Curs Teòric-Pràctic Bàsic de Citometria de Flux 2010 · 2 Curs Teòric-Pràctic Bàsic de...

1

Curs Teòric-Pràctic Bàsic de Citometria de Flux 2010


Aquest és un curs Teòric-Pràctic....i com que ja heu vist la teoria ara farem pràctiques. El programa de les pràctiques serà el següent:

• El citòmetre. Presentació de l'equip.• Engegar el Citòmetre.• Crear un document.• Adquirir mostra i guardar-la.• Compensar.• Cicle Cel·lular.• Apagar el citòmetre.

2


UCTS – Plataforma de Citòmica

En el nostre servei, disposem de 2 citòmetres FacsCalibur de BD. Els citòmetres de què disposem tenen com a font llumínica 2 LASERS.

• LASER Blau que emet llum a 488nm de longitud d'ona.• LASER Vermell que emet llum a 633nm.

Detecció de 4 fluorescències simultàniament.


Què hem de tenir en compte?

• Quins fluorocroms volem mesurar?• Quins fluorocroms podem mesurar?• Quants en volem mesurar alhora?• Com interaccionen entre ells?

Aquesta és la configuració òptica del FacsCalibur. Això ens determina quins fluorocroms podem usar i com els podem combinar. Els filtres que hi ha davant els detectors són fixes de manera que no podem canviar-los per d'altres que potser ens serien més útils.

3


Quins fluorocroms podem detectar en el FacsCalibur? Quins podem combinar?

• FL1(530/30): Fitc, Alexa 488, EGFP• FL2 (585/42): PE, PI• FL3 (670LP): PerCp, PI, 7AAD, PE-Alexa700• FL4 (661/16): APC, Alexa 647

Aquest són uns exemples de fluorocroms que podem detectar. Podem combinar fluorocroms que es detectin amb diferent detectors.


El citòmetre

Líquid d’arrossegament

Waste

Pressió

Controlador del Carrussel

Zona de mostreig

4


FuncionamentEl primer que hem de fer és comprovar que el tanc del líquid d'arrossegament està ple i que el tanc de les deixalles, del waste, està buit. Aleshores engeguem el citòmetre prement el botó dret situat a la part lateral dreta del citòmetre.

Una vegada fet això retirem la tapa de la zona de mostreig i tirem el tub amb aigua que hi ha. Deixem la palanca totalment cap a la dreta Activem el sistema de pressions tibant de la palanca, situada entre els tancs de waste i de líquid d'arrossegament, cap a un mateix.

Agafem un carrusel i posem en la posició 39 un tub amb uns 4ml de solució rentadora i en la posició 40 un tub amb uns 4ml d'aigua destil·lada. Situarem les nostres mostres a partir de la posició 1 i col·locarem el carrusel a la zona de mostreig. Posarem la tapa.


FuncionamentA la part frontal dreta del citòmetre tenim una sèrie de botons que ens serviran per controlar el pas de mostra.

Controla la velocitat de pas de la mostra.Low-Med-High. A Low tindrem una resolució major, amb CV més baixos

Controla el pas de mostra.Run: Adquireix mostraStandBy: No adquireix mostraPrime: Serveix per eliminar bombolles i per netejar la cámara de flux.

Cliquem sobre Prime. Quan el citòmetre torni a estar en StandBy repetim el procés 2 vegades més. Per poder adquirir mostra cal que al citòmetre estigui activada la opció Run. Una vegada en aquesta pas per controlar quina mostra adquirim i començar a adquirir cal que activem el controlador manual del carrusel.

5


Activem el controlador. En el controlador del carrusel tenim 4 botons que ens serveixen per controlar el carrusel.

Ens permet girar el carrusel i escollir aixíquina mostra adquirirem

Puja i baixa el tubPer agitar la mostra

Quan tinguem clar quina mostra volem passar pugem el tub. Cal que el citòmetre estigui en estat “RUN”


FuncionamentEngeguem l'ordinador. Ens apareixerà una pantalla d'identificació on posarem el nostre nom d'usuari i paraula clau de la xarxa de recerca. Una vegada fet això entrarem a la nostra sessió.

Abans de fer res esperarem que la icona del citòmetre que fa pampallugues a la part inferior desaparegui.

Això ens indicarà que el Citòmetre i l'ordinador s'han reconegut. En cas que no desaparegui seguirem el procediment escrit en l'ajuda per aquests casos.

Una vegada hagi desaparegut clicarem sobre la icona del programa CellQuest Pro, que és el programa que ens serveix per controlar el citòmetre. Anirem al menú "Acquire " i clicarem sobre la opció "Connect to the Cytometer".

6


Una vegada cliquem sobre “Connect to the Cytometer” ens apareixerà una nova finestra, el “Browser”.

En aquesta finestra podrem definir on volem guardar les dades que obtinguem, com les volem anomenar, podrem afegir informació diversa i també ens serveix per controlar l’adquisició de dades. La part que més ens interessa és la que està marcada.

Mentre el SetUp estigui marcat no gravarem la mostra, només veurem les dades que analitza el citòmetreperò no les guardarem. Per guardar les dades cal que el SetUp estigui desmarcat.Per adquirir mostra cliquem sobre el botó “Acquire”. Una vegada clicat es canviarà per la opció “Pause”.

És important entendre que l’únic que controlem amb el Browser és l’adquisició de dades del citòmetre, no l’adquisició de mostra. Encara que cliquem “Pause” o no cliquem “Acquire”, si la mostra està passant pel citòmetre, continuarà passant!!!!!.


Per anomenar la mostra tenim diverses opcions. Si cliquem sobre “File: Change…” del Browser ens apareix una altra finestra amb les diferents opcions:

A “File Name Prefix” ens permet escollir quin prefix li posarem al nom. Podem escollir “Custom Prefix” i llavors posarem el prefix que volem a la zona destinada per això. També podem escollir “Sample ID” i aleshores posarem el prefix que volem en el Browser, a l’apartat “Sample ID”.

A “File Name Sufix” ens permet escollir el sufix. Des de l’UCTS us recomanem que mantingueu el prefix constant i com a sufix escolliu la opció “File Count”, de manera que totes les mostres s’anomenaran igual però tindran un número diferent com a sufix. Per exemple:

•Data.001•Data.002•Data.003•Data.004

7


Finalment a la part dreta del Browser trobem una opció que es diu “Untitled Parameter Settings”. Aquíens apareix la llista de paràmetres que tenim amb la opció de posar-los una etiqueta, un nom. Aquest nom pot ser el que nosaltres vulguem o si cliquem sobre les fletxetes ens apareix un desplegable amb etiquetes ja predefinides entre les que podrem escollir.

La principal recomanació que us fem des de l’UCTS és que poseu el nom que poseu indiqueu sempre quin detector esteu usant. No seria la primera vegada que s’etiqueta malament un paràmetre i dóna lloc a resultats erronis…


Els altres menús-finestres que ens ajudaran a controlar el citòmetre i a adquirir la mostra els trobem al menú Cytometer i són:

•L’Status ens informa de si el citòmetre està llest per treballar o no. Mentre no passem mostra ha d’estar en Standby i quan passem mostra ha d’estar en Ready.•El Threshold ens permet indicar al citòmetre un llindar en alguna de les senyals. Així doncs, qualsevol event que no assoleixi aquest llindar no serà analitzat pel citòmetre. Això ens permet eliminar restes cel·lulars de la mostra o analitzar només una determinada població. Generalment treballem amb el Threshold al FSC-H, però en el cas per exemple del cicle cel·lular s’acostuma a treballar amb el Threshold en el canal de la fluorescència corresponent al marcatge de DNA.•El Detectors/Amps ens permet controlar els voltatges dels diferents detectors, decidir si volem treballar en escala linial o logarítmica. També ens serveix per engegar o apagar el LASER Vermell (Four Color) i activar així l’FL4-H i també ens permet escollir en quin paràmetre volem el DDM, o mòdul discriminador de doblets.•Finalment, el Compensation ens permet compensar la senyal entre els diferents detectors.

8


Crear plantillaUna plantilla és el document amb els gràfics i finestres necessaris per adquirir i analitzar la nostra mostra. Per crear una plantilla ens valdrem de les icones que apareixen a la dreta. Cliquem sobre la icona del tipus de gràfic que volem i cliquem sobre la zona del document on el volem crear. Per defecte, el programa el crea com a gràfic d'anàlisi. Aquest tipus de gràfic només ens serveix per analitzar mostres que ja tenim, que ja hem gravat. A nosaltres ens interessen gràfics que ens permetin adquirir mostres. Per això seleccionarem el gràfic i en el menú "Inspector" a la primera opció marquem Acq<analysis.


Crear plantillaAra crearem una plantilla per adquirir mostra. En aquest cas adquirirem boles fluorescents per aprendre a compensar. Crearem gràfics per compensar. Necessitem un gràfic de FSC-H / SSC-H i un gràfic enfrontant els diferents paràmetres que volem compensar (FL1-H; FL2-H; FL3-H; FL4-H). Recordeu que per tenir actiu FL4-H cal activar la opció Four Color.

9


Crearem una regió-gate al gràfic FSC-H/SSC-H per escollir la població d’interès. Per això clicaremsobre la icona marcada en la barra d’eines “Palette” i sobre el gràfic on tenim la població d’interès per englobar-la. En els altres gràfics direm que només volem veure aquesta població. Per això seleccio-narem els gràfics i a l’Inspector, a la opció Gate seleccionarem la Gate 1.


Com que el que volem és compensar el que farem serà afegir quadrants als gràfics de fluorescències i traurem les estadístiques per veure si compensem bé o no. Per afegir quadrants seleccionem el gràfic, cliquem sobre la icona de quadrant de la Palette i cliquem sobre el gràfic on volem situar el quadrant. Una vegada creat el quadrant anem al menú “Stats” i escollim la opció “Quadrant Stats”.

10


Començarem per passar unes boles que no presenten cap mena de fluorescència. Són negatives per a tots els fluorocroms. Així doncs modificarem el voltatge dels detectors de manera que en el gràfic FSC-H/SSC-H ens quedi la població més o menys centrada i la puguem englobar bé amb la regió que hem creat i a la resta de gràfics farem que la població es situï a la part inferior esquerra, que es correspon a la zona negativa. Ens fixem en les estadístiques. Ens interessa el valor de la “Mean” per als dos eixos. Les sigles UL (UpperLeft), UR (UpperRight), LL (LowLeft), LR (LowRight) ens indiquen de quin dels quadrants estem obtenint les dades. En aquest cas la població és negativa per als dos eixos.


La següent mostra és una barreja de boles negatives, com les d’abans i unes que presenten fluorescència per a una de les fluorescències, en aquest cas FITC, que el detectem en FL1-H. Com veieu en el primer gràfic la fluorescència del FITC la detectem tan a FL1-H com a FL2-H. Això és perquè hi ha una part de l’espectre d’emissió del fluorocrom que es troba dins el rang en què detectem FL2-H. El que volem és tenir només senyal a FL1-H, per això compensem la senyal fins que les “Mean”de la població doble negativa i de la població positiva per a FL1-H siguin igual per a l’eix de les Y, per a FL2-H. Farem el mateix per a la resta de paràmetres i fluorescències.

11


En el següent cas el que farem serà fer una plantilla per fer anàlisi de DNA, ja que és una de les aplicacions que més es fa servir. Necessitem un gràfic de FSC-H/SSC-H i diferents gràfics de la fluorescència de la sonda de DNA que tinguem. En aquest cas tenim PI, que el detectem en l’FL2 principalment. També es pot detectar en FL3, però ens queda més lluny del màxim d’emissió del PI.Cal que el paràmetre FL2 estigui en escala lineal ja que les diferències de fluorescència que volem detectar són petites. També necessitem que el DDM estigui en el canal del PI, en FL2, i necessitem que la opció de “Four Color” estigui desactivada.

Els gràfics que necessitem són, a part del FSC-H/SSC-H:

•FL2-A/FL2-W: aquest gràfic ens servirà per eliminar els agregats. Cal pensar que dues cèl·lules que estiguin en G1 que passin juntes davant del laser tindran la mateixa intensitat de senyal que una sola cèl·lula en G2!! La manera de poder discriminar els agregats és usant l’amplada de la senyal, que ens dóna informació de quan triga una cèl·lula determinada en passar davant del laser. Si tenim dues cèl·lules que passin juntes trigaran més en passar que una de sola.•FL2-H: El necessitem per assegurar-nos que no estem perdent senyal.•FL2-A: Aquest histograma ens donarà el perfil de contingut de DNA que haurem d’analitzar per estudiar el cicle.


Així és com hauria de quedar la plantilla. Com aconseguim discrimar els doblets i ajustar els diferents paràmetres?.

Modificant el voltatge de FL2 modifiquem tots els paràmetres que depenen de FL2. Modificant l’”AMP Gainde FL2 modifiquem només FL2-H. Si modifiquem l’AMPGain de FL2-A i FL2-W només afectarà a aquests paràmetres.

12


També hem de tenir en compte el threshold. Generalment situem el threshold en el FSC però quan fem cicle cel·lular s’acostuma a situar en el paràmetre que estem fent servir per mesurar el DNA, en aquest cas FL2-H.

També hem de tenir en compte el threshold. Generalment situem el threshold en el FSC però quan fem cicle cel·lular s’acostuma a situar en el paràmetre que estem fent servir per mesurar el DNA, en aquest cas FL2-H. És per això que cal que tinguem visible un gràfic de FL2-H ja que serà aquest el que ens dirà si estem perdent senyal o no.

Però....on situem la mostra? El que acostumem a fer és situar el pic de G1 a 200, de manera que G2 el trobarem sobre 400 i encara tindrem escala per si tenim cèl·lules amb major contignut de DNA i que vulguem analitzar.


El que molta gent fa aleshores és crear uns marcadors sobre el gràfic acotant les diferents fases i treure els estadístics. Menú “Stats” – “Histogram Stats”.

Així tindrem els estadístics de les diferents fases.....aproximadament. Aquest mètode d’anàlisi no és molt acurat i ens dóna errors. De la mateixa manera, si tenim a la nostra mostra dues poblacions amb diferent contingut de DNA no podrem fer l’anàlisi. El què cal és agafar les dades que hem obtingut i analitzar-les amb un programa que ens permeti descompondre el perfil del contingut de DNA. Per exemple l’FCS Express amb la opció del Multicycle, com veurem a la part de software.

13


Procediment per apagar el citòmetre

Per apagar el citòmetre cal preparar un tub de citometria amb 4 ml de solució rentadora i un tub de citometria amb 4 ml d’aigua destil·lada, i col·locar-los a les posicions 39 i 40 del carrusel, respectivament. Tot seguit, col·loqueu el carrusel a la zona de mostreig.

A continuació, obrir l’aplicació “LoaderManager” situada al Dock-Menú.

A l’obrir l’aplicació, una vegada ha comprovat que has col·locat el carrusel, s’obre una finestra amb un únic botó que diu “Mainteinance”. En clicar aquesta opció, apareix una altra finestra amb diverses opcions de neteja: “Long clean” i “Short clean”. Clicar la primera opció si heu passat més de 10 mostres o bé si heu passat mostres tenyides amb colorants vitals (Iodur de Propidi, 7AAD). En qualsevol altre cas escolliu la segona opció.

LoaderManager



A l’obrir l’aplicació, una vegada ha comprovat que has col·locat el carrusel, s’obre una finestra amb un únic botó que diu “Mainteinance”. En clicar aquesta opció, apareix una altra finestra amb diverses opcions de neteja: “Long clean” i “Short clean”. Clicar la primera opció si heu passat més de 10 mostres o bé si heu passat mostres tenyides amb colorants vitals (Iodur de Propidi, 7AAD). En qualsevol altre cas escolliu la segona opció. Una vegada escollida la opció adient, cliqueu sobre l’opció “Run” i tot seguit, “Run”, altra vegada.

14



A continuació, a la part inferior dreta de la pantalla apareix una finestra on s’explica que el procediment de neteja està en curs. Finestra que desapareix una vegada s’hagi finalitzat el procés de neteja, tornant a la finestra anterior on apareixien les opcions de neteja. Clicar sobre l’opció “Done”. Una vegada cliquem en l’opció “Done”, reapareix la finestra amb l’opció “Mainteniance”. Això vol dir, que hem aconseguit acabar exitosament el procés de rentat!!!



Ara només cal tancar l’aplicació “LoaderManager”, per fer-ho cal anar al menú principal, opció“LoaderManager” i clicar damunt l’opció “Quit LoaderManager”.

Tot seguit, retirem la tapa de la zona de mostreig, traiem el carrusel, llencem els tubs que contingui el carrusel. Agafem un tub nou, l’omplim d’aigua destil·lada (uns 3 ml, no l’ompliu fins dalt!!), el col·loquem a la zona d’adquisició de mostra i tanquem la palanca. Situem el citòmetre en velocitat “Low” i en estat de “Standby”.

Low

Standby

15

Procediment per apagar el citòmetreApaguem la unitat controladora del carrusel.

Apaguem el citòmetre (botó verd del lateral dret). Abans d’apagar l’ordinador, cal apagar també el programa “CellQuest Pro” (i qualsevol programa que estigui obert!!!). Anant al menúprincipal del programa, clicant sobre l’opció “Quit CellQuest Pro” del menú desplegable de l’opció “CellQuest Pro” del menú principal.


Procediment per apagar el citòmetreA continuació, cal treure la pressió l’equip, per això cal tirar de la palanca de la pressió cap a enrere. Omplir el tanc del líquid d'arrossegament amb FacsFlow fins a la marca (amb ajuda d’una proveta i d’un embut) i tancar-lo bé. Buidar el tanc de les desfets i afegir-hi 100ml de la solució de rentat (atenció!!! Conté Lleixiu!!!), no cal roscar completament el tap.

Si us plau, manteniu el citòmetre i la zona del laboratori, el més neta i ordenada possible.


Curs Teòric-Pràctic Bàsic de Citometria de Flux 2010 · 2 Curs Teòric-Pràctic Bàsic de...

Documents

Transcript of Curs Teòric-Pràctic Bàsic de Citometria de Flux 2010 · 2 Curs Teòric-Pràctic Bàsic de...