INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE

BIOTECNOLOGÍA

LABORATORIO DE CULTIVOS CELULARES

Prácticas 1 y 2:“Efecto de los reguladores de

crecimiento en un cultivo de callos de zanahoria (Daucus carota)”

“Cultivo de Células vegetales en suspensión”

4FM2

Equipo: The Avenger - Poison

INTEGRANTES:García Martínez Víctor Manuel

Martínez Guerra María de JesúsMontes Nito Isaí

Sandoval Reyes Juan Carlos

PROFESORES: Karen Moreno Guerrero

Donají Ariadna Ramírez López

MÉXICO, DISTRITO FEDERAL A 16 de abril del 2013

Contenido

1. Práctica 1: “EFECTO DE LOS REGULADORES DE CRECIMIENTO EN UN CULTIVO DE CALLOS DE ZANAHORIA (Daucus carota)”............................................................................................................1

2. Objetivos....................................................................................................................................1

3.1 Metodología...........................................................................................................................2

3.2 Preparación del medio MS.................................................................................................2

3.3 Desinfección del explante e introducción al medio de cultivo...........................................3

4 Resultados experimentales........................................................................................................4

5 Análisis de Resultados................................................................................................................7

6 Conclusiones............................................................................................................................10

7 Referencias...............................................................................................................................11

8 Anexo 1: Cuestionario práctica 1..............................................................................................11

9 Práctica 2: “Cultivo en suspensión”..........................................................................................15

10 Objetivos..............................................................................................................................15

11.1 Metodología.........................................................................................................................16

11.2 Preparación del medio MS...............................................................................................16

11.3 Siembra de callos en medio líquido..................................................................................16

12 Resultados............................................................................................................................17

13 Análisis de resultados...........................................................................................................20

14 Conclusiones........................................................................................................................22

15 Referencias...........................................................................................................................23

16 Anexo 2. Cuestionario práctica 2..........................................................................................23

1

1. Práctica 1: “EFECTO DE LOS REGULADORES DE CRECIMIENTO EN UN CULTIVO DE CALLOS DE ZANAHORIA

(Daucus carota)”

2. ObjetivosGENERAL:

“Analizar el efecto de los reguladores de crecimiento, logrando la generación de callos de un cultivo de zanahoria (Daucus carota)”

ESPECÍFICOS:

Llevar a cabo la preparación de medios de cultivo (MS) y analizar los puntos críticos de su preparación.

Observar las características de el callo de zanahoria (Daucus carota) Realizar de forma correcta un protocolo de desinfección al explante de zanahoria

(Daucus carota) Toma de un explante de zanahoria (Daucus carota) en condiciones asépticas, y

cultivo del explante en el medio MS. Observar el comportamiento de los reguladores empleados en los cultivos

vegetales a diferentes concentraciones, a través de los callos obtenidos.

24

3.1 Metodología

3.2 Preparación del medio MS

Figura 1.Frascos empleados para el medio MS.

Pesar el medio basal MS (Cada equipo ocupo 125

mL, para 5 frascos Gerber)

Disolver con agitación en l de agua destilada

Suplementar con los reguladores de

crecimiento. 2,4-D y BAP, ANA

Agregar 20g/l de sacarosa y disolver

Ajustar el pH del medio con NaOH 1N

o H2SO4 1N a 5.8

Agregar 1.0502 g de agar y completar el volumen total del

medio

Homogenizar y clarificar el medio

Vaciar cada frasco gerber con el

volumen requerido

Esterilizar a 121°C durante 15 minutos

Enfriar y tapar con polipropileno cada

tapa de cada frasco y rotular.

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3.3 Desinfección del explante e introducción al medio de cultivo

Figura 2. Material empleado en la desinfección del explante y su introducción al medio MS

Se selecciono una zanahoria a utilizar en el

cultivo

Se lavo la zanahoria con una solución de agua y jabón , y enjuagar con

agua.

Se Sumergio en una solución de etanol al

70% por 30 seg.

Se enjuago con agua destilada y se retiro.

Se sumergio la zanahoria en una

solución de hipoclorito por 10 min.

(Se realizó en la campana)

Se enjuago con agua estéril , y con el

agitador.

Se corto la zanahoria en trozos de 1cm maximo de grosor (no se usaron

las puntas)

Cada trozo se corto en 4, procurando obtener la mayor cantidad de

cambium posible.

Se colocaron 4 trozos en cada frasco que

contenia ya el medio MS estéril.

Se taparón con polipropileno cad auno

de los frascos.

Se Incubarón a 24-26°C con un fotoperiodo de

16 horas de luz por ocho de obscuridad.

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4 Resultados experimentales

En el cuadro 1 se muestran los resultados obtenidos de cada equipo después de una semana de haber cultivado los explantes de zanahoria.

Cuadro 1. Datos de explante a la semana de haber cultivado.

Equipo Frascos Viables Apariencia Num. de frascos no viables

Tipo de contaminación

Biorreactor 2 Explantes con aparente deshidratación

4 2-Hongos

2-BacteriaPoison 3 Explantes con

deshidratación ,apariencia blanquecina en la superficie.

2 Bacteria

H. de UPIBI 2 Pérdida parcial del pigmento y deshidratación.

4 2-Bacteria

2-OxidaciónAvenger - - 6 1-Bacteria

1-Levadura4-Oxidación

En la figura 2 se muestra uno de los frascos contaminados después de una semana de haber sido sembrados, lo cual indica mala técnica aséptica.

Figura 3. Contaminación en frasco de cultivo de explante de zanahoria.

24

En el cuadro 2 se muestran los resultados de los equipos después dos semanas de edad de los cultivos en sólidos de los explantes de zanahoria.

Cuadro 2. Registro de crecimiento de callos en explantes de zanahoria.

Concentración de Reguladores

Equipo Friabilidad Frascos

Viables

Auxina(ANA)

Citoquinina(BAP)

Crecimiento de callo

Características de callo

Semana de aparicion

Avenger - 0.5 x -0.0062mg/L

1x-.125 mg/L

No - -

Poison 5 0.5x-0.0175mg/L

0.5x-0.0175mg/L

Si Blanco 2 semanas(20

callos)H.de UPIBI 2 1x-

0.175mg/L2x-0.35

mg/LSi Pequeños

Verdosos14 dias (6

callos)*7

dias(6callos)

Biorreactores 1 1.5x-0.15mg/l

1.0x-1mg/L Si AbultadoBlanquecino

Hidratado

3 semanas (8 callos)

2da siembra1semana(3callos)

En el cuadro 3 se muestra la formulación del medio MS, las vitaminas MS se encuentran en un Stock a 10,000x.

Cuadro 3. Formulación del medio MS.

ANA BAP Vitaminas MS Sales MS Sacarosa Agar 1 mg/mL 1 mg/mL 10,000 x 4.6 g/L 30 g/L 6 g/L

Vitaminas MS--------------10,000 x-----------10x/L------------------1x

1.5 mL/L

ANA 2,4D-------------0.1mg/L--------------1x----------------------0.1mg/mLBAP--------------------1 mg/L----------------1x----------------------1mg/mLSoluciones madre

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ANA 10 mL sol. madreC1V1=C2V2V1=1x(700mL)/1000X= 0.7 mL = 700 μL

Calculo de la concentración de los reguladores de crecimiento de equipo “Avengers”:

ANA 0.5mg/mLBAP 1 mg/mL

Para 0.5x de Auxina0.05mg-----------1000mL x-------------125 mL

x= 0.00625 mL x= 6.25 μL

Para 1x de citoquinina1mg----------------1000mL x------------------125 mL x=0.125 mL x=125 Μl

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5 Análisis de ResultadosLo que se analizó en esta parte de la experimentación es el crecimiento de callos en medio sólido. Para que se observara un crecimiento real de un callo se debió haber preparado el medio de cultivo, que en este caso fue el medio MS (Murashige Skoog) , ya que este se utiliza para provocar la desdiferenciación en plantas , también en el medio de cultivo se encuentran las sustancias necesarias para el crecimiento y desarrollo de los tejidos vegetales como sales minerales que deben aportar los elementos esenciales como Macronutrientes (N, P, K, S. Ca y Mg) y Micronutrientes (Fe, B, Mn, Zn, Cu, Mo, y Co). Normalmente es imprescindible una fuente de carbono, generalmente la sacarosa la cual fue la que se utilizó en este caso , esto debido a que hay una escasa actividad fotosintética en los tejido in vitro. Además, el medio puede ser enriquecido con Aminoácidos, Vitaminas y Reguladores del Crecimiento (en este caso se empleo ANA y BAP). Se prepararon 150 mL del medio MS , pero este procedimiento debe tener ciertos cuidados que son fundamentales para que el crecimiento fuera exitoso , uno de ellos es haber ajustado el pH del medio de 5 -6.5 ya que este es un factor fisicoquímico que afecta al cultivo de tejidos , por otra parte el pH después del proceso de esterilización puede disminuir y ocasionar las siguientes complicaciones: Las hormonas se hacen menos sensibles , el agente gelificante puede perder su rigidez, las vitaminas pueden hacerse menos estables , entre otras que como la temperatura ideal para el crecimiento según la bibliografía debe ser alrededor de 25 a 27 0C otro factor que es importante es haberlo mantenido a una buena humedad que también se indica que es en un promedio de 30% ya que si se eleva esta humedad puede inducir a una contaminación del medio y esto afectaría el crecimiento del cultivo. En algunos medios de cultivo del equipo Avengers se observaron contaminaciones, la humedad pudo ser un factor, el cual se debe de tener en cuenta al realizar este tipo de cultivos.

Ya que el medio de la mayoría de los equipos no se observó ninguna contaminación del medio se procedió a la elección del vegetal para poder extraer el explante el cual debía tener ciertas características , como , debía ser una zanahoria joven que tuviera un color naranja brilloso , no estuviera dañada con cortes, que estuviera firme, y que al hacer el corte mostrara un cambium que fuera de tamaño considerable ya que de ahí obtendríamos células meristematicas que estas nos dice que son tejidos embrionarios capaces de diferenciarse o perpetuarse; es decir, se multiplican activamente para formar los tejidos adultos diferenciados (crecimiento y especialización) y a su vez originan nuevas células meristemáticas. , al ser joven tejido este podría soportar las condiciones del medio de cultivo que busca estresar a las células meristematicas . Esto se llevó de igual manera que en la elaboración del medio en condiciones asépticas con la desinfección del vegetal, con Etanol al 70% e Hipoclorito de sodio al 10%, el agregar hipoclorito de sodio para algunos equipos afecto ya que en principio se dejó el tiempo para agragar en 10 min. pero algunas zanahorias no resistieron el tratamiento, esto pudo ser causado porque la zanahoria no estaba en buenas condiciones ( no era joven ) o también que el cloro que se utilizo estaba muy concentrado y se debió hacer otra solución con otras concentraciones más bajas para que los explantes resistieran el tratamiento. Este punto es crítico ya que si

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se deja una cantidad de tiempo mayor a la que se requiere para desinfectar a la zanahoria, esta se puede morir, esto se observa por que la zanahoria toma un color blanco; además de que se debe de realizar en la campana ya limpia.Otra fuente de contaminación puede provenir de la zanahoria ya que esta probablemente no se desinfecto completamente.

Al realizar la elección del vegetal y haberlo limpiado se trabajó en la campana de flujo laminar que esta debe estar estéril al igual que el material que se utilizó en la campana (Bisturí , pinzas, cajas Petri , agua destilada), al desinfectar el área de trabajo con etanol al 70% , se procedió a realizar el corte de la zanahoria para poder obtener del cambium las células meristematicas , el corte debía ser considerable para que abarcara el cambium esto dependiendo de las zanahorias, al ver los resultados de la Tabla1 y Tabla2. Se observa que para nuestro equipo “Avengers” no se mostró ningún crecimiento esto pudo ser que al hacer los cortes no se supo manejar bien el bisturí , se utilizaron dos hojas de bisturí lo cual se vio reflejado en el resultado de nuestros cultivos al haber contaminación , ya que como se dijo anteriormente uno de los objetivos del CTV es tener nuevos cultivos sin contaminación por lo que en las dos sesiones que se realizó este procedimiento se tuvo el mismo problema , viendo los demás comparaciones los que obtuvieron mejor obtención fue el equipo de” Biorreactores” y “Poison” los cuales independientemente de las condiciones de asepsia que se usaron que si son importantes , aquí el objetivo es comparar las diferentes concentraciones de reguladores de crecimiento que se aplicaron al medio de cultivo , la bibliografía muestra unos datos sobre la concentración de auxinas la cual se usó en el medio solido Ms , de 1 a 2 m/gL de 2,4-D y 30 mg/L de sacarosa en este punto de comparación es importante decir que nosotros ocupamos ANA como regulador , y se sabe que la mayoría de los sistemas embriogénicos requieren , para la inducción de los embriones de una alta concentración de auxinas (generalmente 2-4-D) en el medio esto porque las auxinas como se dijo anteriormente tienden a llevar a una modificación a las células modificando su funcionamiento celular y activan su metabilismo y como consecuencia la división celular y el crecimiento celular . El ácido naftalenacetico (ANA) se usa normalmente para inducir la formación de raíces adventicias, que sería uno de los beneficios que tendríamos con el uso de ANA.

Comparando con otra referencia, se realizó un estudio para crecimiento de callos en zanahoria donde presentan varios tratamientos en los cuales se muestran:

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Como se ve uno de los mejores tratamientos que se mostro fue el 7 en el cual se muestra un parecido con el tratamiento de bieorreactores que se muestra en la Tabla2 que fue de auxina(ANA) 0.15mg/L y de citoquinina (BAP) 1mg/L , comparando con el estudio realizado se usó una menor concentración de BAP que el de Biorreactores sabiendo que

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las citoquininas que promueven la división y la diferenciación celular , es por eso que se mostró un mejor crecimiento de callo en ese equipo , se duplico el uso de BAP produciendo este efecto .

Las condiciones de incubación deben ser adecuadas, debe de incubarse el medio tapándolo con polipropileno, incubar a una temperatura de 24-26°C con un fotoperiodo de 16 horas de luz por ocho de obscuridad.El medio debe de estar bien tapado, esta puede ser una fuente de contaminación de algunos de nuestros medios.

6 ConclusionesAlgunos de los puntos criticos de la preparación del medio MS es la humedad que hay en él, debe tener un pH dentro del rango aceptable, y se deben de esterilizar y tapar de forma adecuada para evitar contaminaciones.

La desinfección de un explante de zanahoria (Daucus carota), debe ser con una solución de hipoclorito de sodio que tenga una concentración adecuada, además se require de un tiempo necesario para desinfectar los explantes, y no matarlos.

Se tomaron explantes de zanahoria en condiciones asépticas, y se cultivaron en medio MS.

Se observo el comportamiento de los reguladores empleados en los cultivos vegetales a diferentes concentraciones, a través de los callos obtenidos.

Hubo mayor obtención de callos a la concentración de 0.5x (0.0175mg/L) de ANA y 0.5x (0.0175mg/L) de BAP, en menos tiempo.Los reguladores presentan diferentes comportamientos dependiendo de su concentración y de lo que se quiere obtener en el medio de cultivo.

El callo de zanahoria (Daucus carota) que es capaz de diferenciarse se debe de observar friable, de un color blanco y verdoso.

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7 Referencias

Salvador Rojas González , Jairo García Lozano, “Propagación Asexual de plantas”, Edit.

Corpoica, pag-10-12.

William M. Roca, Luis A. Mroginski,” Cultivo de tejidos en la agricultura: fundamentos y aplicaciones”,Edit.CIAT.1991.pag.433.

8 Anexo 1: Cuestionario práctica 1

1. Investiga y clasifica los componentes del medio de cultivo MS

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2. Elabora un diagrama de bloques que describa como es preparar

3. Define que es totipotencialidad

Del latín totuspotens, "totus" (todo) y "potens" (poder o habilidad), el término célula totipotencial es utilizado en biología para refrirse a células que poseen la capacidad de dar origen a otros tipos celulares, incluso pudiendo una sola de estas células dar origen a millones de células, tejidos, órganos, hasta incluso embriones. Diferenciación en cualquier tipo de célula

La mayoría de especies vegetales mantienen esta característica de totipotencialidad en gran parte de sus células, y de llevar a buen término la generación de un nuevo espécimen, asexualmente Así mismo, muchos animales poseen regiones corporales con este tipo de células y pueden regenerar tejidos. Las "células madre" son un ejemplo de células totipotenciales. También la totipotencialidad es una característica que posee la mórula, que luego de la blastulación comienza a dar origen a nuevas células con distintas funciones.

4. ¿Qué es un tejido meristemático?

De la palabra griega meristos que significa divisible, este se caracteriza por su activa división celular y es el encargado del crecimiento del vegetal. Se encuentran en Apicales, Laterales e Intercalarios

Pesar el medio basal MS 3.01g

para 700 ml

Disolver con agitación en 50

ml de agua destilada

Suplementar con los reguladores de crecimiento.

2,4-D y BAP, ANA

Agregar 20g/l de sacarosa y

disolver

Ajustar el pH del medio con NaOH 1N o H2SO4 1N a

5.8

Agregar 0.25 gr de agar y

completar el volumen total

del medio

Homogenizar y clarificar el

medio

Vaciar cada frasco gerber

con el volumen requerido

Esterilizar a 121°C durante

15 minutos

Enfriar y colocar mega-pack a cada tapa de cada frasco.

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5. ¿Qué es un callo vegetal?

Tejido desorganizado formado por una masa de células vegetales tumorales debido a que éstas crecen de manera descontrolada. La mayoría de estas células están en estado diferenciado salvo algunas que revierten al estado indiferenciado

6. ¿Qué es el cambium? Realiza un esquema que ilustre el cambium de una zanahoria

Es un tejido vegetal meristemático específico de las plantas leñosas, situado entre la corteza y el leño, compuesto normalmente por una capa única de células embrionarias. Cada año el cámbium origina dos capas de células adultas. La primera, hacia el interior, es de leño (xilema); éstas son las que forman la madera y se reconocen luego como anillos de crecimiento. La segunda, hacia afuera, es otro tipo de tejido el floema, que transporta savia elaborada en dirección a las raíc

7. ¿Qué es una solución stock o solución madre y como se prepara?

Son composiciones concentradas de nutrientes las cuales están formuladas por sales minerales que se emplean en un medio particular. Debido al elevado número de compuestos que incluye y a que algunos de ellos se emplean a muy baja concentración, resulta más práctico preparar soluciones madre o "stocks" concentrados.

Para prepararlo se utilizan para la preparación de las 4 soluciones que componen al medio de cultivo para la propagación de plantas in vitro es por ello que al momento de querer preparar dicha solución se deben de hacer cálculos dependiendo la cantidad de plantas que se deseen cultivar, de acuerdo a esto mediante los cálculos ya que por medio de estos

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se indicara cuanto se pesara de cada componente del MS; con el fin de poder obtener un buen manejo y por lo tanto esto permite que se tenga una buena propagación.

8. ¿Cuáles son los disolventes comúnmente empleados para preparar 2,4-D, ANA, BAP y ZINETINA? Sacarosa, agua, glicerol, etc.

9. ¿Qué es la técnica aséptica?

El término aséptico significa "sin microorganismos." La técnica aséptica se refiere a las prácticas que reducen la posibilidad de que los microorganismos entren en el cuerpo durante procedimientos clínicos, reduciendo así a su vez el riesgo de que los usuarios se infecten más tarde. Algunas de estas prácticas también disminuyen la posibilidad de que los profesionales de salud tengan contacto con sangre y tejidos infecciosos durante los procedimientos clínicos.

10. ¿Qué es el fotoperiodo? ¿En qué unidades se mide?¿Cuáles son los rangos de intensidad y duración de luz mas comunes?

Son los cambios de iluminación que reciben las plantas, que pueden modificar su germinación. Siendo un lapso de tiempo en horas y fracción que dura el día civil más la duración de los crepúsculos matutino y vespertino.

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9 Práctica 2: “Cultivo en suspensión”

10 Objetivos

GENERAL:

“Conocer el procedimiento para el cultivo de células vegetales en suspensión con el medio Murashige and Skoog (MS)”

ESPECÍFICOS:

Realizar los procedimientos para los cultivos de células vegetales en suspensión. Analizar las diferentes concentraciones de citosinas y auxinas en cada uno de los

equipos y comprobar los resultados En base a análisis y resultados ver la eficiencia del medio en suspensión y las

deficiencias del mismo y las posibles mejoras.

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11.1 Metodología

11.2 Preparación del medio MS

11.3 Siembra de callos en medio líquido

Pesar el medio basal MS

Disolver con agitación en l de agua destilada

Suplementar con los reguladores de

crecimiento. 2,4-D y BAP, ANA

Agregar 20g/l de sacarosa y disolver

Ajustar el pH del medio con NaOH 1N o H2SO4

1N a 5.8Homogenizar el medio

Vaciar en dos matraces Erlenmeyerde 500 mL el volumen requerido

Esterilizar a 121 °C durante 15 minutos

Enfriar cada matraz y rotular

Se pesaron los matraces con medio

MS

Se tomó el explante con callo en

condiciones de esterilidad

Se colocó el explante en caja petri estéril con

papel filtro

Se cortó el callo

Después , el callo se colocó en el

matraz con medio MS

Se pesó el matras con medio MS y

calloSe colocó el matraz en agitación a 150

rpm

Se incubó a 25 °C

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12 Resultados

Las citoquininas más usadas en cultivo de tejidos son quinetina, benziladenina y zeatina Se las adiciona en relativamente bajas del orden de 0,1 a 1 mg/L. Son solubles en HCl 1 N.

En el cuadro 1 se muestran las concentraciones utilizadas por cada equipo en la práctica de cultivo en medio sólido.

Cuadro 1. Concentración obtenida por los equipos

EQUIPO Auxinas Citocinas

Poison 0.5 x→0.0125 mg → 0.0125 mg →6.25x10-3 ml

0.5 x→0.0125 mg → 6.25x10-3 ml

Avenger 0.5 x 1 x

Hijos de UPIBI 1x 2 x

Biorreactores 1.5 x 1 x

En el cuadro 2 se muestran los pesos obtenidos de los matraces antes y después de inocular con los callos obtenidos previamente en la práctica de cultivo en medio sólido.

Cuadro 2. Peso de la biomasa obtenida

Cultivos en suspensiónMatraz pesos (antes de inocular) g

Matraz pesos (después de inocular)g

Peso del callo inoculado

Avenger-poison 122.2864 g 125.4395 g 3.1531 g

Avenger-bio 113.2929 g 116.6303 g 3.3374 g

En el cuadro 3 se muestra los resultados obtenidos de la observación de cada equipo del cultivo de células vegetales en medio líquido a las 4 semanas de edad, describiendo si se presentó crecimiento o no de células vegetales, si se presentó diferenciación en alguno de los cultivos o no.

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Medio Liquido

Equipos Edad(inoculo)

Estado del cultivo (1 semana)

Estado del cultivo (3 semana)

Diferenciación Crecimiento(+)(-)

Regeneración y Efecto esperado

Bio-reactores

contaminación Altamentecontaminado

no - Las mismas en solido se esperaba un crecimiento medio y alta disgregación.

Hijos de Upibi

4 semanas

Poca turbidez Turbio no - Se esperaba un crecimiento y mucha disgregación

2 semanas

Sin turbidez

Avenger -Poison

4 semanas

Poca turbidez Turbio si +++ Células disgregadas Mayor producción de células totipotenciales

Cuadro 3. Observaciones del cultivo en medio líquido.

En la figura 1 se muestra el matraz del medio de cultivo en medio líquido.

Figura 1. Matraz con células vegetales de 4 semanas de edad con callos del equipo Poison (matraz del lado izquierda) y con callos del equipo biorreactores (matraz del lado

derecho).

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En la figura 2 se muestra uno de los matraces del cultivo en suspensión a las 4 semanas de edad, en éste se muestra una disminución del medio de cultivo.

Figura 2. Se observa una disminución del medio se toma una muestra para tinción de Gram Y otra de azul de tripano. Muestra avenger-bio en la fecha 26 /03/2013

Figura 3. Tinción1. En la muestra no se observa muestra de células vegetales o contaminación con otra cepa bacteriana

Figura 4. A la 3 semana se toma otra muestra 9/04/2013 del medio poison avengers.

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Figura 5. Tinción 4 y 5. En la imagen del lado izquierdo, se observan células de azul las muertas (tinción con azul de tripano). En la imagen del lado derecho se observó un

conjunto de células vegetales a 10X.

Tinción 6

Figura 6. Tinción 5. Se observa el aglomerado de las células 40X.

13 Análisis de resultados

Los resultados de la tabla 1 se utilizaron para decidir a qué concentración se iba a trabajar con los reguladores de crecimiento vegetal (citocininas y auxinas) para el cultivo en medio líquido, se eligió la concentración utilizada por el equipo de biorreactores después de hacer un análisis de la friabilidad del callo obtenido por éste equipo, dándonos como resultado la concentración de citocinina de 1 mg/l y una concentración de auxinas de 0.15mg/l.

En el medio se utilizaron más auxinas que citocinas ya que con las citocinas logra el crecimiento celular de los callos obtenidos y así logramos un mayor proceso de crecimiento ya que al llegar a la célula provoca dos respuesta en esta una rápida y otra lenta. La primera hay un crecimiento rápido de las vesículas de la célula donde los genes ya estimulados que sintetizan las ATP asas y enzimas hidroliticas en la pared celular de nuestras células. Las ATP asas tienden a bombear protones donde hay enzimas hidroliticas donde rompen la pared celular.

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Y en el otro caso la respuesta lenta es en el aplazamiento o regresión de los que logran la generación de nuevos compuestos de la pared celular de nuestras células.

Y en el caso de las citocininas promueven la división de nuestras células y la división de estas pero en nuestro caso queríamos un aumento mayor en biomasa y no el surgimiento de nuevos órganos de la célula ya sea en tallos y raíces si nuestro objetivo era el de obtener un planta o generar varias plantas en cultivo in vitro pero en nuestro caso no era.

Ya que con el conjunto de estas era la de favorecer el ciclo celular ya que lo que queríamos era mejorar el rendimiento de la célula y así lograr un mayor producción de biomasa.

En ese caso se utilizó un medio líquido ya que la célula tendría mayor libertad de desplazamiento y así aprovechar los nutrientes en el medio y favorecer al crecimiento necesario y en otro caso la de incubación ya que se pude agitar y mantener en eses estado y distribuirlos en su medio y las condiciones de temperatura y estrés al cual fue sometidas al tapar con aluminio el matraz. Cabe mencionar que el matraz Avenger-poison se inoculó con 3.1531 g de callo aproximadamente debido a que se pudo haber sembrado parte del explante de la zanahoria debido a la inexperiencia por parte de los alumnos para extraer sólo al callo. El matraz Avenger-biorreactores se inoculo con 3.3374 g de de callo pudiendo ocurrir el mismo error ya explicado.

Figura 7. Para un mejor resultado se estresó a las células y se les colocó papel aluminio a los matraces, se volvió a incubar se revise una semana después de vacaciones.

En el caso de viabilidad, se realizaron tinciones de Gram para cada uno de los matraces por duplicado y también se realizó por duplicado, tinción en fresco con azul de tripano donde se comprobó que el medio estaba libre de patógenos.

En la tabla 3, se presenta una prueba de contaminación por medio de las tinciones de Gram y con la tinción de azul de tripano en dónde algunos equipos anotaron que sus

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cultivos casi no tenían turbidez esto debido a que se encontró en bibliografía que como norma general, los cultivos se inoculan con una densidad celular relativamente elevada (2x105 células/mL), durante la incubación esta densidad se eleva hasta 4x106 células/mL, lo que se supone que 4 a 6 divisiones en 21- 28 días de incubación (Coll, 1993), por lo tanto fue normal no encontrar mucha turbidez en los matraces hasta las 3 semanas de edad del cultivo en líquido.

En la tabla 3, también se analizó si las células en suspensión presentaron diferenciación celular, en dos de tres 3quipos no se presento está diferenciación, pero en el equipo Poison-Avenger se encontró gracias a la profesora, diferenciación celular, la cual pude apreciarse en la figura 6 de la presente práctica.

En la figura 4 observamos que los matraces de medio de cultivo liquido con células en suspensión disminuyeron su volumen por evaporación de agua y consumo de nutriente en el medio.

En cuanto a la diferenciación de células vegetales encontradas en nuestro medio de cultivo, en bibliografía se encontró que debido a la adición de ANA a un medio con bajo BAP, favorece el crecimiento de raíces con o sin callo; y que a mayores niveles de ANA el crecimiento del callo aumenta (A. Rodríguez et al., 1980), eso podría explicar el porqué de la diferenciación presentada en nuestros cultivos, una hipótesis con respecto al por qué no se presentó diferenciación en los cultivos de los otros equipos, pudiera ser por la contaminación que se presentó en sus matraces, impidiendo así la proliferación de las células vegetales.

14 Conclusiones

Se realizaron los procedimientos para los cultivos de células vegetales en suspensión con éxito, debido que en el matraz con medio líquido se consiguió la producción de células vegetales sin contaminación cómo se mostro en la figura 6, aunque cabe mencionar que el objetivo original de la práctica es la producción de carotenoides.

Se analizó las diferentes concentraciones de reguladores de crecimiento vegetal, citocinas y auxinas en cada uno de los equipos y comprobar los resultados, se utilizó la concentración de reguladores del equipo de biorreactores; de citocininas se utilizó una concentración de 1 mg/l y

de auxinas una concentración de en un volumen de 0.15mg/l.

Se concluyo que debido a la adición de ANA a un medio con bajo BAP, favorece el crecimiento de raíces con o sin callo; y que a mayores niveles de ANA el crecimiento del

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callo aumenta según lo reportado por A. Rodríguez et al., 1980, y que debido a la contaminación de los otros equipos, éste efecto sólo se presento en nuestro cultivo.

15 Referencias

A. Rodríguez J., Beltrán J. Ceballos, L. F.& M. Roca, W (1980) Guía de estudios. El cultivo de meristemos de Yuca. Cali, Colombia: Centro internacional de agricultura tropical, CIAT.

Coll Morales, J. (1993) (Vol. 1) Técnicas de diagnostico en virología. Madrid: Ediciones Díaz de Santos.

Eichhorn, Evert, Raven (1992) Biología de las plantas. Barcelona: editorial Reverté.

Vol. 46, (1998) Cultivo y uso del bambú en el Neotrópico. Revista de biología tropical. Universidad de Costa Rica.

16 Anexo 2. Cuestionario práctica 2

1.- Que función tiene el BAP?Estimulan la división celular y crecimientoInhiben el desarrollo de raíces lateralesPromueven las organogénesis en los callos celulares Promueven el desarrollo de los cloroplastosRetrasan la secuencia o envejecimiento de los órganos vegetales

2.- ¿Qué función tiene el 24-D?Es un inhibidor del crecimiento al imitar a la hormona auxina de la planta

3.- ¿Que es la friabilidad?Grados de disgregación de una célula

4.- ¿Menciona, por lo menos una estrategia para incremental la friabilidad de las células?Para aumentar la friabilidad (callo disgregable) del tejido calloso, se incrementa la concentración de auxinas o se disminuye la concentración de citoquininas en el medio de cultivo.

5.- investiga y comenta un ejemplo de la aplicación de cultivo de células en suspensión aplicado a la farmacología.El cultivo de células, (suspensiones celulares) permite un manejo similar al que se realiza con microorganismos, lo cual nos sirve para la obtención de metabolitos secundarios de interés farmacéutico, un ejemplo de esto es la obtención de antraquinonas de Morinda Citrifolia, la cual se ha utilizado para tratar el cáncer, infecciones, artritis, diabetes, asma, hipertensión, dolor, dificultades menstruales y cecfaleas.

6.- Menciona al menos un método de recuperación de la biomasa o de algún metabolito

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Cromatografía o afinidadProducción de un biocatalizador

7.- Menciona las ventajas que tiene el cultivo de células vegetales frente a los cultivos microbianos y de células animales

Ventajas

Recuperar biomasaObtener subproductosMayores productos

Desventajas

CostosTiempo de obtención del metabolitoEquipo caroCrecimiento lento