DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ANALÍTICA
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DEPARTAMENTO DE QUIacuteMICA ANALIacuteTICA
FACULTAD DE CIENCIAS
UNIVERSIDAD DE EXTREMADURA
TESIS DOCTORAL
MENCIOacuteN DOCTOR EUROPEO
UTILIZACIOacuteN DE SENtildeALES FLUORESCENTES PARA EL
ANAacuteLISIS Y CARACTERIZACIOacuteN DE VINOS MEJORA DE LA
SENSIBILIDAD Y SELECTIVIDAD MEDIANTE
DERIVATIZACIOacuteN FOTOQUIacuteMICA
USEFULNESS OF FLUORESCENCE SIGNALS FOR ANALYSIS
AND CLASSIFICATION OF WINES IMPROVEMENT OF
SENSITIVITY AND SELECTIVITY BY MEANS OF
PHOTOCHEMICAL DERIVATIZATION
Diego Airado RodriacuteguezBadajoz 2008
Edita Universidad de Extremadura Servicio de Publicaciones Caldereros 2 Planta 3ordf Caacuteceres 10071 Correo e publicacunexes httpwwwunexespublicaciones
UTILIZACIOacuteN DE SENtildeALES FLUORESCENTES PARA EL
ANAacuteLISIS Y CARACTERIZACIOacuteN DE VINOS MEJORA DE LA
SENSIBILIDAD Y SELECTIVIDAD MEDIANTE
DERIVATIZACIOacuteN FOTOQUIacuteMICA
USEFULNESS OF FLUORESCENCE SIGNALS FOR ANALYSIS
AND CLASSIFICATION OF WINES IMPROVEMENT OF
SENSITIVITY AND SELECTIVITY BY MEANS OF
PHOTOCHEMICAL DERIVATIZATION
por
Diego Airado Rodriacuteguez
VISADO en Badajoz a 30 de Abril de 2008
Dra Dordf Teresa Galeano DiacuteazProfesora TitularDpto de Quiacutemica AnaliacuteticaFacultad de CienciasUniversidad de Extremadura
Dra Dordf Isabel Duraacuten Martiacuten-MeraacutesProfesora TitularDpto de Quiacutemica AnaliacuteticaFacultad de CienciasUniversidad de Extremadura
Memoria de Investigacioacuten presentada para optar al Grado de Doctor Europeodentro del Programa de Doctorado ldquoCiencias Quiacutemicasrdquo Bienio 2004-2006 yrealizada en el Departamento de Quiacutemica Analiacutetica de la Universidad deExtremadura
Fdo Diego Airado Rodriacuteguez
DEPARTAMENTO DE QUIacuteMICA ANALIacuteTICA
Campus UniversitarioAvda de Elvas sn06071-BADAJOZ (ESPANtildeA)Teleacutefono (+34 924) 289300 y 289375FAX (+34 924) 289375
ARSENIO MUNtildeOZ DE LA PENtildeA CASTRILLO Catedraacutetico y Director del
Departamento de Quiacutemica Analiacutetica de la Facultad de Ciencias de la Universidad
de Extremadura
I N F O R M A
Que el trabajo que se presenta en esta TESIS DOCTORAL con el tiacutetulo de
UTILIZACIOacuteN DE SENtildeALES FLUORESCENTES PARA EL ANAacuteLISIS Y
CARACTERIZACIOacuteN DE VINOS MEJORA DE LA SENSIBILIDAD Y
SELECTIVIDAD MEDIANTE DERIVATIZACIOacuteN FOTOQUIacuteMICA ha sido
realizado bajo la direccioacuten de las Dras Dordf Teresa Galeano Diacuteaz y Dordf Isabel Duraacuten
Martiacuten-Meraacutes en el Departamento de Quiacutemica Analiacutetica de la Facultad de Ciencias
de la Universidad de Extremadura y reuacutene todos los requisitos para poder optar al
Grado de Doctor Europeo en Ciencias Quiacutemicas
Badajoz 30 de Abril de 2008
OBJETO DE LA TESIS DOCTORAL
El objeto de esta Memoria de Investigacioacuten es doble - Por una parte se centra en el desarrollo de nuevos meacutetodos
analiacuteticos para la determinacioacuten en vino de resveratrol y sus derivados compuestos con importantes implicaciones en la salud humana y que han despertado un gran intereacutes en la sociedad en los uacuteltimos antildeos Se pretende mejorar los meacutetodos anteriormente propuestos para la determinacioacuten de estos compuestos fundamentalmente en lo referido a su sensibilidad rapidez y sencillez Para ello nos basaremos en la fotorreaccioacuten que sufren estos compuestos estilbenoides la cual probablemente es una reaccioacuten de ciclacioacuten en la cual se originan derivados del fenantreno moleacutecula altamente fluorescente
- Otro objetivo de este trabajo es aportar nuevas metodologiacuteas para facilitar la tipificacioacuten de muestras de vino y la deteccioacuten de fraude en la industria del vino para lo que se pretende hacer uso de sentildeales fluorescentes de tres viacuteas en combinacioacuten con herramientas quimiomeacutetricas
DOCTORAL THESIS OBJECTIVE The purposes of this Report of Investigation are
- On the one hand the development of new analytical
methods for the determination of resveratrol derivatives in wine samples It has been demonstrated that these compounds have beneficial effects on human health and a great interest has been aroused in society in recent years The main objective is improving the previously proposed methods for the analysis of these compounds in terms of sensitivity speed and simplicity For that we will use the photoreaction that stilbenoids compounds suffer which is probably a cyclation reaction in which phenanthrene derivatives are originated
- On the other hand new methodologies for wine
classifications and fraud detection will be developed Three-way fluorescence signals will be used in combination with chemometric tools
IacuteNDICE CAPIacuteTULO I Introduccioacuten Parte I Resveratrol El Compuestohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip3 Resveratrol en vinohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip10 Efectos bioloacutegicos de resveratrolhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip14 Los compuestos fenoacutelicos de la uvahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip18 Parte II Antecedentes bibliograacuteficos para el anaacutelisis de resveratrol28 Aparatos reactivos y software utilizados en este trabajo de investigacioacutenhelliphelliphellip55 Capiacutetulo II Determinacioacuten de resveratrol en vino mediante fluorescencia fotoinducida de segunda derivada y extraccioacuten liacutequido-liacutequido ANTECEDENTEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip73 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN Estudio baacutesico sobre las propiedades de intereacutes analiacutetico de trans-resveratrolhellip76 Efecto de la irradiacioacuten ultravioleta externa sobre las propiedades absorbentes y fluorescentes de trans-resveratrolhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip87 Estudio extracto-espectrofluorimeacutetrico de trans-resveratrol Aplicacioacuten al anaacutelisis de muestras de vinohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip98 Perspectivas de futurohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip109
Capiacutetulo III Anaacutelisis de piceido en vinos mediante fluorescencia fotoinducida aplicando segunda-derivada a los espectros de emisioacuten ANTECEDENTEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip113 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN Estudio baacutesico sobre las propiedades de intereacutes analiacutetico de trans-piceidohelliphellip115 Efecto de la irradiacioacuten ultravioleta externa sobre las propiedades absorbentes y fluorescentes de trans-piceidohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip124 Estudio extracto-espectrofluorimeacutetrico de trans-piceido Aplicacioacuten al anaacutelisis de muestras de vinohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip135 Perspectivas de futurohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip149 Capiacutetulo IV Determinacioacuten de resveratrol y piceido totales en vino sin tratamiento previo mediante derivatizacioacuten fotoquiacutemica off line-HPLC ANTECEDENTEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip153 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN Estudios fluorescentes previoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip156 Estudios cromatograacuteficos previoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip158 Optimizacioacuten quimiomeacutetrica de la composicioacuten de la fase moacutevil para el anaacutelisis de vinohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip165 Determinacioacuten de las cantidades totales de resveratrol y piceido en muestras de vinohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip171 Perspectivas de futurohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip177
Capiacutetulo V Anaacutelisis de los isoacutemeros de resveratrol y piceido en vinos mediante HPLC isocraacutetica con deteccioacuten fluorescente previa derivatizacioacuten post-columna en liacutenea ANTECEDENTEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip181 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN Estudios fluorescentes previoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip186 Estudios cromatograacuteficos previoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip187 Optimizacioacuten quimiomeacutetrica de las condiciones cromatograacuteficas para el anaacutelisis isocraacutetico de trans-resveratrol y trans-piceido en muestras de vinohelliphelliphelliphelliphelliphellip190 Foto-isomeriacutea cis-trans Evidencia de la presencia de cis-isoacutemeros de resveratrol y piceido en vinoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip205 Aplicacioacuten Anaacutelisis de los isoacutemeros de resveratrol y piceido en vinoshelliphelliphelliphellip219 Capiacutetulo VI Utilizacioacuten de sentildeales fluorescentes de tres viacuteas (matrices de excitacioacuten-emisioacuten) para caracterizacioacuten de vinos ANTECEDENTEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip229 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN Muestras de vino incluidas en el modelohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip235 Matrices de excitacioacuten-emisioacuten de fluorescenciahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip237 Construccioacuten del modelo PARAFAChelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip242 Anaacutelisis de componentes principales de los valores de PARAFAC-scorehelliphelliphellip249 Identificacioacuten de los fluoroacuteforos presentes en vinohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip258 Utilizacioacuten de las sentildeales de autofluorescencia total del vino en combinacioacuten con herramientas quimiomeacutetricas para asegurar la pertenencia del vino a una DOhellip267 Perspectivas de futurohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip273
Capiacutetulo VII Anaacutelisis de resveratrol en vinos tintos mediante voltamperometriacutea de redisolucioacuten adsortiva de onda cuadrada ANTECEDENTEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip277 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN Puesta a punto del procedimientohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip281 Paraacutemetros analiacuteticos de calidadhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip304 Anaacutelisis de trans-resveratrol en muestras de vinohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip306 Seguimiento cromatograacutefico de las etapas de limpiezahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip311 Perspectivas de futurohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip312
CAPIacuteTULO I
INTRODUCCIOacuteN
CAPIacuteTULO I Introduccioacuten
2
CAPIacuteTULO I Introduccioacuten
3
PARTE I RESVERATOL EL COMPUESTO
Se conocen hasta 30 estilbenoides y estilben-glucoacutesidos que se encuentran naturalmente en diversas especies del reino vegetal dentro de las espermatofitas1 Como su propio nombre indica el esqueleto estructural de todos ellos consta de un puente viniacutelico que sirve de unioacuten a dos anillos aromaacuteticos (esqueleto estilbenoide) A partir de esta estructura quiacutemica relativamente sencilla la naturaleza ha sido capaz de crear una gran variedad de compuestos variando entre ellos tanto el nuacutemero como la posicioacuten de grupos hidroxilos la extensioacuten en que dichos grupos hidroxilos se encuentran a su vez sustituidos por azuacutecares por grupos metilo metoxi u otros residuos y la configuracioacuten esteacuterica de moleacuteculas quiacutemicamente ideacutenticas Otra causa de variacioacuten que aumenta mucho maacutes el nuacutemero de sustancias integrantes de esta familia es su habilidad para existir como diacutemeros triacutemeros o poliacutemeros mayores
Uno de los compuestos maacutes conocidos dentro de este grupo de
estilbenoides es la moleacutecula en la que se centra gran parte del trabajo que se describe en esta memoria el resveratrol 34rsquo5-trihidroxiestilbeno cuya foacutermula estructural es la siguiente
Figura 1- Foacutermula estructural de trans-resveratrol
HO
OH
OH
4 3
5
CAPIacuteTULO I Introduccioacuten
4
Respecto al origen del nombre resveratrol el profesor Yutaka Ebizuka de la Universidad de Tokio propone lo siguiente2
bull res puede estar relacionado con la clase de moleacuteculas a las que pertenece el resveratrol los resorcinoles
bull veratr abreviatura del nombre de la planta Veratrum grandiflorum en la que se encontroacute resveratrol por primera vez en 1940
bull ol indicativo de la presencia de grupos hidroxilo
La siacutentesis de resveratrol en el laboratorio puede llevarse a cabo a traveacutes de una reaccioacuten de Witting uniendo dos anillos fenoacutelicos apropiadamente sustituidos a traveacutes de un doble enlace de estireno como describen inicialmente Moreno-Mantildeas y Pleixats3 Cuando la siacutentesis se lleva a cabo mediante esta ruta se parte de precursores metilados para proteger los grupos hidroxilos los cuales son posteriormente liberados mediante tribromuro de boro El producto final de esta ruta sinteacutetica es el trans-resveratrol que es el uacutenico isoacutemero del resveratrol que existe en la naturaleza y el uacutenico que se comercializa (Sigma-Aldrich)
Como ocurre con otros estilbenoides el trans-resveratrol se produce de forma natural en un amplio nuacutemero de familias vegetales encontraacutendose en 72 especies vegetales (distribuidas en 31 geacuteneros y 12 familias) y estaacute ampliamente distribuido tanto en gimnospermas como en dicotiledoacuteneas1 algunas de las cuales constituyen productos empleados en la dieta humana como los cacahuetes o las moras
El resveratrol es identificado en 1940 por primera vez en la raiacutez del eleacuteboro
blanco (Veratrum Grandiflurum O Loes) y despueacutes en las raiacuteces secas de la planta Poligonum Cuspidatum llamada Ko-jo-kon en japoneacutes siendo eacutesta una de las fuentes maacutes ricas de resveratrol La planta es ampliamente empleada en la
CAPIacuteTULO I Introduccioacuten
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medicina tradicional china y japonesa en el tratamiento de enfermedades tales como dermatitis supurativa gonorrea tintildea favosa pie de atleta ehiperlipidemia4-7 En 19768 se descubrioacute la existencia de este compuesto en la vid Vitis vinifera
El trans-resveratrol es una fitoalexina producida en las plantas a nivel celular y para tratar de ubicar dicha moleacutecula debe considerarse en primer lugar coacutemo y por queacute se genera
El metabolismo celular de las plantas puede definirse a traveacutes de la suma
de todas las reacciones enzimaacuteticas que tienen lugar en la ceacutelula pudieacutendose diferenciar dos fases claramente diferenciadas
la fase en la que intervienen todos los procesos degradativos y que es conocida como catabolismo y
la fase constructiva o biosinteacutetica del metabolismo conocida como anabolismo
Bajo este punto de vista puede decirse que el trans-resveratrol es un
anabolito ya que esta moleacutecula se genera en las ceacutelulas de las plantas con el objetivo de cumplir una misioacuten especiacutefica ser un pesticida natural a traveacutes del cual y junto con otros anabolitos la plata se defiende de agresiones externas
Cuando una planta es infectada por un agente patoacutegeno la primera
respuesta estaacute localizada en las ceacutelulas con las que dicho agente entra en contacto directo Estas ceacutelulas reconocen la estructura del patoacutegeno o alguna de las moleacuteculas fundamentales para el desarrollo de su actividad siendo la respuesta primaria maacutes frecuente de la planta la reaccioacuten por necrosis en la que las ceacutelulas infectadas por el agente patoacutegeno mueren fenoacutemeno conocido como muerte celular programada (PCD) Ademaacutes estas ceacutelulas directamente afectadas por el
CAPIacuteTULO I Introduccioacuten
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patoacutegeno producen una serie de moleacuteculas que alertan a las ceacutelulas adyacentes de la infeccioacuten y que reciben el nombre de moleacuteculas elicitadoras9 desarrollaacutendose en dichas ceacutelulas adyacentes la conocida como respuesta secundaria al reconocer a las moleacuteculas elicitadoras producidas en la interaccioacuten primaria Estas viacuteas de defensa implican que las ceacutelulas de las plantas poseen sistemas permanentes de vigilancia capaces de detectar los estiacutemulos generados por el agente patoacutegeno elicitando de este modo la respuesta defensiva en la planta10 El tercer tipo de respuesta defensiva es inducida hormonalmente en la planta11 y es a traveacutes de la cual la planta forma compuestos conocidos como fitoalexinas que trataraacuten de frenar la actividad patoacutegena
Muchas plantas producen metabolitos secundarios (no implicados en las reacciones metaboacutelicas vitales para la planta) con funciones antifuacutengicas Estos compuestos antifuacutengicos pueden encontrarse en plantas saludables que no han sufrido infeccioacuten patoacutegena alguna actuando como mecanismo de barrera frente a las mismas y recibiendo en este caso el nombre de fitoancipinas Se reserva la denominacioacuten de fitoalexinas para los metabolitos secundarios antifuacutengicos que son sintetizados en respuesta al ataque patoacutegeno con el fin de cesar su invasioacuten12 En general las fitoalexinas pueden definirse como moleacuteculas antimicrobianas de bajo peso molecular acumuladas en las plantas como resultado de una infeccioacuten patoacutegena o tras haber sido sometidas a condiciones de estreacutes13
Entre los efectos desencadenantes de la produccioacuten de trans-resveratrol en plantas se pueden citar los siguientes
Infecciones fuacutengicas como la Botrytis Cinerea14 la Plasmopara Vitiacutecola15 la Phomopsis Vitiacutecola16 o la Rhizopus Stonifer17
Dantildeo de la planta Tratamiento con sales como tricloruro de aluminio18
CAPIacuteTULO I Introduccioacuten
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Tratamiento con ozono19 Radiacioacuten Ultravioleta
Como se ve en la Figura 2 los precursores inmediatos de resveratrol son el
p-cumaril-CoA y el malonil-CoA en una relacioacuten molar de 13
Figura 2- Ruta biosinteacutetica desde p-cumaril-CoA hasta resveratrol
El p-cumaril-CoA se genera a partir de la fenilalanina la cual en las plantas es sintetizada a partir de azuacutecares mediante la ruta del aacutecido shikiacutemico20 en primer lugar se produce la peacuterdida del grupo amino de la fenilalanina mediante deaminacioacuten oxidativa catalizada por la enzima especiacutefica fenilalanina-amonio-liasa dando lugar a aacutecido cinaacutemico el cual es hidroxilado a aacutecido p-cumaacuterico por
CAPIacuteTULO I Introduccioacuten
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accioacuten de la enzima cinamato-4-hidroxilasa y finalmente transformado en p-cumaril-CoA por accioacuten de una CoA-ligasa Sobre este sustrato pueden entrar en accioacuten dos enzimas clave la calcona-sintasa (CHS) o la estilbeno-sintasa (STS) En ambos casos tal y como se indica en la ruta biosinteacutetica representada en la Figura 2 (las tres condensaciones son las marcadas en color) se produce la condensacioacuten de p-cumaril-CoA con tres moleacuteculas de malonil-CoA dando lugar a una tetracetona Hasta este punto ambas enzimas actuacutean de manera ideacutentica
A continuacioacuten se produce la ciclacioacuten de la tetracetona lineal y es
precisamente la manera en la que esta ciclacioacuten se lleva a cabo la principal diferencia entre ambas enzimas En el caso de la CHS se liberan 3 moleacuteculas de CO2 en el proceso y el producto final de esta ruta es la calcona el cual es el precursor comuacuten de la familia de los flavonoides familia a la que pertenece la quercetina Cuando la enzima que actuacutea es la STS el producto final de la reaccioacuten es el trans-resveratrol liberaacutendose cuatro moles de CO2 por mol de resveratrol formado
La mayoriacutea de las especies de la familia Vitaceae poseen ambos enzimas
Como dato curioso puede citarse el siguiente Hain et al21 aiacuteslan el gen de la STS de la vid y lo transfirieron al tabaco encontrando que las plantas de tabaco transgeacutenicas resultantes son mucho maacutes resistentes a la infeccioacuten por Botrytis
cinerea Las fitoalexinas dado su caraacutecter antifuacutengico son candidatos idoacuteneos para ser utilizados como pesticidas naturales Dichos pesticidas naturales se plantean como una buena alternativa a los sinteacuteticos teniendo en cuenta la inmunidad desarrollada por ciertas especies patoacutegenas la toxicidad y los grandes tiempos necesarios para la degradacioacuten de estos uacuteltimos
CAPIacuteTULO I Introduccioacuten
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El tratamiento post-cosecha de la uva con luz ultravioleta (concretamente UVC) produce un estreacutes en la uva que hace que eacutesta en respuesta a dicho dantildeo induzca la siacutentesis de resveratrol Esta misma tecnologiacutea se estaacute aplicando actualmente a uvas de mesa y a uvas de vinificacioacuten para obtener nuevas frutas ldquofuncionalesrdquo22 23 y vinos enriquecidos en resveratrol24
Las fuentes de resveratrol en la naturaleza no son muchas y menos auacuten
las plantas y vegetales de consumo humano conteniendo este compuesto En la Figura 3 se representan las fuentes naturales maacutes importantes de aporte de resveratrol y no existe duda acerca de que las fuentes que maacutes aportan a la dieta humana son los productos derivados de la vid esto es la uva y el vino25 Figura 3- Fuentes de resveratrol en la naturaleza
CAPIacuteTULO I Introduccioacuten
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En la uva los mayores niveles de resveratrol se encuentran en las pieles estando praacutecticamente ausente en la pulpa y en las pepitas del fruto26 Otras fuentes de resveratrol son el cacahuete27 28 los araacutendanos29 la Reynoutria
Japonica las moras y en especies herbaacuteceas (Poaceae incluyendo Festuca
Hordeum Poa Stipa y Lolium spp)
Respecto a la existencia de este compuesto en aacuterboles merece la pena destacar su presencia en eucalipto piacutecea y pino asiacute como en el aacuterbol tropical de hoja caduca Bauhinia racemosa
Son pocas las plantas florales en las que se encuentra resveratrol Las dos
uacutenicas que se conocen son la ya mencionada Veratrum Grandiflurum en la que se encuentran altas concentraciones de resveratrol en las hojas cuando la planta es dantildeada por tratamiento con agentes quiacutemicos30 y la Veratrum formosanum cuya raiacutez y rizomas son relativamente ricos en resveratrol tanto que ha sido empleada en Oriente como tratamiento alternativo para la hipertensioacuten31 Tambieacuten estaacute descrita la presencia de resveratrol en Pterolobium hexapetallum una legumbre no comestible32
Recientemente Counet et al33 describen la presencia de trans-resveratrol y
trans-piceido por primera vez en chocolate negro (al menos 04 μgmiddotmL-1 de trans-resveratrol y 10 μgmiddotmL-1 de trans-piceido) y licor de cacao (al menos 05 μgmiddotmL-1 de trans-resveratrol y 12 μgmiddotmL-1 de trans-piceido) Resveratrol en vino
La identificacioacuten de resveratol en vinos es relativamente reciente y data de 1992 antildeo en que el isoacutemero trans es identificado por Siemman y Creasy34 Estos
CAPIacuteTULO I Introduccioacuten
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autores llevan a cabo la cuantificacioacuten de este compuesto en vinos tintos y blancos encontrando que las concentraciones variacutean entre 066 μgmiddotmLminus1 y 068 ngmiddotmLminus1 en vinos tintos y desde 100 ngmiddotmLminus1 a menos de 023 ngmiddotmLminus1 para vinos blancos Justifican los menores niveles encontrados en vinos blancos en base al hecho de que en la uva el resveratrol se encuentra en las pieles y no en la pulpa y el proceso de elaboracioacuten del vino blanco implica un prensado maacutes ligero del fruto y un menor tiempo de contacto entre el mosto y los hollejos Se pone de manifiesto en este primer trabajo una gran variabilidad en el contenido de resveratrol en vino y su dependencia de factores tales como la casta de la uva el origen geograacutefico la cosecha y las teacutecnicas de vinificacioacuten Entre las variables que maacutes influyen en el contenido de los cuatro compuestos en vino ademaacutes de las ya mencionadas se ha encontrado que son muy importantes ciertos aspectos de las teacutecnicas de vinificacioacuten como por ejemplo la maceracioacuten con hollejos35
Un antildeo maacutes tarde Jeandet et al36 describen la presencia del isoacutemero cis
en vino En 1994 Waterhouse y Lamuela-Raventoacutes37 publican la existencia de
resveratrol-3-β-D-glucoacutesido (piceido) en uvas Ese mismo antildeo Roggero y Archier38
basaacutendose en su espectro de absorcioacuten en el ultravioleta describen la existencia de un glucoacutesido indefinido del resveratrol en vino Posteriormente en el antildeo 1995 Lamuela-Raventoacutes et al39 identifican este glucoacutesido en vino tinto como piceido utilizando un estaacutendar de piceido extraiacutedo de la raiacutez del Poligonum Cuspidatum y proponen un meacutetodo para el anaacutelisis de los isoacutemeros trans y cis del glucoacutesido y la aglicona (Figura 4) en vino
CAPIacuteTULO I Introduccioacuten
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Figura 4- Estructuras quiacutemicas de las formas de resveratrol objeto de esta tesis
Los mismos autores40 proponen en 1996 un meacutetodo para la cuantificacioacuten
de los cuatro analitos en vinos blancos y rosados siendo en este caso necesario una etapa de preconcentracioacuten dados los menores niveles encontrados en estos vinos
Fremot en el antildeo 2000 publica un trabajo de recopilacioacuten donde se
recogen las cantidades de resveratol yo piceido encontradas en vinos de diferentes paiacuteses y en distintos tipos de vino Los resultados se muestran en la Tabla 1
OH
HO
HO
OH
HOOH OH
HO
OHOH
O
HHO
H
HO
H
H
HO
H
O
OH
O
H
OHH OH
H
H HO
H
O
OH
trans - Resveratrolcis -Resveratrol
trans-Piceido cis-Piceido
CAPIacuteTULO I Introduccioacuten
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Tabla 1- Concentraciones de resveratrol yo piceido en vinos tinto41
Origen Concentracioacuten de Resveratrol (μgmL-1) (1) Ref
USA Chardonnay hasta 01
Los vinos de California presentan concentraciones maacutes bajas que los de New York
Francia Burdeaux entre 03 - 06
34
Francia (Burgundy) Pinot noir entre 04 - 2 36
USA (California)
Pinot noir entre 02 - 07 Cabernet Sauvignon lt 009
42 Comparacioacuten entre vinos de Norte Ameacuterica
Australia y Europa
Todos contienen entre 01 - 12 Los procedentes de California Australia e Italia
presentan concentraciones maacutes bajas que los de Oregoacuten Canadaacute y Francia
43
USA (California) lt 002-17 (maacuteximas concentraciones en Pinot noir 5)
Francia Beaujolais (Gamay) entre 32 - 36 44
Francia
Resveratrol 05 - 5 piceido 0 - 145 Vinos procedentes de uvas Cabernet franc Gamay y
Grenache presentan concentraciones menores que los procedentes de Pinot noir Mourvegravedre y Cabernet
Sauvignon
44
USA (California) Isoacutemeros del resveratrol entre 03 ndash 3 38
Espantildea
Resveratrol total (aglicona+glucoacutesido) entre 25 - 138 (transgtcis)
Cantidades totales seguacuten el tipo de uva Pinot noir 51 Merlot 4 Grenache 24 Cabernet
Sauvignon 14 Tempranillo 13
39
Europa Isoacutemeros de la aglicona (transgtcis)
Contenido medio seguacuten paiacutes Francia 37 - 71 Italia 12 Espantildea Portugal 28 Europa central 31
Suiza 69
45 (1) concentracioacuten de trans-resveratrol donde no se indique otra cosa
CAPIacuteTULO I Introduccioacuten
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Tabla 1- Concentraciones de resveratrol yo piceido en vinos tinto (continuacioacuten) Origen Concentracioacuten de Resveratrol (μgmL-1) (1) Ref
Ameacuterica Contenido medio seguacuten el origen Ameacuterica del Sur 18 lt California 3 lt Oregon 63 45
Comparacioacuten entre vinos de
Italia Reccioto y Amarone (area de Verona) entre 005 - 08 25
USA (Sureste) Isoacutemeros de la aglicona 01-42 concentraciones maacute-ximas en Muscadine trans hasta 134 cis hasta 319
Presencia de Tetrahidroxiestilbeno 46
Japoacuten Estilbenos totales 08-134 aglicona (media 18 trans gt cis) piceido (media 25 cis gt trans) concentraciones
maacuteximas en los tipos de uva Pinot Noir y Merlot 47
USA (California)
Contenido seguacuten el tipo de uva Cabernet Sauvignon 04-2
Pinot noir 12 Merlot 35
48 (1) concentracioacuten de trans-resveratrol donde no se indique otra cosa
Debido a la generalmente alta razoacuten entre las concentraciones de trans a
cis isoacutemeros encontradas en vino se sugiere que el uacutenico isoacutemero sintetizado en la uva es el trans proviniendo el cis de la exposicioacuten a la luz del mosto durante el proceso de elaboracioacuten del vino o del vino durante el almacenamiento39 Efectos bioloacutegicos de resveratrol
Ya se ha comentado el caraacutecter antifuacutengico de las fitoalexinas No obstante debe tenerse en cuenta que un compuesto natural no tiene por que estar exento de riesgos toxicoloacutegicos para el ser humano ya que los mayores venenos son productos naturales producidos por plantas o animales Sin embargo en el caso concreto de algunas fitoalexinas como el trans-resveratrol no soacutelo se ha demostrado la ausencia de dicho caraacutecter toacutexico sino que ademaacutes presenta grandes beneficios para la salud
CAPIacuteTULO I Introduccioacuten
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Este compuesto como otros polifenoles es un antioxidante muy efectivo por derecho propio por lo que ha atraiacutedo la atencioacuten particular como solucioacuten potencial a la denominada ldquoparadoja francesardquo Este es el teacutermino usado para describir el fenoacutemeno que ha sido por mucho tiempo un rompecabezas para la ciencia meacutedica de que los iacutendices de la enfermedad cardiovascular en Francia son muy bajos con respecto al resto del mundo desarrollado a pesar del elevado consumo de grasa animal y colesterol y un haacutebito firmemente atrincherado del tabaco Por supuesto Francia tambieacuten goza de muchas de las ventajas de la dieta mediterraacutenea pero hay buenas razones para pensar que es el consumo de vino tinto y en gran medida el resveratrol contenido en eacuteste el que puede ser la explicacioacuten verdadera de la paradoja evidente
La paradoja francesa y el resveratrol han abierto las puertas a nuevas
investigaciones pero no se puede olvidar que las bondades del vino ya las prescribioacute Hipoacutecrates padre de la medicina moderna quien afirmaba que el vino
es cosa admirablemente apropiada al hombre tanto en el estado de salud como en
el de enfermedad si se le administra oportunamente y con justa medida seguacuten la
constitucioacuten individual
El resveratrol contribuye al efecto cardioprotectivo del vino tinto ya que este compuesto ha demostrado inhibir la oxidacioacuten del LDL la peroxidacioacuten de liacutepidos la agregacioacuten plaquetaria y la siacutentesis de eicosanoides49 etapa inicial de la patogeacutenesis de la arteriosclerosis
Actualmente se estaacuten realizando numerosos estudios sobre las propiedades
del resveratrol de los cuales se le han atribuido diversas propiedades ldquoin vitrordquo e ldquoin
vivordquo como son
CAPIacuteTULO I Introduccioacuten
16
Proteccioacuten de las lipoproteiacutenas de baja densidad (LDL) frente a la oxidacioacuten50-52
Inhibicioacuten de la agregacioacuten plaquetaria y la siacutentesis de eicosanoides31 53 Proteccioacuten del hiacutegado de peroxidacioacuten de liacutepidos54 Estudios recientes en ratones han demostrado que ratones obesos cuya
dieta estaba suplementada con resveratrol no soacutelo son maacutes longevos sino ademaacutes maacutes activos presentando en menor medida los efectos negativos de una dieta hipercaloacuterica55
Reduccioacuten de la muerte celular por estreacutes oxidativo56 Propiedades antiinflamatorias debido a su efecto inhibidor sobre la
ciclooxigenasa57 Regulacioacuten del metabolismo de los liacutepidos34 Proteccioacuten cardiovascular como fitoestroacutegeno Efectos citoprotectores sobre el rintildeoacuten58 Propiedades anticanceriacutegenas puesto que inhibe la actividad de la enzima
protein-tirosina kinasa enzima implicada en la alteracioacuten de las ceacutelulas tumorales59 60
Previene enfermedades como el Parkinson y el Alzheimer
Auacuten no se han estudiado con profundidad las acciones beneacuteficas del resveratrol en funcioacuten de la dosis y no se sabe si los efectos observados ldquoin vitrordquo e ldquoin vivordquo se pueden extrapolar al ser humano En los estudios en animales y en los limitados estudios en humanos se ha observado que el resveratrol se absorbe en el aparato gastrointestinal Sin embargo la eficacia de su absorcioacuten asiacute como su distribucioacuten metabolismo y excrecioacuten no estaacute bien definida Hasta la fecha son escasos los estudios que se han realizado sobre el metabolismo del resveratrol en humanos si bien se ha puesto de manifiesto recientemente que el resveratrol se
CAPIacuteTULO I Introduccioacuten
17
metaboliza en el hiacutegado para producir metabolitos resveratrol-glucuroacutenido y resveratrol-sulfato52
Actualmente el resveratrol se comercializa para la investigacioacuten meacutedica ademaacutes tambieacuten estaacute disponible como complemento nutricional (no como un agente terapeacuteutico) en forma de extracto seco purificado cuya fuente principal son las uvas tintas En cuanto a las precauciones de uso se desaconseja para las personas que padecen trastornos mentales y hepaacuteticos graves y en mujeres embarazadas y en periodo de lactancia ademaacutes es un producto reservado a los adultos El isoacutemero cis y los isoacutemeros trans y cis del piceido son fisioloacutegicamente tan importantes como el trans-resveratrol cis-Resveratrol posee una actividad similar a la del isoacutemero trans inhibiendo a la enzima protein-tirosina kinasa61 y la agregacioacuten plaquetaria62 Los isoacutemeros de piceido tienen propiedades similares a los de resveratrol inhibiendo la agregacioacuten plaquetaria31 y la oxidacioacuten del LDL en humanos63 Por otra parte de una manera menos activa que el trans-resveratrol el trans-piceido reduce la elevacioacuten de los niveles lipiacutedicos64 e inhibe la siacutentesis de eicosanoides53
En los estudios llevados a cabo con Poligonum Cuspidatum se ha comprobado que la actividad bioloacutegica de piceido es bastante diferente que la de la aglicona no obstante el tracto digestivo humano tiene actividad glucosidasa65 de manera que es probable la liberacioacuten de la aglicona a partir del glucoacutesido durante la digestioacuten
CAPIacuteTULO I Introduccioacuten
18
Los compuestos fenoacutelicos de la uva
Dado que la gran mayoriacutea de los meacutetodos que se ponen a punto en este trabajo estaacuten basados en fluorescencia molecular y muchos de los integrantes de este grupo de sustancias presentan fluorescencia nativa o fotoinducida el uacuteltimo apartado de esta introduccioacuten general se dedica a la descripcioacuten del grupo de los compuestos fenoacutelicos en vino en el cual se engloba el resveratrol No obstante aparte de los compuestos fenoacutelicos merece la pena nombrar tambieacuten como potenciales fluoroacuteforos del vino los aminoaacutecidos fluorescentes triptoacutefano tirosina y fenilalanina asiacute como algunas vitaminas
Los constituyentes fenoacutelicos revisten una gran importancia en enologiacutea
debido al papel que juegan directa o indirectamente sobre la calidad de los vinos En efecto son el origen del color y de la astringencia siendo atribuida esta uacuteltima en particular a la presencia de taninos Ademaacutes seguacuten su naturaleza pueden tener un intereacutes nutricional y farmacoloacutegico
Desde el punto de vista quiacutemico los compuestos fenoacutelicos estaacuten
caracterizados por un nuacutecleo benceacutenico que lleva uno o varios grupos hidroxilos Los compuestos fenoacutelicos se clasifican en no flavonoides y flavonoides Estos uacuteltimos tienen un esqueleto en C6-C3-C6 Los polifenoles incluyen tambieacuten a los derivados (eacutesteres metil eacutesteres glucoacutesidos etc) que resultan de las sustituciones de la estructura base La reactividad de este tipo de moleacutecula es debida tanto a la presencia de la funcioacuten fenol que presenta un caraacutecter aacutecido como al nuacutecleo benceacutenico que puede sufrir sustituciones electrofiacutelicas
Los compuestos polifenoacutelicos estaacuten distribuidos en las distintas partes de la
uva pulpa hollejos pepitas y raspones De esta manera la transformacioacuten
CAPIacuteTULO I Introduccioacuten
19
tecnoloacutegica adoptada condiciona la extraccioacuten de los polifenoles a partir de las diferentes partes del racimo contribuyendo asiacute de manera esencial a la composicioacuten polifenoacutelica de los vinos Un conocimiento profundo de las diversas estructuras polifenoacutelicas presentes en la uva y de los mecanismos de su evolucioacuten durante el transcurso de la vinificacioacuten es una base indispensable en la evaluacioacuten de su papel en enologiacutea y en el desarrollo de los procesos tecnoloacutegicos adaptados a la vez a la materia prima y al tipo de producto deseado
Compuestos no flavonoides Esta denominacioacuten abarca a los aacutecidos fenoacutelicos divididos en aacutecidos
benzoacuteicos (C6-C1) y aacutecidos cinaacutemicos portadores de una cadena lateral insaturada (C6-C3) pero tambieacuten a otros derivados fenoacutelicos como los estilbenos
Aacutecidos fenoacutelicos
En la uva los aacutecidos fenoacutelicos son principalmente aacutecidos hidroxicinaacutemicos
que se encuentran en las vacuolas de las ceacutelulas del hollejo y de la pulpa bajo la forma de eacutesteres tartaacutericos En el vino se pueden encontrar en forma libre procediendo de la hidroacutelisis de otros polifenoles especialmente de los antocianos que se degradan en presencia de oxiacutegeno y calor lo que supone un mecanismo de la destruccioacuten del color o bien en forma combinada parcialmente esterificados especialmente con el aacutecido tartaacuterico o con aacutecidos hidroxicinaacutemicos destacando entre ellos los aacutecidos cafeoil tartaacuterico (aacutecido caftaacuterico) p-cumaroil tartaacuterico (aacutecido cutaacuterico) y feruloil tartaacuterico (aacutecido fertaacuterico) Figura 5 La forma natural es la trans pero los isoacutemeros cis largo tiempo confundidos con los derivados glucosilados tambieacuten existen aunque en deacutebil cantidad Soacutelo el derivado glucosilado del aacutecido trans-cutaacuterico ha podido ser identificado
CAPIacuteTULO I Introduccioacuten
20
Figura 5- Eacutesteres hidroxicinaacutemicos aacutecido trans-cafeoil tartaacuterico (R = OH) trans- p-cumaroil tartaacuterico (R = H) y trans-feruloil tartaacuterico (R = OCH3)
En lo que concierne a los aacutecidos benzoacuteicos la uva contiene principalmente aacutecido gaacutelico (Figura 6)
Figura 6- Aacutecido gaacutelico Estilbenos Es de destacar la presencia en la uva de otros compuestos fenoacutelicos como
el isoacutemero trans del resveratrol como aglicona o 3-β-D-glucoacutesido (piceido)
Compuestos Flavonoides Los flavonoides estaacuten caracterizados por un esqueleto de base de 15 aacutetomos de carbono (C6-C3-C6) de tipo 2-fenil benzopirona (Figura 7)
R
OHCC
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H
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O
OHC
COOH
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OH
OH
OH
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CAPIacuteTULO I Introduccioacuten
21
Figura 7- 2-Fenil benzopirona
Esta gran familia se divide en varias subclases que se distinguen por el
grado de oxidacioacuten de su nuacutecleo pirano Los flavonoides en sentido estricto basados en su estructura fenil-2-benzopirona estaacuten principalmente representados en la uva por los flavonoles mientras que los flavonoides en sentido amplio comprenden igualmente los flavanos 3-ol (3-flavanoles) y los antocianos Las estructuras generales de las subclases maacutes frecuentes en el vino se encuentran en la Figura 8
Figura 8- Estructuras quiacutemicas de las subclases de flavonoides maacutes usuales en el vino
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O
A C
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2
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6
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9
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1
2
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5
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CAPIacuteTULO I Introduccioacuten
22
Flavonoles
Estos flavonoides ldquoen sentido estrictordquo estaacuten uacutenicamente presentes en los hollejos bajo forma de glicoacutesidos en posicioacuten 3 En la Figura 9 se representan los cuatro flavonoles principales de la uva bajo su forma aglicona
Figura 9- Flavonoles de la uva kaempferol (R = H Rrsquo = H) quercetol (R = OH Rrsquo = H) miricetol (R = OH Rrsquo = H) e isoramnetol (R = OCH3 Rrsquo = H)
Las formas glucosiladas son las maacutes abundantes pero se encuentran
igualmente cantidades importantes de glucuroacutenidos
Flavanos 3-oles (3-Flavanoles)
Los flavanos 3-oles (3-flavanoles) estaacuten presentes en la uva en estado de monoacutemeros y bajo formas maacutes o menos polimerizadas que constituyen los taninos cateacutequicos En el seno de la baya de uva se localizan principalmente en las semillas aunque se han detectado tambieacuten trazas de monoacutemeros y diacutemeros en la pulpa
Los principales 3-flavonoles monoacutemeros de la uva son la (+)-catequina y su isoacutemero la (-)-epicatequina pudiendo ser encontrado este uacuteltimo bajo forma de
O
OH
HO
OH
R
R
OH
O
CAPIacuteTULO I Introduccioacuten
23
eacutester gaacutelico (3-galato de epicatequina) Las estructuras de los flavanoles monoacutemeros de la uva estaacuten representadas en la Figura 10
Figura 10- Estructura de los flavanoles monoacutemeros de la uva catequina (R1= H R2= OH R3= H) galocatequina (R1= H R2= OH R3= OH) epicatequina (R1= OH R2= H R3= H) y epigalocatequina (R1= OH R2= H R3= OH)
Flavanonoles y flavonas
Los compuestos pertenecientes a esta familia han sido identificados en el
hollejo de uva blanca Estos son la astilbina (3-ramnoacutesido del dihidroquercetol) y la engelatina (3-ramnoacutesido del dihidrokaempferol) cuyas estructuras se recogen en la Figura 11
Figura 11- Flavanonoles de la uva engeletina (R = H) y astilbina (R = OH)
O
4
6
8
OH
HO
OH
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OH
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OH
HO
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O
O
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CAPIacuteTULO I Introduccioacuten
24
En cuanto a las flavonas se han identificado hasta 7-glucoacutesidos de apigenol y luteolina en las hojas de Vitis vinifera Antocianos
Los antocianos representan una parte importante tanto a nivel cualitativo como cuantitativo de los flavonoides de la baya de uva tinta Contribuyen de manera preponderante al color de las especies tintas Desde un punto de vista general los antocianos se corresponden con unos glicoacutesidos de nuacutecleo flavilium polihidroxilado yo metoxilado Las formas agliconas que responden a la foacutermula general son denominados antocianidinas (o antocianidoles) Figura 12 y las formas heterosiacutedicas se denominan antocianinos siendo estas uacuteltimas maacutes estables
Figura 12- Estructura de los antocianidinas (forma flavilium)
Los antocianos se diferencian por sus niveles de hidroxilacioacuten y de
metilacioacuten por la naturaleza el nuacutemero y la posicioacuten de las osas unidas a la moleacutecula y tambieacuten por la naturaleza y el nuacutemero de los aacutecidos que esterifican los azuacutecares Los antocianos del geacutenero Vitis son cianidol peonidol delfinidol y malvidol (Figura 13) pero el contenido y la composicioacuten en antocianos en la uva variacutea enormemente en funcioacuten de la especie y de la variedad
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A
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3
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6
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CAPIacuteTULO I Introduccioacuten
25
Figura 13- Antocianidinas de la uva en forma de catioacuten flavilium cianidol (R = OH Rrsquo = H) peonidol (R = OCH3 Rrsquo = H) delfinidol (R = OH Rrsquo = OH) petunidol (R = OCH3 Rrsquo = OH) y malvidol (R = OCH3 Rrsquo = OCH3)
La V vinifera presenta la particularidad de contener uacutenicamente 3-
glucoacutesidos de antocianidoles mientras que otras especies del geacutenero Vitis contienen 35 diglucoacutesidos Las numerosas posibilidades de sustitucioacuten del nuacutecleo B y las funciones hidroxilo confieren a los antocianos propiedades especiacuteficas concretamente color y estabilidad que estaacuten directamente ligadas a la estructura Asiacute el aumento del nuacutemero de hidroxilos sobre el nuacutecleo B conduce al desplazamiento del maacuteximo de absorcioacuten hacia longitudes de onda maacutes altas (efecto batocroacutemico) lo que se traduce en una modificacioacuten del color de la moleacutecula Por otra parte la presencia de sustituyentes osiacutedicos se traduce en un ligero efecto hipsocroacutemico y aumenta la estabilidad de las moleacuteculas antociaacutenicas Por uacuteltimo la esterificacioacuten de los azuacutecares concretamente por aacutecidos hidroxicinaacutemicos estabiliza la moleacutecula y sus capacidades colorantes debido al establecimiento de interacciones hidroacutefobas intramoleculares (copigmentacioacuten intramolecular)
El color de los antocianos en solucioacuten depende del medio En efecto los antocianos existen en solucioacuten bajo diversas formas en equilibrio de colores diferentes Estos equilibrios estaacuten regidos por el pH de la solucioacuten A pH inferior a
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OH
HO
OH
R
R
CAPIacuteTULO I Introduccioacuten
26
2 la forma flavilium coloreada en rojo estabilizada por resonancia domina ampliamente Ademaacutes las interacciones de los antocianos entre ellos y con los otros constituyentes del medio (copigmentacioacuten) y la formacioacuten de complejos con los iones metaacutelicos se traducen en modificaciones del color
Taninos Bajo el nombre geneacuterico de taninos se agrupan una serie de sustancias
fenoacutelicas que pueden contener los vinos se clasifican en hidrolizables y condensados Los primeros se basan en fenoles no flavonoides y generalmente se encuentran en forma de eacutesteres y los taninos condensados son poliacutemeros maacutes o menos complejos derivados de los 3-flavanoles especialmente de la (+)-catequina y de la (-)-epicatequina Estas moleacuteculas presentan la propiedad de liberar antocianidinas en medio aacutecido y en caliente de donde toman el nombre de procianidinas o proantocinidinas
Los taninos condensados maacutes sencillos son las procianidinas diacutemeras que
se agrupan en dos categoriacuteas procianidinas tipo A (C30H26O12) y las procianidinas tipo B (C30H24O12) Figura 14 Del mismo modo tambieacuten existen procianidinas triacutemeras agrupadas en los tipos C y D
Figura 14- Estructuras de procianidinas diacutemeras
CAPIacuteTULO I Introduccioacuten
27
Otros taninos maacutes complejos son las procianidinas oligoacutemeros formados por 3 a 10 unidades de flavanoles asiacute como las procianidinas condensadas formadas por maacutes de 10 unidades de flavanoles alcanzando un peso molecular superior a 3000 o proantocianidoles
En definitiva las formas poliacutemeras cuya estructura general viene dada en la Figura 15 representan la mayor parte de los 3-flavanoles tanto de la uva como de los otros vegetales
Figura 15- Proantocianidoles de tipo B
Se localizan en el hollejo especialmente en las capas externas de la
hipodermis en forma libre dentro de las vacuolas de las ceacutelulas o en forma combinada estando ligados a los polisacaacuteridos de las paredes celulares Se encuentran tambieacuten de forma abundante en las pepitas localizados en la envoltura externa situada inmediatamente por debajo de la epidermis y tambieacuten en la envoltura interna que rodea al albumen La pulpa no contiene apenas taninos mientras que el raspoacuten posee una buena cantidad de estas sustancias
En general los contenidos en flavanoles de las semillas son siempre
superiores a los de los hollejos ya se trate de monoacutemeros oligoacutemeros o de poliacutemeros
O
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OH
HO
OH
R3
OH
R1
R2
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CAPIacuteTULO I Introduccioacuten
28
PARTE II ANTECEDENTES BIBLIOGRAacuteFICOS PARA EL ANAacuteLISIS DE RESVERATROL
La praacutectica totalidad de los meacutetodos encontrados en la bibliografiacutea para el anaacutelisis de resveratrol y compuestos relacionados hacen uso de teacutecnicas separativas fundamentalmente cromatografiacutea de liacutequidos de alta eficacia (LC) cromatografiacutea de gases (GC) y electroforesis capilar (CE)
Asiacute estas teacutecnicas se han utilizado para analizar dichos compuestos en
muestras muy diversas tales como alimentos entre ellos fundamentalmente uvas2166-71 cacahuetes79 72 araacutendanos73 o chocolate32 o bien en hojas de parra74 graacutenulos de luacutepulo75 76 y plantas77-80 usadas con fines medicinales
En general en las etapas previas de aislamiento y limpieza se utilizan
diferentes teacutecnicas separativas tales como extraccioacuten soacutelido-liacutequido (SPE) extraccioacuten liacutequido-liacutequido (LLE) y extraccioacuten con fluidos supercriacuteticos (SFE) para obtener finalmente una disolucioacuten de resveratrol y los restantes compuestos de intereacutes que se analiza mediante cromatografiacutea
En cuanto a los meacutetodos encontrados para anaacutelisis de estos compuestos
en vino en la Tablas 2 3 y 4 se recogen los antecedentes encontrados acerca de los meacutetodos mediante cromatografiacutea liacutequida electroforesis capilar y cromatografiacutea de gases respectivamente En este uacuteltimo caso la separacioacuten se acopla generalmente a la espectrometriacutea de masas
En cromatografiacutea de liacutequidos se utiliza maacutes frecuentemente cromatografiacutea
en fase inversa y los detectores usuales son el detector de serie de diodos (DAD) el detector fluorescente (FLD) o el espectroacutemetro de masas (MS) Tambieacuten se han usado en algunos casos detectores electroquiacutemicos (ECD)
CAPIacuteTULO I Introduccioacuten
29
Tambieacuten se encuentran algunos meacutetodos de cromatografiacutea en capa fina en concreto el desarrollado por Chen et al81 que muestran la utilidad del anaacutelisis de resveratrol y piceido para distinguir raacutepidamente entre vinos naturales y falseados y el de Kiraly-Veghely et al82 que utilizan cromatografiacutea en placa a elevada presioacuten y encuentran mayores contenidos de piceido que de aglicona
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CAPIacuteTULO I Introduccioacuten
55
APARATOS REACTIVOS Y SOFTWARE UTILIZADOS EN ESTE TRABAJO DE INVESTIGACIOacuteN
Se recoge a continuacioacuten el instrumental asiacute como los reactivos disoluciones y los programas informaacuteticos utilizados para la realizacioacuten de esta memoria a) Aparatos
diams Espectrofluoriacutemetro Perkin Elmer LS-50B equipado con una
laacutempara de descarga de Xenon equivalente a 20 KW durante 8 s de duracioacuten y conectado a traveacutes de una interfase RS-232 a un PC IBM PS2 La adquisicioacuten de datos se lleva a cabo con el software de Perkin-Elmer Fluorescence Data Manager versioacuten 270
diams Espectrofluoriacutemetro Varian Modelo Cary Elipse equipado con
una laacutempara continuacutea de Xenon Estaacute conectado a un PC viacutea una interfase IEE El paquete de sofware Cary Eclipse Versioacuten 10 se utilizoacute para la adquisicioacuten e interpretacioacuten de datos
diams Espectrofotoacutemetro UV-Visible Varian modelo Cary 50 Bio con
laacutempara de Xenon ordenador DELL Optiplex GX 280 Intel Pentium 4 incorporado y software propio de Varian
diams Cromatoacutegrafo Agilent 1100 Series (Agilent Technologies Inc
Palo Alto CA USA) compuesto por una bomba cuaternaria Agilent un desgasificador de disolventes G1322A Agilent un detector de fotodiodos G1315B Agilent UV-Vis y un detector fluorescente
CAPIacuteTULO I Introduccioacuten
56
G1321A Agilent El sistema cromatograacutefico estaacute controlado por el HP ChemStation para LC 3D software (Agilent Technologies Inc)
diams Cromatoacutegrafo Agilent 1100 Series (Agilent Technologies
Waldbronn Alemania) equipado con un inyector automaacutetico termostatizado a 6 ordmC y un espectromeacutetro de masas de trampa ioacutenica (MSD XCT) conectados a traveacutes de una interfase de ionizacioacuten mediante electrospray (ESI) Se realiza un barrido desde mz 100 hasta 2200 con una velocidad de 27000 amus
diams Potenciostato Autolab PSTAT 10 y stand Metrohm 663VA
dotado de una celda con tres electrodos uno de AgAgCl (electrodo de referencia) otro de platino (electrodo auxiliar) y el tercero de carboacuten vitrificado (electrodo de trabajo Metrohm 61204040) estando controlado todo el sistema por un PC 48666 MHz equipado con el paquete de software GPES 34
diams Espectroacutemetro de resonancia magneacutetica nuclear Broker AM 400
(400 MHz para protones y 100 MHz para 13C)
diams pH-metro Crison 2001 con electrodo combinado de vidrio-
calomelanos saturado
diams Laacutempara de mercurio HBO Osram de 200 W con una fuente de
energiacutea Oriel modelo 8500 protegida con una carcasa metaacutelica
CAPIacuteTULO I Introduccioacuten
57
diams Fotoreactor (Softron Gynkotek HPLC Alemania) equipado con
una laacutempara de Xenon de 4 W y un tubo de tefloacuten enrollado alrededor
diams Bantildeo termostaacutetico Frigiterm 6000382 marca p-Selecta
diams Balanza analiacutetica ER-60A marca AND con una sensibilidad de
plusmn 01 mg
diams Sistema de obtencioacuten de agua ultrapura Milli-Q equipado con un
moacutedulo RIOsElix y un A-10 b) Reactivos
diams trans-Resveratrol (34 5-trihidroxi-trans-estilbeno) suministrado
por Sigma-Aldrich nuacutemero CAS 501-36-0
diams trans-Piceido (345-trihidroxiestilbeno-3-β-D-glucopiranosa)
suministrado por Aldrich Chem Co nuacutemero CAS 65914-17-2
diams Fenantreno 98 suministrado por Aldrich Chem
diams trans-Estilbeno suministrado por Aldrich Chem
diams cis-Estilbeno suministrado por Aldrich Chem
diams Aacutecido gaacutelico suministrado por Sigma-Aldrich
diams Aacutecido p-cumaacuterico suministrado por Sigma-Aldrich
diams Aacutecido egaacutelico suministrado por Sigma-Aldrich
diams Aacutecido feruacutelico suministrado por Sigma-Aldrich
diams Quercetina suministrado por Sigma-Aldrich
diams Rutina suministrado por Sigma-Aldrich
CAPIacuteTULO I Introduccioacuten
58
diams Catequina suministrado por Sigma-Aldrich
diams Epicatequina suministrado por Sigma-Aldrich
diams Aacutecido vanillico sumistrado por Fluka
diams Aacutecido cafeiacuteco sumistrado por Fluka
diams Aacutecido sinaacutepico sumistrado por Fluka
diams Tartrato disoacutedico dihidratado suministrado por Scharlau
diams Perclorato soacutedico monohidratado suministrado por Merck
diams Aacutecido percloacuterico 70 suministrado por Merck
diams Aacutecido fosfoacuterico suministrado por Panreac
diams Aacutecido clorhiacutedrico suministrado por Panreac
diams Reactivo de Folin-Ciocalteu suministrado por Panreac
c) Disoluciones
diams Disolucioacuten etaacutenolica de trans-resveratrol de 100 μgmL-1
conservada en la obscuridad y a 4 ordmC
diams Disolucioacuten etaacutenolica de trans-piceido de 100 μgmL-1
conservada en la obscuridad y a 4 ordmC
diams Disolucioacuten reguladora tartrato monosoacutedico tartrato disoacutedico de
pH 50 preparada a partir de la sal disoacutedica dihidratada (026 M) y antildeadiendo HCl hasta conseguir el pH deseado
d) Disolventes
diams Etanol suministrado por Panreac (Espantildea)
diams NN-Dimetilformamida suministrado por Panreac (Espantildea)
diams Dimetilsulfoacutexido suministrado por Panreac (Espantildea)
CAPIacuteTULO I Introduccioacuten
59
diams Cloroformo suministrado por Panreac (Espantildea)
diams Metanol suministrado por Panreac (Espantildea)
diams Acetonitrilo grado HPLC suministrado por Merck (Alemania)
diams Eacuteter dietiacutelico grado HPLC suministrado por Merck (Alemania)
diams Acetato de etilo suministrado por Panreac (Espantildea)
diams Hexano grado HPLC suministrado por Merck (Alemania)
e) Programas informaacuteticos
diams Grapher 30 2-D Graphing System Golden Software Inc
Colorado Usa 2001
diams PLS Toolbox (Eigenvector Research Inc WA USA)
diams MATLAB ver 710 The MathWorks Inc MA USA
diams Software THE UNSCRAMBLER Versioacuten 611 (Camo AS Olav
Tryggvasonsgt N-7011 Trondheim Norway) utilizado tanto para el disentildeo de experimentos permitiendo la optimizacioacuten a traveacutes de las superficies de respuesta como para el tratamiento de datos multivariantes permitiendo entre otros meacutetodos aplicar Anaacutelisis de Componentes Principales (PCA) con fines clasificatorios
diams ACOC V 20 163 Herramienta estadiacutestica para Quiacutemica Analiacutetica
en entorno MATLAB 53 programa realizado en el Departamento de Quiacutemica Analiacutetica de la UEX que permite realizar todos los caacutelculos de la calibracioacuten univariante calcular los distintos
CAPIacuteTULO I Introduccioacuten
60
paraacutemetros estadiacutesticos y de calidad de las rectas de calibrado asiacute como para aplicar diversos test de comparacioacuten
diams HyperChem trade versioacuten 75 para Windows Molecular modeling
system 2002 Hypercube inc
CAPIacuteTULO I Introduccioacuten
61
Bibliografiacutea 1 J Gorham ldquoThe Stilbenoidsrdquo en ldquoProgress in Phytochemistryrdquo L Reinhold JB Harborne T Swain Eds Pergamon Press Oxford UK 203 (1980) 2 wwwbiologieuni-freiburgdedatabio2schoroederResveratrol 3 Moreno-Mantildeas M Pleixats R Anal Quim 1985 81157-161 4 Takaoka M J J Faculty Sci Hokkaido Imperial U 1940 31-16 5 Vastano BC Chen Y Zhu N Ho CT Zhou Z Rosen RT J Agric Food Chem 2000 48253-256 6 Lee SK Mbwambo ZH Chung H Luyengi L Gamez EJ Mehta RG Kinghorn A D Pezzuto JM Comb Chem HighThroughput Screen 1998 135-46 7 Cichewicz RH Kouzi SA J Nat Prod Chem 2002 26507-579 8 Langcake P Price RJ Physiol Plant Pathol 1976 977-86 9 Hahn MG Ann Rev Phytopathol 1996 34387-412 10 Keen NT Plant Mol Biol 1992 1909-122 11 Sticher L Mauch-Mani B Meacutetraux J P Annu Rev Phytopathol 1997 35325-370 12 Osbourn AE Fungal Genet Biol 1999 26163-168 13 Kuc J Ann Rev Phytopathol 1995 33275-297 14 Stein U Hoos G Vitis 1984 23179-194 15 Dercks W Creasy LL Physiol Mol Plant Pathol 1989 34189-202 16 Hoos G Blaich R J Phytopathol 1990 129102-110 17 Sarig P Zutkhi Y Monjauze A Lisker N Ben-Arie R Physamp Mol Plant Pathol 1997 50337-347 18 Adrian M Jeandet P Bessis R Joubert J M J Agric Food Chem 1996 441979-1981 19 Schubert R Fischer R Hain R Schreier R Bahnweg G Ernst D Sandermann H Plant Mol Biol 1997 34417-426 20 Hrazdina G Parsons GF Mattick LR Am J Enol Vitic 1985 35220-227 21 Hain R Reif HJ Krause E Langebartels R Kindl H Vornam B Wiese W Schmelzer E Schreier H Stocker R H Nature 1993 361153-156 22 Cantos E Espiacuten JC Tomaacutes-Barberaacuten A J Agric Food Chem 2001 495052-5058
CAPIacuteTULO I Introduccioacuten
62
23 Cantos E Espiacuten JC Tomaacutes-Barberaacuten A J Agric Food Chem 2002 506322-6329 24 Cantos E Espiacuten JC Fernaacutendez MJ Oliva J Tomaacutes-Barberaacuten F J AgricFood
Chem 2003 511208ndash1214 25 Celotti E Ferrarini R Zironi R Conte L S J Chromatogr A 1996 73047-52 26 Creasy LL Coffee M J Am Soc Hortic Sci 1988 113230-234 27 Chen RS Wu PL Chiou R Y J Agric Food Chem 2002 501665-1667 28 Sobolev VS Cole RJ J Agric Food Chem 1999 471435-1439 29 Burns J Yokota T Ashihara H Lean ME Crozier A J Agric Food Chem 2002 503337-3340 30 Hanawa F Tahara S Mizutani J Phytochemistry 1992 313005-3007 31 Chung MI Teng CM Cheng KL Ko FN Lin CN Planta Med 1992 58274-276 32 Kumar RJ Jyostna D Krupadanam GL Srimannarayana G Phytochemistry 1988 273625-3626 33 Counet C Callemien D Collin S Food Chem 2006 98649-657 34 Siemann EH Creasy LL Am J Enol Vitic 1992 4349-52 35 Jaendet P Bessis R Maume BF Meunier P Trollat P J Agric Food Chem 1995 43316-319 36 Jeandet P Bessis R Maume BF Sbagui M J Wine Res 1993 479-85 37 Waterhouse AL Lamuela-Raventoacutes RM Phytochemistry 1994 37571-573 38 Roggero JP Archier P Sciences des Aliments 1994 1499-107 39 Lamuela Raventoacutes RM Romero Peacuterez AI Waterhouse AL de la Torre Boronat MC J Agric Food Chem 1995 43281-283 40 Romero Peacuterez AI Lamuela Raventoacutes RM Waterhouse AL de la Torre Boronat MC J Agric Food Chem 1996 44 2124-2128 41 Freacutemont L Life Sciences 2000 66663-673 42 Lamuela-Raventoacutes RM Waterhouse AL J Agric Food Chem 1993 41521-523 43 Goldberg DM Yan J Diamandis EP Karumanchiri A Soleas G Waterhouse AL Anal Chem 1994 663959-3963 44 McMurtrey KD Minn J Pobanz K Schultz TP J Agric Food Chem 1994 422077-2080
CAPIacuteTULO I Introduccioacuten
63
45 Goldberg DM Karumanchiri A Ng E Yan J Diamandis EP Soleas GJ J Agric
Food Chem 1995 431245-1250 46 Lamikanra O Grimm CC Rodin JB Inyang ID J Agric Food Chem 1996 441111-1115 47 Sato M Suzuki Y Okuda T Yokotsuka K Biosci Biotech Biochem 1997 611800-1805 48 Chu QY Dwyer MO Zeece MG J Agric Food Chem 1998 46509-513 49 Pervaiz S FASEB J 2003 171975-1985 50 Frankel EN Waterhouse AL Kinsella JE Lancet 1993 3411103-1104 51 Belguendouz L Fremont L Linard A Biochem Pharmacol 1997 531346-1355 52 Urpiacute Sardaacute M Jaacuteuregui O Lamuela Raventoacutes RM Jaeger W Miksits M Cobas MI Andreacutes Lacueva C Anal Chem 2005 773149-3155 53 Kimura Y Okuda H Arichi S Biochim Biophys Acta 1985 834275-278 54 Kimura Y Ohminami H Okuda H Baba K Kozawa M Planta Med 1983 4951-54 55 Baur JA Pearson KJ Price NL Jamieson HA Lerin C Kalra A Prabhu VV Allard JS Loacutepez-Lluch G Lewis K Pistell PJ Poosala S Becker KG Boss O Gwinn D Wang M Ramaswamy S Fishbein KW Spencer RG Lakatta EG Le Couteur D Shaw R J Navas P Puigserver P Ingram DK de Cabo R Sinclair DA Nature 2006 444337-342 56 Chantavitayapongs S Draczynska Lusiak B Sun AY Neuroreport 1997 81499-1502 57 Shin NH Ryu SY Lee H Min KR Kim Y Planta Medica 1998 64283-284 58 Giovannini L Migliori M Longoni BM Das DK Bertelli AA Panichi V Filippi C Bertelli A J Cardiovascular Pharm 2001 37262-270 59 Jang M Cai L Udeani GO Slowing KV Thomas CF Beecher CWW Fong HHS Farnsworth NR Kinghorn AD Mehta RG Moon RC Pezzuto JM Science 1997 275218-220 60 Mgbonyebi OP Russo J Russo IH Int J Oncol 1998 12865-869 61 Jayatilake GS Jayasuriya H Lee ES Koonchanok NM Geahlen RL Ashendel CL McLaughlin JL Chang CJ J Nat Prod 1993 561805-1810
CAPIacuteTULO I Introduccioacuten
64
62 Bertelli AAE Giovannini L De Caterina F Miglioni M Bernini W Fregoni M Bavaresco J Trevisan M Antiplatelet Activity of cis-resveratrol Feuillet Bleu 25 Office International de la Vigne et du Vin Paris France 1996 63 Meacuterillon JM Fauconneau B Waffo P Barrier L Decendit A Huguet F Antioxidant
activity of wine phenolic compounds in hinhibiting oxidation of human low-density
lipoproteins Presented at the 18th International Conference on Polyphenols Polyphenols Communications 96 Bordeaux (France) July 1996
64 Arichi H Kimura Y Okuda H Baba K Kozawa M Arichi S Chem Pharm Bull 1982 301766-1770 65 Hackett AM The metabolism of flavonoid compounds in mammals En Plant Flavonoids
in Biology and Medicine Cody V Middleton E Harborne J B Eds Liss New York 1986 pp 177-194 66 Pintildeeiro Z Palma M Barroso CG J Chromatogr A 2006 111061-65 67 Chafer A Pascual-Marti MC Salvador A Berna A J Sep Sci 2005 282050-2056 68 Roldaacuten A Palacios V Caro I Peacuterez L J Agric Food Chem 2003 511464-1468 69 Cantos E Espiacuten JC Tomaacutes-Barberaacuten FA Agric Food Chem 2002 505691-5696 70 Schmandke H Ernaumlhrungs-Umschau 2002 49349-352 71 Romero-Peacuterez AI Lamuela-Raventoacutes RM Andreacutes-Lacueva C de la Torre-Boronat MC J Agric Food Chem 2001 49210-215 72 Rudolf JL Resurreccion AVA Food Chem 2005 89623-638 73 Lyons M Chongwoo Y Toma R Cho S Reiboldt W Lee J van Breemen R J Agric
Food Chem 2003 515867-5870 74 Jimeacutenez Saacutenchez JB Crespo Corral E Santos Delgado MJ Orea JM Gonzaacutelez Urentildea A J Chromatogr A 2005 1074 133-138 75 Jerkovik V Callemien D Collin S J Agric Food Chem 2005 534202-4206 76 Callemien D Jerkovic V Rozenberg R Collin S J Agric Food Chem 2005 53424-429 77 Jandera P Škeřiacutekovaacute V Řehovaacute L Haacutejek T Baldriaacutenovaacute L Škopovaacute G Kellner V Horna A J Sep Sci 2005 28 1005-1022 78 Zhao RZ Shaojun L Zhou Li-Lin Chromatographia 2005 61 311-314
CAPIacuteTULO I Introduccioacuten
65
79 Yang F Zhang T Ito Y J Chromatogr A 2001 919443-448 80 Chen L Han Y Yang F Zhang T J Chromatogr A 2001 907343-346 81 Chen M Shu YQ He JG Chinese J Anal Chem 2005 33635-638 82 Kiraly-Veghely Z Katay G Tyihak E Merillon JM J Planar Chromatogr 2004 174-8 83 Loacutepez-Hernaacutendez J Paseiro-Losada P Sanches-Silva A Lage-Yusty MA Eur Food
Res Technol 2008 DOI 101007s00217-006-0483-x 84 Gurbuz O Goccedilmen D Dagdelen F Gursoy M Aydin S Sahin I Buyukuysal L Usta M Food Chem 2007 100518-525 85 Rodriacuteguez-Bernaldo de Quiroacutes A Loacutepez-Hernaacutendez J Feraces-Casais P Lage-Yusty MA J Sep Sci 2007 301262-1266 86 Bravo MN Silva S Coelho AV Vilas Bolas L Bronze MR Anal Chim Acta 2006 56384-92 87 Nikfardjam MSP Mark L Avar P Figler M Ohmacht R Food Chem 2006 98453-462 88 Nikfardjam MSP Laszlo G Dietrich H Food Chem 2006 9674-79 89 Loredana La Torre G Saitta M Vilasi F Pellicano T Dugo G Food Chem 2006 94640-650 90 Gerogiannaki-Christopoulou M Athanasopoulo P Kyriakidis N Gerogiannaki IA Spanos M Food Control 2006 17700-706 91 Abril M Negueruela A I Peacuterez C Juan T Estopantildeaacuten G Food Chem 2005 92729-736 92 Vitrac X Bornet A Vanderlinde R Valls J Richard T Delaunay JC Meacuterillon JM Teisseacutedre PL J Agric Food Chem 2005 53 5664-5669 93 Zhang Q Cui H Aung M Lian M Liu L J Chromatogr A 2005 1095 94-101 94 Abert Vian M Tomao V Gallet S Coulomb PO Lacombe JM J Chromatogr A 2005 1085 224-229 95 Clare SS Skurray GR Shalliker RA Australian J Grape and Wine Res 200 119-14 96 Monagas M Bartolome B Goacutemez-Cordoves C European Food Res Tech 2004 220331-340
CAPIacuteTULO I Introduccioacuten
66
97 Mark L Nikfardjam MSP Avar P Ohmacht R J Chromatogr Sci 2005 43445-449 98 Qin S Min C Yun DQ Feng L Chinese J Chromatog 2005 2388-91 99 Zhou J Cui H Wan G Xu H Pang Y Duan C Food Chem 2004 88613-620 100 Kolouchovaacute Hanzliacutekovaacute I Melzoch K Filip V Smidrkal J Food Chem 2004 87151-158 101 Loredana La Torre G Laganagrave G Bellocco E Vilasi F Salvo F Dugo G Food
Chem 2004 85259-266 102 Moreno Labanda JF Mallavia R Perez-Fons L Lizama V Saura D Micol V J
Agric Food Chem 2004 525396-5403 103 Kammerer D Claus A Carle R Scheiber A J Agric Food Chem 2004 524360-4367 104 Kerem Z Bravdo B Shoseyov O Tugendhaft Y J Chromatogr A 2004 1052211-215 105 Gambelli L Santaroni GP J Food Comp Anal 2004 17613-618 106 Clare SS Skurray G Shalliker RA Am J Enol Vitic 2004 55401-406 107 Skerikova V Grynova L landera P Chem List 2004 98343-348 108 Dugo G Saitta M Giuffrida D Vilasi F La Torre GL Italian J Food Sci 2004 16305-321 109 Rehova L Skerkova V Jandera P J Sep Sci 2004 271345-1359 110 Xiaoging Z Jiang Y Zhiuru X Chinese J Chromatog 2004 22424-427 111 Gil AM Duarte IF Godejohann M Braumann U Maraschin M Sprau M Anal
Chim Acta 2003 48835-51 112 Ali A Strommer JN J Agric Food Chem 2003 517246-7251 113 Pozo Bayoacuten M Hernaacutendez M Martiacuten-Aacutelvarez P Polo MC J Agric Food Chem 2003 512089-2095 114 Poussier M Guilloux-Benatier M Torres M Heras E Adrian M Am J Enol Vitic 2003 54 261-266 115 Cantos E Tomaacutes-Barberaacuten FA Martiacutenez A Espiacuten JC Europ Food ResTech 2003 217253-258
CAPIacuteTULO I Introduccioacuten
67
116 Vitrac X Monti JP Vercauteren J Deffieux G Meacuterillon JM Anal Chim Acta 2002 458103-110 117 Rodriacuteguez Delgado MA Gonzaacutelez G Peacuterez-Trujillo JP Garciacutea-Montelongo FJ Food Chem 2002 76371-375 118 Landrault N Larronde F Delaunay JC Castagnino C Vercauteren J Merillon JM Gasc F Cros G Teissedre PL J Agric Food Chem 2002 502046-2052 119 Wang Y Catana F Yang Y Roderick R van Breeman R J Agric Food Chem 2002 50431-435 120 Castellari M Sartini E Fabiani A Arfelli G Amati A J Chromatogr A 2002 973221-227 121 Franco M Coloru GC Del Caro A Emonti G Farris G Manca G Massa TG Pinna G Europ Food Res Technol 2002 214221-225 122 Yoshihiro Y Keita Y Akihiko N Masanori K Masao O J Japanese Soc Food
Sci Technol 2002 49220-227 123 Malovanaacute S Garciacutea Montelongo FJ Peacuterez JP Rodriacuteguez-Delgado MA Anal Chim
Acta 2001 428245-253 124 Kallithraka S Arvanitoyannis I El-Zajouli A Kefalas P Food Chem 2001 75 355-363 125 Martiacutenez-Ortega MV Garciacutea-Parrilla MC Troncoso AM Food Chem 2001 73 11-16 126 Stecher G Huck CW Popp M Bonn GK Fresenius J Anal Chem 2001 37173-80 127 Loacutepez M Martiacutenez F Del Valle C Orte C Miroacute M J Chromatogr A 2001 922359-363 128 Domiacutenguez C Guilleacuten DA Barroso CG J Chromatogr A 2001 918303-310 129 Rodriacuteguez Delgado MA Malovanaacute S Peacuterez JP Borges T Garciacutea Montelongo FJ J Chromatogr A 2001 912249-257 130 Souto AA Carneiro MC Seferin M Senna MJH Conz A Gobbi KJ Food Comp
Anal 2001 14441-445 131 Vanhoenacker G De Villiers A Chromatographia 2001 54309-315 132 Revilla E Ryan J M J Chromatogr A 2000 881461-469
CAPIacuteTULO I Introduccioacuten
68
133 Roggero JP J Food Comp Anal 2000 1393-97 134 Vintildeas P Loacutepez-Erroz C Mariacuten-Hernaacutendez JJ Hernaacutendez-Coacuterdoba M J
Chromatogr A 2000 87185-93 135 Ribeiro de Lima MT Waffo Teacuteguo P Teissedre PL Pujolas A Vercauteren J Cabanis JC Meacuterillon JM J Agric Food Chem 1999 472666-2670 136 Romero Peacuterez AI Ibern Goacutemez M Lamuela Raventoacutes RM de la Torre Boronat MC J Agric Food Chem 1999 471533-1536 137 Okuda T Yokotsuka K Am J Enol Vitic 1996 4793-99 138 Jeandet P Breuil AC Adrian M Weston LA Debord S Meunier P Maume G Bessis R Anal Chem 1997 695172-5177 139 Goldberg DM Tsang E Karumanchiri A Diamandis EP Soleas G Ng E Anal
Chem 1996 681688-1694 140 Romero Peacuterez AI Lamuela Raventoacutes RM Waterhouse AL de la Torre Boronat M C J Agric Food Chem 1996 442124-2128 141 Trela BC Waterhouse AL J Agric Food Chem 1996 441253-1257 142 Romero Peacuterez AI Lamuela Raventoacutes RM Buxaderas S de la Torre Boronat MC J
Agric Food Chem 1996 441975-1978 143 Jeandet P Bessis R Maume B F Meunier P Peyron D Trollat P J Agric Food
Chem 1995 43316-319 144 Roggero JP Garciacutea Parrilla C Sci Aliments 1995 15411-422 145 Goldberg DM Ng E Karumanchiri A Yan J Diamandis EP Soleas GJ J
Chromatogr A 1995 70889-98 146 Pezet R Pont V Cuenat P J Chromatogr A 1994 663191-197 147 Fan E Zhang K Chromatographia 2005 62289-294 148 Spanilaacute M Pazourek J Farkovaacute M Havel J J Chromatogr A 2005 1084180-185 149 Peng Y Chu Q Liu F Ye J J Agric Food Chem 2004 52153-156 150 Peng YY Chu QC Ye JN Am Lab 2004 3640-44 151 Demianovaacute Z Siren H Kuldvee R Riekkola ML Electrophoresis 2003 244264-4271
CAPIacuteTULO I Introduccioacuten
69
152 Minussi R Rossi M Bologna L Cordi L Rotilio D Pastore GM Duran N Food
Chem 2003 82409-416 153 Dobiaacutesovaacute Z Pazourek J Havel J Electrophoresis 2002 23263-267 154 Gao L Chu Q Ye J Food Chem 2002 78255-260 155 Brandolini V Maietti A Tedeschi P Durini E Vertuani S Manfredini S J Agric
Food Chem 2002 507407-7411 156 Chen YH Chung YL Lin CH J Chromatogr A 2002 943287-294 157 Lin CH Chen YH Electrophoresis 2001 222574-2579 158 Flamini R Dall Vedova A Rapid Commun Mass Spectrom 2004 181925-1931 159 Shao Y Marriot P Huumlgel H Chromatographia 2003 57S349-S353 160 Luan T Li G Zhang Z Anal Chim Acta 2000 42419-25 161 Soleas GJ Goldberg DM Diamandis EP Karumanchiri A Yan J Ng E Am J
Enol Vitic 1995 46346-352 162 Goldberg DM Yan J Ng E Diamandis EP Karumanchiri A Soleas GJ Waterhouse AL Am J Enol Vitic 1995 46159-165 163 Espinosa-Mansilla A Muntildeoz de la Pentildea A Gonzaacutelez Goacutemez D Chem Educator 2005 101-9
CAPIacuteTULO II
DETERMINACIOacuteN DE RESVERATROL EN VINO MEDIANTE FLUORESCENCIA FOTOINDUCIDA
DE SEGUNDA DERIVADA Y EXTRACCIOacuteN LIacuteQUIDO-LIacuteQUIDO
CAPIacuteTULO II Determinacioacuten fluorimeacutetrica de resveratrol en vino
72
CAPIacuteTULO II Determinacioacuten fluorimeacutetrica de resveratrol en vino
73
ANTECEDENTES Como ya se explicado en la introduccioacuten general de esta memoria el resveratrol (34acute5-trihidroxiestilbeno) es un estilbenoide producido por ciertas plantas como respuesta a infecciones fuacutengicas o a un estreacutes abioacutetico producido por ejemplo por iones metaacutelicos Aparece en moras cacahuetes y uvas Concretamente en uvas forma parte del amplio grupo de compuestos polifenoacutelicos presentes en la piel pulpa y semilla que se extraen parcialmente en la elaboracioacuten del vino y son responsables de caracteriacutesticas sensoriales de eacutestos como color sabor astringencia o dureza El rango en que se puede encontrar la concentracioacuten del resveratrol en los vinos es muy amplio Asiacute en la bibliografiacutea se encuentran valores comprendidos entre 066 μgmiddotmLminus1 a menos de 068 ngmiddotmLminus1 para vinos tintos y desde 100 a menos de 023 ngmiddotmLminus1 para vinos blancos1 y seguacuten los datos maacutes recientes2 el vino tinto contiene una media de 19 plusmn 17 μg trans-resveratrolmL siendo no detectable esta compuesto en algunos vinos y el comportamiento es similar respecto a los niveles de cis No se puede decir que exista una regioacuten o variedad que produzca vinos con contenidos significativamente diferentes del resto
La diferente concentracioacuten en vinos estaacute motivada tanto por factores relacionados con el cultivo variedad de uva factores ambientales en la vintildea tiempo de vendimia como por factores relacionados con la elaboracioacuten del vino3
Tambieacuten se ha explicado en la introduccioacuten que el resveratrol presenta un
equilibrio cis-trans y que cuando el trans-resveratrol en disolucioacuten alcohoacutelica se
1 Siemann EH Creasy LL Am J Enol Vitic 19924349ndash52 2 Stervbo U Vang O Bonnesen C Food Chem 2007 101449 ndash457 3 Kallithraka S Arvanitoyannis I El-Zajouli A Kefalas P Food Chem 2001 75355ndash363
CAPIacuteTULO II Determinacioacuten fluorimeacutetrica de resveratrol en vino
74
somete a irradiacioacuten con luz UV intensa se induce primero la isomerizacioacuten a cis-resveratrol y posteriormente la formacioacuten de un compuesto muy fluorescente4 5 El cis-resveratrol no estaacute presente en las uvas pero siacute lo estaacute en los vinos6
En cuanto a los meacutetodos de anaacutelisis de resveratrol encontrados en la bibliografiacutea se han utilizado ampliamente las teacutecnicas de separacioacuten como cromatografiacutea de liacutequidos o gases y electroforesis capilar78 en diferentes alimentos
Asiacute en los uacuteltimos antildeos la mayoriacutea de los meacutetodos publicados para el anaacutelisis de trans-resveratrol en vinos son meacutetodos de cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia (HPLC) y muchos de ellos se recogen en un artiacuteculo publicado en el antildeo 20059 que realiza una extensa revisioacuten de los meacutetodos de HPLC para el anaacutelisis de este compuesto en diferentes producto alimenticios En esta revisioacuten se pone de manifiesto que la mayoriacutea son meacutetodos de fase inversa (RP) utilizando metanol o acetonitrilo como disolventes orgaacutenicos y aacutecido aceacutetico para modificar la acidez de la fase acuosa En muchos casos se hace uso de una elucioacuten en gradiente y en lo referente a la deteccioacuten se utilizan sobre todo detectores de serie de diodos y las longitudes de onda seleccionadas son 300-308 nm para trans-resveratrol y 285-286 nm para cis-resveratrol En algunos casos tambieacuten se utilizan otros detectores que proporcionan mejor sensibilidad como detectores fluorescentes o electroquiacutemicos En el caso de la deteccioacuten fluorescente las longitudes de ondas utilizadas son 324-330370 y 260370 nm para trans- y cis-resveratrol respectivamente Maacutes
4 Roggero JP Garcia-Parrilla C Sci Aliments 1995 15411ndash422 5 Roggero JP J Food Comp and Anal 200 1393-97 6 Trela BC Waterhouse AL J Agric Food Chem 1996 441253-1257 7 Orea JM Montero C Jimeacutenez JB Gonzaacutelez Urentildea A Anal Chem 2001 735921ndash5929 8 Gu X Chu Q OrsquoDwyer M Zeece M J Chromatogr A 2000 881471ndash481 9 Rudolf JL Resurreccion VA Saalia FK Phillips RD Food Chem 2005 89623-638
CAPIacuteTULO II Determinacioacuten fluorimeacutetrica de resveratrol en vino
75
recientemente X Vitrac et al10 utilizan los pares 300390 para el trans y 260400 nm para el cis y Z Pintildeeiro et al11 llevan a cabo la deteccioacuten de trans-resveratrol a 310403 nm en un medio aacutecido aceacutetico al 01 en 7030 aguametanol aportando los espectros fluorescentes de ambos compuestos en dicho medio
Seguacuten los resultados anteriormente expuestos las caracteriacutesticas
fotomeacutetricas y fluorimeacutetricas de estos compuestos se recogen en diferentes artiacuteculos Podemos mencionar el publicado por Trela y Waterhouse6 que comparan los espectros UV y los valores de absortividad molar que obtienen para ambos isoacutemeros en etanol con los resultados reportados por otros autores y hacen un estudio del proceso de isomerizacioacuten inducido fotoquiacutemicamente Seguacuten estos autores las disoluciones de trans-resveratrol en etanolagua 5050 son estables al menos 28 diacuteas (CV lt 47 ) a pH entre 1 y 7 si se protegen de la luz pero si se irradian se degradan a cis en un 906 en dos horas si bien valores bajos de pH causan de nuevo la isomerizacioacuten del cis a trans esteacutericamente maacutes estable Estos autores sin embargo no hacen referencia alguna al comportamiento fluorescente de trans-resveratrol que siacute es descrito anteriormente por Roggero y Garciacutea Parrilla4 Seguacuten sus resultados mientras que tanto trans como cis-resveratrol son deacutebilmente fluorescentes pero al irradiarlos con luz UV intensa no soacutelo se isomeriza el trans a cis sino que aparece un compuesto muy fluorescente en cuyo espectro UV la λ de maacutexima absorcioacuten 260 nm coincidiendo dicho espectro con el atribuido por Siemann y Creasy1 al cis-resveratrol
A pesar de los datos existentes acerca de las propiedades
espectroscoacutepicas del trans-resveratrol y de la influencia de la irradiacioacuten sobre este compuesto no se han encontrado antecedentes acerca de la determinacioacuten
10 Vitrac X Monti JP Vercauteren J Deffieux G Meacuterillon JM Anal Chim Acta 2002 458103ndash110 11 Pintildeeiro Z Palma M Barroso CG J Chromatogr A 2006 111061ndash65
CAPIacuteTULO II Determinacioacuten fluorimeacutetrica de resveratrol en vino
76
fotomeacutetrica o fluorimeacutetrica de este compuesto en vino Ello unido al hecho de que auacuten existen en los artiacuteculos citados resultados discrepantes o no totalmente explicados nos animoacute a realizar estudios sobre las propiedades espectrales de trans-resveratrol y su modificacioacuten mediante irradiacioacuten UV con el objetivo uacuteltimo de llegar a proponer un meacutetodo fluorimeacutetrico de determinacioacuten de este compuesto en vino RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN Estudio baacutesico sobre las propiedades de intereacutes analiacutetico de trans-resveratrol
Caracterizacioacuten absorbente y luminiscente en distintos disolventes
Los estudios baacutesicos se han iniciado con el estudio del comportamiento absorbente y luminiscente del trans-resveratrol en distintos disolventes Para ello en matraces de 100 mL se preparan disoluciones que contienen 102 μgmiddotmL-1 de trans-resveratrol (020 mL de la disolucioacuten etanoacutelica de trans-resveratrol de 510 microgmL-1) Los disolventes ensayados son agua y disolventes orgaacutenicos de distintas polaridades como metanol etanol acetonitrilo dimetilsulfoacutexido NN-dimetilformamida 14-dioxano ciclohexano y hexano asiacute como mezclas hidroetanoacutelicas de diferente composicioacuten En la Figura 1 se representa el espectro de absorcioacuten de una disolucioacuten acuosa de trans-resveratrol Presenta una banda de absorcioacuten centrada a 310 nm con un ancho de banda de 20 nm en la que se distinguen dos maacuteximos centrados a 306 y 319 nm respectivamente La forma del espectro la situacioacuten de los maacuteximos y la absortividad molar no se ven afectados por la naturaleza del
CAPIacuteTULO II Determinacioacuten fluorimeacutetrica de resveratrol en vino
77
disolvente
Figura 1- Espectro de absorcioacuten de una disolucioacuten acuosa (20 vv etanol) conteniendo 102 microgmiddotmL-1 de trans-resveratrol
Este compuesto presenta una deacutebil fluorescencia nativa y los espectros de excitacioacuten y emisioacuten de fluorescencia registrados en algunos de los disolventes ensayados se recogen en la Figura 2 En la mayoriacutea de los disolventes ensayados (acetonitrilo etanol agua o mezclas hidroetanoacutelicas) los espectros de excitacioacuten presentan dos maacuteximos centrados a 225 y 318 nm y un uacutenico maacuteximo de emisioacuten centrado a 390 nm En dimetilformamida se observa un aumento del rendimiento cuaacutentico de fluorescencia del analito asiacute como la desaparicioacuten del primer maacuteximo de excitacioacuten En hexano ciclohexano y 14-dioxano el espectro de emisioacuten se desplaza hipsocroacutemicamente hasta 373 nm
240 280 320 360 400λ (nm)
0
004
008
012
Abso
rban
cia
CAPIacuteTULO II Determinacioacuten fluorimeacutetrica de resveratrol en vino
78
Figura 2-Espectros de excitacioacuten y emisioacuten de disoluciones conteniendo 102 microgmL-1 de trans-resveratrol en distintos disolventes (mdashmdash) etanolagua 4060 vv (λexcem 318390 nm) (mdashmdash) dimetilformamida (20 etanol) (λexcem 318390 nm) (mdashmdash) hexano (20 etanol) (λexcem 310373 nm)
Influencia de la acidez del medio Caacutelculo de constantes de ionizacioacuten de trans-resveratrol Una vez estudiado el efecto que ejerce el disolvente sobre las propiedades absorbentes y fluorescentes del analito se procede a estudiar la influencia de la acidez del medio Dicho estudio se ha llevado a cabo tanto en medio acuoso como en medio hidroetanoacutelico conteniendo el 40 (vv) de etanol Se preparan disoluciones que en un volumen final de 1000 mL contienen 228 μgmiddotmL-1 de trans-resveratrol fijaacutendose la fuerza ioacutenica del medio con KCl 010 M La variacioacuten del pH se efectuacutea por adicioacuten de pequentildeos voluacutemenes de disoluciones diluidas de HCl y NaOH Dado que en principio no se sabe nada acerca de la reversibilidad de los equilibrios en
200 250 300 350 400 450λ (nm)
0
40
80
120In
teni
sidad
de
Fluo
resc
encia
CAPIacuteTULO II Determinacioacuten fluorimeacutetrica de resveratrol en vino
79
los que el analito participa se toma la precaucioacuten de utilizar aliacutecuotas independientes de la disolucioacuten una para acidular y otra para alcalinizar En las Figuras 3 y 4 se recogen los espectros de absorcioacuten maacutes representativos en ambos medios registrados a distintos valores de pH asiacute como la variacioacuten de la absorbancia a las longitudes de onda de maacutexima variacioacuten
Figura 3- (A) Espectros de absorcioacuten correspondientes a trans-resveratrol (228 microgmiddotmL-1) en medio etanolagua 4060 vv a distintos valores de pH (B) Variacioacuten de la absorbancia medida a 306 y 343 nm con el pH
Figura 4- (A) Influencia del pH sobre los espectros de absorcioacuten de trans-resveratrol (152 microgmiddotmL-1) en medio acuoso (B) Variacioacuten de la absorbancia medida a 306 y 343 nm con el pH
0 2 4 6 8 10 12 14pH
0
01
02
03
Abso
rban
cia
306 nm
343 nm
B
250 300 350 400λ (nm)
0
005
01
015
02
025
Abso
rban
cia
10 - 70
92
100
122A
2 4 6 8 10 12 14pH
0
005
01
015
02
025
Abso
rban
cia
343 nm
306 nmB
102
20 - 60121
250 300 350 400λ (nm)
0
01
02
03
Abso
rban
cia
A
CAPIacuteTULO II Determinacioacuten fluorimeacutetrica de resveratrol en vino
80
En los dos medios de trabajo se observa un comportamiento similar no producieacutendose cambios en el espectro de absorcioacuten para pH inferiores a 70 Para pH superiores se observa una disminucioacuten en la absorbancia a 306 nm a medida que la banda de absorcioacuten sufre un desplazamiento batocroacutemico centraacutendose a 343 nm en medio fuertemente alcalino (pH gt 12)
En la Figura 3B se detecta un cambio brusco de la sentildeal en el intervalo de pH 90-120 correspondiente a la ionizacioacuten del analito El valor de pKa de este equilibrio se ha calculado mediante los meacutetodos de Stenstroumlm y Goldsmith12 y de Wilson y Lester13 Los resultados obtenidos se resumen en la Tabla 1
El caso del estudio en medio acuoso es algo maacutes complejo porque como se aprecia en la Figura 4B en la variacioacuten de la absorbancia medida a 343 nm se pueden observar dos tramos diferentes correspondientes a dos disociaciones muy cercanas entre si uno en el intervalo de pH 80-90 y otro en el intervalo 100-120 con una pequentildea meseta intermedia en el intervalo de pH 90-100 Debido a la proximidad de ambos equilibrios los meacutetodos de caacutelculo anteriores no pueden ser aplicados para el caacutelculo de los valores de pKa ya que no existe una meseta claramente definida entre ambos equilibrios no pudiendo relacionar los valores de absorbancia correspondientes a la regioacuten de pH 90-100 con la concentracioacuten de la especie intermedia
En este caso los valores de pKa se han calculado mediante el uso de
diagramas de absorbancia (diagramas-A) Un diagrama-A es una representacioacuten de la absorbancia a una longitud de onda frente a la absorbancia a una segunda longitud de onda de manera que el diagrama refleja los cambios relativos de
12 Stenstroumlm W Goldsmith N J Phys Chem 1926 301683-1687 13 Wilson RF Lester GW Talanta 1963 10319-322
CAPIacuteTULO II Determinacioacuten fluorimeacutetrica de resveratrol en vino
81
absorbancia a ambas longitudes de onda en funcioacuten del pH Para un sistema en el que esteacute implicado un uacutenico equilibrio la absorbancia a cualquier longitud de onda debe ser proporcional a la absorbancia a cualquier otra longitud de onda de manera que los diagramas seraacuten lineales No obstante cuando un sistema esteacute gobernado por dos o maacutes equilibrios los diagramas de absorbancia cambiaraacuten de direccioacuten cada vez que un nuevo equilibrio domine el sistema14 Estos diagramas son particularmente uacutetiles para sistemas en los que los espectros no revelan claramente el nuacutemero de equilibrios implicados
Figura 5- Diagrama de absorbancia A306 nm vs A343 nm de trans-resveratrol en medio acuoso Rango de pH 75-115
En este caso se han empleado los valores de absorbancia a 306 y 343 nm como longitudes de onda caracteriacutesticas de sus formas aacutecida y baacutesica respectivamente para construir el diagrama-A representado en la Figura 5 En dicho diagrama se pueden distinguir dos tramos rectos lo que sugiere la presencia de dos equilibrios La primera ionizacioacuten predomina en el rango de pH 75-89 (primer tramo lineal) y la segunda en el rango 100-115 (segundo tramo lineal) El 14 Polster J Lachmann H ldquoSpectrometric Titration Analysis of Chemical Equilibriardquo VCH Weinheim 1989
004
008
012
016
02
024
Abso
rban
cia (3
06 n
m)
004 008 012 016 02 024Absorbancia (343 nm)
H3ReHRe2-
H2Re-
CAPIacuteTULO II Determinacioacuten fluorimeacutetrica de resveratrol en vino
82
punto del diagrama correspondiente a pH 75 se encuentra sentildealado como H3Re (resveratrol en forma neutra como especie predominante) y el correspondiente a pH 115 como HRe2- (resveratrol-difenoacutexido como especie predominante) En el punto de interseccioacuten entre los dos tramos lineales la especie resveratrol-monofenoacutexido coexiste en equilibrio por ello este punto se ha etiquetado como H2Re- Los valores de pKa calculados son 82 y 97 respectivamente
El estudio de la influencia de la acidez del medio sobre la fluorescencia del
trans-resveratrol se ha llevado a cabo igualmente en medio acuoso y en medio hidroetanoacutelico 6040 (aguaetanol) preparando disoluciones que en un volumen final de 250 mL contienen 098 μgmiddotmL-1 de analito y KCl 01 M
En las Figuras 6 y 7 se recogen los espectros de excitacioacuten y emisioacuten a
distintos valores de pH en cada uno de los medios de trabajo ensayados asiacute como la variacioacuten de la sentildeal de fluorescencia a las longitudes de onda correspondientes a las formas aacutecida y baacutesica con el pH
Figura 6- (A) Espectros de excitacioacuten y emisioacuten correspondientes a una disolucioacuten conteniendo 098 microgmiddotmL-1 de trans-resveratrol en etanolagua 4060 vv en medio aacutecido (λexcem = 318385 nm) y baacutesico (λ excem = 342459 nm) (B) Variacioacuten de las sentildeales de fluorescencia a λ excem = 318385 nm y 342459 nm con el pH
200 300 400 500 600λ (nm)
0
200
400
600
Inten
sidad
de F
luore
scen
cia
gt 100
lt 60A
0 2 4 6 8 10 12 14pH
0
200
400
600
Inten
sidad
de F
luore
scen
cia
IF(λexc 342 nm) (459 nm)
IF(λexc 318 nm) (385 nm) B
CAPIacuteTULO II Determinacioacuten fluorimeacutetrica de resveratrol en vino
83
Figura 7- (A) Espectros de excitacioacuten y emisioacuten correspondientes a una disolucioacuten conteniendo 098 microgmiddotmL-1 de trans-resveratrol en agua a pH aacutecido (λexcem = 318404 nm) y baacutesico (λexcem = 341460 nm) (B) Variacioacuten de las sentildeales de fluorescencia a λexcem = 318404 nm y 341460 nm con el pH
Al disminuir la acidez se produce un desplazamiento batocroacutemico en los espectros de excitacioacuten de 318 a 342 nm y de 318 a 341 nm y de emisioacuten de 385 a 459 nm y de 404 a 460 nm en medio hidroetanoacutelico y acuoso respectivamente ademaacutes de una disminucioacuten del rendimiento cuaacutentico de fluorescencia en ambos casos En base a las curvas de variacioacuten de la sentildeal de fluorescencia con el pH se han calculado valores de pKa cuyos resultados se encuentran en la Tabla 1
Los valores de las constantes de ionizacioacuten del trans-resveratrol se
encuentran recogidos en dos artiacuteculos En el primero de ellos15 se describen valores de pKa de pKa1= 801 pKa2= 986 y pKa3= 105 en medio acuoso obtenidos fotomeacutetricamente por extrapolacioacuten de los valores obtenidos en distintos medios hidrometanoacutelicos Estos valores de pKa1 y pKa2 son bastante coincidentes con los calculados fotomeacutetricamente en nuestro caso mediante el meacutetodo del diagrama-
15 Takagai Y Kubota T Kobayashi H Tashiro T Takahashi A Igarashi S Anal Sci 2005 21183-186
200 300 400 500 600λ (nm)
0
50
100
150
200
250
Inten
sidad
de F
luore
scen
cia
gt 100
lt 60A
0 2 4 6 8 10 12 14pH
0
50
100
150
200
250
Inte
nsid
ad d
e Fl
uore
scen
cia
IF(λexc 318 nm) (404 nm)
IF(λexc 341 nm) (460 nm)
B
CAPIacuteTULO II Determinacioacuten fluorimeacutetrica de resveratrol en vino
84
A14 para trans-resveratrol en medio acuoso En el segundo trabajo16 se describe la obtencioacuten de las constantes de disociacioacuten de primer orden de trans-resveratrol y trans-piceido en medio acuoso mediante datos electroforeacuteticos proporcionando valores de pKa1= 949 y 940 respectivamente El valor de pKa1 calculado en este trabajo para trans-resveratrol es bastante cercano al valor de pKa2 calculado por nosotros fotomeacutetricamente mediante el meacutetodo del diagrama-A
Tabla 1- Valores de pKa calculados para el trans-resveratrol en diferentes medios mediante fotometriacutea y fluorescencia utilizando diferentes meacutetodos de caacutelculo
Meacutetodo de Caacutelculo pKa trans-resveratrol
Stenstroumlm y Goldsmith 104 plusmn 01 EtanolAgua 4060 vv Wilson y Lester 104
FOTO
METR
IacuteA
Agua Diagrama-A pKa1= 82
pKa2= 97
Stenstroumlm y Goldsmith 91 plusmn 05 EtanolAgua 4060 vv Wilson y Lester 92
Stenstroumlm y Goldsmith 85 plusmn 01
FLUO
RESC
ENCI
A
Agua Wilson y Lester 85
Valor medio plusmn Desviacioacuten Estaacutendar
Para estudiar la reversibilidad de los equilibrios en que se encuentra
involucrado el trans-resveratrol al variar el pH se alcaliniza una muestra en las mismas condiciones en las que se ha llevado a cabo el estudio de la influencia del pH hasta un pH en torno a 12 y se acidula a continuacioacuten hasta un pH proacuteximo al inicial Se encuentra que el espectro correspondiente a la muestra original y el
16 Cao J Chen GH Du YS Hou FF Tian YL J Liquid Chromatogr and Rel Technol 2006 291457-1463
CAPIacuteTULO II Determinacioacuten fluorimeacutetrica de resveratrol en vino
85
registrado una vez que se alcaliniza y acidula posteriormente son ideacutenticos de donde se deduce que se trata de un equilibrio aacutecido-base reversible
Rectas de calibrado y paraacutemetros analiacuteticos de calidad
Se procede a estudiar la relacioacuten entre la concentracioacuten de trans-resveratrol y las sentildeales fotomeacutetrica y fluorescente y al establecimiento de las correspondientes rectas de calibrado Para obtener las sentildeales fotomeacutetricas se procede antildeadiendo directamente en la cubeta de medida 200 mL de agua ultrapura y voluacutemenes crecientes comprendidos entre 0020 y 025 mL de una disolucioacuten etanoacutelica de trans-resveratrol de 49 microgmiddotmL-1 Los espectros de absorcioacuten se registran en un rango de longitudes de onda comprendido entre 240 y 360 nm Las medidas de fluorescencia se realizan antildeadiendo directamente en la cubeta de medida 180 mL de agua y 120 mL de etanol absoluto con el objetivo de mantener la composicioacuten oacuteptima del medio de trabajo ya que la emisioacuten fluorescente depende del de etanol en el medio Sobre esta mezcla hidroetanoacutelica una vez desgasificada por ultrasonidos se antildeaden voluacutemenes sucesivos de una disolucioacuten etanoacutelica de trans-resveratrol de 49 microgmiddotmL-1 en incrementos de 50 microL hasta llegar a 0050 mL Tras cada nueva adicioacuten se registran los espectros de emisioacuten (λexc = 318 nm) en las siguientes condiciones instrumentales 20ordmC rendijas de excitacioacuten y emisioacuten 5 nm respectivamente voltaje del tubo fotomultiplicador 800 V
CAPIacuteTULO II Determinacioacuten fluorimeacutetrica de resveratrol en vino
86
Las ecuaciones de las rectas obtenidas mediante ambas teacutecnicas asiacute como los paraacutemetros analiacuteticos de calidad se encuentran recogidos en la Tabla 2
Tabla 2- Paraacutemetros analiacuteticos de calidad para la determinacioacuten fotomeacutetrica y fluorimeacutetrica de trans-resveratrol
trans-resveratrol
Fotometriacutea Fluorescencia
Sentildeal Analiacutetica A306 nm IF318385 nm
Rango Lineal (μgmiddotmL-1) 050 ndash 500 0080 ndash 080
Ordenada en el Origen (a plusmn sa) -00037 plusmn 00025 128 plusmn 55
Pendiente (b plusmn sb) (mLmiddotμg-1) 0127 plusmn 0001 938 plusmn 13
Desviacioacuten Estaacutendar de la Regresioacuten (syx) 00077 131
Coeficiente de Correlacioacuten (r) 0999 0999
Coeficiente de Determinacioacuten (r2) 0999 0997
Linealidad 993 986
Resolucioacuten Analiacutetica (γ-1) (μgmiddotmL-1) 00604 00140
LOD Long y Winefordner17 (μgmiddotmL-1) 00583 00179
LOD Clayton18 (α=β=005) (μgmiddotmL-1) 0135 00345
17 Long GL Winefordner JD Anal Chem 1983 55712ndash724 18 Clayton CA Hines JW Elkins PD Anal Chem 1987 592506ndash2514
CAPIacuteTULO II Determinacioacuten fluorimeacutetrica de resveratrol en vino
87
Repetitividad de los meacutetodos
Para llevar a cabo este estudio se siguen los procedimientos que se describen a continuacioacuten
Meacutetodo fotomeacutetrico Para realizar el estudio de la repetitividad se preparan
seguacuten el meacutetodo anteriormente descrito 11 reacuteplicas de una muestra que contiene 143 microgmiddotmL-1 de trans-reveratrol y se miden las absorbancias correspondientes a 306 nm Aplicando el caacutelculo estadiacutestico a los datos obtenidos la desviacioacuten estaacutendar relativa resulta ser del 22
Meacutetodo fluorimeacutetrico Mediante fluorescencia el estudio de la repetitividad del meacutetodo se lleva a cabo con 11 reacuteplicas de una muestra que en este caso contiene 032 microgmiddotmL-1 de trans-reveratrol Las sentildeales obtenidas a 385 nm (λexc = 318 nm) se tratan estadiacutesticamente obtenieacutendose un valor para la desviacioacuten estaacutendar relativa del 47 Efecto de la irradiacioacuten ultravioleta externa sobre las propiedades absorbentes y fluorescentes de trans-resveratrol En esta seccioacuten se describe el estudio realizado sobre la fotorreaccioacuten que sufre el analito en distintos disolventes Se ha investigado el efecto de diversas variables como la composicioacuten y la acidez del medio tanto sobre el proceso de fotodescomposicioacuten como sobre las propiedades del fotoproducto
CAPIacuteTULO II Determinacioacuten fluorimeacutetrica de resveratrol en vino
88
Influencia del disolvente En primer lugar se procede a estudiar la influencia de la composicioacuten del medio en el desarrollo de la fotorreaccioacuten que tiene lugar cuando las disoluciones de trans-resveratrol son irradiadas bajo una laacutempara de mercurio de alta presioacuten Para ello se preparan disoluciones de trans-resveratrol por dilucioacuten de una disolucioacuten madre concentrada con disolventes orgaacutenicos de diferentes polaridades asiacute como agua y mezclas hidroetanoacutelicas Se examinan las propiedades absorbentes y fluorescentes de estas disoluciones previa irradiacioacuten de las mismas durante distintos intervalos de tiempo en diferentes medios de trabajo
Absorcioacuten molecular- Se comprueba que el porcentaje de etanol en el medio no influye sobre el espectro de absorcioacuten de trans-resveratrol como se explicoacute anteriormente siendo eacuteste exactamente igual en intensidad y fisonomiacutea en etanol en agua y en mezclas hidroetanoacutelicas de diferente composicioacuten Sin embargo siacute lo hace sobre los espectros de absorcioacuten de los fotoproductos que se van generando durante la irradiacioacuten de las respectivas disoluciones bajo una laacutempara de mercurio de alta presioacuten asiacute como sobre la cineacutetica de la fotorreaccioacuten
Para realizar este estudio se preparan disoluciones conteniendo todas
ellas 204 microgmiddotmL-1 de trans-resveratrol en etanol absoluto y en mezclas hidroetanoacutelicas de composicioacuten variable En la Figura 8 se recoge la evolucioacuten de los espectros de absorcioacuten de cuatro de estas disoluciones con el tiempo de irradiacioacuten bajo una laacutempara de mercurio de alta presioacuten
CAPIacuteTULO II Determinacioacuten fluorimeacutetrica de resveratrol en vino
89
Figura 8- Influencia del tiempo de irradiacioacuten sobre disoluciones de trans-resveratrol en etanol absoluto (A) y en etanolagua 6040 vv (B) 4060 vv (C) y 496 vv (D) sin irradiar (mdashmdash) e irradiadas durante 5 segundos (mdashmdash) 30 segundos (mdashmdash) 60 segundos (mdashmdash) 120 segundos (mdashmdash) y 300 segundos (mdashmdash) [trans-resveratrol] = 204 microgmiddotmL-1
Como se observa al irradiar las disoluciones de resveratrol en etanol agua o en cualquier medio hidroetanoacutelico la fisonomiacutea del espectro cambia totalmente desapareciendo en todos los casos la banda ancha de absorcioacuten caracteriacutestica del trans-resveratrol y observaacutendose un nuevo maacuteximo de absorcioacuten centrado a 290 nm correspondiente seguacuten aparece descrito en la bibliografiacutea a cis-resveratrol6 La intensidad de este maacuteximo praacutecticamente no variacutea con el tiempo de irradiacioacuten
240 280 320 360λ (nm)
0
01
02
03
Abso
rban
cia
A
240 280 320 360λ (nm)
0
01
02
03
Abso
rban
cia
B
240 280 320 360λ (nm)
0
01
02
03
Abso
rban
cia
C
240 280 320 360λ (nm)
0
01
02
03
Abso
rban
cia
D
CAPIacuteTULO II Determinacioacuten fluorimeacutetrica de resveratrol en vino
90
Cuando el porcentaje de etanol estaacute comprendido entre 40 y 60 y las disoluciones son irradiadas durante 120 segundos se observa la aparicioacuten de un segundo maacuteximo de absorcioacuten centrado a 260 nm tanto o maacutes importante que el anterior que sin embargo a penas se aprecia en etanol puro o con elevados contenidos de agua En etanol absoluto dicho maacuteximo se observa de una forma muy tenue para tiempos de irradiacioacuten en torno a 60 segundos En cualquier caso la irradiacioacuten de las disoluciones durante tiempos mayores implica la destruccioacuten de este uacuteltimo fotoproducto como puede observarse en los espectros registrados para las disoluciones irradiadas durante cinco minutos
Por uacuteltimo es importante destacar que se ha comprobado que el tiempo de
irradiacioacuten necesario para la obtencioacuten de los fotoproductos estaacute directamente relacionado con el rango de concentraciones de la disolucioacuten inicial del analito en su forma trans original Fluorescencia molecular- Con el objetivo de evaluar la influencia de la irradiacioacuten ultravioleta externa sobre las propiedades fluorescentes de los fotoproductos en diferentes disolventes se prepara en primer lugar una disolucioacuten conteniendo 57 ngmiddotmL-1 de trans-resveratrol en etanolagua 4060 vv y se registran los espectros de excitacioacuten y emisioacuten de la disolucioacuten recieacuten preparada y tras ser irradiada durante 60 segundos bajo una laacutempara de mercurio de alta presioacuten Dichos espectros se recogen en la Figura 9 y como puede observarse se comprueba que la irradiacioacuten ultravioleta externa de disoluciones hidroetanoacutelicas de trans-resveratrol tiene como consecuencia la generacioacuten de fotoproductos altamente fluorescentes Los espectros de estos fotoproductos se caracterizan por presentar un intenso y agudo maacuteximo de excitacioacuten centrado a 260 nm y dos maacuteximos de emisioacuten en torno a 364 y 382 nm respectivamente
CAPIacuteTULO II Determinacioacuten fluorimeacutetrica de resveratrol en vino
91
Se han ensayado otros disolventes concretamente metanol etanol acetonitrilo dimetilsulfoacutexido NN-dimetilformamida 14-dioxano ciclohexano y hexano encontraacutendose que la naturaleza del fotoproducto es independiente del disolvente como puede deducirse de los espectros praacutecticamente ideacutenticos obtenidos en todos disolventes ensayados De dicho estudio se deduce tambieacuten que la velocidad de las fotorreacciones estaacute altamente influida por el disolvente siendo mayor en medios puramente orgaacutenicos que en medios hidroorgaacutenicos Por otra parte se encuentra que el rendimiento cuaacutentico de fluorescencia de los fotoproductos es maacuteximo en medios hidroetanoacutelicos en los que las proporciones de etanol y agua son similares por lo que elegimos este medio para posteriores estudios
Figura 9- Espectros de excitacioacuten y emisioacuten correspondientes a una disolucioacuten conteniendo 57 ngmiddotmL-1 de trans-resveratrol en etanolagua 4060 vv aislada de la luz (mdashmdash) (λexcem 318390 nm) e irradiada durante 60 segundos (mdashmdash) bajo una laacutempara de mercurio de alta presioacuten (λexcem 260364 nm)
200 300 400 500λ (nm)
0
100
200
300
Inten
sidad
de F
luore
scen
cia
CAPIacuteTULO II Determinacioacuten fluorimeacutetrica de resveratrol en vino
92
Con el objetivo de encontrar la composicioacuten del disolvente en el que se obtengan las mayores sentildeales en pro de la sensibilidad de los meacutetodos se preparan una serie de disoluciones conteniendo todas ellas 228 microgmiddotmL-1 de trans-resveratrol en etanol en agua y en diferentes proporciones de ambos disolventes En cada caso se lleva a cabo el estudio de la fotorreaccioacuten por irradiaciones acumulativas de la misma disolucioacuten bajo la laacutempara de mercurio de alta presioacuten registrando los espectros de excitacioacuten y emisioacuten de la disolucioacuten que estaacute siendo irradiada a las longitudes de onda de maacutexima sentildeal de los fotoproductos En la Figura 10A se encuentra representada la evolucioacuten de la sentildeal de fluorescencia fotoinducida con el tiempo de irradiacioacuten de las disoluciones de trans-resveratrol en los distintos medios de trabajo ensayados En todos los casos se observa un aumento de la sentildeal de fluorescencia fotoinducida con el tiempo de irradiacioacuten hasta alcanzar un maacuteximo seguido por un decaimiento de la sentildeal probablemente debido a la destruccioacuten de los fotoproductos y a la generacioacuten de otros fragmentos no fluorescentes
Figura 10- (A) Evolucioacuten de la intensidad de fluorescencia a 364 nm (λexc= 260 nm) con el tiempo de irradiacioacuten de disoluciones conteniendo 228 microgmiddotmL-1 de trans-resveratrol en etanol absoluto (mdashmdash) agua (mdashmdash) y etanolagua 8020 vv (mdashmdash) 6040 vv (mdashmdash) 4060 vv (mdashmdash) y 2080 vv (mdashmdash) (B) Influencia del porcentaje de etanol en el medio sobre la sentildeal de fluorescencia a 364 nm (λexc= 260 nm) para un tiempo de irradiacioacuten de 120 segundos
0 50 100 150 200 250 300Tiempo de Irradiacioacuten (s)
0
100
200
300
400
500
I F (
364 n
m) (λ
exc =
260 n
m)
A
0 20 40 60 80 100 v Etanol
0
100
200
300
400
500
I F (
364 n
m) (λ
exc =
260 n
m)
B
CAPIacuteTULO II Determinacioacuten fluorimeacutetrica de resveratrol en vino
93
En disoluciones puramente etanoacutelicas el tiempo de irradiacioacuten oacuteptimo estaacute
en torno a 25 segundos y la fluorescencia de los fotoproductos es muy deacutebil A medida que disminuye el porcentaje de etanol en el medio aumenta el tiempo de irradiacioacuten necesario para lograr la maacutexima sentildeal asiacute como las sentildeales de fluorescencia fotoinducida En la Figura 10B se representa la intensidad de fluorescencia obtenida para cada una de las disoluciones al irradiarlas durante 120 segundos Se observa que en este caso la maacutexima sentildeal se obtiene en medios con un porcentaje de etanol comprendido entre el 30 y el 50 Por ello para futuras experiencias se elige como medio de trabajo oacuteptimo una mezcla etanolagua 4060 vv
No obstante se encuentra que el tiempo de irradiacioacuten oacuteptimo es
dependiente de la concentracioacuten de trans-resveratrol inicial siendo necesario optimizar dicho paraacutemetro una vez establecido el rango de concentraciones de trabajo
Influencia de la acidez del medio sobre las propiedades absorbentes y fluorescentes del fotoproducto de resveratrol
Una vez establecidas las condiciones oacuteptimas para la obtencioacuten del fotoproducto fluorescente de resveratrol y caracterizado el mismo fotomeacutetrica y fluorimeacutetricamente se procede a estudiar la influencia de la acidez del medio sobre sus propiedades espectroscoacutepicas En todos los casos se fija la fuerza ioacutenica del medio por adicioacuten de KCl en una concentracioacuten final de 010 M Se obtiene el fotoproducto y estas disoluciones se dividen en dos porciones de las cuales una seraacute alcalinizada y la otra acidulada
CAPIacuteTULO II Determinacioacuten fluorimeacutetrica de resveratrol en vino
94
mediante la adicioacuten de pequentildeos voluacutemenes de disoluciones diluidas de NaOH y HCl respectivamente ya que inicialmente no se tienen datos acerca de la reversibilidad de los procesos que ocurren
El estudio fotomeacutetrico se lleva a cabo sobre una disolucioacuten conteniendo 120 microgmiddotmL-1 de trans-resveratrol en etanolagua 4060 vv irradiada durante 60 segundos En la Figura 11 se han recogido los espectros maacutes significativos a distintos valores de pH asiacute como la variacioacuten de la sentildeal fotomeacutetrica a las longitudes de onda caracteriacutesticas de las formas aacutecida y baacutesica
Figura 11- (A) Influencia del pH sobre los espectros de absorcioacuten del fotoproducto del trans-resveratrol en medio etanolagua 4060 vv (B) Variacioacuten de la absorbancia a 261 y 303 nm con el pH [trans-resveratrol ]inicial = 120 microgmiddotmL-1
El espectro de absorcioacuten del fotoproducto en medio neutro y aacutecido estaacute caracterizado por un maacuteximo centrado a 261 nm y otro de menor importancia centrado a 287 nm Para valores de pH superiores a 10 el primer maacuteximo desaparece y el segundo se desplaza batocroacutemicamente hasta 303 nm
240 260 280 300 320 340 360λ (nm)
0
004
008
012
Abs
orba
ncia
35
84
98
107
110
A
0 2 4 6 8 10 12 14pH
0
004
008
012
Abso
rban
cia
261 nm
303 nm
B
CAPIacuteTULO II Determinacioacuten fluorimeacutetrica de resveratrol en vino
95
El estudio de la influencia del pH sobre la fluorescencia del fotoproducto se
lleva a cabo sobre una disolucioacuten conteniendo 98 ngmiddotmL-1 de trans-resveratrol en
etanolagua 4060 vv irradiada durante 60 segundos En la Figura 12A se representan los espectros de excitacioacuten y emisioacuten a diferentes valores de pH La curva de variacioacuten de la sentildeal de fluorescencia con el pH Figura 12B muestra una meseta para valores de pH inferiores a 70 y un decaimiento draacutestico de la sentildeal para valores de pH superiores a 70 obtenieacutendose una sentildeal inapreciable para pH superiores a 110 Se comprueba que el producto resultante de la degradacioacuten alcalina del fotoproducto de resveratrol no es fluorescente
Figura 12- (A) Espectros de excitacioacuten y emisioacuten del fotoproducto de trans-resveratrol a distintos valores de pH (B) Variacioacuten de la intensidad de fluorescencia con el pH [trans-resveratrol] = 98 ngmiddotmL-1 λexc= 260 nm λem= 364 nm
Adicionalmente se estudia fotomeacutetrica y fluorimeacutetricamente la reversibilidad de los equilibrios en que se encuentra involucrado el fotoproducto de resveratrol al alcalinizar Para ello se alcalinizan muestras en las mismas condiciones en las que se ha llevado a cabo el estudio de la influencia del pH hasta un pH en torno a 12 y se acidulan a continuacioacuten hasta un pH proacuteximo al inicial Por comparacioacuten de los espectros correspondientes a las muestras neutras originales y los registrados tras la variacioacuten del pH se deduce que la
200 250 300 350 400 450λ (nm)
0
200
400
600
800
Inten
sidad
de F
luore
scen
cia
lt 70
gt 120
99
0 2 4 6 8 10 12 14pH
0
200
400
600
800
I F (
364
nm) (
λ exc=
260
nm
)
A B
CAPIacuteTULO II Determinacioacuten fluorimeacutetrica de resveratrol en vino
96
transformacioacuten que sufre el fotoproducto del resveratrol en medio alcalino no es reversible Por ello no ha sido posible calcular el valor de pKa correspondiente al fotoproducto de resveratrol por no tratarse de un equilibrio aacutecido-base sino de una hidroacutelisis alcalina irreversible
Rectas de calibrado y paraacutemetros analiacuteticos de calidad Una vez establecida la influencia de las variables quiacutemicas y determinados
sus valores oacuteptimos y dada la mejora de sensibilidad y selectividad que supone en general utilizar sentildeales fluorimeacutetricas se procede a estudiar la relacioacuten entre la concentracioacuten de trans-resveratrol puesta y la sentildeal de fluorescencia fotoinducida asiacute como al establecimiento de la correspondiente recta de calibrado
Para ello se preparan muestras conteniendo entre 66 y 66 ngmiddotmL-1 de analito en etanolagua 4060 vv y se irradian durante 60 segundos A continuacioacuten se registran los espectros de emisioacuten de las disoluciones irradiadas en las siguientes condiciones experimentales 20ordmC rendija de excitacioacuten 5 nm rendija de emisioacuten 5 nm voltaje del tubo fotomultiplicador 750 V y λexc = 260 nm
En la Tabla 3 se recogen los paraacutemetros analiacuteticos de calidad correspondientes a la determinacioacuten de resveratrol mediante fluorescencia fotoinducida utilizaacutendose como sentildeal analiacutetica la intensidad de fluorescencia a 365 nm
CAPIacuteTULO II Determinacioacuten fluorimeacutetrica de resveratrol en vino
97
Tabla 3- Paraacutemetros analiacuteticos para la determinacioacuten de trans-resveratrol mediante fluorescencia fotoinducida (λexcλem = 260365 nm)
Rango Lineal (ngmiddotmL-1) 66 ndash 66
Ordenada en el Origen (a plusmn sa) 211 plusmn 35
Pendiente (b plusmn sb) (mLmiddot ng -1) 777 plusmn 012
Desviacioacuten Estaacutendar de la Regresioacuten (syx) 105
Coeficiente de Correlacioacuten (r) 0998
Coeficiente de Determinacioacuten (r2) 0996
Linealidad 985
Resolucioacuten Analiacutetica (γ-1) (ngmiddotmL-1) 135
LOD Long y Winefordner (ngmiddotmL-1) 156
LOD Clayton (α=β=005) (ngmiddotmL-1) 308
Repetitividad del meacutetodo
Para determinar la repetitividad del meacutetodo se prepara una serie de once disoluciones independientes conteniendo 192 ngmiddotmL-1 de trans-resveratrol se irradian en las mismas condiciones utilizadas para el establecimiento de las rectas de calibrado y se registran sus espectros de emisioacuten manteniendo igualmente las condiciones instrumentales empleadas en dicha experiencia La desviacioacuten estaacutendar relativa calculada sobre las sentildeales medidas resulta ser 36
CAPIacuteTULO II Determinacioacuten fluorimeacutetrica de resveratrol en vino
98
Estudio extracto-espectrofluorimeacutetrico de trans-resveratrol Aplicacioacuten al anaacutelisis de muestras de vino
Los meacutetodos de anaacutelisis de resveratrol en muestras de vino descritos en la bibliografiacutea siempre hacen uso de teacutecnicas separativas bien cromatograacuteficas o bien electroforeacuteticas pero no se han encontrado antecedentes sobre meacutetodos espectroscoacutepicos de anaacutelisis de este analito en muestras de vino Por ello en este apartado se describen los estudios encaminados a proponer un nuevo meacutetodo de anaacutelisis de resveratrol en vino en presencia de su principal interferencia su glucoacutesido mediante fluorescencia fotoinducida Como paso previo a la determinacioacuten mediante fluorescencia fotoinducida es necesaria una etapa de limpieza de la muestra para reducir la sentildeal de fondo de la matriz Con este objetivo se lleva a cabo el estudio extracto-espectrofluorimeacutetrico del analito con objeto de optimizar las condiciones para la extraccioacuten liacutequido-liacutequido que se usaraacute en dicha etapa
Influencia de la naturaleza del disolvente orgaacutenico en la extraccioacuten
En primer lugar se realizan ensayos mediante absorcioacuten molecular con diferentes disolventes y se comprueba que los mayores rendimientos de extraccioacuten se obtienen empleando eacuteter etiacutelico o acetato de etilo y que sin embargo al emplear cloroformo praacutecticamente el 100 del analito permanece en fase acuosa Por otra parte el rendimiento cuaacutentico de fluorescencia del fotoproducto de resveratrol en eacuteter etiacutelico o en acetato de etilo estaacute muy por debajo del observado en el medio hidroetanoacutelico anteriormente optimizado por lo que seraacute necesario
CAPIacuteTULO II Determinacioacuten fluorimeacutetrica de resveratrol en vino
99
evaporar a sequedad los extractos orgaacutenicos y reconstituir el residuo con la mezcla hidroalcohoacutelica En base a estos estudios previos se elige eacuteter etiacutelico como agente extractante por dos motivos fundamentales las recuperaciones del analito estaacuten en torno al 100 y la elevada volatilidad del disolvente facilita su eliminacioacuten lo que acortaraacute sustancialmente el tiempo de anaacutelisis
Antes de optimizar las variables que influyen en la extraccioacuten se realizan pruebas de extraccioacuten en la matriz del vino ya que eacuteste va a ser el objeto final de nuestro anaacutelisis Se aprecia una importante contribucioacuten de la matriz en la sentildeal de fluorescencia en las condiciones necesarias para la obtencioacuten del espectro de emisioacuten del fotoproducto del trans-resveratrol Sin embargo se ha comprobado que esta contribucioacuten se reduce en gran medida por obtencioacuten de las sentildeales derivadas fundamentalmente de la segunda derivada
Por ello a partir de estos resultados previos para evaluar la recuperacioacuten del trans-resveratrol en eacuteter se sigue el siguiente procedimiento se preparan 100 mL de disolucioacuten acuosa de trans-resveratrol conteniendo 57 ngmiddotmL-1 y se extraen con 100 mL de eacuteter etiacutelico agitando vigorosamente durante dos minutos Se recoge el extracto orgaacutenico que se evapora a sequedad por paso de una corriente de nitroacutegeno a temperatura ambiente El residuo se redisuelve en 40 mL de etanol y se antildeade agua ultrapura hasta completar un volumen final de 100 mL Se registran los espectros de fluorescencia y se obtiene la segunda derivada
mediante el algoritmo de Savitzky-Golay19 (Δλ = 5 nm) Los espectros sin derivar y
derivados correspondientes a la disolucioacuten reconstituida sin irradiar e irradiada durante 60 segundos en la laacutempara de mercurio de alta presioacuten se recogen en la Figura 13 Por comparacioacuten del espectro segunda derivada de fluorescencia fotoinducida correspondiente al extracto evaporado y reconstituido con el espectro
19 Savitzky A Golay MJE Anal Chem 1964 361627ndash1639
CAPIacuteTULO II Determinacioacuten fluorimeacutetrica de resveratrol en vino
100
segunda derivada correspondiente a un patroacuten de la misma concentracioacuten en etanolagua 4060 (vv) e irradiado durante 60 s se comprueba que la recuperacioacuten es praacutecticamente del 100 Por otra parte como puede observarse en la misma figura la sentildeal procedente de las muestras sin irradiar praacutecticamente se hace cero en todo el intervalo de longitudes de onda al emplear la segunda derivada
Figura 13- A) Espectros de fluorescencia (λexc= 261 nm) correspondientes al extracto eteacutereo evaporado y reconstituido con etanolagua 4060 (vv) (mdashmdash) y a un patroacuten de ideacutentica concentracioacuten en el mismo medio disolvente (mdashmdash) sin irradiar (middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot) e irradiadas (mdashmdash) durante 60 s B) Segunda derivada de los espectros de fluorescencia
Se procede a continuacioacuten a estudiar la influencia de distintas variables
experimentales sobre la extraccioacuten de resveratrol con eacuteter etiacutelico
Influencia del pH en la extraccioacuten
Para fijar el pH de la fase acuosa se ensayan diversos tampones y finalmente se decide utilizar tampones aacutecido tartaacutericotartrato monoaacutecido de sodio o tartrato monoaacutecido de sodiotartrato disoacutedico ya que no producen quenching de la sentildeal de fluorescencia y ademaacutes son tampones presentes en el vino de forma natural
330 360 390 420 450λem (nm)
0
200
400
600
800
Inten
sidad
de F
luore
scen
cia
A
330 360 390 420 450λem (nm)
-8
-4
0
4
8
2 D
B
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Se preparan una serie de muestras conteniendo 57 ngmiddotmL-1 de resveratrol
y una concentracioacuten 010 M de tampones aacutecido tartaacutericotartrato monoaacutecido de sodio o tartrato monoaacutecido de sodiotartrato disoacutedico de distintos valores de pH en un volumen final de 100 mL de fase acuosa Las muestras se extraen con 100 mL de eacuteter etiacutelico agitando durante dos minutos y dejando decantar las fases Se recoge la fase orgaacutenica y se evapora a sequedad por paso de una corriente de nitroacutegeno a temperatura ambiente el residuo se redisuelve en 40 mL de etanol y se antildeade agua ultrapura hasta completar un volumen final de 100 mL Se registran los espectros de fluorescencia de estas muestras tras irradiarlas durante 60 segundos y se calculan los espectros segunda derivada mediante el algoritmo de
Savitzky-Golay (Δλ = 5 nm) Tambieacuten se registran los espectros de fluorescencia y
se calculan los espectros segunda derivada en ideacutenticas condiciones de disolucioacutenes patroacuten conteniendo la misma concentracioacuten de resveratrol en etanolagua 4060 (vv) a los distintos valores de pH e irradiadas durante 60 segundos
La recuperacioacuten se calcula por comparacioacuten de la amplitud de los espectros segunda derivada de fluorescencia fotoinducida entre 364 y 374 nm (2D364-374) con la sentildeal correspondiente al patroacuten En la Figura 14 se muestra el porcentaje de recuperacioacuten para cada uno de los valores de pH ensayados y se observa que las recuperaciones son maacuteximas y proacuteximas al 100 para valores de pH comprendidos entre 45 y 60
CAPIacuteTULO II Determinacioacuten fluorimeacutetrica de resveratrol en vino
102
Figura 14- Influencia del pH de la fase acuosa sobre el porcentaje de recuperacioacuten en la extraccioacuten
Para posteriores experiencias se fija el pH por adicioacuten de tampoacuten tartrato monoaacutecido de sodiotartrato disoacutedico de pH 50 Se procede a continuacioacuten a optimizar la concentracioacuten de la disolucioacuten reguladora de pH en la fase acuosa
Para establecer la influencia de la concentracioacuten de disolucioacuten reguladora se preparan disoluciones conteniendo 57 ngmiddotmL-1 de resveratrol voluacutemenes variables de tampoacuten tartrato monoaacutecido de sodiotartrato disoacutedico 026 M de pH 50 y agua desionizada hasta 100 mL Estas disoluciones se extraen con 100 mL de eacuteter etiacutelico agitando durante dos minutos Cuando la separacioacuten de fases es completa se recogen los extractos orgaacutenicos y se opera como en el caso anterior La recuperacioacuten estaacute proacutexima al 100 cuando la concentracioacuten de tampoacuten en fase acuosa es de 015 M que se selecciona como concentracioacuten de tampoacuten oacuteptima para futuras experiencias
2 3 4 5 6 7pH
0
20
40
60
80
100
120
R
ecup
erac
ioacuten
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103
Influencia del tiempo de agitacioacuten
Para este estudio se preparan cuatro muestras acuosas conteniendo 57 ngmiddotmL-1 de resveratrol cuyo pH se fija por adicioacuten de 50 mL de tampoacuten tartrato monoaacutecido de sodiotartrato disoacutedico 030 M de pH 50 en un volumen final de 100 mL Dichas muestras tras la adicioacuten de 100 mL de eacuteter etiacutelico se agitan durante tiempos variables comprendidos entre 30 y 120 segundos Una vez separadas las fases se recoge en cada caso la fase orgaacutenica y se procede como en experiencias anteriores
El tiempo de agitacioacuten no influye apreciablemente en la extraccioacuten del
analito y para posteriores experiencias se fija un minuto como tiempo de agitacioacuten adecuado
Influencia de la relacioacuten de fases
Para establecer la influencia de la relacioacuten de fases se opera sobre
disoluciones acuosas conteniendo 057 μg de resveratrol el volumen necesario de etanol absoluto para que el porcentaje de etanol en la fase acuosa sea del 3 voluacutemenes variables de disolucioacuten reguladora tartrato monoaacutecido de sodiotartrato disoacutedico 030 M de pH 50 tales que la concentracioacuten final de tampoacuten sea 015 M y voluacutemenes variables de agua desionizada Todas ellas se extraen con 100 mL de eacuteter etiacutelico agitando durante un minuto Se dejan en contacto ambas fases hasta su completa separacioacuten y se toma la fase orgaacutenica sobre la que se aplica el tratamiento anteriormente descrito
La relacioacuten de fases no afecta praacutecticamente a la extraccioacuten del analito al
menos hasta un valor 41 (fase acuosafase orgaacutenica) ya que en todos los casos la
CAPIacuteTULO II Determinacioacuten fluorimeacutetrica de resveratrol en vino
104
recuperacioacuten estaacute en torno al 100 Para posteriores experiencias se fija como relacioacuten de fases 21 ya que para mayores valores de dicha relacioacuten se dificulta mucho la recogida cuantitativa del extracto eteacutereo
Rectas de calibrado y paraacutemetros analiacuteticos de calidad Dada la necesidad de recurrir a la teacutecnica de derivadas para minimizar la sentildeal de la matriz del vino se procede a comprobar la linealidad entre la concentracioacuten de trans-resveratrol en la muestra original y la amplitud del espectro segunda derivada
Para ello se preparan disoluciones conteniendo entre 66 y 66 ngmiddotmL-1 de trans-resveratrol en etanolagua 4060 vv y se irradian durante 60 segundos Se registran los espectros de fluorescencia de las disoluciones irradiadas en las siguientes condiciones experimentales 20ordmC rendija de excitacioacuten 5 nm rendija de emisioacuten 5 nm voltaje del tubo fotomultiplicador 750 V y λexc= 260 nm Por uacuteltimo se obtienen los correspondientes espectros segunda derivada mediante el algoritmo
de Savitzky-Golay (Δλ = 5 nm)
La maacutexima sensibilidad se obtiene al emplear como sentildeal analiacutetica la amplitud de la derivada entre 356 y 364 nm (2D356-364 nm) En la Tabla 4 se recogen los paraacutemetros analiacuteticos de calidad para la determinacioacuten de resveratrol mediante fluorescencia fotoinducida ndash segunda derivada
CAPIacuteTULO II Determinacioacuten fluorimeacutetrica de resveratrol en vino
105
Tabla 4- Paraacutemetros analiacuteticos para la determinacioacuten de trans-resveratrol mediante fluorescencia fotoinducida ndash segunda derivada
Rango Lineal (ngmiddotmL-1) 66 ndash 66
Ordenada en el Origen (a plusmn sa) -00904 plusmn 01310
Pendiente (b plusmn sb) (mLmiddot ng -1) 0182 plusmn 0004
Desviacioacuten Estaacutendar de la Regresioacuten (syx) 0397
Coeficiente de Correlacioacuten (r) 0995
Coeficiente de Determinacioacuten (r2) 0991
Linealidad 976
Resolucioacuten Analiacutetica (γ-1) (ngmiddotmL-1) 218
LOD Long y Winefordner (ngmiddotmL-1) 220
LOD Clayton (α=β=005) (ngmiddotmL-1) 498
Repetitividad del meacutetodo
Se preparan once disoluciones conteniendo 192 ngmiddotmL-1 de trans-
resveratrol en etanolagua 4060 vv y se irradian durante 60 segundos Se registran sus espectros de emisioacuten de fluorescencia manteniendo las condiciones experimentales empleadas en el establecimiento de la recta de calibrado y se obtienen los espectros segunda derivada mediante el algoritmo de Savitzky-Golay
(Δλ = 5 nm) La desviacioacuten estaacutendar relativa (n = 11) calculada sobre 2D356-364nm
es 48
CAPIacuteTULO II Determinacioacuten fluorimeacutetrica de resveratrol en vino
106
Determinacioacuten de resveratrol en vino mediante fluorescencia fotoinducida de segunda derivada
El procedimiento de extraccioacuten y posterior medida de la fluorescencia fotoinducida anteriormente optimizado se aplica al anaacutelisis de trans-resveratrol en muestras de vino Dicho procedimiento se puede enunciar como sigue en un embudo de decantacioacuten se antildeaden 010 mL de vino tinto oacute 05 mL de vino blanco 50 mL de disolucioacuten reguladora tartrato monoaacutecido de sodiotartrato disoacutedico 030 M de pH 50 y se diluye hasta un volumen final de 100 mL con agua ultrapura La solucioacuten acuosa resultante se extrae con 50 mL de eacuteter etiacutelico agitando durante 1 minuto Se aiacutesla la fase eteacuterea y se evapora a sequedad por paso de una corriente de nitroacutegeno a temperatura ambiente El residuo se redisuelve con 40 mL de etanol absoluto y se antildeade agua ultrapura hasta completar 100 mL Esta disolucioacuten es irradiada durante 60 segundos bajo una laacutempara de mercurio de alta presioacuten Se registra el espectro de fluorescencia (λexc= 260 nm) del fotoproducto generado y se calcula su espectro segunda derivada mediante el algoritmo de
Savytzki-Golay (Δλ = 5 nm) Se toma como sentildeal analiacutetica la amplitud de dicho
espectro derivado entre 356 y 364 nm (2D356-364 nm)
En la Figura 15 se recogen los espectros de fluorescencia fotoinducida asiacute como los espectros de primera y segunda derivada correspondientes a una muestra de vino tinto sin resveratrol antildeadido y a otra a la que se le ha antildeadido trans-resveratrol sometidas al procedimiento de extraccioacuten anteriormente optimizado Puede observarse coacutemo la sentildeal fluorescente correspondiente a la matriz del vino queda totalmente atenuada en el espectro segunda derivada
CAPIacuteTULO II Determinacioacuten fluorimeacutetrica de resveratrol en vino
107
Figura 15-Espectros de fluorescencia (λexc = 260 nm) y espectros primera y segunda derivada correspondientes a una mezcla de vinos tintos de crianza sin resveratrol antildeadido (-----) y con 157 microgmiddotmL-1 de trans-resveratrol (mdashmdash) extraiacutedas con eacuteter etiacutelico y sometidas a una dilucioacuten final de 100 veces
320 360 400 440λem (nm) (λexc= 260 nm)
0
200
400
600
800
Inten
sidad
de
Fluo
resc
encia
-10
0
10
201D
320 360 400 440λ
em (nm) (λexc= 260 nm)
-1
-05
0
05
1
152D
320 360 400 440λem (nm) (λexc= 260 nm)
CAPIacuteTULO II Determinacioacuten fluorimeacutetrica de resveratrol en vino
108
El meacutetodo propuesto se aplica entonces al anaacutelisis de distintas muestras de vino de la regioacuten Las muestras de que se dispone se dividen en tres grandes grupos -Vinos tintos joacutevenes -Vinos tintos de crianza -Vinos blancos y se prepara dentro de cada grupo una mezcla conteniendo voluacutemenes ideacutenticos de todos lo vinos que integran ese grupo con el objetivo de que esteacuten representadas las interferencias maacutes comunes en el anaacutelisis de cualquier muestra de vino Se aplica el meacutetodo de adicioacuten patroacuten por triplicado en cada mezcla de vinos y se construyen las correspondientes curvas sentildeal medida vs concentracioacuten de trans-resveratrol antildeadida Se aplica el test de comparacioacuten de pendientes entre las rectas obtenidas y la de calibrado comprobaacutendose que no existen diferencias significativas entre las pendientes de ninguna de las rectas de adicioacuten patroacuten y la recta de calibrado pudieacutendose concluir por tanto que no existe efecto de matriz Se comproboacute mediante cromatografiacutea de liacutequidos de alta resolucioacuten (HPLC)20 que las concentraciones de resveratrol en las muestras analizadas estaacuten por debajo de los liacutemites de deteccioacuten de la teacutecnica Los porcentajes medios de recuperacioacuten para cada mezcla de vinos y para cada nivel de concentracioacuten se han resumido en la Tabla 5 observaacutendose que son muy satisfactorios en todos los casos
20 Galeano Diacuteaz T Duraacuten Meraacutes I Airado Rodriacuteguez D J Sep Sci 2007 303110-3119
CAPIacuteTULO II Determinacioacuten fluorimeacutetrica de resveratrol en vino
109
Tabla 5- Resultados obtenidos en la determinacioacuten de trans-resveratrol en mezclas de vinos tintos joacutevenes y de crianza y blancos
Recuperacioacuten ( RSD) VINO Antildeadido (μgmiddotmL-1)
Tinto Joven Tinto Crianza
063 107 (5) 109 (4)
094 110 (4) 108 (8)
16 104 (2) 111 (3)
31 98 (4) 105 (3)
Tinto
47 104 (3) 101 (3)
013 100 (8)
019 94 (7)
031 102 (4)
063 96 (5)
Blanco
094 102 (3) Se ha analizado tambieacuten un vino tinto comercial (vino tinto de mesa
Carrefour) conteniendo una cantidad mayor de resveratrol y el resultado obtenido (112 μgmiddotmL-1 (8 RSD)) ha sido tambieacuten satisfactoriamente validado mediante HPLC
Perspectivas de futuro Se ha comprobado la retencioacuten de trans-resveratrol sobre membranas de nylon de manera que las principales perspectivas de futuro pasariacutean por el desarrollo de meacutetodos de determinacioacuten sobre soporte soacutelido
CAPIacuteTULO III
ANAacuteLISIS DE PICEIDO EN VINOS MEDIANTE FLUORESCENCIA FOTOINDUCIDA
APLICANDO SEGUNDA-DERIVADA A LOS ESPECTROS DE EMISIOacuteN
CAPIacuteTULO III Determinacioacuten fluorimeacutetrica de piceido en vino
112
CAPIacuteTULO III Determinacioacuten fluorimeacutetrica de piceido en vino
113
ANTECEDENTES El piceido es el principal derivado glucosilado del resveratrol e igual que eacutel
presenta los isoacutemeros trans y cis Este compuesto ha recibido la misma atencioacuten que el resveratrol porque en los productos derivados de la uva la concentracioacuten de la forma glucosada es significativamente mayor que la de la forma aglicona1 2 y la relacioacuten entre las dos formas depende entre otros factores de la fermentacioacuten y de las condiciones ecoloacutegicas2
La teacutecnica maacutes utilizada para su determinacioacuten en vinos es mediante HPLC efectuando en casi todos los casos una elucioacuten en gradiente utilizando como disolvente menos activo una disolucioacuten reguladora de caraacutecter aacutecido y llevando a cabo la deteccioacuten mediante sistema de diodos3-6 fluorescencia7 combinacioacuten en liacutenea de diodos y fluorescencia8 y mediante acoplamiento con
1 Lamuela Raventoacutes RM Romero Peacuterez AI Waterhouse AL de la Torre Boronat MC J Agric Food Chem 1995 43281-283 2 Moreno-Labanda JF Mallavia R Peacuterez-Fons L Lizama V Saura D Mico V J Agric Food Chem 2004 525396-5403 3 Ribeiro de Lima MT Waffo-Teacuteguo P Teissedre PL Pujolas A Vercauteren J Cabanis JC Meacuterillon JM J Agric Food Chem 1999 472666-2670 4 Burns J Yokota T Ashihara H Jean MEJ Crozier A J Agric Food Chem 2002 503337-3340 5 Vitrac X Bornet AVanderline R Valls J Richard T Delaunay JC Meacuterillon JM Teisseacutedre PL J Agric Food Chem 2005 535664-5669 6 Abert Vian M Tomao V Gallet S Coulomb PO Lacombe JM J Chromatogr A 2005 1085224-229 7 Vitrac X Monti JP Vercauteren J Deffieux G Meacuterillon JM Anal Chim Acta 2002 458103-110 8 Jeandet P Breuil AC Adrian M Weston LA Debord S Meunier P Maume G Bessis R Anal Chem1997 695172-5177
CAPIacuteTULO III Determinacioacuten fluorimeacutetrica de piceido en vino
114
espectrometriacutea de masas9-11 La electroforesis capilar con deteccioacuten de diodos tambieacuten ha sido empleada para su anaacutelisis12
Con respecto a las etapas previas de tratamiento las muestras de vino para
su posterior anaacutelisis lo mas usual es realizar una extraccioacuten liacutequido-liacutequido con acetato de etilo seguida de una evaporacioacuten y redisolucioacuten del residuo en la fase moacutevil utilizada9 11 Tambieacuten se han propuesto realizar una etapa de limpieza a traveacutes de una columna de intercambio ioacutenico3 La extraccioacuten en fase soacutelida es otra posibilidad muy utilizada tanto en cromatografiacutea como en electroforesis10 12 En algunos casos las muestras de vino son introducidas directamente en el sistema cromatograacutefico previa filtracioacuten a traveacutes de un filtro de celulosa 4 6 7 En cuanto a sus propiedades espectroscoacutepicas este compuesto no presenta fluorescencia nativa pero se ha comprobado que la irradiacioacuten con luz UV provoca la conversioacuten del trans al cis-isoacutemero13 14 el cual raacutepidamente evoluciona hasta formar un compuesto que presenta elevada fluorescencia Este hecho es lo que nos ha permitido explorar la posible determinacioacuten mediante fluorescencia fotoinducida del piceido en muestras de vino
9 Bravo MN Silva S Coelho AV Vilas Boas L Bronze MR Anal Chim Acta 2006 563 84-92 10 Domiacutenguez C Guilleacuten DA Barroso CG J Chromatogr A 2001 918303-310 11 Pozo-Bayoacuten MA Hernaacutendez MT Martiacuten-Aacutelvarez PJ Polo MC J Agric Food Chem 2003 51 2089-2095 12 Brandoline V Maietti A Tedeschi P Durini E Vertuani S Manfredini S J Agric Food Chem 2002 507407-7411 13 Roggero JP J Food Comp Anal 2000 1393-97 14 Roggero JP Garciacutea-Parrilla C Sci Aliments 1995 15 411-422
CAPIacuteTULO III Determinacioacuten fluorimeacutetrica de piceido en vino
115
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN Estudio baacutesico sobre las propiedades de intereacutes analiacutetico de trans-pieido
Caracterizacioacuten absorbente y luminiscente en distintos disolventes
Con el objetivo de caracterizar fotomeacutetricamente y fluorimeacutetricamente el trans-piceido se preparan disoluciones de dicho analito por dilucioacuten de aliacutecuotas de 050 mL de una disolucioacuten de 57 microgmiddotmL-1 de analito en etanol con distintos disolventes hasta un volumen final de 250 mL El porcentaje de etanol (2 ) en estas disoluciones es suficientemente pequentildeo para no modificar las propiedades de los mismos Los disolventes empleados son agua y disolventes orgaacutenicos de distintas polaridades como metanol etanol acetonitrilo dimetilsulfoacutexido NN-dimetilformamida 14-dioxano ciclohexano y hexano asiacute como mezclas hidroetanoacutelicas de diferente composicioacuten
En todos los casos se registran los espectros de absorcioacuten utilizando como blanco el correspondiente disolvente igualmente con un 2 de etanol En la Figura 1 se recoge el espectro en medio acuoso observaacutendose una banda de absorcioacuten centrada a 312 nm con un ancho de banda de 20 nm en la que se distinguen dos maacuteximos centrados a 306 y 318 nm respectivamente La fisonomiacutea del espectro no se ve afectada por la naturaleza del disolvente
CAPIacuteTULO III Determinacioacuten fluorimeacutetrica de piceido en vino
116
Figura 1- Espectro de absorcioacuten correspondiente a una disolucioacuten acuosa (20 vv etanol) conteniendo 114 microgmiddotmL-1 de trans-piceido
Los espectros fluorescentes de excitacioacuten y emisioacuten en algunos de los disolventes utilizados se recogen en la Figura 2 Se observa que en todos los medios ensayados este compuesto es deacutebilmente fluorescente y que en acetonitrilo etanol agua o mezclas hidroetanoacutelicas presenta dos maacuteximos de excitacioacuten centrados a 225 y 318 nm y un uacutenico maacuteximo de emisioacuten centrado a 390 nm En dimetilformamida se observa un aumento de su rendimiento cuaacutentico de fluorescencia asiacute como la desaparicioacuten del primer maacuteximo de excitacioacuten Por otra parte el espectro de emisioacuten se desplaza hipsocroacutemicamente hasta 373 nm en hexano ciclohexano y 14-dioxano
240 280 320 360 400λ (nm)
0
002
004
006
008Ab
sorb
ancia
CAPIacuteTULO III Determinacioacuten fluorimeacutetrica de piceido en vino
117
Figura 2- Espectros de excitacioacuten y emisioacuten de disoluciones de trans-piceido en diferentes medios etanolagua 4060 vv (λexcem 318390 nm) (mdashmdash) dimetilformamida (20 etanol) (λexcem 323390 nm) (mdashmdash) y hexano (20 etanol) (λexcem 315373 nm) (mdashmdash) [trans-piceido] = 114 microgmiddotmL-1
Influencia de la acidez del medio y caacutelculo de contantes de ionizacioacuten de trans-piceido Una vez caracterizado el analito espectroscoacutepicamente en distintos disolventes se procede al estudio de la influencia de la acidez del medio sobre sus propiedades absorbentes y fluorescentes El estudio se lleva a cabo en medio acuoso y en medio hidroetanoacutelico conteniendo un 40 (vv) de etanol La fuerza ioacutenica se fija en todos los casos por adicioacuten de KCl en una concentracioacuten final de 010 molmiddotL-1 La variacioacuten del pH se efectuacutea por adicioacuten de pequentildeos voluacutemenes de disoluciones diluidas de HCl y NaOH La acidulacioacuten y la alcalinizacioacuten de la disolucioacuten se llevan a cabo sobre aliacutecuotas independientes de la misma puesto que no se dispone de datos acerca de la reversibilidad de los equilibrios en que este compuesto participa
0
4
8
12
16
Inten
sidad
de F
luore
scen
cia
200 300 400 500λ (nm)
CAPIacuteTULO III Determinacioacuten fluorimeacutetrica de piceido en vino
118
Los espectros maacutes representativos registrados en todo el rango de pH asiacute como la variacioacuten de las sentildeales fotomeacutetricas a distintas longitudes de onda con el pH en los dos medios de trabajo ensayados se recogen en las Figuras 3 y 4
Tanto en medio hidroetanoacutelico como acuoso a medida que disminuye la
acidez se produce un desplazamiento batocroacutemico del maacuteximo de absorcioacuten desde 306 a 344 nm Los datos derivados de estas experiencias nos han permitido cal-cular los valores de pKa en ambos medios y los resultados obtenidos mediante los meacutetodos de Stenstroumlm y Goldsmith15 y Wilson y Lester16 se resumen en la Tabla 1
Figura 3- Influencia del pH sobre (A) los espectros de absorcioacuten de disoluciones hidroetanoacutelicas de trans-piceido y (B) sobre la absorbancia a 306 y 344 nm [trans-piceido] = 228 microgmiddotmL-1 etanolagua 4060 vv
15 Stenstroumlm W Goldsmith N J Phys Chem 1926 301683-1687 16 Wilson RF Lester GW Talanta 1963 10319-322
240 280 320 360 400λ (nm)
0
004
008
012
016
02
Abso
rban
cia
lt 70 gt 120
105
A
0 2 4 6 8 10 12 14pH
0
004
008
012
016
02
Abso
rban
cia
344 nm
306 nm
B
CAPIacuteTULO III Determinacioacuten fluorimeacutetrica de piceido en vino
119
Figura 4- Influencia del pH sobre (A) los espectros de absorcioacuten de disoluciones acuosas de trans-piceido y (B) sobre la absorbancia a 306 y 344 nm [trans-piceido] = 200 microgmiddotmL-1
El comportamiento aacutecido-base de este analito tambieacuten se ha estudiado mediante fluorescencia siguiendo el mismo meacutetodo operatorio que en absorcioacuten molecular y trabajando con disoluciones que contienen 097 microgmiddotmL-1 de trans-piceido
En las Figuras 5 y 6 se recogen los espectros de excitacioacuten y emisioacuten del analito en medio aacutecido y baacutesico en cada uno de dos medios de trabajo ensayados asiacute como la variacioacuten de la sentildeal de fluorescencia medida a las longitudes de onda correspondientes a los maacuteximos de fluorescencia de las formas aacutecida y baacutesica con el pH
Como se observa en la Figura 5 los espectros de excitacioacuten y emisioacuten
fluorescente de trans-piceido en etanolagua 4060 vv se desplazan batocroacutemicamente de 292 a 344 nm y de 392 a 447 nm respectivamente como consecuencia del aumento del pH
240 280 320 360 400λ (nm)
0
004
008
012
016
02
Abso
rban
cia
lt 70 gt 110
98
A
0 2 4 6 8 10 12 14pH
0
004
008
012
016
02
Abso
rban
cia
306 nm
344 nm
B
CAPIacuteTULO III Determinacioacuten fluorimeacutetrica de piceido en vino
120
Figura 5- Influencia del pH sobre (A) los espectros de excitacioacuten y emisioacuten de disoluciones hidroetanoacutelicas de trans-piceido y (B) sobre la intensidad de fluorescencia [trans-piceido] = 097 microgmiddotmL-1 etanolagua 4060 vv Figura 6- Influencia del pH sobre (A) los espectros de absorcioacuten de disoluciones acuosas de trans-piceido y (B) sobre la intensidad de fluorescencia [trans-piceido] = 114 microgmiddotmL-1
200 300 400 500 600λ (nm)
0
200
400
600
Inten
sidad
de F
luore
scen
cia
gt 110
gt 60
A
0 2 4 6 8 10 12 14pH
0
200
400
600
Inten
sidad
de F
luore
scen
cia
λexcem= 344457 nm
λexcem= 318405 nm
B
200 300 400 500λ (nm)
0
20
40
60
80
100
Inten
sidad
de F
luore
scen
cia
lt 70gt 115
A
0 2 4 6 8 10 12 14pH
0
20
40
60
80
100
Inten
sidad
de F
luore
scen
cia
λexcem= 292392 nm
λexcem= 344447 nm
B
CAPIacuteTULO III Determinacioacuten fluorimeacutetrica de piceido en vino
121
En medio acuoso ademaacutes del desplazamiento batocroacutemico de los maacuteximos de excitacioacuten y emisioacuten de 318 a 344 nm y de 405 a 457 nm respectivamente se observa un aumento del rendimiento cuaacutentico de fluorescencia en medio baacutesico En ambos casos se observa un punto isoemisivo lo que indica la presencia de dos especies en equilibrio es decir la existencia de un equilibrio de disociacioacuten aacutecido-base Para dichos equilibrios se han calculado valores de pKa en medio hidroetanoacutelico y en medio acuoso Los resultados obtenidos se presentan en la Tabla 1 Tabla 1- Valores de pKa calculados para el trans-piceido en distintos medios mediante fotometriacutea y fluorescencia
Meacutetodo de Caacutelculo pKa trans-piceido
Stenstroumlm y Goldsmith 102 plusmn 01 EtanolAgua 4060 vv Wilson y Lester 103
Stenstroumlm y Goldsmith 99 plusmn 09
FOTO
METR
IacuteA
Agua Wilson y Lester 93
Stenstroumlm y Goldsmith 104 plusmn 01 EtanolAgua 4060 vv Wilson y Lester 104
Stenstroumlm y Goldsmith 88 plusmn 03
FLUO
RESC
ENCI
A
Agua Wilson y Lester 88
Valor medio plusmn Desviacioacuten Estaacutendar
CAPIacuteTULO III Determinacioacuten fluorimeacutetrica de piceido en vino
122
Solamente se ha encontrado un artiacuteculo17 en el cual se describe el caacutelculo de la constante de disociacioacuten de primer orden de trans-piceido en medio acuoso mediante electroforesis obtenieacutendose un valor de pKa1 = 940 valor bastante en consonancia con el calculado por nosotros mediante fotometriacutea en medio acuoso empleando el meacutetodo de Wilson y Lester
Rectas de calibrado y paraacutemetros analiacuteticos de calidad
Se procede a estudiar la relacioacuten entre la concentracioacuten de trans-piceido
puesta y la sentildeal fotomeacutetrica o fluorescente medida y al establecimiento de las correspondientes rectas de calibrado
Para obtener las sentildeales fotomeacutetricas se procede antildeadiendo en la cubeta de medida 200 mL de agua ultrapura y voluacutemenes crecientes comprendidos entre 0020 y 025 mL de la disolucioacuten de 57 microgmiddotmL-1 de trans-piceido en etanol y registrando los espectros de absorcioacuten en el rango de longitudes de onda comprendido entre 240 y 360 nm Las medidas de fluorescencia se realizan antildeadiendo directamente en la cubeta de medida 180 mL de agua y 120 mL de etanol absoluto con el objetivo de mantener la composicioacuten oacuteptima del medio de trabajo porque la emisioacuten fluorescente depende del de etanol en el medio Sobre esta mezcla hidroetanoacutelica una vez desgasificada por ultrasonidos se antildeaden voluacutemenes sucesivos de una disolucioacuten etanoacutelica de trans-resveratrol conteniendo 19 microgmiddotmL-1 en incrementos de 10 microL hasta llegar a 010 mL Tras cada nueva adicioacuten se registran los espectros de emisioacuten de fluorescencia en las siguientes condiciones
17 Cao J Chen GH Du YS Hou FF Tian YL J Liquid Chromatogr amp Rel Technol 2006 291457-1463
CAPIacuteTULO III Determinacioacuten fluorimeacutetrica de piceido en vino
123
instrumentales 20ordm C rendija de excitacioacuten 5 nm rendija de emisioacuten 5 nm voltaje del tubo fotomultiplicador 800 V y λexc = 318 nm Las ecuaciones de las rectas obtenidas mediante ambas teacutecnicas asiacute como los paraacutemetros analiacuteticos de calidad se encuentran recogidos en la Tabla 2
Tabla 2- Paraacutemetros analiacuteticos de calidad para la determinacioacuten fotomeacutetrica y fluorimeacutetrica de trans-piceido
Fotometriacutea Fluorescencia
Sentildeal Analiacutetica A306 nm IF318390 nm
Rango Lineal (microgmiddotmL-1) 060 ndash 600 0060 ndash 060
Ordenada en el Origen (a plusmn sa) -00037 plusmn 00010 267 plusmn 40
Pendiente (b plusmn sb) (mLmiddotmicrog-1) 00727 plusmn 00003 687 plusmn 11
Desviacioacuten Estaacutendar de la Regresioacuten (syx) 00033 101
Coeficiente de Correlacioacuten (r) 0999 0997
Coeficiente de Determinacioacuten (r2) 0999 0995
Linealidad 996 984
Resolucioacuten Analiacutetica (γ-1) (microgmiddotmL-1) 00450 00147
LOD Long y Winefordner18 (microgmiddotmL-1) 00433 00326
LOD Clayton19 (α=β=005) (microgmiddotmL-1) 0101 00352
18 Long GL Winefordner JD Anal Chem 1983 55712ndash724 19 Clayton CA Hines JW Elkins PD Anal Chem 1987 592506ndash2514
CAPIacuteTULO III Determinacioacuten fluorimeacutetrica de piceido en vino
124
Repetitividad de los meacutetodos
Este estudio se realiza siguiendo los procedimientos que se describen Meacutetodo fotomeacutetrico En la cubeta de medida se depositan 20 mL de agua
ultrapura y 50 microL de disolucioacuten etanoacutelica de trans-piceido conteniendo 57 microgmiddotmL-1 y se mide su absorbancia a 306 nm El proceso se repite once veces Se calcula la media y la desviacioacuten estaacutendar de las mediciones realizadas asiacute como la desviacioacuten estaacutendar relativa como la razoacuten entre ambas
Meacutetodo fluorimeacutetrico En la cubeta de medida de fluorescencia se depositan 120 mL de etanol absoluto y 180 mL de agua ultrapura la mezcla hidroetanoacutelica se pasa por un bantildeo de ultrasonidos para ser desgasificada y sobre ella se antildeaden 50 microL de disolucioacuten etanoacutelica diluida de trans-piceido conteniendo 19 microgmiddotmL-1 Se registra su espectro de emisioacuten de fluorescencia en condiciones ideacutenticas a las empleadas en el establecimiento de la recta de calibrado El proceso se repite once veces Se calcula la media y la desviacioacuten estaacutendar de las sentildeales medidas a 385 nm asiacute como la desviacioacuten estaacutendar relativa del conjunto de mediciones Las desviaciones estaacutendar relativas calculadas en cada caso sobre las sentildeales medidas resultan ser 19 y 58 respectivamente
Efecto de la irradiacioacuten ultravioleta externa sobre las propiedades absorbentes y fluorescentes de trans-piceido
Se lleva a cabo un estudio sobre la fotorreaccioacuten que sufre el trans-piceido
al exponerlo a radiacioacuten UV intensa mediante fotometriacutea y fluorescencia molecular estudiaacutendose como influye el disolvente y la acidez del medio
CAPIacuteTULO III Determinacioacuten fluorimeacutetrica de piceido en vino
125
Influencia del disolvente
Se lleva a cabo el estudio de la fotorreaccioacuten que sufre el trans-piceido en distintos medios de trabajo mediante fotometriacutea y fluorescencia molecular Para ello se preparan disoluciones del analito con disolventes orgaacutenicos de diferentes polaridades asiacute como en agua y en mezclas hidroetanoacutelicas y en cada uno de los casos se realiza una influencia del tiempo de irradiacioacuten bajo una laacutempara de mercurio de alta presioacuten Cronoloacutegicamente los ensayos mediante fluorescencia se realizaron previamente a los de fotometriacutea de manera que mediante fotometriacutea soacutelo se estudioacute la fotorreaccioacuten en medios hidroetanoacutelicos por los motivos que maacutes adelante se exponen
Absorcioacuten molecular- Como ya se ha comentado el espectro de absorcioacuten de trans-piceido no se ve afectado por el disolvente siendo ideacutentico en etanol en agua y en medios hidroetanoacutelicos de diferente composicioacuten No ocurre lo mismo con los fotoproductos que se obtienen como consecuencia de la irradiacioacuten de sus disoluciones bajo una laacutempara de mercurio de alta presioacuten La cineacutetica de los foto-procesos tambieacuten se ve influenciada por la composicioacuten del medio de trabajo Para estudiar la influencia del disolvente sobre las fotorreacciones que sufre este analito se preparan disoluciones en presencia de porcentajes crecientes de etanol conteniendo todas ellas 114 microgmiddotmL-1 de trans-piceido Cada una de estas disoluciones se irradia durante intervalos de tiempo acumulativos y se registran los correspondientes espectros de absorcioacuten entre 240 y 360 nm Figura 7
CAPIacuteTULO III Determinacioacuten fluorimeacutetrica de piceido en vino
126
Como puede observarse la irradiacioacuten ultravioleta de las disoluciones
acuosas etanoacutelicas o hidroetanoacutelicas de trans-piceido provoca la desaparicioacuten inmediata de la banda de absorcioacuten centrada a 312 nm en favor de un nuevo maacuteximo de absorcioacuten centrado a 290 nm correspondiente a cis-piceido seguacuten se encuentra descrito en la bibliografiacutea13 14 Para tiempos de irradiacioacuten superiores a 60 segundos se observa la aparicioacuten de un nuevo maacuteximo centrado a 261 nm que alcanza su maacutexima intensidad para disoluciones conteniendo un 40 de etanol e irradiadas durante 180 segundos y que es insignificante en disoluciones puramente etanoacutelicas y muy deacutebil en disoluciones con porcentajes acuosos superiores al 60 Cuando las disoluciones de trans-piceido son irradiadas durante un tiempo de 10 minutos tiene lugar la destruccioacuten de este uacuteltimo fotoproducto
Para concluir merece la pena destacar que se ha comprobado a traveacutes de
los estudios llevados a cabo mediante absorcioacuten molecular que el tiempo de irradiacioacuten necesario para la obtencioacuten de los fotoproductos es mayor cuanto mayor es la concentracioacuten de trans-piceido en la disolucioacuten original
CAPIacuteTULO III Determinacioacuten fluorimeacutetrica de piceido en vino
127
Figura 7- Influencia del tiempo de irradiacioacuten sobre los espectros de absorcioacuten de disoluciones conteniendo 114 microgmiddotmL-1 de trans-piceido en etanol absoluto (A) y etanolagua 6040 vv (B) 4060 vv (C) y 496 vv (D) sin irradiar (mdashmdash) e irradiadas durante 5 segundos (mdashmdash) 30 segundos (mdashmdash) 60 segundos (mdashmdash) 120 segundos (mdashmdash) 180 segundos (mdashmdash) y 600 segundos (mdashmdash)
240 280 320 360λ (nm)
0
003
006
009
Abso
rban
cia
D
A
0
003
006
009
Abso
rban
cia
240 280 320 360λ (nm)
B
240 280 320 360λ (nm)
0
003
006
009
Abso
rban
cia
C
240 280 320 360λ (nm)
0
003
006
009
Abso
rban
cia
CAPIacuteTULO III Determinacioacuten fluorimeacutetrica de piceido en vino
128
Fluorescencia molecular- Para examinar los efectos de la irradiacioacuten ultravioleta externa sobre el comportamiento fluorescente de trans-piceido se prepara una disolucioacuten conteniendo 030 microgmiddotmL-1 de analito en etanolagua 4060 vv y se registran los espectros de excitacioacuten y emisioacuten de fluorescencia de dicha disolucioacuten recieacuten preparada y tras ser irradiada durante un tiempo bajo una laacutempara de mercurio de alta presioacuten
Se comprueba que la irradiacioacuten ultravioleta externa de disoluciones
hidroetanoacutelicas de trans-piceido tiene como consecuencia la generacioacuten de fotoproductos altamente fluorescentes como puede observarse en la Figura 8
Los espectros de estos fotoproductos se caracterizan por presentar un
intenso y agudo maacuteximo de excitacioacuten centrado a 261 nm y dos maacuteximos de emisioacuten no menos agudos a 361 y 379 nm respectivamente
Figura 8- Espectros de excitacioacuten y emisioacuten correspondientes a una disolucioacuten conteniendo 120 microgmiddotmL-1 de trans-piceido en etanolagua 4060 vv aislada de la luz (mdashmdash) (λexcem 318390 nm) e irradiada durante 180 segundos (mdashmdash) (λexcem 261361 nm )
200 300 400 500λ (nm)
0
400
800
1200
1600
Inten
sidad
de F
luore
scen
cia
CAPIacuteTULO III Determinacioacuten fluorimeacutetrica de piceido en vino
129
El estudio de la influencia del tiempo de irradiacioacuten se lleva a cabo en disolventes orgaacutenicos de distintas polaridades Se ensayan concretamente metanol etanol acetonitrilo dimetilsulfoacutexido NN-dimetilformamida 14-dioxano ciclohexano y hexano Se observa que la naturaleza del fotoproducto es independiente del disolvente sin embargo la velocidad de las fotorreacciones siacute estaacute influida por el disolvente siendo mayor en medios puramente orgaacutenicos que en medios hidroorgaacutenicos Por otro lado tambieacuten depende del disolvente el rendimiento cuaacutentico de fluorescencia de los fotoproductos que es maacuteximo en medios hidroetanoacutelicos con proporciones similares de etanol y agua Se selecciona por tanto el medio hidroetanoacutelico como oacuteptimo para el desarrollo de la fotorreaccioacuten procedieacutendose a continuacioacuten a la optimizacioacuten de las proporciones relativas de etanol y agua en el medio de trabajo Para ello se preparan una serie de disoluciones en mezclas de etanol y agua con distintas proporciones de ambos disolventes conteniendo todas ellas 060 microgmiddotmL-1 de trans-
piceido y se irradian durante diferentes tiempos Las sentildeales obtenidas se representan en la Figura 9A
El comportamiento general en todas las mezclas ensayadas consiste en un aumento de la sentildeal de fluorescencia fotoinducida con el tiempo de irradiacioacuten hasta alcanzar un maacuteximo seguido por un decaimiento de la sentildeal probablemente debido a la destruccioacuten de los fotoproductos y a la generacioacuten de otros compuestos no fluorescentes En disoluciones puramente etanoacutelicas el tiempo de irradiacioacuten oacuteptimo estaacute en torno a 50 segundos pero el rendimiento cuaacutentico de fluorescencia de los fotoproductos es muy pequentildeo A medida que disminuye el porcentaje de etanol aumentan tanto el tiempo de irradiacioacuten oacuteptimo como las sentildeales de fluorescencia fotoinducida Las maacuteximas sentildeales se obtienen en medios con un porcentaje de etanol comprendido entre el 30 y el 50 con un tiempo de
CAPIacuteTULO III Determinacioacuten fluorimeacutetrica de piceido en vino
130
irradiacioacuten de 180 segundos Por ello para las siguientes experiencias se elige como medio de trabajo oacuteptimo una mezcla etanolagua 4060 vv
Figura 9- (A) Influencia del tiempo de irradiacioacuten sobre disoluciones de trans-piceido en etanol absoluto (mdashmdash) y etanolagua 8020 vv (mdashmdash) 4060 vv (mdashmdash) y 1080 vv (mdashmdash) (B) Influencia del porcentaje de etanol sobre la intensidad de fluorescencia irradiando durante 180 segundos [trans-piceido] = 060 microgmiddotmL-1 λexc = 261 nm λem = 361 nm
Adicionalmente se estudia por separado coacutemo afecta la presencia de etanol a la fotorreaccioacuten y al rendimiento cuaacutentico de fluorescencia de los fotoproductos encontraacutendose que en el caso del piceido se obtienen mayores sentildeales irradiando muestras 100 acuosas y antildeadiendo etanol hasta completar el 40 vv previamente a la medida de la fluorescencia
Influencia de la acidez del medio sobre las propiedades absorbentes y
fluorescentes de los fotoproductos de piceido
Para llevar a cabo el estudio de la influencia de la acidez del medio sobre las propiedades espectroscoacutepicas de los fotoproductos de piceido se procede irradiando disoluciones puramente acuosas de trans-piceido y antildeadiendo posteriormente etanol absoluto hasta completar el 40 vv Se preparan de esta manera dos disoluciones conteniendo 37 y 057 microgmiddotmL-1 para ser estudiadas
0 100 200 300Tiempo de Irradiacioacuten (s)
0
200
400
600
I F (
361 n
m) (λ
exc =
261 n
m)
A
0 20 40 60 80 100 v Etanol
0
200
400
600
I F (
361 n
m) (λ
exc =
261 n
m)
B
CAPIacuteTULO III Determinacioacuten fluorimeacutetrica de piceido en vino
131
mediante fotometriacutea y fluorescencia respectivamente Los espectros de absorcioacuten y los espectros fluorescentes de excitacioacuten y emisioacuten a distintos valores de pH se encuentran recogidos en las Figuras 10 y 11 respectivamente asiacute como la variacioacuten de las sentildeales fotomeacutetrica y fluorescente con el pH Figura 10- Influencia del pH sobre (A) Espectros de absorcioacuten de los fotoproductos del trans-piceido (37 microgmiddotmL-1) en etanolagua 4060 vv y (B) sobre la absorbancia medida a 261 y 282 nm
El espectro de absorcioacuten de disoluciones aacutecidas neutras y ligeramente baacutesicas de los fotoproductos de piceido muestra un soacutelo maacuteximo centrado a 261 nm como puede observarse en la Figura 10A cuya posicioacuten e intensidad permanecen constantes a pH inferiores a 80 Para valores superiores de pH se observa un decaimiento de la sentildeal y la aparicioacuten de un nuevo maacuteximo centrado a 271 nm que existe soacutelo en el intervalo de pH 105-110 En medios maacutes baacutesicos se observa un desplazamiento batocroacutemico y un efecto hipercroacutemico apareciendo un nuevo maacuteximo centrado a 282 nm cuya posicioacuten e intensidad se mantiene praacutecticamente constante a partir de pH 120
240 260 280 300 320 340 360λ (nm)
0
01
02
03Ab
sorb
ancia
0 2 4 6 8 10 12 14pH
008
012
016
02
024
028
Abso
rban
cia
261 nm
282 nm
80
100104
108111
gt 12
CAPIacuteTULO III Determinacioacuten fluorimeacutetrica de piceido en vino
132
Figura 11- Influencia del pH sobre (A) Los espectros de excitacioacuten y emisioacuten de los fotoproductos de trans-piceido (057 microgmiddotmL-1) y (B) sobre la intensidad de fluorescencia (λexcem = 261361 nm)
Los espectros de excitacioacuten y emisioacuten de los fotoproductos de piceido en medio aacutecido y neutro estaacuten caracterizados por maacuteximos centrados a 261 nm y 361 y 379 nm respectivamente Figura 11A Los fotoproductos son muy poco fluorescentes a pH superiores a 110 no obstante puede observarse un desplazamiento batocroacutemico del maacuteximo de emisioacuten hasta 271 nm asiacute como la aparicioacuten de un uacutenico maacuteximo de emisioacuten centrado a 420 nm La variacioacuten de la sentildeal fluorescente (λexcem = 261361 nm) con el pH Figura 11B muestra un draacutestico decaimiento a partir de pH 80 obtenieacutendose una sentildeal praacutecticamente nula para pH superiores a 110
Finalmente se ha estudiado fotomeacutetrica y fluorimeacutetricamente la reversibilidad de los equilibrios aacutecido-base de los fotoproductos de piceido Para ello se alcalinizan las muestras hasta un pH en torno a 12 y se acidulan a continuacioacuten hasta un pH proacuteximo al inicial Por comparacioacuten de los espectros correspondientes a las muestras neutras originales y los registrados tras la variacioacuten del pH se deduce que en el caso de trans-piceido el proceso aacutecido base es totalmente reversible trataacutendose pues de un auteacutentico equilibrio aacutecido-base
0 2 4 6 8 10 12 14pH
0
200
400
600
I F (3
61 n
m) (λ
exc=
261 n
m)
200 250 300 350 400 450λ (nm)
0
200
400
600Int
ensid
ad de
Fluo
resc
encia
lt 80
gt 115
99
CAPIacuteTULO III Determinacioacuten fluorimeacutetrica de piceido en vino
133
No obstante no se ha calculado el valor de la constante de ionizacioacuten porque cromatograacuteficamente se ha comprobado la formacioacuten de dos fotoproductos fluorescentes
Rectas de calibrado y paraacutemetros analiacuteticos de calidad
Establecida la influencia de las variables quiacutemicas anteriormente detalladas se procede a continuacioacuten a estudiar la relacioacuten entre la concentracioacuten de piceido puesta y la sentildeal de fluorescencia fotoinducida medida y al establecimiento de la correspondiente recta de calibrado
Para ello se preparan disoluciones en el rango de concentraciones entre
60 y 30 ngmiddotmL-1 de trans-piceido La irradiacioacuten se lleva a cabo en medio acuoso durante 180 segundos con la posterior adicioacuten de etanol absoluto hasta completar el 40 vv Se registran los espectros de emisioacuten de fluorescencia de las disoluciones irradiadas en las siguientes condiciones experimentales 20ordm C rendija de excitacioacuten 5 nm rendija de emisioacuten 5 nm voltaje del tubo fotomultiplicador 750 V y λexc = 261 nm Los paraacutemetros analiacuteticos se resumen en la Tabla 3
CAPIacuteTULO III Determinacioacuten fluorimeacutetrica de piceido en vino
134
Tabla 3- Paraacutemetros analiacuteticos para la determinacioacuten mediante fluorescencia fotoinducida de trans-piceido
Sentildeal Analiacutetica IF 261361 nm
Rango Lineal (ngmiddotmL-1) 60 ndash 30
Ordenada en el Origen (a plusmn sa) 182 plusmn 19
Pendiente (b plusmn sb) (mLmiddot ng -1) 668 plusmn 011
Desviacioacuten Estaacutendar de la Regresioacuten (syx) 455
Coeficiente de Correlacioacuten (r) 0998
Coeficiente de Determinacioacuten (r2) 0997
Linealidad 984
Resolucioacuten Analiacutetica (γ-1) (ngmiddotmL-1) 0681
LOD Long y Winefordner (ngmiddotmL-1) 0850
LOD Clayton (α=β=005) (ngmiddotmL-1) 168
Repetitividad del meacutetodo
Se preparan once disoluciones independientes conteniendo 143 ngmiddotmL-1 de trans-piceido previamente irradiadas en las mismas condiciones que en el la recta de calibrado y se registran sus espectros de emisioacuten manteniendo las condiciones experimentales empleadas en el establecimiento de la recta de calibrado La desviacioacuten estaacutendar relativa resulta ser del 23
CAPIacuteTULO III Determinacioacuten fluorimeacutetrica de piceido en vino
135
Estudio extracto-espectrofluorimeacutetrico del trans-piceido Aplicacioacuten al anaacutelisis de muestras de vino
Los meacutetodos descritos en la bibliografiacutea para el anaacutelisis de piceido en diversas muestras complejas siempre hacen uso de teacutecnicas separativas bien cromatograacuteficas o electroforeacuteticas pero actualmente no existen propuestos meacutetodos espectroscoacutepicos de anaacutelisis de este compuesto Se pretende desarrollar un nuevo meacutetodo de anaacutelisis de piceido en vino en presencia de su principal interferencia su aglicona mediante fluorescencia fotoinducida Como paso previo a la determinacioacuten mediante fluorescencia fotoinducida es necesario una etapa de limpieza de la muestra que se llevaraacute a cabo mediante una extraccioacuten liacutequido-liacutequido de las muestras de vino para reducir la sentildeal de fondo de la matriz Por ello se lleva a cabo un estudio extracto-espectrofluorimeacutetrico del analito con objeto de optimizar las condiciones para la extraccioacuten
Estudios previos
La extraccioacuten de piceido de la matriz acuosa con disolventes orgaacutenicos es maacutes problemaacutetica que la extraccioacuten de resveratrol Al emplear eacuteter etiacutelico como disolvente praacutecticamente el 100 del analito permanece en la fase acuosa probablemente debido a la elevada polaridad del residuo de glucosa presente en la moleacutecula de piceido Se ha comprobado que las mejores recuperaciones se obtienen al extraer con acetato de etilo no el trans-piceido sino sus fotoproductos Asiacute se consiguen los mejores resultados extrayendo disoluciones acuosas de
CAPIacuteTULO III Determinacioacuten fluorimeacutetrica de piceido en vino
136
piceido irradiadas durante 180 segundos El pH de estas disoluciones se fija a 50 tras la irradiacioacuten por adicioacuten de tampoacuten tartrato monoaacutecido de sodiotartrato disoacutedico ya que se comprueba tambieacuten que la presencia de tampoacuten en el proceso de irradiacioacuten supone una disminucioacuten draacutestica en la sentildeal de fluorescencia fotoinducida debido posiblemente a que el ioacuten tartrato impide de alguna manera que se complete la reaccioacuten fotoquiacutemica
Dado que la recuperacioacuten no es total y se observa una acusada influencia
de diversas variables sobre la extraccioacuten de los fotoproductos de piceido se ha utilizado en este caso el Disentildeo de Experimentos y la Metodologiacutea de Superficie de
Respuesta para la optimizacioacuten del proceso
Disentildeo de experimentos y metodologiacutea de la superficie de respuesta La metodologiacutea de superficie de respuesta es un conjunto de teacutecnicas
estadiacutesticas y matemaacuteticas para el descubrimiento del mejor valor de una variable de respuesta (variable de salida) y los valores de los factores (variables de entrada) que producen dicho valor oacuteptimo
En este meacutetodo el sistema se representa por una ecuacioacuten empiacuterica
basada en ecuaciones preseleccionadas usando los datos experimentales obtenidos del sistema para el ajuste de los correspondientes coeficientes Normalmente se usan modelos polinoacutemicos de segundo orden con teacuterminos cruzados que permiten describir concavidades o convexidades de la superficie La superficie representada por dicho modelo polinoacutemico se denomina Superficie de
Respuesta Asiacute para el estudio de dos variables se puede considerar que la superficie de respuesta se ajusta al modelo
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137
Respuesta = b0 + b1A + b2B + b12AB + b11A2 + b22B2
y en general
Respuesta = b0 + sumbiXi + sumbijXiXj + sumbiiXi2
El ajuste de esta ecuacioacuten implica la realizacioacuten de experiencias a maacutes de dos niveles para cada factor llevaacutendose a cabo la seleccioacuten de las experiencias por medio del uso de alguacuten Disentildeo Experimental apropiado
El fin de un disentildeo experimental consiste fundamentalmente en obtener la
maacutexima informacioacuten posible con el menor nuacutemero de experimentos y centrarse uacutenicamente en la recogida de la informacioacuten estrictamente necesaria Se disentildean o seleccionan un pequentildeo nuacutemero de experimentos que se realizan en unas condiciones controladas Existen diferentes tipos de disentildeo en funcioacuten de las caracteriacutesticas del sistema y el objetivo que se pretende conseguir En el presente caso dado que lo que se persiguen son los valores oacuteptimos de las variables significativas implicadas en la extraccioacuten se utiliza un Disentildeo Central Compuesto En este disentildeo cada factor tiene cinco niveles En el caso de tres factores Figura 12 estos seraacuten estrella bajo cubo bajo central cubo alto y estrella alto Cubo alto y bajo son los niveles superior e inferior que se especifican al definir las variables del disentildeo Las muestras estrellas estaacuten localizadas fuera del cubo Como consecuencia todas las muestras excepto la central estaacuten localizadas en la misma esfera si se dispone de tres factores o en una hiperesfera en los demaacutes casos y por consiguiente la informacioacuten que llevan tendraacute el mismo peso en los anaacutelisis (rotatividad) La dificultad de ajustar estos niveles es la principal desventaja de este tipo de disentildeo que por otra parte posee muy buenas propiedades estadiacutesticas
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138
Una vez realizados los experimentos determinados por el tipo de disentildeo elegido se procede a la determinacioacuten de los coeficientes polinoacutemicos del modelo experimental Del estudio del mismo puede deducirse no soacutelo la forma de dependencia de la respuesta con las variables consideradas sino tambieacuten las condiciones oacuteptimas buscadas
Figura 12- Disentildeo Central Compuesto para tres factores
Habitualmente se realiza un Anaacutelisis de la Varianza (ANOVA) con el que se comprobaraacute la significancia del modelo la utilidad de las interacciones y los teacuterminos cuadrados la calidad del ajuste del modelo y en uacuteltimo teacutermino la bondad de la superficie de respuesta Para ello se utiliza el software informaacutetico THE UNSCRAMBLER20 que permite realizar entre otros el ANOVA estudio de residuos anaacutelisis de efectos representacioacuten graacutefica de la superficie de respuesta en el espacio tridimensional asiacute como mapas de contorno para cada dos variables
La bondad de la superficie de respuesta la indica el ANOVA a traveacutes de los
paraacutemetros coeficiente de determinacioacuten (R2) falta de ajuste del modelo cuadraacutetico (ldquoLack of Fitrdquo) y chequeo del modelo cuadraacutetico (ldquoModel Check 20 Unscrambler v 611 CAMO AS Olav Tryggvasonsgt N-7011 Trondheim Norway
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139
Cuadraticrdquo) Estos dos uacuteltimos paraacutemetros tienen unos determinados palores ldquoprdquo (nivel de significacioacuten) de tal forma que para un nivel de confianza del 95 un valor de ldquoprdquo inferior a 005 para Model Check Cuadratic indica que la parte cuadraacutetica del modelo es significativa es decir que las interacciones y teacuterminos cuadrados incluidos en el modelo son uacutetiles un valor de ldquoprdquo superior a 005 para Lack of Fit indica que la peacuterdida o falta de ajuste del modelo no es significativa Por otra parte R2 interesa que sea proacuteximo a 09 El ANOVA que presenta un buen valor de R2 lleva asociado un buen valor de Model Check Cuadratic y Lack of Fit y en definitiva se concluye que la superficie de respuesta es vaacutelida para elegir el punto oacuteptimo que generalmente son las condiciones de las variables que maximizan la respuesta elegida Dicho punto tambieacuten lo presenta el ANOVA aunque se puede deducir analizando la superficie de respuesta en su forma tridimensional o como mapas de contorno En el caso del mapa de contorno se puede deducir una zona alrededor del punto oacuteptimo donde la respuesta no presenta una diferencia significativa respecto a la respuesta maacutexima Dicha zona seraacute interesante puesto que describe unos valores de las variables que pueden ser considerados tambieacuten como oacuteptimos
Ademaacutes el ANOVA presenta los valores de ldquoprdquo para cada uno de los
factores y las interacciones entre ellos de forma que un valor de ldquoprdquo inferior a 005 indica que ese factor o interaccioacuten influye de forma significativa con un 95 de probabilidad
El estudio de los residuos permite la deteccioacuten de posibles outliers
(muestras que no se ajustan al modelo) y por uacuteltimo la visualizacioacuten de las superficies o de las graacuteficas de contorno posibilita una interpretacioacuten final
CAPIacuteTULO III Determinacioacuten fluorimeacutetrica de piceido en vino
140
Planificacioacuten y realizacioacuten de las experiencias
Las variables quiacutemicas implicadas en el proceso de extraccioacuten de los fotoproductos fluorescentes del trans-piceido con acetato de etilo y los niveles considerados para cada una de ellas son las siguientes
- concentracioacuten de disolucioacuten reguladora tartaacuterico monoaacutecido de
sodiotartrato disoacutedico (NaHTrNa2Tr) de pH 50 0026 ndash 019 M
- relacioacuten de fases (mL F Acuosa mL F Orgaacutenica) 099 ndash 34 - tiempo de agitacioacuten 12 ndash 298 s
Con el disentildeo central compuesto se genera un total de 17 experimentos
Tabla 4 Las muestras se preparan de manera que el volumen final de la fase
acuosa sea siempre igual a 100 mL conteniendo 020 mL de disolucioacuten etanoacutelica 286 microgmiddotmL-1 de trans-piceido y voluacutemenes variables de agua ultrapura y disolucioacuten reguladora tartrato monoaacutecido de sodiotartrato disoacutedico 030 M de pH 50 irradiaacutendolas durante 180 segundos previamente a la adicioacuten del tampoacuten La fase acuosa se extrae con el volumen de acetato de etilo que marque la relacioacuten de fases agitando durante el tiempo correspondiente en cada caso Se registra el espectro de emisioacuten de fluorescencia de la fase acuosa antes y despueacutes de ser extraiacuteda en las siguientes condiciones instrumentales 20ordmC rendija de excitacioacuten 5
nm rendija de emisioacuten 5 nm voltaje del tubo fotomultiplicador 800 V y λexc = 261
nm
CAPIacuteTULO III Determinacioacuten fluorimeacutetrica de piceido en vino
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Tabla 4- Disentildeo Central Compuesto para tres variables
Posicioacuten en el disentildeo
Experiencia Nordm
[NaHTrNa2Tr] M pH 50
Relacioacuten de fases
Tiempo de agitacioacuten (s)
Low A 1 0026 25 155
High A 2 019 25 155
Low B 3 011 25 12
High B 4 011 25 298
Low C 5 011 099 155
High C 6 011 40 155
Cube 1 7 006 16 70
Cube 2 8 016 16 70
Cube 3 9 006 16 240
Cube 4 10 016 16 240
Cube 5 11 006 34 70
Cube 6 12 016 34 70
Cube 7 13 006 34 240
Cube 8 14 016 34 240
Central a 15 011 25 155
Central b 16 011 25 155
Central c 17 011 25 155
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Anaacutelisis de la superficie de respuesta
La sentildeal empleada para construir la superficie de respuesta es la diferencia entre las intensidades de fluorescencia medidas a 361 nm sobre los espectros de emisioacuten registrados a la fase acuosa antes y despueacutes de ser extraiacuteda Las caracteriacutesticas de la superficie de respuesta son
-R2 = 0862 -Multiple Correlation 0928 -Model Check Cuadratic (p lt 005) p = 07170 -Lack of Fit (p gt 005) p = 05182
El valor de ldquoprdquo para Lack of Fit indica que la peacuterdida de ajuste no es significativa ademaacutes el valor de R2 indica la bondad del modelo No obstante el valor de ldquoprdquo para Model Check Cuadratic es superior a 005 lo que indica que la parte cuadraacutetica del modelo no es significativa es decir que las interacciones y teacuterminos cuadrados incluidos en el modelo no son del todo uacutetiles
Aplicando el ANOVA al anaacutelisis de los ldquovalores prdquo para la superficie de
respuesta (Tabla 5) se deducen queacute variables influyen de forma significativa (p lt 005) En este caso dichas variables son la concentracioacuten de tampoacuten y la relacioacuten de fases mientras que el tiempo de agitacioacuten las interacciones entre las variables y los teacuterminos cuadraacuteticos no son significativas
En la Figura 13 se recogen las superficies de respuesta para las tres
combinaciones de las tres variables estudiadas El oacuteptimo estaraacute en la zona de maacutexima respuesta que es la zona de color negro En esta zona existe un punto que presenta el valor maacuteximo de respuesta que seraacute tomado como oacuteptimo Este punto corresponde a los siguientes valores para las variables
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-[ NaHTrNa2Tr] = 016 M -Tiempo de agitacioacuten = 150 s -Relacioacuten de fases = 07
Tabla 5- Anaacutelisis de los ldquovalores prdquo para las variables estudiadas
Variable Valor p
A [Tampoacuten] (M) 00422
B Tiempo de agitacioacuten (s) 06673
C Relacioacuten de fases 00020
AB 04561
AC 09239
BC 07689
AA 02931
BB 01602
CC 03235
El valor de relacioacuten de fases predicho como oacuteptimo se encuentra fuera de los liacutemites ensayados para esta variable No obstante se comproboacute que el porcentaje de recuperacioacuten obtenido al emplear como relacioacuten de fases 1 oacute 07 es el mismo fijando por tanto 1 como relacioacuten de fases oacuteptima
El rendimiento de la extraccioacuten calculado por comparacioacuten de la pendiente
de la recta de calibrado recogida en la Tabla 6 y una recta (r = 0995) construida extrayendo patrones en el mismo rango de concentraciones y en las condiciones determinadas como oacuteptimas resulta ser del 61
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Figura 13- Superficies de respuesta para cada par de variables instrumentales
CAPIacuteTULO III Determinacioacuten fluorimeacutetrica de piceido en vino
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Determinacioacuten de piceido en vino mediante fluorescencia fotoinducida de segunda derivada
A pesar del paso de extraccioacuten liacutequido-liacutequido de las muestras de vino la sentildeal fluorescente procedente de la matriz en las condiciones necesarias para la obtencioacuten de los espectros de fluorescencia fotoinducida de piceido no puede ser despreciada No obstante al igual que en caso de resveratrol dicha sentildeal se atenuacutea en gran medida por obtencioacuten de los espectros segunda derivada Los espectros segunda derivada se obtienen en todos los casos mediante el algoritmo
de Savitzsky-Golay21 empleando Δλ = 5 nm
Se comprueba la linealidad entre la amplitud del espectro segunda derivada entre 353 y 361 nm (2D353-361) y la concentracioacuten de trans-piceido en la muestra original como queda reflejado en la Tabla 6 por lo que se propone utilizar eacutesta como sentildeal analiacutetica para el anaacutelisis de piceido en vino
El tratamiento al que se someten las muestras de vino objeto del anaacutelisis es el siguiente en una celda de cuarzo se antildeaden 010 mL de vino tinto o 050 mL de vino blanco que se diluyen con agua ultrapura hasta un volumen final de 50 mL en presencia de un 20 v de etanol La disolucioacuten resultante se irradia durante 180 segundos bajo una laacutempara de mercurio de alta presioacuten y a continuacioacuten se transfiere a un embudo de decantacioacuten Se fija el pH a 50 por adicioacuten de 50 mL de disolucioacuten reguladora tartrato monoaacutecido de sodiotartrato disoacutedico 030 M y se extrae con 100 mL de acetato de etilo agitando vigorosamente durante 150 segundos Se aiacutesla la fase orgaacutenica y se evapora a sequedad en un rotavapor a temperatura ambiente El residuo resultante se
21 Savitzky A Golay MJE Anal Chem 1964 361627ndash1639
CAPIacuteTULO III Determinacioacuten fluorimeacutetrica de piceido en vino
146
redisuelve con 40 mL de etanol absoluto y se antildeade agua ultrapura hasta completar 100 mL
Tabla 6- Paraacutemetros analiacuteticos de calidad para la determinacioacuten de piceido mediante fluorescencia fotoinducida ndash segunda derivada
Sentildeal Analiacutetica 2D353-361 nm
(λexc = 261 nm) Rango Lineal (ngmiddotmL-1) 60 ndash 30
Ordenada en el Origen (a plusmn sa) -0165 plusmn 0064
Pendiente (b plusmn sb) (mLmiddot ng -1) 0181 plusmn 0004
Desviacioacuten Estaacutendar de la Regresioacuten (syx) 0156
Coeficiente de Correlacioacuten (r) 0997
Coeficiente de Determinacioacuten (r2) 0995
Linealidad 980
Resolucioacuten Analiacutetica (γ-1) (ngmiddotmL-1) 0862
LOD Long y Winefordner (ngmiddotmL-1) 134
LOD Clayton (α=β=005) (ngmiddotmL-1) 212
Repetitividad (143 ngmiddotmL-1)
RSD (n = 11) 59
El meacutetodo se aplica al anaacutelisis de distintas muestras de vino de la regioacuten
Las muestras de que se dispone se dividen en tres grandes grupos
-Vinos tintos joacutevenes -Vinos tintos de crianza -Vinos blancos
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Se prepara dentro de cada grupo una mezcla conteniendo voluacutemenes ideacutenticos de todos lo vinos que integran ese grupo con el objetivo de que esteacuten representadas las interferencias maacutes comunes en el anaacutelisis de cualquier muestra de vino Se aplica el meacutetodo de adicioacuten patroacuten por triplicado sobre cada mezcla de vinos y se construyen las correspondientes curvas 2D353-361 nm vs concentracioacuten de trans-piceido puesta Se aplica el test de comparacioacuten de pendientes entre las rectas obtenidas y una recta de calibrado construida sometiendo a los patrones al mismo tratamiento que al vino comprobaacutendose que existen diferencias significativas entre las pendientes de las tres rectas de adicioacuten patroacuten y la recta de calibrado concluyendo por tanto que existe efecto de matriz Se elige el meacutetodo de la adicioacuten patroacuten como meacutetodo de calibracioacuten para el anaacutelisis de piceido
Las concentraciones de piceido calculadas en cada mezcla de vinos teniendo en cuenta que el rendimiento de la extraccioacuten es 61 en comparacioacuten con las calculadas mediante el meacutetodo cromatograacutefico de validacioacuten22 se encuentran recogidas en la Tabla 7 observaacutendose que los resultados son muy aceptables
22 Galeano Diacuteaz T Duraacuten Meraacutes I Airado Rodriacuteguez D J Sep Sci 2007 303110-3119
CAPIacuteTULO III Determinacioacuten fluorimeacutetrica de piceido en vino
148
Tabla 7- Concentraciones de piceido encontradas en las muestras de vino calculadas mediante el meacutetodo extracto-fluorimeacutetrico de derivadas y mediante HPLC
a Adicioacuten Patroacuten (tres adiciones por triplicado)
En uacuteltimo lugar para mejorar el meacutetodo en teacuterminos de simplicidad y
rapidez se examinan los resultados obtenidos llevando a cabo la adicioacuten patroacuten en la etapa de medida Asiacute se comparan los resultados resumidos en la Tabla anterior obtenidos dopando muestras de vino diluidas individuales antes de ser extraiacutedas con los obtenidos realizando la adicioacuten patroacuten sobre la disolucioacuten hidroetanoacutelica resultante de la irradiacioacuten extraccioacuten evaporacioacuten y reconstitucioacuten de la muestra de vino diluida sin dopar por adicioacuten sucesiva en la cubeta de medida de fluorescencia de pequentildeos voluacutemenes de disolucioacuten patroacuten de piceido irradiada en ideacutenticas condiciones que la muestra de vino diluida Se comprueba que los resultados del anaacutelisis no son afectados al llevar a cabo de esta manera la adicioacuten estaacutendar lo que supone un recorte sustancial en el tiempo de anaacutelisis ya que habraacute que realizar una sola vez el proceso de extraccioacuten y evaporacioacuten por muestra de vino analizada
microgmiddotmL-1 de piceido Meacutetodo Vinos Tintos
Joacutevenes Vinos Tintos de
Crianza Vinos Blancos
Extracto-fluorimeacutetrico de
derivadasa 075 plusmn 011 084 plusmn 014 017 plusmn 003
HPLC 072 plusmn 005 076 plusmn 008 020 plusmn 001
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Interferencias
Los espectros de fluorescencia de los fotoproductos de resveratrol y piceido son praacutecticamente iguales lo que significa que un analito es la principal interferencia del otro Con los meacutetodos propuestos para el anaacutelisis de cada uno de ellos se consigue evitar dicha interferencia mediante distintos mecanismos
- el piceido no se extrae en eacuteter etiacutelico lo que permite la determinacioacuten de
resveratrol en presencia de su glucoacutesido - la irradiacioacuten durante 180 segundos de las muestras en el proceso de
determinacioacuten de piceido supone la destruccioacuten y la peacuterdida total de la fluorescencia del fotoproducto de resveratrol en los intervalos de concentraciones normales en los que se trabaja en el anaacutelisis de vino Perspectivas de futuro Al igual que en el caso de la aglicona el piceido tambieacuten es retenido en membranas de nylon de manera que se estaacute trabajando en el desarrollo de meacutetodos de determinacioacuten en soporte soacutelido Se estudiaraacute tambieacuten la posible resolucioacuten de la mezcla aglicona-glucoacutesido por aplicacioacuten de quimiometriacutea (meacutetodos de calibracioacuten multivariantes) sobre sentildeales de fluorescencia
CAPIacuteTULO IV
DETERMINACIOacuteN DE RESVERATROL Y PICEIDO TOTALES EN VINO SIN
TRATAMIENTO PREVIO MEDIANTE DERIVATIZACIOacuteN FOTOQUIacuteMICA OFF LINE-
HPLC
CAPIacuteTULO IV Resveratrol y piceido mediante derivatizacioacuten-fotoquiacutemica ldquooff linerdquo ndashHPLC
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CAPIacuteTULO IV Resveratrol y piceido mediante derivatizacioacuten-fotoquiacutemica ldquooff linerdquo ndashHPLC
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ANTECEDENTES
Los compuestos fenoacutelicos se encuentran entre los compuestos quiacutemicos no nutrientes presentes en la dieta y que podriacutean contribuir a los efectos beneficiosos de la misma Histoacutericamente cuando se habla de vino su compuesto fenoacutelico prototiacutepico seriacutea el resveratrol En las uvas y en compuestos derivados el resveratrol se encuentra en forma libre o como piceido (resveratrol-3-O-glucoacutesido) en sus respectivas formas isomeacutericas trans y cis Los glucuroacutenidos y sulfatos conjugados del trans y cis-resveratrol se forman en las posiciones 3 y 4rsquo Otros metabolitos del resveratrol descritos son el producto hidroxilado en posicioacuten 3 tambieacuten conocido como piceatannol y el dihidroresveratrol que ha perdido el doble enlace que conecta ambos anillos benceacutenicos No obstante eacutestos se encuentran en proporciones inferiores al trans-resveratrol y trans-piceido que son los que centran la mayor parte de los estudios
El piceido glucoacutesido del resveratrol recibe tanta atencioacuten como la aglicona
(resveratrol) ya que en derivados de las uvas su concentracioacuten es significativamente mayor1 La proporcioacuten relativa entre ambas formas depende de una serie de factores tales como las condiciones de fermentacioacuten2 En un reciente artiacuteculo de revisioacuten3 se comparan los niveles de resveratrol y piceido en vinos tintos de diferentes regiones y se encuentra que eacutestos pueden llegar a contener hasta 143 microgmiddotmL-1 de trans-resveratrol y 292 microgmiddotmL-1 de trans-piceido es decir que el nivel de trans-piceido puede llegar a ser tres veces superior al del trans-resveratrol En cuanto a los vinos blancos el resveratrol en todas sus formas se encuentra en eacutestos en una concentracioacuten bastante inferior a la encontrada en vinos tintos Los
1 Lamuela Raventos R M Waterhouse A L Methods Enzymol 1999 299184-190 2 Moreno-Labanda J F Mallavia R Peacuterez-Fons L Lizama V Saura D Micol V J Agric Food Chem 2004 525396-5403 3 Stervbo U Vang O Bonnesen C Food Chem 2007 101449-457
CAPIacuteTULO IV Resveratrol y piceido mediante derivatizacioacuten-fotoquiacutemica ldquooff linerdquo ndashHPLC
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niveles maacutes elevados de trans-resveratrol que aparecen en la bibliografiacutea4 son del orden de 01 microgmiddotmL-1 Por otro lado debido a la elevada proporcioacuten entre los isoacutemeros trans y los cis se sugiere que estos uacuteltimos pueden aparecer como consecuencia de la exposicioacuten de los vinos a la luz durante su elaboracioacuten o incluso en el almacenamiento5 En cuanto al anaacutelisis de resveratrol y piceido en vino si bien existen meacutetodos de cromatografiacutea de gases que requieren generalmente un paso de derivatizacioacuten pre-columna6 7 o de electroforesis capilar8 9 fundamentalmente se efectuacutea por cromatografiacutea de liacutequidos y como ya se ha mencionado anteriormente en esta memoria la mayoriacutea de los meacutetodos utilizan cromatografiacutea en fase inversa con fases moacuteviles aguametanol o aguaacetonitrilo conteniendo aacutecido aceacutetico o aacutecido foacutermico para fijar la acidez En casi todos los casos se utiliza una elucioacuten en gradiente incluso utilizando dos columnas monoliacuteticas en serie10 y los tiempos de anaacutelisis son elevados Sin embargo cuando se utilizan detectores electroquiacutemicos es maacutes frecuente el uso de la elucioacuten isocraacutetica como en los meacutetodos desarrollados por McMurtrey et al11 y por Kolouchova-Hanzliacutekovaacute et al12 Los sistemas de deteccioacuten maacutes utilizados son los detectores UV de serie de diodos en
4 Siemann EH Creasy LL Am J Enol Vitic 19924349ndash52 5 Lamuela Raventoacutes R M Romero Peacuterez A I Waterhouse A L de la Torre Boronat M C J Agric Food Chem 1995 43281ndash283 6 Goldberg DM Yan J Ng E Diamandis EP Karumanchiri A Soleas GJ Anal Chem 1994 663959-3963 7 Flamini R Dalla Vedona A Rapid Commun Mass Spectrom 2004 181925-1931 8 Brandolini V Maietti A Tedeschi P Durini E Vertuani SManfredini S J Agric Food Chem 2002 507407-7411 9 Demianovaacute Z Sireacuten H Kuldvee R Riekkola ML Electrophoresis 2003 244264ndash4271 10 Abert Vian M Tomao V Gallet S Coulomb PO Lacombe JM J of Chromatogr A 2005 1085224-229 11 Mc Murtrey KD Minn J Pobanz K Schultz TP J Agric Food Chem 1994 422077-2080 12 Kolouchova-Hanzliacutekovaacute I Melzoch K Filip V Šmidrkal J Analytical Nutritional and Clinical Methods 2004 87151-158
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fila13-17 pero tambieacuten se han usado otros maacutes sensibles y selectivos como los fluorescentes18-20 los ya mencionados electroquiacutemicos21 quimiluminiscentes22 23 o de espectrometriacutea de masas24 a veces acoplados entre siacute25 26 Los meacutetodos de HPLC maacutes sensibles de los encontrados10 16 18 19 23 25 presentan liacutemites de deteccioacuten en el orden de los ngmiddotmL-1 y soacutelo en un caso se reporta un valor de menor orden de magnitud en concreto 02 ngmiddotmL-1 obtenido utilizando deteccioacuten quimiluminiscente22 El objetivo del trabajo de investigacioacuten descrito en este capiacutetulo es el desarrollo de un meacutetodo de cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten fluorescente raacutepido y sencillo que permita analizar el total (trans + cis) de resveratrol y el total de piceido con una mayor sensibilidad que los meacutetodos similares descritos hasta el momento Para ello se planea hacer uso de la transformacioacuten que sufren estos compuestos al irradiarlos con luz UV intensa cuyo resultado son compuestos de eficacia cuaacutentica de fluorescencia muy superior a la de los compuestos de partida
13 Rudolf JL Resurreccion VA Saalia FK Phillips RD Food Chem 2005 89623-638 14 Abert Vian M Tomao V Gallet S Coulomb P O Lacombe JM J Chromatogr A 2005 1085224-229 15 Abril M Negueruela A I Peacuterez C Juan T Estopantildeaacuten G Food Chem 2005 92729ndash736 16 Nikfardjam MSP Laacuteszloacute G Dietrich H Food Chem 20069674ndash79 17 Vitrac X Bornet A Vanderline R Valls J Richard T Delaunay J C Meacuterillon J M Teisseacutedre P L J Agric Food Chem 2005 535664ndash5669 18 Vitrac X Monti JP Vercauteren J Deffieux G Meacuterillon JM Anal Chim Acta 2002 458103-110 19 Pintildeeiro Z Palma M Barroso CG J Chromatogr A 2006 111061ndash65 20 Rodriguez-Delgado MA Gonzaacutelez G Peacuterez-Trujillo JP Garciacutea-Montelongo FJ Food Chem 2002 76371-375 21 Bocchi C Careri M Groppi F Mangia A Manini P Mori G JChromatogr A 1996 753157-170 22 Zhou J Cui H Wan G Xu H Pang Y Duan C Food Chem 2004 88613ndash620 23 Zhang Q Cui H Myint A Lian M Liu L J Chromatogr A 2005 109594ndash101 24 Wang Y Catana F Yang Y Roderick R Van Breemen RB J Agric Food Chem 2002 50431-435 25 Loredana La Torre G Saitta M Vilasi F Pellicanograve T Dugo G Food Chem 2006 94 640ndash650 26 Bravo MN Silva S Coelho AV Vilas Boas L Bronze MR Anal Chim Acta 2006 56384-92
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Para la optimizacioacuten de las variables cromatograacuteficas se haraacute uso de herramientas quimiomeacutetricas con el objetivo de reducir en lo posible el trabajo experimental RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN Estudios fluorescentes previos Como se ha descrito en los capiacutetulos II y III de esta memoria trans-resveratrol y trans-piceido al igual que sus isoacutemeros cis presentes los cuatro analitos en el vino de forma natural son deacutebilmente fluorescentes En resumen las disoluciones hidroetanoacutelicas de trans-resveratrol y trans-piceido presentan deacutebiles sentildeales de fluorescencia nativa con maacuteximos de excitacioacuten centrados a 225 y 318 nm y 230 y 300 nm respectivamente y maacuteximos de emisioacuten en torno a 385 y 395 nm respectivamente Sin embargo la irradiacioacuten con luz ultravioleta intensa de sus disoluciones hidroalcohoacutelicas tiene como consecuencia primeramente el desplazamiento del equilibrio cisndashtrans totalmente hacia las formas cis de ambos analitos que raacutepidamente desaparecen en favor de nuevos fotoproductos altamente fluorescentes cuyos espectros de fluorescencia estaacuten caracterizados por agudos maacuteximos de excitacioacuten a 260 nm y dos maacuteximos en los espectros de emisioacuten a 364 y 382 nm en el caso de resveratrol y 361 y 380 nm en el caso de piceido Tambieacuten se ha comprobado que las sentildeales de fluorescencia proporcionadas por estos fotoproductos son lineales con la concentracioacuten de resveratrol en las disoluciones originales siendo posible por tanto el anaacutelisis de las cantidades totales (trans- maacutes cis-isoacutemeros) de resveratrol y piceido en las muestras originales a traveacutes de estas sentildeales de fluorescencia fotoinducida
CAPIacuteTULO IV Resveratrol y piceido mediante derivatizacioacuten-fotoquiacutemica ldquooff linerdquo ndashHPLC
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En esta memoria se describen distintas estrategias para explotar este comportamiento fotoquiacutemico en favor de la sensibilidad y la selectividad de los meacutetodos para el anaacutelisis de resveratrol y piceido en muestras de vino En este capiacutetulo se persigue el desarrollo de un meacutetodo de cromatografiacutea de liacutequidos con deteccioacuten fluorescente para el anaacutelisis de las cantidades totales de resveratrol y piceido en vino previa irradiacioacuten off-line de las muestras en una laacutempara de mercurio de alta presioacuten En los capiacutetulos anteriores de esta memoria tambieacuten se describe el estudio del efecto de variables tales como la composicioacuten del medio de trabajo en la etapa de irradiacioacuten y medida de fluorescencia y el tiempo de irradiacioacuten de las muestras deducieacutendose que los valores oacuteptimos de ambos paraacutemetros son distintos para ambos analitos Concretamente se dedujo que el rendimiento de las fotorreacciones depende en gran medida del porcentaje de etanol en el medio siendo la composicioacuten oacuteptima del mismo etanolagua 4060 vv agua 100 para resveratrol y piceido respectivamente
Por su parte el tiempo de irradiacioacuten oacuteptimo teniendo en cuenta el rango de concentraciones de trabajo resultoacute ser de 60 y 180 segundos para resveratrol y piceido respectivamente Esto no supone un problema cuando se determinan individualmente sino que en este caso en particular la utilizacioacuten de un tiempo de irradiacioacuten maacutes alto en el caso de piceido supone la eliminacioacuten de la interferencia de resveratrol en su anaacutelisis como ya se ha explicado anteriormente constituyendo esto una gran ventaja
Sin embargo para realizar la determinacioacuten cromatograacutefica simultaacutenea de
resveratrol y piceido en forma de sus fotoproductos en una solo inyeccioacuten es necesario llegar a alcanzar una situacioacuten de compromiso en lo que a estas
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variables se refiere Teniendo en cuenta por una parte que los niveles de aglicona en vino son menores que los de glucoacutesido y por otra parte la menor polaridad de la moleacutecula de resveratrol y de su fotoproducto y por tanto la mayor retencioacuten en la columna cromatograacutefica (C18) lo que provocaraacute que el efecto de la dispersioacuten sea maacutes notable en este caso se seleccionan unos valores de compromiso para el porcentaje de etanol en el medio de irradiacioacuten y el tiempo de irradiacioacuten maacutes favorables para la formacioacuten del fotoproducto del resveratrol que para la del piceido Se fija un medio de irradiacioacuten etanolagua 4060 vv y un tiempo de irradiacioacuten de 90 segundos para posteriores experimentos La seleccioacuten de un tiempo de irradiacioacuten lejos del oacuteptimo para ambos analitos supone peacuterdida de sensibilidad tanto si es menor que el oacuteptimo caso del piceido ya que el rendimiento de la fotorreaccioacuten es inferior al 100 como si es mayor caso del resveratrol por destruccioacuten del fotoproducto Sin embargo se hace factible la determinacioacuten de ambos conjuntamente Estudios cromatograacuteficos previos Con el objetivo de estudiar los respectivos procesos de transformacioacuten fotoquiacutemica de resveratrol y piceido se prepara en un matraz de 100 mL una disolucioacuten conteniendo 010 mL de sendas disoluciones madre de trans-resveratrol y trans-piceido de 98 y 114 μgmiddotmL-1 39 mL de etanol absoluto y agua ultrapura hasta enrase Se inyectan en el cromatoacutegrafo dos aliacutecuotas de esta disolucioacuten una sin irradiar y una irradiada en la laacutempara de mercurio de alta presioacuten durante 90 segundos Ambas muestras son eluiacutedas isocraacuteticamente con una mezcla acetonitriloaacutecido aceacutetico (32 ) 2278 vv y el eluato se monitoriza fotomeacutetricamente a 306 nm y fluorimeacutetricamente a λexcem 260364 nm longitudes de onda correspondientes respectivamente a los maacuteximos de absorcioacuten de los isoacutemeros trans deacutebilmente fluorescentes y a los maacuteximos de los espectros de
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fluorescencia de sus respectivos fotoproductos altamente fluorescentes Los cromatogramas correspondientes a esta disolucioacuten patroacuten antes y despueacutes de ser irradiada se recogen en la Figuras 1A y 1B respectivamente
En el perfil fotomeacutetrico obtenido a 306 nm correspondiente a la muestra sin irradiar se observan dos picos cromatograacuteficos a 24 y 61 minutos correspondientes a trans-piceido y trans-resveratrol respectivamente En el perfil fluorimeacutetrico tambieacuten se observan ambos compuestos pero en este caso los picos cromatograacuteficos son muy pequentildeos debido a la deacutebil fluorescencia nativa de los analitos Al irradiar esta disolucioacuten durante 90 segundos en la laacutempara de mercurio de alta presioacuten se observan cambios en los cromatogramas obtenidos tanto fotomeacutetrica como fluorimeacutetricamente En el perfil fotomeacutetrico a 306 nm se produce un decaimiento importante en los picos cromatograacuteficos correspondientes a los isoacutemeros trans asiacute como la aparicioacuten de nuevos picos correspondientes a las formas fluorescentes generadas como consecuencia de la fotorreaccioacuten y a los restos de cis-isoacutemeros Existen dos picos que podriacutean atribuirse al cis-piceido y otros dos para cis-resveratrol tal y como se indica en la Figura 1A Se ha comprobado que cuando la isomerizacioacuten de trans a cis se lleva a cabo en condiciones menos energeacuteticas que las que proporciona esta laacutempara de alta presioacuten se genera un uacutenico compuesto cis a partir de cada trans como se discute en el siguiente capiacutetulo En este caso dada la existencia de maacutes de un pico cuyo espectro de absorcioacuten presenta un maacuteximo a 290 nm tiacutepico de las formas cis puede indicar la formacioacuten de fotoproductos secundarios de la reaccioacuten y que no son necesariamente los cis-isoacutemeros Por comparacioacuten con los resultados obtenidos posteriormente en el capiacutetulo V se postula que trans-piceido y trans-resveratrol son los picos a 39 y 113 minutos respectivamente correspondiendo los picos a 29 y 106 a otros productos de fotodescomposicioacuten de piceido y resveratrol respectivamente Es de destacar que cis-piceido coeluye con FP1 Los
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resultados maacutes interesantes producidos como consecuencia de la irradiacioacuten se observan en el perfil obtenido al monitorizar fluorimeacutetricamente el eluato a λexcem 260364 nm En dicho perfil se observan tres nuevos picos cromatograacuteficos a 36 49 y 126 minutos
Figura 1- Cromatogramas correspondientes a una muestra conteniendo 098 y 114 μgmiddotmL-1 de trans-resveratrol y trans-piceido respectivamente sin irradiar (mdash) e irradiada durante 90 segundos (mdash) Fase moacutevil acetonitriloaacutecido aceacutetico (32 ) 2278 vv 08 mLmiddotmin-1 UVD a 306 nm (A) y FLD a λexcem 260364 nm (B)
Se comprueba la formacioacuten de un uacutenico fotoproducto fluorescente a partir
de resveratrol en adelante FR responsable del pico cromatograacutefico a 126 minutos de la Figura 1B lo cual estaacute de acuerdo con los resultados previamente publicados por Roggero et al27 Por otra parte los picos cromatograacuteficos a 36 y 49 minutos
27 Roggero JP Garciacutea-Parrilla C Sci Aliments 1995 15411-422
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14t (min)
0
3
6
9
12
15
18
A (3
06 nm
)
0
1
2
3
4
5
F I (λ e
xcem
260
364
)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14t (min)
0
10
20
30
40
F I (λ e
xcem
260
364
)
0
3
6
9
A (30
6 nm
)
A
B
FP1
FP2
FR
trans-piceidotrans-resveratrol
FR
cis-resveratrol
FP2
cis-piceido
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corresponden a los dos fotoproductos originados a partir de piceido en adelante FP1 y FP2 respectivamente Los espectros de fluorescencia obtenidos en el aacutepice de ambos picos son ideacutenticos y en base a los datos encontrados en la literatura28 que nos permiten asumir que los fotoproductos de la reaccioacuten son derivados del fenantreno es totalmente loacutegica la formacioacuten de dos fotoproductos a partir de
piceido (26-dihidroxifenantreno-4-β-D-glucopiranoacutesido y 46-dihidroxifenantreno-2-
β-D-glucopiranoacutesido) y un uacutenico fotoproducto a partir de resveratrol (246-
trihidroxifenantreno) de acuerdo con los esquemas de reaccioacuten representados en la Figura 2
En la Figura 1B se observa tambieacuten que el pico cromatograacutefico
correspondiente a FP1 es mucho menos intenso que el correspondiente a FP2 Teniendo en cuenta que los espectros de emisioacuten de fluorescencia en el aacutepice de ambos picos son ideacutenticos parece bastante loacutegica la hipoacutetesis de que ambos compuestos son isoacutemeros entre los que la uacutenica diferencia consiste en la distribucioacuten relativa de los grupos hidroxilo y el residuo de glucosa (Figura 2) conservando en ambos casos el esqueleto fenantrenoide responsable maacuteximo del comportamiento fluorescente Partiendo de esta base puede afirmarse que la diferencia entre la intensidad de ambos picos se debe uacutenicamente a que uno de los fotoproductos es maacutes abundante que el otro estando maacutes favorecido en este caso concreto el camino de reaccioacuten que conduce a FP2 que el que desemboca en FP1
Con el objetivo de asignar las estructuras correctas a FP1 y FP2 se llevan
a cabo caacutelculos teoacutericos de energiacutea de enlace y momento dipolar utilizando le meacutetodo semiempiacuterico AM1 mediante el paquete de software HyperChem Los resultados obtenidos de estos caacutelculos se resumen en la Tabla 1 28 Chen YH Chen YL Lin CH J Chromatogr A 2002 943287-294
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Figura 2- Esquemas sugeridos para las fotorreacciones
Tabla 1- Resultados de los caacutelculos teoacutericos y asignacioacuten de picos
Estructura Energiacutea de enlace (Kcalmiddotmol-1)
Momento dipolar (Debye) Asignacioacuten
OH
OHGlc
O
-524401 1194 FP2
HO
OH
GlcO
-524298 4524 FP1
Para asignar las estructuras presentadas en la Tabla a los picos
correspondientes se ha tenido en cuenta que se estaacute trabajando en fase inversa y por tanto el orden de elucioacuten de los compuestos en principio debe ser inverso a su
HO
OH
OH
OH
OH
HO
OH
OHHO
hν hν
hν hν
OH
OHGlc
O
OH
OHGlc O
OH
OHGlc
O
HO
OH
GlcO
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orden de polaridad es decir de entre los dos isoacutemeros FP1 y FP2 eluiriacutea en primer lugar el maacutes polar Asiacute a la vista de los valores de momento dipolar calculado se observa que la estructura de FP1 es la que presenta mayor valor de momento dipolar concretamente 4524 D siendo la estructura de FP2 la que presenta menor valor de esta propiedad (1194 D) Ademaacutes los datos de energiacutea de enlace tambieacuten estaacuten de acuerdo con esta asignacioacuten de estructuras ya que la energiacutea de enlace correspondiente a la estructura maacutes polar revela que este compuesto es ligeramente maacutes inestable que su isoacutemero lo que concuerda con las abundancias relativas de ambos compuestos
Dada la mayor intensidad del pico correspondiente a FP2 seraacute este
compuesto el que sea utilizado para la cuantificacioacuten de la cantidad total de piceido a favor de la sensibilidad del meacutetodo En el caso de resveratrol no existen dudas y su cuantificacioacuten en la muestra inicial se llevaraacute a cabo a traveacutes de su uacutenico fotoproducto FR una vez comprobada en ambos casos la linealidad entre las sentildeales obtenidas de estos picos y la concentracioacuten de piceido y resveratrol en la muestra inicial
Antes de proceder a la optimizacioacuten de la composicioacuten de la fase moacutevil para el anaacutelisis de ambos compuestos en vino se lleva a cabo el mismo estudio que se ha descrito hasta ahora en presencia de vino con el objetivo de comprobar la formacioacuten de los mismos fotoproductos en presencia de la matriz Para ello se deposita en un matraz de 100 mL 20 mL de vino tinto fortificado con 98 y 114 μg de trans-resveratrol y trans-piceido respectivamente etanol hasta completar el 40 y agua ultrapura hasta enrase Se inyectan en el sistema cromatograacutefico aliacutecuotas de esta disolucioacuten antes y despueacutes de ser irradiada durante 90 s en la laacutempara de mercurio de alta presioacuten y se procede a su elucioacuten y monitorizacioacuten en ideacutenticas condiciones a las empleadas anteriormente con los patrones Los
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cromatogramas registrados en los detectores fotomeacutetrico y fluorimeacutetrico en serie se recogen en la Figura 3
Figura 3- Cromatogramas correspondientes a una muestra conteniendo una aliacutecuota de 2 mL de un vino tinto comercial fortificado con 98 y 114 μgmiddotmL-1 de trans-resveratrol y trans-piceido respectivamente en etanol al 40 sin irradiar (mdash) e irradiadas durante 90 segundos (mdash) Fase moacutevil acetonitriloaacutecido aceacutetico (32 ) 2278 vv 08 mLmiddotmin-1 UVD a 306 nm y FLD a λexcem 260364 nm
En las condiciones en las que la separacioacuten se ha llevado a cabo soacutelo el trans-resveratrol es fotomeacutetricamente detectado a 306 nm como un pico totalmente resuelto mientras que trans-piceido coeluye con otros componentes del vino (Figura 3A) Por lo demaacutes se comprueba como la fotorreaccioacuten se da exactamente igual en presencia del vino comprobaacutendose en el perfil de fluorescencia la formacioacuten de FP1 FP2 y FR
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14t (min)
0
20
40
60
80
100
A (3
06 n
m)
0
20
40
60
80
F I (λ e
xcem
260
364
)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14t (min)
2 3 4 5 6 7
07
14212835 trans-piceido
trans-resveratrol
B
A
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Optimizacioacuten quimiomeacutetrica de la composicioacuten de la fase moacutevil para el anaacutelisis de vino Como se ha descrito en la introduccioacuten de este capiacutetulo en los meacutetodos de cromatografiacutea de liacutequidos previamente propuestos para el anaacutelisis de resveratrol y piceido se lleva a cabo la elucioacuten en gradiente Los disolventes orgaacutenicos maacutes comuacutenmente empleados en estas fases moacuteviles son metanol y acetonitrilo y los aacutecidos aceacutetico y foacutermico son los maacutes empleados para fijar la acidez siendo este uacuteltimo comuacuten a todos los meacutetodos en los que la deteccioacuten se lleva a cabo mediante espectrometriacutea de masas En nuestro caso concreto se ha seleccionado acetonitrilo como componente orgaacutenico de la fase moacutevil debido principalmente a su menor viscosidad menor solubilidad de aire y mayor transparencia en el ultravioleta y aacutecido aceacutetico para fijar la acidez de la fase moacutevil En estas condiciones se procede a la optimizacioacuten de la composicioacuten de una fase moacutevil isocraacutetica acetonitriloaacutecido aceacuteticoagua que proporcione una adecuada resolucioacuten de FR y FP2 del resto de componentes fluorescentes del vino en un tiempo razonable Tambieacuten se ha contemplado como objetivo que la fase moacutevil escogida fuese uacutetil para futuros estudios acerca del proceso de fotodescomposicioacuten en vino y para el desarrollo de un meacutetodo en el que la irradiacioacuten tenga lugar detraacutes de la separacioacuten lo que implica tener en cuenta la resolucioacuten de los picos correspondientes a los isoacutemeros trans del resto de picos debidos a los restantes componentes del vino en el proceso de optimizacioacuten
Se utiliza el disentildeo de experimentos para la optimizacioacuten del porcentaje de aacutecido aceacutetico y disolvente orgaacutenico en la fase moacutevil isocraacutetica Concretamente se emplea un disentildeo central compuesto con el objetivo de calcular simultaacuteneamente el efecto de cada variable asiacute como sus posibles interacciones sobre la funcioacuten de
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respuesta Este tipo de disentildeo trabaja con cinco niveles para cada variable Tambieacuten incluye tres reacuteplicas de una muestra central lo que da lugar a un total de 11 experimentos (Figura 4) Dicho disentildeo es posee rotatividad lo que implica que la precisioacuten en el caacutelculo de la respuesta es uniforme en todo el rango ensayado de cada variable
Figura 4- Disentildeo central compuesto Niveles ensayados para las variables v Acetonitrilo 1492 17 22 27 2907 v Aacutecido aceacutetico 024 09 25 41 476
Se selecciona la siguiente funcioacuten de respuesta (FR)
donde ΣRs es la suma de los valores de resolucioacuten (Rs) correspondientes a los
picos de FP1 y FP2 (obtenidos en los cromatogramas proporcionados por el detector de fluorescencia FLD) y de trans-resveratrol (obtenidos en los cromatogramas proporcionados por el detector de serie de diodos UVD) respecto a los picos correspondientes a sustancias interferentes del vino krsquo es el factor de capacidad para trans-piceido (UVD) ya que este compuesto es el menos retenido en la columna eluyendo siempre muy cerca del frente y de las interferencias
16 20 24 28 v Acetonitrilo
12
24
36
v
Aacutecid
o Aceacute
tico
16 20 24 28
12
24
36
tRkRF ssum
=middot
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menos retenidas del vino y t es el tiempo de retencioacuten de uacuteltimo pico FR el cual siempre estaacute resuelto de las interferencias del vino pero cuyo tiempo de retencioacuten es demasiado alto con alguna de las fases moacuteviles ensayadas En el caacutelculo de los valores de funcioacuten de respuesta en los distintos puntos del disentildeo se ha asignado un valor maacuteximo de 15 a Rs para evitar asiacute que este paraacutemetro tenga demasiado peso frente al resto de los incluidos en dicha funcioacuten Es decir si en uno de los puntos del disentildeo alguno de los picos correspondientes a los compuestos FP1 FP2 o trans-resveratrol presentara un valor muy alto de la resolucioacuten mientras que los otros no estuvieran resueltos y se incluyera el valor obtenido para ese pico en la funcioacuten de respuesta se obtendriacutea un valor elevado para la funcioacuten en esas condiciones experimentales lo que conduciriacutea a la eleccioacuten de unas condiciones oacuteptimas que no suponen una solucioacuten real al problema Se prepara en un matraz de 250 mL una disolucioacuten conteniendo 50 mL de vino tinto (12 etanol) voluacutemenes de sendas disoluciones madre conteniendo 98 y 114 μg de trans-resveratrol y trans-piceido respectivamente etanol hasta completar 100 mL y agua ultrapura hasta enrase En cada una de las condiciones cromatograacuteficas marcadas por el disentildeo se inyectan en el sistema cromatograacutefico sendas aliacutecuotas de dicha disolucioacuten una sin irradiar y otra irradiada durante 90 segundos en la laacutempara de mercurio de alta presioacuten y se procede a su elucioacuten El flujo se mantiene en todo momento constante a 08 mLmiddotmin-1 y el eluato se monitoriza fotomeacutetrica y fluorimeacutetricamente a 306 nm y λexcem 260364 nm respectivamente Los valores de factor de capacidad del pico de trans-piceido y resolucioacuten del pico de trans-resveratrol se calculan sobre el cromatograma obtenido fotomeacutetricamente a 306 nm de la muestra sin irradiar y los paraacutemetros correspondientes a las formas fluorescentes sobre el cromatograma de la muestra irradiada obtenido mediante deteccioacuten fluorimeacutetrica
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Los resultados se interpretan con la Metodologiacutea de la Superficie de Respuesta y la optimizacioacuten del modelo se lleva a cabo con el paquete de software THE UNSCRAMBLER (Unscrambler v 611 CAMO AS Olav Tryggvasonsgt N-7011 Trondheim Norway) En el correspondiente anaacutelisis de la varianza (ANOVA) se asume un modelo cuadraacutetico de segundo grado (Model Check Quadratic valor p (95 ) = 00004) El valor de p calculado (95 ) para la falta de ajuste (Lack of Fit) 00760 indica que eacutesta no es significativa a un nivel de confianza del 95 y que por tanto el modelo describe adecuadamente la forma real de la superficie de respuesta Por otra parte aplicando el ANOVA al anaacutelisis de los valores p para las variables estudiadas se deduce que el porcentaje de acetonitrilo (p-value = 00002) asiacute como el teacutermino cuadraacutetico ACN - ACN (p-value = 00002) y la interaccioacuten ACN - aceacutetico (p-value = 00010) contribuyen significativamente al modelo para un nivel de confianza del 95 Sin embargo el efecto aceacutetico (p-value = 00639) y el teacutermino cuadraacutetico aceacutetico - aceacutetico (p-value = 00539) no son significativas para el modelo al nivel de confianza considerado
Figura 5- Superficie de respuesta estimada para el par de efectos estudiados
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169
En la Figura 5 se muestra la superficie de respuesta estimada por el modelo para el par de variables consideradas Las variables estudiadas toman en el maacuteximo de esta superficie valores de 19 de acetonitrilo y 33 de aacutecido aceacutetico Una vez deducida la composicioacuten oacuteptima de la fase moacutevil se ensayan distintos caudales comprendidos entre 06 y 12 mLmiddotmin-1 Se aprecia que caudales inferiores a 08 mLmiddotmin-1 suponen un aumento del tiempo de anaacutelisis sin que se consiga aumentar la eficacia de la separacioacuten mientras que caudales por encima de este valor implican peacuterdida de la eficacia y unas presiones demasiado elevadas seleccionaacutendose finalmente un valor de 08 mLmiddotmin-1 para esta variable Por tanto se fijan las siguientes condiciones para futuras experiencias
Fase moacutevil acetonitriloaacutecido aceacutetico (41 ) 1981 vv Flujo = 080 mLmin Deteccioacuten fluorimeacutetrica λexcem 260364 nm
En estas condiciones como se muestra en la Figura 6 los tres fotoproductos
fluorescentes son eluidos resueltos a liacutenea base en menos de 20 minutos Siendo los tiempos de retencioacuten y factores de capacidad para FP1 FP2 y FR 51 73 y 179 minutos y 27 44 y 122 respectivamente
Figura 6- Cromatograma (FLD λexcem 260364 nm) correspondiente a una muestra patroacuten conteniendo 290 y 340 ngmiddotmL-1 de resveratrol y piceido respectivamente irradiada durante 90 segundos en la laacutempara de mercurio de alta presioacuten y eluiacuteda en las condiciones determinadas como oacuteptimas
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20t (min)
0
4
8
12
16
F I
(λex
cem 2
6036
4)
FP1
FP2
FR
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Validacioacuten del meacutetodo Paraacutemetros analiacuteticos de calidad Una vez optimizadas las variables implicadas en la separacioacuten cromatograacutefica se procede a estudiar la linealidad entre las aacutereas de los picos correspondientes a FP2 y FR y la concentracioacuten de piceido y resveratrol respectivamente en la muestra original
Para evaluar la linealidad del meacutetodo se prepara una serie de disoluciones estaacutendar conteniendo entre 100 y 1000 ngmiddotmL-1 de cada analito Cada una de estas mezclas patroacuten se irradia durante 90 segundos en la laacutempara de mercurio de alta presioacuten se introduce por triplicado en el sistema cromatograacutefico y se eluye en las condiciones previamente determinadas como oacuteptimas La cuantificacioacuten de resveratrol y piceido totales en las muestras originales en teacuterminos de trans-resveratrol y trans-piceido se lleva a cabo a traveacutes de los picos cromatograacuteficos correspondientes a FR y FP2 respectivamente Los paraacutemetros analiacuteticos de calidad correspondientes a la determinacioacuten cromatograacutefica de ambos analitos utilizando en aacuterea de los picos como sentildeal analiacutetica se recogen en la Tabla 2 Los liacutemites de deteccioacuten (LOD) y cuantificacioacuten (LOQ) se obtienen como 3 y 10 veces respectivamente la relacioacuten sentildealruido Para ello se mide la amplitud de la liacutenea base en los cromatogramas correspondientes a los patrones empleados en el establecimiento de la recta de calibrado en varias zonas en intervalos de aproximadamente dos minutos Dicha amplitud se multiplica por 3 o por 10 y se transforma en unidades de concentracioacuten de trans-resveratrol o trans-piceido a traveacutes de rectas de calibrado construidas para cada analito empleando en este caso como sentildeal analiacutetica la altura de pico
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Para evaluar la repetitividad del meacutetodo se realizan once inyecciones sucesivas de una disolucioacuten conteniendo 490 y 570 ngmiddotmL-1 de trans-resveratrol y trans-piceido respectivamente irradiada durante 90 segundos
Tabla 2- Paraacutemetros analiacuteticos de calidad para la determinacioacuten cromatograacutefica de resveratrol y piceido
Resveratrol Piceido
Rango de concentracioacuten examinado(ngmiddotmL-1) 1-1000 1-1000
Ordenada en el Origen (a plusmn sa) 125 plusmn 25 736 plusmn 156
Pendiente (b plusmn sb) (mLmiddotng-1) 122 plusmn 001 0732 plusmn 0004
Coeficiente de Correlacioacuten (r) 0999 0999
Coeficiente de Determinacioacuten (r2) 0999 0999
Resolucioacuten Analiacutetica (γ-1) (ngmiddotmL-1) 1009 1054
LOD (SN=3) (ngmiddotmL-1) 029 028
LOQ (SN=10) (ngmiddotmL-1) 097 095
Repetitividad ( RSD)a 95 46 a n=11 490 y 570 ngmiddotmL-1 de trans-resveratrol y trans-piceido respectivamente
Determinacioacuten de las cantidades totales de resveratrol y piceido en muestras de vino El meacutetodo previamente optimizado y validado en teacuterminos de linealidad liacutemites de deteccioacuten y repetitividad se aplica al anaacutelisis de las cantidades totales de resveratrol y piceido (trans + cis) en muestras de vino En primer lugar se realiza una adicioacuten patroacuten sobre una muestra de vino tinto comercial con el objetivo de determinar si existe o no efecto de matriz y calcular las recuperaciones de cada analito a los distintos niveles de concentracioacuten
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En la Figura 7 se representan las rectas de calibrado y adicioacuten patroacuten para resveratrol y piceido (noacutetese que las concentraciones que figuran en el eje de las abscisas no son concentraciones en vino sino en las disoluciones inyectadas en el cromatoacutegrafo) Como puede apreciarse en dicha Figura y se ratifica por aplicacioacuten de los tests estadiacutesticos de comparacioacuten de pendientes se deduce que las pendientes de cada par de rectas son indistinguibles a un nivel de confianza del 95
Figura 7- Rectas de patrones externos (mdashmdash) y adicioacuten patroacuten (mdashmdash) para resveratrol (izquierda) y piceido (derecha)
Las pendientes de las rectas de calibrado y adicioacuten patroacuten no presentan
diferencias significativas a un nivel de confianza del 95 deducieacutendose por tanto que no existe efecto de matriz y que la determinacioacuten de las cantidades totales de resveratrol y piceido en muestras de vino puede hacerse mediante calibracioacuten por patrones externos Efectivamente si se calculan los valores de recuperacioacuten para las muestras fortificadas usando para ello las rectas de calibrado de patrones externos (Tabla 3) se obtienen resultados muy satisfactorios estando en todos los casos los valores de recuperacioacuten en torno al 100
0 04 08 12[trans-resveratrol] (μgmiddotmL-1)
0
500
1000
1500
2000
2500
Aacuterea
FR
0 04 08 12[trans-piceido] (μgmiddotmL-1)
0
500
1000
1500
2000
2500
Aacuterea
FP2
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Tabla 3- Resultados del procedimiento cromatograacutefico para la determinacioacuten de las cantidades totales de resveratrol y piceido en vino tinto utilizando la calibracioacuten por adicioacuten patroacuten
amedia plusmn SD (n=2)
Por tanto el procedimiento cromatograacutefico que se propone para determinar el resveratrol y el piceido totales en vino a traveacutes de la medida de sus fotoproductos es En un matraz de 100 mL se antildeaden 200 mL de vino (12 v etanol) 375 mL de etanol absoluto y agua ultrapura hasta enrase Se transfiere una aliacutecuota de la disolucioacuten resultante a una cubeta de cuarzo y se irradia durante 90 s en una laacutempara de mercurio de alta presioacuten Se inyectan 20 μL de la disolucioacuten irradiada en el sistema cromatograacutefico previa filtracioacuten a traveacutes de una membrana de nylon de 022 μm y se procede a su elucioacuten isocraacuteticamente con acetonitriloaacutecido aceacutetico (41 ) 1981 vv con un flujo de 080 mLmiddotmin-1 El eluato se monitoriza fluorimeacutetricamente a λexcem 260 364 nm La cuantificacioacuten de resveratrol y piceido se hace mediante patroacuten externo a traveacutes de los picos cromatograacuteficos de FR (179 minutos) y FP2 (73 minutos) respectivamente
RESVERATROL PICEIDO Puesto en vino
(μgmL-1)
Encontrado en vino
(μgmL-1)a Recuperacioacuten
()a Puesto en vino
(μgmL-1)
Encontrado en vino
(μgmL-1)a Recuperacioacuten
()a
000 212plusmn004 mdashmdash 000 3154plusmn039 mdashmdash
102 374plusmn011 119plusmn4 111 3498plusmn019 107plusmn1
255 482plusmn031 103plusmn7 278 3371plusmn084 98plusmn2
357 636plusmn016 112plusmn3 389 3556plusmn038 106plusmn1
510 739plusmn068 102plusmn9 555 3731plusmn21 101plusmn6
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El meacutetodo propuesto se aplica entonces al anaacutelisis de distintas muestras de vino comerciales La totalidad de las muestras de las que se dispone se divide en tres grandes grupos
-Vinos tintos joacutevenes -Vinos tintos de crianza -Vinos blancos y se prepara dentro de cada grupo una mezcla conteniendo voluacutemenes ideacutenticos de todos lo vinos que integran ese grupo Se toman 20 mL de cada una de las mezclas y se llevan a un volumen final de 100 mL con agua ultrapura y etanol en una proporcioacuten final del 40 Se preparan tres reacuteplicas por pool que se irradian durante 90 segundos y se analizan en las condiciones previamente optimizadas Los cromatogramas correspondientes a cada uno de estas mezclas obtenidos monitorizando fluorimeacutetricamente (λexcem = 260364 nm) el eluato se recogen en la Figura 8 en comparacioacuten con el correspondiente a una disolucioacuten patroacuten conteniendo 290 y 340 ngmiddotmL-1 de trans-resveratrol y trans-piceido respectivamente Los resultados obtenidos en el anaacutelisis de cada uno de estas mezclas se resumen en la Tabla 4 en unidades de trans-resveratrol y trans-piceido
Tabla 4- Resultados obtenidos en el anaacutelisis de las cantidades totales de resveratrol y piceido en distintas muestras de vino expresados como concentracioacuten de los trans-isoacutemeros
Tinto Joven Tinto Crianza Blanco
Resveratrol Total en vino (ngmiddotmL-1 de trans-resveratrol)a 028 plusmn 001 027 plusmn 002 015 plusmn 001
Piceido Total en vino (ngmiddotmL-1 de trans-piceido)a 072 plusmn 005 076 plusmn 008 020 plusmn 001
amedia plusmn SD (n=3)
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Figura 8- Cromatogramas (FLD λexcem 260364 nm) correspondientes a un patroacuten conteniendo 290 y 340 ngmiddotmL-1 de trans-resveratrol y trans-piceido respectivamente (mdashmdash) y a un pool de vino tinto joven (A mdashmdash) tinto de crianza (B mdashmdash) y blanco (C mdashmdash) oportunamente diluidos irradiados durante 90 segundos y eluidos en las condiciones oacuteptimas
Se observa que ademaacutes de los picos debidos a los compuestos de intereacutes aparece un pico de gran magnitud a un tiempo de retencioacuten cercano a los 8 min No hemos encontrado datos bibliograacuteficos que orienten acerca de la naturaleza del
0 4 8 12 16 20t (min)
0
20
40
60
80
I F (λ e
xcem
2603
64)
0 4 8 12 16 20t (min)
0
20
40
60
80
I F (λ e
xcem
2603
64)
0 4 8 12 16 20t (min)
0
20
40
60
80
I F (λ e
xcem
2603
64)
A
B
C
16 20
1
6 8 10
0
5
FP1FP2
FR
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compuesto responsable de este pico y tampoco corresponde a ninguno de los compuestos fluorescentes el vino de los que se disponiacutea de patrones
Por otro lado en ciertas muestras de vino se encuentra que aparece otro pico cromatograacutefico muy cercano al pico de FP2 como se aprecia en el ejemplo mostrado en la Figura 9A Figura 9- (A) Porcioacuten de los cromatogramas (FLD λexcem 260364 nm) correspondientes a una muestra patroacuten conteniendo 290 y 340 ngmiddotmL-1 de resveratrol y piceido respectivamente (mdash) y de los obtenidos a λem 348 (mdash) y 369 nm (mdash) (λexc 260 nm) para un vino tinto comercial asiacute como el cromatograma diferencia entre ellos (mdash) (B) Espectros de emisioacuten (λexc 260 nm) obtenidos on-line en los puntos marcados en el cromatograma Sin embargo los espectros de emisioacuten de fluorescencia del compuesto interferente y de FP2 se encuentran ligeramente desplazados entre ellos como se muestra en la Figura 9B lo que hace posible eliminar la contribucioacuten de este interferente tomando como sentildeal analiacutetica la diferencia entre las aacutereas de los picos obtenidos empleando como longitudes de onda de emisioacuten 369 y 348 nm (λexc = 260 nm) que se corresponden con puntos isoemisivos en el espectro de emisioacuten del interferente pero no en el de FP2 De manera que como se ve en la Figura 9A el cromatograma diferencia estaacute totalmente limpio de interferencia
65 7 75 8t (min)
0
20
40
60
80
I F (λ e
xcem
2603
64)
280 320 360 400 440λ (nm)
0
4
8
12
16
20
I F
A B
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Asiacute para la construccioacuten de la recta de calibrado en estas condiciones se ha de hacer uso de la opcioacuten de multiemisioacuten en la configuracioacuten del detector de fluorescencia y monitorizar el eluato a una longitud de onda de excitacioacuten constante de 260 nm y a longitudes de onda de emisioacuten de 369 y 348 nm Una vez obtenido el conjunto de cromatogramas de las disoluciones patroacuten se construye la recta de calibrado tomando como sentildeal analiacutetica la diferencia de aacutereas del pico FP2 obtenido en ambos canales de emisioacuten De esta manera se obtiene una buena relacioacuten lineal entre sentildeal analiacutetica medida y concentracioacuten de analito en el mismo rango de concentraciones indicado en la Tabla 2
Perspectivas de futuro Para la identificacioacuten inequiacutevoca de los fotoproductos seriacutea conveniente el uso de teacutecnicas acopladas LC-MS a las que auacuten no tenemos acceso pero con las que se planea contar en el futuro Otro reto es la identificacioacuten del compuesto fluorescente responsable del pico maacutes intenso que aparece en los cromatogramas del vino en las condiciones de excitacioacuten y emisioacuten de los fotoproductos de resveratrol y piceido
CAPIacuteTULO V
ANAacuteLISIS DE LOS ISOacuteMEROS DE RESVERATROL Y PICEIDO EN VINOS MEDIANTE HPLC ISOCRAacuteTICA CON
DETECCIOacuteN FLUORESCENTE PREVIA DERIVATIZACIOacuteN POST-COLUMNA EN LIacuteNEA
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ANTECEDENTES
Las dos metas generales de cualquier teacutecnica de derivatizacioacuten son 1- incrementar la sensibilidad den la deteccioacuten normalmente introduciendo
los cromoacuteforos o fluoroacuteforos adecuados o generando compuestos derivados de los originales maacutes faacutecilmente detectables
2- incrementar la selectividad aplicando una reaccioacuten de derivatizacioacuten especiacutefica de los compuestos de intereacutes en la matriz compleja
En muchos casos las reacciones de derivatizacioacuten llevan consigo la adicioacuten
de reactivos a la disolucioacuten conteniendo el analito con el objetivo de transformar eacuteste en una forma maacutes faacutecil de detectar Las reacciones que se llevan a cabo entre el analito y el agente derivatizante son normalmente de esterificacioacuten acilacioacuten silanizacioacuten dansilacioacuten etc
Cuando el reactivo es la luz el procedimiento se llama derivatizacioacuten
fotoquiacutemica La luz se considera uno de los agentes derivatizantes maacutes baratos y normalmente las reacciones fotoquiacutemicas son reacciones simples requiriendo de instrumentacioacuten muy sencilla muy limpias y en las que no se da dilucioacuten del analito ya que este reactivo derivatizante no implica la adicioacuten de disolventes Con respecto al tipo de reacciones que pueden ser iniciadas por activacioacuten fotoquiacutemica se pueden citar reacciones de oxidacioacuten reduccioacuten fotolisis fotohidrolisis fotoionizacioacuten reordenamientos moleculares adicioacuten eliminacioacuten isomeriacutea ciclacioacuten polimerizacioacuten etc
Inicialmente los meacutetodos basados en reacciones fotoquiacutemicas como
sistemas de derivatizacioacuten se llevaban a cabo siempre en reacutegimen estacionario y los primeros intentos de combinar los procesos fotoquiacutemicos con sistemas
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182
dinaacutemicos continuos como son los meacutetodos cromatograacuteficos fueron realizados en 1976 por Iwaoka y Tannenbaum1 Estos autores realizan un acoplamiento en liacutenea de un fotorreactor con un sistema de cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten situando el fotorreactor detraacutes de la columna analiacutetica y llevan a cabo la determinacioacuten de derivados N-nitrosos mediante hidroacutelisis a nitritos por irradiacioacuten con luz ultravioleta de longitud de onda larga El tiempo de irradiacioacuten era excesivamente largo y la sensibilidad no se mejoraba en exceso Twitchett et al2 obtienen en 1978 resultados maacutes alentadores determinando cannabinol en fluidos corporales sin necesidad de realizar un tratamiento previo de la muestra y con un liacutemite de deteccioacuten de aproximadamente 05 ng
A partir de aquiacute se han ampliado en gran medida las aplicaciones de este
tipo de sistemas para la mejora de la deteccioacuten En 1999 Lores et al3 publican un artiacuteculo de revisioacuten donde se recogen varias aplicaciones en anaacutelisis por inyeccioacuten en flujo (FIA) y HPLC asiacute como las principales tendencias en instrumentacioacuten y aspectos teacutecnicos Respecto a los compuestos analizados merece la pena resaltar diversos principios farmacoloacutegicos marcadores bioloacutegicos pesticidas componentes naturales en alimentos e incluso trazas de metales en matrices cada vez maacutes complejas
Como ya se ha descrito en capiacutetulos anteriores los trans-isoacutemeros de resveratrol y piceido apenas presentan fluorescencia nativa Cuando sus disoluciones son irradiadas con radiacioacuten UV los trans-isoacutemeros se transforman en los respectivos isoacutemeros cis tambieacuten poco fluorescentes que raacutepidamente evolucionan hacia compuestos altamente fluorescentes En concreto FP1 y FP2
1 Iwaoka W Tannenbaum S R IARC Sci Publ 1976 1451-56 2 Twitchett PJ Williams PL Moffat AC J Chromatogr A 1978 149683-691 3 Lores M Cabaleiro O Cela R Trends in Anal Chem 1999 18392-400
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183
son generados a partir de piceido siendo FR el fotoproducto fluorescente de resveratrol
Este tipo de fotoreaccioacuten es idoacutenea para ser acoplada en liacutenea en un
sistema cromatograacutefico y asiacute poder llevar a cabo el anaacutelisis de los isoacutemeros trans y cis presentes inicialmente en la muestra de manera sensible con un meacutetodo en el que la manipulacioacuten de la muestra es miacutenima Asiacute pues el objetivo de este capiacutetulo es aprovechar este comportamiento fotoquiacutemico y disentildear un sistema de irradiacioacuten post-columna en liacutenea para proponer un meacutetodo isocraacutetico sencillo que permita la determinacioacuten de trans y cis resveratrol y piceido en muestras de vino de diferente naturaleza
En el Esquema 1 se muestra la disposicioacuten del sistema cromatograacutefico con
el fotorreactor acoplado Como puede observarse eacuteste se situacutea detraacutes de la columna concretamente entre los detectores fotomeacutetrico y fluorimeacutetrico de manera que las fotorreacciones tendraacuten lugar despueacutes de la separacioacuten cromatograacutefica La principal ventaja de esta disposicioacuten frente al meacutetodo cromatograacutefico descrito en el capiacutetulo anterior es la posibilidad de determinar las concentraciones relativas para cada par de isoacutemeros trans y cis en la muestra original
Una vez que se ha decidido el esquema de la fotoderivatizacioacuten el
siguiente paso es la construccioacuten del fotorreactor propiamente dicho Comercialmente estaacuten disponibles algunos modelos pero normalmente se suele hacer uso de fotorreactores de fabricacioacuten casera Por otra parte cuando se disentildea alguacuten aparato para acoplarlo a un sistema cromatograacutefico debe prestarse particular atencioacuten a su posible efecto sobre la integridad de dicho sistema Asiacute reactores con un excesivo volumen muerto y caracteriacutesticas de flujo muy pobres pueden causar peacuterdida en la eficacia de la separacioacuten
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En la construccioacuten de un reactor fotoquiacutemico estaacuten implicados dos componentes fundamentales
bull El primero es el reactor para el cual se han descrito dos disentildeos fundamentales de paso de flujo y envolvente En el primero el eluato pasa a traveacutes de una ceacutelula de flujo de volumen interno pequentildeo la cual se irradia externamente mientras que en el segundo un tubo de tefloacuten se enrolla helicoidalmente sobre la fuente de irradiacioacuten de manera que la fotorreaccioacuten se estaraacute dando mientras que el analito de intereacutes circule por este tubo La principal desventaja de los sistemas envolventes es que los voluacutemenes muertos suelen ser mayores que en los sistemas de paso de flujo No obstante la experiencia demuestra que el enrollado helicoidal del tubo es la mejor solucioacuten para los efectos de dispersioacuten y engrosamiento de bandas de manera que este sistema es el maacutes utilizado
bull El segundo componente del fotorreactor es la fuente de luz la cual estaacute caracterizada por una longitud de onda de radiacioacuten intensidad tamantildeo y geometriacutea de la laacutempara como caracteriacutesticas maacutes importantes a tener en cuenta Tradicionalmente se han venido utilizando muchos tipos de laacutemparas como son las laacutemparas de arco de alta media y baja presioacuten conteniendo normalmente mercurio xenon o una mezcla de ambos las laacutemparas de deuterio y de hidroacutegeno asiacute como laacutemparas fluorescentes germicidas o incluso laacuteseres
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En nuestro caso el fotorreactor se ha construido enrollando helicoidalmente 3 m de tubo de tefloacuten de 03 mm de diaacutemetro interno sobre una laacutempara de xenon de 4 W El conjunto se guarda dentro de una caja metaacutelica recubierta interiormente de papel de aluminio como sistema reflectante para aumentar asiacute la efectividad de la laacutempara (Figura 1)
Esquema 1- Esquema del instrumento de LC con derivatizacioacuten fotoquiacutemica post-columna
Figura 1- Fotorreactor utilizado
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RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN Estudios Fluorescentes Previos La gran mayoriacutea de los meacutetodos propuestos para el anaacutelisis de resveratrol y piceido en vino mediante LC trabajan en fase inversa y llevan a cabo la elucioacuten en gradiente mediante la introduccioacuten progresiva de metanol o acetonitrilo sobre disoluciones diluidas de aacutecido aceacutetico (o foacutermico cuando se emplea la espectrometriacutea de masas como sistema de deteccioacuten)
En nuestro caso ya que se va a desarrollar una fotorreaccioacuten on-line es muy importante la eleccioacuten tanto del aacutecido empleado para fijar el pH de la fase moacutevil como del disolvente orgaacutenico Se trataraacute de encontrar unas condiciones que favorezcan tanto la formacioacuten de los fotoproductos como el rendimiento cuaacutentico de fluorescencia de los mismos Por ello inicialmente se llevaraacuten a cabo una serie de estudios previos mediante espectroscopia de fluorescencia
Con respecto a la acidez del medio ya se ha puesto de manifiesto en los
capiacutetulos anteriores que la fotorreaccioacuten transcurre en medio aacutecido y ademaacutes el rendimiento cuaacutentico de fluorescencia de los fotoproductos no se ve alterado como consecuencia de la presencia de una alta concentracioacuten de protones en el medio Se ha comprobado que la presencia de los aacutecidos orgaacutenicos tales como aceacutetico y foacutermico afecta negativamente al proceso por lo que se elige el H3PO4 como aacutecido para controlar el pH de la fase moacutevil
Con respecto al disolvente orgaacutenico a utilizar para preparar la fase moacutevil
teniendo en cuenta los antecedentes bibliograacuteficos se plantean dos posibilidades metanol o acetonitrilo Mediante espectroscopiacutea de fluorescencia se comprueba el
CAPIacuteTULO V Isoacutemeros de resveratrol y piceido mediante HPLC y derivatizacioacuten on-line
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efecto de ambos modificadores sobre la fotorreaccioacuten Para ello se prepara una serie de disoluciones conteniendo 034 μgmiddotmL-1 de trans-resveratrol en presencia de distintas proporciones de acetonitrilo o metanol y se registran sus espectros de emisioacuten (λexc = 260 nm) tras ser irradiadas de manera acumulativa 30 60 y 90 segundos bajo una laacutempara de mercurio de alta presioacuten Las sentildeales obtenidas se representan en la Figura 2 observaacutendose que tanto la velocidad de la fotorreaccioacuten como la maacutexima sentildeal de fluorescencia fotoinducida alcanzada son ligeramente superiores en presencia de acetonitrilo por lo que se elige este disolvente como modificador de la fase moacutevil
Figura 2- Influencia del tiempo de irradiacioacuten para disoluciones conteniendo 034 μgmiddotmL-1 de trans-resveratrol en presencia de distintas proporciones de metanol o acetonitrilo
Estudios Cromatograacuteficos Previos
Una vez seleccionado el aacutecido para fijar el pH de la fase moacutevil y el modificador orgaacutenico se comienza con los estudios cromatograacuteficos Se prepara una disolucioacuten que en un volumen final de 250 mL contiene 102 y 111 μgmiddotmL-1
0 20 40 60 80 100Tiempo de Irradiacioacuten (s)
0
20
40
60
80
I F (
λ exce
m 260
364 n
m)
10 ACN20 ACN40 ACN10 MeOH20 MeOH40 MeOH
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de trans-resveratrol y trans-piceido respectivamente y agua ultrapura hasta enrase Se inyecta en el sistema cromatograacutefico una aliacutecuota de esta disolucioacuten y se eluye isocraacuteticamente con una mezcla acetonitriloagua 1981 vv y una velocidad de flujo de 080 mLmiddotmin-1 Se realizan dos inyecciones de la misma una con el fotorreactor apagado y otra con eacutel encendido para comprobar la eficacia de la fotorreaccioacuten El eluato se monitoriza fotomeacutetricamente a 306 nm y fluorimeacutetricamente a λexcem = 260364 nm y los cromatogramas registrados con ambos detectores se recogen en la Figura 3
Figura 3- Cromatogramas correspondientes a una mezcla conteniendo 102 y 111 μgmiddotmL-
1 de trans-resveratrol y trans-piceido (A) Perfil DAD a 306 nm y (B) FLD a λexcem 260364 nm con el fotorreactor encendido (mdashmdash) y apagado (mdashmdash)
En ausencia de fotorreaccioacuten en ambos detectores se observan dos picos cromatograacuteficos correspondientes a trans-piceido y trans-resveratrol respectivamente Los tiempos de retencioacuten son 44 y 149 minutos en el detector de
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18tiempo (min)
0
2
4
6
8
I F (
λ exce
m 260
364 n
m)
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18tiempo (min)
0
4
8
12
A (3
06 nm
)
trans-Piceido
trans-Resveratrol
A
B
trans-Piceido trans-Resveratrol
(trans-Piceido)hν
(trans-Resveratrol)hν
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diodos y aumentan ligeramente en el detector fluorescente 49 y 154 min debido al fotorreactor que separa ambas ceacutelulas de deteccioacuten cuya longitud es de tres metros que produce un retardo de 045 minutos entre ambos perfiles Cuando se lleva a cabo una segunda inyeccioacuten con el fotorreactor encendido se produce una ganancia sustancial en la intensidad de los picos observados fluorimeacutetricamente lo que indica que los fotoproductos originados a partir de ambos analitos han sido satisfactoriamente obtenidos al menos en cierta extensioacuten
Para estudiar el efecto de la presencia de H3PO4 tanto en el rendimiento
de la fotorreaccioacuten que ambos compuestos sufren en liacutenea como en el rendimiento cuaacutentico de fluorescencia de los fotoproductos generados se prepara una disolucioacuten acuosa conteniendo 102 y 111 μgmiddotmL-1 de trans-resveratrol y trans-piceido respectivamente Esta disolucioacuten se conserva en la oscuridad hasta el momento de ser inyectada en el cromatoacutegrafo y se eluye isocraacuteticamente con distintas fases moacuteviles conteniendo todas ellas un 190 de acetonitrilo y porcentajes variables de H3PO4 entre 0 y 0050 resultando un pH aparente final para estas fases moacuteviles de 442 282 250 y 228 respectivamente El flujo de la fase moacutevil se mantiene a 080 mLmiddotmin-1 y el fotorreactor permanece encendido en todo momento de manera que fotomeacutetricamente se observaraacuten los compuestos
trans originales y fluorimeacutetricamente sus respectivos fotoproductos Para ello el
eluato se monitoriza fotomeacutetricamente a 306 nm y fluorimeacutetricamente a λexcem = 260364 nm Los cromatogramas obtenidos en el detector fluorescente se representan en la Figura 4 donde se puede observar que la presencia de H3PO4 en la fase moacutevil origina una ligera disminucioacuten en el rendimiento cuaacutentico de los fotoproductos Por otra parte se aprecia que los tiempos de retencioacuten disminuyen a medida que aumenta el porcentaje de aacutecido
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Figura 4- Influencia del porcentaje de H3PO4 0 (mdashmdash) 0010 (mdashmdash) 0025 (mdashmdash) y 0050 (mdashmdash) [trans-resveratrol] = 102 μgmiddotmL-1 [trans-piceido] = 111 μgmiddotmL-1 velocidad de flujo = 080 mlmiddotmin-1
Para finalizar este apartado de estudios previos es muy importante remarcar el hecho de que no se pueden utilizar filtros de nylon para filtrar disoluciones conteniendo resveratrol o piceido como trans- o cis-isoacutemeros previamente a su inyeccioacuten en el sistema cromatograacutefico ya que se ha comprobado que el 100 de los analitos resulta retenido en dicha membrana Por ello a lo largo de todo este capiacutetulo se utilizan filtros de membranas hidrofoacutebicas de politetrafluoretileno (PTFE) (Millexreg-FG) para filtrar las muestras Optimizacioacuten quimiomeacutetrica de las condiciones cromatograacuteficas para el anaacutelisis isocraacutetico de trans-resveratrol y trans-piceido en muestras de vino A la hora de optimizar las condiciones cromatograacuteficas se han tenido en cuenta tanto los paraacutemetros relacionados con la separacioacuten cromatograacutefica como los que influyen en la fotorreaccioacuten
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18tiempo (min)
0
2
4
6
8
I F (
λ exce
m 260
364 n
m)
4 45 5 550
2
4
6
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Asiacute como variables quiacutemicas se seleccionan las proporciones relativas de H3PO4 y de modificador como variables a optimizar
Por otra parte la reaccioacuten de derivatizacioacuten que tendraacute lugar en liacutenea es
una fotorreaccioacuten de manera que la luz ultravioleta proporcionada por la laacutempara puede ser considerada como reactivo derivatizante cuya concentracioacuten podraacute ser controlada a traveacutes del tiempo de residencia de los analitos en el fotorreactor esto es a traveacutes de la longitud del fotorreactor o bien a traveacutes del caudal de la fase moacutevil si se mantiene constante la longitud Por ello la sensibilidad del meacutetodo estaraacute directamente relacionada con el caudal de fase moacutevil siendo eacutesta la tercera variable a optimizar Por otra parte esta variable tambieacuten incidiraacute sobre el resultado de la separacioacuten cromatograacutefica
Se intenta encontrar una fase moacutevil que mediante elucioacuten isocraacutetica
permita la determinacioacuten de estos analitos en muestras de vino y para la optimizacioacuten de su composicioacuten se haraacute uso de la estadiacutestica multivariante a traveacutes del disentildeo experimental y la metodologiacutea de la superficie de respuesta Se utiliza concretamente un disentildeo central compuesto con el objetivo de calcular de forma simultaacutenea el efecto de la variacioacuten de cada una de las variables a optimizar asiacute como las posibles interacciones entre ellas Se ensayan cinco niveles para cada variable Existen tambieacuten tres muestras centrales dando lugar a un total de 17 experiencias El disentildeo presenta rotatividad lo que implica que la precisioacuten en el caacutelculo de la respuesta es uniforme en todo el rango experimental
Los rangos considerados para cada una de las tres variables a optimizar
son
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- v acetonitrilo en la fase moacutevil 25 ndash 15 - v H3PO4 en la fase moacutevil 001 ndash 005 - Flujo 050 ndash 150 mLmiddotmin-1 La eleccioacuten de estos rangos estaacute justificada por diversos motivos el
porcentaje de acetonitrilo se variacutea alrededor de un valor central del 20 que fue el valor oacuteptimo deducido en estudios anteriores (Capiacutetulo IV) Con respecto al porcentaje de H3PO4 se elige como valor inferior 001 ya que por debajo de eacuteste la capacidad tamponadora de la fase moacutevil seriacutea miacutenima y un valor superior del 005 el cual origina una fase moacutevil ya muy aacutecida cuyo pH se calcula en torno a 23 Respecto a la velocidad de flujo no se baja de 05 mLmiddotmin-1 ya que los tiempos de anaacutelisis seriacutean excesivos
En la Figura 5 se representa la arquitectura del disentildeo asiacute como los niveles ensayados para cada variable
Figura 5- Disentildeo central compuesto y niveles ensayados para cada una de las tres variables en la optimizacioacuten de las condiciones cromatograacuteficas acetonitrilo 251 230 200 170 150 H3PO4 005 004 003 002 001 flujo 150 130 100 070 050 mLmiddotmin-1
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Para llevar a cabo las experiencias marcadas por el disentildeo se preparan dos disoluciones Con una disolucioacuten patroacuten se evaluacutea la extensioacuten de la fotorreaccioacuten a traveacutes de la altura de los picos obtenidos Por otra parte para evaluar la eficacia de la separacioacuten de los analitos de intereacutes se introduce tambieacuten en cada punto del disentildeo una muestra de vino dopada con los analitos Asiacute en matraces de 250 mL la disolucioacuten patroacuten contiene 053 μgmiddotmL-1 de trans-resveratrol 058 μgmiddotmL-1 de trans-piceido y agua ultrapura hasta enrase la segunda contiene 750 mL de un pool de vinos tintos comerciales y las mismas cantidades de los analitos que en la disolucioacuten patroacuten Estas dos disoluciones mientras no se utilizan en la ejecucioacuten de los experimentos se conservan en la oscuridad a 4 ordmC Las experiencias marcadas por el disentildeo se realizan de manera aleatoria analizaacutendose en cada experiencia tanto la disolucioacuten estaacutendar como la de vino fortificada El fotorreactor se mantiene en todo momento encendido y la monitorizacioacuten del eluato se lleva a cabo fotomeacutetricamente a 306 nm y fluorimeacutetricamente a λexcem 260364 nm
Tras cada inyeccioacuten de la muestra de vino una vez que se ha producido la elucioacuten de los compuestos de intereacutes se limpia la columna para expulsar todos los componentes del vino que puedan originar picos fantasmas en los sucesivos anaacutelisis La limpieza de la columna se lleva a cabo en todos los casos por paso secuencial de acetonitriloagua 2575 5050 1000 vv a 12 mLmiddotmin-1 hasta conseguir presioacuten constante con cada disolucioacuten manteniendo acetonitrilo puro hasta obtener una liacutenea base limpia
La eleccioacuten de la funcioacuten respuesta es crucial ya que de ella dependeraacute
que las condiciones predichas como oacuteptimas sean una solucioacuten real del problema
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Se han tenido en cuenta paraacutemetros relacionados con la sensibilidad y la selectividad Asiacute la funcioacuten de respuesta (FR) seleccionada fue
norm
hPthRtPicts
APAPRRF ⎟⎟
⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛ ++= minusminus
minus2
)()()(
υυ (AP = Aacuterea de Pico)
El primer teacutermino de la ecuacioacuten representa la eficacia de la separacioacuten cromatograacutefica mientras que el segundo estaacute relacionado con la sensibilidad del meacutetodo La resolucioacuten del pico del fotoproducto del trans-piceido con respecto a los interferentes del vino se toma como representativa de la eficacia En algunas muestras del disentildeo este pico aparece resuelto de interferentes pre-eluidos y post-eluidos mientras que en otros puntos este compuesto coeluye totalmente con los interferentes del vino Rs(t-Pic) es el valor de resolucioacuten maacutes desfavorable (respecto a los interferentes pre-eluidos o post-eluidos) para el pico correspondiente a trans-piceido multiplicado por dos cuando el otro valor de resolucioacuten sea superior a 15 con el objetivo de dar un mayor peso a la respuesta correspondiente a las condiciones en que este compuesto esteacute resuelto de todos los interferentes aunque soacutelo sea parcialmente El pico correspondiente a trans-resveratrol aparece totalmente resuelto en todas las condiciones experimentales ensayadas y por eso los valores de resolucioacuten correspondientes a este pico no han sido incluidos en la funcioacuten de respuesta El segundo teacutermino evaluacutea la sensibilidad a traveacutes de los valores de las aacutereas de pico de los fotoproductos Eacutestas dependen tanto del rendimiento de la fotorreaccioacuten como del rendimiento cuaacutentico de fluorescencia de los fotoproductos generados Su valor se calcula como la media normalizada del aacuterea de los picos de los fotoproductos de trans-resveratrol y trans-piceido Se utiliza la estrategia de normalizar el segundo teacutermino con el objetivo de dar igual importancia a ambos
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teacuterminos Asiacute el valor de este teacutermino normalizado estaraacute siempre en torno a la unidad al igual que el teacutermino de las resoluciones Los tiempos de retencioacuten tampoco han sido incluidos en la funcioacuten de respuesta ya que en ninguacuten caso fueron superiores a 30 minutos valor bastante aceptable en comparacioacuten con otros meacutetodos propuestos Los resultados se interpretan con la Metodologiacutea de la Superficie de Respuesta y la optimizacioacuten del modelo se lleva a cabo con el software THE
UNSCRAMBLER (Unscrambler v 611 CAMO AS Olav Tryggvasonsgt N-7011 Trondheim Norway) En el correspondiente anaacutelisis de la varianza (ANOVA) se asume un modelo cuadraacutetico de segundo grado (Model Check Quadratic valor p (95 ) = 00008) El valor de p calculado (95 ) para la falta de ajuste (Lack of Fit) 00583 indica que eacutesta no es significativa a un nivel de confianza del 95 y que por tanto el modelo describe adecuadamente la forma real de la superficie de respuesta Los resultados del ANOVA revelan tambieacuten un valor para R2 de 0947 Por otra parte aplicando el ANOVA al anaacutelisis de los valores p para las variables estudiadas (Tabla 1) se deduce queacute variables influyen de forma significativa (p lt 005) en el modelo
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Tabla 1- Anaacutelisis de los valores p para las variables estudiadas
Variable Valor p
ACN 00310 H3PO4 00765
Flujo 00067 ACN - ACN 00019
H3PO4 - H3PO4 00002 Flujo ndash Flujo 00001
ACN - H3PO4 01348 ACN ndash Flujo 01013 H3PO4 - Flujo 01725
A la vista de los resultados expuestos se deduce que el de acetonitrilo y el flujo asiacute como los teacuterminos cuadraacuteticos H3PO4 - H3PO4 ACN - ACN y flujo-flujo contribuyen significativamente al modelo para un nivel de confianza del 95 Sin embargo el efecto H3PO4 y las interacciones ACN - H3PO4 y ACN - flujo no son significativas para el modelo al nivel de confianza considerado En la Figura 6 se muestran las superficies de respuesta estimadas por el modelo para cada par de variables En estas superficies el oacuteptimo situado en la zona de maacutexima respuesta corresponde a los siguientes valores para cada una de las variables estudiadas 18 de acetonitrilo y 33middot10-2 de H3PO4 en la fase moacutevil y un flujo de 09 mLmiddotmin-1 Por tanto la fase moacutevil seleccionada como oacuteptima fue acetonitriloH3PO4 (004 ) 1882 vv y una velocidad de flujo de la fase moacutevil de 09 mLmiddotmin-1
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Figura 6- Superficies de respuesta predichas para cada par de variables
Con el objetivo de comprobar que las condiciones predichas como oacuteptimas por el modelo quimiomeacutetrico corresponden a una solucioacuten real del problema es decir que el anaacutelisis se puede llevar a cabo de manera sensible y libre de
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interferencias se registran los cromatogramas correspondientes a una muestra patroacuten y una muestra de vino fortificada en las condiciones determinadas como oacuteptimas Los cromatogramas registrados con el fotorreactor encendido en todo momento y monitorizando fluorimeacutetricamente el eluato a λexcem 260364 nm se recogen en la Figura 7
Figura 7- Cromatogramas correspondientes a una muestra patroacuten (mdashmdash) y a una muestra de vino tinto fortificada con los analitos (mdashmdash) [trans-resveratrol] = 053 μgmiddotmL-1 [trans-piceido] = 058 μgmiddotmL-1 fase moacutevil ACN004 H3PO4 1882 vv flujo 09 mLmiddotmin-1
Como se observa bajo las condiciones seleccionadas como oacuteptimas ambos analitos estaacuten resueltos a liacutenea base en un tiempo inferior a 15 minutos siendo los tiempos de retencioacuten y los factores de capacidad 465 y 1437 minutos y 210 y 858 respectivamente para trans-piceido y trans-resveratrol respectivamente Influencia de la Temperatura Se lleva a cabo el estudio de la precisioacuten inter-diacutea inyectando en diacuteas sucesivos y siempre a la misma hora una disolucioacuten conteniendo 050 μgmiddotmL-1 de cada analito Se observa una pobre reproducibilidad en los tiempos de retencioacuten de ambos compuestos oscilando eacutestos entre 465 y 499 minutos para trans-piceido y
0 2 4 6 8 10 12 14 16tiempo (min)
0
5
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15
20
25
30
35
I F (
λ exce
m 260
364 n
m)
trans-Piceido
trans-Resveratrol
desconocido
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1437 y 1609 para trans-resveratrol Como es loacutegico esta falta de reproducibilidad en los tiempos de retencioacuten se traduce en una falta de reproducibilidad en la resolucioacuten de ambos picos con respecto a los interferentes del vino sobre todo en el pico de trans-piceido dada su cercaniacutea a una serie de interferencias menos retenidas que eacutel Pensamos que esta irreproducibilidad puede ser debida a fluctuaciones en la temperatura ambiente Para comprobar como afecta la temperatura se llevan a cabo dos experiencias en condiciones draacutesticamente diferentes Asiacute una misma muestra conteniendo 050 μgmiddotmL-1 de cada analito se eluye en las condiciones seleccionadas como oacuteptimas en primer lugar con los recipientes conteniendo la fase moacutevil sumergidos en hielo y en segundo lugar con los recipientes sin sumergir y con un calefactor de infrarrojos dirigido hacia la columna cromatograacutefica lo que elevaba en gran medida la temperatura en el ambiente de la columna Los tiempos de retencioacuten para el trans-piceido variacutean entre 49 y 51 minutos y para el trans-resveratrol entre 156 y 167 minutos cuando la elucioacuten se lleva a cabo a alta y baja temperatura respectivamente Comprobado el efecto de la temperatura sobre la retencioacuten de los analitos se realiza el estudio de la influencia de la temperatura La termostatizacioacuten de la columna se consigue mediante una camisa consistente en un tubo de silicona enrollado helicoidalmente sobre la misma cuyos extremos estaacuten unidos a la entrada y salida de un bantildeo termostaacutetico dando lugar a un circuito cerrado por el que circula agua cuya temperatura se controla a traveacutes del bantildeo termostaacutetico Se preparan en sendos matraces de 100 mL dos disoluciones conteniendo la primera de ellas 102 y 111 μgmiddotmL-1 de trans-resveratrol y trans-
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piceido respectivamente y agua ultrapura hasta enrase y la segunda 30 mL de una muestra de vino tinto comercial diluida con agua ultrapura hasta enrase Ambas disoluciones se inyectan en el sistema cromatograacutefico y se eluyen a diferentes temperaturas comprendidas entre 10 y 30 ordmC en las condiciones establecidas anteriormente como oacuteptimas En la Figura 8 se muestran los cromatogramas correspondientes a la muestra patroacuten y de vino obtenidos a 15 y 30 ordmC
Figura 8- Influencia de la temperatura sobre los tiempos de retencioacuten de (A) disolucioacuten patroacuten conteniendo 102 y 111 μgmiddotmL-1 de trans-resveratrol y trans-piceido respectivamente y (B) muestra de vino a 15 ordmC (mdashmdash) y 30 ordmC (mdashmdash)
0 5 10 15 20 25t (min)
0
2
4
6
8
I F (
λ exce
m 260
364 n
m)
0 5 10 15 20 25t (min)
0
10
20
30
40
I F (
λ exc
em 26
0364
nm)
3 6t (min)0
25
A
B
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Como se observa el aumento de la temperatura supone una disminucioacuten de los factores de capacidad de ambos compuestos Por otra parte tambieacuten se observa coacutemo a 15 ordmC el pico correspondiente a trans-piceido estaacute resuelto a liacutenea base con respecto a las interferencias del vino menos retenidas que eacutel por lo que para experiencias futuras se selecciona 15 ordmC como temperatura de trabajo
En todas las modalidades de cromatografiacutea liacutequida la retencioacuten de los solutos disminuye con el incremento de la temperatura y por lo general se obtienen relaciones lineales al representar log krsquo frente a 1T y se acepta como regla aproximada que un aumento de 30 ordmC en la temperatura supone una disminucioacuten de dos veces en el factor de capacidad krsquo4 Con el objetivo de comprobar que esta tendencia general se cumple en la separacioacuten cromatograacutefica de estos analitos se han representado sobre un eje logariacutetmico los factores de capacidad para ambos compuestos medidos sobre los picos cromatograacuteficos detectados mediante fluorescencia a las distintas temperaturas ensayadas asiacute como la presioacuten del sistema frente a la inversa de la temperatura Dicha representacioacuten se encuentra en la Figura 9 Se comprueba que existe una relacioacuten lineal al representar sobre un eje logariacutetmico los factores de capacidad de trans-resveratrol y trans-piceido frente a la inversa a la temperatura observaacutendose como los factores de capacidad disminuyen a media que aumenta la temperatura Por su parte la presioacuten del sistema disminuye al aumentar la temperatura ya que a mayor temperatura menor es la viscosidad de la fase moacutevil 4 Introduction to Modern Liquid Chromatography Second Edition LR Snyder y JJ Kirkland John Wiley amp sons inc
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Figura 9- Efecto de la temperatura (T) sobre los factores de capacidad (krsquo) de t-resveratrol (R) y t-piceido (P) y sobre la presioacuten del sistema (p)
Rectas de Calibrado y Paraacutemetros Analiacuteticos de Calidad Establecidas las condiciones oacuteptimas para la determinacioacuten cromatograacutefica de trans-resveratrol y trans-piceido en vino antes de abordar el anaacutelisis de muestras reales se procede a estudiar la relacioacuten entre la concentracioacuten de analito puesta y la sentildeal analiacutetica medida y al establecimiento de las rectas de calibrado para ambos compuestos En matraces de 100 mL se preparan por triplicado disoluciones conteniendo entre 0010 y 015 mL de las disoluciones madre etanoacutelicas de 102 y 111 μgmiddotmL-1 de trans-resveratrol y trans-piceido respectivamente y agua ultrapura hasta enrase Cada una de estas muestras recieacuten preparada y aislada de la luz se inyecta en el sistema cromatograacutefico y se eluye a 09 mLmiddotmin-1 con una mezcla acetonitriloH3PO4 (004 ) 1882 vv manteniendo la temperatura de la columna
36 35 34 33 32103T (K-1)
1
10
100
2
3456789
20
30405060708090
k
10
100
1000
20
30405060708090
200
300400500600700800900
P (ba
r)
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constante mediante una camisa de agua recirculante a 15 ordmC El fotorreactor se mantiene encendido en todo momento lo que permite el desarrollo de las fotorreacciones de ambos analitos en liacutenea y los correspondientes cromatogramas se obtienen monitorizando fluorimeacutetricamente el eluato a λexcem 260364 nm Los paraacutemetros analiacuteticos de calidad correspondientes a la determinacioacuten cromatograacutefica de ambos analitos se recogen en la Tabla 2 Tabla 2- Paraacutemetros analiacuteticos de calidad para la determinacioacuten cromatograacutefica de trans-resveratrol y trans-piceido
trans-Resveratrol trans-Piceido Rango de concentracioacuten examinado (μgmiddotmL-1) 01 ndash 15 01 ndash 15
Ordenada en el Origen (a plusmn sa) -67x102 plusmn 34x102 -43x102 plusmn 12x102
Pendiente (b plusmn sb) (mLmiddotμg-1) (1058 plusmn 35)x102 (4367plusmn 11)x102
Desviacioacuten Estaacutendar de la Regresioacuten (syx) 66 x102 23 x102
Coeficiente de Correlacioacuten (r) 09944 09967
Coeficiente de Determinacioacuten (r2) 09888 09934
Linealidad 9664 9742
Resolucioacuten Analiacutetica (γ-1) (μgmiddotmL-1) 00624 00521
LOD (SN=3) (μgmiddotmL-1) 00012 00014
LOQ (SN=10) (μgmiddotmL-1) 00041 00047 Repetitividad inter- e intra-diacutea de los meacutetodos Con objeto de comprobar la repetitividad del meacutetodo propuesto se preparan dos series de once disoluciones cada una en un volumen final de 100 mL la primera de ellas conteniendo 0204 y 0222 μgmiddotmL-1 de trans-resveratrol y trans-piceido respectivamente y la segunda 102 y 111 μgmiddotmL-1 de cada analito
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Cada una de estas disoluciones se inyecta en el sistema cromatograacutefico y se obtienen sus respectivos cromatogramas en condiciones ideacutenticas a las empleadas en el establecimiento de las rectas de calibrado En la Tabla 3 se resumen las desviaciones estaacutendar en tiempos de retencioacuten aacutereas de pico y alturas de pico paraacutemetros que permiten evaluar la repetitividad intra-diacutea del meacutetodo cromatograacutefico Por otra parte para estudiar la repetitividad inter-diacutea se preparan dos disoluciones en las mismas condiciones ya indicadas y se inyectan en el cromatograacutefo durante once diacuteas consecutivos Los resultados obtenidos de encuentran en la Tabla 3 A la vista de los resultados obtenidos se concluye que la repetitividad intra- e inter-diacutea del meacutetodo es aceptable a los dos niveles de concentracioacuten estudiados
Tabla 3- Repetitividad en la determinacioacuten de trans-resveratrol y trans-piceido
trans-Resveratrol trans-Piceido 0204
μgmiddotmL-1 102
μgmiddotmL-1 0222 μgmiddotmL-1
111 μgmiddotmL-1
tR (min) plusmn SD 1799plusmn005 1788plusmn025 534plusmn002 531plusmn008 RSD (tR) 025 14 037 14
Aacuterea Media plusmn SD (126plusmn12)x102 (867plusmn70) x102
(472plusmn037) x102
(346plusmn11) x102
RSD (Aacuterea) 98 81 80 34
Altura Media plusmn SD 288plusmn27 (1968plusmn016) x102 212plusmn18 (175plusmn020)
x102
I N T R A - D
RSD (Altura) 100 82 86 119 tR (min) plusmn SD 1760plusmn021 1777plusmn020 530plusmn002 530plusmn005 RSD (tR) 12 11 042 099
Aacuterea Media plusmn SD (112plusmn20)x102 (892plusmn70) x102
(479plusmn086) x102
(343plusmn17) x102
RSD (Aacuterea) 182 79 179 49
Altura Media plusmn SD 225plusmn41 (198plusmn013) x102 207plusmn37 (193plusmn034)
x102
I N T E R - D
RSD (Altura) 183 69 181 175
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Foto-Isomeriacutea cis-trans Evidencia de la presencia de cis-isoacutemeros de resveratrol y piceido en vinos La exposicioacuten a la luz solar de manera controlada de disoluciones conteniendo los trans-isoacutemeros de resveratrol y piceido tiene como consecuencia la obtencioacuten de los correspondientes cis-isoacutemeros Este hecho ha sido ampliamente discutido en la literatura cientiacutefica y probado espectroscoacutepicamente por nosotros como se ha descrito en los capiacutetulos anteriores
En el capiacutetulo IV correspondiente al anaacutelisis cromatograacutefico de resveratrol y piceido con derivatizacioacuten off-line pre-columna no es posible diferenciar entre los picos cromatograacuteficos correspondientes a los trans- o cis-isoacutemeros de los analitos porque la irradiacioacuten en la laacutempara de mercurio de alta presioacuten supone la destruccioacuten total de los mismos en favor de sus derivados altamente fluorescentes de manera que los analitos originales no son eluidos como tal sino como sus respectivos fotoproductos Aunque la principal ventaja del meacutetodo propuesto en el capiacutetulo anterior es la sensibilidad ya que el empleo de una laacutempara de mercurio de alta presioacuten supone unos rendimientos muy altos de las fotorreacciones su principal limitacioacuten es el hecho de que soacutelo es posible determinar cantidades totales de resveratrol y piceido presentes en el vino no pudiendo determinar la distribucioacuten relativa entre las formas cis- y trans- de cada analito
En el caso de llevar a cabo las fotorreacciones en liacutenea post-columna
primero tiene lugar la separacioacuten cromatograacutefica y a continuacioacuten las respectivas fotorreacciones sobre porciones discretas del eluato Es decir en este caso dada la diferente polaridad entre los trans- y cis-isoacutemeros en primer lugar se produce su separacioacuten en la columna cromatograacutefica y a continuacioacuten cada analito transportado de manera individual en un bolo discreto del eluato sufre la
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fotorreaccioacuten que supondraacute la obtencioacuten en cierta medida de sus fotoproductos fluorescentes lo que haraacute posible su deteccioacuten mediante fluorescencia molecular De manera que si bien al emplear una laacutempara ultravioleta en liacutenea el rendimiento de las fotorreacciones es menor no llegando a completarse en ninguacuten caso lo que supondraacute una disminucioacuten en la sensibilidad con respecto al meacutetodo de derivatizacioacuten precolumna sin embargo tiene la ventaja de que permite la determinacioacuten de las concentraciones relativas de los trans- y cis-isoacutemeros de cada analito y no cantidades totales
Al no disponer de patrones de los cis-isoacutemeros eacutestos se obtendraacuten por
exposicioacuten controlada a la luz solar de disoluciones de sus respectivos trans-isoacutemeros Para comprobar las posibilidades de este procedimiento se realiza la siguiente experiencia en un matraz de 100 mL se depositan 015 mL de sendas disoluciones madre de trans-piceido y trans-resveratrol conteniendo 111 y 102 μgmiddotmL-1 respectivamente y se completa con agua ultrapura hasta enrase Cuando esta disolucioacuten se inyecta en el sistema cromatograacutefico recieacuten preparada y se lleva a cabo su elucioacuten en las condiciones previamente determinadas como oacuteptimas en el detector fotomeacutetrico se observan uacutenicamente dos picos cromatograacuteficos a 48 y 168 minutos correspondientes a trans-piceido y trans-resveratrol respectivamente A continuacioacuten dicha disolucioacuten se expone a la luz evitando la radiacioacuten solar directa y se van aislando y guardando en la oscuridad aliacutecuotas de la misma a distintos tiempos de exposicioacuten con el objetivo de seguir el transcurso de la fotorreaccioacuten de generacioacuten de los cis-isoacutemeros durante aproximadamente dos minutos Dichas aliacutecuotas son inyectadas sucesivamente en el sistema cromatograacutefico Tres de los cromatogramas tridimensionales registrados en el DAD se muestran en forma de superficies y mapas de contorno en la Figura 10 y en ellos puede apreciarse como la exposicioacuten progresiva a la luz genera dos nuevos
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compuestos correspondientes a los isoacutemeros cis de piceido y resveratrol a 112 y 356 minutos respectivamente Figura 10- Cromatogramas tridimensionales (tiempo ndash longitud de onda - absorbancia) y mapas de contorno en funcioacuten del tiempo de exposicioacuten a la luz de una disolucioacuten que contiene trans-resveratrol y trans-piceido [trans-resveratrol] = 153 microgmiddotmL-1 [trans-piceido] = 166 μgmiddotmL-1
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Por otra parte ademaacutes de realizar la deteccioacuten fotomeacutetrica con el objetivo
de identificar los cis-isoacutemeros durante toda la experiencia se mantuvo encendido el fotorreactor y se monitorizoacute el eluato fluorimeacutetricamente (λexcem 260364 nm) Como se representa en la Figura 11 se comprueba que las fotorreacciones tambieacuten tienen lugar con eacutexito a partir de los cis-isoacutemeros
Figura 11- Perfiles de fluorescencia correspondientes a la muestra de trans-resveratrol y trans-piceido (azul) y a las distintas aliacutecuotas expuestas a la luz durante tiempos sucesivos (rojo verde y rosa)
Se comprueba que los picos cromatograacuteficos correspondientes a los cis-
isoacutemeros estaacuten totalmente resueltos de los correspondientes a los trans- Ademaacutes los cis-isoacutemeros son menos polares que los correspondientes trans- como revela su mayor afinidad por la fase estacionaria debido probablemente a interacciones intra-moleculares tipo puente de hidroacutegeno entre grupos hidroxilo en las moleacuteculas cis
Con el objetivo de comprobar la presencia de los cuatro isoacutemeros en el
vino se comparan los cromatogramas correspondientes a una muestra patroacuten conteniendo 143 y 155 μgmiddotmL-1 de trans-resveratrol y trans-piceido respectivamente y expuesta durante 30 s a la sombra en el exterior del laboratorio
min0 5 10 15 20 25 30 35 40
LU
0
50
100
150
200
250
300
FLD1 A Ex=260 Em=364 (EDIEGOPST19A22D)FLD1 A Ex=260 Em=364 (EDIEGOPST19A24D)FLD1 A Ex=260 Em=364 (EDIEGOPST19A26D)FLD1 A Ex=260 Em=364 (EDIEGOPST19A27D)
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lo que daraacute lugar a la generacioacuten de ciertas cantidades de los cis-isoacutemeros de resveratrol y piceido y una muestra de vino diluida con agua ultrapura (050 mL de un vino tinto comercial se llevan hasta un volumen final de 100 mL) Ambas disoluciones son inyectadas en el sistema cromatograacutefico y eluiacutedas en las condiciones previamente determinadas como oacuteptimas y los cromatogramas obtenidos se recogen en la Figura 12 donde se aprecia la presencia de los cuatro isoacutemeros en la muestra de vino La resolucioacuten de los cuatro compuestos de intereacutes con respecto a las interferencias del vino es en todos los casos superior a 15 excepto en el caso del pico correspondiente a cis-piceido que solapa ligeramente con una interferencia previa No obstante la resolucioacuten en este caso es aceptable de manera que no se contempla la posibilidad de cambiar las condiciones cromatograacuteficas
Figura 12- Perfiles-FLDλexcem 260364 nm correspondientes a una muestra conteniendo 143 y 155 μgmiddotmL-1 de trans-resveratrol y trans-piceido respectivamente expuesta durante 30 segundos a la luz solar (mdashmdash) y a un vino comercial diluido 20 veces con agua (mdashmdash)
Para poder realizar la cuantificacioacuten en vinos es necesario realizar
previamente un calibrado a partir de disoluciones patroacuten algo realmente complejo porque como ya se ha indicado no se comercializan patrones de los cis-isoacutemeros
0 10 20 30 40t (min)
0
40
80
120
160
200
I F (
λ exce
m 260
364 n
m)
trans-piceido
cis-piceido
trans-resveratrol
cis-resveratrol
Desconocido
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En nuestro caso para cuantificar los cis-isoacutemeros se van a emplear disoluciones patroacuten de dichos compuestos obtenidas por exposicioacuten a la luz solar de sus respectivos trans-isoacutemeros en concentraciones conocidas Para llevar a cabo el calibrado es necesario relacionar la sentildeal analiacutetica en este caso aacuterea de los picos correspondientes a cis-resveratrol y cis-piceido con sus respectivas concentraciones calculadas por diferencia entre las aacutereas de los picos de los trans-isoacutemeros antes y despueacutes de la exposicioacuten a la luz solar De manera que se prepararaacuten mezclas de trans-resveratrol y trans-piceido se inyectaraacuten raacutepidamente en el sistema cromatograacutefico y a continuacioacuten dichas disoluciones se expondraacuten a la luz solar y se volveraacuten a inyectar en el sistema relacionando el aacuterea de los dos nuevos picos correspondientes a los cis-isoacutemeros con la caiacuteda de concentracioacuten de trans-resveratrol y trans-piceido
No obstante antes de proceder al establecimiento de rectas de calibrado y
con el objetivo de no cometer errores en la cuantificacioacuten de los isoacutemeros cis es necesario asegurar las condiciones de exposicioacuten en las cuales soacutelo se obtenga el cis-isoacutemero de cada analito y no sus respectivas formas fluorescentes
Se ha comprobado la existencia de ambos pares de isoacutemeros en ausencia
total de sus formas fluorescentes cuando disoluciones conteniendo entre 020 y 150 μgmiddotmL-1 de trans-resveratrol y trans-piceido son expuestas a la sombra en el exterior del laboratorio durante un periodo de 30 segundos La forma maacutes directa de realizar esta comprobacioacuten es comparando alguno de los cromatogramas obtenidos en estas condiciones con el cromatograma correspondiente a una disolucioacuten irradiada en la laacutempara de mercurio de alta presioacuten durante un tiempo tal que se haya dado en cierta extensioacuten la formacioacuten de los fotoproductos fluorescentes Para ello en un matraz de 100 mL se depositan 010 mL de las disoluciones madre de trans-resveratrol y trans-piceido de 102 y 111 μgmiddotmL-1
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respectivamente 38 mL de etanol absoluto y agua ultrapura hasta enrase Una aliacutecuota de esta disolucioacuten se deposita en una cubeta de cuarzo de un centiacutemetro de paso de luz y se expone a la luz de una laacutempara de mercurio de alta presioacuten durante 90 segundos bajo agitacioacuten magneacutetica Por otra parte el matraz conteniendo el resto de la disolucioacuten se expone a la luz del diacutea a la sombra en el exterior del laboratorio durante 30 segundos Ambas disoluciones se inyectan en el sistema cromatograacutefico y se eluyen en las condiciones ya optimizadas Los cromatogramas registrados monitorizando fotomeacutetricamente el eluato a 260 nm se encuentran en la Figura 13
Figura 13- Cromatogramas (260 nm) correspondientes a las muestras expuestas a la luz del diacutea (superior) y a la luz ultravioleta de la laacutempara de mercurio de alta presioacuten (inferior)
A la vista de la Figura 13 se comprueba la no existencia de FP1 ni FR en
las condiciones de obtencioacuten de los cis-isoacutemeros ya que no se observan los picos correspondientes Con respecto a FP2 que coeluye con trans-resveratrol tambieacuten se comprueba que no se genera nada al ser puro el pico de trans-resveratrol en el cromatograma de la muestra expuesta a la luz solar
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Este hecho tambieacuten ha sido corroborado monitorizando la fotorreaccioacuten a 275 nm longitud de onda correspondiente al punto isobeacutestico de los espectros de absorcioacuten obtenidos en los picos correspondientes de cada par cis-trans Figura 14 Dado que para un par cualquiera en el punto isobeacutestico las absortividades molares de ambos isoacutemeros es la misma la razoacuten aacuterea de pico vs concentracioacuten es tambieacuten la misma Por lo tanto el aacuterea total debe mantenerse constante si la concentracioacuten de cada par cis-trans hace lo mismo
Figura 14- Espectros ldquoen el picordquo obtenidos en liacutenea correspondientes a una disolucioacuten de trans-piceido antes de la exposicioacuten a la luz del diacutea (- - -) y tras un tiempo de exposicioacuten de 30 s (----) y 60 s (middotmiddotmiddotmiddot) Punto isobeacutestico a 275 nm redondeado en la figura de la derecha La comprobacioacuten matemaacutetica de este hecho basada en la ley de Lambert-
Beer es la siguiente Supongamos la siguiente fotorreaccioacuten
trans cishlt
Podemos establecer un balance de materia considerando que antes del proceso de irradiacioacuten soacutelo existen los isoacutemeros trans y que una vez que las
240 280 320 360λ (nm)
0
7
14
21
A (m
Au)
240 280 320 360λ (nm)
0
1
2
3
4
5
6
7
A (m
Au)
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muestras comienzan a exponerse a la luz coexisten ambos isoacutemeros por lo que las concentraciones antes y despueacutes de la irradiacioacuten seriacutean
trans cis
Inicialmente ct0
rans 0
Despueacutes de la irradiacioacuten ct0rans - ccis ccis
Teniendo en cuenta que el aacuterea de los picos viene dada por
Area A dt b c dttrans= sdot = sdot sdot sdotintint ε λ
Puesto que el caudal de la fase moacutevil es constante dt seraacute sinoacutenimo de
dvol y tendremos para cada una de las especies las siguientes relaciones entre aacuterea de pico y concentracioacuten y entre aacuterea de pico y masa inyectada
Inicialmente la cantidad del isoacutemero trans es perfectamente conocida y
esto nos permite poder relacionarla con el aacuterea de pico Cuando a traveacutes de la irradiacioacuten comienza a formarse el isoacutemero cis el aacuterea de pico del trans disminuye pero asumiendo que a lo largo de todo el proceso la masa total se conserva tambieacuten lo haraacute la suma de las aacutereas de ambos picos Si definimos un paraacutemetro y como
Area b c dt b c dvol b mtrans trans trans trans trans trans trans= sdot sdot sdot = sdot sdot = sdot sdotint intε ε ελ λ λ
Area b c dt b c dvol b mcis cis cis cis cis cis cis= sdot sdot sdot = sdot sdot = sdot sdotint intε ε ελ λ λ
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donde Areatrans0 es el aacuterea inicial del pico del trans sustituyendo en esta ecuacioacuten
las relaciones previamente establecidas entre aacuterea y masa tendremos
y como en el punto isobeacutestico λi se cumple que ε λtrans
i = ε λcis
i entonces
Por tanto si el paraacutemetro y obtenido a partir de las aacutereas medidas para los picos antes y despueacutes de irradiar es constante e igual a 100 significaraacute que la suma de las cantidades de cis y trans obtenidas al irradiar es igual a la cantidad inicial de trans y ello permitiraacute calcular la concentracioacuten de cis
Se ha comprobado que efectivamente para los picos obtenidos
detectando a la λ del punto isobeacutestico a la cual se cumple que las absortividades son iguales el aacuterea total es igual a la suma de las aacutereas de cada pico por lo que se comprueba que se conserva la masa y se confirma la existencia uacutenicamente de cis- y trans-resveratrol y cis- y trans-piceido
Comprobado este hecho es correcto proceder al calibrado de los
compuestos cis relacionando el aacuterea de sus correspondientes picos con la concentracioacuten deducida a partir de la disminucioacuten de concentracioacuten de sus respectivos isoacutemeros trans
yArea Area
Areaxtrans cis
trans=
+0 100
yb m b m
b mxtrans trans cis cis
trans trans=
sdot sdot + sdot sdotsdot sdot
ε εε
λ λ
λ 0 100
ym m
mxtrans cis
trans=
+0 100
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Rectas de calibrado y paraacutemetros analiacuteticos de calidad para la cuantificacioacuten de los isoacutemeros cis Con el objetivo de comprobar la linealidad del meacutetodo se prepara en un matraz de 100 mL y en ausencia de luz una disolucioacuten conteniendo 153 y 166 μgmiddotmL-1 de trans-resveratrol y trans-piceido respectivamente Esta disolucioacuten recieacuten preparada se inyecta en el cromatoacutegrafo y se eluye en las condiciones previamente fijadas con el objetivo de relacionar el aacuterea de cada pico con las concentraciones de trans-resveratrol y trans-piceido A continuacioacuten la disolucioacuten se expone a la luz del diacutea en el exterior del laboratorio mantenieacutendola a la sombra Se van aislando de la luz aliacutecuotas de la misma durante un periodo de un minuto y se van guardando en la oscuridad lo que supone la paralizacioacuten de la fotorreaccioacuten en distintos momentos de su desarrollo Las aliacutecuotas obtenidas se conservan en ausencia total de luz y se van inyectando sucesivamente en el sistema cromatograacutefico
Excepto en la primera disolucioacuten totalmente aislada de la luz donde soacutelo
existiraacuten trans-isoacutemeros en todas las demaacutes se observan los 4 isoacutemeros y la relacioacuten entre sentildeal (aacuterea de pico) y la concentracioacuten de cada uno de los isoacutemeros se establece de la siguiente manera
1- Se van inyectando las aliacutecuotas expuestas a la luz medimos el
aacuterea de los picos correspondientes a los compuestos trans y a traveacutes de sus correspondientes rectas de calibrado (Tabla 2) se calcula la concentracioacuten que va quedando de cada isoacutemero trans en cada momento
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2- Por diferencia entre la concentracioacuten inicial de cada trans-isoacutemero y la concentracioacuten de esta misma especie calculada en las diferentes aliacutecuotas expuestas a la luz se calcula la concentracioacuten del cis-isoacutemero correspondiente Se representan los valores de aacuterea de pico para los isoacutemeros cis frente a los valores de concentracioacuten asiacute deducidos
Los resultados obtenidos se presentan en la Figura 15 observaacutendose que no son excesivamente buenos porque sobre todo en el caso del cis-resveratrol no se ajustan a una liacutenea recta
Figura 15- Aacuterea de pico vs concentracioacuten de cada cis-isoacutemeros para muestras obtenidas por exposicioacuten continuada a la luz de una misma muestra y extraccioacuten sucesiva de aliacutecuotas
Con objeto de mejorar la linealidad se realizan diversas experiencias ensayaacutendose diferentes metodologiacuteas y finalmente proponemos el siguiente meacutetodo operatorio
En matraces de 100 mL se preparan disoluciones conteniendo entre 020 y 170 μgmiddotmL-1 de ambos analitos etanol absoluto hasta completar el 15 y agua
0 04 08 12 16[cis-isoacutemero] (μgmiddotmL-1)
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
Aacuterea
de
Pico
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ultrapura hasta enrase Cada uno de estos patrones se inyecta dos veces en el sistema cromatograacutefico la primera vez recieacuten preparado y aislado de la luz y la segunda vez tras haber sido expuesto durante 30 segundos a la luz del diacutea a la sombra en el exterior del laboratorio En todos los casos se inyectan las muestras en el sistema cromatograacutefico se eluyen a 09 mLmiddotmin-1 con una mezcla acetonitriloH3PO4 (004 ) 1882 vv manteniendo la temperatura de la columna constante a 15 ordmC El fotorreactor se mantiene encendido en todo momento lo que permite el desarrollo de las fotorreacciones de los analitos en liacutenea y los correspondientes cromatogramas se obtienen monitorizando fluorimeacutetricamente el eluato a λexcem 260364 nm Las concentraciones de cada uno de los isoacutemeros en las muestras que han estado expuestas a la luz se calculan como se ha explicado anteriormente
En la Figura 16 se representan las rectas de calibrado obtenidas para los cuatro isoacutemeros y en la Tabla 4 se recogen los paraacutemetros analiacuteticos de calidad correspondientes a la determinacioacuten cromatograacutefica de los dos cis-isoacutemeros Los valores de los coeficientes de correlacioacuten son bastante aceptables en ambos casos
Figura 16- Aacuterea de pico frente a la concentracioacuten de analito cis
500
1000
1500
2000
2500
3000
Aacuterea
de
Pico
(FLD
)
0 02 04 06 08 1[cis-Resveratrol] (μgmiddotmL-1)
0
400
800
1200
1600
2000
Aacuterea
de
Pico
(FLD
)
0 02 04 06 08[cis-Piceido] (μgmiddotmL-1)
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Tabla 4- Paraacutemetros analiacuteticos de calidad para la determinacioacuten cromatograacutefica de cis-resveratrol y cis-piceido
cis-Resveratrol cis-Piceido
Rango de concentracioacuten examinado (μgmiddotmL-1) 010 ndash 100 010 ndash 100
Ordenada en el Origen (a plusmn sa) (32plusmn10)x102 (17plusmn11)x102
Pendiente (b plusmn sb) (mLmiddotμg-1) (282plusmn19)x102 (190plusmn 24)x102
Desviacioacuten Estaacutendar de la Regresioacuten (syx) 1037 1258
Coeficiente de Correlacioacuten (r) 09957 09843 Coeficiente de Determinacioacuten (r2) 09914 09688 Linealidad 9344 8731 Resolucioacuten Analiacutetica (γ-1) (μgmiddotmL-1) 00368 00661
LOD (SN=3) (μgmiddotmL-1) 0014 00071 LOQ (SN=10) (μgmiddotmL-1) 0046 0023
Se comprueba que las disoluciones de cis-resveratrol y cis-piceido en el rango de concentraciones detallado en la Tabla 2 y obtenidas por exposicioacuten de disoluciones de sus trans-isoacutemeros durante 30 segundos a la luz del diacutea son estables al menos durante 24 horas Repetitividad del meacutetodo cromatograacutefico para la determinacioacuten de cis-resveratrol y cis-piceido Para estudiar la repetitividad del meacutetodo se prepara una disolucioacuten conteniendo 010 mL de cada una de las disoluciones madre etanoacutelicas de trans-resveratrol y trans-piceido de 102 y 111 μgmiddotmL-1 respectivamente 005 mL de etanol absoluto y agua ultrapura hasta completar 100 mL Esta disolucioacuten se
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expone durante 30 segundos a la luz en el exterior del laboratorio y transcurrido ese tiempo se aiacutesla totalmente de la luz Se realizan once inyecciones de la misma para estudiar asiacute la repetitividad relativa al sistema Tabla 5- Repetitividad relativa al sistema en la determinacioacuten cromatograacutefica de los cuatro analitos
trans-resveratrol cis-resveratrol trans-piceido cis-piceido
tR (min) plusmn SD 179 plusmn 02 373 plusmn 03 530 plusmn 004 180 plusmn 02 RSD 14 082 081 16 Aacuterea Media plusmn SD (382plusmn18)x102 (282plusmn12)x102 (1075plusmn027)x102 (1246plusmn039)x102 RSD (Aacuterea) 46 41 25 32 Altura Media plusmn SD 740 plusmn15 275 plusmn 08 438 plusmn 11 256 plusmn 06 RSD (Altura) 21 30 26 24
Aplicacioacuten Anaacutelisis de los isoacutemeros de resveratrol y piceido en vino En primer lugar y para comprobar si existe o no efecto de matriz se va a llevar a cabo una adicioacuten patroacuten sobre un pool de vinos tintos comerciales Para poder realizar esta experiencia es necesario disponer de una muestra que contenga los cuatro analitos en concentracioacuten conocida Esta disolucioacuten se prepara en un matraz que en un volumen final de 500 mL contiene 147 y 160 μgmiddotmL-1 de trans-resveratrol y trans-piceido respectivamente 006 mL de etanol absoluto y agua ultrapura hasta enrase Esta disolucioacuten se expone a la luz evitando la radiacioacuten solar directa durante 30 segundos lo que da lugar a la transformacioacuten parcial de los trans-isoacutemeros en cis-isoacutemeros La concentracioacuten de cada isoacutemero se determina registrando el cromatograma de una aliacutecuota de esta disolucioacuten y una vez medidas las aacutereas sustituyendo estas en las ecuaciones de calibrado previamente establecidas Esta disolucioacuten se conserva en la oscuridad
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condiciones en las que previamente se determinoacute que los cuatro analitos son estables al menos durante 24 horas Para llevar a cabo la adicioacuten patroacuten se dispone un conjunto de cuatro matraces de 100 mL y se deposita en todos ellos 050 mL del pool de vinos tintos voluacutemenes crecientes de la disolucioacuten que contiene los cuatro analitos de intereacutes (000 300 600 y 900 mL) y agua ultrapura hasta enrase Paralelamente en otra serie de tres matraces de 100 mL se preparan patrones por dilucioacuten de 300 600 y 900 mL de la disolucioacuten que contiene los cuatro analitos de intereacutes Se registran los cromatogramas y se representan las aacutereas de pico frente a la concentracioacuten de analito Figura 17
Como se aprecia en todos los casos excepto en el del trans-resveratrol existe un marcado efecto de matriz hecho que se ha comprobado por aplicacioacuten de los correspondientes tests estadiacutesticos de Fischer y de la t-student
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Figura 17- Rectas de calibrado correspondientes a los patrones (------) y a la adicioacuten patroacuten sobre una muestra de vino tinto (-------)
Se sospecha que el origen de este efecto matriz estaacute en la fotorreaccioacuten que tiene lugar en liacutenea Para comprobarlo se miden las sentildeales correspondientes a los analitos de intereacutes sobre los cromatogramas registrados fotomeacutetricamente ya que el fotorreactor estaacute situado tras el detector fotomeacutetrico y en el caso de que la raiacutez del efecto matriz fuese la fotorreaccioacuten eacuteste efecto no se apreciariacutea sobre las sentildeales fotomeacutetricas En la Figura 18 se muestran los cromatogramas obtenidos a 306 y 290 nm de una muestra de vino contaminada con 30 mL de la disolucioacuten conteniendo los cuatro analitos Al emplear este tipo de deteccioacuten no se consigue una resolucioacuten total de los picos correspondientes a los isoacutemeros del piceido con
0 02 04 06 08[cis-Piceido] (μgmiddotmL-1)
0
1000
2000
3000
Aacuterea
de P
ico (F
LD)
cis-Piceido
0 01 02 03 04 05[trans-Piceido] (μgmiddotmL-1)
0
1000
2000
3000
4000
Aacuterea
de P
ico (F
LD)
trans-Piceido
0 02 04 06[cis-Resveratrol] (μgmiddotmL-1)
0
1000
2000
3000
4000
5000
Aacuterea
de P
ico (F
LD)
cis-Resveratrol
0 01 02 03 04 05[trans-Resveratrol] (μgmiddotmL-1)
0
2000
4000
6000
Aacuterea
de P
ico (F
LD)
trans-Resveratrol
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222
respecto a los interferentes del vino de manera que se mediraacuten alturas en vez de aacutereas de pico sobre los cromatogramas obtenidos midiendo absorbancia a 306 nm para los trans-isoacutemeros y a 290 nm para los cis-isoacutemeros
Figura 18- Cromatogramas obtenidos fotomeacutetricamente a 306 y 290 nm correspondientes a una muestra de vino tinto fortificada con los cuatro analitos de intereacutes
En estas condiciones se construyen los correspondientes graacuteficos de calibracioacuten y adicioacuten patroacuten representando las alturas de pico frente a la concentracioacuten de analito puesta o antildeadida respectivamente Figura 19
min0 5 10 15 20 25 30 35
mAU
0
1
2
3
4
5trans-Piceido
trans-Resveratrol
306 nm
min0 5 10 15 20 25 30 35
mAU
0
1
2
3
4
5
cis-Piceido cis-Resveratrol
290 nm
CAPIacuteTULO V Isoacutemeros de resveratrol y piceido mediante HPLC y derivatizacioacuten on-line
223
Figura 19- Alturas de pico frente a la concentracioacuten de analito antildeadida sobre la muestra de vino (-------) y frente a la concentracioacuten de analito en el patroacuten (-------)
Como se observa y posteriormente se comprueba por aplicacioacuten de los correspondientes tests estadiacutesticos de Fischer y de la t-student en este caso no existen diferencias significativas para un nivel de confianza del 95 entre las pendientes de las rectas de patrones externos y de adicioacuten patroacuten obtenidas para cada compuesto lo que confirma el hecho de que el efecto matriz se produce en la fotorreaccioacuten
Dicho efecto matriz podriacutea deberse a alguacuten tipo de cataacutelisis de la
fotorreaccioacuten en presencia de vino Para comprobarlo se lleva a cabo el estudio de la influencia del tiempo de irradiacioacuten en liacutenea para trans-piceido ya que es el
0 01 02 03 04 05[trans-Piceido] (μgmiddotmL-1)
0
2
4
6
8
Altur
a de P
ico (D
AD30
6nm)
trans-Piceido
0 02 04 06 08[cis-Piceido] (μgmiddotmL-1)
0
04
08
12
Altur
a de
Pico
(DAD
290n
m)
cis-Piceido
0 02 04 06[trans-Resveratrol] (μgmiddotmL-1)
0
2
4
6
Altur
a de P
ico (D
AD30
6nm)
trans-Resveratrol
0 02 04 06[cis-Resveratrol] (μgmiddotmL-1)
0
04
08
12
Altu
ra de
Pico
(DAD
290n
m)
cis-Resveratrol
CAPIacuteTULO V Isoacutemeros de resveratrol y piceido mediante HPLC y derivatizacioacuten on-line
224
primer compuesto en eluir El tiempo de exposicioacuten del analito a la luz ultravioleta se controla a traveacutes del caudal de fase moacutevil Se prepara una disolucioacuten conteniendo 055 μgmiddotmL-1 de trans-piceido y otra conteniendo 050 mL de vino tinto y la misma cantidad de analito completando en ambos casos con agua ultrapura hasta 100 mL Ambas disoluciones se eluyen con velocidades de flujo comprendidas entre 02 y 18 mLmiddotmin-1 manteniendo en todo caso el fotorreactor encendido y monitorizando fluorimeacutetricamente el eluato La representacioacuten del aacuterea de pico de cis-piceido correspondientes a la muestra patroacuten y a la muestra de vino fortificada frente a la velocidad de flujo (Figura 20) pone de manifiesto la aceleracioacuten del proceso fotoquiacutemico en presencia de vino como puede observarse en el primer tramo de crecida de las curvas Por otra parte los valores de aacuterea de pico que se alcanzan en presencia de vino son mucho mayores que el aacuterea correspondiente seguacuten la recta de patrones externos a la suma de trans-piceido antildeadido y lo que el vino contiene
Figura 20- Influencia del tiempo de irradiacioacuten en liacutenea sobre trans-piceido en presencia (-----) y en ausencia de vino (----)
Una vez comprobado que en vinos tintos existe efecto de matriz y que por
tanto el anaacutelisis de los cuatro analitos tiene que llevarse a cabo mediante adicioacuten patroacuten se comienza el estudio de los vinos blancos
0 04 08 12 16 2Flujo (mLmiddotmin-1)
0
2000
4000
6000
8000
Aacuterea
de P
ico (F
LD)
CAPIacuteTULO V Isoacutemeros de resveratrol y piceido mediante HPLC y derivatizacioacuten on-line
225
En este caso se lleva a cabo una adicioacuten patroacuten operando exactamente igual que en caso anterior con la excepcioacuten de que el volumen de vino blanco es en este caso de 50 mL Las correspondientes rectas de calibrado tanto de patrones externos como de la adicioacuten patroacuten al vino blanco se representan en la Figura 21
Por aplicacioacuten de los test estadiacutesticos de Fischer y de la t-student se
deduce que en el caso de los vinos blancos no existe efecto de matriz para ninguno de los cuatro analitos pudieacutendose por tanto llevar a cabo el anaacutelisis mediante calibracioacuten externa
Figura 21- Aacuterea de pico frente a la concentracioacuten de analito antildeadida sobre la muestra de vino blanco (-------) y frente a la concentracioacuten de analito en el patroacuten (-------)
0 01 02 03 04[trans-Piceido] (μgmiddotmL-1)
0
200
400
600
800
1000
Aacuterea
de P
ico (F
LD)
0 01 02 03 04[cis-Piceido] (μgmiddotmL-1)
0
500
1000
1500
2000
2500
Aacuterea
de
Pico
(FLD
)
0 01 02 03 04[trans-Resveratrol] (μgmiddotmL-1)
0
400
800
1200
1600
2000
Aacuterea
de P
ico (F
LD)
0 01 02 03 04[cis-Resveratrol] (μgmiddotmL-1)
0
400
800
1200
1600
2000
Aacuterea
de
Pico
(FLD
)
CAPIacuteTULO V Isoacutemeros de resveratrol y piceido mediante HPLC y derivatizacioacuten on-line
226
En uacuteltimo lugar nos planteamos tambieacuten el anaacutelisis de un vino blanco de podredumbre noble en concreto el vino huacutengaro Tokaji Los vinos de podredumbre noble se elaboran a partir de uvas afectadas por Botrytis de manera que estos vinos auacuten siendo vinos blancos deben tener concentraciones de resveratrol en todas sus formas superiores a las encontradas en vinos blancos normales El anaacutelisis de este vino se realiza tambieacuten mediante adicioacuten patroacuten encontraacutendose que en este caso tampoco hay efecto de matriz para ninguno de los cuatro analitos de intereacutes En la Tabla 6 se resumen los resultados del anaacutelisis para todos los vinos analizados Todos ellos fueron analizados mediante adicioacuten patroacuten por triplicado
Tabla 6- Concentraciones encontradas de los isoacutemeros de resveratrol y piceido en diferentes vinos Meacutetodo de adicioacuten patroacuten (por triplicado)
[t-Piceido] (μgmiddotmL-1)
[c-Piceido] (μgmiddotmL-1)
[t-Resveratrol] (μgmiddotmL-1)
[c-Resveratrol] (μgmiddotmL-1)
Vinos Tintos Pool 1 65 plusmn 05 29 plusmn 03 14 plusmn 01 021 plusmn 012
Vinos Tintos Pool 2 12 plusmn 01 15 plusmn 01 0070 plusmn 0050 0060 plusmn 0020
Pool de Vinos Blancos 0099 plusmn 0013 042 plusmn 002 0054 plusmn 0009 0068 plusmn 0010
Vino Blanco de Podredumbre Noble (Tokaji)
029 plusmn 005 070 plusmn 002 0070 plusmn 0010 0064 plusmn 0050
CAPIacuteTULO VI
UTILIZACIOacuteN DE SENtildeALES FLUORESCENTES DE TRES VIacuteAS (MATRICES DE EXCITACIOacuteN-
EMISIOacuteN) PARA CARACTERIZACIOacuteN DE VINOS
CAPIacuteTULO VI EEMs para caracterizacioacuten de vinos
228
CAPIacuteTULO VI EEMs para caracterizacioacuten de vinos
229
ANTECEDENTES Fluorescencia front-face
La espectroscopia de fluorescencia molecular es una teacutecnica de anaacutelisis quiacutemico que cada vez estaacute adquiriendo mayor importancia como teacutecnica analiacutetica cuantitativa principalmente debido a su gran sensibilidad facilidad de utilizacioacuten versatilidad instrumental (se pueden ajustar muchos paraacutemetros instrumentales) rapidez del anaacutelisis pequentildeas cantidades de muestra y por ser ademaacutes una teacutecnica no invasiva ni destructiva Sin embargo aunque esta teacutecnica presenta un gran potencial hasta ahora ha sido poco utilizada para la caracterizacioacuten de alimentos a pesar de que muchos presentan fluorescencia nativa Esto ha sido debido a que la fluorescencia claacutesica no puede aplicarse a muestras turbias opacas o disoluciones muy concentradas Cuando la muestra en estudio presenta elevada absorcioacuten la intensidad de la radiacioacuten emitida no es proporcional a la concentracioacuten de los fluoroacuteforos presentes debido principalmente al efecto de filtro interno Los espectros de excitacioacuten y emisioacuten disminuyen y ademaacutes los espectros de excitacioacuten estaacuten distorsionados Para evitar este problema lo maacutes usual es diluir la muestra de tal forma que la absorbancia sea inferior a 01 Sin embargo los resultados obtenidos para estas disoluciones diluidas no tienen por que ser extrapolables a la matriz original de la muestra ya que con la dilucioacuten se pierde la organizacioacuten de la matriz original Este problema puede ser evitado utilizando la teacutecnica de front-face desarrollada por CA Parker en 19681 cuya principal diferencia con respecto a la modalidad tradicional es la modificacioacuten del aacutengulo de incidencia de la radiacioacuten sobre la muestra pasando de un aacutengulo de 90ordm en la teacutecnica tradicional a un aacutengulo proacuteximo a 30ordm en la teacutecnica de front-face
1 Parker CA Apparatus and experimental methods in Photoluminescence of solutions with applications to photochemistry and analytical chemistry C A Parker ed Elsevier Amsterdam The Netherlands 1968 Paacuteginas 128ndash302
CAPIacuteTULO VI EEMs para caracterizacioacuten de vinos
230
midieacutendose la radiacioacuten emitida en la misma cara que la radiacioacuten incidente y sin que las radiaciones incidente y emitida atraviesen la disolucioacuten en medida apreciable Esta modalidad reduce los efectos de dispersioacuten debidos a la elevada concentracioacuten de las muestras no diluidas o a la presencia de turbidez En un principio su aplicacioacuten maacutes relevante fueron los estudios de fluorescencia en matrices soacutelidas pero en las dos uacuteltimas deacutecadas su aplicacioacuten en el anaacutelisis y caracterizacioacuten de alimentos se ha incrementado considerablemente Si ademaacutes las sentildeales fluorescentes obtenidas en modo front-face se combinan con teacutecnicas de anaacutelisis multivariante se consigue potenciar su uso como herramienta para la caracterizacioacuten de alimentos Los meacutetodos de anaacutelisis multivariante maacutes utilizados son PCA (Anaacutelisis de Componentes Principales) y PLS (Miacutenimos Cuadrados Parciales) para tratar datos de primer orden y en caso de datos de oacuterdenes superiores el maacutes utilizado es PARAFAC (PARAllel FACtor
analysis)
Todaviacutea son relativamente escasas las publicaciones que hacen uso de esta combinacioacuten de front-face con sentildeales multivariantes para la caracterizacioacuten y clasificacioacuten de alimentos En 2006 Christensen et al2 publican un artiacuteculo de revisioacuten acerca de las posibilidades que ofrece la autofluorescencia de diversos alimentos en combinacioacuten con meacutetodos de anaacutelisis multivariante como herramienta tanto para el anaacutelisis como para la clasificacioacuten de los mismos Casi todos los procedimientos hacen uso de datos de primer orden espectros de fluorescencia de excitacioacuten emisioacuten o en algunos casos espectros sincroacutenicos en combinacioacuten casi siempre con PCA Asiacute dichos procedimientos se aplican al estudio de proteiacutenas en harinas con gluten3 o bien para seguir la evolucioacuten de la
2 Christensen J Noslashrgaard L Bro R Engelsen SB Chem Reviews 2006 1061980-1994 3 Genot C Tonetti F Montenay-Garestier T Drapron R Sci Aliments 199212687ndash704
CAPIacuteTULO VI EEMs para caracterizacioacuten de vinos
231
reaccioacuten de Maillard en alimentos infantiles realizando medidas de fluorescencia que permiten tomar la huella digital en base a los cambios que se producen durante la manufacturacioacuten y analizando estos datos mediante meacutetodos quimiomeacutetricos4 Los productos laacutecteos son matrices en que la fluorescencia front-face se usa ampliamente para la caracterizacioacuten y clasificacioacuten Asiacute permite el seguimiento del cambio estructural que se produce en las proteiacutenas de la leche durante el proceso de calentamiento5 o bien la cuantificacioacuten simultaacutenea de furosina y lactosa en leche lo que proporciona un meacutetodo para evaluar la calidad de la leche6 En combinacioacuten con PCA permite la discriminacioacuten entre diferentes tipos de leche seguacuten la temperatura y el tiempo utilizado en el tratamiento teacutermico7 La determinacioacuten de riboflavina en yogures se usa para evaluar la conservacioacuten de los mismos y la aplicacioacuten de PCA a los espectros de emisioacuten revela cambios en la sentildeal de fluorescencia con el tiempo de conservacioacuten8 Wold et al8 proponen el uso de fluorescencia front-face y PCA como herramienta para seguir la foto-oxidacioacuten de productos laacutecteos frescos Tambieacuten se propone la caracterizacioacuten de helados basada en la relacioacuten existente entre grasas proteiacutenas y emulsionantes9 La clasificacioacuten de cervezas procedentes de diferentes paiacuteses se lleva a cabo registrando los espectros de emisioacuten y sincroacutenicos de muestras de cervezas sin diluir y utilizando PLS para realizar el tratamiento quimiomeacutetrico de los datos10
4 Birlouez-Aragon I Locquet N de St Louvent E Jouan-Rimbaud Bouveresse D Stahl P Annals of the New York Academy of Sciences 2005 1043308ndash318 5 Dufour E Riaublanc A Lait 1997 77657-670 6 Kulmyrzaev AA Dufour E Lait 2002 82725-735 7 Kulmyrzaev AA Levieux D Dufour E J Agric Food Chem 2005 53502-507 8 Miquel Becker E Christensen J Frederiksen CS Haugaard VK J Dairy Sci 2003 862508-2515 8 Wold JP Joslashrgensen K Lundby F J Dairy Sci 2002 851693-704 9 Granger C Da Costa JP Toutain J Barey P y Cansell M Int Dairy J 2006 16489-496 10 Sikorska E Goacuterecki T Khmelinskii IV Sikorski MY Keukeleire D J Institute of Brewing 2004 110267-275
CAPIacuteTULO VI EEMs para caracterizacioacuten de vinos
232
y en esta misma matriz la aplicacioacuten de PLS a los espectros sincroacutenicos permite determinar el contenido en vitamina B211
Karoui et al han publicado varios trabajos en los que informan del uso de la fluorescencia front-face para diferenciar entre productos de cereales diferentes12 o entre filetes de pescado fresco y congelado13 asegurar la frescura de huevos almacenados14 seguir el proceso de oxidacioacuten en quesos semicurados15 y clasificar mieles de diferente origen botaacutenico16 La cantidad de informacioacuten que puede obtenerse es auacuten mayor si las sentildeales fluorescentes no se limitan a los espectros de excitacioacuten emisioacuten o sincroacutenicos sino que se manejan las sentildeales fluorescentes totales es decir las matrices de excitacioacuten-emisioacuten (EEMs) o espectros tridimensionales que si se combinan con teacutecnicas quimiomeacutetricas ademaacutes de permitir aumentar la selectividad posibilitan que se pueda obtener informacioacuten extra sobre paraacutemetros que de forma geneacuterica nos permiten agrupar y discriminar objetos descritos mediante un vector de atributos ya sea construyendo las clases o asignando los objetos a clases previamente definidas Esta combinacioacuten permite obtener en tiempos de anaacutelisis muy pequentildeos informacioacuten que puede ser usada como ldquohuella
digitalrdquo de diversos alimentos Por tanto aplicando la teacutecnica de front-face se pueden obtener datos de segundo orden que se pueden tratar con herramientas quimiomeacutetricas con fines clasificatorios de tipificacioacuten seguimiento de procesos etc En su aplicacioacuten al 11 Sikorska E Eur Food Res Technol 2007 22543-48 12 Karoui R Cartaud G Dufour E J Agric Food Chem 2006 542027-2034 13 Karoui R Thomas E Dufour E Food Res Int 2006 39349-355 14 Karoui R Schoonheydt E Decuypere B Nicolau J De Baerdemaeker J Anal Chim Acta 2007 582 83-91 15 Karoui R Dufour E De Baerdemaeker J Food Chem 2007 1011305-1314 16 Karoui R Dufour E Bosset JO De Baerdemaeker J Food Chem 2007 101314-323
CAPIacuteTULO VI EEMs para caracterizacioacuten de vinos
233
anaacutelisis de alimentos son muy pocos los procedimientos desarrollados Bro et al a traveacutes de las EEMs y PARAFAC evaluacutean los fluoroacuteforos responsables de la autofluorescencia de diversas muestras de azuacutecar17 El anaacutelisis mediante PARAFAC de las matrices de excitacioacuten-emisioacuten de diferentes yogures obtenidas mediante front-face pone de manifiesto la presencia de tres fluoroacuteforos riboflavina triptoacutefano y lumicromo cuya cantidad estaacute relacionada con las condiciones de almacenamiento18 Guimet et al aplican PARAFAC a las EEMs para evaluar los principales fluoroacuteforos y realizar una clasificacioacuten de diferentes tipos de aceites de oliva19 Tambieacuten se ha sugerido su aplicacioacuten como un meacutetodo potencial para comprobar la contaminacioacuten por dioxina en aceite de pescado basado en una correlacioacuten indirecta20 Caso concreto del vino
El intereacutes por el estudio acerca de la composicioacuten quiacutemica del vino se debe a su importancia en la evaluacioacuten de la calidad de este producto En los uacuteltimos antildeos los productores han mejorado la calidad de los vinos y por otra parte los consumidores son cada vez maacutes exigentes Por ello es importante desarrollar meacutetodos de anaacutelisis raacutepidos sin tratamiento previo de las muestras Las herramientas para manejar y abordar el anaacutelisis quiacutemico del vino se estaacuten convirtiendo en una necesidad en la industria del vino con el fin de automatizar la produccioacuten y estabilizar la calidad por lo que todas aquellos procedimientos que permitan la clasificacioacuten de los vinos en funcioacuten de la regioacuten de origen del tipo de uva utilizada en la elaboracioacuten o del proceso de elaboracioacuten de los vinos pueden ser uacutetiles para esta industria
17 Bro R Chemom and Intell Lab Syst 1999 46133-147 18 Christensen J Miquel Becker E Frederiksen CS Chemom Intell Lab Syst 2005 75210-208 19 Guimet F Ferre J Boque R Rius FX Anal Chim Acta 2004 51575-85 20 Pedersen DK Munck L Engelsen SB J Chemom 2002 16 451-460
CAPIacuteTULO VI EEMs para caracterizacioacuten de vinos
234
Los uacutenicos antecedentes sobre la utilizacioacuten de sentildeales fluorescentes para clasificar vinos seguacuten la variedad y cosecha son los descritos por Dufour et al21 que estudian el potencial de las sentildeales de primer orden obtenidas mediante fluorescencia front-face combinadas con meacutetodos quimiomeacutetricos e investigan un total de 120 vinos producidos en Francia y Alemania Registran los espectros de emisioacuten (275ndash450 nm) y excitacioacuten (250ndash350 nm) de cada muestra y los relacionan con el contenido en compuestos fenoacutelicos Los espectros de emisioacuten se caracterizan por presentar un maacuteximo a 376 nm y un hombro a 315 nm y los de excitacioacuten muestran dos picos localizados en torno a 260 y 320 nm y su fisonomiacutea variacutea para las diferentes muestras de vino principalmente en cuanto a la relacioacuten de intensidades de maacuteximohombro Las muestras se evaluacutean usando anaacutelisis de componentes principales (PCA) y se clasifican mediante anaacutelisis factorial discriminatorio (FDA) En este primer estudio se muestran las posibilidades de la fluorescencia front-face en combinacioacuten con herramientas quimiomeacutetricas para asegurar la trazabilidad de vinos
Sobre la utilizacioacuten de datos de segundo orden con fines clasificatorios en
muestras de vino no se han encontrado antecedentes en la bibliografiacutea consultada No obstante el potencial de la teacutecnica debe aumentar con la dimensionalidad de los datos de manera que los datos tridimensionales seriacutean una herramienta maacutes poderosa que los bidimensionales especialmente desde el punto de vista de la clasificacioacuten de muestras Ello nos ha llevado a explorar las posibilidades de las matrices de excitacioacuten-emisioacuten obtenidas mediante la teacutecnica de front-face para la clasificacioacuten de muestras de vino y constituir una posible huella digital Asiacute en este capiacutetulo se aborda por primera vez el estudio de la matriz de excitacioacuten-emisioacuten del vino
21 Dufour E Letort A Laguet A Lebecque A Serra JN Anal Chim Acta 2006 563292-299
CAPIacuteTULO VI EEMs para caracterizacioacuten de vinos
235
El objetivo principal de este capiacutetulo es detectar los principales compuestos fluorescentes presentes en el vino con el objetivo de mejorar en la interpretacioacuten de los espectros de fluorescencia de una matriz tan compleja Para ello se aplica PARAFAC sobre un cubo de datos construido a partir de las matrices de excitacioacuten-emisioacuten de fluorescencia del conjunto de muestras consideradas en este estudio La estrategia de muestreo que se sigue consiste en incluir en el modelo muestras de diferentes oriacutegenes lo suficientemente diferentes entre ellas con el objetivo de representar un abanico real de compuestos fluorescentes que pueden estar presentes en cualquier muestra Para la identificacioacuten de los principales fluoroacuteforos en el vino se buscaraacuten las correlaciones existentes entre los scores de cada muestra en cada uno de los componentes obtenidos en la descomposicioacuten mediante PARAFAC y las alturas de los picos correspondientes a componentes individuales separados en la columna cromatograacutefica establecieacutendose asiacute las bases para el desarrollo de futuros meacutetodos raacutepidos para la determinacioacuten cuantitativa de tales fluoroacuteforos
Por otra parte teniendo en cuenta que en el modelo se incluyen vinos de
distinta procedencia se estudiaraacute la capacidad de las sentildeales de autofluorescencia con fines clasificatorios seguacuten dicha procedencia Esta propuesta es muy importante en paiacuteses importadores de vino
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN Muestras de vino incluidas en el modelo
Para la construccioacuten del modelo se partioacute de un conjunto de 57 muestras de vino de diferentes oriacutegenes y elaborados con distintos tipos de uva con el objetivo de que en el modelo esteacuten representados toda la variedad de compuestos
CAPIacuteTULO VI EEMs para caracterizacioacuten de vinos
236
fluorescentes que pueden estar en una muestra real y en niveles tambieacuten lo maacutes cercanos posible a la realidad Concretamente la procedencia de las muestras es dos de Francia 16 de Chile 3 de Sudaacutefrica 6 de Australia (2 de ellas de Occidente) 3 de Espantildea 6 de Argentina 3 de USA 15 de Italia 1 de Tuacutenez y 2 de Portugal En la Tabla 1 se detalla el origen de cada muestra asiacute como el tipo de uva del que se obtienen cuando este dato estaacute disponible Las muestras se mantienen a una temperatura aproximada de 4ordm C y la matriz de fluorescencia de cada muestra se registra inmediatamente despueacutes de abrir cada botella
Tabla 1- Origen y tipo de uva de las muestras consideradas en el estudio
Muestra Nordm Origen Tipo de Uva 1 Francia Cabernet Sauvignon 2 Francia 3 Chile Cabernet Sauvignon 4 Chile Cabernet Sauvignon 5 Chile Cabernet Sauvignon 6 Chile Cabernet Sauvignon 7 Chile Cabernet Sauvignon 8 Chile Cabernet Sauvignon 9 Chile Merlot 10 Chile Cabernet Sauvignon 11 Chile Cabernet Sauvignon 12 Chile Cabernet Sauvignon 13 Chile 14 Chile 15 Sudaacutefrica Cabernet Sauvignon 16 Sudaacutefrica Cabernet Sauvignon 17 Sudaacutefrica Cabernet Sauvignon 18 Australia Occidental Syrah 19 Australia Occidental Syrah 20 Australia Syrah - Cabernet 21 Australia Syrah - Cabernet 22 Australia 23 Australia 24 Espantildea 25 Espantildea 26 Espantildea 27 Argentina Malbec ndash Syrah ndash 28 Argentina Malbec ndash Syrah ndash 29 Argentina Malbec ndash Syrah ndash 30 Argentina Syrah
CAPIacuteTULO VI EEMs para caracterizacioacuten de vinos
237
Tabla 1- Origen y tipo de uva de las muestras consideradas en el estudio (continuacioacuten) Muestra Nordm Origen Tipo de Uva
31 Argentina Syrah 30 Argentina Syrah 31 Argentina Syrah 32 Argentina Syrah 33 USA Syrah 34 USA Ruby Cabernet 35 USA Ruby Cabernet 36 Italia 37 Italia 38 Italia (Sicilia) 39 Italia Sangiovese 40 Italia Sangiovese 41 Italia 42 Italia 43 Italia 44 Tuacutenez 45 Italia 46 Italia 47 Italia 48 Italia 49 Italia 50 Italia 51 Chile 52 Chile 53 Chile Merlot 54 Chile Merlot 55 Portugal 56 Portugal 57 Italia Sangiovese
Matrices de excitacioacuten-emisioacuten de fluorescencia
Las matrices de excitacioacuten-emisioacuten de fluorescencia (EEMs) correspondientes a las 57 muestras se registran en modo front-face con el objetivo de minimizar los efectos de filtro interno reflexioacuten dispersioacuten y despolarizacioacuten de la luz El aacutengulo de incidencia definido como el formado entre el haz de excitacioacuten y la perpendicular a la superficie de la celda se mantiene en 30ordm y el de observacioacuten en 60ordm (Figura 1) Una aliacutecuota de cada muestra de vino se transfiere directamente de la botella a una celda de cuarzo de 3 mL y 1 cm de paso de luz La
CAPIacuteTULO VI EEMs para caracterizacioacuten de vinos
238
temperatura del laboratorio se mantiene en torno a 15 ordmC Las rendijas de excitacioacuten y emisioacuten de los monocromadores se fijan en 15 y 5 nm respectivamente La velocidad de adquisicioacuten se fija en 500 nmmin como solucioacuten de compromiso para disminuir el ruido en los espectros registrados y el tiempo de adquisicioacuten de la matriz Los rangos de longitudes de onda de excitacioacuten y emisioacuten son 245-340 nm y 300-500 nm con incrementos de 5 y 05 nm respectivamente Cada EEM se registra como muacuteltiples espectros de emisioacuten a distintas longitudes de onda de excitacioacuten de manera decreciente es decir de la radiacioacuten excitante menos energeacutetica a la maacutes energeacutetica con el objetivo de evitar en lo posible la alteracioacuten de la muestra por el haz UV de excitacioacuten El tiempo empleado en el registro de cada EEM es aproximadamente 10 minutos Todas las matrices se registran en el periodo de tiempo lo maacutes corto posible en concreto se emplearon 6 diacuteas con el objetivo de minimizar las variaciones instrumentales tales como las fluctuaciones en la intensidad de la laacutempara
Figura 1- Accesorio para realizar medidas de fluorescencia front-face
CAPIacuteTULO VI EEMs para caracterizacioacuten de vinos
239
En la Figura 2 se recogen las EEMs de cuatro de los vinos analizados en forma de mapas de contorno asiacute como los espectros de excitacioacuten y emisioacuten extraiacutedos de las mismas como cortes horizontales y verticales respectivamente a las longitudes de onda de emisioacuten y excitacioacuten indicadas en el pie de dicha Figura
Como puede observarse en los mapas de contorno de la Figura 2 todas
las muestras emiten radiacioacuten fluorescente de longitudes de onda comprendidas entre 300 y 400 nm cuando son excitadas a longitudes de onda por debajo de 290 nm Los espectros de excitacioacuten y emisioacuten previamente publicados por Dufour et al21 empleados para discriminar entre vinos franceses y alemanes caen dentro de esta zona de fluorescencia comuacuten a todas las muestras No obstante como puede verse en la Figura 2 esta regioacuten es demasiados compleja como para obtener una visioacuten general de la misma utilizando un uacutenico par de espectros de excitacioacuten y emisioacuten Por otra parte cuando la radiacioacuten excitante es menos energeacutetica concretamente cuando es de longitudes de onda superiores a 290 nm se observa una nueva zona de emisioacuten de fluorescencia entre 350 y 450 nm
CAPIacuteTULO VI EEMs para caracterizacioacuten de vinos
240
Muestra nuacutemero 1 Vino franceacutes
Muestra nuacutemero 7 Vino Chileno
Muestra nuacutemero 17 Vino sudafricano
Muestra nuacutemero 19 Vino australiano
Figura 2- IZQUIERDA EEMs correspondientes a las muestras nuacutemero 1 (Vino Franceacutes) 7 (Vino Chileno) 17 (Vino Sudafricano) y 19 (Vino Australiano) CENTRO Espectros de excitacioacuten extraiacutedos de la EEM a λem= 325 (negro) 363 (azul) y 388 nm (rojo) DERECHA Espectros de emisioacuten extraiacutedos de la EEM a λexc= 260 (azul) 280 (negro) y 320 nm (rojo)
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Realizando un anaacutelisis maacutes profundo de las EEMs se describen a continuacioacuten las caracteriacutesticas maacutes relevantes de los espectros obtenidos realizando una serie de cortes horizontales y verticales en las zonas de maacutexima fluorescencia de las mismas Los espectros de emisioacuten (liacutenea azul) excitando a 260 nm presentan una banda relativamente ancha centrada a 372 nm en la cual pueden distinguirse dos maacuteximos a 363 y 380 nm La razoacuten de intensidades de emisioacuten de fluorescencia en ambos maacuteximos variacutea seguacuten la muestra como ya describieron previamente Dufour et al21 Asiacute por ejemplo en la muestra 19 la intensidad a 380 nm es mayor que a 363 nm al contrario que para las muestras 7 y 17 o en la muestra 1 en cuyo caso la razoacuten de intensidades a ambas longitudes de onda estaacute proacutexima a 1 En los espectros de excitacioacuten (liacutenea azul) obtenidos a 363 nm se observan dos maacuteximos centrados a 260 y 280 nm Al igual que ocurre con los espectros de emisioacuten previamente descritos las intensidades relativas en ambos maacuteximos de excitacioacuten variacutean con la muestra pudiendo ser la razoacuten IF(260) IF(280) mayor o menor que uno como ocurre en las muestras 19 y 1 respectivamente En otros casos como en las muestras 7 y 17 la maacutexima intensidad de excitacioacuten estaacute localizada en torno a 280 nm observaacutendose ademaacutes un simple hombro a 260 nm La maacutexima intensidad de emisioacuten de fluorescencia excitando a 280 nm (liacutenea negra) se centra a 363 nm apareciendo en algunos casos como por ejemplo en las muestras 1 y 17 un segundo maacuteximo de emisioacuten en torno a 325 nm tan importante como el primero En los espectros de excitacioacuten a 325 nm se observa para todas las muestras un uacutenico maacuteximo centrado a 275 nm
Por uacuteltimo en la zona de longitudes de onda de excitacioacuten maacutes desplazada hacia el rojo concretamente a 320 nm se obtiene el tercer espectro de emisioacuten
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tiacutepico del vino (liacutenea roja) En este caso se observa una banda de emisioacuten centrada a 388 nm En los espectros de excitacioacuten obtenidos a 388 nm se observa un maacuteximo a 325 nm siendo la forma de dichos espectros por debajo de 300 nm similar a la de los previamente descritos a λem= 363 nm Construccioacuten del modelo PARAFAC Fundamentos del anaacutelisis factorial paralelo (PARAFAC) Cuando una muestra produce una matriz de datos de dimensiones J x K (tensor de segundo orden) tal como una EEM siendo J el nuacutemero de longitudes de onda de emisioacuten y K el nuacutemero de longitudes de onda de excitacioacuten el correspondiente conjunto de datos obtenidos apilando las matrices correspondientes a las I muestras incluidas en el modelo es un cubo de datos (matriz 3D) de dimensiones I x J x K (Figura 3)
Figura 3- Estructura del cubo de datos
Dado que las EEMs siguen un modelo bilineal dicho cubo puede
expresarse como un sumatorio de tensores producto de tres vectores extendido al nuacutemero de componentes que contribuye a la EEM Sean los vectores An Bn y Cn la contribucioacuten (I x 1) el perfil de emisioacuten (J x 1) y el perfil de excitacioacuten (K x 1) para el
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componente n respectivamente entonces el cubo de datos F puede escribirse como2223
F = sum=
N
n 1An otimes Bn otimesCn + E
donde otimes representa un producto de tensores N es el nuacutemero total de
componentes y E es el teacutermino de error residual cuyas dimensiones son las mismas que las de F Los vectores columna an bn y cn se recogen en la matriz de los scores A conteniendo las contribuciones relativas de los diferentes componentes y en las matrices de los loadings B y C
En la Figura 4 se representa esquemaacuteticamente la descomposicioacuten mediante PARAFAC de un conjunto de EEMs
Figura 4- Descomposicioacuten mediante PARAFAC de una serie de EEMs en tres factores
Una ventaja importante del modelo PARAFAC viene dada por el hecho de que las soluciones que propone son uacutenicas (unicidad) La descomposicioacuten de F suministra los loadings y los scores de los componentes individuales en todas las muestras sean quiacutemicamente conocidos o no Esto es especialmente uacutetil en el anaacutelisis de matrices de alimentos donde no se disponen de patrones de los componentes puros
22 Ewing GW Instrumental methods of chemical analysis Mc Graw-Hill New York 1985 23 Leurgans S Ross RT Stat Sci 1992 7 289-319
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Bro24 denomina a esta teacutecnica como ldquocromatografiacutea matemaacuteticardquo debido al hecho de que la separacioacuten (cromatografiacutea) de las sentildeales de los constituyentes se lleva a cabo matemaacuteticamente (computacionalmente) Modelo PARAFAC El anaacutelisis por PARAFAC se lleva a cabo en Matlab 710 (The Mathworks Inc MA USA) utilizando las rutinas contenidas en PLS_Toolbox (Eigenvector Research Inc WA USA) Las dimensiones del cubo de datos obtenido agrupando las EEMs correspondientes a las 57 muestras es 57 x 398 x 20 (muestras x λ excitacioacuten x λ emisioacuten) Una vez construido este cubo los datos han de ser pretratados antes de proceder a su anaacutelisis mediante PARAFAC Se procede en primer lugar a la eliminacioacuten de las sentildeales de dispersioacuten Rayleigh Para ello se inserta el teacutermino NaN (ldquonot a numberrdquo) en las liacuteneas λexc = λem y 2λexc= λem con una amplitud determinada Por otra parte en la zona triangular de la matriz donde λexc gt λem se insertan ceros ya que no es loacutegico que exista emisioacuten a longitudes de onda menores que la de excitacioacuten ya que esta situacioacuten se corresponderiacutea con una emisioacuten maacutes energeacutetica que la radiacioacuten causante de la excitacioacuten Se ha comprobado que los ceros en esta zona aceleran los caacutelculos pero no deben estar demasiado cerca de la zona λexc = λem ya que si asiacute fuera se introduciriacutean deformaciones (ldquoartefactsrdquo) en las matrices El cubo de datos ya pretratado se descompone mediante PARAFAC utilizando diferente nuacutemero de factores y aplicando en todos los casos la restriccioacuten
24 Bro R Multi-way Analysis in the Food Industry Theory Algorithms and Applications Doctoral Dissertation University of Amsterdam 1998