CUANTIFICACION DE TRES GRUPOS TROFICOS PRESENTES EN …
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CUANTIFICACION DE TRES GRUPOS TROFICOS PRESENTES EN LOS REACTORES ANAEROBIOS DE UNA PLANTA DE TRATAMIENTO DE AGUAS RESIDUALES DE UNA INDUSTRIA PRODUCTORA DE CERVEZA Y BEBIDAS DE MALTA DE BOGOTA D.C. MARCELA MEDINA GERENA OSCAR LEONARDO OSORIO ROJAS PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA Facultad de Ciencias Carrera de Microbiología Industrial Bogotá, D.C; 2001
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CUANTIFICACION DE TRES GRUPOS TROFICOS PRESENTES EN LOS
REACTORES ANAEROBIOS DE UNA PLANTA DE TRATAMIENTO DE
AGUAS RESIDUALES DE UNA INDUSTRIA PRODUCTORA DE
CERVEZA Y BEBIDAS DE MALTA DE BOGOTA D.C.
MARCELA MEDINA GERENA
OSCAR LEONARDO OSORIO ROJAS
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
Facultad de Ciencias
Carrera de Microbiología Industrial
Bogotá, D.C; 2001
CUANTIFICACION DE TRES GRUPOS TROFICOS PRESENTES EN LOS
REACTORES ANAEROBIOS DE UNA PLANTA DE TRATAMIENTO DE
AGUAS RESIDUALES DE UNA INDUSTRIA PRODUCTORA DE
CERVEZA Y BEBIDAS DE MALTA DE BOGOTA D.C.
MARCELA MEDINA GERENA
OSCAR LEONARDO OSORIO ROJAS
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
para optar al título de
MICROBIOLOGO INDUSTRIAL
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
Facultad de Ciencias
Carrera de Microbiología Industrial
Bogotá, D.C; 2001
1. INTRODUCCION
Una de las industrias que más carga contaminante aporta es la cervecera con
1.4x108 m3/año de vertimientos, generando a su vez una contaminación de
4.2x105 Kg DQO/año (Espitia et al, 1998). El agua residual proveniente de
una industria cervecera se caracteriza por tasas variables de flujo, altas
cargas orgánicas (2250 mg DQO/L), bajo pH, alta relación carbono-nitrógeno
(C/N) y flexibilidad a la degradación biológica. Este tipo de descargas son
tratadas de manera eficaz mediante la tecnología anaerobia y actualmente en
Colombia por este sistema es tratado un alto porcentaje de vertimientos
industriales (Borzacconi, 1996; Duque, 1996).
Los procesos anaerobios son los más empleados en el tratamiento de
desechos de la industria cervecera y en la alimentaria en general, pues
ofrecen rendimientos de eliminación de DQO del 70% al 80%, baja
producción de lodos, temperaturas de operación entre 25°C y 35°C, bajo
consumo energético, inversiones económicas moderadas comparadas con
otras tecnologías, bajos costos de operación y requerimientos menores de
espacio (Arrieta et al, 1998).
Anteriormente los reactores anaerobios para tratamiento de aguas residuales
industriales y domésticas se percibían como cajas negras selladas a las que
se aportaba un efluente y se obtenía agua tratada, pero sin mayor
conocimiento sobre los procesos microbiológicos y bioquímicos involucrados.
En los últimos años los avances en el diseño y operación de los procesos
anaerobios se han realizado gracias al aporte en el conocimiento de la
fisiología de los microorganismos anaerobios encargados de llevar a cabo
este proceso, en el cual el objetivo principal es la degradación de la materia
orgánica hasta convertirla en metano, dióxido de carbono, e hidrógeno bajo
condiciones de ausencia total de oxígeno.
Esta degradación es realizada por la acción concertada de diferentes grupos
de microorganismos, entre facultativos y anaerobios estrictos que utilizan de
forma secuencial los sustratos generados. Las bacterias hidrolíticas y
fermentativas dan inicio al proceso de degradación, cuando la materia
orgánica en suspensión, con estructura compleja, se transforma en
compuestos solubles, y éstos son degradados a intermediarios metabólicos
como los ácidos grasos volátiles por las bacterias acetogénicas
principalmente. (Muñoz, 1989). Esta etapa es esencial para que se complete
la digestión anaerobia; la formación de metano es el paso terminal en dicho
proceso y el grupo responsable son los organismos metanógenos.
El presente estudio se realizó en una Industria productora de cerveza y
bebidas de malta, que presentaba inconvenientes de manejo de la Planta de
Tratamiento de Aguas Residuales y por lo tanto surgió el interés por conocer
los mecanismos a través de los cuales se lleva a cabo el proceso de
degradación de la materia orgánica presente en sus vertimientos, así como
los grupos tróficos involucrados. De igual forma, era de interés establecer
que relación existía entre los parámetros físico químicos de los lodos y las
poblaciones existentes.
Atendiendo dichas necesidades se realizó el presente estudio, en el cual se
determinó y cuantificó la presencia de tres grupos tróficos en los reactores
metanogénicos (bacterias fermentativas, sulfato reductoras y metanógenos)
mediante la técnica de número más probable (NMP); y al mismo tiempo se
evaluaron parámetros físico químicos como DQO, ácidos grasos volátiles,
alcalinidad, temperatura, pH, sólidos suspendidos volátiles, sólidos
sedimentables y actividad metanogénica, y su influencia sobre dichas
poblaciones.
Estudios de este tipo permiten conocer aspectos sobre las posibles
deficiencias del sistema, aportar soluciones a las mismas y mejorar la
eficiencia del proceso, así como lograr un acercamiento al estado actual de la
planta de tratamiento y contribuir con el conocimiento de las características
del lodo que permitan definir sus potencialidades y deficiencias, ya sea para
utilizarlo como semilla o inóculo en el arranque de reactores anaerobios.
2. MARCO TEORICO
2.1 Vertimientos procedentes de la industria cervecera
Las operaciones de limpieza producen gran parte del volumen de las aguas
residuales a tratar, junto con vertidos de cerveza y subproductos sólidos de la
elaboración como granos de cebada, levadura, etiquetas, tapas; los cuales
tienen como disposición final la red de alcantarillado de la fabrica (cerca del
80% del consumo de agua potable). En la tabla 1 se muestran las
características de los efluentes cerveceros.
Tabla1. Características de los efluentes de una industria cervecera.
PARAMETRO UNIDAD VALOR MEDIO RANGO VARIACION
Consumo/Agua Hl/Hl 7.5 4 - 15
Volumen vertidos Hl/Hl 6 2 – 13
DQO mg/l
Kg/m3
2700
16
2000 – 5000
9 – 20
DBO5 mg/l
Kg/m3
1400
8.5
1000 – 3000
5 – 10
DBO/DQO - 0.55 0.50 – 0.75
N-NH4 mg/l 20 10 - 30
P-PO4 mg/l 10 5 – 50
SO4 mg/l 300 50 – 500
pH 7.5 4 – 12
Temperatura ºC 30 20 - 40
Fuente: Arrieta et al, 1998.
Dentro de las tecnologías de tratamiento de aguas residuales figuran los
procesos biológicos. Estos incluyen dos grandes grupos, aerobios y
anaerobios (Tabla 2), siendo los primeros los que emplean bacterias que se
desarrollan en presencia de oxígeno disuelto en el agua, mientras que en los
segundos, las bacterias solo viven en ausencia total de oxígeno. En éste
último caso las bacterias, o biomasa, convierten la materia orgánica en nueva
biomasa, dióxido de carbono y metano, y gracias al desarrollo de la
tecnología, los procesos anaerobios son los más empleados en la industria
cervecera y en la industria de alimentos en general, por las ventajas que
ofrecen en los costos de operación y en los menores requerimientos de
espacio.
Tabla 2. Comparación entre los sistemas de tratamiento biológico aerobio y anaerobio.
TRATAMIENTO AEROBIO TRATAMIENTO ANAEROBIO
• Porcentaje de remoción de DQO
mayor al 90%
• Alta producción de lodos
• Altos requerimientos energéticos
en la aireación
• Mayor consumo de nutrientes
(DQO:N:P=100:5:1)
• Adecuado para tratar efluentes
hasta de 2000 mgDQO/l
• Porcentaje de remoción de DQO
entre 70 y 80%
• Baja producción de lodos
• Bajo consumo energético
• Baja necesidad de nutrientes
(DQO:N:P=100:0,5:1)
• Adecuado para tratar efluentes
mayores a 1500 mgDQO/l
• Necesidades de espacio reducidas
Fuente: Arrieta et al, 1998.
2.2 Degradación anaerobia de la materia orgánica
La tecnología anaerobia se basa en un proceso de eliminación de la materia
orgánica conocido como metanogénesis (Figura 1). Este es un importante
proceso aceptor terminal de electrones en muchos ambientes anaerobios,
donde los sustituyentes del oxígeno, nitratos, formas oxidadas del sulfuro,
hierro y manganeso son limitados. Ejemplos de algunos de estos ambientes
incluyen sedimentos marinos y de agua dulce, suelos anegados, hojas
húmedas de árboles, tundra y lodos de digestores (Metcalf & Eddy, 1995).
HIDROLISIS Bacterias Fermentativas e Hidrolíticas
FERMENTACION
Bacterias Fermentativas
H2 + CO2
Bact. Homoacetogénicas Bact. Oxidantes de Acidos Grasos HOMOACETOGENESIS ACETOGENESIS Metanógenos Metanógenos Acetoclásticos Hidrogenofílicos METANOGÉNESIS
Figura 1. Esquema de la bioquímica del proceso anaerobio
Fuente: Orozco & Salazar, 1990.
POLIMEROS COMPLEJOS Celulosa
Polisacáridos Proteínas
MONOMEROS Azúcares
Aminoácidos
H2 + CO2 ACETATO PROPIONATO BUTIRATO
ACETATO H2 + CO2 ACETATO
METANO
En estos ambientes una compleja comunidad microbiana degrada
completamente polímeros naturales como polisacáridos, proteínas, ácidos
nucleicos y lípidos a metano y dióxido de carbono. Debido a las grandes
cantidades de materia orgánica que son degradadas en ambientes naturales,
la metanogénesis es un proceso importante dentro del ciclo de carbono y
otros elementos en la naturaleza, y puede ser responsable de más del 60%
del metano atmosférico (Figura 2).
Bacterias Fermentativas ÄGº (Kj/reacción)
C6H12O6 + 2 H2O CH3CH2CH2COO- + 2 HCO3- -135
Bacterias Acetogénicas productoras Obligadas de Hidrógeno (APOH)
CH3CH2CH2COO- + 2H2O 2CH3COO- + H+ + 2H2 +48.1 Bacterias Sulfato Reductoras
CH3COO- + SO4
-2 + 3H+ 2CO2 + H2S + 2H2O -97.5
Organismos Metanógenos OM. Hidrogenotróficos
HCO3
- + 4 H2 + H+ CH4 + 3 H2O -105
OM Acetotróficos
CH3COO- + H2O CH4 + HCO3- -3.1
Figura 2. Principales reacciones de la degradación de la materia orgánica.
Fuente: Muñoz, 1989
Los bioreactores anaerobios son comúnmente empleados para el tratamiento
de aguas residuales, estabilización de lodos y el tratamiento de corrientes
naturales; sin embargo, la dinámica de la población microbiana no se ha
estudiado extensivamente (Raskin et al, 1994). Los estudios acerca de la
dinámica de estas comunidades en ambientes naturales y artificiales han sido
de difícil realización, especialmente los estudios sobre metanógenos y
bacterias sulfato reductoras, por su lento crecimiento y exigentes
requerimientos para su cultivo (Raskin et al, 1995).
2.3 Etapas de la degradación anaerobia de la materia orgánica
2.3.1 Hidrólisis o Fermentación
En la hidrólisis la materia orgánica como polisacáridos, grasas y proteínas, es
transformada en compuestos solubles, como azúcares simples, aminoácidos y
ácidos grasos, por acción de las bacterias fermentativas o hidrolíticas, que
comprenden un complejo consorcio de diferentes especies; la cinética del
proceso es rápida a pH bajo (5.8 – 6.2). Esta etapa es esencial para que se
complete la digestión anaerobia; es preciso indicar que al final de esta fase el
grado de acidificación, medido por la relación ácidos grasos
volátiles/demanda química de oxígeno (AGVs/DQO) total, debe estar
comprendido entre 25 – 35% (Arrieta, 1998).
Muchas de las especies de bacterias fermentativas son anaerobios obligados,
pero algunos facultativos como bacterias entéricas, Streptococcus sp y
Bacillus sp también se encuentran presentes. Las bacterias anaerobias
pertenecientes a los géneros Bacteroides sp, Bifidobacterium sp, Butyrivibrio
sp, Acetivibrio sp, Anaerovibrio sp, Clostridium sp, Eubacterium sp y
Ruminococcus sp entre otros, son las poblaciones fermentativas
predominantes en digestores anaerobios (Hobson, 1973; García, 1992).
2.3.1.1 Regulación del metabolismo fermentativo
Como ya se mencionó, el primer paso en la digestión anaerobia es la
hidrólisis de sustratos poliméricos. Para muchos residuos, especialmente
aquellos con alto contenido de celulosa, la fase hidrolítica como tal puede ser
limitante (Pfeffer & Liebman, 1976), pues de ocurrir un incremento en el
caudal del vertimiento que implique choques de cargas orgánicas, la
población fermentativa se ve estimulada y debido a su alta tasa de
crecimiento producen una rápida acumulación de metabolitos como
propionato y butirato, que pueden afectar las etapas siguientes del proceso
de degradación anaerobia como la acetogénesis y metanogénesis.
La concentración de hidrógeno (H2) o formato en el ecosistema anaerobio
juega un papel importante en la regulación del tipo y la cantidad de
productos sintetizados por las bacterias fermentativas. Estos microorganismos
tienen la capacidad de reoxidar sus transportadores de electrones como la
nicotinamida adenina dinucleótido (NADH2) reduciendo protones a H2; esta
reacción es favorable solo cuando la presión parcial de hidrógeno (ppH2) es
baja, alrededor de 100 Pa (Stams, 1994). Si la ppH2 es alta (por encima de
1200 Pa), por ejemplo cuando la metanogénesis es inhibida como resultado
de un choque de cargas orgánicas, la producción de H2 a partir de NADH2 es
desfavorable, y el flujo de electrones se -desvía dando lugar a la formación
de productos reducidos como el etanol, lactato, propionato, butirato, etc.
Numerosos estudios muestran que cuando los organismos fermentativos
crecen en asociación con microorganismos hidrogenotróficos, se produce
poca cantidad de etanol o lactato, mucho menos propionato y butirato, pero
más acetato y CO2 (Stams, 1994).
Resultados de simulaciones realizadas con base en modelos matemáticos
muestran que bajo altas concentraciones de carga orgánica y disminución del
tiempo de retención hidráulica (TRH), la concentración de propionato y
butirato se incrementa como respuesta al incremento en la ppH2,
encontrando replicas de estas condiciones en los digestores reales. El papel
regulatorio del H2, por parte de los organismos hidrogenotróficos, también
explica la acumulación de ácidos grasos volátiles cuando la fase de
acidificación es separada de la fase metanogénica, como ocurre en sistemas
de fases separadas, caso de los reactores en estudio. La alta ppH2
encontrada en reactores de acidificación puede hacer la producción de H2 a
partir de NADH2 energéticamente desfavorable y obliga a la población
fermentativa a reoxidar sus transportadores de electrones con formación de
H2 que conduce a la producción de propionato, butirato, lactato más que
acetato.
Se ha observado que microorganismos pertenecientes al género Clostridium
sp (Figura 3) predominan en reactores que operan bajo cargas moderadas
donde una baja ppH2 (200 – 1000 Pa) permite que estos microorganismos
produzcan acetato, CO2 e H2 y en menor medida butirato a partir de la
hidrólisis y fermentación de carbohidratos.
Figura 3. Coloración de Gram de Clostridium sp.
Fuente:Eddleman, 2000
Con lo anteriormente dicho se confirma que la regulación de la concentración
de H2 por parte de microorganismos hidrogenotróficos es un factor
regulatorio de vital importancia en la fase fermentativa y en el proceso de
digestión anaerobia en general, pues va a determinar la producción de
sustratos utilizables por los grupos tróficos involucrados en las últimas fases
de este proceso como las bacterias sulfato reductoras y los metanógenos.
2.3.2 Acidogénesis
En esta etapa se transforma la materia orgánica disuelta (aminoácidos,
azúcares simples, ácidos grasos de cadena larga) en ácidos orgánicos,
alcoholes, ácidos grasos volátiles (AGV), CO2 e H2. La cinética para este
proceso es rápida a pH bajo (5.8-6.2). Como todas las etapas, ésta es
esencial para que se complete la digestión anaerobia. Es recomendable para
la estabilidad del proceso biológico, que esta etapa sea llevada a cabo en un
depósito separado, para que de esta forma los caudales, cargas y pH sean
amortiguados y sigan el proceso a niveles constantes (Klass, 1984). Este
proceso es realizado por un conjunto diverso de bacterias anaerobias
estrictas y facultativas con un espectro fermentativo extremadamente amplio.
Según García (1992), y de acuerdo con lo ya expuesto sobre regulación del
metabolismo fermentativo, los productos intermediarios como el lactato o el
etanol no se acumulan en los ambientes anaerobios como los reactores
metanogénicos, debido a que los organismos hidrogenotróficos consumen
activamente el hidrógeno y desplazan el metabolismo hacia productos más
oxidados como el acetato, hecho que estimula a las bacterias fermentativas a
producir más hidrógeno y acetato, y en menor proporción los demás
metabolitos como el lactato y el etanol. Los microorganismos anaerobios
estrictos son de 100 a 1000 veces más abundantes que las bacterias
facultativas en digestores anaerobios (García, 1992). Al parecer las especies
del género Clostridium constituyen la mayor parte de la carga acidogénica
anaerobia estricta en digestores anaerobios. La composición de estas
poblaciones varía mucho de acuerdo al origen del sustrato que será
degradado hasta metano, afectando especialmente a las bacterias entéricas,
bacterias del género Bacillus sp y Streptococcus sp.
Se ha reportado especies pertenecientes a los géneros Ruminococcus,
Eubacterium, Cellulomonas, Thermoanaerobacter y Butyrivibrio entre otras,
como poblaciones predominantes en reactores anaerobios. Algunas de estos
géneros son capaces también de seguir un metabolismo homoacetogénico
para la formación de acetato (Guyot et al, 1993).
En esta etapa el piruvato figura como sustrato clave y controla la ruta de la
fermentación. La producción de ácidos hace que el pH disminuya,
convirtiéndose en causa de inhibición en el proceso de digestión anaerobia.
En su mayoría, las bacterias sulfato reductoras y los metanógenos tienen una
estrecha gama de tolerancia de pH (6 a 8), en el cual las funciones
metabólicas de los microorganismos son óptimas. La acumulación de los
ácidos grasos volátiles es tóxica en especial para los microorganismos
metanógenos, pero en menor medida para las bacterias fermentativas que
presentan actividad aún a pH entre 4.5 y 5 (García, 1992).
2.3.3 Acetogénesis
Uno de los procesos intermediarios de la digestión anaerobia de la materia
orgánica es la acetogénesis, donde las bacterias acetogénicas convierten los
productos del metabolismo fermentativo en ácido acético, H2 y CO2. Estos
microorganismos conviven y dependen de los metanogénicos, ya que solo
pueden producir acetato cuando los metanógenos o las sulfato reductoras
mantienen suficientemente baja la concentración de este ácido graso volátil y
la presión parcial de hidrógeno en el líquido. Son extremadamente sensibles a
altas presiones parciales de hidrógeno. Además la degradación del acetato
con producción de H2 es termodinámicamente desfavorable; sin embargo, la
concentración de este gas es mantenida baja por organismos
hidrogenotróficos. Debido al diverso número de microorganismos
involucrados en la producción de metabolitos que son usados por otros como
sustrato, se les ha denominado metabolizadores sintróficos (McInerney,
1999).
En esta fase intervienen tres grupos distintos de bacterias:
§ Bacterias Homoacetogénicas
La principal característica de estos microorganismos es la producción de
acetato, CO2 e H2 a partir de productos de la fermentación como
propionato y butirato o a partir de la reducción del CO2. Este grupo
fermentativo está compuesto principalmente por bacterias del género
Clostridium sp.
§ Bacterias Sintróficas
También conocidas como bacterias acetogénicas productoras obligadas
de hidrógeno (APOH), solo pueden crecer en presencia de
microorganismos hidrogenotróficos que remuevan continuamente el H2
del medio subproducto de la formación de acetato a partir de propionato y
butirato principalmente, compuestos aromáticos, aminoácidos, y ácidos
grasos de cadena larga; esta interacción es conocida como transferencia
de hidrógeno interespecies y permite, además, aprovechar al máximo la
energía contenida en los reactores anaerobios.
§ Bacterias Sulfato reductoras
Este grupo trófico se encuentra ampliamente distribuido en ambientes
anaerobios donde ocurre el proceso de degradación de la materia
orgánica. Así mismo, es un grupo morfológicamente diverso; son
anaerobios estrictos, utilizan el sulfato como aceptor final de electrones
hasta reducirlo a sulfuro de hidrógeno (H2S). Algunas especies presentan
un metabolismo fermentativo, en ausencia de sulfatos, y en este caso la
degradación de carbohidratos no es muy frecuente. A estas bacterias se
les ha catalogado como competidoras de los organismos metanógenos por
la utilización de sustratos comunes. Sin embargo, como se describirá
adelante, estas dos comunidades pueden establecer relaciones que
resultan benéficas para ambas.
2.3.4 Reducción de Sulfatos
Las bacterias sulfato reductoras son un diverso grupo de microorganismos
procariotas, encontrados en una gran variedad de ambientes naturales como
sedimentos de agua dulce, marinos o en hábitats anaerobios como suelos y
lodos. Las especies pertenecientes a este grupo microbiano varían de acuerdo
a sus características ambientales, pues las condiciones óptimas de
crecimiento dependen de las propiedades fisiológicas de cada especie; por tal
razón existe una amplia gama en cuanto a la resistencia a diferentes
temperaturas, pH, y consumo de sustratos (Lens et al, 1995).
Estos organismos pueden usar gran variedad de donadores de electrones,
algunos oxidan los compuestos orgánicos hasta acetato y otros hasta CO2; en
ecosistemas con altos niveles de sulfatos como los sedimentos marinos y
reservas petroleras, la sulfato reducción es la reacción aceptora final de
electrones. Los procesos de degradación involucran el metabolismo de
muchos grupos de bacterias con las sulfato reductoras como metabolizadores
sintróficos (McInerney, 1999). Las bacterias sulfato reductoras forman un
grupo de bacterias anaerobias que tienen afinidad por el hidrógeno o el
acetato principalmente; y usan el hidrógeno disponible cuando el sulfato está
presente en el ambiente reduciéndolo a sulfuro.
2.3.4.1 Relación entre bacterias sulfato reductoras y metanógenos
Se presentan varias similitudes fisiológicas y ecológicas entre las bacterias
sulfato reductoras y los metanógenos, y obviamente la más común es su
capacidad de estar presentes en diversos ambientes anaerobios,
especialmente sedimentos. Entre estos dos grupos microbianos se ha
establecido tres tipos de interacciones principales que incluyen competencia,
coexistencia y sinergismo (Smith, 1991); y que determinan su regulación en
los ecosistemas anaerobios.
§ Competencia
Las bacterias sulfato reductoras han sido consideradas como fuertes
competidoras de los organismos metanógenos (Caicedo, 1996); pueden
competir por el consumo de sustratos comunes como el H2 y el acetato; si
éstos no se encuentran en cantidad abundante en el medio, pueden ser una
de las causas de la inhibición de la metanogénesis; es decir, cuando la
concentración del sustrato es limitante, la competencia se lleva a cabo
(Figura 4).
Acetato SO2-4 Acetato ó H2
H2
BSR OM
CO2 S2- CH4
Figura 4. Relación competitiva entre BSR y Metanógenos.
En altas concentraciones de sulfatos las bacterias sulfato reductoras pueden
competir con los organismos metanogénicos por el H2. En este caso, las
sulfato reductoras predominarían por tener una mayor afinidad frente a dicho
sustrato, presentando competencia por el hidrógeno; por el contrario, la
población metanógena acetotrófica tiene mayor afinidad por el acetato, que
las bacterias sulfato reductoras y la metanogénesis acetotrófica es el proceso
dominante para el metabolismo del mismo; en este caso hay competencia
por el acetato (Colleran & Finnegan, 1995). Sin embargo, estudios cinéticos
realizados sugieren que esta conclusión fue alcanzada usando sólo un
metanógeno (Methanosarcina barkerii) (Figura 5) y una sulfato reductora
(Schönheit et al, 1982); opiniones diferentes podrían emitirse si más especies
son probadas.
En términos generales se puede decir, que a bajas concentraciones de
sulfatos la metanogénesis es el proceso predominante frente a la sulfato
reducción, posiblemente debido a que los metanógenos son menos sensibles
a la toxicidad del sulfuro que las mismas bacterias sulfato-reductoras. Otra
posibilidad radica en el largo lapso (más de un año) que necesitan las sulfato
reductoras en presencia de acetato para establecer un nivel de población
comparable con los metanógenos acetotróficos (Manabu et al, 2000).
Figura 5. Metanosarcina barkerii
Fuente: Madigan, 2000.
Sin embargo, esto no explicaría la persistencia de la metanogénesis
acetotrófica en reactores que reciben sulfato por largos periodos de tiempo
(Visser et al, 1996 citado en McInerney, 1999). En estos estudios se propone
que los metanógenos acetotróficos pueden poseer propiedades favorables de
adhesión y colonización los cuales les permiten mantenerse en altas tasas
bajo condiciones donde las sulfato reductoras son arrastradas.
§ Coexistencia
Otra de las interacciones es la coexistencia, en donde las dos poblaciones
están compartiendo el mismo ambiente sin afectarse mutuamente. Para ello,
una de las posibilidades es que los dos grupos bacterianos utilicen diferentes
donadores de electrones, es decir, diferentes fuentes de carbono. Así por
ejemplo, los metanógenos utilizan donadores de electrones como el metanol,
mientras que las sulfato reductoras utilizan lactato en presencia de sulfatos
(Figura 6).
Existe otro argumento que puede explicar mas fácilmente la coexistencia,
desarrollado por Yavitt & Lang (1990); estos investigadores notaron que en
presencia de altas concentraciones de material orgánico, la competencia
entre metanógenos y sulfato reductoras, se disminuye considerablemente, es
decir, que la competencia puede ocurrir sólo para recursos que están
limitados para los competidores. En otras palabras, sólo conviven y
comparten el mismo espacio y sus nutrientes, sin verse afectados ninguno de
los dos grupos.
Lactato SO2-4 Metanol / Metilaminas
H2
BSR BM
Acetato S2- CH4
Figura 6. Coexistencia entre BSR y Metanógenos.
§ Sinergismo
Los ambientes anaeróbicos contienen una alta variedad de mezclas de
compuestos orgánicos. La mineralización completa de este complejo material,
requiere una asociación entre diferentes tipos metabólicos de
microorganismos. Esto explica el sinergismo, donde al parecer existe una
relación entre las bacterias sulfato reductoras y los metanógenos a través de
la transferencia de hidrógeno interespecies, en la cual esta relación podría
pasar de un sinergismo a una sintrofía, al convertirse en una interacción
obligatoria (Figura 7).
Lactato CO2
H2
BSR BM
Acetato CH4
Figura 7. Transferencia Interespecies de H2.
En dicho proceso (transferencia de hidrógeno interespecies), los
microorganismos metanógenos que consumen el hidrógeno del medio,
producido por los sulfato reductores, reemplazan al sulfato como aceptor final
de electrones y hacen que esta reacción sea termodinámicamente favorable;
sin embargo, solo un número restringido de especies de bacterias sulfato
reductoras son capaces de llevar a cabo esta transferencia en su mayoría
pertenecientes al género Desulfovibrio sp (Figura 8) (García, 1992).
Figura 8. Coloración de Gram de Desulfovibrio sp.
Fuente:Eddleman, 2001 En trabajos anteriormente realizados, ha sido posible establecer relaciones
DQO/SO 4 que indican, bajo parámetros específicos, en que condiciones la
población metanógena puede prevalecer sobre la sulfato reductora; es decir,
si la relación es mayor a 9.5, el grupo metanógeno predominará sobre las
sulfato reductoras, dejándolas por fuera de competencia; si el valor es
cercano a 5, las poblaciones se encontrarán en equilibrio, lo que podría
indicar que se encuentran en coexistencia y/o sinergismo; y si por el
contrario la relación es menor que 2, las bacterias sulfato reductoras estarán
en mayor proporción que las metanógenas, observando de igual forma una
competencia, con predominio de las sulfato reductoras (Oude Elferink et al,
1998; Caicedo, 1992).
Todos los factores nombrados anteriormente, indican que la competencia,
coexistencia y el sinergismo en estos dos grupos tróficos se hacen presentes
de acuerdo a las condiciones ambientales en las que se encuentren con sus
posibles ventajas y desventajas para cada uno de ellos.
2.3.5 Regulación del metabolismo Sintrófico
La degradación de alcoholes, ácidos grasos, aminoácidos, compuestos
aromáticos y ciertos ácidos orgánicos involucra la asociación sintrófica de un
metabolizador sintrófico y un organismo hidrogenotrófico (metanógeno o
sulfato reductor principalmente). Es en este estado del proceso donde la
termodinámica juega un papel importante regulando la eficiencia de la
degradación anaerobia. La degradación del etanol, propionato y butirato a
acetato, CO2 e H2 es termodinámicamente desfavorable bajo condiciones
estándar (298ºK, pH 7, 1M para solutos, 105 Pa para gases) (McInerney,
1999).
La producción de hidrógeno a partir de estos compuestos solo puede ocurrir
si los organismos hidrogenotróficos están presentes para mantener su
concentración baja. La degradación del etanol es termodinámicamente
favorable a presiones parciales de menos de 2 x 104 Pa. Sin embargo, se
necesitan presiones parciales mucho menores para la degradación de
propionato (4 Pa) y butirato (80 Pa) para ser termodinámicamente favorables
(García, 1992). De acuerdo con estas predicciones termodinámicas, pequeños
cambios en la presión parcial de H2 son necesarios para inhibir la degradación
de butirato y benzoato en cultivos sintróficos y degradación de propionato en
cultivos metanógenos mixtos. Cambios en la concentración de acetato
también afectan la termodinámica del metabolismo sintrófico.
La estructura trófica de los ecosistemas anaerobios revela que el
metabolismo anaerobio se lleva a cabo gracias a la interacción de muchos
grupos de organismos. Las condiciones de estas interacciones y el grado de
interdependencia que se pueden establecer entre los grupos tróficos
dependen de la termodinámica y la cinética del metabolismo de los
microorganismos involucrados. Los desequilibrios que se pueden presentar en
estos parámetros resultan en una acumulación de intermediarios del
metabolismo fermentativo que provocan la inhibición de la población que
posee una gama de tolerancia de pH estrecha.
Es aquí donde el metabolismo sintrófico da un carácter de obligatoriedad o
interdependencia a las relaciones que se establecen entre los organismos
presentes en un reactor anaerobio, para mejorar la eficiencia de la
degradación anaerobia de la materia orgánica.
2.3.6 Metanogénesis
La formación de metano es el paso terminal en la digestión anaerobia y el
grupo microbiano responsable es conocido como Methanoarchaea. Estos son
organismos anaerobios obligados que obtienen la energía necesaria para su
crecimiento durante la formación de metano. Además de H2 y CO2 pueden
usar solo unas pocas sustancias orgánicas, como el formato, acetato, metanol
y mono, di y trimetilaminas (Figura 9).
Este proceso tiene lugar en condiciones estrictamente anaeróbicas, a un pH
óptimo de 7 y temperatura óptima de 35°C, aunque existen organismos
metanogénicos con temperaturas óptimas de crecimiento en el rango
termofílico e incluso de hasta 100ºC (Widdel & Pfenning, 1994).
En la naturaleza, el H2/CO2 y el acetato son los principales sustratos para la
formación de metano. El acetato aporta cerca del 70% del metano producido
en la naturaleza (Madigan, 2000). Sin los metanógenos la degradación
efectiva de la materia orgánica puede cesar debido a la acumulación de
productos no gaseosos de la fermentación, los cuales contienen
prácticamente la misma energía que el sustrato original.
Energía LibreÄG°’
Kj/Reacción
4H2 + HCO3- + H+ CH4 + 3H2O -135.6
Hidrógeno 4HCOO- + H2O + H+ CH4 + 3HCO3
- -130.7 Formato
CH3COO- + H2O CH4 + HCO3- -31.0
Acetato 4CH3OH 3CH4 + HCO3
- + H+ + H2O -315.1 Metanol 4CH3NH3
+ + 3H2O 3CH4 + HCO3- + 4NH4
+ + H+ -225.4 Metil amina
Figura 9. Reacciones y cambios de energía libre involucrados en la formación de metano. Fuente: Maharashtra Association for the Cultivation of Science, 1988.
Existen reportes de utilización de hidrógeno por metanógenos
hidrogenotróficos mientras crecen en cocultivo con bacterias celulolíticas u
otras hidrolíticas (Latham & Wolin, 1977). Estos datos no solo aportan
información acerca de la formación de metano sino que revelan la
importancia de la remoción de hidrógeno en la degradación de biopolímeros.
Las reacciones de transferencia de hidrógeno interespecies, son necesarias
para diversos procesos como incremento en la utilización de sustrato,
mantenimiento de las proporciones de los productos finales, síntesis de ATP
por los organismos no metanogénicos, incremento en el crecimiento de los
microorganismos y favorecimiento de las reacciones termodinámicamente
favorables.
2.3.6.1 Fisiología de los metanógenos
Las microorganismos metanógenos son, taxonómica y filogenéticamente, un
diverso grupo de microorganismos que obtienen energía para su crecimiento
a partir de las reacciones que llevan a la producción de metano. Miembros
del dominio Archaea, los metanógenos usan un pequeño número de
compuestos tales como acetato, H2 o compuestos con un solo átomo de
carbono como el CO2 y formato, metanol, metilaminas que son productos de
las etapas precedentes de la digestión anaerobia de la materia orgánica
(Jarrel & Kalmokoff, 1987). Esta especialización hace depender a estos
microorganismos de otros para el suministro de los sustratos en muchos
ambientes anaerobios.
Sin los organismos metanógenos la degradación efectiva de la materia
orgánica puede detenerse como consecuencia de la acumulación de
productos de la fermentación, pues su para usar el H2 juega un papel
regulador que controla los productos sintetizados por las bacterias
fermentativas y fija las condiciones termodinámicas requeridas para la
degradación de ácidos grasos y compuestos aromáticos. Estos organismos
son capaces de metabolizar H2 a presiones parciales de 3 a 7 Pa, lo que hace
que el incremento en la producción de H2 no resulte en altas presiones
parciales de esta gas, debido a que su consumo por parte de los
metanógenos hidrogenotróficos también puede incrementar (McInerney,
1999).
De acuerdo a los sustratos utilizados, los metanógenos se han dividido en
tres grupos:
- Grupo I: Utilizan el H2, formato y ciertos alcoholes como fuente de
energía, el CO2 actúa como aceptor de electrones y es reducido a
metano durante la digestión anaerobia. Esta reducción es importante
ya que mantiene una baja concentración de H2; condición altamente
deseable, por que facilita la transferencia interespecífica de electrones
(Figura 10).
ÄG°
(Kj/mol de metano)
4H2 + CO2 CH4 + 2H2O -135.6
4 Formato CH4 + 3CO2 + 2H2O -130.1
Figura 10. Reacciones metabólicas realizadas por el grupo I.
- Grupo II: Caracterizado por el uso de una gran variedad de
compuestos que contienen el grupo metilo utilizado como fuente de
energía; algunas de estas moléculas son oxidadas a CO2. Los grupos
metilo que no se oxidaron son reducidos hasta metano. La figura 11
muestra las reacciones involucradas en la conversión de compuestos
que contienen grupo metil a metano.
ÄG°
(Kj/mol de metano)
4 Metilamina + H2O 3CH4 + CO2 + 4NH4 -75
2 Dimetilamina + 2H2O 3CH4 + CO2 + 2NH4 -73.2
Figura 11. Reacciones metabólicas realizadas por el grupo II.
El metanol y el H2-CO2 son metabolizados simultáneamente, pero el metanol
es consumido a una mayor tasa. El metabolismo de las aminas metiladas a
metano trae como consecuencia la producción de amonio, que es utilizado
como fuente de nitrógeno (Jarrel & Kalmokoff, 1987).
- Grupo III: Caracterizados por la habilidad para metabolizar el acetato.
El metil carbono del acetato es reducido a metano y el grupo carboxil
es oxidado a CO2. El acetato es el mayor producto del metabolismo
fermentativo y es, cuantitativamente, el más importante sustrato para
la producción de metano. Alrededor de 60 a 90% del metano
producido en los digestores anaerobios son derivados del grupo metil
del acetato. A temperaturas termofílicas o a altos niveles de amonio,
la oxidación del grupo metil de acetato a H2 puede ser la ruta
predominante en el metabolismo del acetato. Sin embargo, la energía
que se obtiene a partir de la degradación anaerobia del acetato es
baja (Figura 12).
ÄG°
(Kj/mol de metano)
CH3COO- + H2O CH4 + HCO -31
Figura 12. Reacciones metabólicas realizadas por el grupo III.
Con los avances en técnicas de anaerobiosis y métodos analíticos, es claro
que los metanógenos no utilizan ácidos grasos volátiles, a excepción de
acetato y formato. La remoción del hidrógeno por los metanógenos en
cultivos mixtos es esencial para la degradación de ácidos grasos volátiles.
Estos procesos y sus actividades permiten una mejor comprensión de la
digestión anaerobia.
Entre los miembros que usan el acetato se encuentran géneros como
Methanosarcina sp y Methanosaeta sp. El primero tiene tasas de crecimiento
mayores a valores aparentes de Km para uso del acetato, comparado con
Methanosaeta sp. Las diferencias en estos valores han sido atribuidas a las
diferencias en las respectivas enzimas usadas en la degradación del acetato.
De acuerdo con el conocimiento de las características de crecimiento de las
bacterias metanogénicas acetotróficas, un descenso en la concentración de
acetato por debajo de 1 mM fue correlacionado con un desplazamiento de
Methanosarcina sp por Methanosaeta sp en un digestor termofílico (Widdel et
al, 1986).
El metanol, las metilaminas y las trimetilaminas también sirven como sustrato
para Methanosarcina sp y otros metanógenos metilotróficos. Estos
compuestos pueden ser sustratos importantes para la metanogénesis en
sistemas marinos (Oremland & Polcin, 1982). Algunos metanógenos
hidrogenotróficos pueden oxidar alcoholes secundarios a cetonas y alcoholes
primarios a ácidos carboxílicos
Actualmente existen diferentes técnicas para cuantificar e identificar las
poblaciones microbiológicas presentes en lodos anaerobios. Dentro de los
procedimientos tradicionales figura la del número más probable (NMP), donde
diluciones en serie de la muestra de lodo son inoculadas en medios
específicos que, además, van a permitir, por medio de diferentes indicadores,
evidenciar macroscópicamente el crecimiento de la población en estudio.
Mediante esta técnica se permite manejar un nivel de confianza del 95%
(Alazard & Molina, 1997).
La determinación de los metanógenos por medio de la microscopia de
fluorescencia se basa en la detección de cofactores fluorescentes y permite
identificar los metanógenos presentes y su morfología. Sin embargo, no
permite detectar aquellos que no poseen fluorescencia (Espitia et al, 1998).
A pesar de las restricciones, estas técnicas han permitido determinar las
comunidades microbianas en ambientes anaerobios aportando mayor
conocimiento y entendimiento sobre las reacciones bioquímicas que ocurren
entre las poblaciones existentes, pero no evalúan la potencialidad de estas
para degradar la materia orgánica.
El uso de la tecnología de sondas de RNA marcadas con radioisotopos,
técnicas de inmunodetección, amplificación selectiva de fracciones de rRNA,
clonación e hibridación ha permitido realizar la cuantificación e identificación
de los grupos metanogénicos, población sulfato reductora y en general las
poblaciones presentes en reactores anaerobios (Raskin et al, 1995; Godon et
al, 1997). Además ha permitido establecer las proporciones de
microorganismos incluidos en diferentes diseños de reactores anaerobios,
donde se ha podido establecer la prevalencia de especies de Methanosarcina,
Methanosaeta, Methanobacterium y en general, miembros del orden
Methanobacteriales (Muñoz et al, 1989, Raskin et al, 1995, Godon et al,
1997).
Así mismo, ha sido posible determinar la presencia en niveles considerables
de la población de Desulfovibrio sp, Desulfobulbus sp, Desulfobacter sp y
Desulfobacterium sp; confirmando el papel que juega la sulfato reducción en
los ambientes anaerobios (Muñoz et al, 1989; Raskin et al, 1995; Oude
Elferink et al, 1998).
Esta determinación y cuantificación permite correlacionar a las poblaciones
con la dinámica entre ellas y los procesos metabólicos llevados a cabo en este
tipo de ambientes. Una vez más, aunque estas técnicas permiten la
cuantificación de las poblaciones no se pueden sacar de sus resultados datos
acerca de su capacidad para llevar la materia orgánica a metano.
El desafío de la digestión anaerobia es mantener el balance apropiado entre
los diferentes grupos de microorganismos y la tasa de consumo de
intermediarios dentro de los límites termodinámicamente favorables para
estas reacciones.
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo General
Estudiar y cuantificar tres de las poblaciones microbianas ó grupos tróficos
(bacterias fermentativas, sulfato-reductoras y metanógenos) presentes en los
lodos de una planta de tratamiento de aguas residuales de una industria
productora de cerveza y bebidas de malta.
3.2 Objetivos Específicos
- Cuantificar mediante la técnica del número más probable (NMP), las
bacterias fermentativas, sulfato-reductoras y metanógenos presentes
en los reactores anaerobios de la planta de tratamiento de aguas
residuales.
- Determinar las diferencias microbiológicas existentes entre los
reactores Norte y Sur de la Planta de Tratamiento de Aguas
Residuales.
- Determinar la actividad metanogénica de los lodos de la planta de
tratamiento de aguas residuales, mediante la técnica de las botellas de
Mariotte.
- Correlacionar los parámetros físico químicos (DQO, AGV/Alk, Actividad
metanogénica) con los resultados de los recuentos microbiológicos de
las poblaciones estudiadas.
4. METODOLOGÍA
4.1 Ubicación
El presente trabajo de investigación fue realizado en la planta de
tratamiento anaerobio de aguas residuales de una industria productora
de cerveza y bebidas de malta en Bogotá. Los análisis físico-químicos se
llevaron a cabo en el laboratorio de la planta de tratamiento y los
microbiológicos en el laboratorio de Investigación y Desarrollo de la
División de Producción de la misma industria.
4.2 Temporalidad
Las muestras se recolectaron durante los meses de Octubre y Noviembre
del año 2000.
4.3 Muestreo
Las muestras fueron recolectadas de los reactores metanogénicos de la
planta de tratamiento de aguas residuales estudiada. Cada reactor está
compuesto por dos zonas, las cuales a su vez poseen cinco salidas con
tres niveles cada una (Figura 13).
Se tomaron 100 ml del segundo nivel (nivel de reacción) en frascos
estériles de 100 ml de capacidad; estos se llenaron hasta el tope con el fin
de evitar el contacto del aire con el lodo. Los datos de pH y temperatura
fueron tomados en el momento del muestreo con el fin de conocer el
estado en el cual se encontraba el lodo en los reactores para este
momento. Es importante anotar que el lodo no era granular,
característica típica de estos reactores anaerobios.
Figura 13. Diagrama del sistema de fases separadas Fuente: Moya & Rodríguez, 2000.
4.3.1 Frecuencia del muestreo
Teniendo en cuenta el volumen de los reactores metanogénicos (230 m3),
se optó por realizar el muestreo basado en una estadística descriptiva.
Cada muestreo estuvo separado por intervalos de quince días durante los
meses de Octubre y Noviembre del año 2000, lapso durante el cual se
llevaron a cabo las siembras de los tres grupos tróficos estudiados para
recuento mediante la técnica del número más probable (NMP) y los
análisis físico-químicos correspondientes para cada una de ellas.
T. Neutralización
Reactor Sur
Reactor Norte
Volumen : 230m3
Bomba sumergible
Zona 1 Zona 2
Canaleta PARSHALL
4.4 Procesamiento de las muestras
Las muestras fueron llevadas al laboratorio de Investigación y Desarrollo
de la División de producción, donde el contenido de lodo de los frascos
fue mezclado por reactor con el fin de obtener una muestra compuesta;
teniendo en cuenta la metodología de Hungate (1969), para mantener la
anaerobiosis del lodo. De esta forma se obtenían dos muestras
compuestas de 1000 ml; una correspondiente al reactor norte y otra al
reactor sur. Una vez recolectadas las muestras compuestas se tomaron
10 ml de cada reactor y se maceraron en un homogenizador, con el fin de
hacerlas menos densas. De este volumen se tomó 1 ml de lodo y se diluyó
en 9 ml de agua de reducción para realizar la dilución 10-1 y a partir de
esta realizar las diluciones seriadas hasta 10-9.
Paralelamente se recolectaron 5 litros de lodo por cada reactor en
recipientes, con el fin de realizar los análisis físico-químicos y la actividad
metanogénica en el laboratorio de la planta de tratamiento de aguas
residuales. A estas muestras también se les realizó tratamiento previo con
N2/CO2 para mantener la anaerobiosis del lodo.
4.5 Recuento de grupos tróficos
Las siembras para el número más probable se realizaron siguiendo la
técnica descrita por Escoffier et al (1998). Los materiales empleados en
las siembras de los recuentos y las técnicas de anaerobiosis se realizaron
de acuerdo a la tecnología descrita por Hungate (1969) (Anexo 1).
4.5.1 Recuento de microorganismos metanógenos
Se sembraron las diluciones 10-7, 10-8 y 10-9 en medios con sustratos
específicos para microorganismos metanógenos aceto tróficos e
hidrogenotróficos, descritos en el Anexo 2. El periodo de incubación para
la población metanógena es de 30 días y se determina su crecimiento por
el metano producido. La evidencia del metano liberado al medio se logra
por medio de la cromatografía de gases (Escoffier et al, 1998).
4.5.2 Recuento de bacterias sulfato reductoras
Se realizaron diluciones seriadas hasta 10-9 a partir del lodo macerado.
Las diluciones 10-7, 10-8 y 10-9 fueron sembradas en un medio adecuado
para el crecimiento de microorganismos sulfato reductores (Anexo 3), y se
incubaron por un periodo de 15 a 20 días, al cabo de los cuales se
evidenciaba el crecimiento de la población sulfato reductora por la
producción de sulfuro de hierro (FeS) (Escoffier et al, 1998).
4.5.3 Recuento de bacterias fermentativas
Se tomó 1 ml de la muestra macerada para hacer diluciones hasta 10-9.
Las diluciones 10-7, 10-8 y7 10-9 fueron sembradas en un medio que
permite el desarrollo de la población fermentativa (Anexo 4). El periodo
de incubación para esta población fue de 3 a 5 días, al cabo de los cuales
se obtuvo producción de ácidos evidenciado por el cambio de color
(Escoffier et al, 1998).
4.6 Actividad Metanogénica
Para los ensayos de actividad metanogénica de los lodos de la planta de
tratamiento de aguas residuales se empleó la técnica reportada en el
Curso Internacional sobre Tratamiento de Aguas Residuales, Universidad
del Valle (1995) (Anexo 5).
4.7 Análisis físico-químicos
Los análisis físico-químicos correspondientes a DQO, ácidos grasos
volátiles, sólidos sedimentables y alcalinidad se realizaron de acuerdo al
procedimiento descrito en los Métodos Estándar para análisis de aguas
residuales (1997). La determinación de sólidos suspendidos volátiles se
realizó siguiendo la técnica enunciada en el Manual del Curso
Internacional sobre Tratamiento de Aguas Residuales, Universidad del
Valle (1995) (Anexo 6).
4.8 Análisis estadístico
La aplicación del análisis de varianza y la prueba T de Student permitió
dar soporte estadístico a los resultados obtenidos a partir de los
recuentos, con el fin de determinar la estabilidad de las poblaciones a lo
largo del muestreo. Así mismo, este análisis se aplicó a los datos de
actividad metanogénica y DQO para lograr determinar el funcionamiento
de la planta de tratamiento.
4.8.1 Prueba de ANOVA para los grupos tróficos estudiados
§ Hipótesis Nula
Los recuentos de los grupos tróficos estudiados serán iguales para los
reactores a lo largo del muestreo.
§ Hipótesis Alternativa
Los recuentos de los grupos tróficos estudiados serán diferentes para
los reactores a lo largo del muestreo.
Esta prueba determinó la similitud de los grupos microbiológicos
(Anexo 7).
4.8.2 Análisis de Tukey B para los grupos tróficos
§ Hipótesis Nula
Todos los grupos tróficos serán iguales a lo largo del muestreo
§ Hipótesis alternativa
Los grupos tróficos serán distintos durante el muestreo
Este análisis permite determinar las similitudes encontradas entre los grupos
tróficos estudiados (Anexo 8).
4.8.3 Prueba de Tukey B para la actividad metanogénica
§ Hipótesis Nula
La actividad metanogénica de los reactores será igual para los cuatro
muestreos.
§ Hipótesis Alternativa
La actividad metanogénica para los reactores será diferente para los
cuatro muestreos.
En la prueba de prueba Tukey B, es posible determinar la homogeneidad de
los grupos estudiados (Anexo 9).
4.8.4 Prueba T de Student para la Actividad Metanogénica
§ Hipótesis Nula
La actividad metanogénica será igual para el reactor norte y para el
reactor sur a lo largo del muestreo.
§ Hipótesis Alternativa
La actividad metanogénica será diferente para el reactor norte y para
el reactor sur a lo largo del muestreo.
Esta prueba determina la homogeneidad en los recuentos obtenidos en cada
uno de los reactores (Anexo 10).
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
5.1. Cuantificación de grupos tróficos
Como resultado de los recuentos obtenidos a lo largo de los cuatro muestreos
realizados, fue posible determinar que el grupo trófico predominante en los
reactores metanogénicos de la planta de tratamiento de aguas residuales, fue
el de los metanógenos con un 57% del total de la población encontrada,
seguido por las bacterias sulfato reductoras con un 30% y por último el grupo
fermentativo con un 13% (Figura 14) (Tabla 3).
Tabla 3. Recuentos Microbiológicos (Expresados como NMP / g SSV)
1er Muestreo 2do Muestreo 3er muestreo 4to muestreo
Grupo
Trófico
RN RS RN RS RN RS RN RS
BFG 24x1010 10x1010 53x109 20x109 24x1010 33x109 24x1010 24x1010
BFL <3 <3 <3 <3 <3 <3 <3 <3
BSRA 53x109 33x109 53x109 33x109 24x1010 24x1010 17x1010 51x109
BSRL 20x1010 77x109 47x109 21x109 10x1010 44x109 33x109 17x1010
MA 24x1010 24x1010 24x1010 24x1010 24x1010 24x1010 24x1010 24x1010
MH 24x1010 24x1010 24x1010 24x1010 24x1010 24x1010 24x1010 24x1010
BFG: Bacterias Fermentativas de la Glucosa BFL: Bacterias Fermentativas del Lactato BSRA: Bacterias Sulfato Reductoras del Acetato BSRL: Bacterias Sulfato Reductoras del Lactato MA: Metanógenos Acetotróficos MH: Metanógenos Hidrogenotróficos RN: Reactor Norte RS: Reactor Sur
DISTRIBUCION GRUPOS TROFICOS
13%
30%57%
BFG-BFL BSRA-BSRL BMA-BMH
Figura 14. Distribución de los tres grupos tróficos durante las cuatro fechas de muestreo.
Una de las características del sistema anaerobio empleado en la planta de
tratamiento de aguas residuales, es la separación del proceso fermentativo
de la fase metanogénica con el fin de optimizar las tasas de reacción de
ambos procesos (Klass, 1984). Esto hace posible explicar la baja
concentración del grupo fermentativo en los reactores metanogénicos, debido
a que la mayor parte del metabolismo fermentativo y ésta población se
encuentra en el tanque de acidogénesis, en el cual se lleva a cabo la hidrólisis
de sustratos poliméricos como carbohidratos, proteínas y lípidos. Por este
motivo, los reactores metanogénicos reciben constantemente altas
concentraciones de acetato, propionato, butirato (ente otros ácidos grasos
volátiles), provenientes del proceso anterior, permitiendo que la población de
bacterias sulfato reductoras sea relevante. Estos microorganismos sulfato
reductores metabolizan dichos ácidos grasos volátiles, produciendo acetato y
otros sustratos como el H2 utilizables por los metanógenos.
La población sulfato reductora es menor que la población metanogénica, pero
posee un porcentaje significativo dentro de los reactores anaerobios (30%),
sin una influencia aparente sobre ésta última, lo que se corrobora con los
resultados arrojados por el análisis estadístico de Tukey B (Anexo 8), en el
cual se muestra una diferencia significativa de la población metanógena con
respecto a los otros dos grupos tróficos.
En ambientes anaerobios existen tres tipos de relaciones entre las bacterias
sulfato reductoras y los metanógenos; competencia, coexistencia y
sinergismo (Smith, 1991), y de acuerdo con los resultados obtenidos en este
estudio, es posible suponer que las relaciones predominantes entre estas dos
poblaciones en los reactores metanogénicos son sinergismo y/o coexistencia.
El fenómeno de sinergismo se observa cuando a concentraciones limitantes
de sulfato la población metanógena se ve beneficiada pues las bacterias
sulfato reductoras siguen un metabolismo fermentativo degradando lactato y
etanol, principalmente. Cuando la población sulfato reductora lleva a cabo la
degradación de éstos sustratos, hay liberación de acetato e hidrógeno,
principales sustratos de la población metanogénica y el hidrógeno debe ser
consumido constantemente por los metanógenos hidrogenotróficos con el fin
de no producir una represión catabólica que inhiba la degradación del lactato
o del etanol, sustratos de las sulfato reductoras (Hansen, 1990). De esta
forma se establece una transferencia de hidrógeno interespecies, lo que da
un carácter sintrófico a esta relación. Esto permite suponer que no existe
competencia por sustratos comunes entre las bacterias sulfato reductoras y la
población metanógena en los reactores evaluados, dados los posibles niveles
de sulfato existentes.
Por otro lado, la coexistencia podría hacerse evidente por los altos recuentos
obtenidos para cada una de estas poblaciones, lo que indica que ninguna se
ve afectada negativamente por la otra.
Estudios similares (Tabla 4) se han llevando a cabo, realizando
comparaciones en los recuentos de estos tres grupos tróficos (bacterias
fermentativas, sulfato reductoras y metanógenos), empleando los mismos
sustratos que en el estudio actual.
5.2. Comportamiento general de los grupos tróficos durante los
muestreos
Se observa claramente que el recuento de las poblaciones fermentativa y
sulfato reductora varía a lo largo de los cuatros muestreos, mientras que la
población metanógena permanece estable (Figura 15).
Participación grupos tróficos durante los muestreos
0,00E+00
5,00E+10
1,00E+11
1,50E+11
2,00E+11
2,50E+11
3,00E+11
1 2 3 4
Muestreo
NMP/gSSV
BF BSR M
Figura 15. Participación de los tres grupos tróficos en las cuatro fechas de muestreo.
BF: Bacterias Fermentativas
BSR: Bacterias Sulfato Reductoras M: Metanógenos
Este hecho se encuentra respaldado por la estabilidad en cuanto a los valores
de pH (6.9 y 7.7), temperatura (28 y 30°C) y por la presencia de sustratos
específicos importantes en los reactores metanogénicos como el acetato y el
hidrógeno, productos del metabolismo de las bacterias sulfato reductoras y
fermentativas, que favorecen el crecimiento y la estabilidad del grupo
metanógeno sobre los otros dos grupos estudiados. El análisis estadístico
Tukey B (Anexo 8), indica que la frecuencia de aparición de los metanógenos
es mucho más estable en comparación con las bacterias fermentativas y
sulfato reductoras.
Durante el segundo muestreo se observó una disminución en los recuentos
de las poblaciones fermentativas y sulfato reductoras. Sin embargo, este
valor no representa una diferencia estadística significativa, que sugiera
establecer una justificación exhaustiva acerca de la causa de dicha diferencia.
En el tercer muestreo se evidencia una recuperación de los grupos
microbianos en general; las bacterias sulfato reductoras muestran una
diferencia comparativa entre los dos sustratos empleados en el estudio,
probablemente como consecuencia de una acumulación de acetato,
consumido por esta población.
En el último muestreo, hubo un incremento de la población fermentativa de
la glucosa, lo que permite suponer, que los efluentes contenían mayor
cantidad de materia orgánica no metabolizada en el tanque de acidogénesis,
lo que ocasionó un incremento en esta población, tras la necesidad de
degradar los polímeros presentes en los reactores anaerobios, para brindar
los sustratos requeridos por los otros grupos microbianos.
5.3. Comparación poblacional entre los reactores
El estudio de los reactores (Norte y Sur), en cuanto a su composición
poblacional, permitió determinar que no existen diferencias estadísticas
significativas entre ellos (Anexo 7), lo que indica que los dos reactores
presentan el mismo comportamiento, tanto en su población como en las
actividades metanogénicas obtenidas de cada uno de ellos (Figura 16); lo
cual está de acuerdo con el esquema de manejo de la planta de tratamiento
presentado por los datos recogidos durante las fechas de muestreo (Tabla 6).
Era de esperar encontrar estos resultados, pues los efluentes que reciben los
dos reactores son de la misma naturaleza y llegan a ellos en la misma
proporción.
0,00E+001,00E+082,00E+083,00E+084,00E+08
5,00E+086,00E+087,00E+088,00E+089,00E+08
1,00E+09NMP/gSSV
Primer Muestreo Segundo Muestreo Tercer Muestreo Cuarto Muestreo
Muestreo
Comparación poblacional
Reactor Norte Reactor Sur
Figura 16. Comparación poblacional entre los dos reactores durante todo el muestreo.
5.4. Recuento de la población metanogénica
La fase metanogénica depende de un grupo de microorganismos, los
metanógenos, con condiciones de crecimiento muy específicas como
anaerobiosis estricta, temperaturas mesófilas (28°C y 30°C) (Chin et al,
1999), pH entre 6.5 y 7.5, entre otras. La población metanógena se
encuentra dividida en dos grupos que se caracterizan por el consumo de
sustratos muy específicos; ellos son los metanógenos acetotróficos y los
hidrogenotróficos. Los primeros tienen alta afinidad por el acetato, producto
del metabolismo sintrófico, precursor fundamental de la metanogénesis en
los reactores anaerobios (70%); y los hidrogenotróficos que toman una
mezcla de H2/CO2 como principal fuente de carbono y energía. Este último
grupo, es de vital importancia en el proceso de digestión anaerobia, pues de
ellos depende que la presión parcial de hidrógeno se mantenga a bajos
niveles, evitando que este sea tóxico para otros grupos bacterianos presentes
en los reactores metanogénicos como las especies sintróficas.
Teniendo en cuenta lo anterior, se tomaron estos dos sustratos para
cuantificar dichos grupos microbianos. Con base en los resultados obtenidos
(Figura 17) se observó que tanto los acetotróficos como los hidrogenotróficos
se encuentran en la misma proporción (50% en ambos casos) en los
reactores metanogénicos. La reacción positiva para los recuentos de
organismos metanógenos se determinó por cromatografía de gases mediante
un cromatógrafo N9316360 con columna PE-Q de 30 m x 0.53 mm I.D
(Figura 18).
0,00E+00
5,00E+10
1,00E+11
1,50E+11
2,00E+11
2,50E+11
NMP/gSSV
MA MH
Grupo Trófico
Población Metanogénica
Figura 17. Distribución promedio de la población metanogénica durante los muestreos.
MA: Metanógenos Acetotróficos MH: Metanógenos Hidrogenofílicos.
Dichos resultados están de acuerdo con los obtenidos por Ramírez et al.
(1996), donde no se observa predominancia de ningún grupo; sin embargo,
los resultados de sus recuentos son inferiores con respecto a los del estudio
actual. Por el contrario otros estudios (Espitia et al, 1999; Oude Elferink et al,
1998; Muxí et al, 1992), muestran una prevalencia de los metanógenos
hidrogenotróficos en sus resultados. Estas diferencias en los valores
obtenidos se deben, probablemente, a las características del efluente y al tipo
de lodo utilizado (Tabla 4).
a) b)
c)
Figura 18. a)Tubos Hungate, b) cromatógrafo y c) cromatografía para la determinación de
organismos metanógenos.
En el estudio realizado por Oude Elferink et al (1998) se encontró que
Metanosaeta sp fue el metanógeno degradador de acetato dominante en el
lodo con cerca del 80% del total de la población Archaea encontrada; por
encima de especies como Methanosarcina sp que se encontraba en niveles
muy bajos o ausente. Especies consumidoras de H2/CO2 pertenecientes al
orden Methanobacteriales como Methanobacterium, se encontraron en una
baja proporción (2%) en el mismo lodo.
Tabla 4. Comparaciones entre recuentos microbiológicos de diferentes tipos de lodo
NE: No se estudió
El balance obtenido a partir de este recuento, hace posible suponer que
existe un equilibrio positivo por parte de estas dos poblaciones, permitiendo
que se mantengan en proporciones adecuadas de acuerdo al consumo de los
sustratos presentes en el medio, evitando un exceso de sustrato que resulte
termodinámicamente desfavorable, como en el caso del H2.
GRUPO TRÓFICO NMP/gSSV
MUXÍ et al, 1992
LODO DE LAGUNA
ANAEROBIA IND.
LEVADURA
RAMÍREZ et al , 1996
LODO UASB IND.
VINAZA
OUDE ELFERINK et al, 1998 GRANULAR
IND. PAPEL
ESPITIA et
al, 1998
GRANULAR CERVECERÍA
ACTUAL ESTUDIO,
2001
CERVECERIA
Bact. Fermentativas
Glucosa
1.1 X 1011 3 X 109 NE 1.9 X 1011 14 X 1010
Bact. Fermentativas
Lactato
NE 4 X 108 NE NE <3
Bact. Sulfato Reductoras
Acetato
<30 X 104 4 X 108 4.1 X 104 – 4.6 X 105 2 X 109 10 X 1010
Bact. Sulfato Reductoras
Lactato
NE 2 X 108 NE 4 X 109 86 X 109
Metanógenos Acetato
4.6 X 107 2 X 109 2.3 X 108 – 1.7 X 109 3 X 106 24 X 1010
Metanógenos H2/CO2
2.4 X 109 2 X 109 1.5 X 1012 – 1.3 X 1013
5 X 107 24 X 1010
Por último, este recuento evidencia una óptima concentración de los
sustratos empleados (acetato e hidrógeno), productos del metabolismo de
otros grupos microbianos, como lo son las bacterias fermentativas y las
sulfato reductoras, lo que lleva a pensar, que la degradación de la materia
orgánica se está desarrollando adecuadamente hasta este punto, pues no se
presenta una deficiencia en la cantidad de sustratos, indicando que se están
llevando a cabo cada una de las etapas propias de la degradación anaerobia,
lo que se ve reflejado en los porcentajes de remoción de la materia orgánica
obtenidos durante el muestreo realizado en el presente estudio (Figura 24).
5.5. Recuento de la población sulfato reductora
Los ecosistemas, como las plantas de tratamiento de aguas residuales de tipo
anaerobio, donde las bacterias sulfato reductoras se encuentran presentes,
pueden generar una competencia por los electrones entre ellas y los
metanógenos, y liberar al medio altas concentraciones de H2S, que pueden
producir problemas de corrosión. El olor característico de dicho compuesto
se percibe notablemente en la planta de tratamiento en estudio, lo que hizo
posible suponer la presencia de sulfatos en los vertimientos evaluados.
Las bacterias sulfato reductoras son un grupo de microorganismos muy
versátil, capaces de utilizar una amplia gama de sustratos tales como ácidos
grasos volátiles, hidrógeno, azúcares, lactato, metanol, etanol, glicerol,
compuestos aromáticos y aminoácidos (Caicedo, 1994; Hansen, 1990). Con
base en esto, se utilizaron el lactato y el acetato, como sustratos para el
crecimiento de las bacterias sulfato reductoras. Teniendo en cuenta que el
acetato es el principal precursor de la metanogénesis, se utilizó con el fin de
establecer una posible competencia por sustrato con el grupo metanógeno; y
el lactato fue empleado para evidenciar el crecimiento de las sulfato
reductoras. El uso de estos sustratos también permite identificar el
metabolismo del grupo sulfato reductor, pues aquellas bacterias que
degradan el acetato hasta CO2 realizan una oxidación completa, mientras que
las que utilizan lactato lo degradan mediante una oxidación incompleta hasta
llevarlo a acetato.
De acuerdo con los resultados, fue posible determinar que las bacterias
sulfato reductoras degradadoras del acetato y del lactato, se encontraron en
proporciones similares en los dos reactores metanogénicos evaluados. Las
diferencias encontradas entre ellas fueron poco significativas 55% y 44%
respectivamente (Figura 19). El crecimiento de la población sulfato reductora
se evidenció por la formación de sulfuro de hidrógeno (H2S) y el consiguiente
ennegrecimiento del medio. (Figura 20).
5,00E+10
1,00E+11
NMP/gSSV
BSRA BSRL
Grupo Trófico
Población Sulfato reductora
Figura 19. Distribución promedio de las bacterias sulfato reductoras durante los muestreos. BSRA: Bacterias Sulfato Reductoras del Acetato BSRL: Bacterias Sulfato Reductoras del Lactato
Figura 20. Reacción positiva para la población sulfato reductora.
La población sulfato reductora presentó un crecimiento aproximadamente del
30% sobre el total de la población cuantificada en los reactores anaerobios
(Figura 14). Aunque la presencia de este grupo fue menor que la población
metanogénica, su alto porcentaje de aparición no inhibe el crecimiento de
ninguna de las dos poblaciones metanógenas (hidrogenotróficas y
acetotróficas). Muxi et al. (1992), observó que los recuentos de las bacterias
sulfato reductoras, eran menores que los de los metanógenos. Del mismo
modo, Oude Elferink et al (1998), reportó recuentos de bacterias sulfato
reductoras inferiores a los valores obtenidos a partir de la población
metanógena, aún cuando había presencia de sulfatos en el medio (Tabla 4),
encontrando géneros como Desulfobulbus sp principalmente y Desulfovibrio
sp en pequeñas proporciones. En este mismo trabajo se describió una
relación DQO/SO4 de 9.5, lo que indica una concentración de SO4 tal que
permite la prevalencia de la metanogénesis sobre la sulfato reducción y por
ende la proliferación de la población metanógena sobre las bacterias sulfato
reductoras, caso similar podría esperarse en el presente estudio.
Teniendo en cuenta estos datos, es posible decir que no se presenta
competencia por el sustrato común (acetato) entre estas dos poblaciones
involucradas en el metabolismo anaerobio. De igual forma y como era de
esperar, el crecimiento sobre lactato fue considerable, indicando que las
sulfato reductoras lo están tomando como fuente de carbono para su
desarrollo y crecimiento.
En los últimos años se han aislado especies de bacterias sulfato reductoras de
reactores anaerobios, involucradas principalmente en la degradación de
compuestos proteínicos. Tal es el caso de Desulfovibrio aminophilus (Baena
et al, 1998) y Desulfovibrio mexicanus (Hernández et al, 2000).
5.6. Recuento de la población fermentativa
Los polímeros de base glucosa que se encuentran en mayor proporción en la
elaboración de la cerveza y bebidas de malta son el almidón y la maltosa; los
cuales son degradados por hidrólisis enzimática hasta glucosa (Madigan,
1999), motivo por el cual se consideró como el monosacárido presente en
mayor proporción en el vertimiento a tratar. Además, los productos de la
degradación anaerobia de la glucosa (ácidos grasos volátiles) contribuyen a
generar las condiciones de crecimiento apropiadas para las bacterias
anaerobias estrictas; razón por la cual la glucosa fue empleada como uno de
los sustratos para dicho recuento. El lactato se utilizó para determinar la
presencia de microorganismos capaces de degradar este ácido orgánico hasta
intermediarios metabólicos del proceso anaerobio como el acetato.
Con base en los resultados, se evidenció que el grupo capaz de degradar el
lactato se encontró ausente y que el total de la población fermentativa tomó
la glucosa como fuente de carbono (Figura 21). Esto permite suponer que los
sustratos, por ser de naturaleza diferente, glucosa (carbohidrato) y lactato
(ácido orgánico), podrían ser degradados por grupos microbianos distintos, y
que en los reactores en estudio, sólo se encontró el grupo degradador de
carbohidratos.
Cabe aclarar que aunque la población fermentativa del lactato se encontró
ausente, las bacterias sulfato reductoras pueden degradar este ácido
orgánico, producto principal del metabolismo fermentativo. Estos son dos
grupos tróficos diferentes y el consumo del lactato por parte de uno de ellos
no implica que el otro lo lleve a cabo.
0,00E+002,00E+104,00E+106,00E+108,00E+101,00E+111,20E+111,40E+111,60E+11
NMP/gSSV
BFG BFL
Grupo Trófico
Población Fermentativa
Figura 21. Distribución promedio de la población fermentativa durante los muestreos
BFG: Bacterias Fermentativas de la Glucosa BFL: Bacterias Fermentativas del Lactato
Es importante anotar que los resultados positivos en la técnica del número
más probable para la población fermentativa de la glucosa y del lactato se
evidenciaron por el viraje de color producido por la formación de ácidos en el
medio (Figura 22); para el caso de la población fermentativa de la glucosa
este cambio tuvo lugar al tercer día de inoculado en el medio. Para las
bacterias fermentativas del lactato no se observó viraje de color, en el mismo
lapso, razón por la cual se reportaron como negativos, sin embargo, en
algunos tubos se observó turbidez del medio lo que indica crecimiento de
microorganismos que probablemente no toman a este ácido orgánico como
fuente de carbono.
Según Guyot et al (1993), las principales especies fermentativas presentes en
los reactores metanogénicos son Clostridium, Bacillus, Ruminococcus,
Cellulomonas, Thermoanaerobacter, Butyrivibrio, Eubacterium, entre otros.
Aunque estos géneros principalmente degradan azúcares hasta formar ácidos
orgánicos, algunas especies pueden seguir rutas bioquímicas
homoacetogénicas para formar acetato.
Figura 22. Reacción positiva para la población fermentativa de la glucosa.
Moya & Rodríguez (2000) reportaron bacterias como Escherichia coli,
Pseudomonas sp, Pantoea sp, Enterobacter sakazakii y Klebsiella pneumonie.
presentes en los tanques de ecualización, acidificación y salida de los
reactores de la planta de tratamiento en estudio, las cuales pueden intervenir
en las primeras fases de degradación de la materia orgánica en el tanque de
acidificación. Así mismo, Ramírez et al. (1996), reportó un recuento
significativo de bacterias fermentativas de la glucosa con prevalencia sobre el
grupo fermentador del lactato en un reactor UASB para el tratamiento de
residuos de una industria de vinazas, aunque no tan notable como en el
actual estudio.
5.7. Actividad Metanogénica
Los ensayos de la actividad metanogénica se llevaron a cabo con el fin de
observar el nivel de producción de metano de los lodos en estudio y de esta
forma analizar el comportamiento de los metanógenos frente a un sustrato
específico como lo fue el acetato; este ensayo fue realizado por duplicado
para cada muestreo (Figura 23).
Se hace evidente una disminución de la producción de metano en el segundo
muestreo, lo cual pudo haberse ocasionado por la aparente disminución de
carga fermentativa y sulfato reductora en esta fecha, lo que trajo como
consecuencia una disminución en la cantidad de materia orgánica
degradada.
Para el tercer y cuarto muestreo se observa una recuperación de la actividad
metanogénica, que indica la estabilidad de los lodos para éste momento. La
evidencia estadística sugiere que existen diferencias apreciables entre los dos
primeros y los dos últimos muestreos; aunque para la actividad metanogénica
entre los reactores (norte y sur) no se obtuvieron diferencias significativas
(Anexos 9 y 10).
Actividad Metanogénica
00,0020,0040,0060,0080,01
0,0120,0140,0160,0180,02
PrimerMuestreo
SegundoMuestreo
TercerMuestreo
CuartoMuestreo
Muestreo
g DQO-CH4/gSSV-d
Figura 23. Actividad Metanogénica durante el muestreo.
La actividad metanogénica del lodo evaluado se encuentra entre 0.01 y 0.02
g DQO – CH4/ g SSV – d, valores bajos si se tiene en cuenta que la actividad
metanogénica alcanzada por lodos provenientes de reactores anaerobios de
lecho fluidizado, se encuentra entre 0.400 y 1.200 DQO – CH4/ g SSV – d
(Field, 1987) .
De acuerdo con los resultados obtenidos es posible catalogar el lodo
estudiado dentro de las características correspondientes a un lodo de tanque
séptico, con una actividad metanogénica considerablemente inferior a las
presentadas por lodos granulares (Tabla 5).
Tabla 5. Actividad Metanogénica Específica y Concentración de SSV de lodos anaerobios. Fuente (o tipo) Actividad Metanogenica+
g DQO / g SSV - d
Concentracion
g SSV / l
Lodo Granular 0.500 –1.500 70 – 120
Lodo de Reactor* 0.400 – 1.200 ND
Lodo de A.R.D digestadas 0.020 – 0.200 15 – 40
Estiércol Digestado 0.020 – 0.080 20 – 80
Lodo de Tanque Séptico 0.010 – 0.070 10 – 50
Laguna Anaerobia (café)** 0.030 30
Estiércol de Porcino Fresco 0.001 – 0.020 30 – 140
Zanja de Lodo 0.002 – 0.005 20 – 50
Fuente: Field, 1987 *Capa biológica de filtros anaerobios y reactores de lecho fluidizado ** Basadas sobre mediciones hechas en un lodo de laguna de una finca de café en Nicaragua + Se asume una temperatura de 30ºC
5.8. Porcentaje de remoción de materia orgánica y parámetros
físico químicos de la planta de tratamiento
La figura 24 indica el porcentaje de remoción de la materia orgánica en cada
reactor y los resultados obtenidos permiten hacer un acercamiento al
funcionamiento de los reactores. Se observa que el porcentaje de remoción
durante los cuatro muestreos es muy similar, a pesar del pico ocasionado en
el segundo muestreo, resultado probablemente del descenso en la población
fermentativa y sulfato reductora ocurrido en esta fecha, como consecuencia
de un cambio en el efluente que llegaba a la planta de tratamiento. Sin
embargo, la diferencia no es significativa pues la gráfica se encuentra entre
valores muy cercanos.
Porcentaje de remoción de la DQO durante el muestreo
75
80
85
90
95
100
Primer Muestreo Segundo Muestreo Tercer Muestreo Cuarto Muestreo
Muestreo
Po
rcen
taje
de
rem
oci
ón
(%
)
Reactor Norte Reactor Sur
Figura 24. Porcentaje de remoción en cada uno de los reactores durante el muestreo
En términos generales, es posible decir, que los reactores metanogénicos
tienen un nivel de remoción de la materia orgánica alto en este punto, cerca
del 80% (Arrieta et al, 1998), lo que indica que se están manejando de forma
adecuada los efluentes y que el comportamiento de los lodos es óptimo para
el manejo de los mismos, a pesar del bajo valor obtenido en la actividad
metanogénica. Es posible realizar los ensayos de actividad metanogénica
utilizando otro tipo de sustratos como por ejemplo el efluente que entra a los
reactores metanogénicos con el fin de reducir el tiempo de adaptación de la
biomasa al sustrato. Por otra parte de esta forma se simulan mejor las
condiciones que se presentan dentro de estos reactores.
Cabe aclarar que el porcentaje de remoción reportado, pertenece sólo a los
reactores anaerobios y no a la planta de tratamiento en general, pues un
estudio previamente realizado en esta misma planta, muestra un porcentaje
de remoción total del 76% (Moya & Rodríguez, 2000), valor que se encuentra
muy cercano al porcentaje máximo de remoción de materia orgánica
alcanzado por este tipo de tratamiento.
Con base en los recuentos obtenidos se observa la presencia de los
principales grupos tróficos (bacterias fermentativas, sulfato reductoras y
metanógenos) involucrados en las etapas de la degradación de la materia
orgánica; esto sumado al esquema de funcionamiento de la planta de
tratamiento (tabla 6), brinda las condiciones adecuadas que permiten explicar
los buenos rendimientos de remoción de materia orgánica presentados a los
largo del muestreo.
El óptimo crecimiento y desarrollo de todos los grupos microbianos presentes
en los reactores metanogénicos, dependen en gran medida del buen manejo
de los parámetros físico químicos que se le dan a la planta (Tabla 6). La
estabilidad del pH y de la temperatura específicamente, en los reactores son
de vital importancia. El pH, por ejemplo, requiere de rangos entre 6.5 y 7.5,
pues una variación en estos valores podría inhibir el crecimiento de grupos
tróficos como las bacterias sulfato reductoras y los metanógenos, esenciales
en esta etapa del proceso. De igual forma mantener la temperatura en un
rango entre 28ºC y 35ºC es fundamental principalmente para los
metanógenos los cuales incrementan su actividad metanogénica con
temperaturas cercanas a los 35ºC (Arrieta et al, 1998).
Tabla 6. Esquema de operación de la planta de tratamiento durante el muestreo.
1er Muestreo 2do Muestreo 3er Muestreo 4to Muestreo Parámetros E RN RS E RN RS E RN RS E RN RS
PH 5.92 7.67 7.7 6.38 6.98 7.02 6.04 6.88 6.89 6.10 6.95 6.91 Temperatura (Tª) 28.4 28 28 27.3 28.1 28.3 28.5 30.1 30.3 246 27.9 28 ALK (mg CaCO3/l) 567 990 1002.1 660 918 982 404 905 866 695 953 942
AGV (mgCH3COOH/l) 524 27.12 19.68 440 27 25 394 29 32 522 34 32 AGV/ALK* 0.027 0.019 0.02 0.02 0.03 0.04 0.04 0.03 DQO (mg/l) 1919 189 198 1663 245 284 2078 192 185 2995 241 138
SSV (g/l) 4.5 4.5 4.5 4.5 4.5 4.5 4.5 4.5 SS 2.0 1.0 400 410 550 500 380 370
TRH (Horas) 8 8 8 8 8 8 8 8 Caudal (m3/h) 75 71 60 62 66 67 62 42
Fuente: Industria Cervecera, Laboratorio de la Planta de Tratamiento de Aguas Residuales, 2000.
E: Entrada RN: Reactor Norte RS: Reactor Sur
La figura 25, realizada con datos tomados directamente de la planta de
tratamiento de aguas residuales durante las fechas correspondientes a los
muestreos evidencia una estabilidad tanto del pH (6.9 –7.7) como de la
temperatura (28– 30°C). Esto permite suponer que estos parámetros no
están afectando negativamente las poblaciones microbianas, ya que, a nivel
general, no presentaron variaciones sustanciales.
Comportamiento del pH en el muestreo
0
2
4
6
8
10
12
14
Primer
Muestreo
Segundo
Muestreo
Tercer
Muestreo
Cuarto
Muestreo
Muestreo
pH
Comportamiento de la temperatura en el muestreo
10
20
30
40
Primer
Muestreo
Segundo
Muestreo
Tercer
Muestreo
Cuarto
Muestreo
Muestreo
ºC
Figura 25. Comportamiento del pH y la temperatura durante el muestreo.
Otro factor importante para tener en cuenta es la relación ácidos grasos
volátiles – alcalinidad (AGV/Alk), pues es un parámetro para el control de la
acumulación de ácidos grasos volátiles en los reactores anaerobios; un valor
de 0.35 indica sobrecarga del sistema (Oude Elferink et al, 1998). Esta
relación también es empleada como indicador temprano de acidificación del
medio en los reactores metanogénicos. Los valores obtenidos en la relación
AGV/Alk se mantuvieron sin mayores variaciones durante el muestreo con
valores cercanos a 0.03 (Figura 26).
Relación AGV/Alk
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
Primer Muestreo SegundoMuestreo
Tercer Muestreo Cuarto Muestreo
Muestreo
Figura 26. Valores de la relación de AGV/Alk obtenidos durante el muestreo.
De este estudio se puede concluir que aunque la actividad metanogénica del
lodo del reactor metanogénico es baja lo que permite catalogarlo como lodo
de tanque séptico el porcentaje de remoción de la materia orgánica como
DQO es bueno, resultado probablemente de la estabilidad de los parámetros
físico-químicos como pH, temperatura y relación AGV/Alk, que brindaron las
condiciones adecuadas para el crecimiento y desarrollo de los principales
grupos tróficos (bacterias fermentativas, sulfato reductoras y metanógenos)
que deben estar presentes en los reactores metanogénicos y que se encargan
de la degradación anaerobia de la materia orgánica.
Esto indica que la presencia de los grupos tróficos no es garantía de una
adecuada degradación de la materia orgánica; es necesario que además de
existir un balance entre ellas, los parámetros operacionales de la planta de
tratamiento brinden las condiciones adecuadas para su desarrollo.
6. CONCLUSIONES
§ Se obtuvieron los recuentos correspondientes a las bacterias
fermentativas, sulfato reductoras y metanógenos, por la técnica del
NMP, encontrando que la población metanógena corresponde a un
57% del total de la población de los reactores anaerobios, seguido
por las sulfato reductoras con 30% y por último la población
fermentativa con 13%. Esta técnica tiene un nivel de confianza del
95%.
§ La población de metanógenos hidrogenotróficos y acetotróficos se
encontraron en la misma proporción (50:50), es decir, no se
observó predominio de un grupo sobre otro. Así mismo la población
sulfato reductora presentó recuento muy similares para el grupo
que emplea el acetato y el que emplea el lactato, sin evidencia
estadística que indique diferencias entre ellos.
§ El grupo fermentativo de la glucosa presentó predominio total
sobre las bacterias fermentativas del lactato que se encontró
ausente.
§ Se determinó que no existen diferencias microbiológicas entre los
reactores norte y sur de la planta de tratamiento, y su
comportamiento a lo largo del muestreo fue similar como
consecuencia de la homogeneidad de los efluentes que llegan a
cada uno de ellos.
§ La actividad metanogénica del lodo estudiado se encuentra entre
valores de 0.01 y 0.02 gDQO-CH4/gSSV-d, y aunque es baja, el
porcentaje de remoción de materia orgánica alcanza cerca del 80%
de eficiencia.
§ Los parámetros físico-químicos (pH, temperatura, AGV/Alk)
presentaron gran estabilidad a lo largo del muestreo que en gran
medida favorecen la proliferación de los grupos tróficos en el
interior de los reactores metanogénicos.
7. RECOMENDACIONES
Una vez obtenidos y analizados los resultados del presente trabajo, es preciso
realizar algunas recomendaciones a la empresa, con el fin de continuar con
investigaciones que complementen el actual estudio.
§ Se recomienda realizar controles estrictos de amonio, sulfatos y
sulfuros en el agua a tratar, para conocer los niveles exactos de estos
compuestos en los vertimientos y de esta forma poder correlacionar la
presencia ó ausencia de los mismos con las condiciones
microbiológicas de la planta.
§ Es aconsejable llevar a cabo comparaciones de la actividad
metanogénica utilizando como sustratos, en un ensayo acetato y en
otro agua residual de la misma planta de tratamiento, realizándole
previamente la determinación de la DQO. De esta forma se reduce el
tiempo de adaptación del lodo al sustrato y se simulan las condiciones
que se encuentran en los reactores metanogénicos.
§ Para la evaluación de la toxicidad de compuestos específicos sobre el
lodo, se recomienda utilizar como sustrato glucosa, pues este brinda la
posibilidad de observar el efecto del compuesto sobre todos los grupos
microbianos que intervienen durante el proceso de degradación de la
materia orgánica.
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ANEXO 1
Preparación de medios pre-reducidos
La preparación de los medios de cultivo y el agua de reducción empleada en
las diluciones es de vital importancia para mantener las condiciones de
anaerobiosis en la siembra de los organismos anaerobios estrictos.
1. Colocar 500 ml de los medios de cultivo o el agua de reducción en un
frasco de suero o balón aforado con 1 ml de Resazurina (indicador de
anaerobiosis), la solución toma una coloración violeta (Figura A1).
Figura A1. Medio de cultivo después de agregar el indicador de anaerobiosis.
2. Agregar 10% más de agua y dejar en ebullición, hasta que vuelva al
volumen inicial. Una vez ha hervido la solución, dejar enfriar bajo
atmósfera de H2/CO2.
3. Diluir 0.25 g de Cisteína y 2.5 g de bicarbonato de sodio, la coloración
violeta debe desaparecer y el medio debe quedar incoloro (Figura A2).
Figura A2. Medio de cultivo reducido.
4. Servir 9 ml en tubos hungate o tubos con tapón de caucho bajo
atmósfera de H2/CO2.
5. Realizar cambio de fase en cada uno de los tubos a emplear con
N2/CO2 para el agua de reducción y con H2/CO2 para el medio de
cultivo de los organismos metanógenos hidrogenotróficos (Figura A3).
Figura A3. Cambio de fase de los medios de cultivo
Inoculación de la muestra en los tubos Hungate
1. Antes de inocular la muestra de lodo para las siembras en los tubos
Hungate, este se debe macerar con ayuda de un homogenizador para
hacerlo menos denso, siempre bajo atmósfera de H2/CO2 para reducir
al máximo el contacto del lodo con el aire (Figura A4).
Figura A4. Homogenización del lodo bajo atmósfera de H2/CO2
2. Para la inoculación de los tubos de dilución y los tubos de las siembras
se utilizan generalmente jeringas de 1 ml del tipo tuberculina,
previamente reducidas con H2/CO2 (Figura A5). Al momento de
inocular las muestras en los tubos Hungate es preciso tener en cuenta
flamear los tapones, las agujas de las jeringas y trabajar cerca de la
llama de los mecheros con el fin de evitar la contaminación de los
medios.
Figura A5. Inoculación de los medios de cultivo con la muestra de lodo
ANEXO 2
Medio para recuento de Metanógenos Hidrogenotróficos (Medio 1)
REACTIVOS PARA 1 LITRO DE SOLUCIÓN
Solución de NiCl2 (50mg/100ml) 1 ml
Selenito de Sodio (1,73g/100ml) 1 ml
K2HPO4 0.3 g
Solución Mineral Balch sin sulfatos 50 ml
FeCl2 * 4 H2O (0,2%) 1 ml
Solución de oligoelementos Balch sin sulfatos 10 ml
Resazurina 1 ml
H2/CO2 (80/20)
Medio para recuento de Metanógenos Acetotróficos (Medio 2)
REACTIVOS PARA 1 LITRO DE SOLUCIÓN
K2HPO4 0.3 g
Solución Mineral Balch sin sulfatos 50 ml
Solución de oligoelementos Balch sin sulfatos 10 ml
FeCl2 * 4 H2O (0,2%) 1 ml
Selenito de Sodio (1,73g/100ml) 1 ml
Extracto de Levadura 1 g
Resazurina 1 ml
Acetato de Sodio 8 g
ANEXO 3
Medio para recuento de Bacterias Sulfato Reductoras del Acetato y
del Lactato
REACTIVOS PARA 1 LITRO DE SOLUCIÓN
K2HPO4 0.2 g
NH4Cl 0.5 g
Na2SO4 3 g
FeCl2 * 4 H2O 0.36 g
CaCl2 * 2 H2O 0.15 g
NaCl 1.2 g
MgCl2 * 6 H2O 0.4 g
Extracto de Levadura 1 g
Solución de Oligoelementos sin sulfatos PW 1 ml
Resazurina 1 ml
Acetato de Sodio * 3 H2O 30mM (Medio 1) 3 g
Lactato de Sodio 60% (Medio 2) 8.4 ml
ANEXO 4
Medio para recuento de Bacterias Fermentadoras de la Glucosa y del
Lactato
REACTIVOS PARA 500 ML DE SOLUCIÓN
K2HPO4 0.15 g
Solución de Minerales Balch sin sulfatos 25 ml
Solución de oligoelementos Balch sin sulfatos 5 ml
FeSO4 * 7 H2O (0,2%) 0.5 ml
NiCl2 * 6 H20 (0,5g/L) 0.5 ml
Azul de Bromotimol (1% en NaOH 1N) 0.5 ml
Azul de Bromotimol (1% en NaOH 1N) 0.5 g
Glucosa (Medio 1) 5 g
Lactato 50 mM (Medio 2) 3.6 g
Solución Mineral de Balch sin sulfatos (1979)
REACTIVOS PARA 1 LITRO DE SOLUCIÓN
KH2PO4 6 g
NH4Cl 5 g
NaCl 12 g
MgCl2 * 6 H2O 2.2 g
CaCl2 * 2 H2O 0.10 g
Conservar en refrigeración
Solución de Oligoelementos Balch sin sulfatos (1979)
Conservar en refrigeración. El ácido nitriloacético de disuelve en KOH (10M) hasta pH 6.5; después mezclar con losminerales restantes.
Solución Mineral Pfenning-Widdel (PW)
REACTIVOS PARA 1 LITRO DE SOLUCIÓN
KH2PO4 0.2 g
NH4Cl 0.3 g
KCl 0.5 g
NaCl 1 g
MgCl2 * 6 H2O 0.4 g
CaCl2 * 2 H2O 0.15 g
REACTIVOS PARA 1 LITRO DE SOLUCIÓN
Acido Nitriloacético (NTA) 1.5 g
MgCl2 * 6 H2O 2.5 g
MnCl2 * 4 H2O 0.6 g
NaCl 1 g
FeCl2 * 4 H2O 0.1 g
CoCl2 * 6 H20 0.1 g
CaCl2 * 2 H2O 0.1 g
ZnCl2 0.1 g
CuCl2 * 2 H2O 0.01 g
AlCl3 0.01 g
H3BO3 0.01 g
Na2MoO4 * 2 H2O 0.01 g
Solución de resazurina
Adicionar 0,1g de resazurina en 100ml de agua destilada. Utilizar 1ml en un
litro de medio.
Solución de Azul de Bromotimol
Adicionar 1g en 100ml de NaOH 1N.
ANEXO 5
Actividad Metanogénica de los Lodos
La actividad metanogénica de un lodo anaerobio consiste en una medida
experimental de la capacidad del lodo para transformar un sustrato en
metano. Se utiliza generalmente como sustrato ácido acético. Este ensayo se
basa en la técnica de las botellas de Mariotte (Figura A6), donde el
desplazamiento de líquido indica el volumen de metano que se ha producido.
Figura A6. Montaje de las Botellas de Mariotte
El resultado de la actividad metanogénica depende de muchos factores como
la temperatura, la concentración de sustrato y de biomasa, el régimen del
ensayo (con o sin agitación), el pH y la composición del sustrato.
Para ensayos de la actividad metanogénica de los lodos sin agitación se
utiliza 1.25 gSSV/l de lodo de acuerdo a relación establecida en estudios de la
universidad de los Andes. Esta concentración equivale a la concentración 1
(C1). La concentración de sustrato para este ensayo es de 4 g DQO-AGV/l,
teniendo en cuenta que 1g de ácido acético es equivalente a 1.074 g de
DQO. El volumen 1 (V1) corresponde al volumen final del reactor piloto (500
ml). La concentración 2 (C2) es el valor de sólidos suspendidos volátiles que
se debe hallar (Anexo 9). Los siguientes son los cálculos que se deben
realizar para hacer el montaje.
C1 * V1 = C2 * V2
V2 = C1 * V1/ C2
Densidad del lodo
Para determinar la cantidad de lodo que se debe utilizar en el ensayo se
utiliza en volumen de lodo hallado y se aplica en la formula de la densidad del
lodo.
a) Peso del pignometro vacío = X g
b) Pignometro (volumen) = Y ml
c) Pignometro + muestra = Z g
d) Peso de la muestra = c - a
Densidad = m / v
Densidad = d / b
Densidad = m / v
m = densidad * v
m = M g, este es la cantidad de lodo que se utiliza para el ensayo.
Procedimiento
En una botella de 500 ml se agrega la cantidad de lodo que se determinó
anteriormente y luego agua destilada hasta la mitad de la botella.
Posteriormente se adiciona el sustrato (g DQO-AGV/l) y la solución de
nutrientes (si son necesarios). El volumen se completa luego con agua
destilada. Con el fin de reducir el medio se burbujea N2 o CH4 a través del
líquido durante tres minutos(se recomienda realizar este proceso para
desplazar el oxígeno presente en las botellas). Esta botella se sella con un
tapón de caucho conectado a una manguera que a su vez está conectada a
otra botella de 500 ml que contiene NaOH al 5%. Esta última botella recibe el
gas producido, compuesto principalmente por CH4 y CO2. El alto pH permite
atrapar el CO2 y por desplazamiento del líquido se mide el volumen de
metano producido. El volumen medido de NaOH es equivalente al volumen
de metano producido.
Cálculos de Actividad Metanogénica
§ Factor de conversión
El factor de conversión depende de las condiciones ambientales bajo las
cuales se realice el ensayo (presión atmosférica y temperatura). Para
condiciones estandar de 0°C y 1 atmósfera de presión, 350 ml de CH4 son
equivalentes a 1g de DQO.
F.C = 1000 mb * 350 ml CH4 * (273 + T) P 1 g DQO 273°K
§ Máxima tasa de producción de metano
La máxima tasa de producción de metano se calcula como la máxima
pendiente promedio en un grafico tiempo vs. Producción acumulada de
metano. Esta pendiente deberá calcularse en un periodo no muy corto de
tiempo.
dCH4 = ml CH4 * 24 h / día
dt h
Actividad Metanogénica
La actividad metanogénica es calculada como:
A.M = 1 * dCH4 F.C * W dt
en donde,
A.M : Actividad Metanogénica (gDQO/gSSV – d)
dCH4/dt : Máxima tasa de producción de metano (mlCH4 / d)
W : Cantidad de biomasa en el ensayo (gSSV)
F.C: Factor de conversión (ml CH4 / gDQO)
ANEXO 6
Determinación de solidos suspendidos totales (SST) y solidos
suspendidos volatiles (SSV)
Principio
Este método es recomendado cuando la muestra posee bajo contenido de
sólidos (Problemas con la filtración).
La materia posee una significante presión de vapor a esta temperatura es
perdida durante la evaporación y no está definida como sólido.
Usando este método no se detectan minerales ni sales como ceniza.
Procedimiento
- La determinación se debe llevar a cabo por duplicado.
- Llenar un tubo de centrífuga con X ml de la muestra.
- Colocar los tubos en la centrífuga, teniendo en cuenta que queden
balanceados.
- Centrifugar las muestras durante 10 minutos a 6000 rpm.
- Dejar secar un crisol de lata con filtro en un desecador.
- Pesar el crisol con el filtro (peso “a”).
- El filtro es colocado en una bomba con vacío y el filtro es vaciado en el
filtro.
- Secar el crisol con la muestra en un horno a 105°C hasta que el peso
sea constante (± 24 horas).
- Dejar enfriar el crisol y pesarlo (peso “b”).
- Colocar el filtro en un crisol de porcelana previamente pesado (peso
“c”) y someter al calor los crisoles en un lugar ventilado hasta que deje
de salir humo.
- Colocar los crisoles de porcelana en un horno a 600°C por dos horas.
- Dejar enfriar los crisoles y pesarlos (peso “d”).
- Limpiar los crisoles y colocarlos nuevamente en una estufa a 105°C.
Cálculos
Sólidos suspendidos totales (g SST/l) = ( b – a ) * 1000 / X
Sólidos suspendidos volátiles (g SSV/l) = (SST – cenizas)
Cenizas (g cenizas/l) = ( c – d ) * 1000 / X
ANEXO 7
Prueba de ANOVA para los grupos tróficos en los reactores
Sumatoria
de medias
df Media F Significancia
Entre
Grupos
6.2017E+17 3 2.0672E+17 0.686 0.566
Dentro de
los grupos
1.3266E+19 44 3.0149E+17
Total 1.3886E+19
Sig < 0.025 Recuento Reactor Norte � Recuento Reactor Sur
Sig > 0.025 Recuento Reactor Norte = Recuento Reactor Sur
Para determinar la homogeneidad de los grupos estudiados con esta prueba
es necesario tener en cuenta el valor obtenido en significancia. De esta
forma si el valor que allí aparece es menor a 0.025 indica que entre los
grupos se presentan diferencias estadísticas apreciables. El valor obtenido es
0.566 lo que indica que no existen diferencias estadísticas entre los grupos
tróficos estudiados.
ANEXO 8
Análisis Tukey B para los grupos tróficos
GRUPOS HOMOGENEOS GRUPO TROFICO 1 2
BFG – BFL 2.619E+08
BSRA – BSRL 5.74E+08
MA - MH 1.100E+09
BFG = Bacterias Fermentativas Glucosa BFL = Bacterias Fermentativas Lactato BSRA = Bacterias Sulfato Reductoras Acetato BSRL = Bacterias Sulfato Reductoras Lactato MA = Metanógenos Acetotróficos MH = Metanógenos Hidrogenotróficos
El análisis de Tukey B corrobora los valores obtenidos por los recuentos
microbiológicos y el análisis de ANOVA, mostrando las diferencias entre los
grupos tróficos estudiados.
ANEXO 9
Prueba de Tukey B para Actividad Metanogénica
GRUPOS HOMOGENEOS MUESTREO 1 2
Primero 84.00
Segundo 53.462
Tercero 153.421
Cuarto 92.885
Esta prueba permite determinar la homogeneidad de la actividad
metanogénica para los reactores en cada uno de los muestreos. Gracias a
este análisis y a los resultados obtenidos de la actividad metanogénica, es
posible observar la diferencia existente entre los dos primeros y los dos
últimos muestreos.
ANEXO 10
Prueba T de Student para Actividad Metanogénica
Intervalo de confianza del
95%
Primer Muestreo
F t df Signific Diferencia de la media
Error Estandar
Menor Mayor
NaOH desp 0.183 -0.050
12 0.961 -1.429 28.463 -63.445 60.588
-0.050
11.636 0.961 -1.429 28.463 -63.661 60.804
Intervalo de confianza del
95%
Segundo Muestreo
F t df Signific Diferencia de la media
Error Estandar
Menor Mayor
NaOH desp 3.093 2.191 24 0.038 38.077
17.376 2.214 73.940
2.191 19.974 0.040 38.077
17.376 1.828 74.326
Intervalo de confianza del
95%
Tercer Muestreo
F
t
df
Signific
Diferencia de la media
Error Estandar
Menor Mayor
NaOH desp 0.731 -0.916
24 0.369 -28.077 30.644 -91.323 35.169
-0.916
22.728 0.369 -28.077 30.644 -91.511 35.357
Intervalo de confianza del
95%
Cuarto Muestreo
F
t
df
Signific
Diferencia de la media
Error Estandar
Menor Mayor
NaOH desp 2.567 1.517 24 0.142 41.154 27.122
-14.822 97.130
1.517 20.839 0.144 41.154 27.122
-15.275 97.583
Sig < 0.025 Actividad Metanogénica Reactor Norte � Actividad
Metanogénica Reactor Sur
Sig > 0.025 Actividad Metanogénica Reactor Norte = Actividad
Metanogénica Reactor Sur
