TRABAJO PRÁCTICO N°6“CARIOTIPO”

OBJETIVOS

Conoce las distintas técnicas de coloración de cromosomas Realizar un análisis de metafase e identificar cromosomas por coloración con Giemsa. Desarrollar el cariotipo de una línea celular por la técnica de bandeo G.

INTRODUCCIÓN

Los cromosomas son unidades del genoma, portadores de la información genética. Formados por largas moléculas de DNA y proteínas, se hacen morfológicamente visibles solamente en el acto de la división celular y el estudio de los mismos constituye el cariotipo que revela información muy valiosa acerca de la constitución genética del individuo ya que cada cromosoma tiene una morfología y un tamaño muy constantes en cada especie. En el ser humano, por ejemplo, cada célula del organismo (excepto las germinales) posee 46 cromosomas, 23 paternos y 23 maternos; 22 de estos pares son verdaderamente homólogos en cuanto a que no sólo la morfología del cromosoma es similar sino también la información genética de que disponen y se denominan autosomas; el 23° par en cambio es el denominado sexual ya que es el que porta los principales determinantes de la diferenciación de sexo. Su morfología, de hecho varía según se trate de un cromosoma que porta la información para que el individuo se desarrolle como hombre o mujer, constituyéndose en los denominados cromosoma Y o X respectivamente.Cada cromosoma presenta a su vez diversos elementos que los caracterizan: un estrechamiento de localización relativamente central, que se denomina centrómero o constricción primaria, y constituye el sitio de unión de los husos mitóticos. Divide a los cromosomas en dos porciones o brazos, denominados largo o “q” y corto o “p” (del francés petit). Algunos cromosomas poseen en su brazo corto otro estrechamiento denominado constricción secundaria. En los extremos de cada cromosoma se encuentra una secuencia particular, no codificante, denominada telómero. En base a estas características, los cromosomas se pueden clasificar en metacéntricos, el centrómero se encuentra en el medio (ambos brazos tiene igual longitud); submetacéntricos, el centrómero se encuentra un poco alojado del medio (se hace evidente un brazo corto y otro largo); acrocénctricos, son pequeños y el brazo corto es de muy corta longitud además de poseer una constricción secundaria; telocéntricos, el centrómero se encuentra en un extremo (tiene un sólo brazo).

EL ESTUDIO DE LOS CROMOSOMAS:

Los cromosomas se estudian a partir de cualquier tejido, pero en mamíferos se emplean preferentemente los linfocitos de sangre periférica debido a su fácil obtención. En este caso, por ejemplo, a la sangre anticoagulada se le agrega una sustancia denominada fitohemaglutinina la

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cual es capaz de estimular los linfocitos T, logrando activar su multiplicación. Luego de 72 hs. de incubación, las metafases son detenidas por la adición de colchicina, que paraliza las fibras del huso mitótico. Los coromosomas se separan y se fijan. En el caso de líneas celulares tumorales, debido a la alta tasa de mitosis, no es necesaria su estimulación, y solamente se las incuba con colchicina antes de analizarlas.Los cromosomas pueden visualizarse a través de un microscopio óptico común, al teñirse con colorantes específicos para DNA.

TINCIONES PARA CARIOTIPOS

Los métodos de tinción para el estudio del cariotipo tienen en común el hacer visibles y permitir identificar los distintos cromosomas. Las distintas características de cada uno permitirán, además de cuantificarlos, estudiar sus morfologías.

BANDEADO G

El bandeado G es el más frecuentemente utilizado en la práctica.Se utiliza el colorante Giemsa, el cual produce bandas oscuras ricas en adenina y timina y bandas claras o brillantes ricas en guanina y citosina.En la siguiente figura vemos a la izquierda un ejemplo de bandeado G para una célula humana (¿qué sexo tiene el individuo?) y a la derecha un esquema que ilustra en detalle las bandas.

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Metodología:

Obtención de metafases de las líneas celulares- 48 hs. posteriores al repique, los cultivos celulares se tratan durante 2 horas con colchicina,

en concentración final 1ug/ml de cultivo. - Se recoge toda la suspensión en un tubo de centrífuga para centrifugarlo 5 minutos a 880

rpm. - Se descarta el sobrenadante y el botón celular se resuspende en 2ml de solución hipotónica

de KCl 0,07M. - Se incuba 10 minutos a 37°C.- Se centrifuga nuevamente 5 minutos a 800 rpm. para eliminar la solución hipotónica. - Se fijan las células con 2ml de metanol:ácido acético (3:1).- Se deja aproximadamente 30 minutos el tubo en la heladera. - Las células ya fijadas son resuspendidas y se las lava con fijador fresco las veces que se

considera necesario.- Los extendidos se realizan dejando caer unas gotas de la suspensión sobre portaobjetos

limpios y fríos. - Se deja secar al aire, según la técnica del air-drying.

Análisis de las metafasesLos preparados se tiñen con solución de Giemsa al 3% en agua para observar, dibujar y contar el número de cromosomas de cada metafase (ploidía).Se colorea entre 3 y 5 minutos y se lava con agua.El número modal es el número de cromosomas de mayor frecuencia.Las metafases primero se seleccionan a bajo aumento (10 X) por la integridad de citoplasma. Se señalan las coordenadas y se pasa a un objetivo de inmersión (100 X) para contar su número cromosómico.

Coloración con Giemsa- Se incuban los portaobjetos 5 minutos en PBS a temperatura ambiente. - Se tratan con tripsina (GIBCO) 0,1% en PBS libre de Ca2+ y Mg2+ durante un tiempo

variable, dependiente de la morfología cromosómica y del estado del preparado. - Se lavan con PBS. - Se colorean con Giemsa a pH7 al 4%, preparada en buffer de Sorensen alrededor de 3

minutos.

AnálisisSe obtiene una imagen como se observa en la figura siguiente, a partir de la cual se deben identificar los pares de cromosomas.Para más detalles consultar la siguiente página web:http://gslc.genetics.utah.edu/units/disorders/karyotype/karyotype.cfm

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OTRAS TÉCNICAS DE TINCIÓN

Existen otras técnicas de bandeado que se basan en el mismo principio: un colorante con alta afinidad por determinados componentes de un cromosoma. Podemos mencionar el bandeado Q (inverso al G), C (tiñe heterocromatina constitutiva), N (tiñe constricciones secundarias).

La hibridación in situ con fluorescencia permite realizar de igual modo un análisis cualitativo de los cromosomas, utilizando sondas complementarias a secuencias propias de cada cromosoma.

Pero existe una técnica relativamente nueva que facilita enormemente el análisis de cariotipo. Se denomina Cariotipo Espectral y consiste en el análisis del espectro de emisión de longitudes de onda de cada cromosoma, luego de impregnarlos con sondas específicas unidas a fluorocromos. El análisis digital determina colores específicos para cada cromosoma permitiendo así, no solamente su fácil individualización, sino también la visualización de anomalías. La siguiente figura ilustra un Cariotipo Espectral, y su metodología.

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