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UNIVERSIDAD AUTNOMA DE YUCATNFACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA.

NOTAS DE DISEOS EXPERIMENTALES

Jos C. Segura Correa. Profesor investigador Titular

Mrida Yucatn, enero de 2000.

PROLOGO. Los mtodos estadsticos son una herramienta til en los principales tipos de investigacin: experimentos, encuestas y estudios retrospectivos. En los experimentos se desea medir y comparar los efectos de fuentes de variacin establecidas por el investigador, por lo cual se cambia la naturaleza de las muestras. En las encuestas y estudios retrospectivos no se cambia la naturaleza de las muestras, nicamente se observan para poder hacer algunas inferencias sobre la poblacin. En la actualidad, el anlisis de datos se realiza a travs del uso de programas de computadoras escritos para tal fin; son pocos los trabajos de investigacin que se analizan a mano. Sin embargo, es importante que el usuario de los mtodos estadsticos haya desarrollado, alguna vez, el anlisis de los datos, para poder entender los procesos que la computadora realiza. El conocimiento del mtodo de anlisis da una apreciacin de la filosofa detrs del anlisis. Por otro lado, la mayora de los libros estn escritos para gente con slidos conocimientos de Estadstica o son demasiado generales: son por lo tanto de poca ayuda para las gentes que tienen escasos conocimientos en esta ciencia. La mayora de la gente que trabaja en Produccin Animal, les interesa planear su experimento y analizarlo con facilidad. El problema principal, sin embargo, es el diseo del experimento. Este libro est escrito con tal fin. Contiene ilustraciones de la distribucin de los tratamientos segn el tipo de Diseo del experimento y ejemplos desarrollados paso a paso de los Diseos Experimentales de uso ms frecuente en las Ciencias Biolgicas para que sirvan de base para el anlisis de diseos similares. Tambin se incluye una seccin sobre algunas alternativas de mejorar la precisin de los experimentos.

CONTENIDO. Simbologa utilizada. I.- IMPORTANCIA DE LA EXPERIMENTACIN. 1.1 Importancia de la experimentacin en las ciencias biolgicas 1.2 Definicin de conceptos. II.- ANALISIS DE VARIANZA. III.- DISEOS EXPERIMENTALES SIMPLES. 3.1.- DISEO COMPLETAMENTE AL AZAR. 3.1.1 Modelo estadstico y Anlisis de varianza. 3.1.2 Ejemplos de Diseos Completamente al Azar. 3.1.3 Comparacin de medias de tratamientos. 3.1.4 Programa SAS para un Diseo Completamente al Azar. 3.1.5 Contrates ortogonales. 3.1.6 Programa SAS para contrastes ortogonales. 3.2.- DISEO DE BLOQUES AL AZAR. 3.2.1 Modelo estadstico y Anlisis de varianza. 3.2.2 Ejemplo de un Diseo de Bloques al Azar. 3.2.3 Comparacin de medias de tratamientos. 3.2.4 Estimacin de parcelas perdidas. 3.2.5 Programa SAS para un Diseo de Bloques al Azar. 3.3.- BLOQUES AL AZAR GENERALIZADOS. 3.3.1 Modelo estadstico y Anlisis de varianza. 3.3.2 Ejemplo de un Diseo de Bloques al Azar Generalizados. 3.3.3 Programa SAS para un Diseo de Bloques al Azar Generalizados. 3.4.- DISEO EN CUADRO LATINO. 3.4.1 Modelo estadstico y Anlisis de varianza. 3.4.2 Ejemplo de un Diseo en Cuadro Latino. 3.4.3 Comparacin de medias de tratamientos. 3.4.4 Programa SAS para un Diseo en Cuadro Latino. 3.5.- DISEO CROSSOVER. 3.5.1 Modelo estadstico y Anlisis de varianza. 3.5.2 Ejemplo de un Diseo Crossover. 3.5.3 Programa SAS para un Diseo Crossover. IV.-DISEOS EXPERIMENTALES CON SUBMUESTREO. 4.1.- DISEO COMPLETAMENTE AL AZAR CON SUBMUESTREO. 4.1.1 Modelo estadstico y Anlisis de varianza. 4.1.2 Ejemplos de Diseos Completamente al Azar. 4.1.3 Comparacin de medias de tratamientos.

4.1.4 Programa SAS para un Diseo Completamente al Azar. 4.1.5 Contrates ortogonales. 4.1.6 Programa SAS para contrastes ortogonales. 4.2.- DISEO DE BLOQUES AL AZAR CON SUBMUESTREO. 4.2.1 Modelo estadstico y Anlisis de varianza. 4.2.2 Ejemplo de un Diseo de Bloques al Azar. 4.2.3 Comparacin de medias de tratamientos. 4.2.4 Estimacin de parcelas perdidas. 4.2.5 Programa SAS para un Diseo de Bloques al Azar. 4.3.- DISEO EN CUADRO LATINO CON SUBMUESTREO. 4.3.1 Modelo estadstico y Anlisis de varianza. 4 3.2 Ejemplo de un Diseo en Cuadro Latino. 4.3.3 Comparacin de medias de tratamientos. 4.3.4 Programa SAS para un Diseo en Cuadro Latino. V.- EXPERIMENTOS FACTORIALES. 5.1 Modelo estadstico. 5.2 Ejemplo de un Diseo Completamente al azar con un arreglo factorial 2x3. 5.3 Comparacin entre tratamientos. 5.4 Programa SAS para comparaciones preplaneadas. VI.- EXPERIMENTOS EN PARCELAS DIVIDIDAS. 6.1 Modelo estadstico. 6.2 Ejemplo de un Experimento en Parcelas divididas con un Diseo Completamente al azar. 6.3 Comparacin entre tratamientos. 6.4 Programa SAS para un Diseo Completamente al Azar con arreglo de parcelas divididas. 6.5 Programa SAS para un Diseo de Bloques con arreglo de parcelas dividas. VII.- ANALISIS DE COVARIANZA. 6.1 Modelo estadstico. 6.2 Ejemplo de un Anlisis de covarianza. 6.3 Comparacin entre tratamientos. 6.4 Programa SAS para un Anlisis de Covarianza. 6.5 Programa SAS para un Anlisis de Covarianza. VIII. METODOS PARA MEJORAR LA PRECISION DE LOS EXPERIMENTOS. IX.- REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS.

ABREVIACIONES Y SIMBOLOGIA UTILIZADA. CM= Cuadrado medio; CMtrat= Cuadrado medio de tratamientos; CMbloque= Cuadrado medio de bloques; CMtotal= Cuadrado medio del total; CMerror= Cuadrado medio del error; CV= FC= FV= GL= Coeficiente de variacin; Factor de correccin; Fuentes de variacin; Grados de libertad;

SC= Suma de cuadrados. SCtrat= Suma de cuadrados de tratamientos; SCbloque= Suma de cuadrados de bloques; SCtotal= Suma de cuadrados del total; SCerror= Suma de cuadrados del error; SP= Suma de productos; r= Nmero de repeticiones; t= Nmero de tratamientos;

1 I.- IMPORTANCIA DE LA EXPERIMENTACIN La investigacin cientfica consiste en la bsqueda permanente de la verdad por mtodos objetivos, adecuados y precisos. Existen dos tipos principales de investigacin: estudios observacionales (encuestas) y experimentacin. En las encuestas no se cambia la naturaleza de las muestras, nicamente se observan para obtener conclusiones sobre ellas y sobre la poblacin total. En los experimentos se miden y comparan los efectos de fuentes de variacin y generalmente se cambia el estado de las muestras y se observa el efecto de los tratamientos. Es decir, la experimentacin es un mtodo cientfico de investigacin que consiste en hacer operaciones y prcticas destinadas a demostrar, comprobar o descubrir fenmenos o principios bsicos. La experimentacin en las ciencias biolgicas, en particular, comprende las pruebas, ensayos, observaciones, anlisis o estudio prctico de todo cuanto interesa a sta disciplina. Se considera un experimento la prueba con la prctica de una hiptesis formulada, por ejemplo, el ensayo de ganancia de peso de animales proporcionados cuatro dietas distintas. Se observan nicamente los efectos y de aplicacin prctica inmediata. Se considera una investigacin cuando se estudia causa y efecto, por ejemplo, la determinacin del tamao de parcela ms eficiente para ensayar variedades de alfalfa. Los resultados de una investigacin son de aplicacin mediata y puede conducir a desarrollar nuevas tcnicas o a modificar las existentes. Comnmente ambos trminos se confunden y son inseparables. Se puede considerar la Experimentacin como un arte y una ciencia: Arte. Por la habilidad necesaria para ingeniar, planear y aplicar un conjunto de tcnicas para eliminar causas extraas y realizar experimentos de campo y de laboratorio o de invernadero. Ciencia. Por la aplicacin del mtodo cientfico y un conjunto de conocimientos cientficos para el desarrollo de tecnologas que permitan obtener nuevas y mejores dietas, nuevas y mejores variedades etc. Las etapas sucesivas en todo trabajo de investigacin se pueden resumir en las siguientes: 1) Especificacin del problema. a) Antecedentes b) Importancia

2 c) Objetivos 2) Revisin de literatura 3) Material y mtodos (Planteamiento o diseo del experimento). a) Lugar de la experiencia b) Identificacin de la unidad experimental (tamao de parcela, animal, corral etc.) c) Nmero de repeticiones por tratamiento. d) Distribucin de los tratamientos (diseo) e) Instrumentos, equipos, animales etc. 4) Ejecucin y desarrollo de las operaciones en el campo o en el laboratorio. 5) Recoleccin de datos y observaciones 6) Captura y anlisis de la informacin en una computadora 7) Interpretacin de los resultados 8) Discusin de los resultados 9) Anlisis econmico 10) Conclusiones (utilidad prctica) 11) Reporte Nota. Es importante para la planeacin correcta de un experimento tener conocimientos de otras ramas de la ciencia. Para un experimento de nutricin por ejemplo es necesario conocer sobre: Fisiologa. Para elegir animales similares en estado fisiolgico ya que sto podra influir en los resultados. Gentica. Para elegir genotipos similares Salud. Para detectar casos subclnicos Estadstica. Para disear y analizar correctamente la informacin generada por el experimento. A continuacin se proporcionan algunas conceptos necesarios para el curso. definiciones y

1.2.- Definicin de conceptos. Experimento. Es una bsqueda planeada para obtener nuevos conocimientos o para confirmar o negar los resultados de experimentos previos. Al disear un experimento, los objetivos deben ser establecidos claramente como preguntas a ser contestadas, hiptesis a ser probadas y efectos a ser estimados. Todos los factores excepto el objeto de estudio deben permanecer constantes. Diseo Experimental. El disear un experimento consiste en planear un experimento de tal forma que reuna la

3 informacin que sea pertinente al problema bajo investigacin. La diferencia fundamental entre los distintos diseos experimentales (p.e., completamente al azar, bloques al azar, cuadro latino etc.) est en la distribucin aleatoria de los tratamientos. Aleatorizacin. Proceso que relaciona los tratamientos con las unidades experimentales en forma sistemtica con el propsito de obtener un estimado vlido e insesgado del error experimental, de las medias de los tratamientos y de las diferencias entre las mismas. La asignacin aleatoria de los tratamientos puede hacerse utilizando una tabla de nmeros aleatorios o trozos de papel en los cuales los tratamientos (t) se escriben r veces. Unidad Experimental. Es el material, lugar o sujeto sobre el cual se aplican los tratamientos en estudio; es la unidad de informacin ms pequea con base en las repeticiones. Puede ser un animal o grupo de animales, una parcela en el campo, una maceta etc. Es caracterstica de las unidades experimentales mostrar variacin an cuando se les aplique el mismo tratamiento. Unidad de muestreo. Fraccin de la unidad experimental (o la totalidad de sta) en la cual se mide el efecto de un tratamiento. Por ejemplo, un animal o cada una de tres muestras de sangre tomadas en el mismo animal. Repeticin. Cada una de las unidades experimentales donde se aplica el mismo tratamiento. p.e.; si se tienen 12 unidades experimentales y se quieren probar tres tratamientos, se tendrn entonces cuatro repeticiones por tratamiento. Tratamiento. Es una sola de las formas en cantidad y calidad que toma durante el experimento el factor que se quiere estudiar (cada uno de los niveles de un factor). Por ejemplo, si el factor que se quiere estudiar es la cantidad de lisina, cada una de las dosis de lisina aplicada durante el experimento es un tratamiento. Los tratamientos a estudiar durante el experimento pueden ser una combinacin de varios niveles de factores. Por ejemplo, si se quiere estudiar el efecto de tres niveles de protena (16 20 y 24%) y dos de energa (2800 y 3200 Kcal/Kg) en la dieta de pollos de engorda en finalizacin, en este caso, cada combinacin de los distintos niveles de protena y energa constituyen un tratamiento y se tendran seis tratamientos. En estudios sociolgicos y

4 sicolgicos, los tratamientos se pueden referir a edad, sexo, grado de educacin, religin, etc. Testigo. Sujeto o tratamiento de comparacin. Al realizar un experimento se debe incluir un testigo para medir el resultado de un experimento o el avance de un programa. Por ejemplo, si se van a usar tratamientos con fertilizantes, el testigo ser aquel tratamiento que no incluya fertilizante (o el nivel de fertilizante de uso ms comn en la regin). El testigo debe considerarse como otro tratamiento ms. Bloque. Conjunto de unidades experimentales que, debido al diseo experimental se consideran por separado para asignarles los tratamientos que les correspondan. Error Experimental. Es la variacin debida a diferencias entre unidades experimentales tratadas en forma similar. El error experimental no puede eliminarse, pero se puede reducir su efecto. Entre las modalidades para reducir el error experimental estn: a) utilizar unidades experimentales tan uniformes (homogneas) como sea posible; b) tamao de la unidad experimental adecuada; c) distribucin aleatoria de los tratamientos; y d) utilizar el nmero ptimo de repeticiones por tratamiento. Error de submuestreo. Es el error debido a variaciones o diferencias entre muestras dentro de unidades experimentales. Por ejemplo, si una corraleta con tres animales es la unidad experimental, entonces las diferencias entre los tres animales son las que contribuyen al error de submuestreo.

II.- ANALISIS DE VARIANZA Quizs el anlisis de varianza (ANOVA) es la tcnica estadstica ms usada por el investigador. Se aplica a situaciones donde existen varios grupos o tratamientos y se prueba la diferencia entre ellos. Si se tiene un nmero de muestras y se quiere probar la diferencia entre ellas, entonces se podran tomar las muestras en pares y hacer todas las comparaciones posibles utilizando prueba de t. Sin embargo, esto no es aceptable: 1) Porque se obtendran respuestas aparentemente significativas cuando no las hay: El nmero de errores tipo I est muy relacionado con el nmero de pruebas

5 (comparaciones) que se llevan a cabo. Tambin, es muy probable que la diferencia entre la media mayor y la menor mostrara significancia en una prueba de t, debida al azar. 2) Hacer todas las comparaciones con pruebas de t, implica mucho trabajo. Por ejemplo, con 5 tratamientos se tendran que hacer 10 pruebas y con 8 tratamientos 28 pruebas. Por ello, la prueba de t es inapropiada cuando se comparan ms de dos tratamientos. El ANOVA es en esencia un procedimiento aritmtico que consiste en descomponer una suma de cuadrados total (variacin total) en fuentes de variacin reconocidas, incluyendo la variacin que no se ha podido medir (proveniente de la variacin inherente al material experimental o de la falta de homogeneidad del ambiente en el que se realiz el experimento), fuente de variacin conocida como residuo o error experimental. El ANOVA se utiliza en todos los campos de investigacin, cuando los datos son medidos cuantitativamente, es decir cuando las observaciones se hallan en forma de nmeros (son medibles). Tambin se utiliza para datos no distribuidos normalmente pero que a travs de transformaciones (p.e., logaritmos o raz cuadrada) pueden aproximarse a la normalidad. Su uso ha significado una gran expansin para el diseo experimental; como se ver ms adelante cada diseo tiene su propio ANOVA. Las suposiciones bsicas para que el ANOVA tenga validez son, a) Los efectos de tratamiento y los efectos ambientales son aditivos. Es decir, la SCtrat + SCError debe ser igual a la SCtotal. b) El error experimental constituye un elemento aleatorio, normal e independientemente distribuido con media cero y varianza comn. c) Las varianzas dentro de grupos (p.e tratamientos) son iguales. d) La media y la varianza de los grupos son independientes. Un mtodo sencillo para probar esto consiste en calcular la desviacin estndar (DE) de cada nivel (es decir la raz cuadrada de las varianzas dentro de cada grupo) y se traza contra las medias de las muestras. Si se observa alguna asociacin entre las medias y DE entonces el ANOVA no es apropiado. Un mtodo ms objetivo de la prueba de normalidad de los datos y desigualdad de varianzas es el de la prueba KolmogorovSmirnov. La prueba de Barlett es otro procedimiento para la prueba de homogeneidad de varianzas (Snedecor y Cochran 1980 seccin 10.21).

6 Cabe mencionar, que aunque el ANOVA no es muy sensible a las violaciones de las suposiciones (especialmente cuando se usan iguales nmeros de observaciones por subclase, alejamientos mayores de las suposiciones invalidan el mtodo. Esto podra conducir a conclusiones incorrectas. Consecuentemente es una preocupacin prudente para verificar las suposiciones bsicas del ANOVA. En el ANOVA para obtener el valor de F calculada (que denota la significacin entre tratamientos) se divide el cuadrado medio de tratamientos entre el cuadrado medio del error. Al comparar el valor de F calculado con el de F tabulado podemos establecer si existe o no existe diferencia estadsticamente significativa entre tratamientos. El valor de F calculado se halla en la tabla de F con el nivel de significancia (1 o 5%) y con los grados de libertad de tratamientos en el numerador y con los grados de libertad del error experimental en el denominador. Si el valor de F calculado es mayor que el valor de F tabulado, se rechaza la hiptesis nula en caso contrario se acepta. El paso siguiente del ANOVA es la comparacin de las medias de tratamientos para conocer cual es el mejor. A continuacin se discuten los diseos experimentales de uso ms frecuente en las ciencias biolgicas.

III.- DISEOS EXPERIMENTALES CLSICOS. 3.1.- DISEO COMPLETAMENTE AL AZAR. Es el diseo ms simple y se usa cuando las unidades experimentales son homogneas o cuando la variacin entre ellas es muy pequea; tal es el caso de experimentos de laboratorio, invernadero etc. en donde las condiciones ambientales son controladas. Esta es una prueba con un solo criterio de clasificacin (tratamientos). La distribucin de los tratamientos se hace aleatoriamente entre todas las unidades experimentales, utilizando para ello tablas de nmeros aleatorios o papeles escritos con los tratamientos o claves de stos (Figura 1).

B

A

C

C

7

B

C

A

C

A

D

B

D

C

B

A

B

A

D

D

D

Figura 1. Distribucin aleatoria de los tratamientos en un diseo completamente al azar con cuatro tratamientos y cinco repeticiones por tratamiento. Algunas ventajas de este diseo son, a) Su facilidad de planeacin. b) Es flexible en cuanto al nmero de tratamientos y repeticiones, ya que no es necesario que el nmero de tratamientos y repeticiones sea igual. c) No hay necesidad de estimar parcelas perdidas. d) Por no tener muchas restricciones aumenta el nmero de grados de libertad para el error. Algunas desventajas son, a) No es eficiente con material experimental heterogneo. b) Puesto que no existen restricciones en la aleatorizacin de los tratamientos, el error experimental incluye toda la variacin excepto aquella debida a tratamientos. 3.1.1 Modelo estadstico y Anlisis de varianza. El modelo estadstico para este diseo es Yij= + i + eij donde: Yij= es la j-esima repeticin correspondiente al i-esimo tratamiento; = es la media general; i es el efecto del iesimo tratamiento; y eij es el error aleatorio normal e

8 independientemente distribudo varianza comn (0, ). (NID) con media cero y

CUADRO 1 ANALISIS DE VARIANZA PARA UN DISEO COMPLETAMENT AL AZAR.

FV

GL

SC

CM

Fc

Tratamiento

t-1

Yr

2 i

FC

SCtrat t 1 SCerror t ( r 1)

CM trat CM error

Error

t(r-1)

SCtotal-SCtrat

Total

tr-1

Yij - FC

FC= (Yij)/rt; repeticiones.

t=nmero

de

tratamientos;

r=nmero

de

3.1.2.- Ejemplos de Diseos Completamente al azar. 3.1.2.1. Ejemplo de un Diseo Completamente al Azar con desigual nmero de repeticiones por tratamiento. Se analiz un experimento en el que se probaron cuatro raciones (A,B,C y D) con siete cerdos (unidad experimental) por racin. Las hiptesis a probar fueron: Ho: No existe diferencia entre tratamientos; Ha: Existe diferencia entre los tratamientos ms all de lo que puede atribuirse al azar. La distribucin de los tratamientos y animales a las jaulas (unidades experimentales) se hizo aleatoriamente.

9 Los resultados se presentan en el Cuadro 2. Se present una enfermedad durante el experimento murindose ocho cerdos.

CUADRO 2 Ganancia de peso de cerdos en una prueba para comparar cuatro tratamientos. R A C I O N E S B C 35 33 34 34 34 35 36 33 33

Repeticiones I II III IV V VI VII Total Media

A 45 46 49 44

D 41 41 44 43 42 44 41 296 42.3 787

184 46.0

102 34.0

205 34.0

A continuacin se presentan los clculos para obtener las sumas de cuadrados del ANOVA. FC = X ..2 N (45 + 46 + 49 + 44 + 35 + ... 41)2

FC= 30,968.45 20 SCtrat 1842 1022 2052 2962 = + + + FC 4 3 6 7 = 31,452.74 - 30,968.45 = 484.29

(787)2 = 20

=

SCtotal= 452 + 462 + 492 + 442 + 352 + ... + 412 -FC = 31,487.00 - 30,968.45 = 518.55 SCerror = SCtotal - SCtrat = 31,487.00 - 31,452.74 = 34.34

10 CUADRO 3 Anlisis de varianza para un diseo completamente al azar con cuatro tratamientos y desigual nmero de repeticiones. FV Tratamiento Error Total GL 3 16 19 SC 484.29 34.26 518.55 CM 161.43 2.14 Fc 75.4 Ft 3.24

** Efecto de tratamiento altamente significativo al 1% (P