Curs d’Especialista Universitari en...

Mòdul 8.1. Seqüenciació de proteïnes.Mètodes de determinació de l’estructura primària de proteïnes.

Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica

Febrer 2007

Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 2

¿Qué información queremos saber de las proteínas?

Función

Regulación de la función

Estructura

Niveles estructurales

Secuencia


http://www.rcsb.org

http://www.rcsb.org/


http://www.rcsb.org/pdb/




http://www.rcsb.org/pdb/http://www.rcsb.org/pdb/


http://www.rcsb.org/pdb/statistics/holdings.do

http://www.rcsb.org/pdb/statistics/holdings.do


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/


NCBI Entrez Nucleotide

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide&itool=toolbar


Métodos de secuenciación de proteínasMÉTODOS TRADICIONALES: propiedades

químicas de las proteínas

MÉTODOS ACTUALES: conocimientos del flujo de información

biológica, aplicación de nuevas técnicas de determinación químicas, …)


Seqüenciació i microseqüenciació de proteïnes

1. Introducció.1.1. Generalitats i aproximació històrica a la seqüenciació de

proteïnes.1.2. L’enllaç peptídic. Estructura primària de les proteïnes.

2. Etapes de la seqüenciació de proteïnes.3. Passes prèvies a la seqüenciació.

3.1. Determinació del nombre de subunitats.3.2. Ruptura i determinació del nombre de enllaços disulfur.3.3. Anàlisis de la composició en aminoàcids.

4. Mètodes de seqüenciació de pèptids.4.1. Mètodes de fragmentació de proteïnes.4.2. Mètodes de determinació de la seqüència de pèptids.

5. Etapes finals a la seqüenciació de proteïnes.5.1. Determinació de la posició dels enllaços disulfur.5.2. Determinació de la seqüència completa.

6. Microseqüenciació de proteïnes. Noves estratègies.


1.1. Generalitats i aproximació històrica a la seqüenciació de proteïnes.

1953 El grup de Frederick Sanger va determinar la seqüència de la Insulina Bovina.

– Insulina Bovina: proteïna polipeptídica de 51 aa, amb dues cadenes de 21 aa i 30 aa, amb 3 ponts disulfur (2 intercatenarisi 1 intracatenari).

– Important no només per la seqüenciació de la insulina sinótambé per la demostració de l'existència d'una seqüència única per a cada proteïna.

‘Seqüenciades’ més de 3.000.000 de proteïnes diferents.

Llocs de Internet: National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)Brookhaven Protein Data Bank (http://www.rscb.org)

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/http://www.rscb.org/


1.1. Generalitats i aproximació històrica a la seqüenciació de proteïnes.

Es requereix per conèixer els mecanismes moleculars d'acció i pels estudis de difracció de raigs X alhora de determinar l'estructura.

Per comparar seqüències de proteïnes anàlogues del mateix individu, entre membres d'una mateixa espècie i entre espècies diferents.

Aplicacions clíniques en el cas de les malalties d'origen hereditari on es donen mutacions que produeixen canvis en la seqüència d'aminoàcids.

Més de 100 g de la proteïna purificada, deu anys per aconseguir la seqüència completa.

Ara fan falta només uns micrograms de proteïna purificada i la seqüenciació es pot realitzar amb unes setmanes.

Fita important 1978 seqüenciació de la β-galactosidasa proteïna de 1021 aa.


1.2. L’enllaç peptídic. Estructura primària de les proteïnes.

α

α

α

α

+

Glicina (Gly, G)

NC

C

O

O

H

H

H

H H

+-

+

Alanina (Ala, A)

NC

C

O

O

H

H

H

C H

H

H

H

+-

NC

H

NC

C

OH

H

H

H H

C

O

O

H

H

H

H

-

GlicilalaninaEnllaç peptídic

+ HO H

Aigüa

Primària: seqüència d’aminoàcids i ponts disulfur

Secundaria: disposició espacial de la cadena lateral dels aminoàcids

Terciària: estructura tridimensional de tota la cadena de aminoàcids

Quaternària: agrupacions de polipéptids o subunitats per a formar una proteïna


2. Etapes de la seqüenciació de proteïnes.

Purificació de la proteïna

1) Preparació de les proteïnes per a la seqüènciació.

2) Seqüenciació de les cadenes polipeptídiques.

3) Organització de l’estructura completa.



Purificació de la proteïna

Obtenció de la mostra (si pot esser enriquida amb la proteïna)

Precipitació amb sals (NH4)2SO4

Dessalat

Cromatografia líquida: intercanvi iònic, hidrofòbic, cribatge molecular, afinitat, etc.


Cromatografia de cribatge molecular


Cromatografia de intercanvi iònic


FPLC™Amersham



1) Preparació de les proteïnes per a la seqüenciació.

a)Determinació del nombre de cadenes polipeptídiquesdiferents (subunitats) existents a la proteïna,

b)Ruptura dels enllaços disulfur si n’hi ha.

c) Separació i purificació de les subunitats,

d)Determinació de la composició aminoacídica de les subunitats.







a)Fragmentació de les subunitats individuals en punts específics.

b)Separació i purificació dels fragments.

c) Determinació de la seqüència aminoacídica de cada un dels fragments peptídics.

d)Repetició de l’etapa 2(a) amb un procés de fragmentació d’especificitat diferent.







a)Solucionar el trencaclosques

b)Si n’hi ha esbrinament de les posicions dels enllaços disulfur.


2. Etapes de la seqüenciació de proteïnes


a)Determinació del nombre de cadenes polipeptídiquesdiferents (subunitats) existents a la proteïna,

b)Ruptura dels enllaços disulfur si n’hi ha.

c) Separació i purificació de les subunitats,

d)Determinació de la composició aminoacídica de les subunitats.




3. Passes prèvies a la seqüenciació3.1. Determinació del nombre de subunitats

• Determinació del residu N-terminal d’una proteïna i del número de cadenes peptídiques– Dansil Clorur– Reacció de Sanger (Dinitrofluorobenzè, DNF)

• Determinació del residu C-terminal d’una proteïna.– Hidrazinòlisis (Hidrazina)– Exopeptidases


Determinació del residu N-terminal d’una proteïna.Dansil Clorur

N

SCl

OO

(CH3)2

+ NH2 CH C NH CH CR1 O R2 O

NH ...

Dansil Clorur

Polipèptid

OH-HCl

N

S OO

(CH3)2

NH CH

C NH

CH

C

R1 O R2 O

NH ...Polipèptid dansilat


Determinació del residu N-terminal d’una proteïna.Dansil Clorur

N

S OO

(CH3)2

NH CH

C NH

CH

C

R1 O R2 O

NH ...Polipèptid dansilat

H+

N

S OO

(CH3)2

NH CH

C OH

R1 O

Aminoàcid dansilat

CH

C

R2 O

OHNH3 ...+ + + CH CR3 O

OHNH3+ +

Aminoàcids lliures


CromatografCromatografííaa

Acetato n-butiloMetanolÁcido acético (75:25:2)

Ácido fórmico 2%


Cis Cys Tau

AspGlu

Ser

Gln Asn

ArgHys

Thr

HypGly

AlaProValNvaLeu+Ile

Lys Phe Met

OrnTrp

Tyr

1

2

VisualizaciVisualizacióón y n y contajecontaje


Determinació del residu N-terminal d’una proteïna.Reacció de Sanger

2,4-dinitrofluorobenzè (DNF)

F

NO2

O2N + CH CR O

NH2OH-

CH

C

R O

NH

NO2

O2N + H+

F+

DNF Aminoàcid DNF-aminoàcido


Determinació del residu C-terminal d’una proteïna.Hidrazinòlisis

ExopeptidasesExopeptidases

...Polipèptid

HN CH

C NH

CH

C

R O Rn O

O-

NH2 NH2 H++

Hidrazina

+...

CH

C

R O

NHNH2H3N+

+ H3N CH CRn O

O-

CH

C

R1 O

NHNH2H3N+

+

Derivats de Hidrazina

Residu C-terminal lliure

(Carboxipeptidasa A pancreàtica, Carboxipeptidasa Y de llevats)


3. Passes prèvies a la seqüenciació3.2. Ruptura dels enllaços disulfur

H3N C COOCH2

H

SH

+ -

H3N C COOCH2

H

SH

+ -

CisteïnaCysC

Oxidació

Reducció

+ -

H3N C COOCH2

H

S

H3N C COOCH2

H

S

+ -

CistinaCis

Enllaçdisulfur + H

+2 + e-2

Àcid perfòrmicβ-mercaptoetanol


Oxidació amb Àcid perfòrmic

NH

CH

CCH2

S

NH

CH

CCH2S

O

O

H CO

OOHÀcid perfòrmic

Pont disulfur

NH

CH

CCH2SO3

O

NH

CH

CCH2

SO3O

-

-

Àcid cisteic


Oxidació amb β-mercaptoetanol

NH

CH

CCH2

S

NH

CH

CCH2S

O

O

Pont disulfur

+ SH CH2

CH2OH2( )

NH

CH

CCH2SH

O

NH

CH

CCH2

SHO

+ S CH2

CH2OHS C

H2CH2OH

NH

CH

CCH2SH

O +ICH2COO

Acetat de IodeCys

SCH2COO

NH

CH

CCH2O

+ H+ I+

Residu de δ-carboximetilcisteïna

Valoració amb acetat de Iode


3.3. Anàlisis de la composició en aminoàcids.

Hidròlisis àcida: HCl 6 N, al buit, 10 i 100 h a 100-120ºC. Problemes amb aminoàcids alifàtics: Val, Leu i Ile, més temps

de reacció.Problemes en la cadena lateral: Ser, Thr i Tyr.Trp es destrueix quasi totalment.Gln i Asn. Glx (= Glu + Gln), Asx (= Asp + Asn) i NH4+ (= Gln

+ Asn).

Hidròlisis bàsica: NaOH 2-4 N, 100ºC durant 4-8 h.Descomponen Cys, Ser, Thr i Arg.S’utilitza per determinar el Trp.

Hidròlisis enzimàtica

Per simplificar es convenient separar y purificar les diferents cadenes polipeptídiques que constitueixen la proteïna.Hidròlisis dels enllaços peptídics


Mètode de la ninhidrina

C

CC

O

O

OH

OH+ NH2 CH

R

COOH

C

CC

O

O

H

OH+ NH3 CO2 R CHO+ +

1. Descarboxilació oxidativa dels aminoàcids i la producció de ninhidrina reduïda, amoníac y diòxido de carboni.


Mètode de la ninhidrina

2. La ninhidrina reduïda reacciona amb més ninhidrina i amb elsaminoàcids alliberats.3. S’obté un complex de color blau (λmax = 570 nm).

C

CC

O

O

OH

OH+ N

H

H H C

CC

O

O

H

OH+

C

CC

O

O

C

CC

O

O

N

Aminoácido Color producido His Marrón Phe Marrón/gris Gly Azul Glu Azul brillante Lys Gris/azul Tyr Gris Pro Naranja Hyp Naranja Asp Naranja/amarillo


TLC (ninhidrina)


Mètode del o-ftalaldèhid.

C

C

O

O

HH + NH2 CH

R

COOH + CH3CH2SH N CH

S CH2

CH3

COOH

R

o-Ftalaldèhid Aminoàcid -Mercaptoetanolβ

β-Mercaptoetanol: Reductor fort. pH: 9-11Producte fluorescent (excetació λ: 340 nm, emissió λ: 455 nm)Pro, Hyp tractament prèvi.Cys i Cis: oxidació a àcid cistèic.


Analizador automAnalizador automáático de aminotico de aminoáácidoscidos





a)Fragmentació de les subunitats individuals en punts específics.

b)Separació i purificació dels fragments.

c) Determinació de la seqüència aminoacídica de cada un dels fragments peptídics.

d)Repetició (!!) de l’etapa 2(a) amb un procés de fragmentació d’especificitat diferent.



4. Mètodes de seqüenciació de pèptids.4.1. Mètodes de fragmentació de proteïnes.

Com a màxim fragments de 60-70 aminoàcids

Mètodes químics.Bromur de cianogen (Met)

Mètodes enzimàtics (endopeptidases).Enzims del tracte intestinal, de bactèries


Enzims

Enzim Procedència Especificitat Observacions

Tripsina Pàncreas boví Rn-1 = restes carregats positivament: Arg, Lys Rn no pot ser Pro

Molt específic

Quimotripsina Pàncreas boví Rn-1 = restes hidrofòbics voluminosos: Phe, Trp, Tyr Rn no pot ser Pro

És més lent quan Rn-1 = Asn, His, Met, leu

Elastasa Pàncreas boví Rn-1 = restes neutres petits: Ala, Gly, Ser, Val Rn no pot ser Pro

Termolisina Bacillus thermoproteolyticus

Rn-1 = Ile, Met, Phe, Trp, Tyr, Val Rn no pot ser Pro

Estable tèrmicament Rn = Ala, Asp, His, Thr

Pepsina Mucosa gàstrica bovina

Rn-1 = Leu, Phe, Trp, Tyr Rn no pot ser Pro

Poc específic, pH òptim = 2

Endopeptidasa Staphylococcus aureus

Rn-1 = Glu


Tripsina

Lys

+NH3

CH2

NH

CH

CCH2CH2

O

CH2

NH

CH

CCH2CH2

O

CH2NHCNH

NH2+

Arg

Enllaç hidrolitzat per la Tripsina

Tractament de la Lys amb anhídrid citracònic

NHCHCH2CH2CH2CH2NH3C O

+ +C

CO

CH3O

O

Lys Anhídrid citracònic

NHCHCH2CH2CH2CH2NHC O

C

OOC CH3

O


4.2. Mètodes de determinació de la seqüència de pèptids.

• Mètode de Sanger (dinitrofluorobenzè DNF)• Mètode d’Edman (fenilisotiocianat PITC)• Seqüenciadors automàtics

Cicle de dues etapes bàsiques:1) Reacció del pèptid amb un reactiu determinat2) Hidròlisi suau per alliberar l’aminoàcid que ha reaccionat

Curs Especialista Universitari en Bioinformàtica

MMèètodetode de de SangerSanger ((dinitrofluorobenzdinitrofluorobenzèè DNF).DNF).

DNF-aminoàcido 1Identificar

CH

C

R2 O

NH2 CHC

R3 O

NH

Pèptid amb n-1 aa

CH

C

R1 O

NH2 CHC

R2 O

NH

CH

C

R3 O

NH

Pèptid amb n aa

DNF-aminoàcido 2Identificar

CH

C

R3 O

NH2

Pèptid amb n-2 aa

CH

C

R1 O

OHNH

NO2

O2N

F

NO2

O2N

DNF

CH

C

R2 O

OHNH

NO2

O2N

F

NO2

O2N

DNF

Curs Especialista Universitari en Bioinformàtica

MMèètodetode dd’’Edman (fenilisotiocianat PITC).Edman (fenilisotiocianat PITC).

CH

C

R2 O

NH2 CHC

R3 O

NH

Pèptid amb n-1 aa

N C S + CH CR1 O

NH2 CHC

R2 O

NH

CH

C

R3 O

NH

PolipèptidFenilisotiocianat

OH-

CH

C

R1 O

NH

CH

C

R2 O

NH

CH

C

R3 O

NH

N C

S

¨ ...

...

Polipèptid Feniltiocarbamilo (PTC)

¨

HF anhidro

...+N

CS

CCHOR1

NH

Derivat de tiazolinona

H+

NC

NCCH

OR1

SAminoàcid feniltiohidantoïna (PTH)


Seqüenciadors automàticsVas giratori Fase sòlida (fase gasosa)

NH2

Aminopolistireno

O SiO

OCH2

CH2

CH2

NH2

Vidre de 3-amino-propil


Seqüenciadors automàtics



1) Preparació de les proteïnes per a la seqüenciació.



a)Solucionar el trencaclosques

b)Si n’hi ha esbrinament de les posicions dels enllaços disulfur


Oxidació amb β-mercaptoetanol

NH

CH

CCH2

S

NH

CH

CCH2S

O

O

Pont disulfur

+ SH CH2

CH2OH2( )

NH

CH

CCH2SH

O

NH

CH

CCH2

SHO

+ S CH2

CH2OHS C

H2CH2OH

NH

CH

CCH2SH

O +ICH2COO

Acetat de IodeCys

SCH2COO

NH

CH

CCH2O

+ H+ I+

Residu de δ-carboximetilcisteïna

Valoració amb acetat de Iode


Exemple: la Insulina (I)

Àc. perfòrmic


Exemple: la Insulina (II)


Exemple: la Insulina (III)


Exemple: la Insulina (IV)


Métodos de secuenciación de proteínasMÉTODOS TRADICIONALES: propiedades

químicas de las proteínas

MÉTODOS ACTUALES: conocimientos del flujo de información

biológica, aplicación de nuevas técnicas de determinación químicas, …)



Mètode tradicionalPurificació proteïna

Fragmentació

Seqüenciació proteïna

Seqüència proteïna

Mètode actualPurificació gen

Fragmentació

Seqüenciació ADN

Seqüència ADN

Seqüència proteïna

Codi genCodi genèètictic



Flux d’informació


6. Microseqüenciació de proteïnes. Noves estratègies

Tècniques de l’ADN recombinant

Mètodes de seqüenciació molt laboriosos

Purificació de quantitats petites de proteïna (electroforèsis, HPLC).

Digestió dels fragments

Seqüenciació d’un dels pèptids purificats

Determinació de les possibles seqüències del corresponen ARNm

Amb sondes sintetitzades es “pesca” l’ARNm problema

Seqüenciació del ARNm

Deducció de la seqüència de la proteïna


Métodos de secuenciación de ácidos nucleicosMétodos de purificación de los mRNA

(librerias de cDNA)


Métodos de secuenciación de ácidos nucleicosMétodos químicos


Métodos de secuenciación de ácidos nucleicosMétodos automáticos


Nuevas estrategias de secuenciación de proteínasMétodos de caracterización de proteínas, la proteómica

• Electroforesis bidimensional (2D)– Comparación de geles: tratamiento de imágenes

• Determinación de la secuencia de peptidos por MS– MALDI-TOF– MALDI-MS-PMF

• Separación de proteínas por LC y determinación por MS O MS/MS

– LC/MS-ESI– nanoLC-ESI-MS/MS

http://www.proteome-factory.de/

http://uk.eurogentec.com

http://www.proteome-factory.de/http://uk.eurogentec.com/http://www.proteome-factory.de/http://uk.eurogentec.com/


Electroforesis 2D


LC-MS-MS


Nuevas estrategias de la Biología Molecular:Genómica y Proteómica

• Genómica:– Todos los genes de un organismo

• Proteómica– Todas las proteínas expresadas por el genoma de

un organismo

– Genes expresados en un momento dado y unacélula determinada


‘In silico’Bases de datos de secuencias de ADN

Localización de genes

Secuencia de proteína

Codi genCodi genèètictic

Kazusa DNA Research Institute EXPASY

http://www.kazusa.or.jp/ja2003/english/index.htmlhttp://us.expasy.org/http://us.expasy.org/


Investigaciones ‘in silico’


Tamaño del genoma y número de proteínas

Organismo Tamaño genoma (pb) Número de genes

M. genitalium 5,8 x 105 480

E. coli 4,2 x 106 4.300

S. cerevisiae 1,3 x 107 6.000

D. melanogaster 1,8 x 108 14.000

C. elegans 1,0 x 108 19.000

A. thaliana 1,0 x 108 25.000

H. sapiens 3,3 x 109 30.000-40.000

O. sativa 4,2 x 108 45.000


De secuencia de ácidos nucleicos a secuencia de genes: estimación a partir de Human Genome Project

• Por software (Genscan, Grail, etc.)

http://genes.mit.edu/GENSCAN.html

http://genes.mit.edu/GENSCAN.html




• Serial Analysis of Gene Expression (SAGE)– 70.000 genes

http://www.sagenet.org/

http://www.sagenet.org/




• Serial Analysis of Gene Expression (SAGE)– 70.000 genes

• Human Genome Sciences deducido de cDNA– 100.000 genes


De secuencia de secuencia de gen a secuencia de proteína:

Procesos que incrementan la variabilidad proteica, estructural y funcional:

Genoma x10 o x100 == Proteoma30.000-40.000 genes == 1.000.000 proteínas

• Promotores alternativos (10%)(neurexinas, c-myc, IGF II, etc.)

• Sitios de poliadenilación alternativos (33%, máx. X4)(calcitonina y CGRP)

• Ayuste alternativo (50%, normalmente x3, máx. x100 o x1000)

• Edición del mRNA (2%, difícil puede confundirse con SNP)– (COX II de tripanosoma cerca del 50% del mRNA no es genómico)

• Cambio de marco de traducción (Frameshifting)

• Modificaciones post-traduccionales


Módulo 8.

Módulo 8.1. Secuenciación de proteínas

Módulo 8.2. Análisis de secuencias de proteínas

Módulo 8.3. Estructura tridimensional de proteínas y otrasmacromoléculas (Núria Centeno, IMIM)

Módulo 8.4. Visualización de estructuras de proteínas y macromoléculas (Isabel Lladó)

Módulo 8.5. Predicción de la estructura tridimensional de proteínas (Michael Tress, CNB)

Módulo 8.6. Interacciones moleculares y macromoleculares (Ferrà Sanz, IMIM)

Mòdul 8.1. Seqüenciació de proteïnes.�Mètodes de determinació de l’estructura primària de proteïnes. ¿Qué información queremos saber de las proteínas?Métodos de secuenciación de proteínasSeqüenciació i microseqüenciació de proteïnes1.1. Generalitats i aproximació històrica a la seqüenciació de proteïnes.1.1. Generalitats i aproximació històrica a la seqüenciació de proteïnes.1.2. L’enllaç peptídic. Estructura primària de les proteïnes.2. Etapes de la seqüenciació de proteïnes.2. Etapes de la seqüenciació de proteïnes.Cromatografia de cribatge molecularCromatografia de intercanvi iònic2. Etapes de la seqüenciació de proteïnes.2. Etapes de la seqüenciació de proteïnes.2. Etapes de la seqüenciació de proteïnes.2. Etapes de la seqüenciació de proteïnes3. Passes prèvies a la seqüenciació�3.1. Determinació del nombre de subunitatsDeterminació del residu N-terminal d’una proteïna.�Dansil ClorurDeterminació del residu N-terminal d’una proteïna.�Dansil ClorurDeterminació del residu N-terminal d’una proteïna.�Reacció de SangerDeterminació del residu C-terminal d’una proteïna.�Hidrazinòlisis3. Passes prèvies a la seqüenciació�3.2. Ruptura dels enllaços disulfur Oxidació amb Àcid perfòrmicOxidació amb b-mercaptoetanol3.3. Anàlisis de la composició en aminoàcids.Mètode de la ninhidrinaMètode de la ninhidrinaMètode del o-ftalaldèhid.2. Etapes de la seqüenciació de proteïnes.4. Mètodes de seqüenciació de pèptids.�4.1. Mètodes de fragmentació de proteïnes.EnzimsTripsina4.2. Mètodes de determinació de la seqüència de pèptids.Seqüenciadors automàticsSeqüenciadors automàtics2. Etapes de la seqüenciació de proteïnes.Oxidació amb b-mercaptoetanolExemple: la Insulina (I)Exemple: la Insulina (II)Exemple: la Insulina (III)Exemple: la Insulina (IV)Métodos de secuenciación de proteínas6. Microseqüenciació de proteïnes. Noves estratègies.6. Microseqüenciació de proteïnes. Noves estratègies.6. Microseqüenciació de proteïnes. Noves estratègiesMétodos de secuenciación de ácidos nucleicosMétodos de secuenciación de ácidos nucleicosMétodos de secuenciación de ácidos nucleicosNuevas estrategias de secuenciación de proteínasElectroforesis 2DElectroforesis 2DLC-MS-MSNuevas estrategias de la Biología Molecular:�Genómica y Proteómica‘In silico’Tamaño del genoma y número de proteínasMódulo 8.sec_prot2_print.pdfMètode de Sanger (dinitrofluorobenzè DNF).Mètode d’Edman (fenilisotiocianat PITC).

Curs d’Especialista Universitari en...

Documents

Transcript of Curs d’Especialista Universitari en...