TEMA 2. CULTIVOS POR LOTE Y CONTINUO OBJETIVOS DEL TEMA. El alumno conocer y aplicar relaciones matemticas para describir y predecir el

crecimiento bacteriano. El alumno conocer, distinguir y aplicar los principios de los diferentes sistemas de

cultivo: por lote, continuo y lote alimentado o semi-continuo. 1. Introduccin.

En un proceso biotecnolgico, existen tres formas de hacer crecer a los microorganismos en un biorreactor de acuerdo a la operacin del fermentador que son: - Cultivo por lote - Cultivo por lote alimentado - Cultivo continuo

En el sistema de cultivo por lote, el biorreactor se carga con el medio de cultivo apropiado

para despus ser inoculado con el organismo de inters, a medida que procede la fermentacin, cambian las condiciones en el reactor al consumirse los sustratos y formarse los productos. Terminada la fermentacin, se vaca el biorreactor, se limpia y el proceso se repite. Este tipo de sistema no se encuentra en estado estacionario. El ambiente nutricional dentro del biorreactor cambia en forma continua y, por lo tanto, fuerza cambios en el metabolismo celular. Eventualmente, la multiplicacin celular cesa por desaparicin o limitacin de nutrientes y acumulacin de productos txicos de excrecin.

La naturaleza compleja del crecimiento de microorganismos por lotes da lugar a las diferentes fases de una cintica de crecimiento (fase de adaptacin o lag, fase de crecimiento o log, fase estacionaria y fase de declinacin o muerte).

En el sistema de cultivo por lote alimentado, parte de un cultivo por lote, dejando que transcurra la cintica de crecimiento para llevar al microorganismo hasta una fase de inters, en la cual se inicia la alimentacin de medio de cultivo fresco para largar la fase de crecimiento de inters. Este cultivo se caracteriza porque el volumen en el biorreactor ir aumentando al transcurrir el tiempo.

En el cultivo continuo, tambin parte del cultivo por lote y se deja que llega a un punto de inters donde el microorganismo tiene la fisiologa deseada, en ese momento se inicia la alimentacin de medio de cultivo y a la vez se retira medio fermentado, de tal manera que el volumen permanece constante as como las condiciones de cultivo, esto es se busca un estado estacionario. 2. Sistemas de cultivo.

Considere la figura 1, en base a la cual, para un componente cualquiera del cultivo, incluida la biomasa, se puede plantear el siguiente balance de materia en el biorreactor: Velocidad de acumulacin = velocidad de entrada velocidad de salida + velocidad de formacin - velocidad de consumo

(1) donde V es el volumen del cultivo, F1 es el flujo de alimentacin, F2 es el flujo de salida, Ci1 la concentracin del componente "i" en la alimentacin y Ci la concentracin a la salida, en un

1

cultivo bien mezclado, se puede asumir idntica a la que hay dentro del biorreactor. Los restantes trminos, rfi y rci se refieren a la velocidad de formacin y consumo del componente "i" respectivamente. Por otra parte, el volumen de cultivo variar en el tiempo segn sean F1 y F2 .

Figura 1. Representacin de entradas y salidas de un biorreactor.

Cuando la densidad del cultivo y de la alimentacin son iguales resulta:

(2) Ahora bien, dependiendo de como sean F1 y F2 surgen, bsicamente, tres sistemas de

cultivo: a) Cultivo continuo. Ambos flujos son iguales, por lo que el volumen es constante en (2), por lo tanto (1) se reduce a:

(3)

b) Cultivo por lote alimentado El flujo de salida, F2, es nulo, por lo que V aumentar en el tiempo en funcin del flujo de

entrada.

(4)

y en el balance de materia se anula el trmino F2Ci resultando:

(5)

Debe destacarse que en este caso V permanece dentro del operador diferencial pues varia con el tiempo segn (4). Por tal motivo, el lote alimentado, a diferencia del caso anterior, tiene una duracin limitada de tiempo, ya que el volumen no puede incrementarse ms all del volumen til que posee el biorreactor. c) Cultivo por lote.

Ambos flujos son nulos, por lo que V es constante y en (1) se anulan los trminos FlCi1,

2

F2Ci

(6) La duracin del cultivo por lote es, por supuesto, tambin limitada en el tiempo y depende

esencialmente de las condiciones iniciales del cultivo. Una vez inoculado el medio, la concentracin de biomasa aumenta a expensas de los nutrientes y cuando el sustrato que limita el crecimiento se agota, finaliza el lote. 3. Cintica de crecimiento microbiano.

Una poblacin de bacterias que se encuentre en un medio adecuado, donde se mantienen constantes todos sus parmetros nutricionales y ambientales, crece de forma tal que el incremento por unidad de tiempo de masa celular, nmero de clulas, ADN, ARN, protenas, etc., es un valor constante y similar en cada caso (ver figura 3, fase log).

M/M = N/N = [ADN]/[ADN] = [protenas]/[protenas] = ... = K

As pues, durante este crecimiento, de tipo exponencial o logartmico, el cultivo se comporta como una reaccin autocataltica de primer orden:

velocidad de aumento del componente = K{cantidad del componente}

Tambin se puede decir que el nmero de clulas, la masa celular u otros componentes se duplican cada determinado lapso de tiempo. Este tipo de crecimiento se denomina balanceado o equilibrado. Se caracteriza, porque todos los constituyentes celulares se duplican en un mismo tiempo, o dicho de otra manera aquel en el que estos constituyentes aumentan proporcionalmente por un mismo factor en la unidad de tiempo. Este factor es la velocidad especfica de crecimiento (), que es caracterstica para cada cepa bacteriana creciendo en un medio determinado y condiciones ambientales especficas. La curva tpica de crecimiento se presenta en la siguiente figura.

Figura 2. Curva tpica de crecimiento para una poblacin bacteriana.

3

Como se puede apreciar, la curva de crecimiento presenta diferentes fases perfectamente definidas, las cuales se explican a continuacin : Fase lag: Tambin conocida como "fase de retardo", es una consecuencia del "choque" que sufren las clulas al encontrarse en ambiente nuevo. Los microorganismos reorganizan sus constituyentes moleculares y dependiendo de la composicin de los nutrientes, sintetizan nuevas enzimas; la sntesis de algunas otras enzimas es reprimida, etc. Mltiples fases lag pueden observarse cuando el medio contiene ms de una fuente de carbono. Fase log o de crecimiento exponencial: En esta fase, las clulas se multiplican rpidamente, y la masa celular y el nmero de microorganismos se incrementa exponencialmente con el tiempo. Este es un perodo de "crecimiento balanceado", esto es, todos los componentes de la clula crecen con la misma velocidad, esto es la composicin promedio de la clula permanece aproximadamente constante. La velocidad de crecimiento bacteriano durante la fase exponencial es de primer orden, y se puede representar por:

0XdtdX

0 === taXX (7) la cual al integrarse origina

teXot 00

XXXln == (8)

donde: X = concentracin celular a tiempo t (g/L) X0 = concentracin celular a tiempo t (g/L) = velocidad especfica de crecimiento (t-1) Fase de desaceleracin: En esta fase, el crecimiento desacelera debido a la disminucin de uno o ms nutrientes esenciales o a la acumulacin de productos txicos al crecimiento. El rpido cambio del ambiente se traduce en un "crecimiento no balanceado" . Fase Estacionaria: En esta fase, la velocidad neta de crecimiento es cero (no existe divisin celular) o cuando la velocidad de crecimiento es igual a la velocidad de muerte. La produccin de ciertos metabolitos es realizada durante la fase estacionaria, por ejemplo; antibiticos, hormonas, vitaminas, etc. Durante el desarrollo de la fase estacionaria uno o ms de los siguientes fenmenos tiene lugar: i) La concentracin total de masa celular permanece constante, pero el nmero de clulas viables puede decrecer ii) Lisis celular puede ocurrir y la masa celular viable descender. Una segunda fase de crecimiento puede presentarse y las clulas crecer sobre los productos de la lisis (crecimiento tpico) iii) Las clulas pueden no estar creciendo pero pueden tener un metabolismo activo para producir metabolitos secundarios

4

Durante la fase estacionaria, la clula cataboliza reservas celulares para generar nuevos bloques de construccin y monmeros para producir energa, a este fenmeno se denomina "metabolismo endgeno". La clula tambin puede gastar energa para mantener una membrana energizada y transportar nutrientes y para funciones metablicas esenciales tales como su movilidad y reparacin del dao a estructuras celulares, este gasto es llamado "energa de mantenimiento". Fase Declinacin o Muerte: Tambin conocida como "fase muerte", se da debido al agotamiento del medio o presencia de un veneno, la velocidad de muerte sigue una cintica de primer orden:

) 9 ( e N = N o X k' - = dtdN t k' -

sdd

donde: Ns = concentracin de clulas al final de la fase estacionaria k'd = constante de velocidad de muerte 3.1 Tiempo de duplicacin (td). Es el tiempo que se requiere para que el microorganismo incremente su poblacin al doble,esto es, el tiempo necesario para que se duplique una bacteria. A partir de la ecuacin (7):

dXdt

= X al integrar la ecuacin:

dt = dtdX 2

1

dX

X

t

0 Si X2 = 2 X1, td= tiempo de duplicacin As :

10) ( 0.693 = 2 ln = td 3.2 Tiempo de generacin (tg). Para muchos propsitos en microbiologa es til conocer el tiempo de generacin de una poblacin durante el crecimiento exponencial, durante esta etapa de la curva de crecimiento, se deduce que el aumento de bacterias es una progresin geomtrica, existiendo una relacin directa entre el nmero de clulas presente en el momento inical y el habido en un momento determinado del crecimiento exponencial, de donde: N =N0 2n (11) siendo: n = nmero de generaciones que ha ocurido durante el perodo de la fase exponencial. N = nmero de clulas al tiempo t. N0 = nmero de clulas al inicio de la fase exponencial.

5

Para calcular el tiempo de generacin se emplea la ecuacin tg = t/n (12) donde: tg = tiempo de generacin t = tiempo de crecimiento transcurrido hasta el momento de la toma de muestra durante la fase exponencial. Para calcular el nmero de generaciones se puede emplear la expresin que se muestra a continuacin: log N = log N0 + n log 2 (13) n =(log N log N0)/log2 (14) n=(log N log N0)/0.301 (15)

4. Sistema de cultivo por lote Aplicando la ecuacin (6) a la biomasa, al producto y al sustrato resulta:

xrdtdx

x == (16) xq

Yxr

dtdS

SSx

S ===/

(17)

xqrdtdp

pp == (18) donde: dx/dt = rx = velocidad de crecimiento celular = velocidad especfica de crecimiento (h-1) x = concentracin de biomasa (g masa celular seca/L) dS/dt = rS = velocidad de consumo de sustrato limitante Yx/S = Rendimiento de biomasa en base a sustrato (g biomasa/g sustrato) qS = Velocidad especfica de consumo de sustrato (g sustrato/g biomasa h) dp/dt = rp =velocidad de formacin de producto qp = Velocidad especfica de formacin de producto (g producto/g biomasa h) Por otro lado, el aumento de la biomasa se puede relacionar con el consumo de sustrato para la fase exponencial de crecimiento a travs de diferentes modelos cinticos. 4.1 Ecuacin de Monod. El modelo de Monod es uno de los empleados, y est desarrollado considerando que el estado interno del microorganismo es "constante" (crecimiento balanceado). La ecuacin de Monod es una expresin emprica establecida por analoga con la ecuacin de Michaelis - Menten, la cual se basa en las siguientes hiptesis: a) Solamente se tiene una velocidad y un sustrato limitante.

6

b) Una cantidad de sustrato limitante es consumida; una velocidad fija se presenta en la produccin de una unidad de biomasa ( Yx/s constante ) c) = f(S) De la ecuacin (16), el valor de se considera constante en la "fase log o exponencial". Monod propuso:

(19) S+ K

S = S

max donde: max = velocidad especfica mxima de crecimiento Ks = constante de saturacin o de velocidad media (g sustrato/L) S = concentracin de sustrato limitante (g sustrato/L) La ecuacin 19 es vlida para S >> Ks. La figura 3 muestra el comportamiento de la velocidad de crecimiento al variar la concentracin de sustrato.

Figura 3. Comportamiento de contra concentracin de sustrato (Ecuacin de Monod)

En la figura 4 se presenta una relacin entre 1/S y 1/, que proviene de la ecuacin de Monod, para determinar max y Ks, donde la ecuacin resultante representa una lnea recta.

Figura 4. Grfica de 1/ contra 1/S.

7

(20) S

S+ K = max

S

1

) (21 S

K1 = max

S

max +1

El cuadro 1 presenta valores de la constante de saturacin para diferentes sustratos y diferentes microorganismos.

Cuadro 1. Constantes de saturacin para diferentes sustratos y microorganismos Organismo

Sustrato

(limitante) Ks

(mg/L) Ks (M)

Escherichia coli E. coli E. coli Candida utilis C. utilis C. utilis Sacch. cerevisiae Aspergillus Klebsiella Klebsiella

Glucosa Glucosa Manitol Glicerol Oxgeno Oxgeno Glucosa Glucosa Mg++

K+

6.8 10-2 4 2

4.5 4.5 10-1 4.5 10-2

25 5

5.6 10-1 3.9 10-1

3.8 10-2 2.2 1.1 4.9 1.4

1.3 10-1 14 2.8 2.3 1.0

4.2 Modelos para la inhibicin del crecimiento. 4.2.1 Inhibicin por sustrato. A altas concentraciones de sustrato, el crecimiento microbiano puede inhibirse por el sustrato. Como en la cintica enzimtica, la inhibicin por sustrato puede ser competitiva o no competitiva. Los principales patrones de inhibicin por sustrato y sus expresiones son los siguientes: Inhibicin por sustrato no competitiva

) 22 (

KS+1

SK+1

=

i

S

max

Si Ki >> Ks: ) 23 (

KS + S+ K

S =

i

2

S

max

Inhibicin por sustrato competitiva

) 24 ( S+

KS+1 K

S =

iS

max

8

3.2.2 Inhibicin por producto Altas concentraciones de producto pueden ser inhibitorias del crecimiento microbiano. La inhibicin por producto puede ser competitiva o no competitiva, la velocidad de crecimiento inhibida puede aproximarse a expresiones de decaimiento exponencial o lineal. Algunas expresiones son: Inhibicin por producto no competitiva

) 25 (

KP+1

SK+1

=

P

S

max

Inhibicin por producto competitiva

) 26 ( S+

KP+1 K

S =

PS

max

3.3 Requerimientos de mantenimiento en cultivo por lote. La relacin expresada como rendimiento celular Yx/s, se define como:

27) ( S

x-xdSdX = Y

0

0X/S S=

donde x es la cantidad final de biomasa, x0 es la cantidad inicial de biomasa, S es la cantidad final de sustrato, S0 es la cantidad inicial de sustrato. La suposicin ms simple es que Yx/s es constante. Esto esencialmente es cierto solamente a altas velocidades de crecimiento. A partir de las ecuaciones 17, 19 y 27, se puede obtener una relacin para la utilizacin de sustrato como:

) 28 ( S+ K

S YX =

dtdS

SX/Smax

Marr, Pirt y otros demostraron que el rendimiento celular Yx/s "no es constante". As, la respiracin endgena de sustratos productores de energa para funciones de mantenimiento; de aqu que la utilizacin de sustrato por las clulas puede ser expresado ms correctamente por:

) 29 ( X m + dtdX

Y1 =

dtdS

G

o

) 30 ( m + Y1 =

dtdS

X1

G

donde: m = constante de mantenimiento de sustrato por unidad de biomasa por unidad de tiempo YG = factor de productividad verdadero representando el sustrato utilizado solamente para crecimiento. Estas relaciones estn representadas en la figura 5.

9

Figura 5. Relaciones entre la utilizacin de sustrato y crecimiento.

4.4 Relaciones sustrato producto. Gran cantidad de modelos han sido propuestos para la produccin de diferentes metabolitos comunes. Tres de estos modelos pueden ser razonablemente tiles al expresar el comportamiento de sistemas simples. Estos se muestran en la figura 6, donde: a) Modelo asociado al crecimiento. La produccin del metabolito de inters se sintetiza durante el crecimiento del microorganismo. Matemticamente la velocidad especfica de produccin est dada por:

xpp Ydtdp

xq /

1 == (31) b) Modelo no asociado al crecimiento. La produccin del metabolito de inters se empieza a sintetizar una vez que se alcanza cierta concentracin de biomasa, y despus tiene un comportamiento que sigue la curva de crecimiento microbiano. Matemticamente la velocidad especfica de produccin est dada por:

+=pq (32)

Figura 6. Diferentes tipos de relacin entre crecimiento y formacin de producto.

c) Modelo combinado asociado y no asociado al crecimiento. La produccin del metabolito de inters se llevar a cabo despus del crecimiento del microorganismo. Matemticamente la velocidad especfica de produccin est dada por:

=pq (33)

10

5. Sistema de Cultivo Continuo. Las operaciones de crecimiento celular en lote, son procesos que terminan despus de un cierto tiempo, la alteracin de estos procesos por el suministro continuo de medio fresco permite que el crecimiento se mantenga por perodos prolongados. Despus de un cierto perodo de tiempo, el sistema usualmente alcanza un estado estacionario donde las concentraciones celulares, de producto y substrato permanecen constantes. El cultivo continuo brinda un conjunto de condiciones ambientales constantes para crecimiento y formacin de producto y proporciona un producto de calidad uniforme. El cultivo continuo es una herramienta importante para la determinacin de la respuesta de los microorganismos a su ambiente y el generar productos deseables bajo condiciones de operacin y ambientales ptimas. La figura 7 muestra un diagrama tpico de la configuracin de un quimiostato en donde el ambiente qumico se mantiene constante lo cual es caracterstico de un estado estacionario. En ocasiones se tiene control de temperatura, flujo de aire, etc. Un turbidiostato es otro sistema de cultivo contnuo, similar al quimiostato pero donde la concentracin celular en el recipiente es mantenida constante por el monitoreo de la densidad ptica del cultivo. Cuando en el cultivo se experimenta una desviacin del "set-point", una bomba es activada y medio fresco es alimentado al medio.

Figura 7. Sistema de Cultivo Contnuo de laboratorio (Quimiostato)

5.1 Teora del cultivo contnuo. Un cultivo continuo se puede representar esquemticamente de acuerdo a: F (L/h), S0 (g/L), x0 (g/L) x (g/L), S(g/L)

11

Cuyo balance de masa es:

celular} mat. n{Acumulaci = celular} {Muerte-celular} to{Crecimien+salida} {Clulas - entrada} Clulas{

Que de acuerdo al esquema del biorreactor operando en cultivo continuo se puede expresar matemticamente por:

)( 34dtdXXXX

VFX

VF

o =+ donde: xo = masa celular (g/L) en la alimentacin x = masa celular (g/L) en el fermentador F = Flujo (L/h) V = volumen del fermentador (L) = velocidad especfica de crecimiento celular (h

-1)

= velocidad especfica de muerte celular (h-1) t = tiempo (h) Si el medio de cultivo alimentado es estril, entonces xo = 0 y en la fase log la velocidad de muerte es despreciable respecto a velocidad de crecimiento , >> , entonces

)( 35dtdXXX

VF =+

En el estado estacionario, no hay cambio con respecto al tiempo, dx/dt = 0, de donde

)( 36VF=

Definiendo D como la velocidad de dilucin que es igual a

D=F/V entonces

)( 37D= 5.1.1 Nutriente limitante: Realizando el balance de masa para el nutriente limitante, se tiene: {Nutriente entrada} - {Nutriente salida} {Nutriente consumido}

{Requerimiento de mtto.} Formacin de producto} = {Acumulacin de nutriente} { Expresado matemticamente:

)(//

38dtdS

YXq

XmY

XSVFS

VF

SP

p

SXo =+

donde: So = Concentracin de sustrato en la alimentacin (g/L) S = concentracin de sustrato a la salida del fermentador (g/L) m = energa de mantenimiento Yx/s = rendimiento de biomasa en funcin del sustrato (g clulas/g sustrato)

12

Yp/s = rendimiento de producto en base a sustrato (g producto/g sustrato) qp = velocidad especfica de formacin de producto (g producto/g clulas-h) Normalmente, la energa de mantenimiento es despreciable respecto al crecimiento

sxYxmx/

La velocidad de dilucin a la cual se obtiene la mxima productividad, se puede calcular al derivar la ecuacin (46), cuya expresin final es:

)(/

47121

0

+= SK

KDDs

scm

La mxima productividad no necesariamente se presenta a la velocidad de dilucin correspondiente a la mxima conversin de substrato a clulas. Utilizando las ecuaciones (43), (44) y (46), se puede predecir el comportamiento terico de un quimiostato(Fig. 8).

Figura 8. Comportamiento en un cultivo continuo al variar la tasa de dilucin (D).

5.3 Uso del cultivo continuo. Las ventajas del cultivo continuo se basan principalmente en: a) La velocidad especfica de crecimiento (), puede establecerse (dentro del los lmites del organismo), de acuerdo a las necesidades del experimento. Se puede seleccionar un estado de actividad metablico particular y el control de ste b) Se pueden obtener clulas en un estado definido, independientemente del tiempo. Tal es caso de los cultivos sincrnicos, donde todas las clulas microbianas estn en el mismo estado fisiolgico. c) Con equipo de laboratorio se pueden producir, comparativamente grandes cantidades de material celular definido En el cuadro 2 se listan algunos de los productos obtenidos por fermentacin continua. Entre ellos destaca por su escala e importancia industrial la obtencin de protena celular. Los dems productos presentan problemas tcnicos o tienen limitaciones de mercado, lo que los hace econmicamente inaceptables por el momento, pero que en el futuro se podrn producir probablemente mediante cultivo continuo.

14

Cuadro 2. Ejemplos de productos obtenidos por fermentacin continua Acetona Butanol Glucosa Isomerasa Acido actico Butanodiol Glicgeno Acido ctrico Celulasa Penicilina Acido glucnico Cloranfenicol Penicilinasa Acido Itacnico Etanol Protena unicelular Acido lctico Estreptomicina Vitamina B12

6. Sistema de Cultivo por Lote Alimentado. En un sistema de cultivo por lote alimentado, los nutrientes son continuamente o semicontinuamente adicionados al sistema, aumentando el volumen de medio de cultivo, ya que no hay flujo de salida. Este tipo de sistema se utiliza para resolver problemas de inhibicin por sustrato o represin catablica. En la figura 9 se muestra esquemticamente la operacin de este tipo de sistema.

Figura 9. Representacin de un sistema de cultivo por lote alimentado.

En un cultivo por lote, la concentracin de biomasa a un cierto tiempo est dada por: ( SSYxx SX )+= 0/0 (48)

En un cultivo por lote alimentado, cuando la biomasa alcanza su mxima concentracin (xm), la concentracin de sustrato es muy baja (Sx0, por lo que:

0/ SYx SXm = (49) Si, para un biorreactor por lote alimentado conteniendo algunas clulas (inculo), se inicia a alimentar un medio con un flujo F, con una concentracin de sustrato S0, la cantidad total de biomasa en el sistema es:

VxX t = (50) donde V es el volumen de medio y Xt es la biomasa al tiempo t. La velocidad de incremento del volumen de medio en el cultivo por lote alimentado es:

15

FdtdV = (51)

Que integrando resulta en FtVV += 0 (52)

La concentracin de biomasa a cualquier tiempo es:

VXx T /= (53) La velocidad de cambio en la concentracin de biomasa es: ( ) ( )

2//

VdtdVXdtdXV

dtdx tt = (54)

Ya que, dXt/dt=netXt, dV/dt=F, y F/V=D, la ecuacin (54) se convierte en:

( xDdtdx

net = ) (55) Cuando el sustrato es totalmente consumido, S0, y x=xm, en este punto se tiene un estado cuasi-estacionario donde la velocidad de consumo de nutriente es aproximadamente igual a la velocidad de alimentacin de nutriente (dx/dt=0), se tiene que.

Dnet = (56) Si la energa de mantenimiento se desprecia,

SKS

smnet += (57)

DDKS

m

s

(58) El balance para el sustrato limitante de la velocidad sin considerar la energa de mantenimiento es:

sx

tnet

t

YXFS

dtdS

/0

= (59) Donde St es la cantidad total de sustrato limitante en el cultivo, y S0 es la concentracin del sustrato en la corriente de alimentacin. En el estado cuasi-estacionario, Xt=Vxm, y esencialmente todo el sustrato es consumido, de donde:

0/ SFYFxdtdVx

dtdX

sxmm

t

==

= (60) Integrando la ecuacin (60), con una concentracin inicial de biomasa en el reactor de Xt0:

tSFYXX sxtt

0/0 += (61) Que indica que la cantidad total de clulas en el cultivo se incrementa linealmente con el tiempo. La tasa de dilucin y net disminuye con el tiempo, as que net = D en el estado cuasi-estacionario, y la velocidad de crecimiento est controlada por el factor de dilucin. Para la formacin de producto en el cultivo por lote alimentado en el estado cuasi-estacionario (S

tp

t

Xqdt

dP = (63) Cuando la velocidad especfica de formacin de producto (qp) es constante:

FSYFP Sp 0/ (64) Sustituyendo Xt= (V0+Ft) xm en la ecuacin (63), se tiene:

)( FtVxqdt

dPomp

t

+= (65) Integrando

tFtVxqPP mptt

++=

200 (66)

Que puede ser expresada en trminos del producto como:

tDtVVxq

VVPP mp

++=

200

0 (67)

En la figura 10 del lado izquierdo se muestra la variacin del volumen (V), la velocidad especfica de crecimiento (), biomasa (x), sustrato (S) con el tiempo en el estado cuasi estacionario. Mientras en el lado derecho de la figura, la variacin del producto.

Figura 10. Variaciones de parmetros en un cultivo por lote alimentado en el estado

cuasi-estacionario.

6.1 Ventajas del cultivo por lote alimentado. a) Produccin de altas concentraciones celulares debido a la extensin del tiempo de crecimiento, lo cual es importante en productos asociados al crecimiento. b) Condiciones controladas para la provisin de sustratos durante la fermentacin.

17

c) Control sobre efectos de represin por productos o catablica, debido a la limitacin de la provisin de aquellos sustratos requeridos para la formacin de producto. d) Permite el reemplazamiento de agua prdida va evaporacin. e) Modo alternativo de operacin para fermentadores involucrados en la biorremediacin de sustratos txicos, o compuestos de baja solubilidad. f) No se requieren aditamentos especiales en el equipo para convertir una operacin por lote en una por lote alimentado. 6.2 Desventajas del cultivo por lote alimentado. a) Requiere de un anlisis previo del microorganismo, sus requerimientos, y un conocimiento de su fisiologa respecto a la productividad. b) Requiere de un operador experto para la definicin y desarrollo del proceso. 6.3 Aplicacin del cultivo por lote alimentado. La aplicacin de un sistema de cultivo por lote alimentado se sugiere cuando se tiene un proceso en dos fases, una de crecimiento y otra de produccin de metabolito. Un ejemplo prctico es la produccin de penicilina donde: la fermentacin se divide en una fase de crecimiento rpido a la mxima velocidad especfica de crecimiento y una fase de crecimiento lento en la cual se produce la penicilina. Durante la fase rpida de crecimiento, un exceso de glucosa causa una acumulacin de cidos, y una demanda de oxgeno por la biomasa mayor que la capacidad de aireacin del fermentador. Una carencia de glucosa puede provocar que la fuente de nitrgeno orgnico en el medio de cultivo sea utilizada como fuente de carbono, resultando en un pH alto, que es inadecuado para la formacin de biomasa. Durante la fase de produccin, las velocidades de alimentacin deben ser diseadas para limitar la velocidad de crecimiento y el consumo de oxgeno, tal que una velocidad alta de sntesis de penicilina se logre, y el oxgeno disuelto sea el suficiente e el medio de cultivo.

18

Inhibicin por sustrato no competitiva Inhibicin por sustrato competitiva Inhibicin por producto no competitiva Inhibicin por producto competitiva