1.4.4. Deslignificación con alcoholes de materiales lignocelulósicos ...
DEGRADACION MICROBIANA DE SUBPRODUCTOS ...La protección de la celulosa por la lignina obliga a que,...
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DEGRADACION MICROBIANA DE SUBPRODUCTOS lIGNOCElUlOSICOS.
C.SAIZ-JlMENEZ
Dirección General del Medio Ambiente.
Junta de Andalucía.
Avda.República Argentin8,21-B
SEVILLA-lI
INTRODUCCION.
La 1ignina, junto a la celulosa, es el polímero más abundante en la naturale
za. Se ha estimado que la producción anual de b:i.omasa terrestre es de 100 x
109 toneladas, de las que 20 x 109 toneladas corresponden a ligOl.na (Bassharn,1975).
Normalmente, el concepto lignlna se suele asociar al de madera, ya que
es en el xilema de árboles y arbustos donde en encuentra más abundantemente,
en proporción del 20 al 30%. En una fibra típica de l:1aclera, la lámina media
posee la mayor concentración de llgnina (60-90%), de entre ~odas las capas
~¡,;e forman la ?ared celular, lo que representa el lG-30% del tetal de llgnlna
~n la fibra. La concent:,aclon de llgr,~na ~n :2S pared~!;: cl",ulares p,¡ma:'la
y secwndaris es relativamente baja, pero representa el 70-90% del t.ot.al de
lignina. Sin embargo, también existe lignina, en mayor o menor cantidad, en
otras partes de la planta, como raices,frutos, semillas,etc. Los tallos de
helechos, hierbas e incluso algunos musgos contlenen elevados porcentajes de
lignins, respecto a su biomasa total.
La función de la lignina es conferir solidez, rigidez y elasticidad a
los teJidos. Las sequoias gigantes de California dan una ldea de la perslstencia
de los tejidos lignificados, ya que alcanzan periodos de vlda de 4 a 5.000
años, alturas superiores a 90 metros y soportan varias toneladas de peso. Durante
todos esos años han debico resistir innumerables tormentas, fuegos y ataques
de iQsectos y microorganismos.
En las plantas, la lignina no sólo incrusta las microfibrillas de celulosa,
recubriéndolas, slno que
vegetales. Químicamente.
metabólico que limita la
está física y químicamente unida a los paliaae'áridos
la unión lignina-carbohidratos origina un bloqueo
acción de las celulasas microbianas, de forma que
miroorganismo~ celuloliticos muy activos. como Trichoderma v~ride. Mvro·thecium
verrucaria, en~re hongos, o Bacillus polymixa. ThermomonQs para fusca o los
habitantes del rumen, entre las bacterias, no pueden alterar la celulo~a de
la madera. FiSlcarnente. la Uo.gnl.na forma una barrera que impide la pene-tración
de las enzimas (Kird y Harkin, 1973). POr ello. la lignina. que es el polímero
natural más reSl.stente al ataque microbiano, confiere protección a los vegetales
frente a los microorganismos patógenos, limitando la eficiencia y grado de
utilización de los polisacáridos, tanto por aquellos como por los animales.
La utilización de la celulosa como sustrato para procesos de conversión
enzimática viene deter~inada por su cristaliniaad, la lignificación de las
paredes celulares y M.I accesibilidad a las enzimas extracelulares y metabolitos
secretados por los Qilcroor~anismos celuloliticos, puesto que el contacto f.ísico
directo es un prerequ1s1to para la hidrólisis. En este último caso, la hidrólisis
sólo puede producirse por difusión de las enzimas en la compleja matriz estructural
de los vegetale~, ya que las enzimas celuloliticas, como otras enzimas, son
moléculas pro~éicas solubles en agua. Tales enzimas degradan más fácilmente
las porciones amorfas de celulosa que las cristalinas y, consecuentemente,
a medida que progresa la hidrolisis, se observa un significativo incremento
en la cristalinidad óe la celulosa y, por tanto, una mayor resistencia a la
degradación del material residual. Esta mayor resistencia de la celulosa cristalina
(moléculas lineales de celulosa, enlazadas lateralmente por puentes de hidrógeno
y. asociadas en diversos grados de paralelismo), altamente orientada, se debe
no sólo a su inaccesibilidad a las moléculas de enzimas, sino también a la
configuraci6n y rigidez estérica de las unidades de glUcosa en las regiones
cristalinas (Cowling y Kirk, 1976).
La protección de la celulosa por la lignina obliga a que, cualquier proceso
que pretenda obtener celulosa de materiales lignocelulósicos, deba utilizar
un sistema que perm::.ta 1& aolubilizar.:ión o extracción de la lignina y rompa
las unione$ 11gn~n~-carbohidrato. La delignificación puede efectuarse quimica,
física o hiológicilment~o. Químicamente se realiza mediante hidrólisis ácida
o alcalina, $ul1·u.. ... ,> ';lódl.cc> alcalino, cloruro de zinc, dióxido de azufre en
caliente, etf" {Grant et al.. 1977; Millet et al., 1975_76; Gonzalez Santillana,
1978;Greenhalgn. 1978), algunos de cuyos procesos ya fueron revisados en el
marco de la anter10r Reunión, celebrada en esta Escuela. así como los tratamientos
físicos (DulPhf! 1978).
COll'lPara-t '""'te, la delignificación biológica ofrece apreciables ventajas
14~
respecto a los anteriores trata.1entos, como son el bajo costo, alta especificidad,
míniru. producción de residuos,. y fOI'lll8.ción de subproductos utilizables. Ya
Worgan (1978) presentó algunos aspectos de este interesante prOceso, sin embargo r
desde entonces se ha progresado enormemente, tanto
como en los puramente quimicoa y bioquimicoa,
volver a incidir nuevamente en el tema.
BIOQUIMICA DE LA DEGRADACION.
en los aspectos biotecno16gicos.
por lo que parece justificado.
De todos los diferentes grupos taxonómicos de microorganismos, los más eficien
tes en la degradación de residuos lignoce1ulósicos son los Basidiomicetos (Setliff
y Eudy, 1980; Eriksson ,1981; Sáiz-Jimenez. ,1983) , mientras que las bacterias
degradan nula o escasamente la madera o afectan sólo a algunos de sus componentes,
principalmente los polisacáridos (Cravford,1978), si bien Haider y colaboradores
(1978,1980) han demostrado la degradación, en cultivos axénicos, de fenoles
deri vados de la lignina y polimeros sintéticos semejantes a la 11gnina. Otros
grupos de hongos. como los Hifomicetos y Ascomicetos atacan la madera, degradando
la celulosa, pero alterando debi1mente la 1ignina, siendo la demetilación de
grupos metoxilos su acción más importante (Duresn ,1960; Kirk ,1971 ¡ Haider y
Trojanowski,1978)o.
Mientras que los mecanismos enzimáticos implicados en la degradación de
la celulosa han sido especialmente bien estudiados en los hongos (Reese, 1977¡
Eriksson ,1981), en los que se ha demostrado que el ataque hidroHtico se lleva
a cabo, principalmente, por tres diferentes tipos de enzimas. endo y exo-l, 4_
p-glucanasas y l,4-P-g1ucosidasa (figura 1), el conocimiento de la degradación
de la lignina está lejos óe ser completo,aunque en los últimos años se han
realiz.ado aceptables progresos.
La información sobre la degrada-=ión de la lignins, una de cuyas estructuras
típicas se muestra en la Figura 2, se roñen! mediante comparación químico-estructu
ral de 1igninas y sus prOductos de óegradación, antes y después de la incubación
con hongos, fundamentalmente Basidiomicetos (Haider et al.,1981; Chua et al .• 1982;
Chen et al. ,1983). as! como por el estudio del metabolismo de compuestos simples,
tipo ácido vanl11ico, ácido ferúlico,alcOhol verátrico,etc. (Lundquist y Kirk,1978¡
Buswell et al. ,1979,1982: Ander et al., 1980¡ Gupta et al., 1981) Y la identifica
ción de las enzimas implicadas en estos procesos (Westermark y Eriksson,1974¡
Yajima et al. ,1979; Buswell f!'- al., 1981). Estas últimas, .1un"to a la fenoloxidasa
(Kirk.1975; Ander y Eriksson,1976) participan indudablemente en la degradaCión
142
lignina
celulosa HzÜ® H202 m '8/ / Ui Ó °2 oligo- S '1 ~A / sacáridos ,/
~2 quinona ,/
\ í2\ ¿ fenol H20 \ ~ \ \B)eliO;~;éD ceIOb';:tonOlacton;aCidO celoOiónic,
]¿--._~j ~\ ~/-H20
glucosa ~9IUCOnolacto~ acido glucónico
~H2020H20~ Sporotrichum pulverulemum
Figura l. Mecan1Smos enzimáticos de la degradación de celulosa y su regul!
ción extracelular por Sporotrichum pulverulentum. según Eriksson.
(1981). Las enzimas implicadas son: l. endo-l,4-p-glucanasas; 2.
exo-l,4-p-glucanasa; 3. P-glucosidasas: 4. glucosaoxidasa¡ 5. C!
lobiosaoxidas8: 6. celooiosa:quinona-oxidoreductasa; 7. catalasa.
A (fenolox1dasa) y B (peroxidasa) representan enzimas que inter
vienen en la degradación de la 11gnina.
C
1: , C
He JI/) II¿-a-
CH,oH I
HC-OI
HCOH H('zO ICHJOHI ~ CU,QH
I! CH,o I (,H~H
-OCH o o/;CH ~H CH,D o 11 15 HroH I H ~OO ,
OH
rn,o I CH,D $14 HOH,('('(:;,.. O--(H . O" H ~O r HD("¡ OCH, /0,,
UroH I o HI; eH Q He I I I He --CH 2 HCOH CH,oH I I
H~OH -$ HoJ9\..CH~ HC'O/CH I O--CH JI) }=dHCoH I (-H,O OCH, OCH~/O
IIC---O S OCH)
o .$ HOH'¡¡ CHp HOC",H) 1) HC
He; OCH) HC.OH HC-O ~
r,¿., CH,DH H,cOH eH oY CH,ay I 1) o
O---("H HC I ,
~H ~O CHP~~~i
Figura 2. Principales estructuras d~ una lignine de conífera. Los enlaces
entre'las unidades 1 y 2, 2 Y 3, ~ Y 5, 6 Y 7, Y 7 Y 8 son los
más abundantes. Otros enlaces c~antitativamente importantes son
los existentes entre las unida6es 3 y 4, 5 Y 6, Y 8 Y 9. Según
Kirk y Fenn (1982).
144
de la lignina.pero,desgraciadamente. hoy día es imposible conocer cada una
de las enzimas que intervienen en el proceso y el papel que juegan en éste.
La 1.Illportancia de la fenoloxidas8 en la degradación de la lignina ha sido,
puesta de manlfiento recientemente por Ander y Eriksson (1976), si bien ya
anteriorment~ se ;onocia Ld relacl.Ón existente entre los hongos capaces de
degradar ll.gnl.na y la reaccl.ón de fenoloxidasa posi ti va -test de Bavertiarnm ,...
(Davidson et al., 193P; Sundmam y Nase, 1971).
En ~fecto. Ander y Eriksson (1976) obtuvieron un mutar.te de Sporotrichum
pulverulentum restado ~onidial.imperfecto. de Phanerocheete chrysosporiUlll)
sin fenolox:i.rlllsu, incapn~ l~ riegradar la 1ignina de la Ilu:.Jera, mientras que
el revert::l.ente de: ::.;;e,-, llutrun:e degradaba la lignina en la misma proporción
que la e~tlrpe orlg~nal.
La accl.Ón de .!.é t'enolo:iUdasl:l. t!S oxida1:l.va, formando quinonas (Ishihara,
1980; Hi¡uchi. 19H1 ¡, y lJuestc =!ue para ~llo se requiere la presencia de hidroxilos
fenólicos l:ibret;. ,~Q'" 'f'eno.í.~s ~tel:"i.f:i.cadoa nO pueden ser substra'tos de la enzima.
Ejemplo de "':.81 ,"!acci6r -as .!.a degradación de sl.rl.ngi1glico1-,B-guayacil éter
por P01reorus versl.co1or y ~ frustulatum (Kirk et al., 1968) Y la producción
de 2,6-dimetoxi-p-benzoquinona (Figura 3).
H~-O-Q
*HCOH 1::::
H3CO O OCH 3
OH
9
--_O ('¡¡ HjCO~OCH3
O
Figura3. Degradación de siringilglicol-j&-guayacil éter
por Polreorus versicolor y Stereum frustulatum.
Las estimaciones del número de hidroxilos fenólicos por diversos métodos
arrojan un valor de 20 grupos fenólicos por cada 100 unidades fenilpropano
(unidad básica. de 1n Hgl1l..na). por 10 que es evidente que las 80 unidades restantes
no r;luoden Udl:: ('3Ubtrtl'~i:o de la tenoloxidas8 y requieren otro tipo de enzimas
capaces de romper el ~fllace I)t:ereo. La existencia de eterasas fué demostrada
por .·Wcu:uml. ~t a.l.. (1969) y más recientemente por Weinstein et al. (1980).
mediante incubac1.6n de veratrilglicerol-~guayacil éter y obtenci6n del alcohol
14·5
verátrieo{Jigura 4) en cultivos de Phañerochaete chryaosporiu..
CH20H
I Hi-o-Q ;2:;' VOCH3
OCH:.
~:,"' OCH:.
Figura4. Degradaci6n de veratrilglicero1-)5-guayacil_
éter por Phanerochaete chrysosporium
Otras reacciones implicadas en la degradación de la lignina son las de
metilaci6n, ruptura oxidativa de puentes . t.<. -C, y C.s -Cr en cadenas laterales.
oxidación de grupos hidroxilos a carbonilos, ruptura oxidativa de nucleos aromáti
cos, etc. (Chen et al., 1982; Tai et al., 1982; Chen et al., 1983).
El ácido vimíllico es el producto de degradaci6n más abundante obtenido
en el ataque de madera de abeto por Phanerochaete chrysosporium (Chen et al ...
1982) Y prOducido por la ruptura de la cadena alifática entre los ~ y C..s' y
posterior oxidación del carbono ,en las distinas unidades representadas en
la ·figura 2 ••
El metabolismo del ácido vanillico ha sido estudiado por Andel' et al.
(1980) y Buswell et al., (1982), qUienes encontraron que éste era decarboxilado
oxidativamente a metoxihidroquinona, y 8imu1 táneamente reducido a va nillina
y alcohol vaníllico. El primer proceso tiene lugar en medios de cultivo con
ácido vanillico como fuente de carbono. Asimismo, se producen reacciones de
polimerización de fenoles. Sporotrichum pulverulentum parece introducir un
nuevo grupo' hidroxilo en el anillo 'bencénico, necesario para su ruptura, como
se muestra en la· Figura 5 . (Buswell y Eriksson, 19.79)
Las reacciones presentadas anteriormente son sólo una pequeña parte de
las muchas existentes a lo largo de la degradación de un polímero tan complejo
y con tantos enlaces de diferente naturaleza, como la lignina, hecho que puede
apreciarse en la ilgura 2.
en
La degradación de la ligni08 es el resultado de un metabolismo secundario
los Basidiomicetos (hongos de Ja podredumbre blanca), puesto que la actividad
COOH
~OCH3 OH
C021 OH
~OCHj OH
reductasa 1 CHO CH20H !cY reductasa II !cY-~OCH3 ~OCH3
fen 010J(.
'(j~
CO2
autooxidación
fo
~
OH ~o ¡o OH
(fO )
~ O
() + YOCH3
O
dime ros y oligómeros
1 celobiosa quinona
oxidoreductasa
[HO);] • ~OCH3
OH
productos de la ruptu ra
del anillo aromatico
Figura 5. Metabolismo del ácido vaníllico por Sporotrichum pulverulentum
(según· Ander et al., 1980),
14.7
ligninolítica no aparece en cultivos hasta que no se ha completado el crecimiento
primario (Kirk y Fenn.1982). Aharonow1tz y Dema!n (1980) consideran que la
diferenciación del metabolislftO primario del secundario está en función de la
nutrición. y en ese sentido la actividad 11gninolítica es una respuesta al
agotamiento de la fuente de nitrógeno (como la síntesis de peniCilina por especies
de Penicillium 8e debe a la limitación de carbono o la de alcaloides en Claviceps
a la de fosfato). Sin embargo, éste no es un fenómeno generalizado en los Basidio
micetos. ya Que se han encontrado especies en las que el nitrógeno no reprime
la actividad 1igninol!tica (Leatham y Kirk.19B3)~
Esta influencia del nitrógeno en la degradación de la lignina pudiera
estar relacionada con su bajo contenido en la madera, considerando que cuando
los Basidiomicetos invaden un substrato leñoso, el crecimiento primario es
probablemente una etapa transitoria, cuyo prinCipal objetivo es el establecimiento
de las hifas. En consecuencia, los componentes no est.ucturales de la madera
servirían como substrato para dicho crecimiento, el nitrógeno se agota:-ia rápida
mente y se iniciaría el metabolismo secundario, con la degradación de la ligoina,
que haria más aCCesible la celulosa y hemicelulosas, y el progresivo deterioro
de todos los componentes de la madera.
UTILIZACION DE SUBPRODUCTOS LIGNOCELULOSICOS POR BASIDIO~aCETOS.
El incremen~o de, la demanda de proteínas de elevada calidad para la alimenta
ción hlll",-na y an:'mal ha impulsado, en los úl timos años, el desarrollo de la
biotecnologíe y de los procesos de conversión enzimática de s~bproductos ag:-ícolas.
lh cierto nmero de microorganismos han sido utilizados come fuente de proteínas
y vitaminas, en~re los que destaca Candida utilis,cuya princ1pal oesventaja
es la exigencia de fuentes de carbono relativamente simples (hexosas, pentosas) ,
lo que la hace inadecuada para la transformación directa de materiales lignocelulóslcos.
Los mismo sucede en el proceso Pekilo, desarrollade en Finlandia. consistente
en la producción de micelios de Paecilomvces va:-iotii él pa:-tir de monosacáridos,
ya que el hongo no puede utilizar oligómeros solubles en agua o polisac:áridos
insolubles. Estos y otros subs~ratos han de se~ hidrolizados antes de le fermenta
ción (Forss, 1973; Ek Y Eriksson, 1975).
Muchos microorganismos requieren un pretratamiento de los substratos,
148
generalmente una hidrólisis ácida o alcalina, como Cellulomonas y Alcaligenes
(Han y Callihan, 1974). Trichodenna viride (flei tersen,1975), diversas especies
de Penicillium. Scopulariops;is. AspergilluB. Trichoderma, Cladosporium y Fusarium
(Updegraff y Grant, 1975) , Chaetomium cel!ulolyticum (Moo-YollOg et al .• 1977).
Geotrichum cand1dum y Tr~chosporum penicilatum (Pou y Gar~ido,1983). etc.,
por lo que suelen pr~sen'tar difieul tades por la manipulación que encarece el
subproducto, el largo tiempo de ~ncubación de muchos de ellos requieren, o
la baja producción de biomasa. DI'! entre todos los microorganismos citados,
Chaetomium cellulolyt~cum rindió la mayor cantidad de proteína cruda (2,? g/litro)
y la máxima pr?duct'ivi<1ad "'"fe; 1JIg/htro/hora), en el menor tiempo de cultivo
{36 horas}. ::..z, ?r"te5.na ·:;on'tieN' :-elativamen'te altas proporciones de todos
los aminoácidos eS{!\"lt' vil "'JO. , _~l'lperiores a las recomendadas por la FAO para nutrición
humana, sa}.vc r·"~t1.,",~. O~:"I "!xpe,":;'t:rlCl.as de nutrl.cl.ón con ::-atas, éstas no mostraron
ningún tipc. .";1(.; "laJ.:t();"',"1~cJ.6r" "'caccioneR pa'tológicas cuando el AO% de su die'ta
;:¡roteinica se :.\Us".:ituVQ por la proteína de Chaetomium cellulolvticum.
Debido a las lnu.1:.aciones fis).ológl.ca::. que presentan las bacterias y la
mayoría de los grupos ::'axonóml.cos de hongos, en los úl tl.mos tiempos se está
prestando consl.deraoÁe atención a los Basidiomicetos, y particularmente a los
hongos de la podredt.:more blanca, ya que poseen la ..capacidaa de degradar tanto
la celulosa como la lignina, lo que evita la necesidad de tratamL{mtos fisicos
y químicos, previos a la utilización de materiales lignocelulósicos.
Los Basidl.oml.ce'tos tl.ene la ven'taja de que los cuerpos fructiferos de
un gran número de especies se consumen en muchos países en can'tidades considerables
(champiñones, setas) y pueden crecer en cultivos liqUidaS. Sin embargo, en
la mayoría de los casos, el crecimiento es lento en fermentadores, por lo que
actualmente son pocas las espeCies que se emplean para la producción industrial
de al~rnentosj entre ellas destaca Polyporus squamosus, utilizado industrialmente
en Sulgaria, donde exis'ten fábricas con una prOducción de varios miles de toneladas
de micelio (Torev,1973).
En la literatura no abundan los casos de utilización de Basidiomicetos
para la producción de proteínas a partir de subproductos agrícolas o su transforma
ción con vl.sta a un posible empleo de nutrición animal. Kirk y Moore (1972)
investigaron la capaCi.dad de 9 hongos de la podredumbre blanca para degradar
lignina de álamo y abedul. encontrando que, comparativamente, la mayoría de
ellos degradaban más lignina que polisacáridos, originando, por tanto, un incremen
to de la diges'tibil1dad de la madera, que alcanz6 valores de más del 60% frente
a un 20% del control, sin incubación.
Jauhri et al. (1978) incubaron Pleurotus ostreatus y Coprinus aratus en
un medio simple, conteniendo bag~o. paja de trigo o estiércol de vace. como
substratos, obteniendo un máximo de 7 &flitro de peso seco de micelio, con
un 20% de proteína cruda, al cabo de 14 dias.
Desde 1974 se viene trabajando continuamente en diversos paises con Phanero
chaete chrysosporiUIII (Hofsten y HOfsten,1974; Eriksson y Larsson, 1975; Hofsten,
1976; Ek Y Eriksson,1977,1980; Daugulis y Bone, 1977,1978: Cardoso y Nica~i,198la,
b: Sáiz-Jimenez,1983), un basidiomiceto termotolerante, con una temperatura
óptima de crecimiento de 39 2C, pudiendo crecer desde los 122 a los SOIC. Se
caracteriza fundamentalmente por una muy activa degradación de la madera, habiendo
se aislado de pilas de troncos talados de Estados Unidos, Suecia. Polonia y
Rusia, donde suele producir graves pérdidas (Saiz-Jiménez,1983l.
El hongo era conocido en su estado imperfecto. conidial, desde 1927, como
Sporotrichum pruinosum. Posteriores aislamientos e identificaciones llevaron
a las descripciones de las especies Chrvsosporium pruinosum (en 1962), Chrysospo
rium lignorum (en 1966) y Sporotrichum pulverulentum (en 1972). Burdsall y
Eslyn (1974) demostraron que estas especies se correspondian con Phanerochaete
chrysosporium/ cuyo holotipo procede de. un ejemplar_ con -basidiocarpos:,' aislado
de un tronco muerto de Platanus \!lrightii (sicomoro de Arizona), en el desierto
de Sonora. Estos autores describieron sus carac'teristicas taxonómicas y morfológi-
cas en medios de cultivos.
La pOS1ble utilizaci6n del hongo en procesos ·de conversión .enzimática
y biotecnologia ya fué apuntada por Hofsten y. Rofsten (1974). quienes es·tudiaron
su crecimiento en diferentes substra'tos, tales como salvado de trigo y arroz
y harinas de cet.ada y centeno, todo los cuales fueron completamente degradados
entre 2 y 5 di as , sugiriendo que el hongo pOdria ser una nueva e interesante
fuente de proteínas.
Hofsten y Ryden (1975) cultivaron Soorotrichum pulverulen'tum en diversas
harinas de cereales, analizando la biomasa prodUCida, respecto al contenido
en aminoácidos,cuyos resultados se mues'tran en la Tabla 1.
como
Comparando la proteina del hongo con las de trigo, cebada y arroz se_observa
compite ventajosamente con todas ellas l~abla 2), con una composición
muy favorable al hongo, incluso en lisina, factor limitante en muchos cereales.
En un estudio posterior, Hofsten(1976) utilizó una amplia gama de substratos
en el cultivo del hongo (paja. salvado, mazorcas de maíz, bagazo, melazas,
harinas de cereales, etc) obteniendo un máximo de proteinas del 25 al 40%,
TABLA 1
Porcentaje de aminoácidos en muestras de ~. pulverulentum liofilizadas
g aminoácido/lOO gr. micelio crecido sobre
aminoácido salvado de trigo harina de cebada (cultivo en frasco)
harina de cebada (fermentador)
l18ina
histidina
arginina
ácido aspártico
treonina
serina
ácido glutámico
prolina
glicina
alanina
valina
metlo\U.na
cistina
iaoleucina
leucina
tirosina
fenilalanina
triptófano
aminoácido
isoleucina
leucina
Hnna
fenilalanina
tirosina
cistina
metionina
treonina
triptófano
vaHna
a.l LO
2.6
2.8
L5
l.5
5.4
l.5
l.5
l.9
l.7
0.5
1.1
l.3
l.3
l.1
l.2
l.6
0.7
2.0
2.5
l.4
L5
3.9
L4
l.4
2.0
l.6
0.6
l.0
Ll
a.O l.0
l.2
0.5
TABLA 2
Aminoácidos esenciales en diversas proteínas
2.1
0.8
a.1
3.2
l.6
l.6
8.4
l.3
l.7
2.0
l.7
0.7
0.8
l.3
2.3
l.0
2.1
0.5
mg aminoácido/g proteina.--------
S. pulverulentum
39
69
6a
65
31
as 19
49
15
50
trigo
38
64
27
46
32
21
16
a9
13
43
cebaoa
38
69
34
50
35
21
14
37
l'
50
arroz
39
80
37
52
33
11
2'
41
l'
57
',=r~
151---
dependiendo de las condiciones d~l cultivo. El contenido en ácidos nucleicos
vari6 entre un 2,5 y 3,5%. En bas.e a estas experiencias, el autor consider6
que 1 Kg de harina de cebada, suplementada con una fuente de nitr6geno inorgánica,
podría prOducir 500 g de micelio (peso seco) conteniendo de 150 a 200 g de.
proteína de alta calidad. Por el contrario, la misma cantidad de cebada utilizada
para alimentar cerdos rendiría sólo de 15 a 20 g de proteína de carne.
Ek Y Eriksson (1975) investigaron el crecimiento del hongo en diferentes
fuentes de carbono (glucosa, celobiosa, seda, algo~ón, fibras de celulosa,
etc.) estimando el contenido en proteína del micelio en más de un 40% en los
dos primeros casos, alrededor del 30% con celulosa y seda, y un 22% en algodón.
En el caso de las fibr~s residuales de celulosa, procedentes de una planta
de pulpa de celulosa, obtuvieron una producción de 350 mg de micelio/litro/hora,
a 392C y pH 4,5. La producción de proteina fué de 95 mg/11 tro/hora, y eran
utilizados simultáneantente 640 mg de fibra. El coste estimado por los autoreS
fué de 400$ por TIII de producto, con un contenido del 25-30% de proteína, en
una planta con capacidad de producción de 10.000 Tm/año, suponiendo nulo el
coste de la fibra. También fué sugerida la posibilidad de efectuar un proceso
simbiótico entre el hongo y Candida utilis o Paecilomvces v~iotii.
Ek Y Eriksson (1980) desarrollaron un proceso que perrni "tió la conversión
de fibras de celulosa, procedentes de una fábrica de cartón, y prese!ltes en
las aguas residuales, en biomasa de 'Ep:lrotridun p..tlve:tiLentum aCsras de la pu.-ifica
ción del agua. En fermentación con"':l.nua '" pH 4,2 Y 39!1C de temperatura, se
obtuvieron, a las 26 horas, una concentración de micelios de 4,9 g/!i tro, con
un 42% de proteína cruda (producto· seco al aire), una reducción de la OB07 del
73% y de la noo del 52%,' así como una reducción oel 88% de las p,!rticulas en
suspenSión. En el aspecto económico. para una planta de cartÓ"l de 150.00:0 Tm/ai'io.
y un 2% de materia seca en las aguas ~esiduales. de la cual el 80% es f~rmentable,
se obtuvieron una concentración de micelios de 3.700 Tm/año. El producto obtenido
se empleó en -la alimentación de cerdos y ovejas, y si bien, comparado con el
preCio de la harina de soja, origina un déficit de 460S/Tm, hay que tener en
cuenta el beneficio añadido tIe la purificación parcial del agua .residual,' ya
que para la producción de 1 Tm de micelios se consuml.an entre 1 y 1,5 Tm de
DBO?, y los .cl?stes de depuración de· ésta serian sensiblemente mayores.
Oaugulis y Bone (1978) cul ti varon Phanerochaete chrvsosporium sobre corteza
de arce, pl.no y cedro, obteniendo 1.500, 1.200 Y 800 mg de proteína/litro,
y una productividad de 2,63, 4,07 Y 3,32 x 10-2 b de proteina/litro/ho~a, respec~i-
vamente.
52
Recientemente, Cardoso 1 Hico11 (1981a, b) obtuvieron casi 12 g/litro
je micelio de Phanarochaete chrysosporium. en cultivos sobre vinazas. El micelio
:ontenía un 23% de proteínas.
Thomke et al. (1SBO) estudiaron el valor nutritivo de la proteína de Sporotri
::hurn oulverulentum en dietas sunll.nistradas a ratas, cerdos y ovejas. Los análisis
químicos de la proteína I!lQstraron que la suma de los aminoácidos corresponden
al 70% de prote;(n~ bruta, y un 20% corresponde a amonio, ácido (-aminobutírico
'1 glucosarnina. Lb diges'C:lbllidad ae los aminoácidos de Spotrichum pulverulentum
~n ratas fup inferio).'" a la oe harina de SOJB, y del mismo nivel que la harina
de cebada. En cerdo~ 5~ confirmó el bajo valor nutritivo del hongo, en comparación
'::00 la harina de sOJa. derivado de la pobre digestibilidad de la glucosamina
y del ácido t -aminobutírico. Las experiencias con ovejas mostraron resultados
m~s satisfactorios que con especies monogástricas, con una digestibilidad de
la proteína cruda del 82%.
UTILIZACION DE ALPECHIN POR PHANEROCHAETE CHRYSOSPORIUM.
Ya hemos expuesto am:eriormente cómo el estado imperfecto de Phanerochaete
chrysosporium ha sido utilizado en Suecia para la producción de biomasa y purifica
ción de aguas residuales de una fábrica de cartón. Igualmente, Eaton et al.
(1982) estudiaron la decolorac~ón de los efluentes de una fábrica de pulpa
de celulosa, encontrando una reducción de la DBO y DQO del 40%, y del 60% del
color. Consecuentemente. el hongo pOdrí.a utilizarse en nuestro país en el trata
miento y purificación de dgUas residuales. ya que es primordial lograr el máximo
aprovechamiento de los recursos hídricos. especialmente en Andalucía, donde
nos encontramos con niveles de precipitación media anuales muy: bajos, y unas
condiciones defici tarias de almacenamiento y regulación de las .-aguas.
El problema se agrava, además, por la cantidad de industrias agrarias
existentes, cuya característica general es el requerim~ento de elevados volúmenes
de agua para sus procesos de producción. El mayor consumo de agua lleva consigo,
también, el aumento de las sobrantes o residuales, por lo que los cauces públicas
van cargados de residuos de origen agrícola. industrial o fecal. Por ello,
es necesario buscar soluciones que permitan evitar los vertidos nocivos e incluso
aprovecharlos mediante reciclado.
En la cuenca del Guadalquivir, que concentra el 70% de la producción nacional
dE. aceite. con tU) !'1úm~r" de nlmazaras próximas a las 900, repartidas sobre
60.000 Km2 I Iill ... er't~oo de alpeChín a los cauces públicos plantea graves inconve-
153
nientes, derivados fundamentalmente' de su alta carga orgánica y del caudal vertido,
Que puede alcanzar volumenes de hasta 2 millones de m3 Las condiciones de extrema sequía, en los últimos años, di6 lugar a la promulgación de un decreto por el
de hasta
que se favorecía la construcción
el 100%. Ello ha originado que, en
de balsas o lagunas. con subvenciones
de forma importante.
durante la estación
del residuo seco.
las últimas campañas, se haya extendido
el almacenamiento en balsas de alpechín, para su evaporación
seca, lo que perml tiría además. la utilización como abono
Si bien se han efectuado estudios para el aprovechamiento y depuración
de aguas residuales de almazaras, mediante digestión anaeróbica (Fiestas et al. 1979) • el lagunamiento de alpechines ofrece nuevas posibilidades para su
tratamiento por hongos, a fin de producir biomasa. En este sentido, la inoculación
de Phanarochaete chrvsosporium podría originar un enriquecimiento en proteínas
del residuo seco resultante, y su posible utiliza=:ión como pienso e incluso
como materia o~gánica compostable. para adiciona~ a suelos agricolas.
En una pUblicación anterior (Saiz-Jil'llénez, 1983) se exponian las ventajas
que se veian en la utilización del hongo, cuales eran:
- Un adecuado pH del alpechin
tampón del ~edio, necesario para el crecimient:o del hongo y un elevado poder
para una
de la materia orgánica y la producci6n de
máxima
biomasa.
eficiencia en la transformación
- La casi ca~encia de espuma, debido al pOder antiespumante del alpechín, que
facilitaría la utilización en fermentadores o la agit:ación y ai~eación de las
lagunas.
- El alpechin no necesitarla suplemento de nitrógeno. ya que los requerimientos
del hongo sor. mínimos, para una adecuada degradación de la celulosa, polisacáridos
y polifenoles.
Posibilidad de formación de pellets cuando el hongo crece en cultivos en
agi tación, englobando· la materia orgánica y partículas en suspensión, con lo
que se pU.!"ificaria el agua, reduciendo los sólidos en suspensión, OBO,OQO y
permitiendo una posterior reutilización del agua, parcialmente purificada.
- Posible presencia de elementos nut~itivos en el medio, producidos;xr el basidio
miceto y activo frente a plantas, por lo que las aguas podrían utilizarse para
riegos.
54
Temperatura adecuada, por la insolación de la zona, para el crecimiento del
.ongo.
Rentabilidad del proceso, si se logra su optimización.
Los~posibles inconveniente que se consideraban, a priori, eran:
Elevado contenido en potasio y salinidad del alpechín.
. Condiciones anaeróbicas, que 1irn.i 'Carian el crecimiento del hongo. muy exigente
m oxígen'o. por lo que se t·equerl.ria una oxigenación del medio •
• Existenci.a de ~u:n::? ... m;.l..t.~ l.nhl.oldoras, que afectan al crec.ml.en'to de microorganis
'05. por' ~ qu~ pOÓ-!":lan imoedl.r el proceso normal de desarrollo.
En eXperiencJ.i:lb, llevadas a cabo
11 el ele .... ado contem.oo en potasl.o ni
en el laboratorio, se ha demostrado que
las sustancias inhibldcras (polifenoles)
3 Lponen un obstáculo para el crecimiento de Phanerochaete cnIYsosporium sobre
llpechín4 Así, en metilOS de cultivo alpechín-agar, incubados a 30 t C, el hongo
üca nzó un ra<J,io de >l5mm en 5 dias (figura 6, B), mientras que en 10$ controles
je extracto oe- l1a.lt¡,.,.~agar :'0 >llcan~e en 3 dias (Figura 6,Al. Est:os periodos
:te tiempo se redllCCT"" r.-uando se 'I.ncubl". a 39 S1 C. su temperatura óptima de crecimiento,
jonde alcanza lon 4Smm de radio Qn 4 y 2 días reRpec~ivamente,
Parece ser que el efecto del alpechín sobre el hongo es un retraso en
la germinación de las esporas (12 a 24 horas en medios normales frente a 36
a 48 horas en alpechín) y un crecimiento de hifas más lento, si bien aún con
todo sigue siendo más ~ápido que la mayoría de los hongos.
Al cabo de 7 dias, Phanerochaete chrysosporium comienza a decolorar el
medio de alpechín-agar (color inicial marrón oscuro a negrol, alcanzando el
halo los 45mru al caco de 13 dlas (figura 6 , C), adquiriendo el medio un color
amarillo claro. Ello ,ngnifica que los pigmentos presentes en el alpechín han
sido metablizados por· el hongo. de manera similar a como degrada la lignina,
es decir, como producto de un metabolismo secundario.
Al igual que ocurre con la madera, el inicio de este metabolismo pudiera
estar relacionado con el agotamiento de la fuente de ni trógeno I lo que induce
la act1vidatl fonolox1dll$a. Ello no debe sorprender si tenemos en cuenta que
la parte orgánica del aloechín se compone de carbohidratos. sustancias nitrogenadas
ácidos orgán1cos, p~c~ines, grasas, polifenoles, etc., siendo ésta última fracción
o o < a:
45
10
30
:;' 20 :;
10
2 3 4 5 6 7
OlAS
B 9 lO " 12 13 "
Figura 6. Crecimiento de Phanerocha~t~ ch~ysospo~ium, a 30t e, sobre __
extrac~o de malta-agar (A); alpechín-agar (6) y halo de deco
loración de este último (C).
15$
156
la responsable del color oscuro que adopta.
Los componentes de naturaleza fenólica del alpechín (tabla 3) estudiados
por Vazque: Roncero et al. (1974) tienen estructuras similares o idénticas
a las prelSontea en la l.:i.grll.na o sus productos de degradac::.ón (ácidos p-cumárico,
caféico, protocatéqUl.cO y van!llico). Por otra parte, Pickart .y Westlake (1970)
aislaron una fenoloxldasn en Polrporus versicolor (hongo de la podredumbre
blanca, cuyo metabolismo guarda estrecha similitud con el de Phanerochaete
chrysosporiUlll, según i.eutharn :¡ Kirk, 1983), inducida por la presencia de flavonoi
des y responssble de tlU degradación. Todo ello explica el pcr~qué el hongo es
capaz de degradar ostas estructuras. en las que intervienen las enzimas estudiadas
en la primera par~e de este trabajo.
Las enz~mas hidroliticas, liberadas durante la molienda de la aceituna,
entre 1 as que 3e encuentra ;lna fenoloxidasa, oXlda y polimeriza parte de los
reno les presentes el: ~l -'\lpechín ( fundamentalmente los ácidos caféico, protocaté
Quico. vaníllicc:,.. t:r.l'osc.l. e h~Ol·oxlt;irosol). de la misma manera Que se ha demostra
do Que ocut'i'c e['\ ((;:JO medios de ::ultl.vO de ciertos bongos (Saíz-Jiménez, 1975) ,
o en reacciones "in vitro" en el .LaOorat:orio (Sáiz-Jiménez et: a1.1979), originando
la form'ación de un polímero o pigmento marrón, de elevado peso molecular, que,
as{mismo.es ~~degradado por -Pbanerochaete chrysosporium.
En consecuencia, Pbanerochaete Chrysosporium posee los mecanismos enzimáticos
para la degradación de los polifenoles presentes en el alpechín, por lo que
es un hongo adeCuado. tant:o para la producción de biomasa, como para la purifica
ción de aguas residuales de las almazaras, de las que elimina los polifenoles
y, consiguientemente, rebaja la OBO y 000.
Actualmente se trabaja en la reproducción del proceso de degradación en
medios líquidos, su optimización, a fin de obtener biomasa yagua parcialmente
purificada, y comprobar si el método podria ser rentable a gran escala,
TABLA 3
POLIFENOLES IDENTIFICADOS EN EL ALPECHIN
FLAVONOIDES O I OH HO~
OH ° 2 "1 Apigenina
Luteolina
Quercetina
~ FENOLES
R 2 3
Acido p-cumárico
Acido protocatéquico
Acido caféico
Acido vaníllico
Tirosol
Hidroxitirosol
GLUCOSIDOS FENOLICOS
Oleuropeina
l-cafeil glucosa
4-monoglucósido del hidroxitirosol
4_ diglucósidodel h:i.dro:<itirosol
Luteolin-7-g1ucósido
RI , R2"" H
R1= OH,R2= H
':t. R2= OH
RI= CH=CH-COOH, R2= H, R3= OH
R1= COOH, R2 , R3= OH
R1= CH=CH-COOH, R2 , R3= OH
RI = COOH, R2= OCH3, R3= OH
R1= CH2-CH20H, R2= OH, R2= H
F.I = Cr.2-CH20H. R2' R3= OH
CH C '1;.0H CH
300C-d- .OO-CH -CH l. -, ¡ CH-eH 2 2\ ~_.' OH
I'-Q-C 3 -' (J _H O e 11 5
157
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