Cromatografia de líquidos -...
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Cromatografía de Líquidos
Elba Rojas Escudero
ERE
¿¿¿ Ab o Ad ???
Temario• Fundamentos
– Definiciones básicas
– Aspectos teóricos
• Instrumentación– Elementos básicos
– Columnas
– Inyectores
– Detectores y sistemas acoplados
• Análisis – cualitativo y cuantitativo
Cromatografía de líquidos
• Método físico de separación
• La muestra se distribuye entre dos fases
– Fase estacionaria: sólido o líquido
– Fase móvil: líquido o mezcla de líquidos
Elución• La muestra se aplica al principio de la
columna como una banda fina
• El eluyente tiene menor afinidad por la fase estacionaria que los solutos
• Los solutos avanzan por el sistema a velocidades diferentes, menores a la de la fase móvil
• Los solutos se separan en bandas que eluyen al final de la columna
Gas Líquido
Columna Plano
CLS CLL CFE CII CE
CPG CFG
CCF CP
Cromatografía
Tipos de CL• PM < 2000
• Cromatografía de intercambio iónico• Adsorción: líquido-sólido• Partición: líquido-líquido
– Cromatografia en fase normal– Cromatografia en fase inversa
• PM > 2000
• Cromatografia de exclusión por tamaño
Requisitos de la muestra
• Soluble en la fase móvil
• “Limpia”
• No debe reaccionar con ningún componente del sistema cromatográfico
HPLC ideal para muestras con:
• Presión de vapor baja
• Compuestos iónicos
• Compuestos de peso molecular elevado
• Compuestos Termolábiles
Instrumentación
Fase móvil Bomba de alta presión
Inyector
Columna
Detector
Muestra
Control de temperatura
Gradientede elución
Registrador
Fase móvil
• Disolventes grado cromatográfico
• Agua de 18 mΩ• Baja viscosidad
• No vólatil
• Miscibilidad
• Filtrada
• Sin oxígeno disuelto (degasificada)
Fase móvil
• Flujo = F = gasto en volumen del eluyente por unidad de tiempo . Se determina a la salida de la columna a temperatura ambiente (mL/min)
H = f (v)
Cromatografía
FMFE
Inyector Detector
Proceso Cromatográfico
• La fase móvil fluye, arrastrando consigo los solutos
• Los solutos se reparten entre ambas fases
MuestraFase estacionaria Fase móvil
Cromatografía de líquidos
• Se realiza en columna
• Separación por adsorción y partición
• Diversidad de técnicas en función de la muestra
• Análisis cualitativo y cuantitativo
• Separaciones analíticas y preparativas
• Análisis de mezclas “relativamente” complejas
Fase estacionaria (columna)
• Tubo de acero inoxidable
• Dimensiones
– Longitud: 30, 50, 75, 100, 150, 300 mm
– Diámetro: 2.1, 3.9, 5, 7.8 mm
– Tamaño de partícula: 3, 5, 10 µm
– Forma de la partícula: irregular o esférica
Dimensiones de la columna
L
di
dp
Fase estacionaria (columna)
• Empaque
– Sílica gel, C8, C18, Ciano, Amino, Resinas, Polímeros
• Carga de Carbón 5-20 % w/w
• Intervalo de pH = f (FE)
• Límite de presión de trabajo
• Compatible con la fase móvil
Fase estacionaria
Soportes de la FE
Permeación o exclusión
Cuidados de la columna
• Instalación
• Introducción de muestras “limpias”
• Contaminación por fase móvil o muestra
• Almacenarla y guardarla de forma adecuada
• Lavarla después de utilizarla condisoluciones reguladoras de pH
Precauciones
• No exceder la presión de trabajo
• Cambios bruscos de presión
• Intervalo de pH adecuado
• No utilizar H+ y OH- concentrados
• Filtrar la muestra y la fase móvil
• w de la muestra=f (dimensiones de la columna)
Cromatografía
• Fase Normal
– FE polar
– FM No-polar
• Fase Inversa
– FE No-polar
– FM polar
Cromatografía de fase inversa
• FE
– Sílica químicamente modificada con grupos no-polares: hidrocarburos saturados: C18 octadecil, C8 octil, C4 tetrametil, C2 dimetl
• FM
– Mezclas: agua/disolventes orgánicos H2O +(CH3OH, THF, CH3CN)
Cromatografía de fase inversa
• Efecto solvofóbico fuerte:– Parte apolar de la molécula del soluto es mayor
– % C en la FE es mayor
– Polaridad de la FM es alta (mayor % de H2O)
Fases estacionarias
• Fases impregnadas– Cubren uniformemente el soporte
– Insolubles en la FM
– Compatibles con el detector
– El flujo de la FM no debe ser elevado
NO son Estables
Fases estacionarias
• Fases químicamente unidas (“Bonded phases”)– Unidas al soporte por enlaces covalentes
– Mayor eficiencia que las Fases impregnadas
– Costo elevado
– Son estables
Cromatografía de fase inversa
• Ventajas– Reproducibilidad en las separaciones
– Estabilidad de la FE (pH ≤ 7)
– Mezclas: acuosos/orgánicos H2O +(CH3OH, CH3CH2OH, CH3CN)
Fuerza del eluyente
Viscosidad del eluyente
Polaridad
Polaridad
Detectores
• Indice de refracción
• Ultravioleta-Visible
• Fluorescencia
• Electroquímico
• Radioactividad
• Infrarrojo
• Espectrómetro de masas
Instrumentación
Fase móvil Bomba de alta presión
Inyector
Columna
Detector
Muestra
Control de temperatura
Gradientede elución
Registrador
Elución
Problema general de la elución
Gradiente de elución
Gradiente de elución
Elución con alta presión
Elución
Equipo con gradiente de elución
Proceso Cromatográfico
• El lecho cromatográfico puede ser abierto (placa) o cerrado (columna)
• La fase móvil fluye a lo largo del lecho cromatográfico en contacto con la fase estacionaria
Proceso Cromatográfico
• Las móleculas de soluto en fase estacionaria se estancan
• Las móleculas en fase móvil avanzan con ella
Mm
M
M
m m
mm
Proceso Cromatográfico
• La velocidad del soluto varía inversamente con la afinidad por la fase estacionaria
Separación de los solutos
• Los componentes con constantes de reparto diferentes, se separarán
Mm
M
M
MM
M
M
m
m
m
Separación de los solutos
H = f (v)
Ensanchamiento de banda
Ensanchamiento de la banda
Transferencia de masa en la FE
Ensanchamiento de la banda
Transferencia de masa en la FM“movimiento”
Ensanchamiento de la banda
Transferencia de masa en la FM“estancada”
H= f (ensanchamiento de la banda)
HL = 2γ DM / v HS = 2k´
1+k´
2vta
HF = 2λdp HD = Ωvdp2 / DM
HM = HF + HD
HSM = (1- θ + k´)2 dp2v
30(1-θ)(1+k´)2γDM
H = f (ensanchamiento de la banda)
H = HL + HS + HM + HSM
H = HS + HM + HSM
H = L / N
Ventajas
• Análisis de compuestos iónicos, de alto peso molecular
• Diversidad de columnas y detectores
• Formación de derivados pre-columna y post-columna
• Separaciones con control de pH
• Separaciones preparativas
Limitantes
• Muestras “relativamente” limpias
• Solubilidad de la muestra en la fase móvil
• Viscosidad de la fase móvil
• Dimensiones de la columna
• Presión de trabajo
• Intervalo de pH
• Utilizar un filtro (pre-columna)
Cromatografía de Líquidos
Formación de derivados
ERE
Derivados
• Fuera de línea
• En línea
• Pre-columna
• Post-columna
Equipo para la formación de derivados
FMFE
Inyector Reactor Detector
FMFE
Inyector Reactor Detector
Derivados
Derivados
Cromatografía de Líquidos
Aplicaciones
ERE
CCF - CLAE
FE = f (diámetro interno)
Diferente λ
Cambio de λ
Aplicación
Aminas
Aplicación
Fluorescencia
Polar - No polar
¿¿¿ Qué sucedió ???
Sensibilidad
Sensibilidad
Peso molecular
Propiedades = f (PM)
Oligosacáridos
Oligoglucosa
Ejemplos
Campo Mezclas típicasFármacos Antibióticos, sedantes,
esteroides, analgésicosBioquímica Aminácidos, proteínas,
carbohidratos, lípidosAlimentos Edulcorantes, antioxidantes,
aflatoxinas, aditivosContaminantes Pesticidas, herbicidas, PCB,
fenolesQuímicaforense
Drogas, venenos, alcohol ensangre, narcóticos