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D Bioquímica Clínica y Patología Molecular

Tema 26. Introducción a la Bioquímica Clínica

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Bioquímica Clínica

• La mayoría de las enfermedades provocan alteraciones bioquímicas

– Ejemplos• Patologías con una base metabólica clara• Enfermedades hereditarias• Alteraciones del ciclo celular

– Pede ser cuantificado si se dispone de un método de análisis adecuado

• En estos casos, el diagnóstico clínico y la monitorización de la evolución del paciente se apoyan en “tests” o pruebas bioquímicas.

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Función de la Bioquímica Clínica

• Las pruebas bioquímicas son un elemento fundamental para la diagnosis, la prognosis y la monitorización de enfermedades, así como la detección de enfermedades subclínicas

• Las funciones de la Bioquímica clínica son:– Diseñar, llevar a cabo e interpretar pruebas

bioquímicas adecuadas– Proporcionar información relevante y significativa que

sirva de guía en la toma de decisiones clínicas

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Diagnosis

• Identificación precisa de la presencia de una determinada enfermedad

• Se basa en:– El historial del paciente (si se dispone de él)– La observación de determinados signos

característicos durante su examen clínico– El resultado de un conjunto de investigaciones

llevadas a cabo a través de una serie de pruebas• Entre ellas se encuentran las de carácter bioquímico

–Diseñadas para confirmar o refutar de manera rápida y certera un determinado diagnóstico clínico

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Prognosis

• Determinación de– La probabilidad de que se desarrolle una

determinada enfermedad– El riesgo de que se desarrolle una

determinada enfermedad• Puede ser apoyada por tests Bioquímicos• Por ejemplo

• Una concentración alta de colesterol en el plasma informa sobre un riesgo elevado de enfermedad de las arterias coronarias.

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Monitorización

• Seguimiento del curso de una determinada enfermedad, o de los efectos de un tratamiento

• Valoración de la toxicidad de los medicamentos, especialmente aquellos que se encuentran en fase de prueba

• Es una de las utilidades más importantes de los tests bioquímicos

• Debe elegirse un analito adecuado– Sus niveles han de estar claramente asociados a la

condición que se desea monitorizar– Debe poder detectarse con suficiente sensibilidad

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"Screening"

• Detección de la presencia subclínica de una determinada condición

• Por ejemplo:• Campañas de análisis sistemáticos de recién

nacidos con el fin de detectar determinadas enfermedades hereditarias

• Se utiliza un conjunto de pruebas automatizadas para establecer el “perfil bioquímico” del sujeto

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Obtención de las Muestras

• Recogidas de acuerdo con un protocolo específico– Datos detallados sobre el paciente

• Edad, sexo, diagnóstico clínico…

– Tipo de muestra a analizar, el test requerido, la fecha, tratamiento que se está llevando a cabo, que permita la evaluación de los resultados en el contexto clínico adecuado.

• Por ejemplo: ¿Plasma o suero?

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El Método de Análisis

• Debe de ser preciso, exacto, reproducible, sensible y específico. Y además, barato, sencillo y rápido.

– Precisión: depende de la dispersión de los valores obtenidos– Exactitud: depende de la desviación del valor medio con

respecto al valor real– Reproducibilidad: un método es reproducible cuando el

resultado de la medida no depende de la sesión de medida– Sensibilidad: un método es sensible cuando permite medir un

determinado analito en concentración baja– Especificidad: un método será más específico cuanto menor

sea la posibilidad de que la medida de un determinado analito sea interferida por la presencia de otras moléculas en la muestra

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Interpretación de Resultados

• ¿Es normal?• ¿Es significativamente

diferente?• ¿Es consistente?

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¿Es Normal?

• Las variables biológicas muestran, por lo general, una distribución Gaussiana, llamada “normal”

• Rango normal o intervalo de referencia

– Valor comprendido entre [la media – 2 x DS] y [la media + 2 x DS]

– Corresponde al ~95% de las medidas

media

Número de tests

Resultado+2DS–2DS

Distribución gaussiana

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Resultados “no Normales”

• Un resultado no normal indica probabilidad de enfermedad

enfermosano

Número de tests

Rango de referencia Resultado

Falsos negativos

Falsos positivos

A

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Especificidad y Sensibilidad

Número de tests

ResultadoUmbral de diagnóstico

Baja especificidadAlta sensibilidad

enfermosano

Alta especificidadBaja sensibilidad

Umbral de diagnóstico

Número de tests

Resultado

enfermosano

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¿Es diferente? ¿Es consistente?

• ¿Es significativamente diferente?

– Depende de:

• La precisión del ensayo

• La variabilidad biológica natural

–Se considera la desviación estándar global (biológica y analítica)

• ¿Es consistente?

– Si el resultado es consistente con otros datos clínicos, aumenta su valor diagnóstico

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Tema 27. Técnicas Analíticas de Diagnóstico.

Ejemplo: Proteínas y Enzimas Plasmáticas

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Composición de la Sangre

• En humano adulto: 5-6 litros de sangre– ~½ volumen total ocupado por tres tipos de células:

• Eritrocitos (glóbulos rojos), Leucocitos (glóbulos blancos) y Plaquetas

• Pueden separarse por centrifugación

– Fase liquida, compuesta por:• Agua (90%)• Solutos, de los cuales:

–70% Proteínas

–10% Iones de sales inorgánicas (Na+, K+, Ca2+, Cl–)

–20% Metabolitos y productos de desecho

–En una concentración mucho más baja, hormonas, vitaminas y

algunos elementos traza.

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SangreSuero:90% agua10% solutos

10% sales inorgánicas20% pequeños nutrientes y

metabolitos70% proteínas séricas

coágulo + células

1 día

coagulación

Obtención del SueroCentrifugación

1500 rpm

Centrifugación1500 rpm

+ anticoagulante

(heparina o quelante de Ca 2+)

células

Plasma:Misma composición que el suero + proteínas del coágulo (fibrinógeno)

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Proteínas y Enzimas Plasmáticas

• Son las más frecuentemente utilizadas en análisis clínicos

– Su concentración cambia de manera característica en determinadas condiciones fisiológicas

– Las muestras son fáciles de obtener• Existen más de 100 proteínas con una función fisiológica

en el plasma– La más abundante es la albúmina, el resto se conocen

colectivamente como globulinas– Algunas proteínas plasmáticas son enzimas

• Enzimas plasmáticas (como los factores de coagulación)• Enzimas de origen intracelular

–Debido al reciclaje celular normal

–Debido a daños en determinados tejidos.

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TodasRegulación del pH (tampón)

Antitripsina 1Inhibidores de proteasas

Renina, Factores de coagulaciónEnzimas

Todas, especialmente la Albúmina

Mantenimiento de presión osmótica

InmunoglobulinasInmunidad

Albúmina, Apolipoproteína, TransferrinaTransporte

ProteínaFunción

Algunas proteínas plasmáticas y sus funciones

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Análisis de Proteínas Plasmáticas

• Proteínas plasmáticas totales– La concentración de proteínas plasmáticas totales

depende de:• La velocidad de síntesis o degradación proteica

–Variación lenta, sujeta a procesos complejos y regulados• Cambios en el volumen de distribución

–Generalmente asociados al estado de hidratación del paciente–Pueden ocurrir de forma rápida

– Sólo la variación de las proteínas plasmáticas más abundantes (albúmina e inmunoglobulinas) tendrá un efecto significativo

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Electroforesis de Proteínas Plasmáticas

• Técnica analítica capaz de separar proteínas en un soporte sólido debido a su migración diferencial en un campo eléctrico

– Se utilizan generalmente soportes de acetato de celulosa– Se distinguen cinco bandas según su migración hacia el ánodo

(polo +):• Albúmina, globulinas 1, globulinas 2, globulinas y globulinas• Generalmente se realiza sobre muestras de suero

–En el análisis de plasma, el fibrinógeno aparece en la región de las -globulinas

– La movilidad electroforética no está relacionada con la función de las proteínas de cada banda

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Patrón de Electroforesis

albúmina

1-globulinas

+Ánodo

Cátodo–

2-globulinas-globulinas

-globulinas

+ Ánodo

– Cátodo

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7-102,002,600,35

Haptoglobinas2-macroglobulinas

Ceruloplasmina2-globulinas

14-18

11-14

4-6

58-70

Rango normal en suero (%)

14,003,501,500,03

trazas

3,001,001,00

2,901,00

0,2540,00

Concentración normal (gr/L)

IgGIgAIgMIgDIgE

-globulinas

TransferrinaLipoproteínas de baja densidadProteínas del complemento

-globulinas

1-antitripsina1-glicoproteína ácida1-globulinas

PrealbúminaAlbúminaAlbúmina

ProteínaBanda

Principales Proteínas Plasmáticas en las Bandas de Electroforesis

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Obtención de un Proteinograma

+ Ánodo

– Cátodo

+ Ánodo – Cátodo

Densitometrado

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Albúmina

• Proteína plasmática más abundante • Funciones principales:

– Transporte de sustancias: ácidos grasos, calcio y hormonas tiroideas, fármacos

– Mantenimiento de la presión osmótica intravascular• Hipoalbuminemia

– Consecuencias: pérdida del equilibrio osmótico entre el plasma y el fluido intersticial (edema)

– Posibles causas: disminución de la síntesis proteica en el hígado, baja absorción de aminoácidos, incremento de la pérdida de proteínas (mucosa ulcerada del intestino, síndrome nefrótico)

• Hiperalbuminemia– Normalmente debida a estados de deshidratación

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Inmunoglobulinas• Función

– Anticuerpos. Reconocimiento específico de antígenos exógenos como parte del sistema inmune

• Estructura– Dos cadenas grandes (“pesadas”) y otras dos cadenas pequeñas

(“ligeras”), unidas entre ellas por puentes disulfuro• Cinco tipos distintos de cadenas pesadas: , y dos tipos de

cadenas ligeras: • El tipo de inmunoglobulina depende del tipo de cadena pesada que

contenga

– Dentro de cada tipo, los extremos N-terminal son altamente variables

• Reconocimiento molecular de los antígenos

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Presente en la superficie de los basófilos. Asociada con reacciones de hipersensibilidad188IgE

Presente en la superficie de los linfocitos B. Participa en el reconocimiento de antígenos184IgD

Pentámero (385 kDa). Principal anticuerpo de la respuesta inmune primaria970IgM

Dímero (385 kDa). Principal anticuerpo de secreciones sero-mucosas (saliva, mucus bronquial, ... etc.)

160IgA

Principal anticuerpo de la respuesta inmune secundaria146IgG

FunciónPeso molecular (kDa)

Cadena pesadaTipo

Tipos y características de las inmunoglobulinas

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Hipogammaglobulemia

• Causas fisiológicas: – En neonatos las concentraciones de IgA e IgM son bajas

• La hipogammaglobulemia es una de las causas de la susceptibilidad de los recién nacidos.

• Causas patológicas– Enfermedades hereditarias que afectan a la síntesis de

inmunoglobulinas:• Agammaglobulemia vinculada al cromosoma X (enfermedad de

Bruton), caracterizada por la ausencia total de inmunoglobulinas• Disgammaglobulemias: defecto parcial de solo alguna de ellas.

– Como consecuencia de cánceres hematológicos:• leucemia linfática, mieloma múltiple

– Otras causas: Utilización de fármacos citotóxicos, o a trastornos catabólicos

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Hipergammaglobulemia

• Causas fisiológicas:– Infecciones agudas y crónicas

• Las detecciones de anticuerpos contra antígenos específicos son ampliamente utilizadas en el diagnóstico de enfermedades infecciosas.

• Causas patológicas– Enfermedad autoinmune.– Paraproteínas: inmunoglobulinas producidas por un

único clon de linfocitos• Da lugar a una única banda en la electroforesis de suero,

normalmente en la región de las -globulinas.• Frecuentes en casos de mieloma múltiple (proliferación

maligna de células plasmáticas)• En un pequeño porcentaje son benignas.

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Otras Proteínas Específicas

• 1-antitripsina– Inhibidor natural de proteasas

– Marcador de enfermedades hereditarias que afectan a su síntesis (hepatitis neonatal)

• Haptoglobina– Su función es unir la hemoglobina liberada en el plasma como

consecuencia de hemolisis intravascular

– Una disminución de la concentración de haptoglobulinaplasmática es indicativa de hemolisis

• 2-macroglobulina– Inhibidor de proteasas de baja especificidad

– Su concentración aumenta en casos de síndrome nefrótico

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Enzimología clínica de enzimas plasmáticas

• La aplicación clínica del análisis de actividades enzimáticas se conoce con el nombre de enzimología clínica

• En el plasma existen gran variedad de enzimas– Enzimas que realizan su función en la sangre (renina,

proteínas del complemento, factores de coagulación)– Enzimas de origen intracelular

• Liberadas en la sangre como consecuencia del reciclaje celular normal

• Se incrementan en situaciones patológicas– Infección, hipoxia, agresión química, desarrollo tumoral, etc

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Utilidad de los Ensayos Enzimáticos

• Sirve para la diagnosis del daño de tejidos– Baja especificidad por un tejido o tipo celular concreto

• Muchas enzimas son comunes en mas de un tejido• Menos problemático si existen isoenzimas características de

cada tejido en particular– Presentan actividades catalíticas similares, pero diferencias en

alguna otra propiedad medible (termoestabilidad, sensibilidad frente a determinados inhibidores, etc)

• La velocidad de las reacciones enzimáticas es directamente proporcional a la concentración de enzima

• La medida de actividades enzimáticas proporciona una alta sensibilidad

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Medida de Actividades Enzimáticas

• Se basan en el análisis de alguna propiedad física medible– Proporcional a la cantidad de producto

formado o de la cantidad de sustrato consumido

– Con frecuencia se emplea la espectrofotometría UV-Vis

– Si el sustrato o el producto no posean espectros de absorción UV-Viscaracterísticos, se utilizan reacciones acopladas

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Ejemplo: Actividad Creatina Quinasa

Creatina + ATP Creatínfosfato + ADPCreatina quinasa

ADP + Fosfoenolpiruvato ATP + PiruvatoPiruvato quinasa

Piruvato + NADH + H+ Lactato + NAD+Lactato deshidrogenasa

Medibles espectrofotométricamente

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Disminuida en hepatopatías y en infarto de miocardioAcetilcolinesterasa

Elevada en cáncer de pulmónEnzima convertidora de la angiotensina

Elevada en cáncer de próstata (isoenzima prostática)Fosfatasa ácida

Elevada en hepatopatíasFosfatasa alcalinaElevada en enfermedades hepatobiliares-glutamiltransferasa ( -GT)

Elevadas en enfermedades hepáticas (hepatitis, cirrosis)Aminotransferasas (transaminasas)

Poco específica debido a su ubicuidadElevada en patologías musculares, cardíacas, renales y hepáticas

Lactato deshidrogenasa (LDH)

Elevada en el infarto de miocardio (isoenzima MB) y en las afecciones musculares (isoenzima MM)Creatina quinasa

Elevada en pancreatitis agudaDisminuida en casos de pérdida de la función pancreática (como en la fibrosis quística)

-amilasa

AlteraciónEnzima

Enzimas Plasmáticas de Interés Clínico

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Tema 28. Patología Molecular

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Bases Moleculares de las Enfermedades

• La mayoría de las enfermedades pueden definirse en términos moleculares

– Un fenómeno patológico puede comprenderse a través de:

• Las propiedades de las moléculas implicadas en él• Las características de las interacciones que llevan a cabo

estas moléculas

– Enfermedades comprensibles a nivel molecular:• Alteraciones genético-metabólicas• El cáncer, la arteriosclerosis, las distrofias musculares, las

inmunodeficiencias congénitas y las infecciones de virus y bacterias

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Origen de la Variabilidad Genética

• La función de las proteínas depende de su secuencia, ya que ésta determina su estructura– Secuencia: codificada en los genes

• Se transmite de generación en generación• No es estable; sujeta a variaciones constantes

– Responsables en última instancia de la diversidad biológica y de la evolución de las formas de vida

– Algunas variantes moleculares presentan un funcionamiento erróneo

» Responsables de enfermedades hereditarias

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Proteínas Homólogas

• Son aquellas relacionadas evolutivamente• Normalmente realizan la misma función en

especies distintas• Presentan muchos residuos invariables en sus

secuencias– Los residuos invariables suelen ser importantes para

función– Entre los residuos variables existen distintos tipos

• Sustituciones conservativas (residuos cuyas propiedades son similares)

– Por ejemplo, Arg en vez de Lys, Asp en vez de Glu, Tyr en vez de Phe

• Sustituciones no conservativas (aparentemente aleatorias)– El análisis de la homología proporcionan información

filogenética

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Mutaciones

• Son variaciones en la secuencia de los genes. Podemos distinguir:– Mutaciones puntuales:

• Ejemplo: UCC UCA– Mutaciones silenciosas:

• Ambos codones UCC y UCA codifican para Ser– Mutaciones de cambio de sentido:

• UUU, Phe UUA, Leu; GAC, Asp CAC, His• De sentido equivocado, cuando cambian las

propiedades del nuevo aminoácido

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Mutaciones

– Mutación sin sentido:• UAC, Tyr UAA, Stop; GAG, Glu UAG, Stop

Origina una proteína más corta• Mutación de un codón de terminación, que origina

una proteína más larga de lo normal– Inserción:

• UGUUGGAGC UGUUCAGGAGC

– Deleción:• UGUUGGAGC UGUUGGC

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Desplazamiento de la Pauta de Lectura

137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 Posición

Thr Ser Lys Tyr Arg Stop Hb salvajeACG UCU AAA UAC CGU UAA GCU GGA GCC UCG GUA Deleción de U

ACG UCA AAU ACC GUU AAG CUG GAG CCU CGG UAGThr Ser Asn Thr Val Lys Leu Gln Pro Arg Stop Hb Wayne

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Herencia de Enfermedades Monogénicas

• En heterocigotos:– Enfermedades autosómicas

recesivas• La variante mutada no afecta al

funcionamiento de la variante normal

– Enfermedades autosómicas dominantes

• La variante mutada dificulta el funcionamiento de la variante normal

– Descendencia de heterocigotos:• ½ heterocigotos• ¼ homocigotos normales• ¼ homocigotos mutantes

Dos alelos para cada gen:

-> salvaje (normal)* -> mutante

Posibles combinaciones:

-> homocigoto salvaje* * -> homocigoto mutante

* -> heterocigoto

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* Incidencia máxima en algunas poblaciones

Adenosina desaminasa<1:100000Inmunodeficiencia

Huntingtina1:20000Enfermedad de Huntington

Fenilalanina hidroxilasa1:15000Fenilcetonuria

Distrofina1:10000Distrofia de Duchenne

Hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa1:10000Síndrome de Lesh-Nyhan

Hexosaminidasa A1:3000Enfermedad de Tay-Sachs

1-Antitripsina1:3500Enfisema

Canal iónico de cloruro (CFTR)1:2000Fibrosis quística

Receptor LDL1:500Hipercolesterolemia familiar

Cadena de la hemoglobina1:400-1000-Talasemia

Cadena de la hemoglobina1:400-800Anemia falciforme

Producto del gen implicadoIncidencia*Enfermedad

Algunas enfermedades Monogénicas y su Incidencia

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Enfermedades Vinculadas al Cromosoma X

• Cuando el gen responsable se encuentre en el cromosoma sexual X

– Si la mutación es transmitida a una mujer (XX) la enfermedad se manifiesta:

• En homocigosis para la variante mutada• En heterocigosis, sólo si es dominante

– Si la mutación es transmitida a descendientes varones (XY), se manifiesta siempre

– Ejemplo: hemofilia clásica• Deficiencia del factor de coagulación VIII• Enfermedad autosómica recesiva ligada al cromosoma X• Incidencia:

– 1 de cada 10,000 varones– Las mujeres pueden ser portadoras, pero no desarrollan la

enfermedad

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Enfermedades Vinculadas al Genoma Mitocondrial

• Las mitocondrias contienen su propio genoma (sólo 37 genes)

• Mayor frecuencia de mutaciones que en el cromosoma nuclear

– Debido a la mayor exposición a especies reactivas de oxígeno y a la escasa reparación

– Posible factor de envejecimiento. • Las mitocondrias son orgánulos citoplasmáticos

– Su herencia es sólo materna– Herencia monogénica de tipo no mendeliano

• Se verán afectados tanto los hijos como las hijas• Ejemplos:

– Neuropatía óptica hereditaria de Leber• Mutación puntual en la subunidad 4 de la NADH deshidrogena

– Epilepsia mioclónica• Mutación en la secuencia que codifica un tRNA mitocondrial

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Ejemplos de Enfermedades Congénitas: Hemoglobinopatías

• Genes de las cadenas de la hemoglobina– Distintos genes procedentes de un ancestro común:

• Cadenas : genes y 2, en el cromosoma 16• Cadenas : genes : G A, y , en el cromosoma 11

• Se expresan en momentos distintos del desarrollo del individuo

– Fase inicial del embrión: hemoglobina – Embrión en desarrollo: hemoglobina – Adulto: hemoglobina – Similitudes entre las cadenas

• Aminoácidos conservados:– Los importantes para la función (ligandos del Fe2+, residuos de la zona

de interacción entre subunidades)– Diferencias

• Distintas propiedades de unión y transporte de oxígeno• Adaptadas a las condiciones y necesidades fisiológicas

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Disociación de las subunidadesLeu→ProBibba

Disociación de las subunidadesPro→ArgSt. Lukes

Pérdida del grupo hemoHis→GlnSt. Etienne

Reduce el efecto Bohr (aumenta la afinidad por el O2)

His→AspHiroshima

Reduce la unión de 2,3-BPG (aumentala afinidad por el O2)

Gly→AspShepherds Bush

Favorece el estado “R” (aumenta la afinidad por el O2)Arg→HisSuresnes

Menor afinidad por O2. Se forma metahemoglobina (oxidación del Fe2+ a Fe3+)

His→TyrM. Iwate

Drepanocitosis (anemia falciforme)Glu→ValS

ConsecuenciaCambioPosiciónNombre

Mutaciones de las hemoglobinas humanas

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Anemia Falciforme

• Mutación GAG GUG (Cambio de Glu 6 en la cadena por Val)

• Se pierde una carga negativa y se gana hidrofobicidad• Formación de oligómeros sólidos fibrilares que modifican

la forma de los eritrocitos (“drepanocitosis”)– Obstrucción de capilares, inflamación, dolor– Rotura de eritrocitos anemia, susceptibilidad a infecciones– Supervivencia:

• Homocigotos– No alcanzan la madurez

• Heterocigotos– Sufren dificultades en el transporte de oxígeno– Supone una ventaja frente al paludismo

» Interrumpe el desarrollo del parásito de la malaria

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Talasemias

• Una o varias cadenas de la hemoglobina no son sintetizadas o se sintetizan en cantidad insuficiente, debido a:

– Uno o varios de los genes se han perdido.– Están presentes todos los genes, pero alguno se encuentra

mutado• Mutación sin sentido• Mutación de desplazamiento de la pauta de lectura (cadenas no

funcionales)– Mutación fuera de las regiones codificantes

• Bloqueo de la transcripción o un procesamiento inadecuado de los mRNA

• Existen muchos tipos de talasemia. La mayoría afectan a los genes de las cadenas y

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-Talasemias

• Pérdida o baja expresión del gen de la cadena – En homocigotos:

• Consecuencias muy graves• En niños se suple con cadenas fetales para

formar hemoglobina F ( 2- 2). No alcanzan la edad adulta

– Talasemias :• Leves• Síntesis no suprimida totalmente

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-Talasemia

• Existen dos copias funcionales del gen de , y

– Puede haber hasta 4 genes que codifiquen para la cadena

• Con una sola copia del gen– Baja cantidad de hemoglobina anemia

• Se compensa en parte por la formación de tetrámeros 4 en infantes (hemoglobina de Bart) y 4 (hemoglobina H) en adultos

– No responden a la transición alostérica (permanecen en estado R, de alta afinidad por el O2) ni presentan efecto Bohr

» La descarga de oxígeno en los tejidos es poco eficaz

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Amelogénesis Imperfecta

• Alteraciones en la maduración del esmalte debido a mutaciones en las amelogeninas

– Capa de esmalte anormalmente pequeña y débil– Fenotipos variados, debido a la variedad de

amelogeninas maduras• Alelos distintos en los cromosomas X e Y• Splicing y maduración proteolítica alternativos

– Se transcribe principalmente el alelo del cromosoma X• Herencia ligada al sexo

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Tema 29. Terapia Génica

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¿Qué es la Terapia Génica?

• Estrategia terapéutica que pretende reparar el daño asociado a una disfunción, de origen genético, de una determinada proteína

– Mediante la administración de una versión normal del gen que codifica dicha proteína

– O bien, bloqueando la expresión del gen responsable del daño

• Es válida tanto para enfermedades congénitas como para enfermedades adquiridas, como el cáncer, las enfermedades autoinmunitarias e infecciones víricas

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Requerimientos

• Conocimiento previo y con gran detalle de la patología a nivel molecular

• Aislamiento del gen o los genes responsables de la patología

• Disponibilidad de mecanismos de transfección eficientes

• Estado actual– En fase de desarrollo

• Dificultades técnicas• Reservas de tipo ético

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Conceptos Importantes

Transfección: Proceso de introducción del gen foráneo

Transgen: Gen transferidoCélula hospedadora: Célula que adquiere

el nuevo genVector: Vehículo de transmisión del gen

• Tiene que ser selectivo y eficiente en la transmisión

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Tipos de Transferencia

• Ex vivo– Transfección de células extraidas del paciente cultivadas in vitro,

y trasplante de nuevo en el paciente– Aplicado a células hematopoyéticas, fibroblastos, células

endoteliales, mioblastos y hepatocitos• Células encapsidadas

– Células heterólogas transgénicas e inmortalizadas– Permeabilidad selectiva

• Protegen del sistema inmunitario• Permiten la salida de las proteínas expresadas• Ejempols: fibroblastos capaces de secretar la hormona del

crecimiento, o células de pituitaria productoras de insulina.• Transferencia in vivo

– Transferencia directa sobre los tejidos implicados, utilizando Liposomas o vectores víricos

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Vectores Retrovirales• Virus de RNA modificados

– Reconocidos por receptores de la membrana celular– Modificados: no pueden completar su ciclo infectivo – Genoma de RNA, retrotranscrito (RNA →cDNA) e integrado en

el genoma celular• Estable. Expresado por la propia célula hospedadora

• Limitaciones– Necesita receptores adecuados en la células hospedadoras– Sólo puede integrar segmentos pequeños de DNA (hasta 8 Kb)– Las células han de encontrarse en proceso de división para

poder integrar el transgen en su genoma– Riesgos de sobrexpresión crónica del transgen– Riesgo de mutacionales asociadas a su utilización.

• Ventajas– Integración permanente del transgen (buena elección en el caso

de enfermedades congénitas)

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Vectores Adenovíricos• Virus aislados de adenoides humanos

– Delecionados en regiones indispensables para su replicación– Reconocen receptores de la superficie celular y penetran por

endocitosis– Su genoma permanece extracromosómico

• Ventajas– Pueden integrar DNA de gran tamaño (hasta 38 Kb)– Seguros

• Anteriormente utilizados en vacunas sin problema– Reconocen gran variedad de células– Elevada eficacia de transfección.

• Inconvenientes– Suelen generar respuestas inmunológicas– Su construcción es compleja– La expresión del transgen desaparece con el tiempo

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Otros Mecanismos de Transfección

• Liposomas (lipofección)– El transgen es introducido en vesículas de lípidos

aniónicos o complejado con lípidos catiónicos– Entrada en la célula por fusión de estas vesículas con

la membrana plasmática– Proceso sencillo, pero de muy baja eficiencia y

selectividad• Métodos físicos, de baja efectividad

– Electroporación– Bombardeo con micropartículas unidas a DNA