DEAMEMORIA

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ORGÁNICA FACULTAD DE CIENCIAS UNIVERSIDAD DE CÁDIZ

MEMORIA DEL PERIODO DE INVESTIGACIÓN

ESTUDIO FITOQUÍMICO DE THAPSIA VILLOSA VAR VILLOSA

que presenta el Ldo. D. JUAN JOSÉ RUBAL LOBO para optar al Diploma de Estudios Avanzados

PUERTO REAL, SEPTIEMBRE 2003

INDICE 1-Introducción

1.1-Los productos naturales o metabolitos secundarios............................3

1.2-La familia de las umbelíferas...............................................................5

1.2.1-Descripción............................................................................5

1.2.2-Importancia de las umbelíferas..............................................6

1.3-El género Thapsia................................................................................6

1.3.1-Descripción............................................................................6

1.3.2-Taxonomía del género Thapsia.............................................7

1.4-Thapsia villosa var villosa.................................................................... 7

1.5-Objetivos...............................................................................................8

2-Antecedentes

2.1-Taxonomía de Thapsia villosa............................................................13

2.2-Usos populares y medicinales de Thapsia villosa..............................14

2.3-Compuestos previamente aislados....................................................15

2.4-El metiltioacrilato, el metiltiopropionato y el acrilato...........................22

3-Materiales y métodos

3.1-Material Biológico...............................................................................27

3.2-Extracción y aislamiento.....................................................................27

3.3-Técnicas Instrumentales.....................................................................28

4-Resultados

4.1- Aislamiento........................................................................................33

4.2-Descripción de los compuestos aislados............................................34

5-Conclusiones.....................................................................................................51

6-Bibliografía........................................................................................................55

7-Anexo de espectros..........................................................................................59

1.Introducción

Juan J. Rubal Estudio fitoquímico de Thapsia villosa

3

1.1 LOS PRODUCTOS NATURALES O METABOLITOS SECUNDARIOS

Los compuestos orgánicos aislados de organismos vivos pueden dividirse

en dos grupos, los metabolitos primarios, también llamados principios esenciales

- hidratos de carbono, lípidos, proteínas y nucleótidos -, comunes a todos los

seres vivos y cuya función es conocida; y los metabolitos secundarios, también

llamados productos naturales.

Los productos naturales tienen una distribución restringida en la

naturaleza, un determinado producto natural puede encontrarse en un grupo de

individuos normalmente relacionados; muchas de las veces estos individuos

pertenecen a un mismo género. Frecuentemente se encuentran casos en que

una sustancia orgánica se aísla exclusivamente de una única especie.

Si hay que destacar la producción de productos naturales en algún

organismo, sin duda hay que hacerlo en el reino vegetal. Debido a la escasísima

o nula movilidad de las plantas, han sido éstas las que más productos naturales

y con más diversas funciones han desarrollado, las plantas son capaces de

estimular o inhibir el crecimiento de otras plantas, de atraer insectos para la

polinización, de producir insecticidas, de producir sustancias con actividad “anti-

feedant”, etc. Aunque no siempre se conocen las funciones de los productos

naturales, éstos juegan un papel muy importante en la sociedad humana puesto

que poseen un amplio rango de actividades.

La historia de la humanidad ha estado ligada desde sus inicios al uso de

las plantas; se han encontrado que actúan como insecticidas, herbicidas,

repelentes, venenos, etc. No cabe duda que la aplicación más extendida, y la

que despierta mayor interés por su enorme importancia, es la medicinal. Se tiene

constancia del uso de extractos vegetales para curar enfermedades desde la

antigüedad. Un ejemplo es el árbol de las fiebres o quino – Cinchona officinalis –

usado por civilizaciones precolombinas para el tratamiento de la malaria; el

responsable de la actividad es un compuesto llamado quinina que no fue aislado

hasta el siglo XIX . Otro ejemplo es el uso extensivo de la corteza del sauce

blanco –Salix alba– a partir del siglo XVIII para bajar la fiebre, durante 100 años

se usó sin conocer al compuesto responsable; la salicilina. La salicilina fue

modificada por la empresa Bayer para mejorar su actividad. Primero se hidrolizó

el glucósido y se oxidó a ácido la posición bencílica dando lugar al ácido

Introducción

4

salicílico, tras estudiar la relación estructura actividad y en vista del sabor

amargo del ácido salicílico y salicilato inicialmente empleados se acetiló el

hidroxilo dando lugar al ácido acetilsalicílico más conocido hoy en día como

aspirina.

Figura 1.1

Hasta el siglo XIX no se comenzaron aislar los principios activos, éstos

se describían mediante la fórmula molecular y algunas propiedades químicas

básicas como la acidez.

En el siglo XX, para restar importancia a la dependencia de la fuente

natural se creo la necesidad de sintetizar los productos naturales, para ello es

necesario determinar sus estructuras. Primero se caracterizaron mediante

degradación, utilizando reacciones como la ozonólisis que permitía detectar la

presencia de dobles enlaces. En la segunda mitad del siglo XX se produce un

gran cambio en la química de productos naturales; aparecen las cromatografías

como técnicas de separación, se extiende el estudio de productos naturales a los

organismos marinos y se introducen en el laboratorio las técnicas espectros-

cópicas: IR, UV, RMN y EM.

Hoy en día los productos naturales siguen conservando una gran

importancia. A pesar del desarrollo de la medicina moderna, según la OMS la

O

NHO

H OHO

OH

OH OOH

H

OH

OHO

HO

OHO

O

O

Quinina

Salicilina

Ácido salicílico Ácido acetilsalicílico


5

medicina tradicional aún cubre las necesidades sanitarias de un 80% de la

población mundial.

En la actualidad el estudio de productos naturales va encaminado al

“screening” o rastreo programado: estudio de la actividad potencial de extractos

de fuentes naturales, aislamiento de sustancias que se consideren responsables

de dicha actividad y ensayos programados de otras actividades y toxicidad.

Todo ello de forma paralela a la síntesis de las mismas sustancias y de análogos

estructurales que permitan estudios de relación estructura-actividad (QSAR,

“Quantitative Structure-Activity Relationship”)

1.2 LA FAMILIA DE LAS UMBELÍFERAS

La familia de las umbelíferas, también conocida como la familia del perejil

o de la zanahoria, comprende unas 3000 especies repartidas en 300 géneros.

Es posible encontrarlas en cualquier lugar del planeta pero la mayoría se

encuentran en zonas templadas del hemisferio Norte, sobre todo en zonas de

clima mediterráneo

1.2.1 DESCRIPCION

Algunas especies son arbustos o pequeños árboles que viven en

Sudamérica y el Pacífico Sur, pero la mayoría de umbelíferas son plantas

herbáceas anuales, bianuales o perennes. El tallo es articulado en nudos o

entrenudos portando hojas alternas y

en su mayoría divididas. La

característica más sobresaliente de la

familia es la inflorescencia en forma

de umbela, simple o compuesta. Una

umbela es un grupo de flores que

nacen de un mismo punto del tallo y

se elevan a una altura similar. La

palabra umbela proviene del latín Figura 1.2

Umbelas de Ferula Communis

Introducción

6

“umbellula” (diminutivo de “umbra”, sombra) que significa sombrilla. Las umbelas

pueden presentar una forma semiesférica como Ferula communis o plana como

la zanahoria (Daucus carota).

Las flores son bastante uniformes dentro de la familia, generalmente son

blancas o amarillas y pequeñas. Los frutos poseen una morfología característica

para cada género y especie por lo que se utilizan como carácter clave.

1.2.2 IMPORTANCIA DE LAS UMBELIFERAS

El hecho de poseer inflorescencias tan atractivas en forma de umbela

hizo que esta familia fuera la primera en ser reconocida como grupo de plantas.

Esta distinción ocurrió a finales del siglo XVII, en 1672 Robert Morrison publicó y

dirigió el primer estudio sistemático sobre este grupo de plantas.

El impacto de las umbelíferas no se restringe a su interés botánico. Los

griegos y romanos ya conocían estas plantas y su potencialidad; se cita que

Sócrates murió envenado por cicuta (Conium Maculatum), los romanos

empleaban Ferula assafoetida y el anís (Pimpinela anissum) como aromati-

zantes y remedio medicinal. En la actualidad las umbelíferas siguen siendo

importantes, los géneros Eryngium, Astrantia, Myrrhis, Aciphylla, Bupleurum y

Heracleum se usan como plantas ornamentales, anís y comino como especias,

perejil, apio y zanahoria se cultivan como hortalizas, etc.

1.3 EL GENERO THAPSIA

Perteneciente a la familia de las umbelíferas, es un pequeño género

nativo de la zona mediterránea. Su nombre fue dado por Plinio en recuerdo de la

isla de Thapsos donde abundaba Thapsia garganica, la especie más conocida

del género.

1.3.1 DESCRIPCION

Son plantas herbáceas perennes, su raíz es axonomorfa, y en algunos

casos napiforme. Los tallos son gráciles o robustos, glabros y con abundantes

restos fibrosos foliares en las bases. Las hojas inferiores son 1 a 4 pinnasectas,


7

las superiores a menudo quedan reducidas a la vaina. Las umbelas son

compuestas, generalmente sin brácteas, las centrales mayores que las laterales

que en la mayor parte de los casos resultan ser estériles. El fruto es de contorno

elíptico con cuatro alas amplias.

1.3.2 TAXONOMIA DEL GENERO THAPSIA

El número de especies que componen este género depende mucho de la

fuente consultada, tres especies según Flora Europaea(2) (Thapsia garganica,

Thapsia maxima y Thapsia villosa), diecinueve nombres reconocidos por el IPNI

(Internacional Plant Names Index) y seis según Flora Ibérica(1) que es la

publicación más reciente. Las seis especies que componen el género según

Flora Ibérica son: Thapsia garganica, Thapsia villosa, Thapsia nitida, Thapsia

gymnesica, Thapsia minor y Thapsia transtagana. Esta diferencia en la

clasificación se basa en:

• Thapsia garganica y Thapsia transtagana se consideraban la misma

especie. Estudios quimiotaxonómicos(3) establecen que son dos especies

muy similares en cuanto a morfología, pero con diferente distribución

geográfica y composición química.

• Thapsia gymnesica(1) es la especie más recientemente descrita del

género (1991), es endémica de las Islas Baleares y Flora Europea la

consideraba intermedia entre Thapsia villosa y Thapsia garganica.

• Thapsia minor se consideraba una variedad de Thapsia villosa.

• Thapsia nitida es un basiónimo de Thapsia maxima, actualmente se

establece que existen 2 variedades(4).

Las plantas del género Thapsia son mayormente diploides, poseen todas

2n=22 cromosomas. La excepción es Thapsia villosa cuyo numero de

cromosomas es 2n=22, 33, 44, 66. e incluso 2n=11(5,6)

1.4 THAPSIA VILLOSA VAR VILLOSA

Conocida popularmente como zumillo o cañeja, es una hierba perenne de

70-190 cm de altura. Su tallo es robusto, 5-25 mm de diámetro. Las hojas

Introducción

8

basales presentan una vaina de 20-80 mm de anchura, muy desarrollada con un

peciolo hirto o velloso que rara vez es glabro. Las hojas son 1 a 3 pinnasectas

con los segmentos oblongos, divisiones de último orden de 8-32 mm de anchura,

tanto el haz como el envés son vellosos. Las umbelas tienen entre 9 y 29 radios

de 6 a 12 cm, subsemiesféricas a globosas sin bracteolas con 18-43 flores. Los

pétalos son ovobados, de un amarillo intenso, los frutos son elípticos de 9-15 x

6-11 cm, de color pardo a castaño, alas de 2-4 mm de anchura de amarillentas a

pardas. Posee 2n = 66 cromosomas. Se localiza en España, Portugal, Sur de

Francia y Noroeste de Marruecos.

Fig 1.3 T. villosa Fig 1.4 Hoja basal Fig 1.5 Frutos

1.5 OBJETIVOS

La especie Thapsia villosa var villosa ha sido usada por sus propiedades

medicinales como por otros usos, esto hace que la especie posea interés

etnológico.

Aunque esta especie fue estudiada en la década de los ochenta, nos

proponemos un estudio más detallado motivado por:

El gran interés que han despertado las especies de este género con el

aislamiento de sustancias con un actividad muy contrastada, caso de la

tapsigargina.

El gran debate que existe en la clasificación de las distintas especies de

este género, que exige una cooperación estrecha entre el trabajo de


9

aislamiento de sustancias y los estudios de morfología botánica y

caracterización genética del material.

La disponibilidad de equipos y técnicas de resonancia magnética nuclear

que nos permitan llegar a metabolitos que en su momento no pudieron

ser detectados.

Los objetivos son:

• Hacer un estudio de los metabolitos secundarios presentes en Thapsia

villosa var villosa.

• De entre los compuestos aislados seleccionar aquellos que puedan tener

algún tipo de actividad biológica para la realización de ensayos

biológicos.

2.Antecedentes


13

2.1 TAXONOMÍA DE THAPSIA VILLOSA

Thapsia villosa es la especie morfológicamente más compleja del género

Thapsia. En este género se distinguen distintas subespecies y variedades, las

cuales a su vez presentan formas intermedias que dificultan su identificación.

En la bibliografía botánica existe mucha confusión en la determinación

taxonómica de Thapsia villosa y especies relacionadas. Atendiendo a la

composición química de distintas muestras identificadas inicialmente como

Thapsia villosa según Flora Europea, un grupo de investigación danés(7)

establece que existen cinco tipos repartidos en dos grupos I y II. En la tabla 2.1

se resume la aportación a la quimiotaxonomía.

Tabla 2.1 Los cinco quimiotipos de Thapsia villosa

La diferencia entre ambos grupos viene dada por la presencia de

tapsigarginas y fenilpropanoides en el grupo II y tapsanos en el grupo I. También

se diferencian en los constituyentes volátiles de los frutos, los frutos del grupo I

contienen acetato de geranilo, los del grupo ll limoneno y metileugenol.

Grupo I Grupo II

Tipo: 1 2 3 4 5

Número de cromosomas: 22 22 44 44 66

Constituyentes de la raíz:

Tapsigarginas + +

Eslovanolidas +

Fenilpropanoides + +

Germacranos + + + + +

Tapsanos + + +

otros Guaianos +

Constituyentes volátiles de los frutos:

Limoneno + +

Metileugenol + +

Acetato de geranilo + + +

Antecedentes

14

El tipo I se correspondería en otras clasificaciones a Thapsia villosa var

minor(8) o Thapsia minor (1); el tipo 2 con Thapsia laciniata(8) y el tipo 5 con

Thapsia villosa var villosa(1).

El profesor Pujadas, en Flora Ibérica(1), hace la clasificación botánica

más actualizada de este género. En este caso Thapsia villosa comprende tres

variedades: Thapsia villosa var villosa, Thapsia villosa var dissecta y Thapsia

villosa var platyphyllos. El IPNI (Internacional Planta Name Index,

http://www.ipni.org) reconoce igualmente 3 variedades: Thapsia villosa, Thapsia

villosa var laciniata y Thapsia villosa var platyphyllos, aunque en este caso se

limita a la recolección de la bibliografía reconocida por esta organización.

Llama la atención que Flora Ibérica no haga referencia alguna a Thapsia

laciniata o Thapsia villosa var laciniata. Según Arán & Mateo(9) los especimenes

de T. villosa tipo 2 no se corresponden con Thapsia villosa var laciniata, sino que

esos especimenes serían en realidad Thapsia villosa var dissecta.

2.2 USOS MEDICINALES Y POPULARES DE THAPSIA VILLOSA. ACTIVIDAD BIOLÓGICA

Al igual que el resto de especies del género Thapsia, la resina de su raíz

se usa en forma de emplasto para combatir afecciones pulmonares, catarros y

dolores reumáticos, así mismo también se usa como purgante violento y

vomitivo(1). En la comarca ilerdense de La Segarra se utiliza la resina de la raíz

para combatir la sarna(1).

El uso medicinal, aunque quizás sea el más importante, no es el único y

se publicado que es una de las especies más usadas para la pesca en Castilla-

La Mancha y en la Comunidad de Valencia(10), también se ha descrito el uso de

los frutos de Thapsia villosa como sustituto del comino(11).

Hasta ahora los únicos compuestos con los que se relaciona actividad

biológica aislados en Thapsia villosa son las tapsigarginas que han demostrado

ser un importante liberador no citotóxico de histamina e inhibidores selectivos

de la ATPasa-Ca2+, por lo que impiden llevar a cabo la regulación de la

concentración de Ca2+ en la célula provocando la muerte de ésta(12).

Actualmente existen investigaciones dirigidas a buscar la selectividad frente a

células malignas para provocar la apoptosis selectiva de éstas(13). Análogos de


15

las tapsigarginas, donde se sustituyen los ésteres naturales del compuesto por

aminas aromáticas, provocan una apotosis selectiva en las células cancerosas

de próstata(13).

Las eslovanolidas han sido ensayadas mediante test de irritación y de

liberación de histaminas, en ambos casos el resultado fue negativo(14).

2.3 COMPUESTOS PREVIAMENTE AISLADOS

Los tipos de compuestos encontrados con anterioridad en Thapsia villosa

son fenilpropanoides y sesquiterpenos. De estos últimos es fecuente encontrar

ejemplos de esqueletos germacrano, tapsano y guayanos, siendo las sustancias

más atractivas a priori dos tipos de guiainolidas: eslovanolidas y tapsigarginas.

2.3.1 FENILPROPANOIDES Los fenilpropanoides se aíslan de las raíces de los dos quimiotipos de T.

villosa del grupo II. Todos ellos presentan oxidadas las posiciones 3, 4 y 5 del

anillo aromático, y funciones éster en las posiciones 1 y 2 de la cadena.

Tabla 2.2 Fenilpropanoides de T. villosa

2.3.2 GERMACRANOS Este tipo de compuestos se encuentra en quimiotipos de los dos grupos

de T. villosa. Se aíslan en las raíces y en las umbelas de T. villosa var minor, que

se corresponde con el quimiotipo 1, y en las raíces de T. villosa var villosa,

que se corresponde con el quimiotipo 5. Todos estos compuestos presentan

oxidadas (hidroxilo o éster) las posiciones 6 y 8 del esqueleto y dobles enlaces

o/y epóxidos en las posiciones 1-10 y 4-5; ocasionalmente presentan oxidada la

posición C-12 del isopropilo

(1) R1 = Ang R2 = H R3 = Ang

(2) R1 = Ang R2 = Ang R3 = H

(3) R1 = Ang R2 = H R3 = Ac

OO

OOR1

O

O

OR2OR3

(4) R1 = Ac R2 = Ang R3 = H

Antecedentes

16

(5) R = Ang

(6) R = p-Coum

(7) R = Fer

OR

OH (8) R = Sen

(9) R1 = Ang R2 = H OR1

OR2O

(10) R1 = Ang R2 = Ac

OH

OHO

OAng

(11)

(12) R1 = H R2 = Ang R3 = H OR2

OR1

OR3

(13) R1 = H R2 = Ang R3 = Ang

OAng

OAcO

O

(12)

Tabla 2.2 Germacranos de T. villosa

2.3.3 GUAIANOS SIN FUNCIÓN LACTONA

Este tipo de compuestos se aísla de las raíces de T. villosa quimiotipo 2,

que por algunos autores(7) se hace coincidir con T. laciniata.

La característica más notable de este grupo de compuestos es la posición

C-11, correspondiente a la unidad isopropilo, oxidada. Otro hecho a destacar es

la presencia en dos de los casos de ésteres aromáticos, una característica que

no aparece en las guaianolidas y que sólo tiene como ejemplo uno de los germa-

cranos vistos en el apartado anterior y tres de los tapsanos que veremos poste-

riormente. Los ésteres aromáticos se aíslan sólo de especimenes del grupo l.


17

OH

(15)

(16) R = Sen

(17) R = p-Coum

OH

OH

R

(18) R = Fer

Tabla 2.3 Guaianos de T. villosa

2.3.4 TAPSIGARGINAS

Las tapsigarginas son un tipo de guaianolida característica del género

Thapsia, que presentan un sistema polioxidado. Se encuentran en las raíces de

los quimiotipos del grupo II. Son más abundantes en el quimiotipo 4 que en el 5;

en éste último, Thapsia villosa var villosa, se aíslan preferentemente

eslovanolidas, como veremos más abajo.

O

O

OH

OAcR1O

OH

OR2AngO

(19) R1 = Ang R2 = Sen

(20) R1 = Ang R2 = 2-Me-But

(21) R1 = Oct R2 = 2-Me-But

(22) R1 = 6-Me-Oct R2 = Sen

(23) R1 = 6-Me-Oct R2 = 2-Me-But

(24) R1 = 5-Me-Hex R2 = 2-Me-But

(25) R1 = Sen R2 = Sen

(26) R1 = Ang R2 = But

(27) R1 = iVal R2 = But

(28) R1 = iVal R2 = 2-Me-But

Antecedentes

18

(29) R = Sen

O

O

OH

OAc

OH

ORAngO

H

(30) R = 2-Me-But

Tabla 2.4 Tapsigarginas de T. villosa

2.3.5 ESLOVANOLIDAS Estas guaianolidas pro-azuleno, menos oxidadas que las anteriores, se

aíslan de las raíces de T. villosa del quimiotipo 5. La característica fundamental

de este grupo de compuestos es que su calentamiento provoca una fácil

transformación en unidades azuleno que confieren a las disoluciones colores

azules intensos.

(31) R1 = Ac R2 = 2-Me-But

(32) R1 = Ac R2 = Sen

(33) R1 = H R2 = 2-Me-But

O

O

O

O

R1O O O

OR2

(34) R1 = H R2 = Sen

Tabla 2.5 Eslovanolidas de T. Villosa

2.3.6 TAPSANOS

Este esqueleto de sesquiterpeno fue aislado por primera vez desde la

Thapsia villosa. Los tapsanos se encuentran en raíces de T. villosa de los

quimiotipos del grupo I

El esqueleto tapsano es un sistema bicíclico 6-5 y los seis carbonos

restantes se encuentran como unidades de un carbono en distintas posiciones


19

del sistema. Respecto a otros sesquiterpenos, podemos decir que carece de

unidad isopropilo y que posee una unidad gem-dimetilo sobre uno de los

carbonos del anillo de seis. También merece ser destacada la frecuente

presencia de un anillo furano conteniendo una unidad hemiacetal y la detección

de un dímero diacetal.

CHO

OAc

(35)

OR

(36) R = Fer

(37) R = H

OH

OSen

(38)

OH

OSen

O

(39) R = Ac

(40) R = H

O

OH (41)

O

OH

OR

(42) R = Ang

(43) R = Sen

(44) R = p-Coum

(45) R = Fer

O

OH

OR

(46) R = Sen (47) R = Ang

(48) R = Tig O

OH

AngO

(49)

O

O

O OAng

SenO

(50)

Tabla 2.5 Tapsanos de T. villosa

Antecedentes

20

En la siguiente tabla se detalla la procedencia de cada compuesto y su

referencia bibliográfica.

Número Fuente Parte Referencia (1) T. villosa var villosa Raíces 15 (2) T. villosa var villosa Raíces 16 (3) T. villosa var villosa Raíces 16 (4) T .villosa var villosa Raíces 16

(5) T. villosa avr villosa

T. minor Raíces 17

(6) T .minor Raíces 17 (7) T. minor Raíces 17 (8) T. minor Raíces 17

(9) T. villosa var villosa

T. minor Raíces 17


T. minor Raíces 17

(11) T. minor Umbelas 17 (12) T. minor Raíces 18 (13) T. minor Raíces 18


T. minor Raíces 17

(15) T. laciniata Raíces 19 (16) T. laciniata Raíces 20 (17) T. laciniata Raíces 20 (18) T. laciniata Raíces 20


T. villosa tipo 4 Raíces 21


T. villosa tipo 4 Raíces 21


T. villosa tipo 4 Raíces 21, 16

(22) T. villosa var villlosa T. villosa tipo 4

Raíces 21

(23) T. villosa var villosa T. villosa tipo 4

Raíces 21


Raíces 21


21

Tabla 2.6 Compuestos, procedencia y referencias.

Número Fuente Parte Referencia


Raíces 21

(26) T. garganica Raíces 21

(27) T. garganica Raíces 21

(28) T. villosa var villosa Raíces 21, 16

(29) T. villosa var villosa Raíces 21






(35) T. minor Raíces 24

(36) T. laciniata Raíces 25











(47) T. villosa tipo 3 Raíces 26

(48) T. villosa tipo 3 Raíces 26



Antecedentes

22

2.4 El METILTIOACRILATO, EL METILTIOPROPIONATO Y EL ACRILATO

No existen precedentes de que los ésteres metiltiopropionato y acrilato

hayan sido aislados formando parte de productos naturales.

El metilitoacrilato, aunque es bastante infrecuente si ha sido aislado

formando parte de productos naturales. Ha sido aislado en los musgos

Balatiopsis rosea(27) e Isotachis japonica(28), como éster aromático; del tunicado

Aplidium uouo(29) en los sesquiterpenos Uomanina A y B: y también en plantas

del género Petasites (Compositae) en las especies Petasites formosanus(30),

Petasites formosanus var kitamura(31) y en Petasites japonicus(32). Los

compuestos de Petasites que contiene el metiltioacrilato son sesquiterpenos del

tipo eremofilano; se han aislado varios derivados de este tipo y los dos más

representativos de esta familia conteniendo el metiltioacrilato son:

Estos compuestos han sido estudiados y se han determinado que poseen

actividad biológica. La iso-S-Petasina, al igual que las tapsigarginas, bloquea el

canal del Ca2+ (34). La S-Petasina es capaz de inhibir la secreción de testosterona

en ratas(35).

2.4.1 ORIGEN BIOGENÉTICO DEL METILTIOPROPIONATO Y DEL ACRILATO.

El resto 3-metiltiopropanoico (MTP) proviene del metabolismo de la

metionina(36):

MtaO

O

MtaO

O

iso-S-Petasina S-Petasina

ác. 4-metilsulfanil-2-oxobutanoico

ác. 3-metiltiopropiónico

metionina

aminotransferasaS

NH2O

OHS

OO

OH

S

O

OH

CO2


23

El MTP se considera precursor del DMSP (Dimetilsulfopropionato) que es

su análogo metilado en el S. El DMSP es una molécula que presenta múltiples

funciones en las plantas, es un osmolito, un crioprotector y un donador de

metilo(38). Además el DMSP por ruptura enzimática genera en algas marinas

DMS (dimetilsulfuro) y ácido acrílico(37):

El acrilato presenta propiedades antimicrobianas y es tóxico para el

propio organismo que lo genera, por ello éste se almacena como DMSP y se

libera en caso necesario como mecanismo de defensa. Este mismo sistema

actúa como antioxidante puesto que el acrilato es capaz de capturar radicales

hidroxilo y otras formas reactivas de oxígeno.

El sistema DMSP/DMS contribuye al ciclo natural del azufre. El DMS

generado se incorpora a la atmósfera, mecanismos de oxidación atmosférica

transforman DMS a sulfatos. Recientemente se ha considerado el ciclo del

azufre como el responsable, al menos en el mismo nivel que los cambios en la

concentración de CO2, en el efecto invernadero y su influencia el clima global y

los ciclos hidrológicos(38).

S O

O

+HO

O

DMSP

DMSPliasa Me2S

3.Materiales y métodos


27

3.1 MATERIAL BIOLÓGICO:

Se recolectaron raíces de Thapsia villosa var villosa en mayo del 2002 en

la Sierra de San Cristóbal (El Puerto de Santa María). Las plantas se

encontraban en floración. Un espécimen se encuentra depositado en el

Departamento de Ciencias y Recursos Agrícolas y Forestales, Escuela Técnica

Superior de Ingenieros Agrónomos y Montes, Universidad de Córdoba, número

de pliego COA 31092 (Profesor A. Pujadas).

3.2 EXTRACCIÓN Y AISLAMIENTO

Extracción: Se extrajeron 100 g de raíces con diclorometano en un Soxhlet durante 6

horas. Se evaporó el disolvente en un rotavapor para dar un residuo aceitoso

(13,5 g). El extracto se fraccionó mediante cromatografía en columna en gel de

sílice usando como eluyente mezcla de hexanos y acetato de etilo en gradiente

con polaridad creciente dando lugar, después de análisis por CCF, a siete

fracciones.

Cromatografía en Capa Fina (CCF):

Se usaron cromatofolios de gel de sílice sobre base de aluminio, Kiesegel

60 HF254 Merk con espesor de 0,20 mm y con indicador fluorescente.

Las cromatografías se siguieron mediante visualización bajo luz UV (365

y 254 nm), y posterior tratamiento con reveladores. El revelador más usado fue

el CAM, disolución de 4 g de Ce(SO4)2 y 100 g de (NH4)6Mo7O24.H2O en una

mezcla de 100 mL de H2SO4 conc y 900 mL de agua.

Los eluyentes usados fuero hex/AcOEt y hex/acetona, en todos los casos

la polaridad se expresa como la proporción del disolvente más polar.

Materiales y métodos

28

Cromatografía en Columna:

Para las columnas se utilizó gel de sílice Kieselger 60 (63 a 200 µm) de

Merck. Las columnas se eluyeron a presión atmosférica o con sobrepresión de

nitrógeno.

Cromatografía Líquida de Alta Eficacia (HPLC):

Se utilizaron aparatos Merck-Hitachi L-6270 y L-7100, equipados con

columnas de gel de sílice LiChrosorb Si 60 con relleno de 7 µm y dimensiones

de 1 x 25 cm. El detector empleado fue índice de refracción.

Los eluyentes utilizados en este caso fueron mezclas en distintas propor-

ciones de hexano/acetato de etilo.

Disolventes para cromatografía.

En cromatografía, se utilizaron disolventes de grado técnico destilados.

En el caso del HPLC los disolventes fueron previamente filtrados

3.3 TÉCNICAS INSTRUMENTALES

Resonancia Magnética Nuclear: Para la realización de los espectros se emplearon los aparatos: Varian

Gemini 300 (300 MHz para 1H y 75 MHz para 13C), Varian Inova 400 (400 MHz

para 1H y 100 MHz para 13C) y Varian Inova 600 (600 MHz para 1H y 150 MHz

para 13C)

Los espectros se realizaron utilizando como disolvente cloroformo deu-

terado, tomando como referencia las señales residuales del disolvente, 7,27 ppm

(singlete) para 1H y 77,0 ppm (pico central del triplete) para 13C.

Los valores de los desplazamientos químicos se indican en δ (ppm) y las

constantes de acoplamiento en Hertzios (Hz). La asignación de 1H y 13C se

representa en tablas ordenadas por la posición de los protones en el esqueleto

Materiales y métodos

29

carbonado indicando la multipilicidad de las señales y sus constantes de

acoplamiento.

Espectrometría de Masas: Los espectros de masas de baja resolución se realizaron en un

espectrómetro Voyager GCMS/Thermoquest con rango de masas 1-1000. Todos

se realizaron por impacto electrónico y con la técnica gases-masas, inyectán-

dose las muestras en modo “SPLIT” (partición de muestra).

Para los espectros de masas de alta resolución se empleó un

espectrómetro VG Autospec-Q. Para todos se utilizó el impacto electrónico

(70 eV). La introducción de la muestra se realizó con una sonda directa para

sólidos.

Espectroscopia Infrarroja:

Los espectros de infrarrojo se realizaron en un espectrofotómetro de

transformada de Fourier Genesis Series FTIR de Mattsob. Los valores aparecen

en cm-1. Las medidas fueron realizadas mediante el depósito en película (film)

líquida o sólida sobre pastillas de NaCl.

Actividad Óptica ([α]D):

Las medidas se hicieron en un polarímetro Perkin-Elmer 241 con lámpara

de sodio (589 nm). La concentración y el disolvente utilizado se expresan entre

paréntesis.

4.Resultados


33

4.1 AISLAMIENTO Se han aislado cinco nuevos compuestos denominados B, D, E, F y H,

junto con los ya conocidos Thapsivillosina C (G), 6-O-Acetil-8-angeloilshiromodiol

(A) y 6-O-Acetil-8-O-angeloildiepoxytovarol (C) procedentes de las raíces de

Thapsia villosa var villosa. Es la primera vez que los ésteres metiltiopropanoato

y acrilato se aíslan formando parte de un producto natural.

El extracto se separó mediante cromatografía en columna empleando

como eluyente mezclas éter de petróleo/AcOEt de polaridad creciente. Se

realizaron siete reuniones (1 a 7) tras el análisis de las fracciones recogidas,

mediante cromatografía en capa fina.

A O

O

O

O

O

1

2

3 45

67

8

910

12

13

11

14

15

1'2' 3'

4'

5'

1''2''

H

B O

O

O

O

O

1

2

3 45

67

8

910

12

13

11

14

15

1' 2' 3'

4' 5'

1''2''

H

C

O

OO

O

O

OH

H1

2

2 4 4

67

11

12

13

8

9

14

15

1'2'

3'

4'

1''

2''

10 5'

D

O

OO

O

O

OS

H

H1

2

2 4 4

67

11

12

13

8

9

14

15

1'2' 3' 4'

1''

2''

10

E

O

O

O

O

O

O O

OO

O1

53 8

10

11

12 13

14

15

1'2' 3'

H

HH

2

6 7

9H

H

F

O

O

O

O

O

O O

OO

O

S1

53 8

10

11

12 13

14

15

1'2'

3'

H

HH

2

6 7

9

G H

O

O

O

O

OHOH

O

OO

OO

O

1

5

3 8

11

13

14

15

910

67

2

4

12

H

O

O

O

O

O

O O

OO

OS

1

53 8

10

11

12 13

14

15

1'2'

3'

H

HH

2

6 7

9

Resultados

34

En la siguiente tabla se detallan los eluyentes empleados para el

aislamiento de cada compuesto y las cantidades aisladas de cada uno de ellos.

Fracción (masa) Compuesto Separación Cantidad A Ep/AcOH 10% (CC) 500 mg

4 (1,3 g) B Ep/Acetona 5% (CC) 17 mg

5 (4,3 g) C Ep/AcOH 20% (CC) 2,5 g

D Ep/AcOH 20% (CC) 250 mg

E Ep/AcOH 40% (HPLC) 0,1 mg

F Ep/AcOH 20% (CC) 28 mg 6 (4,0 g)

G Ep/AcOH 20% (CC) 15 mg

7 (260 mg) H Ep/AcOH 40% (CC)

Ep/Acetona 20% (CC) 7 mg

4.2 DESCRIPCIÓN DE LOS COMPUESTOS AISLADOS 4.2.1 Compuesto B 4.2.1.1- Descripción:

El EM muestra un ión molecular a 378 correspondiente a una fórmula

molecular C22H34O5. El espectro de 1H-RMN a 25º C

muestra unas señales muy anchas y poco definidas, al

igual que en el 13C-RMN donde algunos carbonos

muestran señales muy anchas y con baja intensidad,

este problema se resuelve realizando los espectros a una

temperatura de -40º C.

El doblete a δH = 2,90 (δc = 66,5) se corresponde con el protón de un

epóxido que en el COSY da una correlación con la señal doblete de δH = 4,87

(δc = 79,8) correspondiente a un protón en α a un éster, este protón tiene

correlación en el COSY con la señal doblete a 1,40 ppm (δc = 47,2) que a su vez

se acopla con un protón con δH =1,90 (δc = 25,8) y éste último se acopla con los

dobletes a δH = 0,90 (δc = 21,5) y δH = 1,20 (δc = 21,4), lo que implica la

existencia de un isopropilo mostrando la siguiente estructura parcial:

OO

O

O

O

1

2

3 45

67

8

910

12

13

11

14

15

1' 2' 3'

4' 5'

1''2''

H

OO


35

La señal doble doblete a δH = 5,43 (δc = 72,5) correspondiente a un protón

en α a un grupo éster se acopla con las señales a 2,70 y 1,90 ppm correspon-

dientes ambas a un mismo carbono (δC = 39,5); esto genera la siguiente estruc-

tura parcial:

La señal doblete a δH = 5,30 (δc = 129,0) correspondiente a un carbono

olefínico se acopla con las señales a 2,30, 2,10 y 1,80 ppm, ésta última señal

corresponde a un grupo metilo en posición alílica. La señal a δH = 2,30 se acopla

a su vez con las señales a 2,10 y 1,20 ppm, correspondiendo ambas señales a

un mismo carbono (δC = 38,2). La estructura parcial queda de la siguiente

manera:

Mediante el estudio del espectro HMBC (5 Hz) se observa que el H-1

correlaciona con C-9, el H-3 con C-4, el H-15 con C-4 y H-7 con C-9, lo que nos

lleva a que uniendo los trozos la estructura sea la siguiente:

Aunque no se observa acoplamiento alguno mediante el COSY entre H-7

y H-8, si se observa en el HMBC una correlación entre H-7 y C-9, lo que nos

permite justificar la estructura.

Los ésteres unidos a la estructura son un acetato y un tiglato. El acetato

se corresponde con la presencia de un singlete que integra para tres protones a

1,92 ppm (δc = 20,8) y con una pérdida de 60 unidades en el espectro de masa.

El tiglato se origina una señal qq a 6,83 ppm (δc = 137,4), un metilo doblete a

O

H H

HH

HH

O

O1

2

3 45

67

8

9

10

12

11

14

15 OR

R

Resultados

36

1,80 ppm (δc = 14,6) y un metilo singlete ancho a 1,82 ppm (δc = 12,0), así

mismo en el espectro de masas el pico de intensidad relativa 100 con m/z = 83

corresponde a:

La posición de los ésteres se establece en base al HMBC, en el que se

observa una correlación de H-8 con C-1’ y de H-6 con C-1’’.

4.2.1.2- Datos experimentales:

νmax (film), cm-1: 2950, 2870, 1742, 1708, 1258, 1231, 1138, 1024.

Actividad óptica:

[α]D25= - 37,50º (c 0,20; CHCl3)

EIMS m/z (int.rel.):

378 [M+] (2,0), 318 [M-AcOH]+ (2,0), 278 (20), 263 (18), 93 (40), 83 (100), 55

(82).

Desplazamientos de 1H-RMN y 13C-RMN: (600 y 150 MHz, -40ºC)

1H m J (hz) 13C 1H m J (hz) 13C

1 5,30 d J1-2=11,8 129,0 12 0,90 d J2-13=6,5 21,5 2 2,36 m - 24,5 13 1,10 d J3-12=6,5 21,4

3 2,10 1,20

m m - 38,2 14 1,10 s - 23,0

4 - - - 58,5 15 1,75 s - 16,6 5 2,90 d J5,6= 6,5 66,5 1’ - - - 167,0 6 4,70 d J6,5= 6,5 73,8 2’ - - - 128,3

7 1,36 d J7,8=10,3 47,2 3’ 6,83 qq J3’-4’=6,9 J3’-5’=1,5 137,4

8 5,43 dd J8-9α=13,0 J8-9β=5,7 72,5 4’ 1,82 s - 12,6

9α 2,70

dd

J9α-8=13,0 J9β-9α=5,7

5’ 1,80 d J5’-3’=6,9 14,6

9β 1,90 m - 39,5

1’’ - - - 170,3 10 - - - 130,1 2’’ 1,92 s - 20,82

11 1,90 m - 25,8

O


37

4.2.2 Compuesto A 4.2.2.1- Descripción:

El compuesto A presenta un espectro de 1H y 13C muy similar al del

compuesto B, al igual que este último los espectros se

realizan a -40º C y la diferencia con el B es la naturaleza

del éster en la posición C-8, en éste caso un angelato,

caracterizado por un qq a δH = 6,04, un metilo doblete a

1,95 ppm y un metilo singlete ancho a δH = 1,80.

4.2.2.2- Datos experimentales

νmax (film), cm-1: 2953, 2869, 1743, 1714, 1648, 1456, 1370, 1235, 1159, 1040.

Actividad óptica:

[α]D25= - 63,65º (c 0,4; CHCl3)


1H m J (hz) 13C 1H m J (hz) 13C 1 5,26 d J1-2=11,8 128,9 12 0,82 J2-13=6,5 21,3 2 2,30 m - 24,3 13 1,05 J3-12=6,5 21,2

3 2,10 1,20 m -

- 38,1 14 1,10 - - 22,80

4 - - - 59,3 15 1,70 - - 16,4 5 2,87 d J5,6= 6,9 66,3 1’ - - - 165,5 6 4,80 d J6,5= 6,9 73,7 2’ - - - 127,1

7 1,30 d J7,8=10,3 46,9 3’ 6,04 qq J3’-4’=6,9 J3’-4’=1,1 139,0

8 5,40 dd J8-9α=13,0 J8-9β=5,7 71,9 4’ 1,80 s - 20,4

9α dd J9α-8=13,0 J9β-9α=5,7

5’ 1,95 d J5’-3’=6,9 15,5

9β 1,90 - - 39,4

1’’ - - - 170,0 10 - - - 129,9 2’’ 1,90 s - 20,6

11 1,90 m - 25,7 0,82 J2-13=6,5 21,3

OO

O

O

O

1

2

3 45

67

8

910

12

13

11

14

15

1'2' 3'

4'

5'

1''2''

H

Resultados

38

4.2.3 Compuesto D 4.2.3.1- Descripción: La fórmula molecular, C21H32O6S, se determinó mediante análisis

elemental y fue confirmada mediante HREIMS. El

espectro de 13C-RMN muestra señales correspon-

dientes a dos grupos carbonilos, 170,4 y 135,6

ppm y a un doble enlace, 153,5 y 112,9 ppm.

En el espectro de 1H-RMN las señales a

3,08 ppm (δc = 61,5) y 3,16 ppm (δc = 66,6)

corresponden ambas con H de epóxidos, al no existir correlación en el COSY

entre estas señales se deduce que existen dos epóxidos en la molécula.

Del análisis del COSY se deducen las siguientes secuencias de correla-

ción y las consiguientes estructuras parciales:

La señal de 4,89 ppm (δC = 73,2) junto con la de 5,66 ppm (δC = 66,3)

resultan ser hidrógenos en α a un grupo éster visto el desplazamiento de su

correspondiente carbono

La señal de los protones del metilo a 1,26 ppm muestra correlación en el

HMBC con los carbonos a 66,6, 58,8 y 36,5 ppm lo que nos permite unir el

primer trozo con el tercero. Así mismo, el metilo a 1,45 ppm muestra correlación

en el HMBC con los carbonos a 61,4, 58,7 y 42,5 ppm lo que nos permite unir el

O

OO

O

O

OS

H

H1

2

2 4 4

67

11

12

13

8

9

14

15

1'2' 3' 4'

1''

2''

10

O

H H

OO

3,16 4,89 1,60 1,841,13

0,95(66,6) (73,2)

(23,2)

(21,5)

5,662,23

1,85(42,5)

(69,3)

3,081,45

2,07(23,82)

1,26

2,17(36,58)

HH

HH O

(61,4)

H

(26,5)(48,5)


39

segundo trozo con el tercero. La estructura se cierra finalmente con la

correlación entre δH = 1,60 y δc = 42,5. Los ésteres unidos a la molécula son un

acetato y un metiltioacrilato. El acetato se corresponde con un singlete a 1,92

ppm (δc = 21,0). El metiltioacrilato se caracteriza por la presencia de un singlete

correspondiente al –SMe a δH = 2,38 (δc = 19,6) y dos dobletes a δH = 5,80 (δc =

112,9) y δH = 7,05 (δc = 153,1). La constante de acoplamiento entre estos dos

dobletes de 10 Hz indica que el doble enlace tiene una configuración Z.

La localización de los ésteres se hace a través del HMBC, el H-5

correlaciona con el carbono a δc = 170,4 correspondiente al acetato, y el H-8

correlaciona con el carbono a δc = 165,6 correspondiente al metiltioacrilato.


νmax (film), cm-1: 2960, 1740, 1698, 1558, 1387, 1235, 1161, 992, 796.

Actividad óptica:

[α]D25= - 18,34º (c 0,24; CHCl3)


412 [M]+ (1), 235 [M-HOAc-C4H5O2S]+ (1), 195 [M-HOAc-C3H7-C4H6O2S]+ (4),

193 (2), 163 (4), 149 (5), 101 [C4H5OS]+ (100).

HREIMS m/z (calculada):

412,1905 (412,1920).

Análisis elemental: C (teórico) H (teórico) S (teórico) 60,81 (61,14) 7,845 (7,82) 7,972 (7,77)

Resultados

40

Desplazamientos de 1H-RMN y 13C-RMN: (400 y 100 MHz, 25ºC)

4.2.4 Compuesto C:

4.2.4.1- Descripción: Este compuesto muestra espectros de RMN muy similares al compuesto

anterior, salvo en lo que se refiere a las señales del

éster de la posición C-8 que en este caso se trata de

angelato, caracterizado por un qq a δH = 6,07, un

metilo dq a δH = 1,95 y un metilo singlete ancho a

1,85 ppm.


νmax (film), cm-1:

2960, 2871, 1744, 1715, 1457, 1387, 1236, 1159, 1192, 1040.

Actividad óptica:

[α]D25= - 9,41º (c 0,17; CHCl3).

1H m J (hz) 13C 1H m J (hz) 13C

1 3,08 d 10,4 61,5 12 1,13 d J12-13 = 6,5 23,2 2α 1,45 m - 13 0,95 d J13-12 = 6,5 21,5

2β 2,07 dt J3α,2α = 14,6 J2α-3α=3,4

23,8 14 1,45 s - 22,4

3α 2,17 dt J3α,2β = 13,2 J3α-2α=3,4 15 1,26 s - 17,2

3β 1,26 m - 36,6

1’ - - - 165,6 4 - - - 58,8 2’ 5,80 d J2’,3’ = 10,0 112,9 5 3,16 d J5-6=6,8 66,6 3’ 7,05 d J3’,2’ = 10,0 153,1

6 4,89 dd J6,5=6,8 J6,7=1,0 73,2 SCH3 2,38 s - 19,6

7 1,60 d J7,11 = 8,7 48,5 1’’ - - - 170,4

8 5,66 dd J8-9α = 12,2 J8-9β = 5,8 69,3 2’’ 1,92 s - 21,0

9α 2,23 t J9α-8=12,2

9β 1,85 dd J9β-8 = 5,8 J9β-9α = 13,7

42,5

10 - - - 58,7

11 1,84 m - 26,5

O

OO

O

O

OH

H1

2

2 4 4

67

11

12

13

8

9

14

15

1'2'

3'

4'

1''

2''

10 5'


41


4.2.5 Compuesto F:

4.2.5.1- Descripción:

La fórmula molecular se estableció por análisis elemental y se confirmó

por HREIMS, C25H34O10S (526,1860), nueve

insaturaciones. El IR muestra la presencia

bandas de grupos carbonilo a 1791 y 1738

cm-1, la primera señal corresponde a una

γ-lactona.

En el 1H-RMN a 25º C aparecen

señales anchas centradas en 2,6 y 2,8 ppm, sus respectivos carbonos presentan

también señales anchas de intensidad baja. Este comportamiento nos llevó a

realizar los espectros de RMN a -50º C quedando solucionado el problema.

El 13C-RMN muestra señales de cinco grupos carbonilos, dos carbonos

pertenecientes a un doble enlace y cinco carbonos oxigenados. Si consideramos

cinco carbonilos, un doble enlace y una lactona suman 7 insaturaciones, lo que

1H m J (hz) 13C 1H m J (hz) 13C

1 3,10 d 10,6 60,9 12 1,16 d J12-13 = 6,6 23,4 2α 1,50 m - 13 0,97 d J13-12 = 6,6 21,4

2β 2,08 dt J3α,2α = 14,6 J2α-3α= 3,3

23,4 14 1,47 s - 22,5

3α 2,17 dt J3α,2β = 13,5 J3α-2α=3,3 15 1,28 s - 16,8

3β 1,30 m - 36,0

1’ - - - 166,0 4 - - - 58,4 2’ - - - 127,5 5 3,15 d J5-6=6,9 65,8 3’ 6,07 138,8

6 4,93 dd J6,5=6,9 J6,7=1,0 72,9 4’ 1,85 m J4’-3’=1,45 20,4

7 1,63 d J7,11 = 9,5 48,2 5’ 1,95 dq J3’-5’=7,32

J3’-4’=1,45 15,6

8 5,64 dd J8-9α = 12,0 J8-9β = 5,4 68,8 1’’ - - - 169,5

9α 2,23 t J9α-8=12,0 2’’ 1,93 s - 20,5 9β 1,89 m J9α-9β=12,0 42,3

10 - - - 58,2 11 1,85 m - 26,3

O

O

O

O

O

O O

OO

O

S1

53 8

10

11

12 13

14

15

1' 2'

3'

H

HH

2

6 7

9

Resultados

42

llevaría a que tenemos un compuesto con dos ciclos, además del correspon-

diente a la lactona.

El COSY muestra las siguientes correlaciones:

Aparentemente parece que existe un anillo de cuatro miembros, pero el H

a 5,60 ppm se corresponde con un carbono olefínico (δC = 126,0), el no aparecer

otro protón olefínico está de acuerdo con la existencia de acoplamiento alílico

entre las señales en 3,10 y 5,60 ppm, por tanto tenemos un anillo de cinco, así

pues el otro anillo es un anillo de siete, un carbono cuaternario lo completaría en

el esquema anterior.

El espectro de 1H-RMN muestra señales de tres acetatos, que unidos a la

presencia de la lactona suman cuatro ésteres, queda un éster sin determinar en

la molécula.

El HMBC está de acuerdo con que se coloque la lactona entre los

carbonos C-6 y C-7; el H-6 aparece a 4,83 ppm y su carbono a 75,4 ppm. Así

mismo, mediante el HMBC se colocan los grupos acetato en C-2, C-10 y C-11 y

el éster restante sobre C-8. La estructura de este éster se dedujo desde las

señales en 1H-RMN, dos metilenos centrados en 2,60 y 2,80 ppm acoplados

entre ellos y un metilo a 2,10 ppm que no acopla con los metilenos. Este metilo

se corresponde con un SMe que muestra correlación en HMBC con el C-3’’.

Estas correlaciones nos llevan a deducir que se trata del metiltiopropionato, éster

que se describe aquí por primera vez formando parte de un producto natural.

4,83 3,60 5,803,105,60

5,70 3,42 2,60 1,96

(126,0)

(79,4) (44,5)

(65,7)(75,4)

(50,1)

(49,6) (48,2)

OR

O R

OR


43

4.2.5.2 Datos experimentales:

νmax (film), cm-1:

2960, 1740, 1698, 1558, 1387, 1235, 1161, 992, 796.

Actividad óptica:

[α]D25= -40º (c 0,13, CHCl3)


466 [M-HOAc]+ (1), 244 (16), 226 [M-HOAc-C4H8O2S]+ (100), 173 (42).


526,1860 (526,1873)

Análisis elemental C (teórico) H (teórico) S (teórico) 57,35 (57,02) 6,639 (6,51) 6,20 (6,09)


1H m J (hz) 13C 1H m J (hz) 13C

1 3,42 dd J1,5=7,8 J1,2=2,1 50,09 13 1,60 s - 20,30

2 5,70 m - 79,37 14 1,24 s - 26,94 3 5,60 m - 126,05 15 1,90 d J15,3=1 17,31 4 - - - 149,56 1’ - - - 170,14 5 3,10 m - 49,56 2’ 2,60 m - 34,08

6 4,83 dd J6,5=11,72 J6,7=9,5 75,40 3’ 2,80 m - 28,34

7 3,60 dd J7,6=9,7 J7,8=10,74 48,25 SMe 2,13 s - 15,309

8 5,80 td J8,7=11,23=J8,9

J8,9β=2,7 65,73 (C-2)-OCOCH3 - - - 170,7

9β 2,60 dd J9β,9α=13,54 J9β,8=2,7 (C-2)-OCOCH3 2,03 s s 21,0

9α 1,96 dd J9α,9β=13,54 J9α,8=11,17

44,5

(C-10)-OCOCH3 - - - 170,7

10 - - - 79,73 (C-10)-OCOCH3 2,02 s s 21,2 11 - - - 77,79 (C-11)-OCOCH3 - - - 170,0 12 - - - 173,90 (C-11)-OCOCH3 2,10 s s 22,3

Resultados

44

4.2.6 Compuesto H: 4.2.6.1 Descripción:

Este compuesto se diferencia del anterior en la naturaleza del éster sobre

C-8, en este caso es un metiltioacrilato.

El MTA queda caracterizado en 1H-RMN por un singlete correspondiente

al –SMe a 2,38 ppm (δc = 19,6) y dos dobletes a 5,80 ppm (δc = 112,9) y 7,05

ppm (δc = 153,1).


νmax (film), cm-1:

2921, 1790, 1733, 1566, 1371, 1240, 1155, 1019, 797.

Actividad óptica:

[α]D25= -24,5º (c 0,25, CHCl3)


464 [M-HOAc]+ (2), 422 [M-C4H6O3]+ (5), 226 [M-3HOAc-C4H6O2S]+ (54), 101

[C4H5OS]+ (100).


464,1500[M-HOAc]+ (464,1505).

Análisis elemental C (teórico) H (teórico) S (teórico) 57,11 (57,24) 6,171 (6,15) 6,307 (6,11)

O

O

O

O

O

O O

OO

OS

1

53 8

10

11

12 13

14

15

1'2'

3'

H

HH

2

6 7

9


45


4.2.7 Compuesto E: 4.2.7.1 Descripción:

Al igual que el anterior este compuesto se diferencia del compuesto F en

el éster situado en C-8 que en este caso se

trata de acrilato, el acrilato se corresponde en el 1H-RMN por tres dobletes de dobletes a 6,00

(J = 10 y 17 Hz), 6,40 (J = 17 y 1 Hz ) y 5,88

ppm (J = 10 y 1 Hz). Los valores de la constan-

tes de acoplamiento nos permiten deducir la

estructura -CH=CH2, por el desplazamiento de

las señales esta unidad etileno es α a un carbonilo, lo que nos confirma la

presencia del éster acrilato que se describe aquí por primera vez formando parte

de un producto natural.

1H m J (hz) 13C 1H m J (hz) 13C

1 3,33 dd J1,2=2,2 J1,5=8 51,87 13 1,62 s - 20,58

2 5,77 m - 79,65 14 1,38 s - 26,35 3 5,63 m - 126,64 15 1,95 d J15,3=1,1 17,38 4 - - - 149,48 1’ - - - 164,80 5 3,10 m - 50,12 2’ 5,76 d J2’,3’=10,26 112,28

6 4,83 dd J6,5=11,9 J6,7=9,7 76,1 3’ 7,10 d J3’-2’=10,26 153,5

7 3,68 dd J7,6=9,89 J7,8=10,99 48,25 SMe 2,42 s - 19,25

8 5,73 td J8,7=11,15 =J8, 9 J8,9β=2,8 65,73 (C-2)-OCOCH3 - - - 170,2

9β 2,62 dd J9β,9α=15,38 J9β,8=2,75

(C-2)-OCOCH3 2,03 s - 21,2

9α 2,14 dd J9α,9β=15,38 J9α,8=11,17

44,91 (C-10)-OCOCH3 - - - 170,4

10 - - - 80,56 (C-10)-OCOCH3 2,03 s - 20,9 11 - - - 78,08 (C-11)-OCOCH3 - - - 169,9 12 - - - 173,72 (C-11)-OCOCH3 2,1 22,0

O

O

O

O

O

O O

OO

O1

53 8

10

11

12 13

14

15

1'2' 3'

H

HH

2

6 7

9H

H

Resultados

46


νmax (film), cm-1:

2921, 2861, 1790, 1737, 1238, 1098.


4.2.8 Compuesto G:

4.2.8.1 Descripción:

El espectro IR muestra una señala 3.444 cm*1 correspondiente a grupos

hidroxilos y una señal a 1.790 cm*1

correspondiente a una γ-lactona.

En 13C-RMN hay señales atribui-

bles a cuatro carbonilos, siete carbonos

oxigenados y dos dobles enlaces

El 1H-RMN está de acuerdo con la

presencia de cuatro ésteres y una lactona y con los cinco carbonos oxigenados

correspondientes, esto implica que la molécula debe de contener dos grupos

hidroxilo. Los ésteres que conforman la molécula son un acetato caracterizado

por un singlete a 1,87 ppm, un angelato caracterizado por un qq a 6,07 ppm, un

1H m J (hz) 13C 1H m J (hz) 13C

1 3,38 dd J1,2=2,2 J1,5= 8,1 51,42 13 1,62 s - 20,50

2 5,74 m - 79,46 14 1,32 s - 26,86 3 5,61 m - 126,6 15 1,93 d J15,3=1,1 17,28 4 - - - ? 1’ - - - ?

5 3,10 m - 50,09 2’ 6,06 dd J=10,31 J=17,3 128,07

6 4,79 dd J6,5=11,78 J6,7=9,57 76,03 3’ 6,40 dd J=17,3

J=1,47

7 3,66 dd J7,6=10,68 J7,8=10,68 48,44 3’ 5,88 dd J=10,3

J=1,47

131,67

8 5,80 td J8,7=11,04=J8, 9α J8,9β=2,58 65,97 (C-2)-OCOCH3 - - - ?

9β 2,60 dd J9β,9α=15,46 J9β,8=2,58 (C-2)-OCOCH3 2,03 s - 22,3

9α 2,06 dd J9α,9β=15,46 J9α,8=11,04

44,9 (C-10)-OCOCH3 - - - ?

10 - - - ? (C-10)-OCOCH3 2,02 s - 22,3 11 - - - ? (C-11)-OCOCH3 - - - ?

12 - - - ? (C-11)-OCOCH3 2,02 s - 22,3

H

O

O

O

O

OHOH

O

OO

OO

O

1

5

3 8

11

13

14

15

910

67

2

4

12


47

2-metilbutirato caracterizado por un doblete a 1,11 ppm, un triplete a 0,85 ppm y

un multiplete a 2,30 ppm, el último éster, un octilo, se corresponde con una señal

ancha a 1,30 ppm, un triplete a 2,30 ppm, superpuesto al multiplete del 2-

metilbutirato, y un triplete a 0,85 (solapado con el del 2-metilbutirato). El 13C-

RMN y el DEPT confirman la naturaleza de los ésteres.


νmax (film), cm-1:

3444, 2930, 1790, 1739, 1719, 1237, 1149, 1085, 1042.

Actividad óptica:

[α]D25= -17,14º (c 0,28, CHCl3)


Posición 1 2 3 6 8

δ 1H 4,30 5,45 5,60 5,68 5,60

Posición 9β 9α 13 14 15

δ 1H 3,04 2,30 1,46 1,38 1,85

Posición 1 2 3 4 5 6 7

δ 13C 57,5 77,7 76.8 141.5 130.4 84.1 78,5

Posición 8 9 10 11 12 12 14 15 δ 13C 66,1 38,2 84.7 78,6 175,7 16,2 23.2 12,9

Octilo: 1H: 2,3, 1,6, 1,3, 0,9.

13C: 172,5, 34,2, 26,1, 29,0, 31,0, 31,6, 24,8, 14,0.

Angelato: 1H: 6,07, 1,97, 1,90. 13C: 167,0, 127,4, 138.6, 16,3, 20,6.

2-Metilbutirato: 1H: 2,27, 1,72, 1,40, 1,11, 0,85. 13C: 175,3, 41,3, 28,9, 11,6, 15,8.

Acetato: 1H: 1,87. 13C: 170,6, 23,0.

5.Conclusiones

Conclusiones

51

5 CONCLUSIONES

• El estudio fitoquímico de Thapsia villosa var villosa ha revelado la presen-

cia de cinco nuevos metabolitos.

OO

O

O

O

1

2

3 45

67

8

910

12

13

11

14

15

1' 2' 3'

4' 5'

1''2''

H

B

O

OO

O

O

OS

H

H1

2

2 4 4

67

11

12

13

8

9

14

15

1'2' 3' 4'

1''

2''

10

C

O

O

O

O

O

O O

OO

O1

53 8

10

11

12 13

14

15

1'2' 3'

H

HH

2

6 7

9H

H

E

O

O

O

O

O

O O

OO

O

S1

53 8

10

11

12 13

14

15

1'2'

3'

H

HH

2

6 7

9

F

O

O

O

O

O

O O

OO

OS

1

53 8

10

11

12 13

14

15

1'2'

3'

H

HH

2

6 7

9

H

• Dos de los nuevos metabolitos, C y H, presentan un resto metiltioacrilato,

un éster poco frecuente aislado anteriormente sólo de seis especies, de

las cuales tres son plantas superiores.

• El metabolito F contiene el resto éster metiltiopropionato que por primera

vez se ha aislado formando parte de un producto natural. Su origen está

en el metabolismo de la metionina.

• El metabolito E está esterificado con acrilato. Al igual que el metiltiopro-

pionato, es la primera vez que se aísla formando parte de un producto

natural. Parece ser que su origen se encuentra en la descomposición del

metiltiopropionato y se ha encontrado que existen algas que se defienden

mediante la liberación de acrilato.

6-Bibliografía

Bibliografía

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7-Anexo de espectros

Anexo de espectros

59

0255075100125150175

0.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.5 Espectro de 13C (150 MHz) y 1H (600 MHz) del compuesto A a -40º C


60

0255075100125150175

0.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.5 Espectro de 13C (150 MHz) y 1H (600 MHz) del compuesto B a -40º C

Anexo de espectros

61

0255075100125150175200

1.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.5 Espectro de 13C (100 MHz) y 1H (400 MHz) del compuesto C a 25º C


62

102030405060708090100110120130140150160170180190

Espectro de 13C (100 MHz) y 1H (400 MHz) del compuesto D a 25º C

Anexo de espectros

63

0102030405060708090100110120130

1.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.0

5.906.006.106.206.306.40

Espectro de 13C (150 MHz) y 1H (600 MHz) del compuesto E a 25º C


64

0102030405060708090100110120130140150160170180190

Espectro de 13C (150 MHz) y 1H (600 MHz) del compuesto F a -50º C

Anexo de espectros

65

0102030405060708090100110120130140150160170180

0.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.5 Espectro de 13C (100 MHz) y 1H (400 MHz) del compuesto G a 25º C


66

102030405060708090100110120130140150160170180

1.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.5 Espectro de 13C (100 MHz) y 1H (400 MHz) del compuesto H a 25º C

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