 400 420 440 460 480


Ab

sorb

an

cia

t = 0

t = 10 min

t = 20 min

t =30 min

t = 40 min

t = 50 min

t = 60 min

B

0

015

03

045

06

075

09

105

12

135

15

320 340 360 380 400 420 440 460 480


Ab

sorb

an

cia

t = 0 min

t = 10 min

t = 20 min

t = 30 min

t = 40 min

t = 50 min

t = 60 min

GlDHNAD+

GlDH


74













tenemos

[53]



[54]



A

05

056

062

068

074

08

086

092

098

104

11

0 600 1200 1800 2400 3000 3600

tiempo (s)

Ab

s 4

20

nm

B

0

004

008

012

016

02

024

028

032

036

04

044

048

0 600 1200 1800 2400 3000 3600tiempo (s)

Ab

s 3

40

nm

C

y = 00004405x

R2 = 09983921

0

0035

007

0105

014

0175

021

0 60 120 180 240 300 360 420 480

tiempo (s)

Ab

s 3

40

nm R

2 = 09984


75



b

k

tb

tk

tb

Abs

nmNADHnmNADHnmNADH

nm

340340340

340 [55]







[56]


εNADH 340nm = 6220 M-1

cm-1

Δt = 3600 s

b = 1 cm

k = 44 x 10-4

s-1

resultando

[57]


[58]

nmCNFe 420)( 36

= 1080 M-1

cm-1

ΔAbs420nm = 052


M [59]






equivale




76

2 Fe(CN)63-

+ NADH 2 Fe(CN)64-

+ NAD+ [510]















(mM)

Blanco 0 0

Muestra 1 11 22

Muestra 2 082 16

Muestra 3 055 11

Muestra 4 027 55

Muestra 5 011 22


77








obtenidos

[Glicerol] mM

000 005 010 015 020 025 030 035 040

Ab

s 42

0 n

m

00

02

04

06

08

10



estaacutendares



02

03

04

05

06

07

08

09

1

0 1200 2400 3600 4800 6000 7200

tiempo (s)

Ab

s 4

20

nm


78









triplicado
















4 1 -1 068 08790

7 03333 1 227 09962

8 1 1 184 09621

5 -1 1 159 09931

3 03333 -1 083 09590

2 -03333 -1 1 09850

6 -03333 1 244 09863

1 -1 -1 071 09914


79




(mM)

Blanco 0 0

Muestra 1 0010 02

Muestra 2 0025 05

Muestra 3 0050 10

Muestra 4 0075 15

Muestra 5 010 20


pendiente fue

tBNADAm ][421 [512]
























80











de Bonferroni










del ensayo









81

Bla

nco

Med

io 0

025

00

25

+ F

ago t

= 0

00

25

C

eacutelula

s t

= 0

00

25

Ceacutel

ula

s +

Fag

o t

= 0

00

25

+ F

ago t

= 2

00

25

Ceacutel

ula

s t

= 2

00

25

Ceacutel

ula

s +

fag

o t

= 2

00

25

fa

go t

= 4

00

25

Ceacutel

ula

s t

= 4

00

25

Ceacutel

ula

s +

fag

o t

= 4

Abs

420 n

m

03

04

05

08



color sin glicerol







3- que se

reduce a Fe(CN)64-





glicerol

DHA

GlDHox

GlDHred NAD+

NADH Mediador ox

Mediador red

e- Electrodo


82


obtenido

Tiempo s

100 200 300 400 500

I

nA

0

20

40

60

80

100





solucioacuten





fue

[513]








Tiempo s

0 500 1000 1500 2000

I

nA

0

50

100

150

200


83

[Glicerol] mM

000 025 050 075 100 125 150 175 200

Ic

nA

0

50

100

150

200
























84










pico















col)

Ep = 075 V


85





primero












Musameh y col

2002 Este trabajo

Electrodo de

trabajo Cv

C v +



-1

pH 74 105

Ep (V) 082 033

057 075 057

Aumento de la

I cap (μA) - 55 - 18


86












Tiempo s

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900

I A

0

1

2

3

4














87


















88












Nominal mM

00 02 04 06 08 10

Pre

dic

ho

mM

00

02

04

06

08

10

Equipo comercial

Tip Au

Biosensor

Recta identidad



0

05

1

15

2

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

[Glicerol] (mM)

Ip (

uA

)


89






Pendiente

08 09 10 11 12

Ord

enad

a al

ori

gen

-06

-04

-02

00

02

04

06

Equipo comercial

Tip Au

Biosensor

Punto (1 0)


















90




previos) LD

(microM)

Rango de

linealidad

(M)

Muestra

ensayada

Tiempo de

anaacutelisis

(min)

Reactivos o

accesorios

onerosos Referencia



4 times 10-5

a

2 times10-4




5 times 10minus5

a

5 times 10minus4


2010



1 times 10minus6

a

5 times 10minus4


col2012



informa 2 times 10

minus2 a

1 times 10minus1


ATP Kronka y col

2001



8 times 10minus6

a

25 times 10minus4

Suero

Humano 10

GK PK

LDH ATP

NAD+

Li y col 2001



5 times 10minus4

a

12 times 10minus2




33 times 10minus5

a

17 times 10minus3


Paixao 2012



33 times 10minus5

a

17 times 10minus3


C18

Lourenccedilo amp

Stradiotto


amperomeacutetrico


No

informa 16 times 10

minus4 a

16 times 10minus3


col 2009




23 times 10minus5

a

23 times 10minus4

Solucioacuten

Acuosa

pH=13 5

MWCNT

funcionalizad

os con Ag

Pop y col 2011

Electroquiacutemico

amperomeacutetrico


25 times 10minus5

a

20 times 10minus3

Solucioacuten

Acuosa

pH=13 8 -

Este Trabajo

de Tesis

Electroquiacutemico

amperomeacutetrico


5 times 10minus5

a

23 times 10minus2

Solucioacuten

Tampoacuten

Fosfato

5

(estimados) GO

Goriushnika y

col 2010

Biosensor


10 times 10minus6

a

10 times 10minus4

Jarabe de

cantildea 15


Aacutelvarez-

Gonzalez y

col 2000

Biosensor


1 times 10minus6

a

2 times 10minus5

Vino 3 GlDH DP

NAD+ Gamella y

col 2008

Biosensor


1 times 10minus6

a

1 times 10minus5

Vino 3 GK GPO

HRP ATP Gamella y

col 2008 Biosensor


5 times 10minus6

a

1 times 10minus4

Vino 5 GK GPO

ATP Ghica amp Brett

2006

Biosensor


70 times 10minus5

a

18 times 10minus3

Caldo

Middlebrook 10

GlDHb

NAD+ Este Trabajo

de Tesis





91
































biosensores




92







GlDH



biosensor NAD

+ por

anaacutelisis

Gamella y

col 2008 75 U 162 U 15x10-6

M 5x10-3

M Este Trabajo

de Tesis 23 U - - 5x10-4

M













94



por ceacutelulas B













Programa

VPP

promedio

AAPPred 691

ABCPred 628

BcePred 309

BepiPred 453

Antigenic 419

Aleatorio 382





toxoplasmosis aguda


95







Proteiacutena

Coacutedigo

NCBI

Nordm de

residuos

Cantidad de

epiacutetopes


antigeacutenicas

MPT70 (A) NP_217391 193 2 31-70 100-120

MSP-1 (A) BAF622801 1693 3 29-39 1594-1611 1644-1662

Exotoxina

A (A) NP_249839 638 8

297-313 324-333 354-387 412-421 510-522

528-539 557-593 596-638

GAG1 (A) P20873 504 10

11-25 113-122 142-156 176-214 216-268

280-308 312-321 330-367 406-416 428-448

Gp160 (A) NP_057856 856 13

30-141 161-191 211-231 252-281 294-344

346-413 424-511 525-558 561-615 639-701

724-747 761-778 822-855

Pr55 (B) NP_579876 132 2 11-38 51-78

Rev (B) NP_057854 116 4 5-15 32-51 70-91 96-116

VP1 (17) ABC87248 781 12

31-41 55-65 85-95 151-161 292-392 316-326

493-500 529-539 547-554 571-578 667-707

712-722

Gliadin

(18) A27319 296 3 31-72 165-176 237-264

Proteiacutena N

(16) AAP13445 422 6 1-6 45-61 153-192 211-223 225-235 354-412

Proteasa

(B) CAB66012 99 2 1-7 36-47










96









Sueros P22C P22C-

biotina P35B

P35B -

biotina

Positivos

2 gt3 26 1900

3 2900 2 gt3

gt3 gt3 26 gt3

Negativos

13 1000 11 0800

06 0500 09 0700

11 1600 1 1000





















97




Leche 1 0066 01445

Caseinato 1 00725 02425

Gelatina 1 00725 03925

BSA 1 00625 0192

BSA 1 Tween 002 00615 01515


bloqueante

622 Esquema A














Antiacutegenos

Sueros


2 02 002 2 02 002

Negativos 0576 0294 0155 1071 0681 0566

0543 0335 0176 1079 0769 023

Croacutenicos 0469 0246 0135 103 069 0299

0514 0215 0111 0914 0567 0196

Agudos 0331 0181 0109 081 0574 0168

0555 0254 0139 0789 0391 0169


98

623 Esquema B












Masa de P22C

(ng)

Muestras

50 10 50 10

Agudos 0393 0303 0553 0450

0273 0335 0793 0367

Croacutenicos 0230 0398 0316 0345

0284 0291 0444 0493

Negativos 0392 0210 0380 0380

0286 0292 0314 0350

Sin suero 0367 0468 0415 0411

0327 0358 0468 0536


biotina ni sueros

0102 0087 0128 0079

0131 0095 0116 0104







99








41931

E V

04 06 08 10 12 14 16

I

A

-15e-5

-10e-5

-50e-6

00

50e-6














de 0762 cm2 s



100

E V

-02 -01 00 01 02 03 04 05 06

I

A

-20e-4

-10e-4

00

10e-4

20e-4


























006 008 010 012 014 016 018 020 022 024

Ip

A

40e-5

60e-5

80e-5

10e-4

12e-4

14e-4

16e-4

18e-4

20e-4


101


voltameacutetricos


ES (mV) 5 5 10

E (mV) 25 50 50















)










102







Conclusiones

Conclusiones

104

7 Conclusiones





















Bibliografiacutea

Bibliografiacutea

106

8 Bibliografiacutea











265-279



1450ndash1453





1150




1771-1773










Bibliografiacutea

107





153-157







b) httpwwwcdcgovTB





(2009) 43 166-174



17 286



Lancet (1999) 353 1829





68 75-87





Bibliografiacutea

108







1570




Acta (2008) 609 201-209




















89



Bibliografiacutea

109




54072864-8



29(10)1489-1492




132-138





















96

Bibliografiacutea

110





(2004) 15181-190











4 743ndash746


(2010) 131(2) 153-168




101A-110A











Bibliografiacutea

111










(2003) 5 689ndash694


Genomics (2005) 6 79-76









83 559-564




2627-2633



0-444-51958-0





(2012) 70 153-157

Bibliografiacutea

112






Appl Chem (1991) 63(5) 711-734



Chem (2000) 48 2812



8493-1116-1 eBook ISBN 978-0-203-00899-7








Iacutendice

iii




fotomeacutetrica 45

4161 Esquema A 46

4162 Esquema B 46























Iacutendice

iv











53 Inmunoensayos 61



5312 Esquema B 62


recombinantes 66


acuoso 67








smegmatis 79



Iacutendice

v


modificada 81












622 Esquema A 97

623 Esquema B 98






amortiguadoras 100



de base 101

7 Conclusiones 104


Resumen

vi

1 Resumen






















infectados











Resumen

vii













Resumen

viii

1 Summary

































Resumen

ix











Publicaciones

x

Publicaciones
























Septiembre de 2011




Publicaciones

xi









de 2012









xii




Ac(s) Anticuerpo(s)









a enzima)


Frecuencia


















muacuteltiples)


xiii











TB Tuberculosis

TRX Tioredoxina




Introduccioacuten

Introduccioacuten

1

2 Introduccioacuten

21 Toxoplasmosis

211 Generalidades






























Introduccioacuten

2


2008)





Reino Protista

Sub-reino Protozoa

Phylum Apicomplexa

Clase Sporozoea

Sub-clase Coccidea

Orden Eucoccidiia

Sub-orden Eimeriina




Especie gondii


















Introduccioacuten

3


1998 Perotti 2007)


















Introduccioacuten

4


























Acar y col 2008)







Durlach y col 2008)

Introduccioacuten

5







2008)



























Introduccioacuten

6






























facie seguacuten




Introduccioacuten

7















Directo Indirecto












Introduccioacuten

8















cosustrato









Introduccioacuten

9
























Introduccioacuten

10


































Introduccioacuten

11























Recuadro 1


Verdaderos

positivos

Verdaderos

negativos

Ensayo

positivo A B

Ensayo

negativo C D

BA


DB

D dadEspecifici

CA

A adSensibilid

Introduccioacuten

12





Introduccioacuten

13

22 Tuberculosis

221 Generalidades
















web del CDC b)




web de la OMS)










Introduccioacuten

14


Reino Bacteria

































Introduccioacuten

15







Introduccioacuten

16

23 Biodiesel
































Introduccioacuten

17


particulares




insumos caros




Introduccioacuten

18







O + ne- R [21]


[22]





[23]




[24]


[25]




Introduccioacuten

19





[26]

[27]







[28]



[29]

o directamente

[210]





[211]



Introduccioacuten

20






[212]






[213]



ndash [214]








ellas




Introduccioacuten

21











t ge0 C0 = 0





[215]











otra

Introduccioacuten

22






















t

Salto de potencial


E

Introduccioacuten

23







[216]


2 s

-1 C en mol cm

-3 y en

V s-1









Idif

IP

Introduccioacuten

24









mismo










M) la










E

I

Introduccioacuten

25











de potencial

a)

b)

E

E

E

t

Amplitud de la

onda cuadrada EP



de potencial ES

Medida

alta

Medida

baja

t


de potencial ES

t

Amplitud de la

onda cuadrada

EP


Introduccioacuten

26













1f [217]



P2

1

tf [218]

Luego

ft

2

1P [219]




fSEv [220]

Introduccioacuten

27





1985)










21 fBAnIp [221]




25 Biosensores














Introduccioacuten

28

































Introduccioacuten

29

























Introduccioacuten

30



































Introduccioacuten

31
























(Park y col 2003)








Introduccioacuten

32






inmunoensayo


















Introduccioacuten

33





















moles de















Introduccioacuten

34



























glicerol

DHA

GlDHox

GlDHred NAD+

NADH Mediador ox

Mediador red

e- Electrodo

Introduccioacuten

35







3 Barras de grafito





b) GKGPOxHRP

a)Fe(CN)63-

b)Fe(CN)64-






de Prusia

GlDH Tt NADH






10 Au a)GlDHDP



b) 0 mV vs AgAgCl



intriacutenseco


Muestra

Rango dinaacutemico


(mA M-1

cm-2

)

Liacutemite de


Desde Hasta


10-3 - 5 10

-7 Hasta 1 mes

2 Jugo de uva 10-6

2 10-3

- 10-6 -

3 Vino 1 10-6

2 10-4

32 1 10-6


de 20 horas


rapidamente

5 Fermento

anaeroacutebico

1 10-5

1 10-5

10-3

1 10-3

a) 620

b) 142 -



hs b) 70 16 hs

6 Fermento de

jugo de uva 10

-51 10

-4 - 10

-6 -

7 - 10-5

1 10-3

- 10-6 -

8 Jarabe 997 10-7

10-4

162 cm2 43 10-7


de 3 diacuteas

9 Vino 10-5

147 10-4

a) 101

b) 079

a) 4 10-6

b) 15 10-5




10 Vino 10

-6

4 10-7

2 10-5

1 10-5

a) 207

b) 250

a) 4 10-7

b) 31




11 Fermento - - - 11 10-6

-

12 Vino 10

-5

2 10-6

25 10-2

64 10-3

-

10-5

2 10-6 -

Objetivos

Objetivos

37

3 Objetivos




alternativos




por T gondii









39



411 Reactivos

































40





extracto de

levadura y 10 g L-1









siguiente tabla



(NH4)2SO4 050

Na2(HPO4) 250

K(H2PO4) 100


MgSO4 005

CaCl2 0005

ZnSO4 0001

CuSO4 0001



Piridoxina 0001

Biotina 00005



siguiente tabla


41



Escherichia

coli (E coli)

BL21 (DE3)






M smegmatis

mc2155











Ricardo Morbidoni

44 Plaacutesmidos




pET32a





(DE3) de E coli










42



durante 10 min
















antes de su

















43


















durante 20 min


















44





(SDS-PAGE)







g L-1



Coomasie G-250





















45








poro controlado
























46

4161 Esquema A
















H2SO4 05 M

4162 Esquema B














47



















reaccioacuten ( L)


0125 M pH 105 815

K3Fe(NC)6 10-2

M 100

(NH4)2SO4 10 M 10

NAD+ 10

-2 M 25


1










48







mv


























49






(preparada






utilizacioacuten























10-4



50

















destilada










1991)




de referencia


51






[216]


2 s

-1 C en mol cm

-3 y

en V s-1









determinaciones















52


































53





























sistema


54

































55



[41]


[42]





Nm

EE r

c

1

[43]






hoc



57

















ser AAPred
















58














derecha













59







una










precipitar







60















una







P35B

P1 P2 P3 P4 MPM


SN1


SN2 SN3 SN4


61








conjugada (derecha)

53 Inmunoensayos























62



dilucioacuten 12000


maacutes arriba

Placa 1 Placa 2

Agudos

0100 0158

0311 0273

0140 0165

Croacutenicos

0281 0322

0256 0278

0260 0226

Negativos

0217 0168

0235 0179

0409 0354

Sin suero

0135 0134

0143 0114

0126 0100

Sin suero

Sin

P22cBiotina

0071 0050

0070 0037

0047 0040





5312 Esquema B












63















Ang


Agudos 2131 1567 0335 0296

1849 1311 065 0413

Negativos 176 1350 0282 0327

1025 1676 0262 0325

Sin suero 1658 1658 0174 0149

1812 1504 0130 0144

Sin Ang

conjugado

0055 004 0041 0045

0057 0042 0039 004


64

















65




(Negativos)




























66


recombinantes
























67






















( A cm-2

)

DS

( A cm-2

)



Sin suero -0052 004


68







M hasta 01 M











a 10 x 10-2








[Glicerol]

(mM)

Ip

(microA cm-2

)

DS Ip

(microA cm-2

)

050 18 032

100 28 038

200 74 041

500 17 035

750 262 055

100 347 053

-50E-05

00E+00

50E-05

10E-04

15E-04

20E-04

25E-04

-0400 -0200 0000 0200 0400 0600 0800

E(V)

i(A

)

-40E-06

00E+00

40E-06

80E-06

12E-05

16E-05

-1000 -0800 -0600 -0400 -0200 0000 0200 0400

E(V)

i(A

)


69






[51]












amperomeacutetrica





70

t s

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450

I A

0

2

4

6














[Glicerol]

(mM)

Ic A

( A cm-2

)

DS

( A cm-2

)

0000 0447 0029

0010 0763 0016

0025 1098 0068

0050 1510 0055

0100 285 049

0250 609 036

0500 1245 033

0750 1730 0097

100 2361 0099

150 3445 033

175 3997 020

200 4613 045


71






[52]




[Glicerol] mM

000 025 050 075 100 125 150 175 200

I cA

m

A c

m-2

0

10

20

30

40

50














M o


72




















1 mM y Fe(CN)34-

1 mM




La






0

025

05

075

1

125

15

175

2

225

25

275

260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500


Ab

sorb

an

cia

Ferricianuro 1 mM

Ferrocianuro 1 mM


73


y enzima GlDH y





cada 10 min Ambas











DHA + Fe(CN)64-

(1)






3- y glicerol






Fe(CN)63-




y se


en la Fig 516

A

0

015

03

045

06

075

09

105

12

135

15

320 340 360 380 400 420 440 460 480


Ab

sorb

an

cia

t = 0

t = 10 min

t = 20 min

t =30 min

t = 40 min

t = 50 min

t = 60 min

B

0

015

03

045

06

075

09

105

12

135

15

320 340 360 380 400 420 440 460 480


Ab

sorb

an

cia

t = 0 min

t = 10 min

t = 20 min

t = 30 min

t = 40 min

t = 50 min

t = 60 min

GlDHNAD+

GlDH


74













tenemos

[53]



[54]



A

05

056

062

068

074

08

086

092

098

104

11

0 600 1200 1800 2400 3000 3600

tiempo (s)

Ab

s 4

20

nm

B

0

004

008

012

016

02

024

028

032

036

04

044

048

0 600 1200 1800 2400 3000 3600tiempo (s)

Ab

s 3

40

nm

C

y = 00004405x

R2 = 09983921

0

0035

007

0105

014

0175

021

0 60 120 180 240 300 360 420 480

tiempo (s)

Ab

s 3

40

nm R

2 = 09984


75



b

k

tb

tk

tb

Abs

nmNADHnmNADHnmNADH

nm

340340340

340 [55]







[56]


εNADH 340nm = 6220 M-1

cm-1

Δt = 3600 s

b = 1 cm

k = 44 x 10-4

s-1

resultando

[57]


[58]

nmCNFe 420)( 36

= 1080 M-1

cm-1

ΔAbs420nm = 052


M [59]






equivale




76

2 Fe(CN)63-

+ NADH 2 Fe(CN)64-

+ NAD+ [510]















(mM)

Blanco 0 0

Muestra 1 11 22

Muestra 2 082 16

Muestra 3 055 11

Muestra 4 027 55

Muestra 5 011 22


77








obtenidos

[Glicerol] mM

000 005 010 015 020 025 030 035 040

Ab

s 42

0 n

m

00

02

04

06

08

10



estaacutendares



02

03

04

05

06

07

08

09

1

0 1200 2400 3600 4800 6000 7200

tiempo (s)

Ab

s 4

20

nm


78









triplicado
















4 1 -1 068 08790

7 03333 1 227 09962

8 1 1 184 09621

5 -1 1 159 09931

3 03333 -1 083 09590

2 -03333 -1 1 09850

6 -03333 1 244 09863

1 -1 -1 071 09914


79




(mM)

Blanco 0 0

Muestra 1 0010 02

Muestra 2 0025 05

Muestra 3 0050 10

Muestra 4 0075 15

Muestra 5 010 20


pendiente fue

tBNADAm ][421 [512]
























80











de Bonferroni










del ensayo









81

Bla

nco

Med

io 0

025

00

25

+ F

ago t

= 0

00

25

C

eacutelula

s t

= 0

00

25

Ceacutel

ula

s +

Fag

o t

= 0

00

25

+ F

ago t

= 2

00

25

Ceacutel

ula

s t

= 2

00

25

Ceacutel

ula

s +

fag

o t

= 2

00

25

fa

go t

= 4

00

25

Ceacutel

ula

s t

= 4

00

25

Ceacutel

ula

s +

fag

o t

= 4

Abs

420 n

m

03

04

05

08



color sin glicerol







3- que se

reduce a Fe(CN)64-





glicerol

DHA

GlDHox

GlDHred NAD+

NADH Mediador ox

Mediador red

e- Electrodo


82


obtenido

Tiempo s

100 200 300 400 500

I

nA

0

20

40

60

80

100





solucioacuten





fue

[513]








Tiempo s

0 500 1000 1500 2000

I

nA

0

50

100

150

200


83

[Glicerol] mM

000 025 050 075 100 125 150 175 200

Ic

nA

0

50

100

150

200
























84










pico















col)

Ep = 075 V


85





primero












Musameh y col

2002 Este trabajo

Electrodo de

trabajo Cv

C v +



-1

pH 74 105

Ep (V) 082 033

057 075 057

Aumento de la

I cap (μA) - 55 - 18


86












Tiempo s

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900

I A

0

1

2

3

4














87


















88












Nominal mM

00 02 04 06 08 10

Pre

dic

ho

mM

00

02

04

06

08

10

Equipo comercial

Tip Au

Biosensor

Recta identidad



0

05

1

15

2

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

[Glicerol] (mM)

Ip (

uA

)


89






Pendiente

08 09 10 11 12

Ord

enad

a al

ori

gen

-06

-04

-02

00

02

04

06

Equipo comercial

Tip Au

Biosensor

Punto (1 0)


















90




previos) LD

(microM)

Rango de

linealidad

(M)

Muestra

ensayada

Tiempo de

anaacutelisis

(min)

Reactivos o

accesorios

onerosos Referencia



4 times 10-5

a

2 times10-4




5 times 10minus5

a

5 times 10minus4


2010



1 times 10minus6

a

5 times 10minus4


col2012



informa 2 times 10

minus2 a

1 times 10minus1


ATP Kronka y col

2001



8 times 10minus6

a

25 times 10minus4

Suero

Humano 10

GK PK

LDH ATP

NAD+

Li y col 2001



5 times 10minus4

a

12 times 10minus2




33 times 10minus5

a

17 times 10minus3


Paixao 2012



33 times 10minus5

a

17 times 10minus3


C18

Lourenccedilo amp

Stradiotto


amperomeacutetrico


No

informa 16 times 10

minus4 a

16 times 10minus3


col 2009




23 times 10minus5

a

23 times 10minus4

Solucioacuten

Acuosa

pH=13 5

MWCNT

funcionalizad

os con Ag

Pop y col 2011

Electroquiacutemico

amperomeacutetrico


25 times 10minus5

a

20 times 10minus3

Solucioacuten

Acuosa

pH=13 8 -

Este Trabajo

de Tesis

Electroquiacutemico

amperomeacutetrico


5 times 10minus5

a

23 times 10minus2

Solucioacuten

Tampoacuten

Fosfato

5

(estimados) GO

Goriushnika y

col 2010

Biosensor


10 times 10minus6

a

10 times 10minus4

Jarabe de

cantildea 15


Aacutelvarez-

Gonzalez y

col 2000

Biosensor


1 times 10minus6

a

2 times 10minus5

Vino 3 GlDH DP

NAD+ Gamella y

col 2008

Biosensor


1 times 10minus6

a

1 times 10minus5

Vino 3 GK GPO

HRP ATP Gamella y

col 2008 Biosensor


5 times 10minus6

a

1 times 10minus4

Vino 5 GK GPO

ATP Ghica amp Brett

2006

Biosensor


70 times 10minus5

a

18 times 10minus3

Caldo

Middlebrook 10

GlDHb

NAD+ Este Trabajo

de Tesis





91
































biosensores




92







GlDH



biosensor NAD

+ por

anaacutelisis

Gamella y

col 2008 75 U 162 U 15x10-6

M 5x10-3

M Este Trabajo

de Tesis 23 U - - 5x10-4

M













94



por ceacutelulas B













Programa

VPP

promedio

AAPPred 691

ABCPred 628

BcePred 309

BepiPred 453

Antigenic 419

Aleatorio 382





toxoplasmosis aguda


95







Proteiacutena

Coacutedigo

NCBI

Nordm de

residuos

Cantidad de

epiacutetopes


antigeacutenicas

MPT70 (A) NP_217391 193 2 31-70 100-120

MSP-1 (A) BAF622801 1693 3 29-39 1594-1611 1644-1662

Exotoxina

A (A) NP_249839 638 8

297-313 324-333 354-387 412-421 510-522

528-539 557-593 596-638

GAG1 (A) P20873 504 10

11-25 113-122 142-156 176-214 216-268

280-308 312-321 330-367 406-416 428-448

Gp160 (A) NP_057856 856 13

30-141 161-191 211-231 252-281 294-344

346-413 424-511 525-558 561-615 639-701

724-747 761-778 822-855

Pr55 (B) NP_579876 132 2 11-38 51-78

Rev (B) NP_057854 116 4 5-15 32-51 70-91 96-116

VP1 (17) ABC87248 781 12

31-41 55-65 85-95 151-161 292-392 316-326

493-500 529-539 547-554 571-578 667-707

712-722

Gliadin

(18) A27319 296 3 31-72 165-176 237-264

Proteiacutena N

(16) AAP13445 422 6 1-6 45-61 153-192 211-223 225-235 354-412

Proteasa

(B) CAB66012 99 2 1-7 36-47










96









Sueros P22C P22C-

biotina P35B

P35B -

biotina

Positivos

2 gt3 26 1900

3 2900 2 gt3

gt3 gt3 26 gt3

Negativos

13 1000 11 0800

06 0500 09 0700

11 1600 1 1000





















97




Leche 1 0066 01445

Caseinato 1 00725 02425

Gelatina 1 00725 03925

BSA 1 00625 0192

BSA 1 Tween 002 00615 01515


bloqueante

622 Esquema A














Antiacutegenos

Sueros


2 02 002 2 02 002

Negativos 0576 0294 0155 1071 0681 0566

0543 0335 0176 1079 0769 023

Croacutenicos 0469 0246 0135 103 069 0299

0514 0215 0111 0914 0567 0196

Agudos 0331 0181 0109 081 0574 0168

0555 0254 0139 0789 0391 0169


98

623 Esquema B












Masa de P22C

(ng)

Muestras

50 10 50 10

Agudos 0393 0303 0553 0450

0273 0335 0793 0367

Croacutenicos 0230 0398 0316 0345

0284 0291 0444 0493

Negativos 0392 0210 0380 0380

0286 0292 0314 0350

Sin suero 0367 0468 0415 0411

0327 0358 0468 0536


biotina ni sueros

0102 0087 0128 0079

0131 0095 0116 0104







99








41931

E V

04 06 08 10 12 14 16

I

A

-15e-5

-10e-5

-50e-6

00

50e-6














de 0762 cm2 s



100

E V

-02 -01 00 01 02 03 04 05 06

I

A

-20e-4

-10e-4

00

10e-4

20e-4


























006 008 010 012 014 016 018 020 022 024

Ip

A

40e-5

60e-5

80e-5

10e-4

12e-4

14e-4

16e-4

18e-4

20e-4


101


voltameacutetricos


ES (mV) 5 5 10

E (mV) 25 50 50















)










102







Conclusiones

Conclusiones

104

7 Conclusiones





















Bibliografiacutea

Bibliografiacutea

106

8 Bibliografiacutea











265-279



1450ndash1453





1150




1771-1773










Bibliografiacutea

107





153-157







b) httpwwwcdcgovTB





(2009) 43 166-174



17 286



Lancet (1999) 353 1829





68 75-87





Bibliografiacutea

108







1570




Acta (2008) 609 201-209




















89



Bibliografiacutea

109




54072864-8



29(10)1489-1492




132-138





















96

Bibliografiacutea

110





(2004) 15181-190











4 743ndash746


(2010) 131(2) 153-168




101A-110A











Bibliografiacutea

111










(2003) 5 689ndash694


Genomics (2005) 6 79-76









83 559-564




2627-2633



0-444-51958-0





(2012) 70 153-157

Bibliografiacutea

112






Appl Chem (1991) 63(5) 711-734



Chem (2000) 48 2812



8493-1116-1 eBook ISBN 978-0-203-00899-7








Iacutendice

iv











53 Inmunoensayos 61



5312 Esquema B 62


recombinantes 66


acuoso 67








smegmatis 79



Iacutendice

v


modificada 81












622 Esquema A 97

623 Esquema B 98






amortiguadoras 100



de base 101

7 Conclusiones 104


Resumen

vi

1 Resumen






















infectados











Resumen

vii













Resumen

viii

1 Summary

































Resumen

ix











Publicaciones

x

Publicaciones
























Septiembre de 2011




Publicaciones

xi









de 2012









xii




Ac(s) Anticuerpo(s)









a enzima)


Frecuencia


















muacuteltiples)


xiii











TB Tuberculosis

TRX Tioredoxina




Introduccioacuten

Introduccioacuten

1

2 Introduccioacuten

21 Toxoplasmosis

211 Generalidades






























Introduccioacuten

2


2008)





Reino Protista

Sub-reino Protozoa

Phylum Apicomplexa

Clase Sporozoea

Sub-clase Coccidea

Orden Eucoccidiia

Sub-orden Eimeriina




Especie gondii


















Introduccioacuten

3


1998 Perotti 2007)


















Introduccioacuten

4


























Acar y col 2008)







Durlach y col 2008)

Introduccioacuten

5







2008)



























Introduccioacuten

6






























facie seguacuten




Introduccioacuten

7















Directo Indirecto












Introduccioacuten

8















cosustrato









Introduccioacuten

9
























Introduccioacuten

10


































Introduccioacuten

11























Recuadro 1


Verdaderos

positivos

Verdaderos

negativos

Ensayo

positivo A B

Ensayo

negativo C D

BA


DB

D dadEspecifici

CA

A adSensibilid

Introduccioacuten

12





Introduccioacuten

13

22 Tuberculosis

221 Generalidades
















web del CDC b)




web de la OMS)










Introduccioacuten

14


Reino Bacteria

































Introduccioacuten

15







Introduccioacuten

16

23 Biodiesel
































Introduccioacuten

17


particulares




insumos caros




Introduccioacuten

18







O + ne- R [21]


[22]





[23]




[24]


[25]




Introduccioacuten

19





[26]

[27]







[28]



[29]

o directamente

[210]





[211]



Introduccioacuten

20






[212]






[213]



ndash [214]








ellas




Introduccioacuten

21











t ge0 C0 = 0





[215]











otra

Introduccioacuten

22






















t

Salto de potencial


E

Introduccioacuten

23







[216]


2 s

-1 C en mol cm

-3 y en

V s-1









Idif

IP

Introduccioacuten

24









mismo










M) la










E

I

Introduccioacuten

25











de potencial

a)

b)

E

E

E

t

Amplitud de la

onda cuadrada EP



de potencial ES

Medida

alta

Medida

baja

t


de potencial ES

t

Amplitud de la

onda cuadrada

EP


Introduccioacuten

26













1f [217]



P2

1

tf [218]

Luego

ft

2

1P [219]




fSEv [220]

Introduccioacuten

27





1985)










21 fBAnIp [221]




25 Biosensores














Introduccioacuten

28

































Introduccioacuten

29

























Introduccioacuten

30



































Introduccioacuten

31
























(Park y col 2003)








Introduccioacuten

32






inmunoensayo


















Introduccioacuten

33





















moles de















Introduccioacuten

34



























glicerol

DHA

GlDHox

GlDHred NAD+

NADH Mediador ox

Mediador red

e- Electrodo

Introduccioacuten

35







3 Barras de grafito





b) GKGPOxHRP

a)Fe(CN)63-

b)Fe(CN)64-






de Prusia

GlDH Tt NADH






10 Au a)GlDHDP



b) 0 mV vs AgAgCl



intriacutenseco


Muestra

Rango dinaacutemico


(mA M-1

cm-2

)

Liacutemite de


Desde Hasta


10-3 - 5 10

-7 Hasta 1 mes

2 Jugo de uva 10-6

2 10-3

- 10-6 -

3 Vino 1 10-6

2 10-4

32 1 10-6


de 20 horas


rapidamente

5 Fermento

anaeroacutebico

1 10-5

1 10-5

10-3

1 10-3

a) 620

b) 142 -



hs b) 70 16 hs

6 Fermento de

jugo de uva 10

-51 10

-4 - 10

-6 -

7 - 10-5

1 10-3

- 10-6 -

8 Jarabe 997 10-7

10-4

162 cm2 43 10-7


de 3 diacuteas

9 Vino 10-5

147 10-4

a) 101

b) 079

a) 4 10-6

b) 15 10-5




10 Vino 10

-6

4 10-7

2 10-5

1 10-5

a) 207

b) 250

a) 4 10-7

b) 31




11 Fermento - - - 11 10-6

-

12 Vino 10

-5

2 10-6

25 10-2

64 10-3

-

10-5

2 10-6 -

Objetivos

Objetivos

37

3 Objetivos




alternativos




por T gondii









39



411 Reactivos

































40





extracto de

levadura y 10 g L-1









siguiente tabla



(NH4)2SO4 050

Na2(HPO4) 250

K(H2PO4) 100


MgSO4 005

CaCl2 0005

ZnSO4 0001

CuSO4 0001



Piridoxina 0001

Biotina 00005



siguiente tabla


41



Escherichia

coli (E coli)

BL21 (DE3)






M smegmatis

mc2155











Ricardo Morbidoni

44 Plaacutesmidos




pET32a





(DE3) de E coli










42



durante 10 min
















antes de su

















43


















durante 20 min


















44





(SDS-PAGE)







g L-1



Coomasie G-250





















45








poro controlado
























46

4161 Esquema A
















H2SO4 05 M

4162 Esquema B














47



















reaccioacuten ( L)


0125 M pH 105 815

K3Fe(NC)6 10-2

M 100

(NH4)2SO4 10 M 10

NAD+ 10

-2 M 25


1










48







mv


























49






(preparada






utilizacioacuten























10-4



50

















destilada










1991)




de referencia


51






[216]


2 s

-1 C en mol cm

-3 y

en V s-1









determinaciones















52


































53





























sistema


54

































55



[41]


[42]





Nm

EE r

c

1

[43]






hoc



57

















ser AAPred
















58














derecha













59







una










precipitar







60















una







P35B

P1 P2 P3 P4 MPM


SN1


SN2 SN3 SN4


61








conjugada (derecha)

53 Inmunoensayos























62



dilucioacuten 12000


maacutes arriba

Placa 1 Placa 2

Agudos

0100 0158

0311 0273

0140 0165

Croacutenicos

0281 0322

0256 0278

0260 0226

Negativos

0217 0168

0235 0179

0409 0354

Sin suero

0135 0134

0143 0114

0126 0100

Sin suero

Sin

P22cBiotina

0071 0050

0070 0037

0047 0040





5312 Esquema B












63















Ang


Agudos 2131 1567 0335 0296

1849 1311 065 0413

Negativos 176 1350 0282 0327

1025 1676 0262 0325

Sin suero 1658 1658 0174 0149

1812 1504 0130 0144

Sin Ang

conjugado

0055 004 0041 0045

0057 0042 0039 004


64

















65




(Negativos)




























66


recombinantes
























67






















( A cm-2

)

DS

( A cm-2

)



Sin suero -0052 004


68







M hasta 01 M











a 10 x 10-2








[Glicerol]

(mM)

Ip

(microA cm-2

)

DS Ip

(microA cm-2

)

050 18 032

100 28 038

200 74 041

500 17 035

750 262 055

100 347 053

-50E-05

00E+00

50E-05

10E-04

15E-04

20E-04

25E-04

-0400 -0200 0000 0200 0400 0600 0800

E(V)

i(A

)

-40E-06

00E+00

40E-06

80E-06

12E-05

16E-05

-1000 -0800 -0600 -0400 -0200 0000 0200 0400

E(V)

i(A

)


69






[51]












amperomeacutetrica





70

t s

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450

I A

0

2

4

6














[Glicerol]

(mM)

Ic A

( A cm-2

)

DS

( A cm-2

)

0000 0447 0029

0010 0763 0016

0025 1098 0068

0050 1510 0055

0100 285 049

0250 609 036

0500 1245 033

0750 1730 0097

100 2361 0099

150 3445 033

175 3997 020

200 4613 045


71






[52]




[Glicerol] mM

000 025 050 075 100 125 150 175 200

I cA

m

A c

m-2

0

10

20

30

40

50














M o


72




















1 mM y Fe(CN)34-

1 mM




La






0

025

05

075

1

125

15

175

2

225

25

275

260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500


Ab

sorb

an

cia

Ferricianuro 1 mM

Ferrocianuro 1 mM


73


y enzima GlDH y





cada 10 min Ambas











DHA + Fe(CN)64-

(1)






3- y glicerol






Fe(CN)63-




y se


en la Fig 516

A

0

015

03

045

06

075

09

105

12

135

15

320 340 360 380 400 420 440 460 480


Ab

sorb

an

cia

t = 0

t = 10 min

t = 20 min

t =30 min

t = 40 min

t = 50 min

t = 60 min

B

0

015

03

045

06

075

09

105

12

135

15

320 340 360 380 400 420 440 460 480


Ab

sorb

an

cia

t = 0 min

t = 10 min

t = 20 min

t = 30 min

t = 40 min

t = 50 min

t = 60 min

GlDHNAD+

GlDH


74













tenemos

[53]



[54]



A

05

056

062

068

074

08

086

092

098

104

11

0 600 1200 1800 2400 3000 3600

tiempo (s)

Ab

s 4

20

nm

B

0

004

008

012

016

02

024

028

032

036

04

044

048

0 600 1200 1800 2400 3000 3600tiempo (s)

Ab

s 3

40

nm

C

y = 00004405x

R2 = 09983921

0

0035

007

0105

014

0175

021

0 60 120 180 240 300 360 420 480

tiempo (s)

Ab

s 3

40

nm R

2 = 09984


75



b

k

tb

tk

tb

Abs

nmNADHnmNADHnmNADH

nm

340340340

340 [55]







[56]


εNADH 340nm = 6220 M-1

cm-1

Δt = 3600 s

b = 1 cm

k = 44 x 10-4

s-1

resultando

[57]


[58]

nmCNFe 420)( 36

= 1080 M-1

cm-1

ΔAbs420nm = 052


M [59]






equivale




76

2 Fe(CN)63-

+ NADH 2 Fe(CN)64-

+ NAD+ [510]















(mM)

Blanco 0 0

Muestra 1 11 22

Muestra 2 082 16

Muestra 3 055 11

Muestra 4 027 55

Muestra 5 011 22


77








obtenidos

[Glicerol] mM

000 005 010 015 020 025 030 035 040

Ab

s 42

0 n

m

00

02

04

06

08

10



estaacutendares



02

03

04

05

06

07

08

09

1

0 1200 2400 3600 4800 6000 7200

tiempo (s)

Ab

s 4

20

nm


78









triplicado
















4 1 -1 068 08790

7 03333 1 227 09962

8 1 1 184 09621

5 -1 1 159 09931

3 03333 -1 083 09590

2 -03333 -1 1 09850

6 -03333 1 244 09863

1 -1 -1 071 09914


79




(mM)

Blanco 0 0

Muestra 1 0010 02

Muestra 2 0025 05

Muestra 3 0050 10

Muestra 4 0075 15

Muestra 5 010 20


pendiente fue

tBNADAm ][421 [512]
























80











de Bonferroni










del ensayo









81

Bla

nco

Med

io 0

025

00

25

+ F

ago t

= 0

00

25

C

eacutelula

s t

= 0

00

25

Ceacutel

ula

s +

Fag

o t

= 0

00

25

+ F

ago t

= 2

00

25

Ceacutel

ula

s t

= 2

00

25

Ceacutel

ula

s +

fag

o t

= 2

00

25

fa

go t

= 4

00

25

Ceacutel

ula

s t

= 4

00

25

Ceacutel

ula

s +

fag

o t

= 4

Abs

420 n

m

03

04

05

08



color sin glicerol







3- que se

reduce a Fe(CN)64-





glicerol

DHA

GlDHox

GlDHred NAD+

NADH Mediador ox

Mediador red

e- Electrodo


82


obtenido

Tiempo s

100 200 300 400 500

I

nA

0

20

40

60

80

100





solucioacuten





fue

[513]








Tiempo s

0 500 1000 1500 2000

I

nA

0

50

100

150

200


83

[Glicerol] mM

000 025 050 075 100 125 150 175 200

Ic

nA

0

50

100

150

200
























84










pico















col)

Ep = 075 V


85





primero












Musameh y col

2002 Este trabajo

Electrodo de

trabajo Cv

C v +



-1

pH 74 105

Ep (V) 082 033

057 075 057

Aumento de la

I cap (μA) - 55 - 18


86












Tiempo s

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900

I A

0

1

2

3

4














87


















88












Nominal mM

00 02 04 06 08 10

Pre

dic

ho

mM

00

02

04

06

08

10

Equipo comercial

Tip Au

Biosensor

Recta identidad



0

05

1

15

2

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

[Glicerol] (mM)

Ip (

uA

)


89






Pendiente

08 09 10 11 12

Ord

enad

a al

ori

gen

-06

-04

-02

00

02

04

06

Equipo comercial

Tip Au

Biosensor

Punto (1 0)


















90




previos) LD

(microM)

Rango de

linealidad

(M)

Muestra

ensayada

Tiempo de

anaacutelisis

(min)

Reactivos o

accesorios

onerosos Referencia



4 times 10-5

a

2 times10-4




5 times 10minus5

a

5 times 10minus4


2010



1 times 10minus6

a

5 times 10minus4


col2012



informa 2 times 10

minus2 a

1 times 10minus1


ATP Kronka y col

2001



8 times 10minus6

a

25 times 10minus4

Suero

Humano 10

GK PK

LDH ATP

NAD+

Li y col 2001



5 times 10minus4

a

12 times 10minus2




33 times 10minus5

a

17 times 10minus3


Paixao 2012



33 times 10minus5

a

17 times 10minus3


C18

Lourenccedilo amp

Stradiotto


amperomeacutetrico


No

informa 16 times 10

minus4 a

16 times 10minus3


col 2009




23 times 10minus5

a

23 times 10minus4

Solucioacuten

Acuosa

pH=13 5

MWCNT

funcionalizad

os con Ag

Pop y col 2011

Electroquiacutemico

amperomeacutetrico


25 times 10minus5

a

20 times 10minus3

Solucioacuten

Acuosa

pH=13 8 -

Este Trabajo

de Tesis

Electroquiacutemico

amperomeacutetrico


5 times 10minus5

a

23 times 10minus2

Solucioacuten

Tampoacuten

Fosfato

5

(estimados) GO

Goriushnika y

col 2010

Biosensor


10 times 10minus6

a

10 times 10minus4

Jarabe de

cantildea 15


Aacutelvarez-

Gonzalez y

col 2000

Biosensor


1 times 10minus6

a

2 times 10minus5

Vino 3 GlDH DP

NAD+ Gamella y

col 2008

Biosensor


1 times 10minus6

a

1 times 10minus5

Vino 3 GK GPO

HRP ATP Gamella y

col 2008 Biosensor


5 times 10minus6

a

1 times 10minus4

Vino 5 GK GPO

ATP Ghica amp Brett

2006

Biosensor


70 times 10minus5

a

18 times 10minus3

Caldo

Middlebrook 10

GlDHb

NAD+ Este Trabajo

de Tesis





91
































biosensores




92







GlDH



biosensor NAD

+ por

anaacutelisis

Gamella y

col 2008 75 U 162 U 15x10-6

M 5x10-3

M Este Trabajo

de Tesis 23 U - - 5x10-4

M













94



por ceacutelulas B













Programa

VPP

promedio

AAPPred 691

ABCPred 628

BcePred 309

BepiPred 453

Antigenic 419

Aleatorio 382





toxoplasmosis aguda


95







Proteiacutena

Coacutedigo

NCBI

Nordm de

residuos

Cantidad de

epiacutetopes


antigeacutenicas

MPT70 (A) NP_217391 193 2 31-70 100-120

MSP-1 (A) BAF622801 1693 3 29-39 1594-1611 1644-1662

Exotoxina

A (A) NP_249839 638 8

297-313 324-333 354-387 412-421 510-522

528-539 557-593 596-638

GAG1 (A) P20873 504 10

11-25 113-122 142-156 176-214 216-268

280-308 312-321 330-367 406-416 428-448

Gp160 (A) NP_057856 856 13

30-141 161-191 211-231 252-281 294-344

346-413 424-511 525-558 561-615 639-701

724-747 761-778 822-855

Pr55 (B) NP_579876 132 2 11-38 51-78

Rev (B) NP_057854 116 4 5-15 32-51 70-91 96-116

VP1 (17) ABC87248 781 12

31-41 55-65 85-95 151-161 292-392 316-326

493-500 529-539 547-554 571-578 667-707

712-722

Gliadin

(18) A27319 296 3 31-72 165-176 237-264

Proteiacutena N

(16) AAP13445 422 6 1-6 45-61 153-192 211-223 225-235 354-412

Proteasa

(B) CAB66012 99 2 1-7 36-47










96









Sueros P22C P22C-

biotina P35B

P35B -

biotina

Positivos

2 gt3 26 1900

3 2900 2 gt3

gt3 gt3 26 gt3

Negativos

13 1000 11 0800

06 0500 09 0700

11 1600 1 1000





















97




Leche 1 0066 01445

Caseinato 1 00725 02425

Gelatina 1 00725 03925

BSA 1 00625 0192

BSA 1 Tween 002 00615 01515


bloqueante

622 Esquema A














Antiacutegenos

Sueros


2 02 002 2 02 002

Negativos 0576 0294 0155 1071 0681 0566

0543 0335 0176 1079 0769 023

Croacutenicos 0469 0246 0135 103 069 0299

0514 0215 0111 0914 0567 0196

Agudos 0331 0181 0109 081 0574 0168

0555 0254 0139 0789 0391 0169


98

623 Esquema B












Masa de P22C

(ng)

Muestras

50 10 50 10

Agudos 0393 0303 0553 0450

0273 0335 0793 0367

Croacutenicos 0230 0398 0316 0345

0284 0291 0444 0493

Negativos 0392 0210 0380 0380

0286 0292 0314 0350

Sin suero 0367 0468 0415 0411

0327 0358 0468 0536


biotina ni sueros

0102 0087 0128 0079

0131 0095 0116 0104







99








41931

E V

04 06 08 10 12 14 16

I

A

-15e-5

-10e-5

-50e-6

00

50e-6














de 0762 cm2 s



100

E V

-02 -01 00 01 02 03 04 05 06

I

A

-20e-4

-10e-4

00

10e-4

20e-4


























006 008 010 012 014 016 018 020 022 024

Ip

A

40e-5

60e-5

80e-5

10e-4

12e-4

14e-4

16e-4

18e-4

20e-4


101


voltameacutetricos


ES (mV) 5 5 10

E (mV) 25 50 50















)










102







Conclusiones

Conclusiones

104

7 Conclusiones





















Bibliografiacutea

Bibliografiacutea

106

8 Bibliografiacutea











265-279



1450ndash1453





1150




1771-1773










Bibliografiacutea

107





153-157







b) httpwwwcdcgovTB





(2009) 43 166-174



17 286



Lancet (1999) 353 1829





68 75-87





Bibliografiacutea

108







1570




Acta (2008) 609 201-209




















89



Bibliografiacutea

109




54072864-8



29(10)1489-1492




132-138





















96

Bibliografiacutea

110





(2004) 15181-190











4 743ndash746


(2010) 131(2) 153-168




101A-110A











Bibliografiacutea

111










(2003) 5 689ndash694


Genomics (2005) 6 79-76









83 559-564




2627-2633



0-444-51958-0





(2012) 70 153-157

Bibliografiacutea

112






Appl Chem (1991) 63(5) 711-734



Chem (2000) 48 2812



8493-1116-1 eBook ISBN 978-0-203-00899-7








Iacutendice

v


modificada 81












622 Esquema A 97

623 Esquema B 98






amortiguadoras 100



de base 101

7 Conclusiones 104


Resumen

vi

1 Resumen






















infectados











Resumen

vii













Resumen

viii

1 Summary

































Resumen

ix











Publicaciones

x

Publicaciones
























Septiembre de 2011




Publicaciones

xi









de 2012









xii




Ac(s) Anticuerpo(s)









a enzima)


Frecuencia


















muacuteltiples)


xiii











TB Tuberculosis

TRX Tioredoxina




Introduccioacuten

Introduccioacuten

1

2 Introduccioacuten

21 Toxoplasmosis

211 Generalidades






























Introduccioacuten

2


2008)





Reino Protista

Sub-reino Protozoa

Phylum Apicomplexa

Clase Sporozoea

Sub-clase Coccidea

Orden Eucoccidiia

Sub-orden Eimeriina




Especie gondii


















Introduccioacuten

3


1998 Perotti 2007)


















Introduccioacuten

4


























Acar y col 2008)







Durlach y col 2008)

Introduccioacuten

5







2008)



























Introduccioacuten

6






























facie seguacuten




Introduccioacuten

7















Directo Indirecto












Introduccioacuten

8















cosustrato









Introduccioacuten

9
























Introduccioacuten

10


































Introduccioacuten

11























Recuadro 1


Verdaderos

positivos

Verdaderos

negativos

Ensayo

positivo A B

Ensayo

negativo C D

BA


DB

D dadEspecifici

CA

A adSensibilid

Introduccioacuten

12





Introduccioacuten

13

22 Tuberculosis

221 Generalidades
















web del CDC b)




web de la OMS)










Introduccioacuten

14


Reino Bacteria

































Introduccioacuten

15







Introduccioacuten

16

23 Biodiesel
































Introduccioacuten

17


particulares




insumos caros




Introduccioacuten

18







O + ne- R [21]


[22]





[23]




[24]


[25]




Introduccioacuten

19





[26]

[27]







[28]



[29]

o directamente

[210]





[211]



Introduccioacuten

20






[212]






[213]



ndash [214]








ellas




Introduccioacuten

21











t ge0 C0 = 0





[215]











otra

Introduccioacuten

22






















t

Salto de potencial


E

Introduccioacuten

23







[216]


2 s

-1 C en mol cm

-3 y en

V s-1









Idif

IP

Introduccioacuten

24









mismo










M) la










E

I

Introduccioacuten

25











de potencial

a)

b)

E

E

E

t

Amplitud de la

onda cuadrada EP



de potencial ES

Medida

alta

Medida

baja

t


de potencial ES

t

Amplitud de la

onda cuadrada

EP


Introduccioacuten

26













1f [217]



P2

1

tf [218]

Luego

ft

2

1P [219]




fSEv [220]

Introduccioacuten

27





1985)










21 fBAnIp [221]




25 Biosensores














Introduccioacuten

28

































Introduccioacuten

29

























Introduccioacuten

30



































Introduccioacuten

31
























(Park y col 2003)








Introduccioacuten

32






inmunoensayo


















Introduccioacuten

33





















moles de















Introduccioacuten

34



























glicerol

DHA

GlDHox

GlDHred NAD+

NADH Mediador ox

Mediador red

e- Electrodo

Introduccioacuten

35







3 Barras de grafito





b) GKGPOxHRP

a)Fe(CN)63-

b)Fe(CN)64-






de Prusia

GlDH Tt NADH






10 Au a)GlDHDP



b) 0 mV vs AgAgCl



intriacutenseco


Muestra

Rango dinaacutemico


(mA M-1

cm-2

)

Liacutemite de


Desde Hasta


10-3 - 5 10

-7 Hasta 1 mes

2 Jugo de uva 10-6

2 10-3

- 10-6 -

3 Vino 1 10-6

2 10-4

32 1 10-6


de 20 horas


rapidamente

5 Fermento

anaeroacutebico

1 10-5

1 10-5

10-3

1 10-3

a) 620

b) 142 -



hs b) 70 16 hs

6 Fermento de

jugo de uva 10

-51 10

-4 - 10

-6 -

7 - 10-5

1 10-3

- 10-6 -

8 Jarabe 997 10-7

10-4

162 cm2 43 10-7


de 3 diacuteas

9 Vino 10-5

147 10-4

a) 101

b) 079

a) 4 10-6

b) 15 10-5




10 Vino 10

-6

4 10-7

2 10-5

1 10-5

a) 207

b) 250

a) 4 10-7

b) 31




11 Fermento - - - 11 10-6

-

12 Vino 10

-5

2 10-6

25 10-2

64 10-3

-

10-5

2 10-6 -

Objetivos

Objetivos

37

3 Objetivos




alternativos




por T gondii









39



411 Reactivos

































40





extracto de

levadura y 10 g L-1









siguiente tabla



(NH4)2SO4 050

Na2(HPO4) 250

K(H2PO4) 100


MgSO4 005

CaCl2 0005

ZnSO4 0001

CuSO4 0001



Piridoxina 0001

Biotina 00005



siguiente tabla


41



Escherichia

coli (E coli)

BL21 (DE3)






M smegmatis

mc2155











Ricardo Morbidoni

44 Plaacutesmidos




pET32a





(DE3) de E coli










42



durante 10 min
















antes de su

















43


















durante 20 min


















44





(SDS-PAGE)







g L-1



Coomasie G-250





















45








poro controlado
























46

4161 Esquema A
















H2SO4 05 M

4162 Esquema B














47



















reaccioacuten ( L)


0125 M pH 105 815

K3Fe(NC)6 10-2

M 100

(NH4)2SO4 10 M 10

NAD+ 10

-2 M 25


1










48







mv


























49






(preparada






utilizacioacuten























10-4



50

















destilada










1991)




de referencia


51






[216]


2 s

-1 C en mol cm

-3 y

en V s-1









determinaciones















52


































53





























sistema


54

































55



[41]


[42]





Nm

EE r

c

1

[43]






hoc



57

















ser AAPred
















58














derecha













59







una










precipitar







60















una







P35B

P1 P2 P3 P4 MPM


SN1


SN2 SN3 SN4


61








conjugada (derecha)

53 Inmunoensayos























62



dilucioacuten 12000


maacutes arriba

Placa 1 Placa 2

Agudos

0100 0158

0311 0273

0140 0165

Croacutenicos

0281 0322

0256 0278

0260 0226

Negativos

0217 0168

0235 0179

0409 0354

Sin suero

0135 0134

0143 0114

0126 0100

Sin suero

Sin

P22cBiotina

0071 0050

0070 0037

0047 0040





5312 Esquema B












63















Ang


Agudos 2131 1567 0335 0296

1849 1311 065 0413

Negativos 176 1350 0282 0327

1025 1676 0262 0325

Sin suero 1658 1658 0174 0149

1812 1504 0130 0144

Sin Ang

conjugado

0055 004 0041 0045

0057 0042 0039 004


64

















65




(Negativos)




























66


recombinantes
























67






















( A cm-2

)

DS

( A cm-2

)



Sin suero -0052 004


68







M hasta 01 M











a 10 x 10-2








[Glicerol]

(mM)

Ip

(microA cm-2

)

DS Ip

(microA cm-2

)

050 18 032

100 28 038

200 74 041

500 17 035

750 262 055

100 347 053

-50E-05

00E+00

50E-05

10E-04

15E-04

20E-04

25E-04

-0400 -0200 0000 0200 0400 0600 0800

E(V)

i(A

)

-40E-06

00E+00

40E-06

80E-06

12E-05

16E-05

-1000 -0800 -0600 -0400 -0200 0000 0200 0400

E(V)

i(A

)


69






[51]












amperomeacutetrica





70

t s

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450

I A

0

2

4

6














[Glicerol]

(mM)

Ic A

( A cm-2

)

DS

( A cm-2

)

0000 0447 0029

0010 0763 0016

0025 1098 0068

0050 1510 0055

0100 285 049

0250 609 036

0500 1245 033

0750 1730 0097

100 2361 0099

150 3445 033

175 3997 020

200 4613 045


71






[52]




[Glicerol] mM

000 025 050 075 100 125 150 175 200

I cA

m

A c

m-2

0

10

20

30

40

50














M o


72




















1 mM y Fe(CN)34-

1 mM




La






0

025

05

075

1

125

15

175

2

225

25

275

260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500


Ab

sorb

an

cia

Ferricianuro 1 mM

Ferrocianuro 1 mM


73


y enzima GlDH y





cada 10 min Ambas











DHA + Fe(CN)64-

(1)






3- y glicerol






Fe(CN)63-




y se


en la Fig 516

A

0

015

03

045

06

075

09

105

12

135

15

320 340 360 380 400 420 440 460 480


Ab

sorb

an

cia

t = 0

t = 10 min

t = 20 min

t =30 min

t = 40 min

t = 50 min

t = 60 min

B

0

015

03

045

06

075

09

105

12

135

15

320 340 360 380 400 420 440 460 480


Ab

sorb

an

cia

t = 0 min

t = 10 min

t = 20 min

t = 30 min

t = 40 min

t = 50 min

t = 60 min

GlDHNAD+

GlDH


74













tenemos

[53]



[54]



A

05

056

062

068

074

08

086

092

098

104

11

0 600 1200 1800 2400 3000 3600

tiempo (s)

Ab

s 4

20

nm

B

0

004

008

012

016

02

024

028

032

036

04

044

048

0 600 1200 1800 2400 3000 3600tiempo (s)

Ab

s 3

40

nm

C

y = 00004405x

R2 = 09983921

0

0035

007

0105

014

0175

021

0 60 120 180 240 300 360 420 480

tiempo (s)

Ab

s 3

40

nm R

2 = 09984


75



b

k

tb

tk

tb

Abs

nmNADHnmNADHnmNADH

nm

340340340

340 [55]







[56]


εNADH 340nm = 6220 M-1

cm-1

Δt = 3600 s

b = 1 cm

k = 44 x 10-4

s-1

resultando

[57]


[58]

nmCNFe 420)( 36

= 1080 M-1

cm-1

ΔAbs420nm = 052


M [59]






equivale




76

2 Fe(CN)63-

+ NADH 2 Fe(CN)64-

+ NAD+ [510]















(mM)

Blanco 0 0

Muestra 1 11 22

Muestra 2 082 16

Muestra 3 055 11

Muestra 4 027 55

Muestra 5 011 22


77








obtenidos

[Glicerol] mM

000 005 010 015 020 025 030 035 040

Ab

s 42

0 n

m

00

02

04

06

08

10



estaacutendares



02

03

04

05

06

07

08

09

1

0 1200 2400 3600 4800 6000 7200

tiempo (s)

Ab

s 4

20

nm


78









triplicado
















4 1 -1 068 08790

7 03333 1 227 09962

8 1 1 184 09621

5 -1 1 159 09931

3 03333 -1 083 09590

2 -03333 -1 1 09850

6 -03333 1 244 09863

1 -1 -1 071 09914


79




(mM)

Blanco 0 0

Muestra 1 0010 02

Muestra 2 0025 05

Muestra 3 0050 10

Muestra 4 0075 15

Muestra 5 010 20


pendiente fue

tBNADAm ][421 [512]
























80











de Bonferroni










del ensayo









81

Bla

nco

Med

io 0

025

00

25

+ F

ago t

= 0

00

25

C

eacutelula

s t

= 0

00

25

Ceacutel

ula

s +

Fag

o t

= 0

00

25

+ F

ago t

= 2

00

25

Ceacutel

ula

s t

= 2

00

25

Ceacutel

ula

s +

fag

o t

= 2

00

25

fa

go t

= 4

00

25

Ceacutel

ula

s t

= 4

00

25

Ceacutel

ula

s +

fag

o t

= 4

Abs

420 n

m

03

04

05

08



color sin glicerol







3- que se

reduce a Fe(CN)64-





glicerol

DHA

GlDHox

GlDHred NAD+

NADH Mediador ox

Mediador red

e- Electrodo


82


obtenido

Tiempo s

100 200 300 400 500

I

nA

0

20

40

60

80

100





solucioacuten





fue

[513]








Tiempo s

0 500 1000 1500 2000

I

nA

0

50

100

150

200


83

[Glicerol] mM

000 025 050 075 100 125 150 175 200

Ic

nA

0

50

100

150

200
























84










pico















col)

Ep = 075 V


85





primero












Musameh y col

2002 Este trabajo

Electrodo de

trabajo Cv

C v +



-1

pH 74 105

Ep (V) 082 033

057 075 057

Aumento de la

I cap (μA) - 55 - 18


86












Tiempo s

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900

I A

0

1

2

3

4














87


















88












Nominal mM

00 02 04 06 08 10

Pre

dic

ho

mM

00

02

04

06

08

10

Equipo comercial

Tip Au

Biosensor

Recta identidad



0

05

1

15

2

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

[Glicerol] (mM)

Ip (

uA

)


89






Pendiente

08 09 10 11 12

Ord

enad

a al

ori

gen

-06

-04

-02

00

02

04

06

Equipo comercial

Tip Au

Biosensor

Punto (1 0)


















90




previos) LD

(microM)

Rango de

linealidad

(M)

Muestra

ensayada

Tiempo de

anaacutelisis

(min)

Reactivos o

accesorios

onerosos Referencia



4 times 10-5

a

2 times10-4




5 times 10minus5

a

5 times 10minus4


2010



1 times 10minus6

a

5 times 10minus4


col2012



informa 2 times 10

minus2 a

1 times 10minus1


ATP Kronka y col

2001



8 times 10minus6

a

25 times 10minus4

Suero

Humano 10

GK PK

LDH ATP

NAD+

Li y col 2001



5 times 10minus4

a

12 times 10minus2




33 times 10minus5

a

17 times 10minus3


Paixao 2012



33 times 10minus5

a

17 times 10minus3


C18

Lourenccedilo amp

Stradiotto


amperomeacutetrico


No

informa 16 times 10

minus4 a

16 times 10minus3


col 2009




23 times 10minus5

a

23 times 10minus4

Solucioacuten

Acuosa

pH=13 5

MWCNT

funcionalizad

os con Ag

Pop y col 2011

Electroquiacutemico

amperomeacutetrico


25 times 10minus5

a

20 times 10minus3

Solucioacuten

Acuosa

pH=13 8 -

Este Trabajo

de Tesis

Electroquiacutemico

amperomeacutetrico


5 times 10minus5

a

23 times 10minus2

Solucioacuten

Tampoacuten

Fosfato

5

(estimados) GO

Goriushnika y

col 2010

Biosensor


10 times 10minus6

a

10 times 10minus4

Jarabe de

cantildea 15


Aacutelvarez-

Gonzalez y

col 2000

Biosensor


1 times 10minus6

a

2 times 10minus5

Vino 3 GlDH DP

NAD+ Gamella y

col 2008

Biosensor


1 times 10minus6

a

1 times 10minus5

Vino 3 GK GPO

HRP ATP Gamella y

col 2008 Biosensor


5 times 10minus6

a

1 times 10minus4

Vino 5 GK GPO

ATP Ghica amp Brett

2006

Biosensor


70 times 10minus5

a

18 times 10minus3

Caldo

Middlebrook 10

GlDHb

NAD+ Este Trabajo

de Tesis





91
































biosensores




92







GlDH



biosensor NAD

+ por

anaacutelisis

Gamella y

col 2008 75 U 162 U 15x10-6

M 5x10-3

M Este Trabajo

de Tesis 23 U - - 5x10-4

M













94



por ceacutelulas B













Programa

VPP

promedio

AAPPred 691

ABCPred 628

BcePred 309

BepiPred 453

Antigenic 419

Aleatorio 382





toxoplasmosis aguda


95







Proteiacutena

Coacutedigo

NCBI

Nordm de

residuos

Cantidad de

epiacutetopes


antigeacutenicas

MPT70 (A) NP_217391 193 2 31-70 100-120

MSP-1 (A) BAF622801 1693 3 29-39 1594-1611 1644-1662

Exotoxina

A (A) NP_249839 638 8

297-313 324-333 354-387 412-421 510-522

528-539 557-593 596-638

GAG1 (A) P20873 504 10

11-25 113-122 142-156 176-214 216-268

280-308 312-321 330-367 406-416 428-448

Gp160 (A) NP_057856 856 13

30-141 161-191 211-231 252-281 294-344

346-413 424-511 525-558 561-615 639-701

724-747 761-778 822-855

Pr55 (B) NP_579876 132 2 11-38 51-78

Rev (B) NP_057854 116 4 5-15 32-51 70-91 96-116

VP1 (17) ABC87248 781 12

31-41 55-65 85-95 151-161 292-392 316-326

493-500 529-539 547-554 571-578 667-707

712-722

Gliadin

(18) A27319 296 3 31-72 165-176 237-264

Proteiacutena N

(16) AAP13445 422 6 1-6 45-61 153-192 211-223 225-235 354-412

Proteasa

(B) CAB66012 99 2 1-7 36-47










96









Sueros P22C P22C-

biotina P35B

P35B -

biotina

Positivos

2 gt3 26 1900

3 2900 2 gt3

gt3 gt3 26 gt3

Negativos

13 1000 11 0800

06 0500 09 0700

11 1600 1 1000





















97




Leche 1 0066 01445

Caseinato 1 00725 02425

Gelatina 1 00725 03925

BSA 1 00625 0192

BSA 1 Tween 002 00615 01515


bloqueante

622 Esquema A














Antiacutegenos

Sueros


2 02 002 2 02 002

Negativos 0576 0294 0155 1071 0681 0566

0543 0335 0176 1079 0769 023

Croacutenicos 0469 0246 0135 103 069 0299

0514 0215 0111 0914 0567 0196

Agudos 0331 0181 0109 081 0574 0168

0555 0254 0139 0789 0391 0169


98

623 Esquema B












Masa de P22C

(ng)

Muestras

50 10 50 10

Agudos 0393 0303 0553 0450

0273 0335 0793 0367

Croacutenicos 0230 0398 0316 0345

0284 0291 0444 0493

Negativos 0392 0210 0380 0380

0286 0292 0314 0350

Sin suero 0367 0468 0415 0411

0327 0358 0468 0536


biotina ni sueros

0102 0087 0128 0079

0131 0095 0116 0104







99








41931

E V

04 06 08 10 12 14 16

I

A

-15e-5

-10e-5

-50e-6

00

50e-6














de 0762 cm2 s



100

E V

-02 -01 00 01 02 03 04 05 06

I

A

-20e-4

-10e-4

00

10e-4

20e-4


























006 008 010 012 014 016 018 020 022 024

Ip

A

40e-5

60e-5

80e-5

10e-4

12e-4

14e-4

16e-4

18e-4

20e-4


101


voltameacutetricos


ES (mV) 5 5 10

E (mV) 25 50 50















)










102







Conclusiones

Conclusiones

104

7 Conclusiones





















Bibliografiacutea

Bibliografiacutea

106

8 Bibliografiacutea











265-279



1450ndash1453





1150




1771-1773










Bibliografiacutea

107





153-157







b) httpwwwcdcgovTB





(2009) 43 166-174



17 286



Lancet (1999) 353 1829





68 75-87





Bibliografiacutea

108







1570




Acta (2008) 609 201-209




















89



Bibliografiacutea

109




54072864-8



29(10)1489-1492




132-138





















96

Bibliografiacutea

110





(2004) 15181-190











4 743ndash746


(2010) 131(2) 153-168




101A-110A











Bibliografiacutea

111










(2003) 5 689ndash694


Genomics (2005) 6 79-76









83 559-564




2627-2633



0-444-51958-0





(2012) 70 153-157

Bibliografiacutea

112






Appl Chem (1991) 63(5) 711-734



Chem (2000) 48 2812



8493-1116-1 eBook ISBN 978-0-203-00899-7








Resumen

vi

1 Resumen






















infectados











Resumen

vii













Resumen

viii

1 Summary

































Resumen

ix











Publicaciones

x

Publicaciones
























Septiembre de 2011




Publicaciones

xi









de 2012









xii




Ac(s) Anticuerpo(s)









a enzima)


Frecuencia


















muacuteltiples)


xiii











TB Tuberculosis

TRX Tioredoxina




Introduccioacuten

Introduccioacuten

1

2 Introduccioacuten

21 Toxoplasmosis

211 Generalidades






























Introduccioacuten

2


2008)





Reino Protista

Sub-reino Protozoa

Phylum Apicomplexa

Clase Sporozoea

Sub-clase Coccidea

Orden Eucoccidiia

Sub-orden Eimeriina




Especie gondii


















Introduccioacuten

3


1998 Perotti 2007)


















Introduccioacuten

4


























Acar y col 2008)







Durlach y col 2008)

Introduccioacuten

5







2008)



























Introduccioacuten

6






























facie seguacuten




Introduccioacuten

7















Directo Indirecto












Introduccioacuten

8















cosustrato









Introduccioacuten

9
























Introduccioacuten

10


































Introduccioacuten

11























Recuadro 1


Verdaderos

positivos

Verdaderos

negativos

Ensayo

positivo A B

Ensayo

negativo C D

BA


DB

D dadEspecifici

CA

A adSensibilid

Introduccioacuten

12





Introduccioacuten

13

22 Tuberculosis

221 Generalidades
















web del CDC b)




web de la OMS)










Introduccioacuten

14


Reino Bacteria

































Introduccioacuten

15







Introduccioacuten

16

23 Biodiesel
































Introduccioacuten

17


particulares




insumos caros




Introduccioacuten

18







O + ne- R [21]


[22]





[23]




[24]


[25]




Introduccioacuten

19





[26]

[27]







[28]



[29]

o directamente

[210]





[211]



Introduccioacuten

20






[212]






[213]



ndash [214]








ellas




Introduccioacuten

21











t ge0 C0 = 0





[215]











otra

Introduccioacuten

22






















t

Salto de potencial


E

Introduccioacuten

23







[216]


2 s

-1 C en mol cm

-3 y en

V s-1









Idif

IP

Introduccioacuten

24









mismo










M) la










E

I

Introduccioacuten

25











de potencial

a)

b)

E

E

E

t

Amplitud de la

onda cuadrada EP



de potencial ES

Medida

alta

Medida

baja

t


de potencial ES

t

Amplitud de la

onda cuadrada

EP


Introduccioacuten

26













1f [217]



P2

1

tf [218]

Luego

ft

2

1P [219]




fSEv [220]

Introduccioacuten

27





1985)










21 fBAnIp [221]




25 Biosensores














Introduccioacuten

28

































Introduccioacuten

29

























Introduccioacuten

30



































Introduccioacuten

31
























(Park y col 2003)








Introduccioacuten

32






inmunoensayo


















Introduccioacuten

33





















moles de















Introduccioacuten

34



























glicerol

DHA

GlDHox

GlDHred NAD+

NADH Mediador ox

Mediador red

e- Electrodo

Introduccioacuten

35







3 Barras de grafito





b) GKGPOxHRP

a)Fe(CN)63-

b)Fe(CN)64-






de Prusia

GlDH Tt NADH






10 Au a)GlDHDP



b) 0 mV vs AgAgCl



intriacutenseco


Muestra

Rango dinaacutemico


(mA M-1

cm-2

)

Liacutemite de


Desde Hasta


10-3 - 5 10

-7 Hasta 1 mes

2 Jugo de uva 10-6

2 10-3

- 10-6 -

3 Vino 1 10-6

2 10-4

32 1 10-6


de 20 horas


rapidamente

5 Fermento

anaeroacutebico

1 10-5

1 10-5

10-3

1 10-3

a) 620

b) 142 -



hs b) 70 16 hs

6 Fermento de

jugo de uva 10

-51 10

-4 - 10

-6 -

7 - 10-5

1 10-3

- 10-6 -

8 Jarabe 997 10-7

10-4

162 cm2 43 10-7


de 3 diacuteas

9 Vino 10-5

147 10-4

a) 101

b) 079

a) 4 10-6

b) 15 10-5




10 Vino 10

-6

4 10-7

2 10-5

1 10-5

a) 207

b) 250

a) 4 10-7

b) 31




11 Fermento - - - 11 10-6

-

12 Vino 10

-5

2 10-6

25 10-2

64 10-3

-

10-5

2 10-6 -

Objetivos

Objetivos

37

3 Objetivos




alternativos




por T gondii









39



411 Reactivos

































40





extracto de

levadura y 10 g L-1









siguiente tabla



(NH4)2SO4 050

Na2(HPO4) 250

K(H2PO4) 100


MgSO4 005

CaCl2 0005

ZnSO4 0001

CuSO4 0001



Piridoxina 0001

Biotina 00005



siguiente tabla


41



Escherichia

coli (E coli)

BL21 (DE3)






M smegmatis

mc2155











Ricardo Morbidoni

44 Plaacutesmidos




pET32a





(DE3) de E coli










42



durante 10 min
















antes de su

















43


















durante 20 min


















44





(SDS-PAGE)







g L-1



Coomasie G-250





















45








poro controlado
























46

4161 Esquema A
















H2SO4 05 M

4162 Esquema B














47



















reaccioacuten ( L)


0125 M pH 105 815

K3Fe(NC)6 10-2

M 100

(NH4)2SO4 10 M 10

NAD+ 10

-2 M 25


1










48







mv


























49






(preparada






utilizacioacuten























10-4



50

















destilada










1991)




de referencia


51






[216]


2 s

-1 C en mol cm

-3 y

en V s-1









determinaciones















52


































53





























sistema


54

































55



[41]


[42]





Nm

EE r

c

1

[43]






hoc



57

















ser AAPred
















58














derecha













59







una










precipitar







60















una







P35B

P1 P2 P3 P4 MPM


SN1


SN2 SN3 SN4


61








conjugada (derecha)

53 Inmunoensayos























62



dilucioacuten 12000


maacutes arriba

Placa 1 Placa 2

Agudos

0100 0158

0311 0273

0140 0165

Croacutenicos

0281 0322

0256 0278

0260 0226

Negativos

0217 0168

0235 0179

0409 0354

Sin suero

0135 0134

0143 0114

0126 0100

Sin suero

Sin

P22cBiotina

0071 0050

0070 0037

0047 0040





5312 Esquema B












63















Ang


Agudos 2131 1567 0335 0296

1849 1311 065 0413

Negativos 176 1350 0282 0327

1025 1676 0262 0325

Sin suero 1658 1658 0174 0149

1812 1504 0130 0144

Sin Ang

conjugado

0055 004 0041 0045

0057 0042 0039 004


64

















65




(Negativos)




























66


recombinantes
























67






















( A cm-2

)

DS

( A cm-2

)



Sin suero -0052 004


68







M hasta 01 M











a 10 x 10-2








[Glicerol]

(mM)

Ip

(microA cm-2

)

DS Ip

(microA cm-2

)

050 18 032

100 28 038

200 74 041

500 17 035

750 262 055

100 347 053

-50E-05

00E+00

50E-05

10E-04

15E-04

20E-04

25E-04

-0400 -0200 0000 0200 0400 0600 0800

E(V)

i(A

)

-40E-06

00E+00

40E-06

80E-06

12E-05

16E-05

-1000 -0800 -0600 -0400 -0200 0000 0200 0400

E(V)

i(A

)


69






[51]












amperomeacutetrica





70

t s

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450

I A

0

2

4

6














[Glicerol]

(mM)

Ic A

( A cm-2

)

DS

( A cm-2

)

0000 0447 0029

0010 0763 0016

0025 1098 0068

0050 1510 0055

0100 285 049

0250 609 036

0500 1245 033

0750 1730 0097

100 2361 0099

150 3445 033

175 3997 020

200 4613 045


71






[52]




[Glicerol] mM

000 025 050 075 100 125 150 175 200

I cA

m

A c

m-2

0

10

20

30

40

50














M o


72




















1 mM y Fe(CN)34-

1 mM




La






0

025

05

075

1

125

15

175

2

225

25

275

260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500


Ab

sorb

an

cia

Ferricianuro 1 mM

Ferrocianuro 1 mM


73


y enzima GlDH y





cada 10 min Ambas











DHA + Fe(CN)64-

(1)






3- y glicerol






Fe(CN)63-




y se


en la Fig 516

A

0

015

03

045

06

075

09

105

12

135

15

320 340 360 380 400 420 440 460 480


Ab

sorb

an

cia

t = 0

t = 10 min

t = 20 min

t =30 min

t = 40 min

t = 50 min

t = 60 min

B

0

015

03

045

06

075

09

105

12

135

15

320 340 360 380 400 420 440 460 480


Ab

sorb

an

cia

t = 0 min

t = 10 min

t = 20 min

t = 30 min

t = 40 min

t = 50 min

t = 60 min

GlDHNAD+

GlDH


74













tenemos

[53]



[54]



A

05

056

062

068

074

08

086

092

098

104

11

0 600 1200 1800 2400 3000 3600

tiempo (s)

Ab

s 4

20

nm

B

0

004

008

012

016

02

024

028

032

036

04

044

048

0 600 1200 1800 2400 3000 3600tiempo (s)

Ab

s 3

40

nm

C

y = 00004405x

R2 = 09983921

0

0035

007

0105

014

0175

021

0 60 120 180 240 300 360 420 480

tiempo (s)

Ab

s 3

40

nm R

2 = 09984


75



b

k

tb

tk

tb

Abs

nmNADHnmNADHnmNADH

nm

340340340

340 [55]







[56]


εNADH 340nm = 6220 M-1

cm-1

Δt = 3600 s

b = 1 cm

k = 44 x 10-4

s-1

resultando

[57]


[58]

nmCNFe 420)( 36

= 1080 M-1

cm-1

ΔAbs420nm = 052


M [59]






equivale




76

2 Fe(CN)63-

+ NADH 2 Fe(CN)64-

+ NAD+ [510]















(mM)

Blanco 0 0

Muestra 1 11 22

Muestra 2 082 16

Muestra 3 055 11

Muestra 4 027 55

Muestra 5 011 22


77








obtenidos

[Glicerol] mM

000 005 010 015 020 025 030 035 040

Ab

s 42

0 n

m

00

02

04

06

08

10



estaacutendares



02

03

04

05

06

07

08

09

1

0 1200 2400 3600 4800 6000 7200

tiempo (s)

Ab

s 4

20

nm


78









triplicado
















4 1 -1 068 08790

7 03333 1 227 09962

8 1 1 184 09621

5 -1 1 159 09931

3 03333 -1 083 09590

2 -03333 -1 1 09850

6 -03333 1 244 09863

1 -1 -1 071 09914


79




(mM)

Blanco 0 0

Muestra 1 0010 02

Muestra 2 0025 05

Muestra 3 0050 10

Muestra 4 0075 15

Muestra 5 010 20


pendiente fue

tBNADAm ][421 [512]
























80











de Bonferroni










del ensayo









81

Bla

nco

Med

io 0

025

00

25

+ F

ago t

= 0

00

25

C

eacutelula

s t

= 0

00

25

Ceacutel

ula

s +

Fag

o t

= 0

00

25

+ F

ago t

= 2

00

25

Ceacutel

ula

s t

= 2

00

25

Ceacutel

ula

s +

fag

o t

= 2

00

25

fa

go t

= 4

00

25

Ceacutel

ula

s t

= 4

00

25

Ceacutel

ula

s +

fag

o t

= 4

Abs

420 n

m

03

04

05

08



color sin glicerol







3- que se

reduce a Fe(CN)64-





glicerol

DHA

GlDHox

GlDHred NAD+

NADH Mediador ox

Mediador red

e- Electrodo


82


obtenido

Tiempo s

100 200 300 400 500

I

nA

0

20

40

60

80

100





solucioacuten





fue

[513]








Tiempo s

0 500 1000 1500 2000

I

nA

0

50

100

150

200


83

[Glicerol] mM

000 025 050 075 100 125 150 175 200

Ic

nA

0

50

100

150

200
























84










pico















col)

Ep = 075 V


85





primero












Musameh y col

2002 Este trabajo

Electrodo de

trabajo Cv

C v +



-1

pH 74 105

Ep (V) 082 033

057 075 057

Aumento de la

I cap (μA) - 55 - 18


86












Tiempo s

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900

I A

0

1

2

3

4














87


















88












Nominal mM

00 02 04 06 08 10

Pre

dic

ho

mM

00

02

04

06

08

10

Equipo comercial

Tip Au

Biosensor

Recta identidad



0

05

1

15

2

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

[Glicerol] (mM)

Ip (

uA

)


89






Pendiente

08 09 10 11 12

Ord

enad

a al

ori

gen

-06

-04

-02

00

02

04

06

Equipo comercial

Tip Au

Biosensor

Punto (1 0)


















90




previos) LD

(microM)

Rango de

linealidad

(M)

Muestra

ensayada

Tiempo de

anaacutelisis

(min)

Reactivos o

accesorios

onerosos Referencia



4 times 10-5

a

2 times10-4




5 times 10minus5

a

5 times 10minus4


2010



1 times 10minus6

a

5 times 10minus4


col2012



informa 2 times 10

minus2 a

1 times 10minus1


ATP Kronka y col

2001



8 times 10minus6

a

25 times 10minus4

Suero

Humano 10

GK PK

LDH ATP

NAD+

Li y col 2001



5 times 10minus4

a

12 times 10minus2




33 times 10minus5

a

17 times 10minus3


Paixao 2012



33 times 10minus5

a

17 times 10minus3


C18

Lourenccedilo amp

Stradiotto


amperomeacutetrico


No

informa 16 times 10

minus4 a

16 times 10minus3


col 2009




23 times 10minus5

a

23 times 10minus4

Solucioacuten

Acuosa

pH=13 5

MWCNT

funcionalizad

os con Ag

Pop y col 2011

Electroquiacutemico

amperomeacutetrico


25 times 10minus5

a

20 times 10minus3

Solucioacuten

Acuosa

pH=13 8 -

Este Trabajo

de Tesis

Electroquiacutemico

amperomeacutetrico


5 times 10minus5

a

23 times 10minus2

Solucioacuten

Tampoacuten

Fosfato

5

(estimados) GO

Goriushnika y

col 2010

Biosensor


10 times 10minus6

a

10 times 10minus4

Jarabe de

cantildea 15


Aacutelvarez-

Gonzalez y

col 2000

Biosensor


1 times 10minus6

a

2 times 10minus5

Vino 3 GlDH DP

NAD+ Gamella y

col 2008

Biosensor


1 times 10minus6

a

1 times 10minus5

Vino 3 GK GPO

HRP ATP Gamella y

col 2008 Biosensor


5 times 10minus6

a

1 times 10minus4

Vino 5 GK GPO

ATP Ghica amp Brett

2006

Biosensor


70 times 10minus5

a

18 times 10minus3

Caldo

Middlebrook 10

GlDHb

NAD+ Este Trabajo

de Tesis





91
































biosensores




92







GlDH



biosensor NAD

+ por

anaacutelisis

Gamella y

col 2008 75 U 162 U 15x10-6

M 5x10-3

M Este Trabajo

de Tesis 23 U - - 5x10-4

M













94



por ceacutelulas B













Programa

VPP

promedio

AAPPred 691

ABCPred 628

BcePred 309

BepiPred 453

Antigenic 419

Aleatorio 382





toxoplasmosis aguda


95







Proteiacutena

Coacutedigo

NCBI

Nordm de

residuos

Cantidad de

epiacutetopes


antigeacutenicas

MPT70 (A) NP_217391 193 2 31-70 100-120

MSP-1 (A) BAF622801 1693 3 29-39 1594-1611 1644-1662

Exotoxina

A (A) NP_249839 638 8

297-313 324-333 354-387 412-421 510-522

528-539 557-593 596-638

GAG1 (A) P20873 504 10

11-25 113-122 142-156 176-214 216-268

280-308 312-321 330-367 406-416 428-448

Gp160 (A) NP_057856 856 13

30-141 161-191 211-231 252-281 294-344

346-413 424-511 525-558 561-615 639-701

724-747 761-778 822-855

Pr55 (B) NP_579876 132 2 11-38 51-78

Rev (B) NP_057854 116 4 5-15 32-51 70-91 96-116

VP1 (17) ABC87248 781 12

31-41 55-65 85-95 151-161 292-392 316-326

493-500 529-539 547-554 571-578 667-707

712-722

Gliadin

(18) A27319 296 3 31-72 165-176 237-264

Proteiacutena N

(16) AAP13445 422 6 1-6 45-61 153-192 211-223 225-235 354-412

Proteasa

(B) CAB66012 99 2 1-7 36-47










96









Sueros P22C P22C-

biotina P35B

P35B -

biotina

Positivos

2 gt3 26 1900

3 2900 2 gt3

gt3 gt3 26 gt3

Negativos

13 1000 11 0800

06 0500 09 0700

11 1600 1 1000





















97




Leche 1 0066 01445

Caseinato 1 00725 02425

Gelatina 1 00725 03925

BSA 1 00625 0192

BSA 1 Tween 002 00615 01515


bloqueante

622 Esquema A














Antiacutegenos

Sueros


2 02 002 2 02 002

Negativos 0576 0294 0155 1071 0681 0566

0543 0335 0176 1079 0769 023

Croacutenicos 0469 0246 0135 103 069 0299

0514 0215 0111 0914 0567 0196

Agudos 0331 0181 0109 081 0574 0168

0555 0254 0139 0789 0391 0169


98

623 Esquema B












Masa de P22C

(ng)

Muestras

50 10 50 10

Agudos 0393 0303 0553 0450

0273 0335 0793 0367

Croacutenicos 0230 0398 0316 0345

0284 0291 0444 0493

Negativos 0392 0210 0380 0380

0286 0292 0314 0350

Sin suero 0367 0468 0415 0411

0327 0358 0468 0536


biotina ni sueros

0102 0087 0128 0079

0131 0095 0116 0104







99








41931

E V

04 06 08 10 12 14 16

I

A

-15e-5

-10e-5

-50e-6

00

50e-6














de 0762 cm2 s



100

E V

-02 -01 00 01 02 03 04 05 06

I

A

-20e-4

-10e-4

00

10e-4

20e-4


























006 008 010 012 014 016 018 020 022 024

Ip

A

40e-5

60e-5

80e-5

10e-4

12e-4

14e-4

16e-4

18e-4

20e-4


101


voltameacutetricos


ES (mV) 5 5 10

E (mV) 25 50 50















)










102







Conclusiones

Conclusiones

104

7 Conclusiones





















Bibliografiacutea

Bibliografiacutea

106

8 Bibliografiacutea











265-279



1450ndash1453





1150




1771-1773










Bibliografiacutea

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153-157







b) httpwwwcdcgovTB





(2009) 43 166-174



17 286



Lancet (1999) 353 1829





68 75-87





Bibliografiacutea

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1570




Acta (2008) 609 201-209




















89



Bibliografiacutea

109




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29(10)1489-1492




132-138





















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Bibliografiacutea

110





(2004) 15181-190











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(2010) 131(2) 153-168




101A-110A











Bibliografiacutea

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8493-1116-1 eBook ISBN 978-0-203-00899-7








Desarrollo de métodos (bio)electroquímicos que faciliten ...

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