• Entre las desventajas se tienen que requiere de protocolos de limpieza y purificación de muestra complicados, los que dependen del tipo y origen de alimento que se analiza.

Se han reportado que los pesticidas modernos requieren para ser detectados de sistemas acoplados a detectores de Masas en Tandem como los de LC-MS-MS o GC-MS-MS pues no se pueden logran separaciones visibles en los sistemas GC-MS

• En el pasado solo las pequeñas moleculas ionizadas podian ser analizadas por MS,

• Ahora con el desarrollo de técnicas de ionización tales como Electro Spray (ESI) y Matriz Assisted lasser Desorption Ionizacion (MALDI), se pueden ionizar péptidos y proteínas, por que ahora se aplican por ejemplo al secuenciamiento rápido de aminoácidos en proteínas.

Electro Spray (ESI)

Conclusiones espectroscopia • Técnica de análisis con adelantos

constantes. • Tecnicas adicionales que no se han

discutido en esta clase son las de espectroscopía en el infrarrojo que en el futuro tendrán aplicaciones bastante frecuentes como química seca en el analisis de adulteraciones en alimentos por ser técnicas rápidas.

Conclusiones espectroscopia • La efectividad de las técnicas

espectroscópicas requiere asimismo de un buen diseño del análisis. Tal como una preparación de la muestra adecuada y número de muestras que permitan el análisis estádístico.

• Las técnicas cromatográficas acopladas a detectores espectroscópicos son muy poderosas en la mejora de la sencibilidad y eficiencia.

APLICACIÓN PRÁCTICA HPLC

Mecanismo Liquido- Liquido

Cromatografia de partición (Líquido-Líquido)

• El soluto se distribuye entre dos fases líquidas una de las cuales puede estar fija en un soporte sólido inerte. Los solutos se distribuyen en función de sus coeficientes de partición.

• La fase líquida estacionaria es usualmente la mas polar en comparación con el solvente utilizado en la elución (Cromatografía de fase normal). Usada para separar carbohidratos, aminoácidos y pigmentos de plantas solubles en agua.

• Cuando se usa el solvente menos polar en la fase estacionaria y el mas polar en la fase móvil, se habla de un sistema de Cromatografía de fase reversa. Usada en la separación se compuestos lipofílicos.

Sistema para HPLC

Característica de las columnas para HPLC.

• Tamaños:• (Longitudes de 4 a 30 cm)• Diametros de 0.2 a 2.5 cm.• Tamaño de poro y particula. • Naturaleza quimica

Pregunta

•Cuales son los detectores para HPLC?

Detector de Absorbancia con arreglo de diodos (Para HPLC)

Cromatografía líquida (CL). HPLC

Reservorios para los solventes

Válvula distribuidora Válvula Check de entrada

Válvula Check de salida

Columna analíticaColumna de

Guardia

Sistema de cómputo de

datos

DetectorInyector

Fracción a ser desechada

BombBomba

Principales partes de un sistema de Cromatografía Líquida de tipo HPLC según Reuhs y Rounds (2010)

HPLC en colorantes

Soportes sólidos para la cromatografia de partición.

• Son materiales inertes con una gran area superficial a fin de maximizar la cantidad de líquido retenido. Se usan:

• Silica, Almidón, celulosa en polvo, y cuentas de vidrio. (activación). Silica gel se refiere a precipitados hidratados de sílica y es usada en adsorción y partición.

• Soportes enlazados, donde el líquido estacionario es fijado mediante un enlace covalente al soporte. (Silanoles, grupos C8 y C18.

OTROS TIPOS DE CROMATOGRAFIA.

Cromatografía gaseosa (GC).

• En un sistema de este tipo la fase móvil es un gas, generalmente una sustancia inerte como el nitrógeno, helio u otros. Esquema de un cromatógrafo de gases (Barquero-Quirós, 2006).

Detector FID.

OTROS TIPOS DE CROMATOGRAFIA.

Cromatografia de Intercambio Iónico

• Intercambio Iónico

Cromatografia de intercambio iónico.

• Utilizada como técnica de separación y purificación. Se consiguen tres tipos:– Separación de iones de los no iones– Cationes de los aniones.– Mezclas de especies cargadas con similares cargas.

• La interacción entre la fase estacionaria y el soluto es de naturaleza electrostática.

• Los intercambiadores de cationes tienen unidos covalentemente un grupo funcional cargado negativamente y los intercambiadores de aniones lo contrario.

• Se usan resinas de intercambio basadas en poliestireno o en polisacáridos tales como celulosa.

OTROS TIPOS DE CROMATOGRAFIA.

Filtración en Gel

Cromatografía de exclusión molecular.

• Es llamada también como cromatografia de permeación en gel o de filtración en gel.

• Tiene mucha utilidad en la purificación de material biológico y macromoléculas como proteinas y carbohidratos.

• Idealmente las moléculas son separadas unicamente en base a su tamaño, sin ocurrir interacciones entre los solutos y la fase estacionaria. Una columna de exclusión molecular es calibrada con una serie de solutos de peso molecular conocido para obtener una curva de calibración.

• Una columna de exclusión molecular debe ser calibrada con una serie solutos de peso molecular conocido para obtener una curva similar a la mostrada en la figura donde se grafica el valor de Kav para el desconocido y luego por interpolación se puede llegar a estimar el peso molecular(1).

• Kav= (Ve-Vo) / (Vt -Vo)• Donde:• Kav= Coeficiente de partición disponible. • Ve= Volúmen de elución del soluto.• Vo= Volúmen nulo de la columna.• Vt= Volúmen de la columna de permeación total.

Relación entre Kav y log (peso molecular) para proteinas globulares cromatografiadas en na columna de sephadex G-

150 superfina.

OTROS TIPOS DE CROMATOGRAFIA.

Cromatografia de afinidad.

• La separación es realizada en interacciones reversibles entre la molécula del soluto y un ligante inmobilizado en la fase estacionaria cromatografica.

• Los ligante podrían ser: anticuerpos, inhibidores enzimáticos, lectinas y otras moléculas que selectiva y reversiblemente enlazan moléculas complementarias del analito de la muestra.

• Se usan como soportes inertes en este tipo de cromatografia polímeros tales como: agarosa, celulosa, dextrano y poliacrilamina.

Afinidad general de ligantes y sus respectivas afinidades.

• Ligante.• Cibacron, Azúl F3G-A,

derivados del AMP, NADH y NADPH

• lectinas de germen de trigo.

• Inhibidor de tripsina• Proteina A • DNA, RNA, nucleótidos,

nucleósidos.

• Especificidad.• Ciertas

deshidrogenasas.

• Polisacáridos, glicoproteinas.

• Proteasas. • Inmunoglobulinas.• Nucleasas, polimerasas

y ácidos nucleicos.

Res

umen

apl

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ione

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rafi

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