CUESTIONARIO-TURBIDIMETRIA

PRACTICAS DE LABORATORIO

CUESTIONARIO DE BIOTECNOLOGIA 1. Cules son las causas ms comunes de los errores para la cuantificacin de biomasa utilizando estos mtodos? A. Errores Podemos agrupar a las fuentes potenciales de error en 3 grandes grupos: 1. Errores del proceso analtico. 2. Errores en la medicin. 3. Errores de clculo. I. Errores del proceso analtico a) Errores aleatorios comunes

y y y y

Pipeteo Recuperacin Dilucin Separacin de la fraccin libre de la unida

b) Errores aleatorios anormales outliers o flyers Error en el uso de tubos Doble dispensamiento de algn reactivo en el mismo tubo Falta de un reactivo en algn tubo Generacin de burbujas al dispensar

y y y y

c) Errores sistemticos Generan desviaciones del valor asignado como verdadero.

y y y y

Incorrecto tiempo de incubacin Incorrecta temperatura de incubacin Alteracin en el proceso de separacin de la fraccin unida Errores tcnicos (error en el volumen dispensado de estndar, control, muestra, trazador o anticuerpos)

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II.

Errores en la medicin. Dependen de la naturaleza de la seal que mido. En caso de radiactividad: a) Errores de fondo. Ruidos trmicos del instrumento. Contaminacin. Spillover (contribucin de radiacin de otros nucledos). Crosstalk (actividad por irradiacin de otro nucledo).

y y y y

b) Errores de conteo Falta de calibracin del aparato de medicin. Errores estadsticos (Tiempo de conteo incorrecto) Contaminacin del algn tubo. Diferencias de eficiencia de medicin.

y y y y

III.

Errores de clculo. a) Errores de los calibradores o estndares. Errores en la concentracin de los estndares. Errores en el clculo de la curva Dosis Repuesta Naturaleza de la curva Dosis Repuesta

y y y

b) Errores en la interpolacin en la curva Dosis - Respuesta Error en el clculo de los desconocidos. Errores en la identificacin de algn tubo.

y y

TURBIDIMETRIA: El error de proceso analtico de pipeteo en el momento de las diluciones. La sedimentacin rpida de la muestra, en el caso de las levaduras.

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PESO SECO La principal causa de error de medicin en este mtodo es la dificultad de pesar menos de 1 mg con exactitud en las balanzas habituales de laboratorio. Tambin la muestra seca puede recobrar humedad durante el pesado, principalmente si el ambiente tiene una humedad relativa alta. La presencia de slidos en el medio

RECUENTO EN PLACA Una causa de error de proceso analtico en este mtodo es el uso de un medio de cultivo inadecuado de enriquecimiento selectivo para la incubacin del microorganismo. Tambin un mal manejo en la introduccin de las campanas, pueden introducir gas y errar los resultados.

http://aulavirtual.usal.es/aulavirtual/demos/microbiologia/unidades/documen/uni_ 02/58/texthtml/cap804.htm http://www.qb.fcen.uba.ar/microinmuno/SeminarioRecuento.htm

2. Cules son las ventajas y desventajas de los mtodos utilizados? TURBIDIMETRIA VENTAJAS Es un mtodo rpido y reproducible. DESVENTAJAS Solo se puede aplicar a microorganismos unicelulares. Este mtodo slo da una estimacin del nmero de microorganismo (viable y no viable) y sirve slo para cargas altas. Es afectada por burbujas y slidos no disueltos. Es sensible en un rango acotado de concentracin (igualmente la muestra se puede diluir). Normalmente se usan longitudes de onda de aproximadamente de 540 nm.

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RECUENTO EN PLACA VENTAJAS La tcnica es apta para microorganismos unicelulares y para cultivo de esporas. La capacidad de estimar tamaos poblacionales basados en atributos relacionados a un proceso (selectividad); por ejemplo: Se puede determinar la densidad poblacional de organismos que pueden nodular leguminosas en una muestra de suelo usando el mtodo de infeccin de plantas. Es posible enumerar tambin por este mtodo microorganismos anaerobios utilizando en los tubos medio prerreducido, que se tapan con un tapn de vaselina-parafina luego de inocular y se incuban en condiciones aerobias. Se prefiere tambin este mtodo cuando los microorganismos son de lento crecimiento, o cuando han sido sometidos a condiciones adversas (temperatura alta, desecacin, etc.). Provee una recuperacin uniforme de las poblaciones microbianas de suelos diversificados. Determina slo organismos vivos y activos metablicamente. Suele ser ms rpido e igual de confiable que los mtodos tradicionales de esparcimiento en platos de cultivo, entre otros. Este mtodo es especialmente til para determinar cargas microbianas bajas, menores de 10 por gramo, pero puede igualmente emplearse para cargas mayores utilizando las diluciones apropiadas.

DESVENTAJAS Se considera semicuantitativo, porque slo da una estimacin. Solo es posible utilizar este mtodo para determinar la biomasa de microorganismos productores de gases. Es un mtodo muy lento (requiere ms de 24 horas).

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PESO SECO VENTAJAS Esta tcnica es til para grandes volmenes de muestra. Es un mtodo rpido. DESVENTAJAS Se necesitan aproximadamente 24 hs para secar el material. Interfieren los slidos no disueltos del medio de cultivo. No se discrimina entre material viable y no viable. Es muy poco sensible. Las prdidas de componentes voltiles de la clula por el proceso de secado y existir alguna degradacin. No diferencia clulas vivas de muertas y su sensibilidad es limitada. La muestra seca puede recobrar humedad durante el pesado, principalmente si el ambiente tiene una humedad relativa alta. Es difcil pesar menos de 1 mg con exactitud en las balanzas habituales de laboratorio. 1 mg de peso seco equivale a unas 5x109 bacterias.

http://www.microbiologia.com.ar/bacteriologia/fisiologia.php?Mostrar=medidahttp://www.textil.org/extranet/inf/Revista9/pag20.pdf http://www.qb.fcen.uba.ar/microinmuno/SeminarioRecuento.htm

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3. Esquematice y esplique el mtodo de recuento de clulas por mtodos electrnicos? 4. Mencione otros mtodos de estimacin de biomasa? Existen varias formas de cuantificar las poblaciones microbianas, las cuales se pueden agrupar en dos tipos de procedimientos: mtodos directos y mtodos indirectos. I. MTODOS INDIRECTOS:

Usan parmetros que no son directamente el nmero de clulas, sino otros parmetros relacionados con la cantidad de poblacin, como por ejemplo el peso seco, cantidad de protenas, cantidad de clorofila, etc. PESO SECO/FRESCO Como resultado del crecimiento, se produce nueva biomasa. Una tcnica que permite realizar una estima indirecta de esta biomasa es la determinacin del peso seco de una alcuota de un cultivo. Se toma una alcuota del cultivo y se retiran las clulas, bien por centrifugacin o filtracin. En la centrifugacin previamente hay que pesar el tubo donde vamos a retirar las clulas, a continuacin lo ponemos en una estufa para eliminar el agua, despus se vuelve a pesar el tubo y por la diferencia sacamos el volumen de lo centrifugado. En la filtracin, se pesa previamente el filtro, se seca y se vuelve a hacer la diferencia. Despus se hacen los clculos. As, podemos saber cunto pesa una clula.

DENSIDAD PTICA El mtodo est basado en la ley de Lambert y Beer.

Turbidimetra: Se mide la "opacidad" o "densidad ptica". El detector se ubica en la misma direccin en la que incide el haz inicial. La Turbidimetra mide la cantidad de luz transmitida por una suspensin. Las poblaciones microbianas en medio lquido actan como suspensiones de partculas, teniendo la capacidad de dispersar la luz que incide sobre estas. El grado de dispersin ser proporcional a la concentracin de clulas presentes. Podemos medir la cantidad de luz que pasa a travs de esa dilucin de partculas o cultivo y mediante una calibracin saber el nmero de partculas de esa dilucin aproximadamente y esto se hace con el espectrofotmetro. Log I0 / I t = A [x] l A este trmino se lo denomina "densidad ptica" Donde: I0=intensidad inicial It=intensidad transmitida A=constante (a baja concentracin de biomasa) x=concentracin de biomasa l=paso de luz

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Nefelometra: El detector se ubica en un ngulo distinto del haz incidente (normalmente 90r). Donde: Log I0 / Is = -B[x] l Is= intensidad de luz CITOMETRIA DE FLUJO ( DENTRO DEL ELECTRNICO) Permite, adems de contar, determinar algunas de las caractersticas de las clulas en una suspensin lquida. Las clulas suspendidas una por una son llevadas a un detector por medio de un conducto de flujo, al pasar por el detector, sobre las clulas se incide una luz lser, de tal manera que se puede detectar fluorescencia, absorbancia y dispersin de luz, que permiten obtener informacin sobre propiedades celulares. Es similar al de conteo en campo elctrico, pero el monitoreo del paso de las clulas es por un haz de lser. El detector registra la interrupcin de este haz. DESVENTAJAS: Alto costo del equipo Solo para microorganismos unicelulares. PERMEABILIDAD DIELCTRICA BIOLUMINISCENCIA Y QUIMIOLUMINISCENCIA

Determinacin del ATP: El ATP se encuentra en todas las clulas vivas, ya que es el agente universal de transferencia de energa, pero se deteriora rpidamente en el momento en que la clula muere. Por esto, la medida del ATP tambin se puede considerar como una medida indirecta de la biomasa Es til, sobre todo, en productos acelulares como por ejemplo las bebidas, en las cuales es fcil separar las clulas de los microorganismos del resto del lquido. Pero es compleja en el caso de alimentos, en los cuales previamente habra que eliminar el ATP del alimento que no son clulas, sin tocar el ATP de los microorganismos. El ATP se puede medir gracias a una tcnica muy sencilla, en la que se usa una enzima proveniente de un organismo (la lucirnaga), los cuales producen luz de forma natural, debido a una reaccin enzimtica. La luciferaza acta sobre la luciferina y en presencia del ATP produce oxiluciferina, hidrolizando el ATP, produciendo CO2 y luz. A ms ATP mayor ser la cantidad de luz. Hoy en da se vende la luciferina y luciferaza purificada y en el momento en que se aade el ATP se produce luz, pudiendo calibrar la cantidad de luz emitida por una cantidad de ATP.

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PRACTICAS

La biomasa es expresada en t rminos de ATP, asumiendo que las clulas tienen una cantidad relati amente constante de ATP, que pierden cuando mueren. Sin embargo la concentraci n de ATP vara segn el estado fisiol gico del microorganismo. Esto dio origen al dosaje del tot l de ATP, ADP y AMP, que sera a constante independientemente del estado fisiol gico de la clula. E

FLUORE

IA

E PE TROSCOPIA DE INFRARROJO CERCANO

La cuenta de clulas somticas reali ada mediante el Contador Infrarrojo de DeLaval y el Contador Electrnico (Fossomatic) es tan confiable como la reali ada con microscopa.

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FIG 1: La bi l

.i i

AB RATORIO

ATP + l i

i

+ O2

oxil i

i

+ AMPi + PPi + CO2

ia del ATP puede emplearse para evaluar la limpieza de las superfi ies en contacto con los alimentos


MASA DE UN COMPONENTE CELULAR

Si la cantidad de una sustancia es constante en cada clula, la cantidad total de dicho constituyente celular, estar directamente relacionada con la masa celular total. Por ejemplo para protenas, ADN, ARN, clorofila.

j Nitrgeno celular: El mtodo utili ado es el de Kjeldahl. DESVENTAJA: El contenido de N vara a lo largo del crecimiento. j Protenas: El mtodo ms utili ado es el de Biuret. DESVENTAJAS: Depende de la composicin de aminocidos (los reactivos se calibran generalmente contra seroalbumina).

j DNA: El ensayo es una colorimetra basada en la reaccin entre la deoxiribosa y la difenilamina. VENTAJA: La concentracin de DNA es bastante constante durante los procesos. DESVENTAJAS Es poco sensible Se usan reactivos peligrosos.

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Fi

2: Contador Infrarrojo de DeLaval

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ACTIVIDADES METABLICAS Relaciona biomasa con alguna velocidad de reaccin metablica Se pueden monitorear por ejemplo: La produccin de gases como CO2. El consumo de sustratos o de O2. Reacciones de reduccin de colorantes especficos.

En el caso del consumo de sustratos, se debe tener en cuenta que parte del consumo se destina al mantenimiento y solo una parte de estos se destina al crecimiento de la biomasa. II. MTODOS DIRECTOS:

Son los que permiten estimar directamente el nmero de clulas de la muestra. CONTEO EN CAMPO ELCTRICO (RECUENTO ELECTRNICO)

Para realizar recuentos de microorganismos se pueden utilizar un instrumento electrnico llamado contador de partculas de Coulter. Lleva una sonda en cuya base lleva un orificio, en ese tubo lleva un electrodo conectado a una fuente de voltaje y por fuera del tubo lleva otro electrodo El tubo lleva dentro una solucin electroltica (conduce la electricidad). El circuito se cierra con la muestra, colocndola en una cubeta con una solucin electroltica y ya puede pasar la corriente. Al Coulter se le puede indicar el volumen que me interesa contar, porque est asociado a una bomba de vaco que chupa a travs del orificio el volumen que interesa. Al chupar la bomba, las clulas comienzan a entrar por el orificio y cuando pasa una partcula cae la corriente y despus se vuelve a recuperar. Este cambio de corriente adems es proporcional al tamao de la partcula y le podemos indicar que slo cuente las partculas de un tamao determinado, mediante un calibrado. Uno de los inconvenientes es que pueden pasar ms de una clula junta o tambin que pueden pasar partculas que no son clulas y se cuentan como clulas. Se hace pasar las clulas por una pequea apertura en la cual est aplicado un campo de corriente elctrica constante. Como las clulas son generalmente no-conductoras, al pasar por la apertura generan un incremento en el voltaje (resistencia). La concentracin de la muestra debe de ser tal que pase una sola clula a la vez por la ranura. Tambin se puede calcular el tamao de la clula, ya que el cambio en la resistencia es proporcional al tamao. Esto es importante si se quiere monitorear los cambios en la evolucin del cultivo.

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Fig. 3: El Contador Electrnico (Fossomatic)

DESVENTAJAS: Est restringido a medios de cultivo definidos (por la conductividad del medio). Solo aplicable a microorganismos unicelulares. Equipo costoso (Coulter counter) VOLUMETRICO

Si es poco volumen de muestra se hace como un hematocrito (en capilar).Si el volumen es mayor se centrifuga en un tubo graduado. En cualquier caso se debe estandari ar las condiciones en las que se sedimenta la biomasa. Volmenes mayores: se determina el empaquetado celular (CPV= cell pack volume) por simple decantacin.

t=5 min

Fig 4: A non-invasive method for the routin-estimation of fresh wieght of cell grown batch suspension culture.

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DESVENTAJA: La manera en que sedimenta la biomasa depende de la morfologa del cultivo (ejemplo: hongos filamentosos) esto trae un sesgo importante en los datos.

RECUENTO DE VIABLES

La tcnica se basa en el plaqueo de la muestra y el recuento de colonias. Su demora en la obtencin de los resultados lo hace poco prctica para el monitoreo de procesos. Tcnicas de recuento en placa: Es el mejor mtodo para determinar clulas vivas. Se realiza sembrando un determinado volumen de la muestra sobre placas con medio de cultivo, el cual debe permitir el crecimiento o de una gran cantidad de microorganismos o slo de los que nos interesan. Se basa en la hiptesis de que todas las clulas formarn una colonia y que todas las colonias surgen de una sola clula (aunque no va a ser as exactamente). Dentro de los medios de cultivo tenemos: medios selectivos, medios enriquecidos y medios diferenciales. En general, todos los medios de cultivo son selectivos, porque no permiten el crecimiento de todos los microorganismos. Antes de hacer las siembras hay que hacer las diluciones seriadas. A partir de cada dilucin hay que hacer una siembra y una vez que est incubado se escoge para contar aquella placa que nos d un contaje entre 30 y 300 colonias y sabemos de qu dilucin procede. Existen tres mtodos para hacer el recuento: Recuento por siembra en superficie: A partir de la dilucin madre se hacen las seriadas, de ellas se toma una parte y se aade a la placa que tiene el medio de cultivo slido y con un asa se extiende la siembra por la superficie de la placa y despus de incubada se hace el recuento. Las ventajas son que permite ver la morfologa , color y textura de las colonias y adems es el mejor mtodos para el crecimiento de aerobios estrictos , la desventaja es que lleva ms tiempo , hay que usar el asa de Drigalski que hay que esterilizar y adems slo permite sembrar volmenes muy pequeos ( hasta 0'1 ml ) . Recuento por siembra en inclusin: Se siembra en placas Petri vacas y a continuacin se aade el medio de cultivo fluido todava y con movimientos circulares ligeros se homogeniza. Por lo que los microorganismos crecen dentro del agar una vez solidificado. Recuento por filtracin de membrana: Un volumen conocido se filtra a travs de una membrana estril de 0'22 micras, con lo que las bacterias quedan retenidas en el filtro y despus es el filtro el que se coloca sobre el medio de cultivo y se incuba. Para facilitar la filtracin cuando el

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volumen de muestra es muy pequeo, esta se disuelve en un volumen indeterminado de una solucin estril. Este volumen no influye en el recuento porque est estril, y se est filtrando toda la muestra, por lo que slo se recuenta lo que hay en 1 ml de muestra.

Mtodo de las gotitas de Agar: La muestra se diluye realizando diluciones seriadas en tubos con el medio de cultivo slido, pero fundido, y luego se transfiere a una placa Petri gotitas de 0'1 ml de cada dilucin, se incuba y se cuentan las colonias con una lupa de 10 aumentos. Este mtodo suele ser ms rpido que los mtodos convencionales de recuento en placa y gasta mucho menos material. Tcnicas del nmero ms probable tambin de viables: La tcnica consiste en sembrar en distintos tubos, conteniendo un medio de cultivo lquido apropiado, distintos volmenes de la muestra problema. Una vez realizada la incubacin de los tubos se valora aquellos en los que se produjo crecimiento de los microorganismos que nos interesa cuantificar, anotando el nmero de tubos de cada dilucin realizada que dieron positivos. Con este resultado se va a unas tablas estadsticas realizadas para esto (tablas del NMP), que dan el nmero ms probable de microorganismos considerados por unidad de volumen, junto con el intervalo de confianza para este valor. A veces este mtodo se considera semicuantitativo, porque slo da una estima.

Recuento microscpico con cmara de recuento: Cuando nos interesa realizar un recuento de clulas totales, uno de los mtodos ms usados es el de la cmara de contaje usando un microscopio. Es un mtodo directo, ya que determina directa y exactamente el nmero de clulas en un determinado volumen. Para ello, se coloca una suspensin de los microorganismos en las cmaras de recuento, las cuales permiten determinar el nmero de partculas que hay en un determinado volumen. Las partculas se cuentan visualmente, con ayuda de un microscopio. Uno de los tipos de cmaras ms utilizadas, son las de Neubauer: Es una cmara que se utiliza para en conteo de clulas en distintas variedades y est diseada de manera de contener una cantidad fija de lquido y que Consta de un cuadrado central de 1 mm de lado dividido en 25 cuadraditos con una altura de 0.1 mm entre el cubreobjetos y la cmara. sta determina que el lquido quede contenido en un volumen de 0.1 mm3.

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Tabla 1: Mtodos de determinacin del nmero de microorganismos. Mtodo Microorganismos para los que se utiliza La mayora de las bacterias y levaduras Tipo de recuento Indirecto Turbidez Total Determina la turbidez con un espectrofotmetro; rpido y reproducible; la suspensin debe contener ms de unos l0 millones de clulas por ml; se requiere una curva patrn Tedioso y requiere un cierto tiempo, pero preciso y reproducible Requiere un cierto tiempo y puede ser impreciso; puede utilizarse con materiales complejos Muy til para el recuento de un tipo de clulas de una mezcla; requiere un cierto tiempo; no es adecuado para cultivos diluidos Muy til para el recuento de clulas de un cultivo axnico; rpido y preciso; no debe estar presente material extralio Muy sensible - puede detectar incluso una clula; lento y tedioso; para evitar el error debido al muestreo, se debe recontar un gran nmero de colonias Utilizado para microorganismos que son difciles de cultivar en medio slido y para determinar contaminacin por Escherichia coli en aguas; requiere un cierto tiempo Se concentra una muestra, de manera que se puede recontar un pequeo nmero de clulas a partir de grandes volmenes de un lquido o de un gas Usos / Limitaciones

Peso seco Actividad metablica

Cualquier microorganismo Cualquier microorganismo viable Cualquier microorganismo unicelular Cualquier microorganismo unicelular Cualquier microorganismo unicelular viable Cualquier microorganismo viable

Total Viables Directo

Recuento microscpico Recuento electrnico Recuento en placa

Total

Total

Viables

Numero ms probable

Viables

Filtracin

Cualquier microorganismo viable

Viables

http://html.rincondelvago.com/control-microbiologico-de-calidad.html http://weblogs.madrimasd.org/alimentacion/archive/2008/01/31/83638.aspx

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PRACTICAS DE LABORATORIO http://www.monografias.com/trabajos10/10cincrec/10cincrec.shtml?relacionados http://64.233.169.104/search?q=cache:fMhXeXVGDwJ:www.ffyb.uba.ar/micro_ind/biot1/ Teoricos/estimacion%2520biomasa2004.ppt+estimacion+biomasa2004&hl=es&ct=clnk&c d=1&gl=pe http://www.fcv.unl.edu.ar/archivos/grado/catedras/tecnologialeche/informacion/tp4.pdf

5. Porque se agrega sal al agua antes de diluir la levadura? Las levaduras crecen mejor que la mayora de las bacterias en sustratos que contie nen elevadas concentraciones de soluto (sal). Las levaduras y hongos toleran mejor los ambientes hipertnicos que la mayora de las bacterias las cuales son sensibles a las presiones osmticas, pero existen algunas bacterias que resisten altas presiones osmticas. Las levaduras requieren pH altos, medios poco salados dependiendo poco de las concentraciones de glucosa, para obtener un verdadero desarrollo. Adems que la levaduras tienen una actividad de agua entre 0,88 y 0,94 para el lograr un crecimiento ptimo. W.C. Frazier, D. C. Westhoff, Microbiologa de los alimentos, 4ta Edicin Acribia, Zaragoza-Espaa, 1993.

6. Qu es nefelometra? La nefelometra es un procedimiento analtico que se basa en la dispersin de la radiacin que atraviesan las partculas de materia. Cuando la luz atraviesa un medio transparente en el que existe una suspensin de partculas slidas, se dispersa en todas direcciones y como consecuencia se observa turbia. La dispersin no supone la prdida neta de potencia radiante, solo es afectada la direccin de la propagacin, porque la intensidad de la radiacin es la misma en cualquier ngulo. La intensidad depende de: El nmero de partculas suspendidas, su tamao, su forma, los ndices refractivos de la partcula y del medio dispersante, y la longitud de onda de la radiacin dispersada. La relacin entre variables y es ms factible un tratamiento terico, pero debido a su complejidad raras veces se aplica a problemas analticos especficos. El procedimiento generalmente es emprico y slo se consideran 3 factores: La concentracin: Mayor sea el nmero de partculas, mayor es la dispersin. Tamao de la partcula: Factores como el pH, la velocidad y orden de la mezcla, concentracin de los reactivos, duracin del estado de reposo y la fuerza inica.

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Longitud de onda: Generalmente las muestras se iluminan con luz blanca, pero si estn coloreadas, se debe escoger una porcin del espectro electromagntico en la que la absorcin del medio se reduzca al mnimo.

En las muestras se agregan agentes tensoactivos (como gelatina), para prevenir la coagulacin del coloide. Slo se obtienen datos confiables si se controlan escrupulosamente las variables que afectan el tamao de partculas.

http://es.wikipedia.org/wiki/Nefelometr%C3%ADa 7. Describe el mtodo del nmero ms probable? Se basa en la determinacin de la presencia o ausencia de un determinado tipo de microorganismo (en funcin de que crezcan o de que produzcan determinada reaccin en el medio), en diferentes cantidades de muestra. Segn el tipo de microorganismo que se desea contar se utilizan medios de enriquecimiento selectivos, o medios de propagacin. En funcin de esto se pude considerar como positivos aquellos tubos en los que: a) hubo crecimiento visualizado por aparicin de turbidez b) hubo crecimiento visualizado por desaparicin del sustrato (reaccin qumica coloreada) y/o aparicin de producto final del metabolismo (ej. nitritos o nitratos en medio con sales de amonio). Cada tubo positivo, significa que en la cantidad de muestra en l sembrada haba por lo menos 1 microorganismo de los que se est contando. La interpretacin de los resultados, se hace en base a una distribucin de tipo Poisson, y en general se emplean tablas, como la de Mc Grady, con 3 o 5 tubos por cada dilucin, preparadas de acuerdo a la cantidad de muestra que se siembra en cada serie de tubos.Fermentacin de fuentes carbonadas: se usa YNB con el azcar correspondiente pero en medio liquido y con campana de Durham donde se acumularan burbujas de gases si existe fermentacin.

Descripcin del mtodo del numero mas probable:1. Preparacin del Material Se seleccionaron ocho frascos de vidrio de 300 ml, en el interior de cuyas tapas se coloc papel de aluminio. Seguidamente se envolvieron los mismos en papel de diario, junto con juegos de tres pipetas a utilizar en cada muestreo y se colocaron en la estufa de esterilizacin. 2. Recoleccin de las muestras Se tomaron tres muestras de agua en cada uno de los cuatro sitios se seleccionaro n, utilizando en cada uno de ellos los mismos mtodos.

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PRACTICAS DE LABORATORIO 3. Preparacin del medio de cultivo: En el laboratorio se prepar Caldo Mac Conkey, en simple y doble concentracin, como medio de cultivo para las muestras. Posteriormente se procedi a calentar las mezclas en dos erlermeyers para obtener soluciones homogneas. Luego, el medio es distribuido en 60 tubos de ensayo con sus respectivas campanitas, a razn de 5 ml por tubo, y 12 con Caldo Mac Conkey de doble concentracin, a razn de 10 ml por tubo. Por ltimo, los tubos con el caldo Mac Conkey fueron puestos en la autoclave a 121 C durante 15 minutos, para luego ser trasladados a la heladera. 4. Siembra de las muestras: Se unificaron los contenidos de los dos frascos, para obtener as una muestra representativa de cada sector del ro. Luego se reparti el agua de cada frasco resultante en los tubos de ensayo preparados con caldo de la siguiente manera por cada muestra: 10 ml en cada tubo de doble concentracin (3) ,1 ml por cada tubo de simple concentracin (3), y 0,1 ml, por cada tubo de simple concentracin (3) con una pipeta previamente esterilizada. Los tubos fueron ubicados en una gradilla y se colocaron en el bao termosttico durante 48 horas a 37 C. con los tubos que dieron positivos se tomo una alcuota de cada uno y se colocaron nuevamente en el bao termosttico, pero esta vez a 44 C.

5. Anlisis y recuento de los resultados: Tras la primera incubacin los tubos que presentaron viraje de color, de magenta oscuro a amarillo, y en los que adems se observ produccin de gas, se contabilizaron en nuestra carpeta de campo como positivos, lo que quiere decir que en esta muestra haba presencia de bacteria coliformes. Luego se procedi a sacar el NMP de bacterias coliformes consultando la tabla de NMP. stos fueron cultivados nuevamente, pero esta vez a 44 C, repitiendo el mismo procedimiento. Luego de la segunda incubacin con los tubos que dieron resultado positivo, seleccionando muestras que llamaron nuestra atencin, por ejemplo si formaban un velo sobre la campanita o si su color era particular, se procedi a aislar las bacterias mediante estras en placa de petri estriles con medio agar Levine (EMB), brindado por el laboratorio LAC, que se utiliza para la deteccin de bacilos coliformes, para as poder observar el desarrollo de las colonias de

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PRACTICAS DE LABORATORIO b cte i li. que e incub n, c m ejem l , el b ill met lic de l che ichi

http://www.coopeducativamoreno.com.ar/ uemquemtreu/metodos.html http://usuarios.l cos.es/zandoli/web3/Tabla%20NMP.htm

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