Cristina Aguado Esteban

132
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA MOLECULAR INVESTIGACIÓN EN TERAPIAS ESPECÍFICAS DE MUTACIÓN EN ENFERMEDADES METABÓLICAS HEREDITARIAS. RESPUESTA A COFACTORES Y TERAPIA ANTISENTIDO. Cristina Aguado Esteban TESIS DOCTORAL Madrid, 2008

Transcript of Cristina Aguado Esteban

Page 1: Cristina Aguado Esteban

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID

FACULTAD DE CIENCIAS

DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA MOLECULAR

 

 

 

 

 

INVESTIGACIÓN EN TERAPIAS ESPECÍFICAS DE MUTACIÓN EN ENFERMEDADES METABÓLICAS 

HEREDITARIAS. RESPUESTA A COFACTORES Y TERAPIA 

ANTISENTIDO. 

Cristina Aguado Esteban

TESIS DOCTORAL

Madrid, 2008

Page 2: Cristina Aguado Esteban
Page 3: Cristina Aguado Esteban

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID

FACULTAD DE CIENCIAS

DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA MOLECULAR

 

 

 

 

 

INVESTIGACIÓN EN TERAPIAS ESPECÍFICAS DE MUTACIÓN EN ENFERMEDADES METABÓLICAS 

HEREDITARIAS. RESPUESTA A COFACTORES Y TERAPIA 

ANTISENTIDO. 

Directora de Tesis:

Dra. Lourdes Ruiz Desviat

 

 

 

 

 

Memoria presentada por la licenciada Cristina Aguado Esteban para optar al grado de Doctor en Ciencias

Page 4: Cristina Aguado Esteban

El  presente  trabajo  ha  sido  realizado  en  el laboratorio  de  la  Prof.  Magdalena  Ugarte, Catedrática  del  Departamento  de  Biología Molecular, en el Centro de Biología Molecular “Severo Ochoa” de la Universidad Autónoma de Madrid, y durante una estancia breve en el laboratorio de  la Prof.   Ruma Banerjee,  en  el Centro  Redox  de  Biología, Departamento  de Bioquímica,  en  la  Universidad  de Nebraska, EEUU, con  la ayuda de una beca predoctoral concedida  por  el ministerio  de  Educación  y Ciencia. 

Page 5: Cristina Aguado Esteban

AGRADECIMIENTOS  

En primer lugar quiero agradecer a Dios la vida y la gente tan genial que ha puesto en mi camino durante estos cinco años. Gracias por los buenos y malos momentos, porque nunca me he sentido sola, por ese amor tan grande que me muestra siempre. 

Gracias a la Profesora Magdalena Ugarte por darme la gran oportunidad de realizar la  tesis  doctoral  en  su  laboratorio.  Por  su  gran  ejemplo  profesional  y  humano.  Por presentarme a varios de sus niños.  

Gracias a cada una de las personas del laboratorio 201‐210/204 porque me he sentido muy querida y muy cuidada y porque de cada uno he aprendido mucho, por poder hacer la tesis junto a ellos: 

A Lourdes por  ser mi directora de  tesis, por haber escuchado  siempre mis  teorías, porque  eso  ha  hecho  que me  ilusione  este mundo.  Por  transmitirme mucha  confianza  y tranquilidad, por corregirme y  regañarme en  los momentos adecuados, por  tener siempre una  solución, por  acertar  siempre  los  resultados, por  ser  como  eres;  inteligente, práctica, clara y fuerte.   

A Belén por ser  la primera persona del  laboratorio con  la que hablé, por  la  fuerza, seguridad e inteligencia que transmite.   A las dos por su ejemplo como investigadoras, por esa capacidad de integrar  tantos temas científicos a la vez, por trabajar de forma tan complementaria.  

A Rosa por ser tan buena gente, una de las mejores que conozco, por los mil detalles que ha tenido conmigo, por defenderme siempre, por escucharme aquel día a las tres de la mañana, por ser tan buena amiga.  

A Ascen porque fue la primera persona con la que compartí poyata, por todo lo que me ha enseñado, por su paciencia, porque tiene una solución para cualquier problema, por sus buenos consejos.   

A Fa por  los viajes en el  tren, por ser  tan elegante  trabajando, porque eres  la única persona que me ha visto medio llorar, por las zapatillas de estar por casa, por estar atenta a lo que me pasaba, por escucharme siempre. A las tres Ascen, Fa y Rosa por la seguridad y unión que transmitís en el laboratorio. 

A Ana Rincón por los cinco años compartiendo tesis, por ser mi ONG personal, por soportar mi enano gruñón, por “es un señor....”, por el intento de libro, por algún que otro secreto. 

A Ana Vega por su sinceridad y franqueza siempre, por querer siempre entender lo que haces, por el viaje a Barcelona, por tu humor y por intentar enseñarme a bailar. 

A  Patricia  porque me  parece  que  te  conozco  desde  hace mucho más  tiempo,  por aquel “me caes muy bien” después de la cena de Navidad, por compartir tus sentimientos, por la confianza que me transmites. 

A Ana Jorge por ser tan trabajadora y luchadora. A  Celia  y  a  Begoña  por  contestar  siempre  mis  preguntas,  por  transmitirme  lo 

maravilloso que es el diagnóstico de las enfermedades metabólicas. A  Carmen  por  ser  ejemplo  de  fuerza,  por  enseñarme  tanto,  por  todas  las 

conversaciones en el cuarto de cultivo, por preocuparte tanto por la gente.. A Pilar por ser una de las mejoras profesoras que tuve en la carrera y por todos sus 

buenos consejos. A Marga por hacerme siempre un hueco en el aparato, por explicarme tantas cosas.  

Page 6: Cristina Aguado Esteban

A  Palo  por  dejarme  cotillear  en  los  picos  de  los  aminoácidos  y  por  tantas conversaciones. A Fer por ser tan dispuesto y amable. 

A Rocío alias “Irene”, por  la  tranquilidad que  transmite, por aguantar mis bromas, por preguntarme y fiarte de mi.  

A Irene y el niño porque fueron mis avanzados, por todas las historias que he vivido con ellos, por dejarse enseñar, por la paciencia con mis largas explicaciones, por los bollitos de su pueblo Rubén, por las historias con su hermano, por llevar tan bien lo del aire que le dio. Irene, por ser un ejemplo en empeño y paciencia hasta conseguir un experimento. 

A  los  dos  informáticos  Julio  y  Gonzalo,  por  su  paciencia  con  mis  estropicios informáticos  y  por  su  gran  humor,  por  las  discusiones  de  religión,  por  los  partiditos  al baloncesto y por las cañas en los dardos. 

A Sonia, a MA y a Ángel  mis becarios predecesores por luchar cada uno a su manera por conseguir vuestros sueños Sonia por las bromas en los primeros tiempos, por acogerme en  tu casa  tras una comida de Navidad, por  tus mil consejos, por  los viajes en el  tren, por llamarme cuando estaba en Nebraska. A María Ángeles por los cines por su dulzura y por su  sinceridad.  A  Pey  por  enseñarme  con  tanta  precisión,  por  ser  un  enamorado  de  su trabajo. 

A Isaac por los partidos de baloncesto, por las partidas de dardos, porque aunque en muchas cosas pensamos diferente siempre me has escuchado, por tus bromas. 

A Pedro por todas las conversaciones en el laboratorio y fuera de el, por los teatros compartidos,  las cañas y porque siempre he aprendido cuando he hablado contigo, por  tu humor. 

A Gema, María, Charo, Yolanda, Nuria, María Jesús por tantas conversaciones en el lado de diagnóstico, por  los experimentos que me habéis enseñado, por vuestra paciencia cuando me dejaba cosas en vuestro lado. 

A la Richi por su sonrisa perenne, por contestar siempre mis preguntas y por ser tan cercana. 

A  las  biosecre  (Ana,  Isa,  Eva  y  Julia)  por  tener  siempre  una  sonrisa  aunque  nos coláramos en  la  impresora con  las secuencias y a  la  Juli en especial, por su humor, por su capacidad teatral, por comer con nosotras a las tres, por presentarme a un amigo común, por preocuparte por mi. A Maja,  Abel  y  Lorena  porque  aunque  habéis  estado  poco  conmigo  habéis  hecho muy agradable el día a día en el laboratorio. Gracias a  la gente de  los diversos  laboratorios y de  los distintos  servicios del CBM    cuya ayuda ha sido importante para esta tesis.    OS VOY A ECHAR MUCHO DE MENOS  No  se  puede  hacer  una  tesis  sin  una  familia  y  unos  amigos  que  te  apoyen,  quieran  y acompañen durante los cinco años que dura este camino. 

Por supuesto y en primer lugar gracias a mis padres, a mi padre por su ejemplo de trabajo, honradez y humor, a mi madre por su ejemplo de atención, detallismo y dulzura.  A los dos gracias  por la confianza que siempre habéis tenido en mi, por apoyarme siempre durante  la  carrera  y durante  estos  cinco  años de doctorado,  pero  sobre  todo  gracias  por quererme  tanto y siempre, porque no creo que me merezca unos padres  tan buenos. A mi hermana,  por  su  ejemplo  de  entrega  total,  por  su  fuerza  y  decisión,  por  que  cada  día descubro  la gran  suerte de  tenerla, de poder hablar  con  ella, de que  esté  en  ese pequeño 

Page 7: Cristina Aguado Esteban

convento  rezando por  todos. A mi  hermano por  ser  tan  trabajador  y por  tener  tan  buen corazón. 

A Raquel por los 24 años de amistad, por los tres años de compartir piso, por abrir tu corazón siempre, por tu fuerza de voluntad, porque hemos compartido mucho  

A mis compis de piso del último año y medio, por las conversaciones del salón, por la libertad de esta casa, a María por los paseos de los últimos tiempos, por ese disco que me grabaste y que nunca dejaré de escuchar, a Ana Merino por los intentos de magdalenas y el triunfo del bizcocho, por tantas conversaciones espirituales, por ser tan alegre y vivaz, a Ana Barquero por su humor, por preocuparte por mi a altas horas de la madrugada, a Bea por ser tan generosa, por dar sin preguntar, ojala todo el mundo pudiera tener unas compañeras de piso tan geniales como ellas. 

A  los  chavales  de  Fundamipf    sobre  todo Quique,  Irene  (Lala)  y  Laurita  porque conocerles es una de las mejores cosas que me ha pasado en la vida y de las que más me ha cambiado, porque si he hecho la tesis en este laboratorio es gracias a encontrarme con ellos. 

Al grupo de San  Jorge, a  los chavales, por  la  felicidad que  transmitís, por  todas  las sonrisas,  besos  y  abrazos  que  me  habéis  regalo  durante  estos  dos  años,  por  los campamentos, por el club de  los martes y  las celebraciones de  los domingos. Gracias a  los padres  y  a  todos  los monitores  con  los  que  he  aprendido  a  cuidar  y  disfrutar  de  estos chavales tan especiales. 

A mis amigos de Segovia por  los más de 10 años que  llevamos  juntos, porque cada vez que vuelvo a Segovia es como si nunca me hubiera ido. 

A la gente de lokos por hacerme disfrutar en cada viaje y en cada partido. A mi  comunidad de Mirto  con  la  que  he  crecido  espiritual  y  humanamente  estos 

años, a Pablo, Marisa, Gabriella, María José, María “Kika”, Jorge, Vanesa, Abraham, Noemí, María Casado, Carmen, Quique, Javi, David,Pepa.  En fin, muchas gracias a todos. 

Page 8: Cristina Aguado Esteban

                         

A  mis  padres: Hilario y Pilar 

           

Page 9: Cristina Aguado Esteban

SUMMARY In  this  work,  we  have  investigated  specific  mutation  therapies  in  metabolic genetic diseases, specifically we have analyzed the mechanisms underlying cofactor and coenzyme  responsiveness  in  phenylketonuria  (PKU),  propionic  acidemia  (PA), methylcrotonylglycinuria  (MCG)  and  methylmalonic  aciemia  (MMA)  and  splicing therapies in PA.   We have identified the mutations present in Spanish PKU patients who respond to  BH4  and  we  have  selected  some  mutations  associated  to  responsiveness  for expression  analysis. We  have  analyzed  in  total  14 missense mutations  using  different prokaryote, eukaryote and cell‐free systems. Five mutations were expressed  in vitro  in E.coli  as  MBP‐PAH  fusion  proteins,  we  have  determined  PAH  steady‐state  kinetic properties  in  order  to  detect  possible  defects  in  BH4  affinity.  The  majority  of  the mutations  affected  kinetic  and  regulatory  properties.  Only  one  mutation  showed slightly  reduced  affinity  for  the  cofactor under  steady‐state  conditions. We have  also measured  the  degradation  rates  of  11 mutant  PAH  proteins  expressed  in  a  cell‐free system, using pulse‐chase analysis and presence or absence of BH4 and determined the amount of three of the mutant proteins after transfection in Hep3B as FLAG‐PAH fusion proteins in presence of different levels of BH4. The results show that high concentrations of BH4   protect some mutant proteins against degradation and result  in an  increase  in the steady‐state amounts of protein  in hepatoma cells. In the hepatoma cellular model, BH4 levels don’t affect the expression of the PAH gene. 

In MMA cblB  type we have  selected  two mutations previously associated with responsiveness  to  OHcobalamin. We  have  expressed  the  ATR  protein  in  E.  coli  to determine steady‐state kinetic properties in order to detect possible defects in cobalamin affinity.  The  results  suggest  a  stability  defect  for  one  of  the  mutant  proteins,  with reduced enzymatic activity but with K(m)  for ATP and Kd  for cob(I)alamin similar  to wild‐type values.  

The  last  coenzyme  analyzed  in  this  work  was  biotin,  for  which  there  is  no consensus  in the  literature  if  it affects the expression of biotin‐dependent carboxylases. In Hep3B cells we have analyzed  the effect of different  levels of biotin  in  the activity, amount  of  functional  active protein  and mRNA  levels  of  two  carboxylases, PCC  and MCC, that when defective cause PA and MCG, respectively. In our model, biotin does not affect the expression of the enzymes but favours the conversion of apocarboxylase to holocarboxylase.   Finally, we describe the use of antisense morpholino oligonucleotides (AMOs) to restore normal splicing caused by  intronic molecular defects  identified  in PA. The  two point  mutations  described  in  deep  intronic  regions  increase  the  splicing  score  of pseudoexonic regions or generate consensus binding motifs for splicing factors, such as SRp40, which favour the intronic inclusion in PCCA (r.1284ins84) and PCCB (r.654ins72) mRNAs. AMOs were targeted to the 5´ and 3´ cryptic splice sites of the pseudoexons to block  the access of  the  splicing machinery. Using  this antisense  therapeutics, we have obtained correctly spliced mRNA that was efficiently translated and PCC activities were rescued  in patients´fibroblasts. Our  results demonstrate  that  the aberrant  inclusions of the  intronic sequences are disease‐causing mutations  in these patients and that the use of AMOs is an effective therapeutic strategy in this genetic disorder. 

Page 10: Cristina Aguado Esteban

ABREVIATURAS  ACC:  Acetil‐CoA carboxilasa AdoCbl:  Adenosilcobalamina ADP:  Adenosina difosfato AON:  Oligonucleótiodo antisentido  AP:  Acidemia propiónica ATP:  Adenosina trifosfato ATR:  ATP: cobalamina adenosil transferasa BH4:   (6R)‐L‐eritro‐5,6,7,8‐tetrahidrobiopterina  BPS:  Secuencia de ramificación (branch point sequence) BSA:  Albúmina de suero bovino cAMP:  Adenosina monofosfato cíclica Cbl:  Cobalamina CBR:  Región de unión del cofactor cDNA:  DNA complementario DAHP:  2,4‐Diamino‐6‐hydroxypyrimidine DMSO:  Dimetil sulfóxido. DNA:  Ácido desoxirribonucleico dNTP:  Desoxinucleótido trifosfato DTT:   1,4‐ditio‐L‐treitol EDTA:  Ácido etilen‐diamino‐tetraacético EGTA:  Ácido etilen‐glicol‐tetraacético EMH:  Enfermedades metabólicas hereditarias ESE:  Secuencia exónica potenciadora de splicing (exonic splicing enhancer) FAS:   Sulfato amónico ferroso  FBS:  Suero fetal bovino. FPLC:   Sistema de separación rápida de proteínas por cromatografía de 

líquidos GAPDH:  Gliceraldehído‐fosfato deshidrogenasa gDNA:  DNA genómico h:   Índice o coeficiente de Hill HCS:  Holocarboxilasa sintetasa Hepes:   Ácido N‐2‐hidroxietilpiperazina‐N´‐2‐etanosulfónico HPLC:   Cromatografía líquida de alto rendimiento HFA:   Hiperfenilalaninemia suave o benigna IPTG:  Isopropil 1‐tio‐β‐D‐galactopiranósido IVS:  Intrón (Intervening Sequence) kb:  Kilobases Kd:   Constante de disociación kDa:  Kilodaltons Km:   Constante de Michaelis‐Menten LB:  Medio Luria Broth 

Page 11: Cristina Aguado Esteban

L‐Phe:   L‐Fenilalanina L‐Tyr:   L‐Tirosina MBP:   Proteína de unión a maltosa MBP‐PAH:   Proteína de fusión, proteína de unión a maltosa‐fenilalanina 

hidroxilasa MBP‐PAHtet:  Proteína de fusión, proteína de unión a maltosa‐fenilalanina     hidroxilasa tetramérica MCC:  3‐metilcrotonil‐CoA carboxilasa MCG:  Metilcrotonilglicinuria MCM:  Metilmalonil‐CoA mutasa MeCbl:  Metilcobalamina MEM:  Medio mínimo esencial de Eagle Met:  Metionina MMA:  Acidemia metilmalónica mRNA:  RNA mensajero Na‐Hepes:   Hepes 20 mM NaCl 200 mM pH 7.0 NBCS:  Suero de ternera recién nacida NMD:  Sistema de (nonsense mediated decay) nt:   Nucleótido  OH‐Cbl :  Hidroxicobalamina PAH:   Fenilalanina hidroxilasa PAHtet:   Fenilalanina hidroxilasa tetramérica pb:   Par de bases PBS.  Tampón fosfato salino PC:  Piruvato carboxilasa PCC:  Propionil‐CoA carboxilasa. PCR:  Reacción en cadena de la polimerasa PDB:  Banco de datos de proteínas (Protein Data Bank). PKU:   Fenilcetonuria PMSF:  Fenilmetilsulfonil fluoruro PVDF:  Fluoruro de polivinilo Pm:  Peso molecular qRT‐PCR:  Retrotranscripción y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa RNA:  Ácido ribonucleico RT‐PCR:  Retrotranscripción y reacción en cadena de la polimerasa S0,5:   Concentración de velocidad semi‐máxima SDS:  Dodecilsulfato sódico SDS‐PAGE:   Electroforesis en geles de poliacrilamida en presencia de SDS t1/2 :   Vida media TAE:  Tris acetato‐EDTA TBE:  Tris borato‐EDTA TCA:  Ácido tricloroacético Tm:   Temperatura de semidesnaturalización 

Page 12: Cristina Aguado Esteban

TNT:  Sistema transcripción‐traducción acoplada Tris:  Tris (hidroximetil) aminometano Vmax:   Velocidad máxima o limitante wt:   Salvaje o normal  

 

Algunos  términos  ingleses, ampliamente utilizados  en Biología Molecular y sin clara traducción en castellano, se presentan en cursiva. 

Page 13: Cristina Aguado Esteban

                 

 

ÍNDICE 

Page 14: Cristina Aguado Esteban

 

1 INTRODUCCIÓN ............................................................................................... 1  

1.1. ENFERMEDADES METABÓLICAS HEREDITARIAS (EMH) .......................... 2  

1.2. RESPUESTA A COFACTORES EN EMH ............................................................. 5  

1.2.1. FENILCETONURIA Y RESPUESTA A TETRAHIDROBIOPTERINA (BH4) ................................................................................................................ 7 

1.2.1.1. Estructura y función de la fenilalanina hidroxilasa .................... 10 1.2.1.2. El cofactor tetrahidrobioterina ....................................................... 12 

 1.2.2. ACIDEMIA METILMALÓNICA AISLADA Y RESPUESTA A 

COBALAMINA ............................................................................................ 14 1.2.2.1. Estructura y función de la ATP:cob(I)alamina 

adenosiltransferasa (ATR)............................................................... 15  

1.2.3. ACIDEMIA PROPIÓNICA Y METILCROTONILGLICINURIA Y RESPUESTA A  BIOTINA........................................................................... 18 

1.2.3.1. Estructura y función de la propionil‐CoA carboxilasa y metilcrotonil‐CoA carboxilasa........................................................ 21 

1.2.3.2. El cofactor biotina............................................................................. 21  

1.3. SPLICING Y ENFERMEDADES GENÉTICAS ................................................... 24  

2 OBJETIVOS............................................................................................................ 26  

3 MATERIALES Y MÉTODOS.................................................................... 28  3.1. MATERIALES.......................................................................................................... 29 

3.1.1. Reactivos y aparatos..................................................................................... 29 3.1.2. Material biológico......................................................................................... 30 

3.1.2.1. Pacientes.............................................................................................. 30 3.1.2.2. Líneas celulares establecidas................................................................ 31 3.1.2.3. Cepas bacterianas ................................................................................ 31 3.1.2.4. Vectores plasmídicos............................................................................ 31 

 3.2. MÉTODOS................................................................................................................ 31 

3.2.1. Tratamiento de ácidos nucleicos ................................................................ 31 3.2.2. Electroforesis en geles con gradiente de desnaturalización (DGGE) ... 35 3.2.3. Expresión y purificación de proteínas en E. coli ...................................... 35 

3.2.3.1. Expresión y purificación de la proteína de fusión MBP‐PAH............ 35 

Page 15: Cristina Aguado Esteban

1

3.2.3.2. Expresión y purificación de la proteína hATR.................................... 36 3.2.4. Cromatografía en gel ................................................................................... 38 3.2.5. Electroforesis, transferencia  y detección de proteínas ........................... 38 

3.2.5.1. Electroforesis, transferencia e  inmunodetección de la proteína  PAH .................................................................................................... 38 

3.2.5.2. Electroforesis, transferencia y detección de la proteína α‐PCC mediante marcaje con avidina conjugada a fosfatasa alcalina ............................ 39 

3.2.6. Ensayos enzimáticos .................................................................................... 39 Actividad fenilalanina hidroxilasa ...................................................... 39 

3.2.6.1. Actividad ATP:cob(I)alamina adenosiltransferasa ............................. 40 3.2.6.2. Actividad propionil‐CoA carboxilasa y metilcrotonil‐CoA 

carboxilasa ........................................................................................... 41 3.2.7. Síntesis in vitro  y pulso caza de las proteínas PAH ............................... 42 3.2.8. Cultivo celular............................................................................................... 43 

3.2.8.1. Expresión transitoria en células eucariotas Hep3B ............................ 43 3.2.8.2. Transfección de oligonucleótidos antisentido tipo morfolinos en 

fibroblastos........................................................................................... 44 3.2.9. Medida de pterinas ...................................................................................... 44 3.2.10. Soporte informático...................................................................................... 45 

 

4 RESULTADOS ..................................................................................................... 46  4.1. BASES MOLECULARES DE LA RESPUESTA A BH4 EN FENILCETONURIA

.................................................................................................................................... 47 4.1.1. Identificación de mutaciones asociadas a respuesta a BH4 en 

pacientes fenilcetonúricos españoles ......................................................... 47 4.1.2. Expresión de proteínas PAH mutantes implicadas en la respuesta  

a BH4 .............................................................................................................. 50 4.1.2.1. Análisis cinéticos................................................................................. 51 4.1.2.2. Análisis del efecto del cofactor BH4 sobre la   estabilidad de las 

proteínas PAH  normal y mutantes .................................................... 53 4.1.3. Efecto de la BH4 sobre la transcripción y traducción del gen PAH...... 57 

 4.2. BASES MOLECULARES DE LA RESPUESTA A COBALAMINA (VIT B12) 

EN ACIDEMIA METILMALÓNICA AISLADA ................................................ 61 4.2.1. Expresión de proteínas mutantes implicadas en respuesta in vitro  

a B12; Análisis cinéticos ............................................................................... 61  

4.3. BASES MOLECULARES DE LA RESPUESTA A BIOTINA EN ACIDEMIA PROPIÓNICA Y METILCROTONILGLICINURIA........................................... 66 

 

Page 16: Cristina Aguado Esteban

2

4.4. TERAPIAS MODULADORAS DE  MUTACIONES DE SPLICING EN ACIDEMIA PROPIÓNICA .................................................................................... 71 4.4.1. Análisis del efecto de drogas sobre mutaciones de splicing   

que producen niveles detectables de transcritos  normales ................... 71 4.4.2. Análisis del efecto de oligonucleótidos antisentido sobre la  

inclusión aberrante de pseudoexones. ...................................................... 73  

5 DISCUSIÓN........................................................................................................... 77  5.1. RESPUESTA A COFACTORES EN EMH ........................................................... 78 

5.1.1. Respuesta a tetrahidrobioterina en fenilcetonuria .................................. 78 5.1.2. Respuesta a cobalamina en acidemia metilmalónica aislada................. 84 5.1.3. Respuesta a biotina en acidemia propiónica y en  

metilcrotonilglicinuria ................................................................................. 86  5.2. TERAPIAS MODULADORAS DE MUTACIONES DE SPLICING EN 

ACIDEMIA PROPIÓNICA .................................................................................... 88 5.2.1. Efecto de drogas sobre mutaciones de splicing que producen niveles 

detectables de transcritos normales. .......................................................... 88 5.2.2. Efecto de la terapia con oligonucleótidos sobre mutaciones de splicing 

que producen inclusión de pseudoexones................................................ 89  6 CONCLUSIONES .............................................................................................. 93  

7 BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................. 95  

8 PUBLICACIONES ........................................................................................... 109  

Page 17: Cristina Aguado Esteban

                  

1. INTRODUCCIÓN 

Page 18: Cristina Aguado Esteban

2

1.1 ENFERMEDADES METABÓLICAS HEREDITARIAS (EMH)  

Etimológicamente  el  origen  de  la  palabra metabolismo  procede  del  griego metabolé  (μεταβολισμος) que significa cambio,  transformación. El metabolismo es el  conjunto  regulado y  coordinado de  reacciones químicas que  tienen  lugar  en un organismo vivo. Las enfermedades metabólicas son aquellas patologías causadas por alteraciones adquiridas o congénitas en las proteínas implicadas en estas reacciones. Cuando  el  defecto  es  hereditario  hablamos  de  enfermedades  metabólicas hereditarias (EMH). 

 El  análisis  sistemático  de  los  errores  innatos  del metabolismo  lo 

inició Garrod (Fig. 1), con sus estudios sobre alcaptonuria, observó que los pacientes  con  esta  enfermedad  excretaban  grandes  cantidades  de  ácido homogentísico  y  determinó  que  esta  acumulación  era  debida  a  una alteración  en una  enzima del metabolismo de  la  tirosina  (Garrod  1908). Además determinó  que  la  herencia de  la  enfermedad  se podía  explicar según  las  leyes  de  Mendel.  Garrod  definió  el  concepto  de  que determinadas enfermedades  se producen debido al  fallo o ausencia de una enzima que cataliza un paso específico de una ruta metabólica  

 Las  EMH  representan  en  su  raíz  inicial,  alteraciones  en  el  material  genético 

(DNA),  cuando  se  altera  un  gen  (mutación),  el  patrón  de  su  producto  génico específico  puede  ser  dañado,  producir  la  pérdida  de  sus  funciones  y  como consecuencia  alterar  la  homeostasis  fisiológica  (patogénesis)  induciendo  las manifestaciones clínicas y el  fenotipo  (enfermedad). Las alteraciones homeostáticas más  comunes  que  se  presentan  en  las  enfermedades metabólicas  hereditarias  se deben a  fenómenos por acúmulo de  sustrato  (y derivados de  este) y/o  fenómenos por  defecto  del  producto  que  deja  de  metabolizarse.  Las  diferencias  en  las manifestaciones  fenotípicas  dependen  del  grado  de  afectación  del  gen,  del  tipo  y función  del  producto  génico  que  queda  alterado,  de  eventos  post‐traducción, factores celulares, genes situados en otros  loci y factores ambientales y estocásticos,  por  lo  que  las  EMH  se  comportan  frecuentemente  como  caracteres  complejos (Pàmpols Ros 2006).  

Las  EMH  se  heredan  en  forma monogénica:  el  60%  en  forma  autosómica recesiva, el 20% autosómica dominante y el 12%  ligada al X. Alrededor de un 8% están relacionadas con alteraciones en el genoma mitocondrial (Blau et al. 2001).  

 Las  frecuencias  individuales  de  las  EMH  son  muy  bajas,  por  lo  que  son 

consideradas enfermedades raras  (definidas según European Organisation  for Rare Disease (EURORDIS) y según  la Unión Europea (UE) como   aquellas que afectan a menos de 1 individuo cada 2000), sin embargo debido a que se han descrito mas de 

Figura 1:A. Garrod 

Page 19: Cristina Aguado Esteban

3

500 EMH  diferentes y se reportan nuevas casi continuamente en su conjunto afectan a un número elevado de individuos. 

 Las dos características definitorias de  las EMH, su gran diversidad y su baja 

frecuencia  individual, determinan que  tanto el diagnóstico, el  tratamiento  como el análisis  bioquímico‐molecular  sean  complejos.  La  capacidad  para  reconocer  y diagnosticar  EMH  se  ha  incrementado  enormemente  debido  al  desarrollo  de  la tecnología  analítica,  el  conocimiento  bioquímico  en  general  y  el  desarrollo  de  la biología celular y de la tecnología del DNA.  

 En general las EMH debutan en el periodo neonatal, siendo muy característico 

una sintomatología clínica aguda  (convulsiones,  insuficiencia hepática,  insuficiencia cardíaca,  hipotonía,  letargia…)  en  recién  nacidos  tras  un  periodo  de  normalidad.  Para algunas  enfermedades  en  las que  existe un  intervalo de  tiempo  cercano a un mes  entre  la  presencia  de  alteraciones  bioquímicas  y  el  comienzo  de  la sintomatología  clínica  es  posible  la  identificación  del  transtorno metabólico  en  el periodo  neonatal  y  en  fase  preclínica,  pudiéndose  instaurar  un  tratamiento  y evitando la sintomatología negativa (la fenilcetonuria es un caso clásico de este tipo de EMH).  

Al  igual  que  la  capacidad  para  reconocer  y  diagnosticar  las  EMH  ha aumentado en los últimos treinta años, el tratamiento de estas alteraciones también lo  ha  hecho,  pero  mas  lentamente,  actualmente  el  12  %  de  los  EMH  tienen tratamiento eficaz, un 54 % obtiene un beneficio en grado variable y en un 34 % no hay respuesta a ningún tratamiento (Scriver and Treacy 1999).  

Debido a que en las EMH el defecto primario reside en el DNA la posibilidad de  obtener  información  clínica  relevante  sobre  la  severidad  fenotípica  de  la enfermedad a partir del genotipo del paciente es el motor que impulsa los cada vez más numerosos análisis genéticos. En estas y otras enfermedades genéticas, una vez identificados  los genes  involucrados y  las mutaciones patogénicas,  la  investigación se  centra  en  el  estudio  de  los mecanismos moleculares  responsables  del  defecto, tanto a nivel de DNA y RNA (genómico y transcripcional) como a nivel de proteína, en  la  estabilidad  y/o  funcionalidad  de  las  mismas.  Estas  investigaciones proporcionan una base científica para establecer la relación genotipo‐fenotipo y para el desarrollo de terapias específicas de mutación en lo que se conoce como medicina genómica.  

En la mayoría de las EMH un porcentaje muy elevado de mutaciones originan un  cambio  de  aminoácido  (representan  cerca  del  50%  de  los  cambios  registrados según   la  Human Gene Mutation Database (HGMD ®)), en este caso, así como para mutaciones  que  generan  deleciones  en  fase,  codones  de  parada  de  traducción cercanos al original y cambios puntuales que afectan al splicing, es difícil predecir su 

Page 20: Cristina Aguado Esteban

4

efecto. Además para el caso de pacientes con mutaciones de cambio de aminoácido la heterogeneidad es muy elevada y por  lo  tanto  la relación genotipo‐fenotipo es más compleja, ya que es necesario valorar la contribución de cada variante alélica.  

Frecuentemente  se han  empleado para  el  análisis  funcional de  las  variantes alélicas de los genes distintos sistemas de expresión eucariotas (células de mamífero), procariotas (fundamentalmente Escherichia coli (E. coli)) y libres de células (Desviat et al. 2003b; Waters 2003)  todos ellos basados en  la expresión de  los correspondientes cDNA  clonados  en  vectores  adecuados.  Estos  sistemas  permiten  determinar  las propiedades bioquímicas, catalíticas y estructurales de las proteínas. Se ha observado que  las mutaciones missense producen  fundamentalmente defectos en  la estabilidad (mutaciones estructurales) o defectos en las propiedades catalíticas (Cohen and Kelly 2003; Gregersen et al. 2000; Pey et al. 2003).  

 Este  conocimiento  ha  permitido  el  desarrollo  de  diferentes  estrategias 

terapéuticas, como el uso de dosis farmacológicas de cofactores, uso de  chaperonas químicas o uso de drogas reguladoras de la expresión génica que producen diversos efectos sobre las proteínas mutantes. Algunos de estos efectos son: estabilización de las  proteínas  mutantes  (uso  de  chaperonas  específicas  de  sitio  activo  (1‐deoxigalactonojirimicin)  en  la  enfermedad  de  Fabry  (Fan  and  Ishii  2007)),  la compensación de defectos  cinéticos  (uso de biotina  en defectos de holocarboxilasa sintetasa  (Suzuki  et  al.  1996))  o  aumento  de  la  transcripción  o  traducción  de  las proteínas mutantes. (uso de bezafibrato en defectos de la acil CoA dehidrogenasa de cadena muy larga (Djouadi et al. 2005)).  

Aproximadamente  un  15%  de  las  mutaciones  puntuales  asociadas  a  estas enfermedades afectan al procesamiento del mRNA. El conocimiento que el efecto que cada mutación produce, no sólo referente a su severidad sino  también en  términos de  su mecanismo  de  acción,  obtenida  de  diversos  estudios  de  expresión  como  la utilización de vectores  apropiados  en  los que  se  introducen  regiones discretas del DNA genómico para generar los llamados minigenes (Clavero et al. 2004; Vockley et al. 2000) ha abierto nuevas y prometedoras vías  terapéuticas genéticas, como es  la inhibición  de  la  expresión  de  determinados  transcritos  mutantes  con oligonucleótidos antisentido (AONs) y RNA de interferencia (RNAi) o la utilización de efectores transcripcionales y drogas que modulan la expresión de mutaciones de splicing (Hims et al. 2007; Takeshima et al. 2006; Wood et al. 2007).  

Las cuatro enfermedades estudiadas en este trabajo (fenilcetonuria, acidemia propiónica, metilcrotonilglicinuria y acidemia metilmalónica aislada) pertenecen al grupo de enfermedades metabólicas hereditarias que ocasionan  intoxicación aguda (Saudubray et al. 2006). 

 

Page 21: Cristina Aguado Esteban

5

Los distintos estudios realizados sobre los genes asociados a estas cuatro EMH ha  revelado  que  desde  el  punto  de  vista  genético  las  mutaciones  son mayoritariamente  mutaciones  de  cambio  de  aminoácido  seguidas  de  pequeñas deleciones  en  fase  y  de  mutaciones  que  afectan  al  proceso  de  splicing (http://www.pahdb.mcgill.ca(Perez et al. 2003; Ugarte et al. 1999; Yang et al. 2004a; Yang et al. 2004b). 

 La restricción proteica es la base del tratamiento a largo plazo en estas cuatro 

EMH  y  su  finalidad  es  eliminar  la  formación  de  las  sustancias  tóxicas  que  se acumulan y sus precursores,  esta estrategia terapéutica incluye la administración de drogas que unen los metabolitos acumulados y favorecen su excreción. 

Las dietas necesarias en estos tratamientos conllevan una dura carga social y psicológica  para  los  pacientes  y  sus  familias, además en  algunos  casos  no  son suficientes  para  una  mejora  significativa  de  los  individuos  por  lo  que  se  hace necesaria  la  búsqueda  de  nuevas  terapias  eficaces  que mejoren  la  vida  de  estos enfermos. 

En base al conocimiento de los efectos que las mutaciones producen a nivel de proteína,  RNA  y DNA  se  están  postulando  diversas  aproximaciones  terapéuticas como  terapias  alternativas  para  estas  enfermedades,  entre  ellas  la  suplementación con  el  cofactor  de  la  enzima  implicada  y  el  uso  de  oligonucleótidos  y  drogas moduladoras de splicing.   1.2 RESPUESTA A COFACTORES EN EMH  

En la actualidad se están utilizando dosis altas de cofactores en el tratamiento de numerosas enfermedades genéticas humanas. La investigación en este campo está siendo potenciada por su gran relevancia clínica ya que posibilita la implantación de tratamientos individualizados.  

Se  calcula  que  un  tercio  de  las  mutaciones  en  los  genes  asociados  a enfermedades  hereditarias  humanas  producen  una  disminución  en  la  afinidad (aumento  de  la  constante  de    Michaelis‐Menten  (Km))  por  el  cofactor  o  por  el sustrato. El uso de  niveles  terapéuticos de  cofactores  aumenta  las  concentraciones intracelulares de estos compuestos y sus derivados, compensando así la baja afinidad de  las enzimas defectuosas por ellos y recuperando  la actividad  (Ames et al. 2002). En  un  principio  se  pensaba  que  este  era  el  único  mecanismo  implicado  en  la respuesta a cofactores.  

 Para  otros  dos  tercios  de  genotipos  asociados  a  enfermedades  hereditarias 

humanas  el  defecto  responsable  de  la  enfermedad  no  es  un  defecto  de  Km.  La respuesta a dosis farmacológicas de cofactores está asociada no sólo a mutaciones de Km  sino a otras que presentan una afinidad normal por  el  cofactor, por  lo que  se 

Page 22: Cristina Aguado Esteban

6

postulan otros mecanismos llevados a cabo por el cofactor como son la estabilización (chaperona  química)  de  proteínas  mutantes  o  la  alteración  en    el  patrón  de transcripción y traducción. Para algunos de estos cofactores ya se ha demostrado su efecto regulador a nivel genético (Chauhan and Dakshinamurti 1991; Dakshinamurti and Li 1994; Hyland and Munk‐Martin 2001) siendo muy  interesante el estudio de estos posibles mecanismos.  Los cofactores asociados a  las cuatro enfermedades estudiadas en este  trabajo y 

que  en  algunas  de  ellas  ya  están  siendo  utilizados  como  terapia  son,  la tetrahidrobiopterina  (6(R)‐L‐eritro‐5,6,7,8–tetrahidrobiopterina,  BH4)  en fenilcetonuria,  la  biotina  en  acidemia  propiónica  y  metilcrotonilglicinuria  y  la hidroxicobalamina (OHCbl)  en acidemia metilmalónica aislada. 

Page 23: Cristina Aguado Esteban

7

1.2.1 FENILCETONURIA Y RESPUESTA A TETRAHIDROBIOPTERINA (BH4)  

La  fenilcetonuria  (PKU;  OMIM:  261600)  es  una  enfermedad  metabólica humana  con base genética que  se hereda  con  carácter  autosómico  recesivo y  cuyo origen  es  la  deficiencia  en  la  enzima  fenilalanina  hidroxilasa  (fenilalanina  4‐monooxigenasa, PAH, EC.1.14.16.1). El defecto de esta proteína genera un aumento patológico  en  la  concentración de  fenilalanina  en  todos  los  fluidos  fisiológicos. La incidencia de esta enfermedad es dependiente de la zona geográfica de estudio, para Europa  es de 1:10000  recién nacidos  (Scriver and Kaufman 2001) y la estimación de portadores  por  lo  tanto  es  1  de  cada  50  individuos. Algunas  características  de  la enfermedad se encuentran recogidas en la Tabla 1. 

 La fenilalanina hidroxilasa es una monooxigenasa  de función mixta que lleva 

a cabo la parahidroxilación de L‐fenilalanina a L‐tirosina. En la reacción interviene el oxígeno molecular, como co‐sustrato y el cofactor BH4, como donador de electrones (Fig. 2).  

N

N N

N

H2N

O OH

OH

H

N

N N

N

H2N

O OH

OH

H

HHO

HN

N NH

NH

O OH

OHH2N

+H3N

H-OOC

+H3NOH

H-OOC

HN

N NH

NHO

H2N

O

O

+ O2

L-Phe L-Tyr

BH4

4-OH-BH4

q-BH2

GTP7,8-DHNP

6-PTP

PAH

PCD

H2O

DHPR

NAD(P)H

NAD(P)+

GTPCHPTPS

SR

L-Phe

BH4

+-

2 H2OHCOOH

O

HN

N N

N

H2N

OH OH

P

O O O

-O

-O -O -O

O CH2 OO PO P

P

O O O

-O

-O -O -O

O PO P O H

N

N N

N

H2N

O OH

OH

H

HO-PO PO O

-O-O-O

OOO

P

2 NAD(P)H

2 NAD(P)+

Figura 2. Esquema del ciclo catalítico de la fenilalanina hidroxilasa (PAH) en presencia del cofactor natural BH4 (en rojo), en el que se incluyen las rutas principales de biosíntesis de BH4 (en azul) y de reducción del  cofactor oxidado  (en verde). Se  indica  la  regulación  ejercida por L‐Phe  (+) y BH4  (‐) sobre  la  etapa  limitante  en  la  biosíntesis  de  BH4.  Las  enzimas  implicadas  en  estos  procesos  se muestran en recuadros.  Abreviaturas: BH4.‐ (6R)‐L‐eritro‐5,6,7,8‐tetrahidrobiopterina; 4‐OH‐BH4.‐ 4α‐carbinolamin‐tetrahidrobiopterina;  q‐BH2.‐  7,8‐dihidrobiopterina  quinoinoide;  6‐PTP.‐  6‐piruvoil‐5,6,7,8‐tetrahidropterina;  7,8‐DHNP.‐  7,8‐dihidroneopterina‐trifosfato;  PCD.‐  4α‐carbinolamin‐tetrahidropterina  deshidratasa;  DHPR.‐  dihidropteridina  reductasa;  SR.‐  sepiapterina  reductasa; PTPS.‐6‐piruvoil‐5,6,7,8‐tetrahidropterina sintasa; GTPCH.‐ GTP ciclohidrolasa I 

Page 24: Cristina Aguado Esteban

8

Tabla 1: DIAGNÓSTICO, TRATAMIENTO Y CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS, BIOQUÍMICAS Y GENÉTICAS DE LA  FENILCETONURIA (OMIM 261600) 

CLÍNICA  BIOQUÍMICA 

• En los casos más graves, no tratados, se produce alteración en las funciones y desarrollo cerebrales  

 

Hiperfenilalaninemia   Elevación de metabolitos derivados de la fenilalanina: ácido mandélico, o‐hidroxifenilacético, fenilpirúvico, fenilláctico  

 

DIAGNÓSTICO  

Niveles de fenilalanina y otros aminoácidos en plasma.  Análisis de pterinas, aminoácidos y ácidos orgánicos en orina  Medida de actividad DHPR en sangre total o en papel.  Análisis de mutaciones en el gen PAH.  

       GEN  cDNA  GENÉTICA 

PAH (GenBank: NM_000277) , 

171 Kb, 13 exones 12q22‐q24.1 

PAH (GenBank: NM_000277) 2,4 Kb, codifica para una proteína de 51,7 KDa.  

Mas de 500 mutaciones descritas: 63% de cambio de aminoácido, 13% pequeñas deleciones y 11% afectan al procesamiento del mRNA (http://www.pahdb.mcgill.com). El mecanismo patogénico más frecuente parece ser la inestabilidad conformacional (Cohen and Kelly 2003; Desviat et al. 2003b; Gamez et al. 2000). 

TRATAMIENTO  El tratamiento clásico es una restricción en la dieta del aminoácido fenilalanina.  Dosis farmacológicas de tetrahidrobiopterina  o derivados (en fase clínica dosis farmacológicas de sapropterina)(Levy et al. 2007)  En fase de estudio: Terapia de reemplazamiento enzimático con la enzima recombinante fenilalanina amonio‐liasa (PAL) y terapia génica. 

Page 25: Cristina Aguado Esteban

9

El  sistema  de  hidroxilación  de  la  fenilalanina  a  tirosina  es  también dependiente de  otra  serie de  enzimas  implicadas  en  la  regeneración y  síntesis del cofactor BH4    (Fig 3). La  regeneración del BH4 desde  la  forma oxidada pterin‐4α‐carbinolamina mediante  su deshidratación y posterior  reducción  es  llevada  a  cabo por  las  enzimas  pterin‐4α‐carbinolamina  dehidratasa  (PCD)  y  dihidropteridina reductasa  (DHPR). Por otro  lado  la ruta de biosíntesis del BH4, a partir de GTP, es llevada  a  cabo  por  tres  enzimas GTP  ciclohidrolasa  I  (GTPCH),  6‐piruvoil‐5,6,7,8‐ tetrahidropterina  sintasa  (PTPS)  y  sepiapterina  reductasa  (SR).  Existe  además  una ruta  de  síntesis minoritaria  a  partir  de  sepiapterina  en  la  que  está  implicada  la sepiapterina  reductasa y  la DHFR  (dihidrofolato  reductasa). El principal punto de regulación  de  la  síntesis  del  cofactor  es  la  primera  enzima  de  la  ruta,  la GTPCH, siendo modulada positivamente por niveles elevados de L‐Phe y negativamente por niveles elevados de BH4. Aunque el defecto en cualquiera de las actividades de estas rutas puede conducir a una hiperfenilalaninemia, las mutaciones en el gen de la PAH son  la  causa más  frecuente de  la enfermedad,  representando un 98 % de  los  casos descritos (Scriver and Kaufman 2001; Thony et al. 2000) 

 El diagnóstico neonatal de la fenilcetonuria y la implantación temprana de la 

restricción proteica permiten una prevención total de la sintomatología clásica de la enfermedad recomendándose una continuación durante toda la vida de la dieta y en especial en el caso de madres afectadas por la enfermedad, cuyos fetos pueden sufrir hiperfenilalaninemia materna.    

Los pacientes con  fenilcetonuria por defectos en el gen PAH se clasifican en grupos  fenotípicos en base a  la  ingesta diaria de L‐Phe que  toleran para mantener niveles  plasmáticos  en  un  rango  terapéutico  (Scriver  and  Kaufman  2001) normalmente por debajo de 400 μM y en base a los niveles de L‐Phe en sangre en el momento  del  diagnóstico.  En  general  se  distinguen  4  grupos  fenotípicos  PKU (Desviat et al. 1997) (Tabla 2).  Tabla  2. Clasificación de  los pacientes PKU  en  función de  los niveles de L‐Phe plasmáticos y las cantidades diarias de L‐Phe toleradas en la dieta. Frecuencia de fenotipos en la población española.   Phe en plasma a  Tolerancia a la Phe b  Frecuenciac PKU clásica  >1800 μM  < 400 mg/día  15,7 % PKU moderada  1200‐1800 μM  400‐500 mg/día  9.0 % PKU leve  900‐1200 μM  500‐1000 mg/día  23.0 % HFA  < 600 μM  > 1000 mg/día  52.3 % aDatos en el momento del diagnóstico.  b Datos relativos a niños de 5 años.  c según (Pérez et al. 1999)   

 

Page 26: Cristina Aguado Esteban

10

Estructura y función de la fenilalanina hidroxilasa  La  forma  funcionalmente más  activa  de  la  PAH  es  el  homotetrámero,  un 

dímero  de  dímeros  unidos  por  la  región  de  tetramerización  (Fusetti  et  al.  1998) aunque esta forma coexiste en equilibrio con la estructura dimérica. La actividad de esta enzima hidroxilasa requiere  la presencia de un átomo de hierro no hemínico y de  tetrahidrobiopterina  para  catalizar  la  incorporación  de  un  grupo  hidroxilo, procedente del oxígeno molecular  al anillo aromático de su sustrato (L‐Phe).   

La estructura tridimensional de la proteína fenilalanina hidroxilasa (Fig. 3) ha sido obtenida mediante  la caracterización estructural de diversas  formas  truncadas cristalizadas  (Andersen  et  al.  2001,  2002;  Flatmark  and  Stevens  1999;  Fusetti  et  al. 1998),  con  esta  información  y  con  la  obtenida  por  diversos  estudios  sobre propiedades funcionales y reguladoras se ha podido comprobar la existencia de tres dominios  diferenciados  en  la  enzima:  un  domino  de  tetramerización  carboxilo terminal  (residuos  411‐452)  formando  una  lámina  β  antiparalela  implicada  en dimerización  (residuos 411‐427) seguida de un motivo de  tetramerización coiled‐coil (residuos 428‐452) (Fusetti et al. 1998), un dominio catalítico (residuos 111‐410) en el que  se halla  el  centro activo de  la  enzima,  con  el átomo de hierro  esencial para  la catálisis  y  los  sitios de unión para  sustrato  y  cofactor  (Andersen  et  al.  2002)  y un dominio  amino‐terminal  (residuos  1‐110)  que  contiene  una  secuencia autorreguladora  corta  (ARS).  Esta  ARS  comprende  los  residuos  19‐33  y  tapa  la entrada del centro activo catalítico  restringiendo el acceso del sustrato y cofactor y está implicada en la regulación de la enzima.    

Figura  3:  Estructura  en  dominios  de  un monómero  de  PAH,  dominio  catalítico  (rojo),  dominio regulador (verde) y dominio de tetramerización (amarillo). El cofactor BH4 (azul) se une al dominio catalítico. 

Page 27: Cristina Aguado Esteban

11

En  condiciones  fisiológicas  los  efectos  reguladores más destacables  sobre  la actividad enzimática PAH son ejercidos por:  

L‐Phe: es un modulador alostérico positivo homotrópico. Se propone que la L‐Phe  induce  un  cambio  conformacional  que  desplaza  la  secuencia autorreguladora del sitio activo (Thorolfsson et al. 2003). 

BH4: Actúa como efector negativo manteniendo la proteína en estado de baja actividad específica y dificultando su activación por L‐Phe. 

Fosforilación de  la Ser 16:  In vitro  la  fosforilación de  la serina 16 aumenta  la actividad  específica,  en  ausencia de preincubación  con L‐Phe, de  la  enzima recombinante  (Miranda  et  al.  2002).  In  vivo  esta  serina  es  fosforilada  por proteín quinasas dependientes de cAMP y Ca2+/Calmodulina (Kaufman 1993). 

 Dentro  de  la  estructura  de  la  enzima  existen  una  serie  de  aminoácidos 

directamente implicados en la función hidroxilante de la enzima y que configuran el centro  activo. La His‐285, His‐290 y Glu‐330  forman un  complejo de  coordinación octaédrico  con  el  átomo de hierro  en  estado  férrico que  se  encuentra  en  el  centro activo de la enzima, en el mecanismo catalítico de la PAH el hierro es reducido por el cofactor. Los residuos que  interaccionan o están en  la proximidad del cofactor han sido incluidos en unas regiones denominadas regiones de unión al cofactor (cofactor binding regions, CBR), estas regiones son CBR#1 (residuos 245‐266), CBR#2 (residuos 280‐283),  CBR#3  (residuos  322‐326)  y  CBR#4  (residuos  377‐379)  (Erlandsen  and Stevens  2001).  Por  su  parte  la  L‐Phe  establece  un  puente  salino  con  la Arg270  y puentes de hidrógeno con la Tyr277 y Ser349, e interacciones de Van der Waals con los residuos Trp326 y Phe 331, localizados en un cluster hidrofóbico (Andersen et al. 2002; Teigen et al. 1999).  

Para  concocer el efecto de  las mutaciones PAH  identificadas en pacientes  se han  empleado  sistemas  de  expresión  procariotas,  fundamentalmente  E.  coli,  y eucariotas,  tanto  células  de mamífero  en  cultivo  como  sistemas  libres  de  células (Desviat  et  al.  2003b; Waters  2003).  La  expresión  en  estos  sistemas  conduce  a  la obtención de proteínas cuyas propiedades bioquímicas y catalíticas son comparables (Gamez et al. 2000; Knappskog et al. 1996a; Knappskog et al. 1996b), y a su vez muy similares a las de la proteína normal obtenida de rata y humanos  (Baker and Shiman 1979; Gamez et al. 2000; Martínez et al. 1995; Smith et al. 1984; Solstad and Flatmark 2000).  

Para  las mutaciones PKU, el mecanismo patogénico más frecuente parece ser la  inestabilidad  conformacional.  En  bacterias,  muchas  de  las  proteínas  mutantes presentan menor estabilidad térmica (Gamez et al. 2000; Pey et al. 2003) y una mayor tendencia a  la agregación,  resultando en proteínas más  insolubles y/o en proteínas solubles  con  una  mayor  fracción  de  proteína  agregada,  y  por  lo  tanto  con  una actividad PAH disminuida (Bjørgo et al. 1998; Gamez et al. 2000; Gjetting et al. 2001; 

Page 28: Cristina Aguado Esteban

12

Waters  et  al.  2000).  En  células  eucariotas,  la  inestabilidad  se manifiesta  como  un descenso de proteína  inmunorreactiva, posiblemente debido a una combinación de degradación  proteolítica  incrementada  y  menor  solubilidad  (Gamez  et  al.  2000; Waters  et  al.  2000).  Cuando  las  proteínas  mutantes  son  expresadas  en  sistemas eucariotas  libres  de  células  se  observa  una  degradación  proteolítica  acelerada (Desviat et al. 2003b; Gamez et al. 2000; Pey et al. 2003; Waters et al. 2000).  El cofactor tetrahidrobioterina  

La  tetrahidrobiopterina es un cofactor perteneciente al grupo de  las pterinas, estructuralmente está constituida por una cadena de pteridina con  las sustituciones 2‐amino,  4 oxo y  5,6,7,8  tetrahidro. En humanos  la BH4  se  encuentra  en  todos  los tejidos y fluidos biológicos y puede ser tanto reciclada como sintetizada de novo (Fig. 3).  La  BH4  actúa  como  cofactor  de  la  oxido  nítrico  sintasa  y  de  la  gliceril  eter monooxigenasa aunque la función mejor establecida y más estudiada  para la BH4 en humanos  es  su  actuación  como  cofactor  de  tres  enzimas  implicadas  en  la hidroxilación de aminoácidos aromáticos; la fenilalanina‐4‐hidroxilasa,  la tirosina‐3‐hidroxilasa y  la triptófano‐5‐hidroxilasa, estas enzimas son claves en la biosíntesis de aminas biógenas.   

En  las  hiperfenilalalinemias  para  distinguir  las  deficiencias  producidas  por defectos  en  la  síntesis  o  regeneración  del  cofactor  BH4  (Fig.  4)  de  las  debidas  a defectos en el gen de la PAH se realiza un test de sobrecarga oral con BH4, aunque para un diagnóstico exacto es necesario además el análisis de los niveles de pterinas en  la  orina  y  la  actividad  dihidropterina  reductasa  en  eritrocitos.  En  general,  los pacientes con alteraciones en las enzimas implicadas en la síntesis y regeneración de la BH4 presentan una normalización de los niveles de L‐Phe plasmática muy rápida (4‐8 horas después de la sobrecarga) tras la ingesta oral de dosis moderadas de este cofactor (Fig. 4). 

Deficiencia en PTPS

0-

5-

10-

15-

20-

25-

30-

35-

0 horas 4 horas 8 horas

Defeciencia en PAH

Deficiencia en DHPR

Feni

lala

nina

plás

mat

ica

(mg/

dl)

Figura 4: Niveles de fenilalanina plasmática antes y después de una sobrecarga en un paciente con deficiencia en PAH, uno con deficiencia en PTPS y un caso de deficiencia en DHPR. Considerando niveles plasmáticos en  rango  terapéutico  (Scriver and Kaufman 2001) normalmente por debajo de 7 mg/dl (400 μM). 

Page 29: Cristina Aguado Esteban

13

Para  la  deficiencia  en  PAH  lo  esperable  es  que  no  se  produzca  esta disminución  de  L‐Phe  tras  las  sobrecarga  con  BH4,  pero  en  1999  Kure  y colaboradores  (Kure  et  al.  1999)  describieron  en  detalle,  por  primera  vez,  cuatro casos  de  pacientes  con  mutaciones  en  el  gen  de  la  PAH  que  respondían favorablemente a la suplementación con el cofactor. Este trabajo abrió la posibilidad de una nueva estrategia  terapéutica para algunos pacientes PKU. Los pacientes de este primer trabajo de Kure, eran individuos con un fenotipo leve de la enfermedad, en  posteriores  trabajos  se  ha  demostrado  que  existe  una  mayor  proporción  de respuesta  positiva  en  las  formas  clínicas  leves  y moderadas  (Blau  and  Erlandsen 2004; Muntau et al. 2002; Spaapen et al. 2001), aunque  también  se ha descrito una respuesta positiva en algunos pacientes con fenotipos mas graves.  

 Uno  de  los  objetivos  de  los  estudios  de  suplementación  con  BH4  es  poder 

determinar  la viabilidad de esta  terapia a  largo plazo con el  fin de poder sustituir parcial o totalmente la restricción proteíca que llevan los enfermos fenilcetonúricos. Recientemente  se  han  descrito  casos  en  los  que  el  tratamiento  con  BH4  ha desplazado totalmente la restricción dietética en L‐Phe (Shintaku et al. 2004). Otro de los objetivos fundamentales en los estudios de sobrecarga es intentar establecer una relación  entre  el  genotipo  y  el  fenotipo de  la  enfermedad, para poder determinar diversos grados de potencialidad en la respuesta para las distintas mutaciones PKU. A partir de  los datos de  estos  estudios  se  ha  configurado una  base de datos  que contiene  los  genotipos  relacionados  con  una  respuesta  positiva  a  BH4 (http://www.BH4.org). 

 Los estudios de localización de las mutaciones presentes en la PAH asociadas 

a respuesta han revelado que sólo un pequeño porcentaje de ellas se localizan en las regiones de unión  al  cofactor. Por  ello  se han propuesto  varios mecanismos para explicar  la  respuesta:  efecto  catalítico  (mutantes  de  Km),  efecto  sobre  la estabilización de la enzima PAH, efecto sobre la estabilización del mRNA de la PAH y  efecto  sobre  la  regulación de  la  expresión  génica de  la PAH,  estos dos últimos basados en que para  la proteína oxido nítrico sintasa, de  la que  la BH4 es  también cofactor, se ha descrito un aumento en los niveles de mRNA asociado a un aumento en los niveles de BH4 (Saura et al. 1996) y para un ratón transgénico con defecto en la GTP ciclohidrolasa I, se ha descrito un aumento de actividad, niveles de proteína y mRNA para  la PAH en hígado  tras administración oral de cofactor  (Hyland and Munk‐Martin 2001).   

Page 30: Cristina Aguado Esteban

14

1.2.2 ACIDEMIA METILMALÓNICA AISLADA Y RESPUESTA A COBALAMINA  

La  acidemia  metilmalónica  aislada  (OMIM  251110)  es  una  enfermedad metabólica  genéticamente  heterogénea,  de  herencia  autosómica  recesiva  con  una prevalencia  de 1:50.000 nacidos vivos (Coulombe et al. 1981; MacMahon 1995).  

Se  caracteriza  por  la  acumulación  de  ácido  metilmalónico  y  metabolitos derivados del mismo en sangre y orina debido a un bloqueo en el paso mitocondrial de  isomerización  de  L‐metilmalonil‐CoA  a  Succinil‐CoA  (Fig.  5).  Este  paso, implicado  en  el  catabolismo de  aminoácidos  ramificados,  ácidos grasos de  cadena impar y la cadena lateral del colesterol es catalizado  por la enzima metilmalonil‐CoA mutasa  (MCM)  cuya  actividad depende del  cofactor Adenosilcobalamina  (AdoCbl) (Gurnani et al. 1960). Defectos tanto en  la apoenzima MCM como en algunas de  las enzimas  implicadas  en  la  activación  del  cofactor  B12  producen  acidemia metilmalónica aislada 

.

Cbl(II?)

Propionil‐CoA

D‐Metilmalonil‐CoA

Succinil‐CoA

PCC

cblHcblD

L‐Metilmalonil‐CoA

MCMmut

cblA

Adocbl

ATRcblB

Cbl(II)

 Figura  5.  Ruta  catabólica  del  metilmalonil‐CoA.  El  enzima  ATR  (ATP:cob(I)alamina adenosiltransferasa)  en  rojo  convierte  la  cobalamina  reducida  (Cbl(I))  a  adenosilcobalamina  (verde), que es cofactor de la MCM (Metilmalonil‐Co mutasa). El L‐Metilmalonil‐CoA dará en último término Succinil‐CoA, que podrá ser sustrato de la ruta de degradación de los ácidos tricarboxílicos.   

La  cobalamina  (vitamina    B12)  es  una molécula  compleja  que  contiene  un átomo central de cobalto rodeado por un anillo de corrina similar al de porfirina y una  compleja  cadena  lateral  DMB  (5,6‐dimetil‐benzimidazol  fosforibosil).  La molécula se completa por la unión de manera covalente a diferentes radicales libres, si  este  radical  es un grupo metil da  lugar  a  la metilcobalamina  (MeCbl) que  es  el cofactor de  la metionina sintasa que cataliza  la  formación de metionina a partir de homocisteína  (Cauthen et al. 1966; Drummond and Matthews 1993) y si el grupo que 

Page 31: Cristina Aguado Esteban

15

se  une  covalentemente  a  la  cobalamina  es  la  5´‐deoxiadenosil  se  forma  la adenosilcobalamina que es cofactor de la MCM. 

 Para que se  formen estos dos cofactores  la cobalamina de  la dieta   ha de ser 

absorbida, transportada y endocitada al interior de las células, donde sufrirá todo un procesamiento  complejo  y  todavía  no  conocido  totalmente  en  el  que  el  átomo  de cobalto  reducirá  su  estado  de  oxidación  de Co(III)  a Co(I)  (Walker  et  al.  1969)  y posteriormente unirá el ligando correspondiente. 

 Hasta la fecha mediante estudios bioquímicos y de fusión de células somáticas 

de  individuos  con  acidemia metilmalónica  se  han  caracterizado  diferentes  formas químicas asociados a la síntesis de estos cofactores, en total se han descrito 9 grupos de complementación genética (cbl A, B,  C, D (variantes 1 y 2), E, F, G y H) (Kapadia 1995). La AdoCbl y la MeCbl comparten varios pasos citoplasmáticos de su síntesis y mientras  que  la MeCbl  completa  su  síntesis  en  el  citoplasma,  la  formación  de  la AdoCbl es finalizada en el interior de la mitocondria.  

 Los defectos en los pasos implicados únicamente en la síntesis mitocondrial de 

la  AdoCbl    incluyen    los  grupos  de  complementación  cblA,  cblB,  cblH  y  cblD    y conllevan  la deficiencia  indirecta de  la actividad de  la MCM produciendo acidemia metilmalónica aislada (Fig. 5). 

Se  postula  que  los  grupos  de  complementación  cblD  y  cblH  podrían  estar causados por deficiencias en un   solo gen  (MMADHC). Mutaciones en  las distintas regiones de este  locus causarían  las  tres variantes  fenotípicas diferentes asociadas a estos  grupos  de  complementación,  una  de  las  cuales  es  responsable  de  aciduria metilmalónica aislada. (Coelho D 2007). 

El  grupo  de  complementación  cblA  es  causado  por  mutaciones  en  el  gen MMAA que codifica para una proteína de  función  todavía desconocida, aunque ha sido descrito que tiene actividad GTPasa y se postula que forma un complejo con la MCM interviniendo en su unión a la AdoCbl (Banerjee 2006). 

 La  enzima  deficiente  en  el  grupo  de  complementación  cblB  es  la  ATP: 

cob(I)alamina adenosiltransferasa (ATR) (EC 2.5.1.17) que cataliza la transferencia de un  grupo  adenosilo  desde  el  ATP  a  la  cobalamina  para  generar  la adenosilcobalamina. El gen que codifica para esta proteína es el MMAB (Dobson et al. 2002a), las características de la acidemia metilmalónica causada por la deficiencia en este gen se resumen en la Tabla 3.  Estructura y función de la ATP:cob(I)alamina adenosiltransferasa (ATR)  

 La estructura   de  la ATR humana unida a ATP es de un  trímero constituido 

por 3 monómeros idénticos (24 KDa.), formados cada uno de ellos por 5 hélices α y dos  láminas  β,  el  sitio de unión  a ATP  está  en  las  interfases  entre  los monómeros 

Page 32: Cristina Aguado Esteban

16

adyacentes  indicando que  la ATR  es  funcional  como un  trímero. Aunque hay  tres interfases,  la  interacción con el ATP solo ocurre en dos de ellas  (Fig. 6). La unión a ATP produce un cambio conformacional que contribuye a  la  formación del sitio de unión a la cobalamina (Schubert and Hill 2006). 

 

. Figura 6: Estructura trimérica de la hATR, se observan los tres monómeros (verde, amarillo y azul) y las dos moléculas de ATP (rojo) en las interfases entre dos monómeros adyacentes.

Aproximadamente  un  40%  de  los  pacientes  pertenecientes  al  grupo  de 

complementación cblB manifiestan un efecto positivo in vivo a la suplementación  con cobalamina (en forma de OH‐Cbl) con una disminución de los niveles de metabolitos excretados (Matsui et al. 1983). Los estudios  in vitro muestran un porcentaje similar de  recuperación de  la vía de  incorporación del propionato  (medida  indirecta de  la actividad  MCM)  en  respuesta  a  niveles  elevados  de  OH‐Cbl  en  fibroblastos  de  pacientes en cultivo. 

 El conocimiento de  los mecanismos moleculares asociados a esta respuesta y 

la búsqueda de  la relación genotipo‐respuesta ha producido diversos estudios para analizar  el  efecto  estructural  y  catalítico de mutaciones presentes  en pacientes del grupo de complementación cblB. Para la expresión y caracterización de las proteínas mutantes  se  han  utilizado  varios  sistemas  de  expresión  entre  ellos  sistemas procariotas como E.coli (Leal et al. 2004; Zhang et al. 2006), además del análisis de la proteína ATR endógena en fibroblastos de los pacientes. Los diferentes estudios han permitido  observar  que  algunas  de  las mutaciones  producen  inestabilidad  de  las proteínas y/o actividad nula o disminuida. Hasta  la  fecha sólo existe una mutación descrita, R191W que disminuye  su afinidad por  los  sustratos ATP y  cob(I)alamina (Zhang et al. 2006).  

Page 33: Cristina Aguado Esteban

17

Tabla 3: DIAGNÓSTICO, TRATAMIENTO Y CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS, BIOQUÍMICAS Y GENETICAS DE LA  ACIDURIA METILMALÓNICA tipo cblB (OMIM 251110)  

CLÍNICA  BIOQUÍMICA • Gran heterogeneidad  tanto en  la gravedad como en el  inicio 

de  los primeros síntomas  (Matsui et al. 1983). Síntomas más comunes  son  letargia,  fallo  en  el  desarrollo,  vómitos recurrentes,  deshidratación,  problemas  respiratorios, hipotonía muscular. 

Cetonemia, cetonuria, hiperamonemia, hiperglicinemia  Cantidades  elevadas  de  ácido  metilmalónico, propionilcarnitina,  propionilglicina,  2‐metilcitrato  y  3‐hidroxipropiónico en fluidos fisiológicos

DIAGNÓSTICO  Medida de los ácidos metilmalónico, 3‐hidroxipropiónico, metilcítrico y glicina en fluidos fisiológicos  Medida de la actividad metilmalonil‐CoA mutasa. Estudios de complementación celular con líneas celulares “tester”.  Diagnóstico enzimático por medida de la incorporación de 14C‐propionato en proteínas en células en cultivo con medio basal y suplementado con hidroxicobalamina. 

Análisis de mutaciones en el gen MMAB. GEN  cDNA  GENÉTICA MMAB 

(GenBank: AF550404) 9 exones 12q24

MMAB (GenBank: NM_052845) 4,1 Kb, codifica para una proteína de 24 KDa.

Las mutaciones más frecuentes son las mutaciones missense (50%) seguidas de las mutaciones que afectan al splicing. 

TRATAMIENTO  Limitación de la ingesta proteica  combinado con suplemento especial exento de aminoácidos precursores de ácido propiónico.  Suplementación con L‐carnitina.  Suplementación con cobalamina (CN‐Cbl o preferiblemente OH‐Cbl intramuscular).  Metronidazol para inhibir la síntesis de propionato bacteriano. 

Page 34: Cristina Aguado Esteban

18

1.2.3 ACIDEMIA PROPIÓNICA Y METILCROTONILGLICINURIA Y RESPUESTA A  BIOTINA  

 Dos  de  las  acidemias  orgánicas más  frecuentes  en  humanos  son  la  acidemia 

propiónica y  la metilcrotonilglicinuria, ambas son enfermedades genéticas debidas al déficit de una enzima mitocondrial dependiente de biotina. Algunas características de estas dos EMH se encuentran recogidas en las Tablas 4 y 5.  

 La  acidemia  propiónica  (AP;  MIM  606054)  está  causada  por  la  deficiencia 

genética  en  el  enzima mitocondrial  biotina‐dependiente  propionil‐CoA  carboxilasa (PCC). La propionil‐CoA carboxilasa (PCC; E.C. 6.4.1.3) genera D‐metilmalonil‐CoA al llevar a cabo la carboxilación del propionil‐CoA (Fig. 7), este sustrato proviene del catabolismo de los aminoácidos valina, isoleucina, metionina y treonina, catabolismo de  los  ácidos grasos de  cadena  impar y de  la  cadena  lateral del  colesterol y de  la fermentación realizada por bacterias de la flora intestinal (Bain et al. 1988; Thompson and Chalmers 1990; Thompson et al. 1990). 

 

D-Metilmalonil-CoAPropionil-CoA

Valina, isoleucina, metionina, treonina Acidos grasos de cadena impar.        

Cadena lateral del colesterol

H2C‐CH3

CO‐S‐CoA+ HCO3

COOH

HC‐CH3

CO‐S‐CoA

Propionil‐CoAcarboxilasa (PCC)

Biotina ATP Mg2+  

Figura 7. Ruta catabólica del propionil‐CoA. El enzima propionil‐CoA carboxilasa cataliza la conversión dependiente de biotina del propionil‐CoA hasta D‐metilmalonil‐CoA. 

La metilcrotonilglicinuria  (MCG; MIM  210200,  210210)  está  causada  por  la 

deficiencia  en  la  enzima  mitocondrial  biotina‐dependiente  3‐metilcrotonil‐CoA carboxilasa (MCC; E.C.6.4.1.4). Esta enzima está implicada en la ruta de degradación de  la  leucina y cataliza  la carboxilación del 3‐metilcrotonil‐CoA a 3‐metilglutaconil‐CoA (Sweetman and Williams 2001)(Fig 8). 

  

3-Metilcrotonil-CoA

3-Metilcrotonil-CoACarboxilasa

AcetilCoA3-Metilglutaconil-CoAÁcido Acetoacético

Ácido MevalónicoL-Leucina

Biotina ATPMg+2

Figura  8.  Ruta  catabólica  de  la  L‐Leucina.  El  enzima  3‐metilcrotonil‐CoA  carboxilasa  cataliza  la conversión dependiente de biotina del 3‐metilcrotonil‐CoA hasta 3‐Metilglutaconil‐CoA. 

Page 35: Cristina Aguado Esteban

19

Tabla 4: DIAGNÓSTICO, TRATAMIENTO Y CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS, BIOQUÍMICAS Y GENÉTICAS DE LA ACIDEMIA PROPIÓNICA (OMIM 606054)  

CLÍNICA BIOQUÍMICA

• Neonatal:  vómitos,  somnolencia,  convulsiones, letargia, coma. 

• Tardía:  retraso  psicomotor,  convulsiones, problemas gastrointestinales

Cetoacidosis con o sin hiperamonemia.  Niveles elevados de ácido propiónico y metabolitos derivados (metilcitrato, 3‐OH propiónico, propionilglicina y tigliglicina en fluidos fisiológicos (sangre y orina) y propionilcarnitina (C3) en plasma. 

Hiperglicinemia, hipocarnitinemia y aumento relativo de los ácidos grasos largos de cadena impar en plasma.

DIAGNÓSTICO Cuantificación en sangre y orina del ácido propiónico y de sus metabolitos derivados (3‐OH propiónico, metilcitrato, propionilglicina)   Determinación de la actividad enzimática propionil‐CoA carboxilasa  en linfocitos o en fibroblastos de piel. Estudios de complementación celular con líneas celulares “tester”. 

Análisis de mutaciones en los genes PCCA y PCCB. GEN cDNA MUTACIONES

PCCA (GenBank:AY035786– AY035808), 24 exones , 13q32 (codifica para la subunidad α)  

PCCB (GenBank:AJ006499–AJ006487), 15exones, 3q13.3‐q22 (codifica para la subunidad ß)

PCCA (GenBank: AF385926) 2,9 Kb, codifica para una proteína de 72 KDa. 

 

PCCB (GenBank:NM000532) 2,0 Kb, codifica para una proteína de 56 KDa. 

Existen más de 40 mutaciones descritas en el gen PCCA  y más de 50 en el gen PCCB   En ambos genes las mutaciones más frecuentes (40%) son las que implican cambio  de  aminoácido  seguidas  de  pequeñas  inserciones‐deleciones  y mutaciones de procesamiento de mRNA.

TRATAMIENTO Limitación de la ingesta proteica  combinado con suplementos especiales exentos de aminoácidos precursores de ácido propiónico.  Metronidazol para disminuir la producción bacteriana de propionato intestinal (Thompson et al. 1990)  Suplementación con L‐carnitina.  Suplementación con biotina.  Transplante hepático en casos con agravamiento progresivo y descompensaciones frecuentes(van ʹt Hoff et al. 1998).

Page 36: Cristina Aguado Esteban

20

Tabla 5: DIAGNÓSTICO, TRATAMIENTO Y CARACERÍSTICAS CLÍNICAS, BIOQUÍMICAS Y GENÉTICAS DE LA 

METILCROTONILGLICINURIA  (OMIM 210210, 210200)   CLÍNICA  BIOQUÍMICA 

• Presentación  clínica  entre  primer  y segundo  año de  vida  con  Síndrome de Reye,  retraso  psicomotor, movimientos involuntarios y convulsiones.    

• Existen casos asintomáticos. 

Acidosis metabólica, transaminasas altas, hipoglucemia, hiperamonemia y moderada cetonuria en plasma. 

Niveles elevados de 3‐metilcrotonilglicina  y ácido 3‐OHisovalérico en orina y de 3‐OHisovalerilcarnitina (C5OH) en plasma. 

Hipocarnitinemia. 

DIAGNÓSTICO  Medida de 3‐hidroxiisovalerilcarnitina en sangre y de  3‐metilcrotonilglicina  y ácido 3‐OHisovalérico en orina.  Diagnóstico  enzimático  por  medida  de  la  actividad  metilcrotonil‐CoA  carboxilasa  en  linfocitos  y  fibroblastos. Estudios  de complementación celular con líneas celulares “tester”. 

Análisis de mutaciones en los genes MCCC1 y MCCC2. GEN cDNA GENÉTICA

MCCC1(codifica para la subunidad α), 19 exones, 3q25‐q27 (GenBank: NM_020166)  MCCC2(codifica para la subunidad β), 17 exones, 5q12‐q13.1 (GenBank:NM_022132)

MCCC1 (GenBank: AF310972) 2,6 Kb, codifica para una proteína de 80 KDa. 

 MCCC2 (GenBank: AF 310971)2,3 Kb, codifica  una proteína de 

62 KDa. 

El espectro de mutaciones incluye mayoritariamente mutaciones missense junto  con  mutaciones  de  splicing y  pequeñas  inserciones/deleciones (Baumgartner  et  al.  2001b;  Desviat  et  al.  2003a;  Gallardo  et  al.  2001; Holzinger et al. 2001).  Existe una mutación en el gen MCCC1 R385S que ha sido descrita como una mutación dominante negativa y con respuesta a biotina (Baumgartner et al. 2004). 

TRATAMIENTO

Dieta con moderada restricción proteica  Suplementación con L‐carnitina.  Suplementación con biotina.

Page 37: Cristina Aguado Esteban

21

Estructura  y  función  de  la  propionil‐CoA  carboxilasa  y  de  la metilcrotonil‐CoA carboxilasa. 

 La PCC y la MCC son dos de las cuatro carboxilasas dependientes de biotina 

existentes en humanos, ambas se  localizan en  la matriz mitocondrial y son enzimas heteroméricas compuestas por dos tipos de subunidades, α y β y con una estructura nativa correspondiente a un heteropolímero α6β6  (Chloupkova et al. 2000; Hector et al. 1980). La subunidad α es de mayor  tamaño para  las dos proteínas y contiene el  sitio de unión  a  biotina  (Kalousek  et  al.  1980)  en  la  región  carboxi  teminal  con  el motivo  conservado  A‐M‐K‐M,  y  los  sitios  de  unión  a  ATP  y  bicarbonato.  La subunidad β en cuya región carboxilo terminal del polipéptido se localiza el dominio de unión al propionil‐CoA o metilcrotonil‐CoA,  (Lamhonwah et al. 1990; Samols et al. 1988), posee la actividad carboxiltransferasa y es de un tamaño menor.  

La reacción catalizada por estas dos enzimas tiene  lugar en dos etapas. En  la primera  reacción,  la  cual  requiere  ATP  y Mg2+,  el  bicarbonato  (fuente  del  grupo carboxilo)  se  une  al  nitrógeno  N1  de  la  biotina,  formando  un  intermediario carboxibiotina‐apoenzima.  En  la  segunda  etapa,  este  complejo  reacciona  con  un carbono del sustrato (propionil‐CoA para el caso de PCC y 3‐metilcrotonil‐CoA para la MCC), transfiriendo el grupo carboxilo de la biotina.  El cofactor biotina  

La  biotina  es  una  vitamina  hidrosoluble  esencial  para  el  metabolismo  y  crecimiento celular (Wolf 2001). Su función es ser transportador de grupo carboxilo en reacciones  de carboxilación, decarboxilación y transcarboxilación (Knowles 1989). En mamíferos  es  el  cofactor  de  cuatro  carboxilasas,  tres  de  ellas mitocondriales, propionil‐CoA carboxilasa (PCC),  3‐metilcrotonil‐CoA carboxilasa (MCC) y piruvato carboxilasa (PC),  la cuarta, la acetil‐CoA carboxilasa se presenta como dos proteínas genéticamente diferentes, una mitocondrial (ACC2) y la otra citoplasmática (ACC1).  La PCC y  la MCC al  igual que el  resto de  carboxilasas dependientes de biotina  se sintetizan en  forma de apoenzima y  son posteriormente biotiniladas por el enzima holocarboxilasa sintetasa (HCS), enzima que se localiza tanto en el citosol como en la mitocondria.     La HCS  lleva a cabo  la reacción, ATP dependiente, de unión covalente de  la 

biotina al grupo amino ε de un residuo de lisina de la carboxilasa (Chapman‐Smith and  Cronan  1999).  Esta  lisina  está  presente  en  un  dominio  de  unos  60‐80 aminoácidos  de  longitud  en  cuyo  interior  se  encuentra  la  secuencia  universal aceptora  de  biotina  (A/V)MKM,  común  a  todas  las  carboxilasas  dependientes  de biotina y altamente conservado desde bacterias a mamíferos. 

La biotina es sintetizada en microorganismos, levaduras y plantas (Streit and Entcheva 2003), mientras que los humanos y otros mamíferos no tienen la capacidad 

Page 38: Cristina Aguado Esteban

22

de producir su síntesis,  por ello tienen que adquirirla mediante la dieta y a través de la  síntesis  de  novo  de  las  bacterias  intestinales  y  han  desarrollado  un  complejo mecanismo conocido como el ciclo de la biotina para optimizar la utilización de este nutriente esencial. En el ciclo de la biotina están implicadas la HCS, responsable de la transferencia a carboxilasas y la biotinidasa responsable del reciclaje de la biotina, catalizando  la hidrólisis de biotina a partir de biocitina  (biotinil‐lisina) o pequeños péptidos  biotinilados  (Pacheco‐Alvarez  et  al.  2002).  El  delicado  balance  en  la utilización y reciclaje de la biotina puede ser alterado por desórdenes genéticos en la biotinidasa  (Hymes  et  al.  2001)  o  en  la  HCS  (Sakamoto  et  al.  1999)  con  graves consecuencias en la homeostasis metabólica.  

 La biotina  tiene  toda una serie de efectos sobre procesos sistémicos como el 

desarrollo (Watanabe and Endo 1990),  la  inmunidad (Baez‐Saldana et al. 1998) y el control de  la  expresión génica  en  animales de  laboratorio y  células  en  cultivo. La lista  de  proteínas  afectadas  por  la  biotina  incluye  enzimas  implicadas  en  el metabolismo  de  la  glucosa,    enzimas  asociadas  a    la  homeostasis  de  la  biotina, transportadores de vitaminas, factores de transcripción, citokinas y sus receptores y oncogenes  (Baur et al. 2002; De La Vega and Stockert 2000; Pacheco‐Alvarez et al. 2002).  

Utilizando como modelo  la rata se ha demostrado que  la biotina estimula  la síntesis  de  glucokinasa  hepática  y  reprime  la    fosfoenol  piruvato  carboxikinasa (Chauhan and Dakshinamurti 1991; Dakshinamurti and Li 1994; Dakshinamurti et al.  1970).  En  células  de  hepatoma  la  biotina  regula  a  nivel  postranscripcional  los niveles del receptor de asialoglicoproteínas (Collins et al. 1988; Stockert and Morell 1990; Stockert et al. 1992).   

Con  respecto  al  efecto de  la  biotina  sobre  la  expresión  génica de proteínas implicadas en la homeostasis de la biotina existen múltiples trabajos con diferentes resultados. León del Río y colaboradores (Solorzano‐Vargas et al. 2002) observaron una disminución  en  la  expresión de HCS, PCCA y ACC1  en  células HepG2 y  en fibroblastos  normales  en  respuesta  a  la  deficiencia  de  biotina.  Velázquez  y colaboradores  (Rodriguez‐Melendez  et  al.  2001;  Rodriguez‐Melendez  et  al.  1999) reportaron disminución en la expresión de HCS en hígado, riñón, músculo y cerebro en ratas después de una deficiencia progresiva en biotina y no encontraron cambios significativos en  la expresión de PC y PCC. Zempleni y colaboradores (Manthey et al. 2002) utilizando  células  Jurkat deficientes  en biotina no detectaron  cambios de expresión en PCCA aunque si encontraron aumentada la expresión del gen MCCA en  células  mononucleares  de  sangre  periférica  (PBMC)  obtenidas  de  pacientes suplementados con biotina (Wiedmann et al. 2003). Mock y colaboradores (Vlasova et al. 2005) no encontraron diferencias significativas en la expresión de los genes que codifican para PCCA, PCCB, MCCA, MCCB, PC, ACC1, ACC2, HCS, biotinidasa o 

Page 39: Cristina Aguado Esteban

23

transportador  de  vitaminas  dependiente  de  sodio  (SMVT)    en  linfocitos  transformados (EBVL).    

Se han postulado varios mecanismos a través de los cuales  la biotina podría ejercer un efecto regulador sobre la expresión génica:  

1. Regulación  vía  cascada  de  señalización  mediada  por  HCS,  biotinil‐AMP, guanilato  ciclasa  soluble  (sGC),  GMPc  y  proteín‐kinasas  dependiente  de  GMPc. Niveles elevados de biotina estimulan  la activación, mediada por esta  cascada, de proteínas kinasa G que producen la fosforilación y activación de proteínas que a su vez  aumentan  la  actividad  transcripcional  de  diversos  genes,  entre  ellos  HLCS (Solorzano‐Vargas et al. 2002).  

2. Regulación  de  la  vía  de  señalización  celular  dependiente  del  factor  de transcripción NF‐кB. La deficiencia de biotina produce una translocación celular de este, favoreciendo la actividad transcripcional de genes diana de NF‐кB (Rodriguez‐Melendez and Zempleni 2003).   

3. Remodelación de  la  cromatina por biotinilización de histonas.  (Hymes  and Wolf 1999; Stanley et al. 2001).  

Page 40: Cristina Aguado Esteban

24

1.3 SPLICING Y ENFERMEDADES GENÉTICAS.  

Aproximadamente  un  15%  de  las  mutaciones  puntuales  asociadas  a enfermedades genéticas humanas afectan al procesamiento del mRNA. Durante este proceso de splicing los intrones son eliminados, la correcta identificación y unión de los exones es  llevada a cabo por un complejo macromolecular denominado spliceosoma, compuesto de 5 partículas ribonucleoproteicas (snRNPs) (U1, U2, U4, U5 y U6) y más de 50 proteínas. Cada snRNP está compuesto de un RNA pequeño nuclear, rico en uridinas  (snRNA) y múltiples proteínas asociadas. El spliceosoma debe reconocer  las secuencias  exónicas  inmersas  entre  largas  secuencias  intrónicas  y  eliminar  estas últimas. Los  límites exón‐intrón están definidos por una  serie de  secuencias más o menos  conservadas  que  serán  reconocidas  por  la maquinaria  de  splicing:  el  sitio donador  5´  de  splicing,  el  sitio  aceptor  3´  de  splicing,  la  secuencia  de  ramificación (BPS) y el tracto polipirimidínico.  

La  maquinaria  de  splicing  en  ocasiones  requiere  secuencias  reguladoras adicionales en cis para modular el procesamiento. Estas secuencias que se encuentran localizadas  tanto  en  exones  como  en  intrones,  pueden  actuar  bien  estimulando  la eliminación  intrónica  (potenciadores  de  splicing  o  enhancers)  o  bien  impidiéndola (silenciadores de splicing). Los elementos reguladores de splicing ejercen su acción a través de factores proteicos. En concreto, los silenciadores parecen interaccionar con una serie de reguladores negativos, frecuentemente pertenecientes a la familia de las ribonucleoproteínas  heterogéneas  nucleares  (hnRNPs).  Los  enhancers  exónicos  de splicing  (ESEs)  son  sitios de unión de  factores proteicos  ricos  en  serina y  arginina, conocidos como proteínas SR, a través de los cuales realizan su función activadora. 

 La identificación de las secuencias consenso de unión para factores reguladores 

de  splicing  (proteínas  SR)(Liu  et  al.  2000)  ha  permitido  la  generación  de  diferentes programas informáticos (ESEfinder (Cartegni et al. 2003), Rescue‐ESE, PESX) mediante los  cuales  se  pueden  predecir  los  posibles  ESE  de  una  secuencia  nucleotídica  a estudiar. Para validar el efecto que ejercen las mutaciones sobre el procesamiento del mRNA se hace necesario utilizar otras aproximaciones experimentales que impliquen la expresión de regiones discretas del DNA genómico y no sólo del cDNA, como son los  sistemas modelo  de  splicing  que  utilizan  vectores  apropiados  para  generar  los llamados minigenes (Clavero et al. 2004; Vockley et al. 2000).  

Cualquier cambio en las secuencias conservadas y reguladoras puede alterar el patrón de splicing. Se ha calculado que el 60% de  las mutaciones asociadas a splicing afectan a secuencias conservadas (sitios 5’ donador y 3’ aceptor de splicing, secuencia de  ramificación y  tracto polipirimidínico) y  el  40 %  afecta  a  secuencias  reguladoras (Krawczak  et  al.  1992).  En  los  últimos  años  se  han  definido  ciertas  mutaciones puntuales que afectan a secuencias reguladoras de splicing y en concreto a ESEs (exonic splicing  enhancers),  y  que  fueron  incorrectamente  clasificadas  como  mutaciones  de 

Page 41: Cristina Aguado Esteban

25

cambio  de  aminoácido,  mutaciones  nonsense  o  incluso  polimorfismos  silenciosos debido  a  la  ausencia  de  análisis  a    nivel  de  cDNA  (RT‐PCR)  y  a  la  utilización  de sistemas de expresión inadecuados    

Las  dos  consecuencias  más  comunes  de  las  mutaciones  de  splicing  son  el skipping exónico, eliminación de un exón que no se incluye en el mRNA maduro y la activación de sitios crípticos cuya consecuencia es la inclusión de secuencias aberrantes o  la eliminación de secuencias codificantes. La mayoría de  las mutaciones de splicing producen una secuencia madura de mRNA  con un codón prematuro de terminación, este  triplete  activa  un  sistema  de  degradación  presente  en  la  célula  (denominado sistema  nonsense mediated  decay  (NMD))  y  cuya  función  es  evitar  la  generación  de proteínas truncadas potencialmente tóxicas (Maquat 2004).  

 Algunas mutaciones de splicing impiden el reconocimiento exónico o producen 

la  inclusión  de  secuencias  aberrantes  en  el  total  de  los  transcritos  produciendo solamente  mRNA  aberrantes,  otras  mutaciones  sin  embargo  producen  transcritos correctamente  procesados  y  transcritos  aberrantes,  el  porcentaje  de  transcritos correctos e  incorrectos determinara  la severidad de  los fenotipos (Clavero et al. 2004; Lualdi et al. 2006). 

 El conocimiento de las consecuencias que cada mutación  produce en términos 

de  su  mecanismo  de  acción  a  nivel  de  DNA  y  mRNA,  ha  abierto  nuevas  y prometedoras  vías  terapéuticas  genéticas  en  estas  alteraciones  del  splicing.  La modulación  del  splicing,  que  permitirá  modificar  los  transcritos  incorrectamente procesados y por lo tanto alterar la expresión fenótipica de la mutación se puede llevar a cabo mediante: 

• Sobreexpresión de factores específicos de splicing o uso de drogas como butirato sódico,  kinetina,  valproico,  aclarubicina  que  favorecen  el  correcto procesamiento  de  los  transcritos.  (Andreassi  et  al.  2001;  Hims  et  al.  2007; Nissim‐Rafinia et al. 2004). 

• Uso  de  oligonucleótidos  antisentidos  (AONs)  que  son  pequeñas  cadenas  de análogos de deoxiribonucleotidos que hibridan con el mRNA complementario vía  apareamiento  de  bases  descrito  por  Watson  y  Crack  formando  los heteroduplex AONs‐mRNA.  Los mecanismos mediante  los  cuales  los AONs llevan  a  cabo  la  regulación  de  la  expresión  génica  incluyen  inducción  de  la actividad RNasa H  endonucleasa  que  degrada  el mRNA,  interferencia  de  la traducción por  impedimento estérico de  la actividad ribosomal e  interferencia de  la maduración  del mRNA  por  inhibición  del  splicing    (Kurreck  2003).  La terapia antisentido ha sido usada en  fibrosis cística y  la distrofia muscular de Duchene (Takeshima et al. 2006) para interferir el proceso de splicing y originar proteína funcional. 

Page 42: Cristina Aguado Esteban

26

                  

2. OBJETIVOS 

Page 43: Cristina Aguado Esteban

27

Los  objetivos  principales  de  este  trabajo  han  sido  el  análisis  de  los mecanismos moleculares  asociados  a  la  terapia  farmacológica  con  cofactores  y  el  ensayo  de terapias moduladoras de splicing en enfermedades metabólicas hereditarias. Para ello se establecieron una serie de objetivos específicos.  

1. Caracterización genética de pacientes fenilcetonúricos que responden in vivo al tratamiento con tetrahidrobiopterina. 

 2. Caracterización de los mecanismos moleculares (cinéticos, de estabilización y 

sobre  la  expresión  génica del  gen PAH)  asociados  a  la  respuesta  a BH4  en fenilcetonuria. 

 3. Caracterización  cinética de proteínas ATR mutantes  asociadas  a  respuesta  a 

cobalamina en acidemia metilmalónica aislada.  

4. Caracterización  del  efecto  de  distintas  concentraciones  de  biotina  sobre  la actividad, estabilidad y expresión génica de la propionil‐CoA carboxilasa y de la metilcrotonil‐CoA carboxilasa. 

 5. Estudio del efecto de drogas como posible  terapia aplicada a mutaciones de splicing que producen niveles detectables de transcritos normales en acidemia propiónica.  

 6. Estudio de la terapia antisentido en el contexto de mutaciones de splicing que 

producen activación de pseudoexones en acidemia propiónica. 

      

Page 44: Cristina Aguado Esteban

28

                  

3. MATERIALES Y MÉTODOS

Page 45: Cristina Aguado Esteban

29

3.1 MATERIALES  3.1.1Reactivos y aparatos  

Los reactivos químicos utilizados en este estudio fueron suministrados por:  Amersham  Pharmacia  Biotech,    Aldrich,  BiotechBio‐Rad  Laboratories,  Cambrex, Difco Laboratorios, Fluka, GibcoBRL, Merck, Panreac Quimica,  Perkin‐Elmer, Pierce, Pronadisa,  Promega,  Sigma,  Stratagene,  Roche Diagnostics,  Schircks  Laboratorios, Scharlau, DBH laboratorios.    La agarosa y la agarosa NuSieve®GTG® son de las casas comerciales Pronadisa y  Cambrex    y  la  acrilamida  y  bisacrilamida  de  Bio‐Rad.  La  (6R)‐L‐eritro‐5,6,7,8‐tetrahidrobiopterina  y  la  L‐sepiapterina  fueron  suministradas  por  Schircks Laboratorios.  La  3,3´‐Metilen‐bis(4‐hidroxicoumarina)(dicumarol),  la  kinetina,  el ácido valproico, el butirato sódico, la Actinomicina D y la Puromicina dihidroclorido fueron  adquiridos  de  Sigma.  El  2,4‐Diamino‐6‐hydroxypyrimidin  (DAHP)  fue  de Aldrich. La avidina conjugada con fosfatasa alcalina de Pierce.    

La mezcla   marcada radiactivamente L‐[35S]‐Met+ L‐[35S]‐Cys (PromixTM L‐[35S] in vitro cell labelling mix; >1000 Ci/mmol) y el isótopo radiactivo NaH[14C]O3, con una actividad  de  56 mCi/mmol NaHCO3  y  2 mCi/ml  fue  suministrada  por Amersham Pharmacia Biotech.   

Los  anticuerpos  utilizados  fueron  anticuerpo  monoclonal  comercial  anti‐tirosina, anti‐triptófano y anti‐fenilalanina hidroxilasa PH8 (Pharmingen), anticuerpo secundario de cabra anti‐ratón conjugado a peroxidasa (Nordic y Santa Cruz), Anti‐Flag M2  (Promega)  y  anticuerpo  secundario  antiratón  Ig  conjugado  a  peroxidasa (Santa Cruz).   

Los  tubos de  filtración  empleados para  concentrar  las muestras de proteína fueron obtenidos de Amicon.   

La cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) fue realizada usando los sistemas  suministrados por Shimadzu  (Serie VP) y Agilent Technologies  (Serie HP 1100), las columnas procedentes de Whatman y Agilent Technologies, y los reactivos de alto grado de pureza (analytical grade o HPLC grade) de Merck, Scharlau y DBH laboratories.  

 En  el  cultivo  celular  se  emplearon  los  siguientes  reactivos: medio mínimo 

esencial de Eagle (MEM) y glutamina de la firma comercial GibcoBRL, suero fetal de ternera recién nacida (NBCS), suero fetal bovino (FBS) y suero fetal bovino dializado (FBS dializado) de  SIGMA. Los  antibióticos  fueron  suministrados por Antibióticos 

Page 46: Cristina Aguado Esteban

30

S.A. La tripsina y los medios de comprobación se obtuvieron de Difco Laboratorios y la biotina de Sigma.       

Promega  e  Invitrogen  proporcionaron  los  productos  necesarios  para  la purificación  de  RNA  total.  La  purificación  de  productos  de  PCR  y  de  DNA plasmídico  a  baja  y  alta  escala  se  llevó  a  cabo  con  los  productos  de  las  casas comerciales Promega, Quiagen y Mbiotech. Las firmas comerciales GENTRA Systems, Promega,  Invitrogen proporcionaron  los productos  necesarios para  la  extracción de DNA genómico. 

Los  reactivos y enzimas   empleados en  las  reacciones de PCR, RT‐PCR, RT‐PCR tiempo real y mutagénesis dirigida fueron obtenidos de  las firmas comerciales Perkin‐Elmer, Applied Biosystem, Invitrogen, Roche y Stratagene. 

Las  reacciones  de  secuenciación  cíclica  directa  se  llevaron  a  cabo  con productos  de  Promega  y  Applied  Biosystems.  Los  oligonucleótidos  sintéticos proceden  de  la  firma  comercial  Isogen  y  los  oligonucleótidos  antisentido  tipo morfolinos fueron suministrados por la casa comercial GeneTools.  

Las  enzimas  de  restricción  fueron  proporcionadas  por  Roche  Diagnostics, New England Biolabs y Promega.     Los  reactivos de purificación de proteínas y  los utilizados para Western Blot son de las casas comerciales: Amersham Pharmacia Biotech, Millipore, New England Biolabs, Nordic Inmunology, Perkin Elmer, Pierce, Sigma y Stratagene.  3.1.2 Material biológico  Pacientes  

Se han incluido en el estudio 31 pacientes fenilcetonúricos españoles que han sido sometidos a pruebas de sobrecarga con BH4 en un estudio en colaboración con la Dra. Martínez‐Pardo (Hospital Ramón y Cajal). 

 El  estudio  del  efecto  de  compuestos  moduladores  de  splicing  incluyó  3 

pacientes  diagnosticados  de  acidemia  propiónica  y  correspondientes  al  grupo  de complementación PCCA,  los  tres de  origen  turco  enviados por  los Drs. Adrian C. Sewell, T. Parlowsky y Art. Warman, al laboratorio para su diagnóstico genético. 

El estudio del efecto de  la  terapia con oligonucleótidos antisentido  incluyó 2 pacientes   diagnosticados de acidemia propiónica, uno correspondiente al grupo de complementación  PCCA  y  el  otro  correspondiente  al  grupo  de  complementación PCCB, ambos de origen turco enviados por el Dr. Gülden Gokcay al laboratorio para su diagnóstico genético. 

Page 47: Cristina Aguado Esteban

31

 Las muestras de  los pacientes utilizados  incluyen fibroblastos de piel, sangre 

total periférica y/o muestras de sangre impregnada en papel.  Líneas celulares establecidas    

La  línea celular de hepatoma utilizado para este estudio  fue Hep 3B, cedida por el Dr. S. R. de Córdoba.   La  línea celular de  linfoblastos utilizada  fue MCR de European Collection of  Cell Cultures (ECACC).  Cepas bacterianas     Las  estirpes de E.  coli utilizadas  en  este  estudio  fueron  las  siguientes: XL1‐Blue, DH5α, JM109, TB1 y BL21 StarTM (DE3) One Shot Cell (Invitrogen)  Vectores plasmídicos 

   Los plásmidos utilizados en este estudio fueron: pMALc2‐PAH wt (De Lucca 

et al. 1998), R68S (Zekanowski et al. 2000) ,V388M (Gamez et al. 2000),  F39L, E178G, A300S,  A313T,  A373T  y  Y414C  (enviados  por  el  Dr.R.C.Stevens),  pFLAG‐CMV (Sigma), pET 41a‐hATR (enviado por la Dr. R. Banerjee),   pGL3‐ luciferasa y pCMV PRC β‐galactosidasa. 3.2 MÉTODOS  3.2.1 Tratamiento de ácidos nucleicos    Para  la  purificación  de DNA  plasmídico  se  empleó  el  sistema  comercial  de extracción de DNA plasmídico Wizard®Plus SV Minipreps DNA Purification system de Promega.  En  las  purificaciones  a  gran  escala  se  empleó  el  sistema  de  extracción QUIAGEN® Plasmid Maxi kit de Quiagen.    

Para la purificación de RNA celular se emplearon los sistemas comerciales de extracción  de  RNA  Promega®  SV  total  RNA  Isolation  System  y  Invitrogen  “TriPure Isolation Reagent”. 

 El proceso de retotranscripción (RT) se llevó a cabo a partir de 1 μg de RNA 

total, utilizando los reactivos suministrados por Invitrogen (SuperScriptTM First‐Strand Síntesis System for RT‐PCR) y siguiendo las recomendaciones del proveedor.  

Page 48: Cristina Aguado Esteban

32

  Para  la  amplificación  de  DNA  genómico  y  de  cDNA  obtenido  tras  RT, mediante el proceso de PCR se utilizaron  los  reactivos y  las  instrucciones descritas por  las  firmas  comerciales Perkin Elmer  (AmpliTaq® DNA polimerasa)  e  Invitrogen (Platinum® Taq DNA polimerasa). En las amplificaciones realizadas con los productos de Perkin Elmer, se añadió la enzima tras incubar la mezcla de amplificación durante 15 minutos a 95ºC  (hot start). Las reacciones de amplificación se llevaron a cabo en un volumen final de 100 μl  ó  50  μl,  con  una  concentración  de  MgCl2  de  1,5  mM,  100  pmoles  de  cada oligonucleótido, 2,5 U Taq polimerasa y entre 0,5‐1 μg de DNA genómico o 200‐500 ng de cDNA obtenido  tras RT. La  temperatura de hibridación osciló entre 48‐55 °C según  fuera  la  temperatura  de  fusión  o  melting  del  par  de  oligonucleótidos empleados en cada caso. 

Las  amplificaciones  se  llevaron  a  cabo  en un  termociclador Peltier Thermal Cycler PTC‐200 (MJ Research). 

 Los  fragmentos exónicos que comprenden  toda  la región codificante más  las 

regiones  intrónicas  adyacentes  a  cada  exón  (secuencias  consenso  donadoras  y aceptoras implicadas en el procesamiento del premRNA o splicing) y los fragmentos de  cDNA  de  los  distintos  genes  estudiados  fueron  amplificadas  usando  los oligonucleótidos descritos previamente en el laboratorio (Gravel et al. 1994; Ohura et al. 1993; Pérez et al. 1994; Richard et al. 1999). Para algunos fragmentos del cDNA del gen PAH se diseñaron nuevos oligonucleótidos (Tabla 6). 

Tabla 6: Oligonucleótidos utilizados en la amplificación del cDNA de PAH 

Nombre del  oligo  Secuencia 5´  3´ 

PCR  ( pb) 

cDNA PAHa ENSG00000171759 

 PAH 10  PAH 13  

GGTGCTGGGCTCCTGTCATC  CTCCATCAACAGATTCACAGCT 

377 1029‐1048 1384‐1405 

a  Se  muestra  la  localización  de  cada  oligonucleótido  en  la  secuencia  del  cDNA  PAH,  siendo  el nucleótido +1 la adenosina del ATG iniciador de la traducción. 

Para  la  purificación  de  los  fragmentos  obtenidos  tras  la  amplificación  se utilizó  el  kit  SpinCleanTM  PCR  Purification  (Mbiotech),  en  el  caso  de  que  la purificación se realizara a partir de los fragmentos en geles de agarosa se utilizó PCR Preps DNA Purificación Resin (promega) y QIAEX II Gel Extraction Kit (Qiagen).  

La secuenciación cíclica directa se  realizó empleando el producto Big DyeTM   Terminador  v3.1  Cycle  Sequencing  kit  (Applied  Biosystem)  junto  con oligonucleótidos  sintéticos  y  los  productos  de  secuenciación    se  analizaron  en  el secuenciador capilar ABI Prism ®3700 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). 

Page 49: Cristina Aguado Esteban

33

En  las  reacciones  de  secuenciación  de  productos  amplificados  por  PCR  se emplearon 300 ng de DNA. La secuenciación de productos amplificados por PCR se llevó  a  cabo  con  oligonucleótidos  de  igual  secuencia  a  los  empleados  en  las reacciones de amplificación.  

Para  la qRT‐PCR del mRNA de  la PAH y de PCCA se utilizaron  las sondas Taqman Hs00609359 y Hs01120554‐ml  respectivamente  suministradas por Applied Biosystems (Taqman Gene Expresión Assays, http://myscience.appliedbisyntesis.com ),  para  los mRNAs  de  PCCA,  PCCB, MCCA, MCCB  y HCS  se  utilizaron  sondas Universal  Probe  y  oligonucleótidos  específicos  diseñadas  usando  el  probeFinder Software (Universal Probe Library) de Roche Applied Science. La retrotranscripción se  llevó  a  cabo  con  el Archive  kit de Applied Biosystems  a una  concentración de síntesis  10 ng de RNA/μl y  siguiendo  las  recomendaciones del proveedor. Para  la  PCR  se  utilizó  la  TaqMan  2X  Universal  PCR  Master  Mix  No  Amperese  ONG (Applied Biosystems). 

La  amplificación  y  análisis  se  realizó  en un  aparato ABIPRISM  7900 HT    y utilizando el programa SPS2.1 o SDS software de Applied Biosystems. 

La  eficiencia  de  la  amplificación  fue  estandarizada  mediante  la retrotranscripción  y  posterior  amplificación  en  paralelo  del  mRNA  de  los  genes constitutivos GAPDH o 18s rRNA. 

Para  llevar  a  cabo  la  cuantificación, una vez obtenidos  los datos de  crossing point (Cp) o cycle threshold (Ct) de  la PCR a tiempo real tanto para el gen de  interés como para  los constitutivos se  llevó a cabo el  tratamiento matemático para obtener  finalmente  el parámetro  (RQ)  relative  quantity que nos permite  comparar de  forma cuantitativa  las  cantidades  de  mRNA  en  los  distintos  extractos  celulares,  siendo calculado según la siguiente fórmula: 

RQ = 2‐ ΔΔCt  ; ΔΔCt =  (ΔCt de una muestra ‐ ΔCt  la muestra de referencia) ΔCt = (Ct del gen de estudio ‐ Ct del gen constitutivo [GAPDH o 18s rRNA]) 

Para  la mutagénesis  dirigida mediante  el  proceso  de  PCR  se  utilizó    el  kit 

QuickChangeTMSite Directed Mutagenesis de Stratagene.  La mutación PAH A309V fue introducida en el vector pFLAG‐CMV que porta 

la secuencia del cDNA PAH con primers existentes previamente en el laboratorio.  Las mutaciones ATR I96T y R195H fueron obtenidas por mutagénesis dirigida 

a  partir  del  cDNA  wt  de  la  hATR  en  el  plásmido  pET  41a  utilizando  los oligonucleótidos que se detallan en la tabla siguiente. 

Page 50: Cristina Aguado Esteban

34

Tabla  7: Oligonucleótidos  sintéticos diseñados para  la mutagénesis dirigida del cDNA  MMAB  clonado en el vector pET 41a 

a La base que introduce la mutación en la reacción de mutagénesis dirigida se muestra en negrita. b Se muestra la localización de cada oligonucleótido en la secuencia del cDNA, siendo el nucleótido +1 la adenosina del ATG iniciador de la traducción. 

Para  el  clonaje  del  cDNA  de  la  PAH  en  el  vector  pFLAG‐CMV  y  de  las regiones reguladoras de transcripción y traducción de la PAH en el vector pGL3 las dianas escogidas fueron NotI y SalI en el primer caso y SacI y HindIII en el segundo. Estas dianas fueron creadas mediante PCR a partir de DNA genómico o cDNA de la PAH  clonado  en  el  plásmido  pMALc2‐PAH  utilizando  oligos  que  contenían  la  secuencia de corte para cada enzima y cuya secuencia se describe en  la Tabla 8. De esta manera  se  obtuvieron  los mutantes  para  PAH  Y414C  y  V388M  en  el  vector pFLAG‐CMV y la construcción pGL3‐PrUTRPAH en el vector pGL3. 

Tabla  8:  Oligonucleótidos  sintéticos  diseñados  para  el  clonaje  de  la  región codificante  del  cDNA  de  la  PAH  y  las  regiones  reguladoras  de  transcripción  y traducción de la PAH. 

Nombre del oligo 

Secuencia 5´  3´ cDNA PAHa 

ENSG00000171759 

cPAH1 cPAH2 

TTTTGCGGCCGCGATGTCCACTGCGGTCCTGG AAAAGTCGACGGCTTTACTTTATTTTCTGGAG 

+1/+19 +1341/+1361 

 PrPAH1   PrPAH5  

TAAAGAGCTCTTAAAACCTTCCAGCAAGGT TTTAAGCTTCTGGCTCCCCGGGAGT 

‐731 / ‐710 ‐2 / ‐17 

a  Se  muestra  la  localización  de  cada  oligonucleótido  en  la  secuencia  del  cDNA  PAH,  siendo  el nucleótido  ‐1 el primer nucleótido previo a la   adenosina del ATG  iniciador de  la traducción y +1 el nucleótido A del ATG iniciador de la traducción.   

Mutación Nombre del 

oligo  Secuencia 5´→ 3´ a cDNA MMABb 

ENSG00000139428 

I96T MMAB I96Tsense MMAB I96Tantisense 

AGTTCAGCTACTGGGTTTGCTCTG CAGAGCAAACCCAGTAGCTGAACT 

277‐290 290 ‐277 

R195H MMAB R195Hsense MMAB R195Hantisense 

GCCGAGAGACATGTGGTGCCTCTTG CAAGAGGCACCACATGTCTCTCGGC 

574‐598 598‐574 

Page 51: Cristina Aguado Esteban

35

3.2.2 Electroforesis en geles con gradiente de desnaturalización (DGGE)  El  rastreo  inicial de mutaciones  en  el gen de  la PAH  se  realizó mediante  la 

técnica  de  electroforesis  con  gradiente  de  desnaturalización  (DGGE)  según  se describe  en  (Pérez  et  al.  1997).  Esta  técnica  está  basada  en  las  propiedades  de desnaturalización del DNA, determinadas por  su  secuencia,  que permiten  separar moléculas de DNA que difieren en una sola base nucleotídica debido a su diferente migración  electroforética en geles  con gradiente de desnaturalización  (Lerman and Silverstein 1987). 

La  amplificación  se  llevó  a  cabo  utilizando  primers  con  colas  GC  en  su extremo  5’  ó  3’  terminal previamente descritos  y  la  electroforesis  se desarrolló  en geles de poliacrilamida al 6 % con un gradiente de desnaturalización del 0 % al 80 % de urea‐formamida, en los que el 100 % corresponde a una concentración de urea 7 M y 40 % de formamida. La electroforesis se realizó a 150 V durante 5 h en TAE (0,04 M Tris‐acetato, 1 mM EDTA, pH 8) a una temperatura constante de 60 °C en un aparato de la casa CBS Scientific CO. 

La presencia de varias bandas debidas a la formación de heteroduplex indica la  presencia  de  mutaciones  que  fueron  posteriormente  identificadas  por secuenciación.  3.2.3 Expresión y purificación de proteínas en E. coli  Expresión y purificación de la proteína de fusión MBP‐PAH    

La expresión y purificación de la proteína de fusión MBP‐PAH se llevó a cabo esencialmente siguiendo el protocolo descrito por (Martínez et al. 1995). A lo largo de todo el proceso de purificación se empleó un tampón Hepes 20 mM   NaCl 200 mM pH 7.0 (Na‐Hepes).  

El  cultivo de  las  cepas de E.  coli  transformadas  con  los plásmidos pMALc2‐PAH  normal  y mutantes  se  realizó  en medio  LB  en  presencia  de  ampicilina  (0,1 mg/ml). Cuando estos cultivos alcanzaron una A600nm≈ 0.6, se indujo la expresión de las  proteínas MBP‐PAH  normal  y mutantes, mediante  la  adición  de  IPTG  1 mM, adicionándose  también  0,2 mM de  sulfato  amónico  ferroso  (FAS)  como  fuente del cofactor metálico necesario para la actividad PAH.   Tras  ser  incubados  los  cultivos  a  37ºC  durante  16‐21  h,  las  células  fueron sedimentadas por centrifugación, resuspendidas en  tampón Na‐Hepes en presencia de  0,2 mM  Pefabloc®  (como  inhibidor  de  proteasas)  y  posteriormente  lisadas  por sonicación.  El  extracto  proteico  soluble  fue  obtenido  tras  centrifugación.  Las proteínas  de  fusión  totales  (MBP‐PAH)  normal  y  mutantes  fueron  purificadas mediante cromatografía de afinidad en columnas de amilosa (New England Biolabs), equilibradas en  tampón Na‐Hepes. La elución se realizó empleando una disolución 10 mM  de maltosa  en Na‐Hepes.  Las  proteínas  de  fusión  totales  así  obtenidas  se 

Page 52: Cristina Aguado Esteban

36

mantuvieron a 4ºC hasta su utilización o fueron congeladas inmediatamente después de la purificación en N2 líquido y almacenadas a ‐80ºC.  La  separación  de  las  distintas  formas  oligoméricas  para  obtener  la  forma tetramérica presente en  la proteína de  fusión  total  (MBP‐PAH) purificada de E. coli fue  realizada  mediante  cromatografía  de  exclusión  molecular  a  4ºC  usando  la plataforma integrada AKTA®PRIME (Amersham Pharmacia Biotech) para desarrollar y monitorizar la separación cromatográfica.      El  desarrollo  cromatográfico  se  realizó  a  4ºC,  empleando  como  fase móvil tampón Na‐Hepes  previamente  desgasificado,  usando  un  flujo  de  0,38 ml/min,  el volumen de muestra aplicado  fue de 2 ml,  tomándose  fracciones del eluido cada 5 min  (≈ 1,9 ml/fracción). La detección se  realizó espectrofotométricamente a 280 nm usando  una  célula  de  flujo  continuo.  Una  vez  eluida  la  forma  tetramérica,  las fracciones  correspondientes  (según  indicó  la  señal  espectrofotométrica  registrada) fueron concentradas usando  tubos CENTRIPLUS YM‐50  (Amicon) y congeladas en N2 líquido, almacenándose posteriormente a ‐80ºC hasta su utilización.  

La  concentración  de  proteína  total  de  las  proteínas  de  fusión  totales purificadas  se  determinó  siguiendo  el  método  de  Bradford  (Bradford  1976) empleando  el  reactivo  Bio‐Rad  Protein  Assay  (Bio‐Rad).  En  el  caso  de  las  formas tetraméricas purificadas de la proteína de fusión (MBP‐PAHtet), la concentración de proteína se determinó espectrofotométricamente a 280 nm empleando ε =1,6 (ml.mg‐1.cm‐1) para  la MBP‐PAHtet. Para  la  cuantificación de  concentraciones  en mol/l,  se empleó como peso molecular 92,3 kDa para la subunidad de MBP‐PAHtet.    Expresión y purificación de la proteína hATR.  

La expresión y purificación de la proteína ATR se llevó a cabo esencialmente siguiendo el protocolo descrito por (Leal et al. 2004). 

La proteína hATR se expresó en la cepa de E. coli BL21 StarTM (DE3) One Shot Cell (Invitrogen) a partir del plásmido pET 41a que tiene el cDNA de  la ATR sin el péptido mitocondrial. La cepa E. coli  fue crecida en LB suplementado con 30‐60 mg/L de kanamicina a 37ºC y con agitación a 275 rpm. Cuando el cultivo alcanzó A600nm≈ 0,6  se  indujo  la  expresión de  la proteína mediante  la adición 1mM de  IPTG a una temperatura de 25ºC o 37ºC durante 3‐5 horas. Una vez transcurridas las 3‐5 horas las células fueron recogidas por centrifugación a 6000 K durante 10 minutos, pesadas y guardadas a ‐70ºC durante al menos 12 horas.  

El pellet celular congelado se resuspendió a una concentración 0,25 mg/ml en  buffer 50 mM fosfato de potasio (KPB) (pH: 8), 100‐300 mM NaCl, 1 mM DTT, 1 mM PSMF, 1 mM EDTA, 0,05 mg/ml DNAse I, 0,3 mg/ml lisozima durante 1 hora a 4ºC 

Page 53: Cristina Aguado Esteban

37

con  agitación.  El  homogenado  obtenido  fue  sonicado  durante  10 minutos  con  la secuencia 10´´ sonicación (p=5) y 20´´ descanso. El extracto celular crudo fue centrifugado a 18000 K durante 1 hora, el sobrenadante obtenido tras la centrifugación se diluyó en buffer 50 mM fosfato de potasio (pH=8), 1 mM DTT y 300 mM KCl. Se determinó la cantidad de proteína siguiendo el método de Bradford.  

Una vez diluido el extracto a una concentración de 1mg/ml se  añadió un 22% (p/v) de sulfato de amonio para producir la primera precipitación, se dejó a 4ºC con agitación  durante  7‐12  horas,  tras  este  tiempo  se  centrifugó  a  8000K  durante  una hora, el sobrenadante se recogió y en frío y con agitación se le añadió un 11% (p/v) de sulfato de amonio para producir la segunda precipitación, una vez disuelto el sulfato se  quitó  la  agitación  y  se  mantuvo  durante  16  horas  a  4º,  posteriormente  se  centrifugó a 8000K durante una hora, el sobrenadante se descartó y el precipitado, donde se encuentra la hATR, se diluyó sin agitación ni pipeteo en 5‐10 ml de Tris 10 mM pH:8, DTT 1 mM.  

Una vez resuspendido el segundo precipitado se eliminó el sulfato de amonio mediante diálisis, para ello se utilizó una membrana de diálisis 5,1 ml/cm. en cuyo interior se pusieron las proteínas resuspendidas, la membrana se metió en 5L de Tris 10 mM pH: 8, DTT 1 mM durante 12 horas en agitación y en cámara fría. Al día siguiente se cambiaron  los 5L por otros 3L nuevos del mismo buffer, Tris 10 mM pH:8, DTT 1 mM y se volvió a dejar al menos 12 horas en agitación.  

Una vez eliminado el sulfato de amonio se filtró la proteína con un filtro 0,45 μM y se introdujo en una columna de sefarosa Q (previamente equilibrada con Tris 10 mM pH: 8) para llevar a cabo una cromatografía de intercambio aniónico.  

El desarrollo cromatográfico se realizó a 4ºC, empleando como fase móvil un gradiente Tris 10 mM pH:8, DTT 1 mM KCl 20 mM hasta Tris 10 mM pH: 8, DTT 1 mM KCl  220 mM y  tomándose  fracciones del  eluido de  12 ml  con un  colector de fracciones.  

La  concentración  de proteína  total de  las  fracciones  obtenidas  se determinó siguiendo  el  método  de  Bradford.  Para  seleccionar  las  fracciones  en  las  que  se encontraba  la ATR  se  realizó  electroforesis  SDS‐PAGE  con  las  fracciones  con  una mayor concentración de proteína.  

Posteriormente con las fracciones en las que se detectó la ATR se llevó a cabo cromatografía de exclusión molecular utilizando una columna de hidroxiapatita para obtener una mayor purificación de la proteína. El desarrollo comatográfico se realizó a 4ºC y se utilizó como fase móvil un gradiente desde 10 mM KPB pH: 8, KCl 5 mM 

Page 54: Cristina Aguado Esteban

38

hasta  400 mM  KPB  pH:  8.,  KCl  5 mM  Las  fracciones  obtenidas  con  un  colector automático fueron de 7 ml.   

La  concentración  de  proteína  total  de  las  fracciones  obtenidas  tras  esta cromatografía también se determinó siguiendo el método de Bradford. 

Las fracciones con la hATR se concentraron mediante columnas Amicon para obtener una concentración de 10 μg/μl  3.2.4 Cromatografía en gel   

Para estudiar el estado de oligomerización de la hATR wt y mutante se utilizó una  columna Superdex  200  (1,2cm  x  92cm)  con un  flujo  2,0 ml/min buffer  50 mM Tris‐HCl  pH:8  con  100  mM  KCl.  Se  utilizaron  estándares  para  calcular  la  masa molecular  de  la  proteína  (molecular  standard  marker  (Biorad)).  La  cantidad  de proteína utilizada fue de 100μg. 

  

3.2.5 Electroforesis, transferencia  y detección de proteínas  Electroforesis, transferencia e  inmunodetección de la proteína PAH  

La  transferencia  e  inmunodetección  de  la  proteína  PAH  y  de  las  proteínas FLAG‐PAHwt y mutantes procedentes de hepatoma se realizó sometiendo 50‐300 μg de los extractos proteicos solubles (obtenidos por congelación‐descongelación de los precipitados celulares resuspendidos en el buffer Na‐Hepes 20 mM con Pefabloc 0,2 mM) a electroforesis discontinua en gradiente desnaturalizante  (SDS‐PAGE)  (Davis 1964; Laemmli 1970; Ornstein 1964) 

La proteínas  separadas por SDS‐PAGE,  fueron  transferidas a membranas de nitrocelulosa (Western blot) y detectadas mediante tinción con Rojo Poinceau (Harlow and Lane 1988). La  inmunodetección de proteínas se  realizó utilizando anticuerpos monoclonales comerciales anti‐tirosina, anti‐triptófano y anti‐fenilalanina hidroxilasa (PH8; Pharmingen) de  ratón y para  las proteínas de  fusión Flag‐PAH  se utilizó  el anticuerpo  primario  Antiflag  M2  (Sigma),  y  como  anticuerpos  secundarios, anticuerpos  de  cabra  anti‐ratón  GAM/Ig  (Nordic  y  Santa  Cruz)  conjugados  a peroxidasa, ambos anticuerpos a una dilución 1/5000  (V/V). La visualización de  los complejos  formados  se  llevó  a  cabo  mediante  el  desarrollo  de  una  reacción quimioluminiscente en presencia del reactivo ECL™ (Amersham Pharmacia Biotech) durante 1 min y posterior impresión de una película fotográfica durante 1 min. para las proteínas FLAG‐PAH y entre 15 y 30 min. para la PAH endógena del hepatoma.    La  cuantificación  de  los  niveles  de  proteína  inmunorreactiva  se  realizó mediante densitometría láser, utilizando el densitómetro Bio‐Rad GS‐710 Calibrated Imaging Densitometer (Bio‐Rad). 

Page 55: Cristina Aguado Esteban

39

  Electroforesis, transferencia y detección de la proteína α‐PCC mediante marcaje con avidina conjugada a fosfatasa alcalina.  

Para la detección de la proteína α‐PCC las mitocondrias de fibroblastos fueron aisladas  por  homogenización  y  centrifugación  diferencial  a  4°C  en  una  solución 25mM sacarosa, 10 mM Tris‐HCl, 2 mM EDTA pH 7,4 y 0,2 mM PMSF, siguiendo el protocolo descrito por (Bergman et al. 1989) y posteriormente  resuspendidas en 20‐50 μl de una solución 25 mM sacarosa, 10 mM Tris‐HCl y 2 mM EDTA pH 7,4. La determinación  de  la  concentración  de  proteínas  se  llevó  a  cabo  mediante cuantificación  por  el método  de  Bradford.  La misma  cantidad,  25‐100  μg  de  las fracciones mitocondriales fue sometida a SDS‐PAGE. 

    Tras  la  electroforesis,  las  proteínas  procedentes  de  las  fracciones mitocondriales fueron transferidas a membranas de PVDF (Immobilon™‐P, Millipore) según el protocolo descrito por (Baumgartner et al. 2001a). La transferencia se realizó empleando una  solución  24 mM Tris base,  192 mM glicina,  20% metanol  según  el protocolo descrito por  (Towbin et al. 1979), en el aparato Mini Trans‐Blot Transfer Cell (Bio‐Rad). Una vez finalizada, la membrana fue sometida a tres lavados de 5‐10 minutos en PBS y bloqueada durante al menos una hora en una solución PBS‐BSA 2%  (p/v).  Una  vez  bloqueada  la  membrana,  se  incubó  durante  1  hora  con  una solución de PBS/BSA 0,3 %  (p/v) a  la que  se había añadido avidina  conjugada  con fosfatasa alcalina (Pierce) en una proporción 1:1000. Tras tres lavados sucesivos de 5 min. en PBS, se procedió al revelado de la membrana por adición del sustrato 1‐Step™ NBT/BCIP de la firma comercial Pierce y posterior desarrollo colorimétrico.   3.2.6 Ensayos enzimáticos  Actividad fenilalanina hidroxilasa    Para determinar  la actividad específica PAH en  la  fracción  tetramérica de  la proteína de  fusión purificada  (MBP‐PAHtet) y  en  extracto  celular de hepatoma  se cuantificó la L‐Tyr formada a partir de L‐Phe en los ensayos mediante la separación de  ambos  aminoácidos  por  cromatografía  líquida  de  alto  rendimiento  (HPLC)  y detección fluorimétrica.      En los extractos celulares de hepatoma se eliminaron los aminoácidos antes de llevar a cabo el ensayo de actividad utilizando los filtros ULTRAFREE®‐ MC 10,000 NMWL Filter Unit.  (Amicon) y  la concentración de proteína se determinó siguiendo el método de Bradford.  

Page 56: Cristina Aguado Esteban

40

La mezcla de reacción, conteniendo 0,15‐1 μg de MBP‐PAH y de MBP‐PAHtet ó  5‐10  μg  extracto  celular  de  hepatoma  en Na‐Hepes  a  pH  7.0,  en  presencia  de catalasa  (0,04 mg/ml),  albúmina  de  suero  bovino  (0,5 mg/ml)  y  L‐Phe  1 mM,  fue incubada  durante  4  min  a  25ºC,  adicionándose  posteriormente  sulfato  amónico ferroso 100 μM, y tras 1 min de incubación, se inició la reacción mediante la adición de BH4 75 μM en DTT 5 mM, en un volumen final de 50 μl. La reacción se desarrolló durante 1 min a 25ºC en el  caso de MBP‐PAHtet y durante 30 min. en el  caso del extracto  de  hepatoma  y  se  detuvo  usando  3  volúmenes  de HClO4  12%  (V/V)  frío (método de (Allen et al. 1999)). La mezcla final se incubó a 0ºC durante al menos una hora y a ‐20ºC durante una noche, después se centrifugó durante 15 minutos en una centrífuga  de  mesa  y  el  sobrenadante  se  almacenó  a  ‐20ºC  para  ser  aplicado posteriormente en el HPLC. En algunos experimentos, en  lugar de preincubarse  la proteína  con L‐Phe 1 mM,  ésta  se adicionó  junto al BH4 al  iniciar  la  reacción. Los blancos de reacción se determinaron adicionando H2O (en  lugar de L‐Phe) o DTT 5 mM  (en  lugar de BH4). Para determinar  la  velocidad máxima  (Vmax)  y  la  afinidad aparente  (Km)  por  BH4,  se  realizaron  los  ensayos  de  actividad  en  ausencia  de preincubación  con  L‐Phe,  iniciándose  la  reacción  con  1  mM  L‐Phe  y  distintas concentraciones de BH4 (2,5‐200 μM), mientras que la Vmax, la afinidad aparente (S0,5) y  cooperatividad  (índice de Hill,  h) por L‐Phe  se determinaron  en  condiciones de preincubación con L‐Phe (5‐4000 μM) e iniciándose la reacción con 75 μM BH4.  

 Los niveles de L‐Tyr formada durante  los ensayos se determinaron mediante 

la separación de los aminoácidos por HPLC, según el método descrito por (Allen et al. 1999). Se utilizó una columna de matriz hidrofóbica  (Eclipse®XDB 250 x 4.6 mm Zorbax®XDB‐C18  de Agilent  Technologies)  equilibrada  en  5%  acetonitrilo  (V/V)  en H2O y desarrollándose la separación cromatográfica en condiciones isocráticas a 25ºC durante 10 min, siendo  los tiempos de retención de ~3,9 min para L‐Tyr y ~6,8 min para L‐Phe. El volumen de muestra aplicado fue de 50 μl. La detección de L‐Phe y L‐Tyr  se  realizó  usando  un  detector  fluorimétrico,  con  una  λexcitación=  274  nm  y λemisión=304 nm. La determinación de  la  concentración de L‐Tyr  formada  se  realizó interpolando  las  señales  obtenidas  para  las  muestras  en  una  recta  de  calibrado generada usando patrones de L‐Tyr pura  (preparada  inicialmente  en HCl  0.1 N y titulada usando λ275nm= 1400 M‐1 ∙ cm‐1), procesados de idéntica manera a las muestras en cada método.    Actividad ATP:cob(I)alamina adenosiltransferasa   

Los  ensayos  enzimáticos  para  la ATR  fueron  llevados  a  cabo  siguiendo  el protocolo descrito en (Johnson et al. 2001) con algunas modificaciones.  La mezcla de  reacción utilizada contenía 200 mM Tris  (pH:8), 1,6 mM KH2PO4, 2,8 mM MgCl2, 100 mM KCl, 0,4 mM ATP y 80  μM  (Cob(II)alamina o OHcobalamina (Sigma)). La mezcla de reacción (800 μl) se introdujo en cubetas de metacrilato y se 

Page 57: Cristina Aguado Esteban

41

empezó a monitorizar la absorbancia a 388 nm y 37ºC, cuando la línea fue estable se añadieron  10  μl de  ácido Ti(III)citrato, una vez  estabilizada  la  línea por ultimo  se añadieron 10‐100 μg de proteína y se observó  la disminución de  la absorbancia. El análisis matemático para el cálculo  las actividades a partir de  las gráficas obtenidas se llevó a cabo utilizando el programa informático IGOR Pro6 (WaveMetrics Inc.). 

Tanto la mezcla de reacción, la proteína y el ácido Ti(III)citrato se prepararon en condiciones anaeróbicas. 

Los  ensayos  enzimáticos de  la  actividad  realizados  con  el mismo protocolo anteriormente  descrito  pero  utilizando  50  μM  Cob(II)alamina  y  diferentes concentraciones  de ATP  (entre  0‐0,2 mM)  permitió  el  cálculo  de Km  y Vmax  por ATP. El programa  informático con el que se realizaron  los análisis matemáticos  fue también IGOR Pro6(WaveMetrics Inc.).  

Para  calcular  la  Kd  para  los  distintos  análogos  de  Cob(II)alamina    se pusieron 3 ml de buffer Tris 50mM pH: 8    en una  cubeta de  cuarzo y  se midió  la fluorescencia ( λexcitación= 280 nm y λemisión=340 y un  tiempo de integración de 2 min). A continuación  se  añadieron  entre  40‐150  μg  proteína  y  se  volvió  a  medir  la fluorescencia, se fueron añadiendo 1‐ 10 μl del análogo (concentración entre 2‐7 mM) midiéndose la fluorescencia tras cada adición. El programa informático con el que se realizaron los análisis matemáticos fue también IGOR Pro6 (WaveMetrics Inc.). 

  Para calcular la Kd por Cob(II)alamina, se midió en una cámara anaeróbica el 

espectro desde 300 nm hasta 750 nm de la proteína ATR a una concentración de 2μM en  el  buffer  Tris  50mM  pH:  8,  posteriormente  se  añadió  Cob(II)alamina  a  una concentración  final  10μM  y  se  volvió  a medir  el  espectro  con  el mismo  rango  de absorción. El experimento se repitió a distintas concentraciones de proteína hasta un máximo de  100  μM. Posteriormente  se  llevo  a  acabo  el  análisis matemático de  los espectros con el programa informático IGOR Pro6 (WaveMetrics Inc.).   Actividad propionil‐CoA carboxilasa y metilcrotonil‐CoA carboxilasa     La medida de  la actividad PCC y MCC se realizó en  fibroblastos cultivados. Los  fibroblastos  fueron  recogidos por  tripsinización  y  resuspendidos  en un  buffer Tris‐HCl 20 mM, glutation 0,025 % (p/v). Posteriormente, se sometieron a tres ciclos sucesivos  de  congelación/descongelación  en  N2  líquido  y  a  una  centrifugación posterior 5 min. a 13000 rpm, para obtener el extracto celular total.    La  determinación  de  las  actividades  enzimáticas  PCC  y  MCC  se  realizó siguiendo  el protocolo descrito por  (Suormala  et  al.  1985). Cada  ensayo  se  llevó  a cabo en un volumen  final de 200 μl, en  la siguiente mezcla de  reacción: 20 μmoles Tris‐HCl  pH  8.0,  0,15  μmoles  DTT,  0,628  μmoles  Na2‐ATP.3H2O,  1,2  μmoles MgCl2.6H2O, 20 μmoles KCl, 5% (v/v) Triton X‐100, 0,2 μmoles propionil‐CoA o 0,2 

Page 58: Cristina Aguado Esteban

42

μmoles 3‐metilcrotonil‐CoA y 8 μmoles NaHCO3.   El  isótopo radiactivo NaH[14C]O3 (Amersham  Pharmacia  Biotech)  utilizado  tenía  una  actividad  de    56  mCi/mmol NaHCO3 y 2 mCi/ml,  fue suministrado a  la  reacción en una proporción de 1, 2 ó 3 μCi/ μmol NaHCO3.   

La reacción enzimática comenzó al añadir 20 μl del extracto proteico celular y se  llevó a  cabo a 30°C durante 20 minutos  con agitación. La parada de  la  reacción enzimática  tuvo  lugar por  la  adición de  140  μl de TCA  30%  (p/v)  y  las proteínas precipitadas  se  separaron  por  centrifugación  a  14000  rpm  durante  15  min.  El sobrenadante  fue  transferido  a  un  vial  de  centelleo  y  sometido  a  evaporación    a totalidad a temperatura ambiente, siendo posteriormente resuspendido en 500 μl de agua miliQ. Posteriormente  se  añadieron  a  cada  vial  5 ml de  líquido de  centelleo Optiphase Hisafe  2  (Perkin  Elmer)  y  se  procedió  a  la  determinación  de  cpm  en  el contador 1209 Rackbeta Liquid Scintillation Counter (Wallac).  

La cuantificación de proteínas totales en los extractos proteicos se llevó a cabo según el método descrito por (Lowry et al. 1951).   

Las actividades específicas residuales PCC y MCC se expresaron en unidades de pmoles [14C]O2 incorporado/min/mg proteína total.   3.2.7 Síntesis in vitro  y pulso caza de las proteínas PAH     La  expresión  in vitro de  las proteínas PAH  se  realizó  empleando  el  sistema comercial  TnT‐T7  Quick  Coupled  Transcription/Translation  System  de  Promega siguiendo las instrucciones del proveedor.    El cDNA de la PAH se amplificó mediante PCR utilizando como molde 100 ng de  los plásmidos   pRc/CMV‐PAH o pMALc2‐PAH wt y mutantes, empleando para ello el oligonucleótido T7‐PAH que introduce el promotor de la RNA polimerasa T7 y  la  secuencia  consenso  Kozak  próxima  al  ATG  iniciador  (Kozak  1984)    y  el oligonucleótido 13B, según se describe en (Gamez et al. 2000).    

El experimento de pulso‐caza llevado a cabo para estudiar la vida media de la PAH en presencia/ausencia de BH4, se desarrolló en presencia de L‐[35S]‐metionina y L‐[35S]‐cisteína  según  se describe  en  (Gamez  et al. 2000). La  reacción de  síntesis  se desarrolló a 30ºC durante 35 minutos, tras los cuales el proceso de síntesis se detuvo añadiendo RNAsa A  (1 mg/ml) y DNAsa  I  (1 mg/ml). En  este punto  se obtuvo  la alícuota (10 μl) correspondiente a la síntesis y tiempo cero. El resto de la reacción se incubó a 37  ºC y  se  tomaron alícuotas  (10  μl)  cada hora  tras  la  síntesis hasta  las 7 horas. Las muestras  se  congelaron a  ‐20ºC hasta  su utilización. Para  cada proteína PAH se realizaron en paralelo  los experimentos en presencia y ausencia de 500 μM 

Page 59: Cristina Aguado Esteban

43

BH4  en  la mezcla  de  síntesis.  Las  diferentes  alícuotas  fueron  desnaturalizadas  y analizadas  posteriormente  mediante  SDS‐PAGE.  Las  proteínas  marcadas radiactivamente  fueron  visualizadas  por  fluorografía  y  cuantificadas  por densitometría  láser de  las   películas  fotográficas  (Gamez et al. 2000) Los resultados fueron ajustados a una función de decaimiento exponencial.   

3.2.8 Cultivo celular.    Las células de hepatoma, fibroblastos y LB  fueron cultivadas en botellas de 75 cm2  y  en  placas  estandarizadas  de  6  pocillos  (P6)  a  37°C  en  una  atmósfera  de humedad  relativa  del  95%  y  CO2  5%,  utilizando  como  medio  de  cultivo  MEM suplementado con glutamina 2 mM, suero al 10% (v/v) y una mezcla de antibióticos.       Los  sueros  utilizados  fueron  suero  fetal  bovino  (FBS),  suero  fetal  bovino dializado y suero de ternera recién nacida (NCBS).      Las  células  fueron  recogidas  con  una  solución  de  tripsina‐EDTA  y sedimentadas mediante centrifugación.    Se  realizaron  controles  de  contaminación  de  reactivos, medios  de  cultivo  y cultivos celulares de forma sistemática durante todo el estudio.   Expresión transitoria en células eucariotas Hep3B 

 Para  el  análisis  del  efecto  de  la  sepiapterina  sobre  la  transcripcion  y 

traducción de  la PAH   se sembraron 5x105 células Hep3B por pocillo en placas P6, después de 24 horas se cotransfectaron los plásmidos pGL3UTRPrPAH y pRCCMV‐βgal (como estándar interno para montorizar la eficiencia de la transfección) según el protocolo  descrito  por  la  casa  comercial  para  el  Jet  PEI.  5  horas  después    de  la transfección  se  cambió  el medio  por medio  control  o    con  sepiapterina  100  μM  (filtrada con  MILLEX®GS filter 0,22 μm) y 48 horas después se recogieron las células por centrifugación y se resuspendieron en 180 μl de buffer (Reporter lysis buffer del kit luciferase Assay System de Promega®) con 0,2 mM de pefabloc y se sometió a 2 ciclos de congelación/descongelación  en  N2  líquido.  Los  extractos  proteicos  solubles  se recuperaron  por  centrifugación  de  las  células  lisadas. A  partir  de  estos  extractos proteicos  se  procedió  a  la  medida  de  la  actividad  luciferasa  con  20  μl  de  cada muestra,  utilizando  para  ello  un  luminómetro  Monolight  2010  (Analytical Luminescence  Laboratory),  siendo  la  luciferina  del  kit  (luciferase  Assay  System  de Promega®) el sustrato de la reacción.  

La medida de  la  actividad β‐Galactosidasa  (Nielsen  et  al.  1983)  sirvió  como control de la eficiencia de la transfección   

Page 60: Cristina Aguado Esteban

44

Para  el  estudio  de  expresión  transitoria  de  la  proteína  FLAG‐PAH  wt  y mutantes se sembraron de 4‐5x106 células de Hep3B en botellas T75, después de 24 horas se  transfectaron según el protocolo descrito por  la casa comercial para el    Jet PEI,  10 μg de plásmido  pFLAG‐CMVPAH normal o mutantes y 20 μl de Jet PEI. A las  5 horas  se    cambió  el medio por medio  control o  con  sepiapterina  100  μM,  48 horas  después  se  recogieron  las  células  y  tras  su  lisis  mediante  congelación‐descongelación se utilizaron para experimentos de Western blot.  Transfección de oligonucleótidos antisentido tipo morfolinos en fibroblastos.  

La secuencia de los oligonucleótidos tipo morfolinos (GeneTools) utilizados en la modulación de splicing se muestra en la siguiente tabla.  Tabla  9:  Oligonucleótidos  tipo  morfolinos  diseñados  para  la  modulación  del splicing en los genes PCCA y PCCB. Nombre del 

oligo Secuencia 5´  3´  Gen diana 

Ins84PCCA  CACAGTGTTGACAAAAACTAGAAAA PCCA 

ENSG00000175198 

Ins72PCCB  TCATGTAATAAAGATATGTACCTCT PCCB 

ENSG00000114054   

Los  fibroblastos del paciente  fueron cultivados en placas estandarizadas   P6, 5x105 células por pocillo, 24 horas después de la siembra se añadió el oligonucleótido antisentido (AON) a una concentración final en el medio de 10 μM ó 20 μM. Para la transfección del AON se utilizó Endo‐Porter (Gene Tools) a una concentración final de 6 μM. El tiempo de cultivo tras la adición del Endo‐Porter y el AON fue de 48‐72 horas, tras este tiempo se recogieron las células y se guardó el precipitado celular a ‐70º hasta su utilización.  

3.2.9 Medida de pterinas  

El análisis de pterinas en el extracto celular de hepatoma  fue  llevado a cabo usando  HPLC  con  columna  modelo  HP1100  de  Agilent  technologies  y  con  un detector  de  fluorescencia.  La  preparación  de  las  muestras  se  hizo  siguiendo  el método de (Fukushima and Nixon 1980) y la monitorización fluorimétrica se realizó usando un detector fluorimétrico, con una λexcitación= 360 nm y λemisión=440 nm.  

Page 61: Cristina Aguado Esteban

45

3.2.10 Soporte informático  Los ajustes a  las ecuaciones de Michaelis‐Menten  (para determinar Vmax y Km 

por BH4) y de Hill (Vmax, S0,5 y h por L‐Phe) se realizaron mediante regresión no‐lineal, usando los programas SPSS 11.0 (SPSS Inc.) y Origin 5.0 (MicroCal Inc.).  

 El  tratamiento de  imágenes digitales y densitometría de  las mismas se realizó 

mediante  los  programas  Kodak  Digital  Science  1D  2.0.3.  (Kodak  Scientific  Image Systems),y Quantity One 4.3.1 (Bio‐Rad).  

El análisis estructural de  las mutaciones PAH tuvo  lugar a partir del modelo de  la  PAH  full  length  generado  por  P.  Gómez  y  E.  López  de  la  Unidad  de Bioinformática del CBM. El análisis estructural de las mutaciones ATR tuvo lugar a partir del modelo tridimensional descrito en (Schubert and Hill 2006). 

 La  visualización  de  las  estructuras  tridimensionales  y  la  localización  de  los 

aminoácidos mutados en las distintas variantes alélicas de los genes PAH y MMAB se realizaron con el soporte informático DS ViewerPro5.0 de Accelrys Inc. 

 La  identificación  de  las mutaciones  detectadas  en  los  genes  PCCA  y  PCCB 

como  posibles  ESEs  (exonic  splicing  enhancers)  se  llevó  a  cabo  con  los  programas informáticos  ESEfinder  versión,  Rescue‐ESE  (RESCUE‐ESE  Web  Server),  y  PESX (PESXs Server).  

La identificación de los posibles sitios aceptores y donadores de splicing en una determinada secuencia se realizó con el programa informático Splice Site Prediction de BDGP (http://www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html). 

 

Page 62: Cristina Aguado Esteban

46

                 

4. RESULTADOS 

Page 63: Cristina Aguado Esteban

47

4.1 BASES  MOLECULARES  DE  LA  RESPUESTA  A  BH4  EN FENILCETONURIA  

En  el  momento  de  comenzar  este  trabajo  (año  2003)  se  había  descrito  la respuesta positiva a BH4 en pacientes PKU en diversas poblaciones, con frecuencias variables  y  gran  heterogeneidad  en  las  mutaciones  asociadas.  En  la  población española no  se había  analizado  aún  la  respuesta  en pacientes PKU, por  lo que  en colaboración con  la Dra Martínez‐Pardo (Hospital Ramón y Cajal, Madrid) se  inició un estudio mediante  la aplicación de  test de sobrecarga de BH4 y el genotipado de los pacientes sometidos al mismo. 

 Por otra parte, el  laboratorio estaba realizando un estudio con el objetivo de 

investigar  los mecanismos moleculares  responsables de  la  respuesta  in vivo a BH4, (en  colaboración  con  los  doctores  R.  Stevens  (Scripps  Research  Institute,  La  Jolla, USA)  y  A.  Martínez  (Univesidad  de  Bergen,  Noruega)),  en  este  sentido  nos propusimos la caracterización de la proteína PAH con algunas mutaciones asociadas a respuesta a BH4 en sistemas procariotas, eucariotas y libres de células.  4.1.1 IDENTIFICACIÓN DE MUTACIONES ASOCIADAS A RESPUESTA A BH4 EN PACIENTES FENILCETONÚRICOS ESPAÑOLES 

 En colaboración con la Dra. Martinez‐Pardo (Hospital Ramón y Cajal) se llevó 

a cabo un estudio piloto de sobrecarga con BH4 en 31 pacientes españoles deficientes en  el  gen  PAH.  Para  el  genotipado  de  todos  los  pacientes  sometidos  al  test  de sobrecarga  se  analizaron   muestras  de DNA  genómico,  obtenidas  de  sangre  total periférica.  Las  mutaciones  de  los  31  individuos  fueron  estudiadas  mediante  las técnicas  de  DGGE  y  secuenciación  cíclica  directa  identificándose  un  total  de  34 mutaciones  diferentes,  previamente  descritas  en  la  base  de  datos  de  la  PAH (http://www.pahdb.mcgill.ca).  Únicamente  en  dos  pacientes  sólo  se  determinó  la mutación  en  uno  de  los  alelos,  por  lo  que  el  porcentaje  de  variantes  alélicas identificadas en el total de pacientes fue de un 96,7% (Tabla 10). En aquellos casos en los  que  se  tuvo muestra  de  los  padres  se  confirmó  la  herencia mendeliana  y  la presencia de ambas mutaciones en posición trans. 

 De  los  31  pacientes  incluidos  en  este  estudio,  11  (5  HFA  y  6  PKU  leves) 

mostraron una respuesta positiva al test de sobrecarga con BH4, considerando como respuesta positiva una disminución  igual o mayor a un 30% en los niveles de L‐Phe 8 horas después de  la  sobrecarga. Adicionalmente  3 pacientes más mostraron una respuesta lenta con una  disminución igual o mayor a un 30% en los niveles de L‐Phe entre  12‐16 horas después de la sobrecarga. 

 El 90% de  los HFAs y  el 50% de  los PKU  leves  responden positivamente al 

test, se observa por  lo  tanto que  los  fenotipos más suaves presentan una  respuesta 

Page 64: Cristina Aguado Esteban

48

favorable  en  un  alto  porcentaje mientras  que  en  los  pacientes  con  fenotipos más graves  esta  respuesta  es  muy  poco  frecuente.  Tan  solo  un  20%  de  los  PKUs moderados y un 13% de los clásicos responden de forma lenta. 

 Todos  los  individuos  estudiados  con  respuesta  favorable  son  compuestos 

heterocigotos  con  al  menos  una  mutación  missense  potencialmente  asociada  a respuesta  excepto  el paciente  19548  que  es homocigoto para  la mutación  IVS10nt‐3C>T (en cursiva y negrita en la Tabla 10). Las mutaciones missense de los pacientes que  se  postulan  podrían  estar  implicadas  en  respuesta  serían  aquellas  que  tienen actividad  residual por  estudios de  expresión de mutaciones  o que  se han descrito asociadas  a  respuesta  a  BH4  en  pacientes  en  otros  trabajos  (Spaapen  and  Estela Rubio‐Gozalbo 2003) y aparecen subrayadas y en negrita en la Tabla 10.  

El paciente 19548 es homocigoto para la mutación IVS10nt‐3C>T, este cambio nucleotídico altera el sitio aceptor de splicing del  intrón 10 y como consecuencia se produce la eliminación del exón 11 en la maduración del mensajero (Jaruzelska et al. 1995).  La  hipótesis  para  explicar  la  respuesta  a  BH4  y  el  fenotipo  HFA  en  este paciente es la presencia de transcritos normales con el exón 11, para comprobar esto se  llevó  a  cabo  el  estudio  del  mRNA  de  la  PAH mediante  retrotranscripción  y posterior  PCR  a  partir  de  RNA  de  linfoblastos  del  paciente,  rescatando  la transcripción basal de la PAH en estas células ya que la expresión del gen de la PAH  se activa exclusivamente en hígado y riñón.

La amplificación y posterior  secuenciación del  fragmento del  cDNA  con  los primers PAH10 y PAH13 permitió observar  la existencia de mRNA normal  (Fig 9) que podría explicar el fenotipo HFA que presenta el paciente y la respuesta a BH4. 

Exón 10

Exón 10

Exón 12

Exón 11

MCR 19548

10 11 12

10 12

Figura  9:  Análisis  por  RT‐PCR  y  posterior  secuenciación  del  cDNA  de  la  PAH  utilizando  los oligonucleótidos específicos PAH10 ‐ PAH13 a partir del RNA del paciente 19548 y utilizando la línea celular MCR (linfoblastos control).  

Page 65: Cristina Aguado Esteban

49

Tabla 10: Fenotipos, genotipos y  tipo de  respuesta de  los pacientes  sometidos al test de sobrecarga con BH4. 

Genotipo Referencia  Fenotipo Mutación 1  Mutación 2 

Respuesta a BH4 a 

12710  HFA  I65T  A300S  + 18447  HFA  A300S  R261Q  + 18801  HFA  D415N  R176X  + 18811  HFA  S87R  S349P  + 18930  HFA  R176L  P281L  + 19548  HFA  IVS10nt‐3C>T  IVS10nt‐3C>T  +/‐ 

8438  leve  I65T  IVS10nt‐11G>A  ‐ 8439  leve  I65T  IVS10nt‐11G>A  ‐ 10806  leve  R68S  IVS7nt3G>C  ‐ 11332  leve  Y414C  L348V  + 12525  leve  IVS10nt‐11G>A T418N  ‐ 12528  leve  Y414C  IVS4nt5G>T  + 12556  leve  P122Q  F39L  ‐ 12572  leve  R408Q  L311P  ‐ 12576  leve  I65T  P244L  + 12895  leve  P275R  L348V  + 18236  leve  I65T  R408Q  + 19068  leve  E390G  IVS12nt1G>A  + 

9384  moderado  I65T  R261Q  ‐ 11353  moderado  IVS1nt5G>T  L348V  ‐ 12324  moderado  I65T  V388M  +/‐ 12562  moderado  V388M  IVS10nt‐11G>A  ‐ 12569  moderado  I65T  S196fsdel22bp  ‐ 

10637  clásico  A309V  IVS1nt5G>T  +/‐ 11942  clásico  R261Q  R408W  ‐ 14116  clásico  IVS10nt‐11G>A ND  ‐ 15618  clásico  IVS10nt‐11G>A delF39  ‐ 16550  clásico  R158Q  E280K  ‐ 16714  clásico  R243Q  ND  ‐ 17045  clásico  R261X  R243Q  ‐ 18149  clásico  IVS1nt5G>T IVS4nt5G>T  ‐ 

a +,  respuesta  positiva: disminución  igual o mayor a un 30% en los niveles de L‐Phe 8 horas después de la sobrecarga con BH4; ‐ respuesta negativa; +/‐,  respuesta lenta: disminución igual o mayor a un 30%  en  los  niveles  de  L‐Phe  entre  12‐16  horas  después  de  la  sobrecarga  con    BH4  .  ND,  no determinado. En negrita y subrayado, mutaciones missense potencialmente responsables de la respuesta. En negrita y cursiva mutación de splicing asociada a respuesta lenta. 

Page 66: Cristina Aguado Esteban

50

4.1.2  EXPRESIÓN  DE  PROTEÍNAS  PAH  MUTANTES  IMPLICADAS  EN  LA RESPUESTA A BH4  

Las  mutaciones  analizadas  mediante  expresión  para  caracterizar  sus parámetros cinéticos y/o su estabilidad han sido F39L, R68S, D129G, H170D, E178G, V190A, A300S, A309V, A313T, A373T, V388M, E390G, P407S, Y414C. La mayoría de las mutaciones estudiadas están presentes en el dominio catalítico y todas ellas han sido  descritas  en  pacientes  fenilcetonúricos  americanos  (Matalon  et  al.  2004)  y españoles que responden a BH4 .  

La  localización en  la estructura monomérica de  la PAH de  las mutaciones se muestran en la Figura 10. Destaca el hecho de que muchas de ellas no se encuentran ni en la región de unión al cofactor ni en las proximidades, por lo que se postula que es difícil que todas las proteínas mutantes tengan afectada la Km por BH4, por lo que el  efecto  positivo  de  un  aumento  en  las  concentraciones  de  BH4  podría  estar relacionado con la estabilización de las proteínas mutantes, (que tendrían defectos de plegamiento), actuando la BH4 como una chaperona química.  

Figura  10:  Estructura  en  dominios  de  un  monómero  de  PAH  y  localización  de  los  residuos implicados  en  respuesta  a  BH4,  sometidos  a  estudios  cinéticos  y/o  de  estabilidad    La  BH4  se muestra en rosa y blanco y los residuos implicados en respuesta a BH4  en azul y blanco. 

Page 67: Cristina Aguado Esteban

51

Análisis cinéticos 

El  procedimiento  experimental  utilizado  para  caracterizar  las  diversas  propiedades cinéticas de la PAH ha sido la expresión de la proteína de fusión MBP‐PAH   en  la bacteria E. coli y su utilización para ensayos de actividad enzimática en forma de  tetrámero. La  fracción  tetramérica activa se obtuvo mediante purificación por cromatografía de afinidad y posterior cromatografía de exclusión molecular. En el caso de la mutación D129G se llevaron a cabo los ensayos cinéticos con la proteína total  obtenida  tras  cromatografía  de  afinidad  en  paralelo  con  la  proteína  normal ensayada en las mismas condiciones   

Los  ensayos  cinéticos  en  condiciones  de  estado  estacionario  han  permitido determinar  los  parámetros  cinéticos  del  enzima  tetramérica  normal  y  mutante; actividad específica, afinidad aparente por BH4 (Km), afinidad aparente por L‐Phe (S 0,5), cooperatividad (índice de Hill, h) y activación por L‐Phe.   

Para determinar la actividad PAH se cuantificó la L‐Tyr formada durante los ensayos mediante separación cromatográfica de L‐Tyr y L‐Phe en HPLC y detección y  cuantificación por  fluorimetría  tal y  como  se especifica en materiales y métodos. Los datos se muestran en la Tabla 11.  

Se observa que sólo una mutación (P407S) presenta  parámetros similares a los de  la proteína normal, mientras que  las otras  cuatro proteínas mutantes presentan alteraciones en algún parámetro cinético, dos (D129G y H170D) tienen una actividad específica preincubando con L‐Phe disminuida, tres (D129G, H170D y V190A) tienen una  actividad  específica  sin  preincubar  con  L‐Phe  disminuida  y  una  (E390G) presenta  alteraciones  en  el  grado  de  activación  (<2,5).  Solo  una  de  ellas  (D129G) presenta una cierta disminución de la afinidad por BH4 (Km elevada en un 40%).  

 

Page 68: Cristina Aguado Esteban

52

Tabla 11. Parámetros cinéticos obtenidos para las proteínas MBP‐PAHtet y MBP‐PAH normal (wt) y mutantes. 

Forma purificada Actividad Específica (μmol L‐Tyr/min.mg) L‐Phe (c)  BH4 (d) 

 MBP‐PAH  

 + L‐Phe (a)   ‐ L‐Phe (b) 

Grado de activación

Vmax (μmol L‐

Tyr/min.mg) 

S0.5 (μM) 

h Inhibición por L‐Phe 

Vmax (μmol L‐Tyr/min.mg) 

Km (μM) 

Wt  1,71±0,05  0,70±0,01  2,5  1,89±0.05  111±5  2,4±0,2  +  0,95±0,03  27±2 

D129G (e)  0,35±0,07(e)  0,23±0,02(e) 1,5 (e)  ND  ND  ND  ND  ND  37±3 (e) 

H170D  0,81±0,13  0,32±0,04  2,5  1,1±0,02  104±3  2,8±0,2  +  0,35±0,01  12±2 

V190A  2,1±0,3  0,50±0,02  4,2  2,23±0,13  139±10  2,9±0,5  +  0,61±0,02  17±2 

E390G  1,78±0,1  1,37±0,07  1,3  1,71±0,1  153±15  1,5±0,1  +  1,87±0,05  29±2 

P407S  1,8±0,07  0,88±0,06  2,0  1,7±0,1  147±19  2,1±0,2  +  0,9±0,04  17±3 

a) Actividad específica determinada preincubando con 1 mM L‐Phe durante 5 min. e iniciando el  ensayo con 75μM BH4. b) Actividad específica determinada sin  preincubar con L‐Phe e iniciando el ensayo con 75 μM BH4 y 1mM de L‐Phe. c) Actividad determinada preincubando con 0‐4 mM L‐Phe durante 5 min. e iniciando el ensayo con 75 μM BH4. d) Actividad  determinada  iniciando el ensayo con 1mM de L‐Phe y BH4  0‐200 μM. e) Actividad medida en  la  forma purificada MBP‐PAH  tras  cromatografía de afinidad. Los parámetros  cinéticos para  la MBP‐PAHwt en esta  forma 

purificada son : actividad específica (μmol L‐Tyr/min.mg)+L‐Phe =1,54±0,13  y  –L‐Phe = 0,86±0,16,  grado de activación = 1,8 y  Km por BH4 =26±3. ND: no determinado  Todos los datos son la media de al menos dos experimentos independientes por duplicado        

Page 69: Cristina Aguado Esteban

53

Análisis  del  efecto  del  cofactor  BH4  sobre  la  estabilidad  de  las  proteínas  PAH normal y mutantes. 

Para  el  análisis  del  posible  efecto  de  la  BH4  sobre  la  estabilidad conformacional de las proteínas mutantes se llevaron a cabo experimentos de pulso‐caza  mediante  transcripción‐traducción  acoplada  (TNT)  en  un  sistema  libre  de células  en  ausencia o presencia de  altas  concentraciones de BH4  (500μM). Tras  el pulso‐caza  las  proteínas  marcadas  fueron  sometidas  a  electroforesis, autorradiografía y densitometría. 

Estos  experimentos  permitieron  determinar  la  vida  media  (t1/2)  tanto  en presencia  como  en  ausencia  de  BH4  de  la  enzima  normal  (wt)  y  de  las  distintas variantes  alélicas. Los  resultados de  t1/2 obtenidos  en  los  experimentos de pulso‐caza de las proteínas mutantes y de la proteína normal se encuentran recogidos en la Tabla 12. En la Figura 11 se muestran experimentos representativos obtenidos para la proteína normal y algunas proteínas mutantes. 

 Todas  las mutaciones estudiadas, excepto R68S y A300S, presentan defectos 

de estabilidad probablemente debido a una deficiencia en el plegamiento, con una vida media en ausencia de BH4 inferior a la vida media de la proteína normal, son por lo tanto proteolíticamente degradadas más rápidamente que la salvaje. 

Para la mayoría de las variantes alélicas estudiadas la presencia de una mayor concentración de BH4 o no produce ningún efecto positivo en  la estabilidad de  la proteína o si existe un aumento en la vida media es muy leve. Sin embargo para tres de  ellas  (A309V,  V388M,  Y414C)  la  presencia  de  altas  concentraciones  de  BH4 implica un aumento significativo de  la vida media,  llegando a alcanzar valores de t1/2 similares a los de la proteína PAH salvaje.  

 Figura  11: Análisis  mediante  SDS‐PAGE  y  posterior  autorradiografía  de  la  estabilidad  de  la proteína PAH normal y algunas mutantes en presencia/ausencia de BH4.

0  1  2 3  4  5  6 7 0 1 2 3 4 5 6 7 

Con 

WT 

Tiempo (h)  Tiempo (h) 0  1  2 3  5  6 7 0 1 2 3 4 5 6 7 0 1 2 3 4 5 6 7 

Sin BH4  BH4

R68S 

A309V 

V388M 

Y414C 

Page 70: Cristina Aguado Esteban

54

 Tabla  12:  Vida  media  (t1/2)  de  las  proteínas  PAH  normal  y  mutante  en presencia/ausencia de BH4 en el sistema TNT.  

T1/2 (horas) Proteína 

Sin BH4  Con BH4 

wt‐PAH  8.7  7.9 

Mutaciones     

F39L  5.6  6.5 

R68S  8.2  8.6 

E178G  5.5  5.8 

V190A  5.7  5.2 

A300S  8.9  8.8 

A309V  3.5  8.5 

A313T  4.9  4.9 

A373T  6.1  7.1 

V388M  5.5  7.0 

E390G  5.6  6.4 

Y414C  5.8  8.8 

Una vez observado que un aumento en los niveles de BH4 en el sistema TNT producía un efecto estabilizador en algunas de las proteínas mutantes, analizamos si este efecto era reproducido en un modelo celular de hepatoma. Para ello en primer lugar  se midieron  los niveles  intracelulares de BH4 en el hepatoma y  se alteraron estos  niveles  con  distintos  compuestos.  Para  disminuir  los  niveles  celulares  de tetrahidrobiopterina se utilizaron varios inhibidores de la vía de síntesis intracelular del  cofactor,  en  concreto  se usaron dicumarol que  es  inhibidor de  la  sepiapterina reductasa  y DAHP  (2,4‐Diamino‐6‐hidroxipirimidina)  que  inhibe  la GTPCH  (GTP ciclohidrolasa I) (Fig 3). Para aumentar los niveles de tetrahidrobiopterina se utilizó un precursor de la BH4 que es la sepiapterina.  

Page 71: Cristina Aguado Esteban

55

Se comprobó en primer lugar cual era la alteración en los niveles de pterinas 

intracelulares  al  cultivar  el  hepatoma  durante  24  ó  48  horas  en  presencia  de  los distintos compuestos a una concentración  final   de 100 μM para el dicumarol y  la sepiapterina y de 10 mM para el DAHP. Los metabolitos marcadores utilizados para determinar  el  efecto  de  estos  compuestos  fueron  la  biopterina  (BH4+BH2+BH2 oxidada)  como medida  de  la  cantidad  de  BH4    y  neopterina  como medida  de  la interrupción de la vía de síntesis de novo de la BH4. 

 Se obtuvo a ambos  tiempos en presencia de sepiapterina, un aumento en  la 

concentración de biopterina, siendo a 48 horas más de  trescientas veces respecto al control y disminuía a  cero  en presencia de  los dos  inhibidores. Los datos para 48 horas se muestran en la Tabla 13.   Tabla  13:  Niveles  de  biopterina  y  neopterina  (pmol/mg  proteína)  en    extracto celular  de  hepatoma  cultivado  durante  48  horas  en  presencia  de  dicumarol,  sepiapterina o DAHP.    Control  Dicumarol 100μM   DAHP 10mM  Sepiapterina 100μM

Neopterina  21,7±5,5  100,9±15  ND  20,3±3,3 Biopterinaa  15,6±1,9  0  0  4601±1633 

Todos los datos son la media de dos experimentos independientes. a (BH4+BH2+BH2 oxidada). ND: no determinado 

Una  vez  comprobado  que  los  niveles  intracelulares    del  cofactor  eran alterados,  según  lo  esperado,  seleccionamos  tres  mutaciones  (A309V,  V388M  y Y414C) para el estudio de su estabilidad, estas mutaciones fueron seleccionas por su presencia en el genotipo de  individuos  respondedores  in vivo y por presentar una corrección en su defecto estructural en el sistema TNT en presencia de BH4. 

 Para analizar el efecto de niveles elevados de BH4  sobre  las proteínas PAH 

mutantes  seleccionadas,  se  clonaron  los  cDNA  de  la  proteína  PAH  normal  y mutantes en el vector pFLAG‐CMV como proteínas de fusión al péptido FLAG, este sistema  nos  permitió  la  detección  de  manera  específica  de  dichas  proteínas  en hepatoma mediante el uso de un anticuerpo antiFLAG, evitando  la detección de  la PAH endógena. 

En primer  lugar  se  calculó  la vida media de  la proteína de  fusión normal, para ello se transfectó el hepatoma humano con el plásmido pFLAG‐CMVPAHwt y se paró la síntesis proteica a las 48 horas con puromicina (inhibidor de la traducción) a una  concentración  final de 10  μg/ml. La proteína  recogida a  tiempo 0, 4, 8 y 10 horas  tras  la  parada  de  la  traducción  se  sometió  a  Western  Blot  y  los  datos resultantes se analizaron para determinar la vida media de la proteína. La proteína 

Page 72: Cristina Aguado Esteban

56

de  fusión FLAG‐PAHwt presentaba una   vida media de 9,4 horas  (Fig 12), siendo del mismo orden que la vida media calculada en el sistema TNT.  

0

20

40

60

80

100

120

0 2 4 6 8 10

tiempo(horas)

% P

AH

resi

dual

 Fig 12: Representación semilogarítmica de la degradación de la proteína FLAG‐PAHwt en función del tiempo. Todos los puntos de la gráfica son la media de tres experimentos independientes. 

Posteriormente  comprobamos  si  la  cantidad  de  proteína  de  fusión  FLAG‐PAHwt aumentaba en presencia de sepiapterina, y al igual que ocurre en el sistema TNT, el cultivo en presencia de niveles elevados de BH4 no aumenta la cantidad de proteína. Cuando  trasfectábamos  las proteínas mutantes observábamos que dos de las mutantes (A309V y V388M) cuando se cultivaban en ausencia de sepiapterina y en comparación con la FLAG‐PAHwt se acumulaban en menor cantidad y que para las tres mutantes, el cultivo en presencia de sepiapterina durante 48 horas, llevaba a una mayor  cantidad de proteína detectada. Este aumento  era más  importante  (2,5 veces) para la mutación A309V (Tabla 14).  Tabla 14: Cantidad relativa de proteína FLAG‐PAH wt y mutantes en hepatoma en presencia o ausencia de sepiapterina 100 μM durante 48 horas.. 

  Sepiapterina 100 μM 

%Proteína FLAG‐PAH  ‐  +  Ratio +/‐ Wt  100  110±12  1,1 A309V  64±20  166±3  2,5 V388M  48±17  85±7  1,8 Y414C  96±2  162±40  1,6 

Todos los datos son la media de tres experimentos independientes y  referidos a la cantidad obtenida con la proteína FLAG‐PAHwt.                                                                        

Tiempo (horas) % FLAG-PAHwt

0 100 4 77±9 6 73,±13 8 50±6

Page 73: Cristina Aguado Esteban

57

4.1.3 EFECTO DE LA BH4 SOBRE LA TRANSCRIPCIÓN Y TRADUCCIÓN DEL GEN PAH  

Con  el  objeto  de  analizar  otro  de  los mecanismos moleculares  propuestos implicados en la respuesta a BH4 se estudió el efecto de una variación en los niveles intracelulares de la BH4 en el modelo celular Hep3B sobre la expresión del gen PAH. 

 En  primer  lugar  tras  cultivar  las  células Hep3B  durante  24  y  48  horas  en 

presencia de los distintos compuestos descritos previamente para alterar los niveles de BH4  intracelular  (DAHP, dicumarol y  sepiapterina)  se midió  la actividad de  la fenilalanina  hidroxilasa  endógena  en  el extracto  celular.  El  ensayo  enzimático  se llevó  a  cabo  preincubando  entre  5‐20  μg  de  proteína  total  del  extracto  celular durante  5 minutos  con L‐Phe  (1mM)  y disparando  la  reacción  con BH4  75μM,  el tiempo total de reacción fue de 30 minutos.   Tabla 15: Actividad específica de la PAH del extracto celular de hepatoma control o cultivado en presencia de dicumarol, DAHP o sepiapterina. 

Actividad PAH en extracto de hepatoma (nmol L‐Tyr/min.mg prot) Tiempo  Control  Dicumarol 100μM   DAHP 10mM  Sepiapterina 100μM 24 horas  0,16±0,09  0,03±0,01  ND  0,27±0,09 48 horas  0,16±0,09  0,011±0,01  0,52±0,18  0,65±0,09 

Todos los datos son la media de al menos tres experimentos independientes por duplicado. ND: no determinado   

Tanto a 24  como a 48 horas  la actividad de  la PAH del extracto  celular   de hepatoma cultivado con dicumarol disminuía drásticamente mientras que cultivado con sepiapterina aumentaba  2 y 4 veces respectivamente. Con el DAHP, a 48 horas, la actividad fue más de tres veces la del control (Tabla 15). 

 En  paralelo  a  los  estudios  de  actividad  se  llevaron  a  cabo  experimentos 

mediante Western Blot (Fig 13) con anticuerpos monoclonales antiPAH para medir la cantidad de proteína. Los resultados obtenidos mostraron un paralelismo con los obtenidos  para  la  actividad,  en  el  caso  de  extractos  procedentes  de  cultivo    en presencia de dicumarol la cantidad de proteína PAH disminuía drásticamente tanto a 24   como a 48 horas, siendo 6 veces menos que en el control a ambos tiempos. El extracto  procedente  del  cultivo  con  sepiapterina  alcanzaba  hasta  4,5  veces  más respecto  al  control  a  las  48  horas  de  tratamiento  y  para  el  cultivo  con DAHP  el aumento observado en el extracto, a 48 horas, era de casi tres veces. 

.

Page 74: Cristina Aguado Esteban

58

Figura 13: Análisis por Western Blot de  la proteína PAH normal del extracto de  cultivo  control, cultivo en presencia de dicumarol 100 μM y cultivo en presencia de sepiapterina 100 μM a las 24 horas.  

De manera  análoga  a  los  experimentos  realizados  con  la  proteína  FLAG‐PAHwt se midió  la vida media de  la proteína PAH endógena del hepatoma en  las distintas condiciones. Se cultivó el hepatoma humano en presencia de sepiapterina 100 μM, en presencia de DAHP 10 mM  y en condiciones control y se paró la síntesis proteica a  las 48 horas  con puromicina a una  concentración  final de 10  μg/ml. La proteína  recogida  a  tiempo  0,  4,  8  y  10  horas  tras  la  parada  de  la  traducción  se sometió a Western Blot y los datos resultantes se analizaron para determinar la vida media de la proteína (Tabla 16 y Figura 14) 

Tabla 16: Datos de vida media (t1/2) de la proteína PAH en el extracto control, con sepiapterina 100 μM y con DAHP 10 mM. 

t1/2(horas) Control DAHP 10mM Sepiapterina 100µM

9,4 10 26

Figura 14: Representación semilogarítmica de  la degradación de  la PAH de  las células Hep3B en función del tiempo. Todos los puntos de la gráfica son la media de dos experimentos independientes. 

 Los  resultados  obtenidos  permiten  afirmar  que  la  presencia  de  mayores 

cantidades de  tetrahidrobiopterina en cultivo celular hepático humano  lleva a una 

                                  Hep 3B         Hígado                     Control            Dicumarol 100 μM        Sepiapterina 100μM 

PAH

Proteína PAH 

 

10 

100

0 2  4  6 8 10 12

Tiempo (horas)

+  sepiapterina 100 μM  

control 

+ DAHP 10 mM  

% PAH residual

Page 75: Cristina Aguado Esteban

59

mayor estabilidad de la proteína PAH endógena, sin embargo el cultivo en presencia del inhibidor DAHP no altera la vida media de la PAH. 

 Aunque la superior estabilidad de la enzima por aumento de la concentración 

de BH4 ya nos permitiría justificar la mayor actividad obtenida en los experimentos, comprobamos si también había una aportación al efecto observado por un aumento de la transcripción del gen PAH o por un aumento en la estabilidad del mensajero.   

Para el análisis del posible efecto de  la BH4  sobre  los niveles del mRNA  se utilizó  como  método  experimental  la  qRT‐PCR  a  partir  del  RNA  de  las  células obtenidas  tras  cultivo de Hep3B  control  o  en presencia de dicumarol  100  μM, de sepiapterina  100  μM  o  de  DAHP  10  mM.  Una  vez  obtenido  el  RNA  total,  se utilizaron  entre 500‐1000 ng del mismo para  llevar a  cabo una qRT‐PCR a  tiempo real con sondas Taq man específicas para el cDNA de la PAH. Para la cuantificación de  la  PCR  se  utilizaron  como  estándares  internos  dos  genes  con  expresión constitutiva, el gen de  la gliceraldehido fosfato deshidrogenasa (GAPDH)   y el gen del rRNA 18S.  Tabla  17: Cantidad  relativa  del mRNA  de  la  PAH  en  células Hep3B  cultivadas durante 48 horas con  sepiapterina 100 μM, dicumarol 100 μM y DAHP 10 mM.   

 

 

 

 

 

 

 

 

Todos los  datos son la media de tres experimentos independientes por triplicado  En  los  resultados  obtenidos  observamos  que  no  existe  diferencia  entre  la 

expresión del gen PAH en hepatoma control y en hepatoma cultivado en presencia de  sepiapterina  100  μM  o  DAHP  10 mM  durante  48  horas.  Por  el  contrario  las cantidades de mRNA de la PAH  en hepatoma cultivado en presencia de dicumarol 100 μM eran significativamente inferiores (30%) (Tabla 17). 

La  estabilidad del mRNA de  la PAH  en  las distintas  condiciones  se  realizó tras  el  cultivo del  hepatoma, durante  48  horas,  con dicumarol  o  con  sepiapterina (siempre  con un hepatoma  control de  referencia) y parada de  la  transcripción  con actinomicina  (10  μg/ml). El mRNA  se  analizó  a  tiempos  0,  4,  6,  8 y  10 horas  tras parada  de  la  transcripción mediante  PCR  a  tiempo  real  con  sondas  Taq Man  y posterior  tratamiento  matemático  de  los  datos.  El  resultado  obtenido  (datos  no mostrados)  fue  que  no  existe una  estabilización del mRNA de  la PAH  cuando  el 

                     % mRNA  Control  100 DAHP  97±12 

Dicumarol  32±14 Sepiapterina  84±28 

Page 76: Cristina Aguado Esteban

60

hepatoma se cultiva en presencia de sepiapterina mientras que con el dicumarol  la estabilidad con respecto al control es significativamente menor.  

Por último se analizó el efecto de  la BH4 sobre  la expresión del gen reporter (luciferasa)  clonado bajo  regiones  reguladoras de  la PAH, para  ello  se  clonó  en  el vector pGL3 un  fragmento de  500 pares de bases de  la  región promotora del gen PAH más la región 5´UTR (pGL3PrUTRPAH). Este vector se cotransfectó en células Hep3B  junto  al  vector  pCMV  PRCβ‐galalactosidasa  (para  normalizar  la transfección),  se cultivó durante   48 horas en presencia o ausencia de  sepiapterina 100 μM y se midió en los extractos celulares la actividad luciferasa y la actividad β‐galactosidasa. Los  resultados obtenidos   muestran que no existe un aumento de  la actividad  luciferasa cuando se cultivan  las células en presencia de niveles elevados de BH4 (Fig  15)  

Actividad luc/b-gal

-1

1

3

5

7

9

B-gal B-gal + pGL3 B-gal +pGL3PrUTRPAH

Act

ivid

ad lu

c /B

-gal

Uni

dade

s ar

bitr

aria

s en

mill

ones

- sepiapterina+ sepiapterina

Figura 15: Actividad luciferasa normalizada con actividad ß‐galactosidasa en extracto celular de hepatoma  cotransfectado  el  plásmido  pCMVPRC‐β‐galactosidasa  y  el  plásmido  pGL3  o  el pGL3PrUTRPAH en presencia o ausencia de sepiapterina 100μM. Todos los datos son la media de dos experimentos independientes por duplicado.  

Page 77: Cristina Aguado Esteban

61

4.2 BASES MOLECULARES DE LA RESPUESTA A COBALAMINA (VIT B12) EN ACIDEMIA METILMALÓNICA AISLADA  

Aproximadamente un  40% de  los pacientes del grupo de  complementación cblB (defecto en el gen MMAB) manifiestan un efecto positivo in vivo en respuesta a suplementación  con  cobalamina  (en  forma  de OH‐Cbl)  (Matsui  et  al.  1983).  Este porcentaje  es  similar  cuando  se  llevan  a  cabo  estudios  in  vitro  mediante suplementación  con  OH‐Cbl  en  fibroblastos  de  pacientes  y  medida  de  la incorporación de propionato.  

En  estudios  previos  en  el  laboratorio  se  han  descrito  varios  pacientes  que pertenecen  al  grupo  cblB  con  respuesta    in  vitro  a OHcobalamina,  entre  ellos  se encuentra el paciente con el genotipo  (I96T y  P173fs (c.584G>A)) en  el gen  MMAB (datos del  laboratorio) El  cambio nucleótidico  c584G>A  se  encuentra  en  el último nucleótido del exón  siete afectando al  splicing,   como  consecuencia  se genera o un mRNA  sin  el  exón  siete  o  si  existe  splicing  correcto,  con  el  exón  siete pero  con  la mutación R195H (datos del laboratorio).  

 4.2.1 EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS MUTANTES IMPLICADAS EN RESPUESTA IN VITRO A B12; Análisis cinéticos 

Para poder entender cuales son los mecanismos moleculares que determinan la  respuesta  in  vivo  e  in  vitro  (datos  del  laboratorio)  en  acidemia metilmalónica aislada  tipo  cblB  se  llevaron  a  cabo  análisis  cinéticos  y  estructurales  de    la ATP:cob(I)alamina adenosiltransferasa humana (hATR) normal y con las mutaciones puntuales  (I96T  y  R195H)  mediante  expresión  en  un  sistema  procariota.  Estos estudios se realizaron en el laboratorio de la doctora Ruma Banerjee (Centro Redox de  Biología,  Departamento  de  Bioquímica,  Universidad  de  Nebraska,  Lincoln, Nebraska,USA).  

La  hATR  es  un  trímero  constituido  por  3  monómeros  cada  uno  de  ellos organizado en 5 hélices α y dos  laminas ß  (Schubert and Hill 2006).   La mutación  I96T se encuentra localizada en  la  hélice α1 (Fig  16). Esta estructura secundaria es muy importante ya que el sitio de unión a ATP se forma entre las hélices α1, α2 de un monómero y el  loop  α3  ‐α4 y  las hélices    α4,  α5 del monómero adyacente. La unión de ATP a su sitio activo produce un cambio conformacional en el trímero que contribuye a  la  formación del sitio de unión a cobalamina. Una de  las hipótesis de partida es que el cambio de la isoleucina por la treonina en el aminoácido 96 podría producir un alteración en el sitio de unión a ATP y disminuir la afinidad de la hATR por  este  sustrato,  esto  podría  producir  a  su  vez  una  alteración  en  el  cambio conformacional de  la proteína para  formar el sitio de unión a cobalamina y por  lo tanto  también podría verse alterada  la afinidad por este sustrato. Otra hipótesis es 

Page 78: Cristina Aguado Esteban

62

que  este  cambio  nucleotídico  I96T  puede  afectar  a  la  estructura  final  del  trímero produciendo una menor estabilidad del mismo. 

Figura 16: Visualización parcial de la estructura cristalizada de la ATR humana. La figura muestra uno de los monómeros (amarillo) con sus cinco hélices α. El aminoácido I96 (en gris) se encuentra en la hélice α1 y el ATP en el espacio entre dos de los monómeros (amarillo y azul) de la proteína,  

La mutación   R195H   se encuentra  localizada en  la   hélice α4  (Fig. 17). Esta 

estructura secundaria junto con la hélice α1 están implicadas en la interacción entre los  tres  monómeros  y  formación    del  oligómero.  Existen  dos  pares  arginina glutámico (Glu84/Arg195 y Glu91/Arg191) esenciales en la formación del trímero.  

Figura  17:  Visualización  de  la  estructura  trimérica  cristalizada  de  la  ATR  humana.  La  figura muestra  los  tres monómeros  (amarillo, verde  y  azul)  con  sus  cinco hélices  α. El  aminoácido R195 (morado) se encuentra en la hélice α4 en el espacio de interacción entre los tres monómeros. 

I96

ATP

hélice α 4

R195hélice α 1

Page 79: Cristina Aguado Esteban

63

Con  objeto  de  determinar  las  características  cinéticas  y  estructurales  de  las hATR  I96T  y  R195H  que  nos  permitirían  determinar  la  base  molecular  de  la respuesta a cobalamina, se expresaron  las proteínas normal y mutantes en    la cepa bacteriana BL21 StarTM (DE3) One Shot Cell (Invitrogen) utilizando el vector pET 41a con  el  cDNA  de  la  ATR  humana  clonado  por  la  Dra  Ruma  Banerjee.  Las  dos mutaciones I96T y R195H se introdujeron mediante mutagénesis dirigida. 

 Tras  la  inducción  con  IPTG  las proteínas normal y mutantes  se purificaron 

secuencialmente  mediante  precipitación  con  sulfato  de  amonio  seguida  de cromatografía  de  intercambio  aniónico  mediante  columna  de  sefarosa  Q  y finalmente  cromatografía  de  exclusión  molecular  utilizando  una  columna  de hidroxiapatita. La purificación obtenida para I96T  fue de más del 95% después de la primera cromatografía y casi del 99% tras  la segunda. (Fig 18). Para R195H  tras    la primera cromatografía  (con columna de sefarosa Q) se obtuvo una purificación del 95% (dato no mostrado) que fue suficiente para llevar a cabo el resto de los ensayos a partir de las fracciones de esta cromatografía.

Figura  18:  Electroforesis  SDS  PAGE  de  los  extractos  y  fracciones  de  los  diferentes  pasos  de purificación de la proteína hATR I96T. a) Extracto celular inducido a 25ºC con 1mM de IPTG (1) y sin  inducir  (2), b) Fracciones conteniendo  la proteína hATR  I96T  tras cromatografía de  intercambio aniónico con columna de sefarosa Q (carriles 2, 3 y 4). El carril 1 corresponde a la hATR wt purificada, c)  Fracciones  conteniendo  la  proteína  hATR  I96T  tras  cromatografía  de  exclusión molecular  con columna hidroxiapatita (carriles 1, 2, 3 y 4).   

Las  fracciones  de  las  proteínas  purificadas  en  los  distintos  pasos cromatográficos  se  concentraron  para  obtener  una  solución  con  una  cantidad mínima de proteína de 1mg/ml que fue utilizada para ensayos enzimáticos y análisis estructurales. 

 La medida de actividad para la proteína hART normal y las dos mutantes se 

realizó siguiendo el protocolo descrito en métodos y los resultados se muestran en la Tabla  18    y  en  la  Figura  19  se muestra un  experimento  representativo. Los datos obtenidos  muestran  que  la  proteína  R195H  tiene  la  misma  actividad  que  la  wt mientras que la I96T alcanza el 60% de la actividad salvaje. 

  

1 2 3 4

hATR hATR hATR

1 2 1 2 3 4 Kda 36 27

18

a) c) b)

Page 80: Cristina Aguado Esteban

64

 Tabla 18: Actividad específica para las proteínas hATR wt,  I96T  y R195H. 

  Wt (tras cromatografía 

intercambio aniónico) 

I96T (tras cromatografía 

intercambio aniónico) 

I96T (tras cromatografía 

exclusión molecular) 

R195H (tras cromatografía 

intercambio aniónico) 

Actividad específica (nmol min–1 mg–1)  200 ± 10  123 ±19  132 ±13  185 ±15 

Todos los datos son la media de dos experimentos independientes por triplicado. 

1.5

1.0

0.5

0.0

543210  Figura 19: Experimento representativo de la actividad de la proteína  hATR I96T como medida de la disminución en  la absorbancia a 388 nm  con  respecto al  tiempo debido a  la  formación de AdoCbl desde cob(I)alamina.  La cantidad de proteína utilizada en el ensayo fue de 10 μl a una concentración 11 μg/μl. 1‐Adición de 10 μL de ácido Ti(III)citrato. 2‐ Adición de 10μL de proteína hATR I96T.  

 La  caracterización  cinética  de  las  proteínas  mutantes  se  completó  con  la realización de ensayos que nos permitieron calcular  las Kds para Cob(II)alamina y diversos análogos y la Km y Vmax por ATP (Tablas 19 y 20).  

Tanto  las   Kd para  la Cob(II)alamina  como para  los análogos no mostraron diferencias  significativas,  excepto  para  la CNCbl,  con  los  descritos  para  la wt  en ninguna de las dos mutaciones. La Km por ATP para la proteína hATR I96T muestra que no  existe alteración  en  la afinidad por  el ATP para  la proteína mutante    I96T aunque si se observa una disminución de un 30% en la Vmax. 

 Tabla 19: Km  y Vmax para ATP para la proteína hATR wt y I96T.   Km (μM)  Vmax (nmol min–1 mg–1) Wt  6,2 ± 1,3  170 ± 9 I96T  7,8 ± 1.9  125 ± 8  

1

2

Tiempo (minutos)

Absorbancia 

Page 81: Cristina Aguado Esteban

65

Tabla 20: Constante de disociación para la Cob(II)alamina y para los diversos análogos para la proteína wt, I96T y R195H.   Wt  I96T  R195H   Kd (μM)  Kd (μM)  Kd (μM) AdoCbla  1,7 ± 0,4  2,58 ± 0,62  ND OHCblb  8,5 ± 1,1  7,8 ±1,55  11,38 ± 2,4 CNCblb  7,8 ± 0,5  13,28 ± 0,28  14,16 ± 4,7 Cob(II)alaminaa  3,6± 1,6  1,37± 0,33  ND a  Los datos son la media de dos experimentos independientes por duplicado.  b Los datos son la media de un experimento  por triplicado. 

Por  último  analizamos  el  efecto  de  los  cambios  nucleotídicos  en  la distribución oligomérica de la proteína. Para el caso de la proteína con la mutación R195H era especialmente  interesante este estudio ya que el aminoácido mutado se encuentra  implicado  directamente  en  la  formación  del  trímero.  Mediante cromatografía en gel a 4  ºC en condiciones nativas y obtención del peso molecular por comparación con patrones se determinó el estado de oligomerización de las tres  proteínas  observándose  que  la  wt  se  presentaba  como  un  trímero  y  la  I96T mayoritariamente también, aunque una pequeña proporción de la proteína aparecía como monómero. El estado de oligomerización de la proteína R195H   correspondía mayoritariamente a la mezcla de trímeros y monómeros (Fig 20).

Figura 20: Perfil de elusión de las proteínas I96T y R195H tras cromatografía en gel. El estado de oligomerización  se  dedujo  a  partir  de  la  obtención  del  peso molecular  por  comparación  con  los patrones.  

 

44 KDa.

Trímero + monómero

R195H

Trímero hATR (72KDa.)

I96T

Monómero hATR (24 KDa.)

I96T

670 KDa. 158 KDa. 17 KDa.

1,35 KDa.

Trímero hATR (72KDa.)

I96T

Page 82: Cristina Aguado Esteban

66

4.3 BASES MOLECULARES  DE  LA  RESPUESTA  A  BIOTINA  EN ACIDEMIA PROPIÓNICA Y METILCROTONILGLICINURIA.   

Los  estudios desde hace  36  años han presentado  evidencias  que  indican  la implicación  de  la  biotina  en  el  control  de  la  expresión  génica  en  animales  de laboratorio y células en cultivo. La lista  de proteínas cuya expresión es afectada por la  biotina  incluye  enzimas  implicadas  en  el metabolismo  de  la  glucosa,    enzimas asociadas a  la homeostasis  de la biotina, transportadores de vitaminas, factores de transcripción, citokinas y sus receptores y oncogenes  (Baur et al. 2002; De La Vega and Stockert 2000; Pacheco‐Alvarez et al. 2002).   

Con  objeto  de  esclarecer  el  posible  efecto  de  la  biotina  sobre  la  expresión génica de carboxilasas dependientes de biotina, acerca de lo cual no hay consenso en la  literatura,  y  que  permitiría  sentar  las  bases  para  una  posible  terapia  de suplementación con esta vitamina, nos centramos en el estudio de dos enzimas, PCC y  MCC,  cuyo  defecto  causa  acidemia  propiónica  y  metilcrotonilglicinuria, respectivamente. Para analizar el posible efecto de una suplementación con biotina sobre  la  expresión  de  PCC  y MCC  utilizamos  dos modelos  celulares,  hepatoma (Hep3B) y  linfoblastos  (MCR), que  cultivamos durante periodos  largos de  tiempo (14‐16 días) en presencia de diferentes niveles de biotina.   

Para alterar los niveles de la biotina se prepararon medios de cultivo con un 10%  de  tres  sueros  comerciales  diferentes  con  concentraciones  de  biotina  ya definidas  en  la  literatura;  FBS  (biotina  100‐200  nM), NBCS  (biotina  <1nM  )  y  FBS dializado (biotina <1nM) (Collins et al. 1988; Suormala et al. 2002). La concentración de biotina  en  suero humano  en  condiciones  fisiológicas  es de 2,5 nM  (Mock  et al. 1995)  por  lo  que  cuando  el  suero  utilizado  era    FBS  dializado  o  suero NBCS  la concentración  final  de  biotina  en  el medio  era  de  0,1  nM  correspondiendo  a  una situación de deficiencia en biotina y cuando el suero utilizado era el FBS los niveles finales de biotina  en  el medio  eran de  10‐20 nM  correspondiendo  a una  situación farmacológica.   

En primer  lugar  comprobamos  si  existía  algún  efecto de  las  variaciones de biotina  sobre  las  actividades  enzimáticas  PCC  y MCC,  para  ello  llevamos  a  cabo estudios  cinéticos  con  células  de  hepatoma  cultivadas  en  presencia  de concentraciones deficientes (0,1nM) y farmacológicas (10nM) de biotina. 

Page 83: Cristina Aguado Esteban

67

0

25

50

75

100

125

150

175

% a

ctiv

idad

car

boxi

lasa

[Biotina] 14 dias 10 nM 0.1 nMa a

Actividad carboxilasa

Actividad MCC

Actividad PCC

Figura 21: Actividad relativa PCC y MCC en extracto celular tras cultivo de hepatoma con distintas concentraciones de biotina durante 14 días. Los datos son  la media de al menos dos experimentos independientes por duplicado  

Mediante estos estudios, se observa que para ambas enzimas hay una mayor 

actividad  al  cultivar  el  hepatoma  en  presencia  de  niveles  farmacológicos.  Este aumento fue de 4 veces más para la propionil‐CoA carboxilasa y de 6 veces más para la metilcrotonil‐CoA carboxilasa (Fig.21) respecto a la actividad obtenida en cultivo con niveles deficientes de biotina.    

Las diferencias en  las actividades no eran debidas a  la utilización de sueros diferentes sino a la diferencia de concentración de biotina entre ellos, este resultado se obtuvo al medir las actividades carboxilasas en células de hepatoma cultivado en presencia  del  suero NBCS  (con  niveles  de  0,1  nM)  durante  14  dias  y  hepatoma cultivado en las mismas condiciones y suplementado con biotina 10 μM durante 24 horas. El aumento de actividad al adicionar la biotina es igual al obtenido cultivando las células con suero FBS.  

 El  aumento  de  actividad  podría  deberese  a  un  aumento  paralelo  de  la 

cantidad de proteína unida a biotina (forma activa de las enzimas). Para comprobar esta hipótesis se realizó el estudio en las células de hepatoma en presencia de los dos niveles de biotina y  se utilizó  la  técnica de  transferencia y detección de proteínas mediante marcaje con avidina conjugada a fosfatasa alcalina a partir de 25‐100 μg de proteínas  de  fracciones mitocondriales  de  las  células.  Se  observó  un  aumento  en ambas  proteínas  cuando  los  niveles  de  biotina  en  el  cultivo  eran  farmacológicas. Como ocurría  con  la  actividad,  las variaciones  en  las  cantidades de proteína  eran más marcadas para  la subunidad alfa de  la metilcrotonil‐CoA carboxilasa  (6 veces más) que para la subunidad alfa de la propionil‐CoA carboxilasa (2 veces más) (Fig. 22)  

Page 84: Cristina Aguado Esteban

68

Figura  22:  Experimento  representativo  de  la  detección  de  las  proteínas  biotiniladas (subunidades α de PCC y de MCC) en extractos mitocondriales de células Hep3B cultivadas en presencia de diferentes concentraciones de biotina en el medio. PC: Piruvato carboxilasa. 

 Cuando aumentamos más la cantidad de biotina alcanzando niveles de 10 μM 

en  el  medio  de  cultivo  no  se  observa  un  aumento  en  la  cantidad  de  proteína biotinilada ni para MCCA ni para PCCA en comparación con niveles 10 nM (datos no mostrados).  

Para el análisis del posible efecto de la biotina sobre los niveles de mRNA se utilizó  como  método  experimental  la  qRT‐PCR  a  partir  de  RNA  de  las  células cultivadas en presencia de ambos niveles de biotina. Una vez obtenido el RNA total, se utilizaron entre 500‐1000 ng del mismo para llevar a cabo qRT‐PCR a tiempo real con sondas específicas (sondas Universal Probe Library o sonda TaqMan) de mRNA de PCCA y MCCA. Para normalizar los datos se utilizó como estándar interno el gen de expresión constitutiva rRNA 18S. 

 También  se  cuantificaron  en  las  mismas  condiciones  otros  dos  genes 

relacionados  con  la  biotina:  MCCB  (gen  de  la  subunidad  no  biotinilada  de  la metilcrotonil‐Coa carboxilasa) y HLCS (gen de la holocarboxilasa sintetasa) (Fig. 23).  

 Los resultados obtenidos permiten afirmar que el aumento en  los niveles de 

biotina no produce variación en la cantidad de los mRNA de ninguno de los genes estudiados, descartando así un efecto de la biotina sobre la transcripción y sobre la estabilidad de dichos mRNAs.  

    

 

PC

MCCAPCCA 

10 nM 0.1 nM[Biotina] 

Page 85: Cristina Aguado Esteban

69

Figura 23: Cantidad relativa de mRNA PCCA, MCCA, MCCB y HLCS en hepatoma cultivado con distintas concentraciones de biotina.   Para PCCA y MCCA los datos son la media de al menos dos experimentos  independientes  por  triplicado,  para MCCB  y HLCS  los  datos  son  la media  de  un experimento por triplicado.   

Está  descrito  en  la  literatura  que  el  efecto  de  la  biotina  sobre  la  expresión génica de  las enzimas difiere según el tipo celular, por ello utilizamos otro modelo celular,  la  línea  celular de  linfoblastos  (MCR) para  estudiar  los niveles de mRNA PCCA y MCCA asociado a distintas concentraciones de biotina. El tiempo de cultivo fue de 14 días y  los  sueros utilizados  fueron FBS para niveles 10 nM y  suero FBS dializado  para  niveles  0,1  nM.  Los  resultados  obtenidos  en  linfoblastos  fueron iguales que los obtenidos en hepatoma e indican que  la cantidad de mRNA PCCA y MCCA es independiente de los niveles de biotina (Fig. 24). 

Figura  24:  Cantidad  relativa  de  mRNA  PCCA, MCCA  en  linfoblasto  cultivados  con  distintas concentraciones de biotina.  Todos los datos son la media de un experimento por triplicado.  

El  aumento  de  la  traducción  de  los  mensajeros  PCCA  y MCCA  también 

podría  explicar  la  elevación  en  las  cantidades  y  actividades  de  las  enzimas estudiadas. Para comprobar si los niveles elevados de biotina producían algún efecto sobre la traducción o sobre la estabilidad de las carboxilasas se cultivaron células de hepatoma en presencia de niveles deficientes (0,1 nM) de biotina durante 14 ‐16 días y se añadió entonces biotina 10 μM  durante 30 min. u 8 horas. De forma paralela se 

020406080

100120

% mRNA

PCCA MCCA

10 nM0.1 nM

0

50

100

150

200

250

PCCA MCCA MCCB HLCS

10 nM

0.1 nM

0

50

100

150

200

250

PCCA MCCA MCCB HLCS

10 nM

0.1 nM

0

50

100

150

200

250

PCCA MCCA MCCB HLCS

10 nM

0.1 nM

% mRNA

Page 86: Cristina Aguado Esteban

70

añadió biotina  10  μM  simultáneamente  con puromicina  10  μg/ml  (inhibidor de  la traducción) durante 8 horas. Se midió la actividad en las diferentes condiciones.  

 Se  observa  que  la  recuperación  de  la  actividad  es  prácticamente  igual  en 

presencia  y  ausencia  de  puromicina,  por  lo  que  podemos  descartar  un  efecto significativo de  la biotina sobre  la  traducción  (Fig. 25). También se observa que  la actividad PCC alcanza la mitad de los niveles control a los 30 minutos de cultivo en presencia de 10μM de biotina y recupera totalmente los niveles de actividad a las 8 horas. Para la actividad MCC la recuperación era total a las 8 horas mientras que a los 30 minutos era de un 25%. 

0

25

50

75

100

125

150

175

Figura 25: Porcentaje de actividad PCC y MCC en extracto celular  tras cultivo de hepatoma con distintas concentraciones de biotina y puromicina en el medio, considerando 100%  la actividad obtenida cultivando a 10nM de biotina durante 14 días. Los datos son  la media de al menos dos experimentos independientes por duplicado. a Datos de un experimento por duplicado. 

10 nM  0.1 nM0.1 nM  0.1 nM 10 μM biotin+  + ‐ ‐ 

‐ ‐ ‐  +  10 μg/ml puromicina

0.1 nM+ ‐ 

30 min 8 horas 8 horas 

a [Biotina] 14 días 

% Actividad carboxilasa  Actividad PCC 

Actividad MCC 

Page 87: Cristina Aguado Esteban

71

4.4 TERAPIAS MODULADORAS DE  MUTACIONES DE SPLICING EN ACIDEMIA PROPIÓNICA  

Una  fracción  significativa  de  mutaciones  causantes  de  EMH  afectan  al proceso  de  splicing,  estas  mutaciones  han  sido  encontradas  tanto  en  los  sitios canónicos de splicing como en regiones reguladoras  intrónicas o exónicas (Cartegni et al. 2002). Las dos consecuencias más comunes de las mutaciones de splicing son el skipping exónico (eliminación de un exón que no se incluye en el mRNA maduro) y la activación  de  sitios  crípticos  cuya  consecuencia  es  la  inclusión  de  secuencias aberrantes o la eliminación de secuencias codificantes. 

 El  conocimiento  de  las  consecuencias  que  cada  mutación    produce  en 

términos de su mecanismo de acción a nivel de DNA y mRNA ha abierto nuevas y prometedoras  vías  terapéuticas  genéticas  en  estas  alteraciones  del  splicing.  La modulación  del  splicing,  mediante  sobreexpresión  de  factores  de  splicing,  uso  de drogas  (butirato  sódico,  kinetina,  valproico,  aclarubicina,  benzamidas etc…)(Andreassi  et  al.  2001;  Hims  et  al.  2007;  Nissim‐Rafinia  et  al.  2004)  uso  de oligonucleótidos  antisentido  (Takeshima  et  al.  2006)  etc.  permitirá  modificar  los transcritos incorrectamente procesados y por lo tanto alterar la expresión fenotípica. 

  4.4.1  ANÁLISIS  DEL  EFECTO  DE  DROGAS  SOBRE  MUTACIONES  DE SPLICING  QUE  PRODUCEN  NIVELES  DETECTABLES  DE  TRANSCRITOS  NORMALES   

Ocasionalmente mutaciones de splicing pueden resultar en niveles detectables de  mRNAs correctamente procesados generando ciertos niveles de proteína normal, tales mutaciones por lo tanto producen a partir del mismo alelo transcritos mutantes y normales, los niveles de ambos transcritos varían dependiendo de la mutación, el tejido  y  el  individuo,  pero  en  todos  los  casos  existe  una  correlación  entre  la severidad  fenotípica  y  los  niveles  de  transcrito  aberrante.  Se  ha  demostrado  en diversos  trabajos  que  la  sobreexpresión  de  factores  de  splicing  y  diversas  drogas incrementan  los  niveles  de mRNA  correctamente  procesado(Nissim‐Rafinia  et  al. 2004).  

En el presente estudio  se han  seleccionado  tres pacientes diagnosticados de acidemia propiónica y que genéticamente presentaban en homocigosis mutaciones que  alteraban  el  splicing  generando mayoritariamente  transcritos  aberrantes  (con perdida  de  un  exón)    pero  que  presentaban  ciertos  niveles  de mRNA  procesado correctamente (Tabla 21) para evaluar el efecto de diversas drogas sobre el patrón de splicing.  

Page 88: Cristina Aguado Esteban

72

Tabla 21 : Mutaciones y efectos sobre el mRNA de los tres pacientes analizados. Gen /Paciente  Mutación  Efecto en el mRNA  % Transcritos normales 

PCCA/17475  IVS22nt‐2A>G  Skipping exón 23  6‐16%(Clavero et al. 2004)

PCCA/20743  IVS13nt+3A>G  Skipping exón 13  2‐3 %(Desviat et al. 2006) 

PCCA/19802  IVS13nt+3A>G  Skipping exón 13  2‐3 %(Desviat et al. 2006) 

La presencia de transcritos normales en estos pacientes abría la posibilidad de utilizar  compuestos  como el valproico, el butirato  sódico y  la kinetina  cuyo efecto sobre  la restauración del splicing normal había sido descrito en otros  trabajos. Para analizar  este  posible  efecto  se  cultivaron  fibroblastos  de  los  tres  pacientes  en presencia  de  valproico  o  butirato  sódico  a  una  concentración  final  de  500  μM durante  24  horas  o  con  kinetina  100  μM  durante  72  horas,  después  se  recogió  el precipitado celular mediante centrifugación y posteriormente se cuantificó el mRNA correctamente  procesado  llevando  a  cabo  una  qRT‐PCR  utilizando  sondas específicas  para  los  exones  delecionados  que  nos  permitían  rescatar  sólo  los transcritos normales. No se observó variación significativa en los niveles de mRNA correctamente  procesado  para  las  tres  líneas  de  fibroblastos  con  ninguno  de  los compuestos  utilizados.  Para  el  paciente  17475  se  llevaron  a  cabo  además experimentos de medida de  actividad PCC y  tampoco  se observó un  aumento  en presencia de los diversos compuestos (Fig 26) 

0

20

40

60

80

100

120

16440(control)

17475 17475Valproíco500μM 24 horas

17475NaBu

500μM 24 horas

17475Kinetina100μM 72 horas

Figura 26: Porcentaje de mRNA con el exón 23 y actividad de fibroblastos control y del paciente 17475  tras  cultivo en presencia de diversos  compuestos. Los datos  son  la media de al menos dos experimentos independientes por duplicado. 

RNA Actividad

Cantidad relativa (%)

Page 89: Cristina Aguado Esteban

73

4.4.2  ANÁLISIS  DEL  EFECTO  DE  OLIGONUCLEÓTIDOS  ANTISENTIDO SOBRE LA INCLUSIÓN ABERRANTE DE PSEUDOEXONES.  

Los pacientes 22742 y 23660 fueron diagnosticados de acidemia propiónica en base  a  sus  niveles  de  metabolitos  marcadores  en  sangre  y  orina  y  ensayos enzimáticos  en  fibroblastos  y  fueron  referidos  al  laboratorio  para  su  estudio genético. 

 En el cDNA del paciente  22742 se observó una inserción entre los exones 14 y 

15 de 84 pares de bases correspondientes a una región del intrón 14 del gen PCCA. Esta secuencia intrónica ya había sido descrita (Campeau et al. 1999) como transcrito minoritario en individuos normales, pero en el paciente el transcrito con la inserción era prácticamente exclusivo. Los análisis en el gDNA del paciente 22742 revelaron el cambio nucleotídico IVS14‐1416A>G en el interior de las 84 pb. El análisis mediante programas de predicción de secuencias auxiliares de splicing, en concreto el uso de ESEfinder ha identificado que este cambio nucleotídico en el paciente PCCA elimina un sitio de unión para SRp55 y crea una nueva secuencia de unión a SRp40 (Fig. 27), por lo tanto este cambio generaría una secuencia reconocida con gran afinidad por la maquinaria de splicing que llevaría a cabo la inclusión en el mRNA maduro de las 84 pb como si fueran un exón (pseudoexón).  

Figura 27: Análisis in silico con el programa ESEfinder del pseudoexón para PCCA en cuyo interior se encuentra la base que aparece mutada en el paciente (rosa). Se muestran el cambio en el patrón de unión a los factores de splicing Srp55 y Srp40 dependiendo si la base es la A ( nucleótido wt) o la G (nucleótido mutante)

De manera análoga,   para el paciente 23660 se  identificó una  inserción en el cDNA de PCCB de 72 pares de bases entre los exones 6 y 7 correspondientes a una región del  intrón 6. El cambio nucleotídico encontrado en gDNA es  IVS6+462A>G, este cambio se encuentra en  la posición +5 relativa al GT de  la secuencia  insertada  incrementando el sitio 5´críptico donador de splicing aumentando el score de 0,93 a 1 

SF2/ASF

ag//…………TGAATTTCATA/GGAACATCAGTTT…………..//gt

SC35 SRp40 SRp55

A G

Page 90: Cristina Aguado Esteban

74

aumentando  la afinidad de  la secuencia consenso de reconocimiento de U1snRNA (Fig. 28). Análisis adicionales in silico utilizando el ESEfinder predicen la creación de un  sitio para SRp55. Como ocurre para el paciente 22742 parece probable que ese cambio  genere  un  reconocimiento  por  parte  de  la maquinaria  de  splicing  de  una región  en  el  intrón  6  que  se  introducirá  en  el  mRNA  maduro  como  un  exón generando un mensajero aberrante cuya traducción queda interrumpida de manera prematura.  

Figura 28: Alineamiento entre  la secuencia consenso para U1snRNA y  la región donadora de splicing del pseudoexón, se observa que el cambio de una A por una G en el nucleótido + 5 (en rojo) del pseudoexón aumenta la complementariedad entre ambas secuencias.  

A  partir    de  estos  datos  previos,  nos  planteamos  como  hipótesis  que  la eliminación de  estas  inserciones produciría  la  recuperación del mRNA normal,  la obtención de proteína normal y como consecuencia la recuperación de la actividad. 

 Para la eliminación del pseudoexón se utilizaron oligonucleótidos antisentido 

tipo morfolinos  (diseñados,  sintetizados  y purificados por  la  casa  comercial Gene Tools)  que  se  unirían  a  la  región  3´  ó    5´  del  pseudoexón    e  impedirían  su reconocimiento por parte de  la maquinaria de  splicing y  su  inclusión en el mRNA final (Fig 29).  

c.1209ins84 (IVS14-1416A>G)

Exon 14 ag

10.92

0.92

Exon 15ag gt

0.98

A >G

gt

Exon 14 Exon 1584 bp

a)

c.654ins72 (IVS6+462A>G)

A >G

Exon 6 ag

0.98

Exon 7ag gt

0.93

Exon 6 Exon 7

gt

0.87

72 bp

b)

1

Figura 29:  Esquema de la incorporación a) del fragmento de 84 pares de bases en el mRNA de PCCA entre los exones 14 y 15 y b) del fragmento de 72 pares de bases en el mRNA de PCCB  entre  los  exones 6 y  7. En verde  se muestra  el  cambio nucleotídico presente  en  cada paciente y en azul el oligo antisentido que se une a la región 5´ o 3´del pseudoexón. También se  indica encima de las  diferentes secuencias el valor de splicing según (Shapiro et al 1987).  

U1 snRNA UCCAUUCAUA

Paciente PCCB AGGTACATAT

G

Page 91: Cristina Aguado Esteban

75

El  cultivo  de  los  fibroblastos  de  los  dos  pacientes  en  presencia  de  los oligonucleótidos  antisentido  (AON)  en  las  condiciones  que  se  describen  en materiales  y métodos  permitió  la  recuperación  total  del  transcrito  normal  (sin  la inserción) tanto a las 48 horas como a las 72 horas de tratamiento con el AON tanto a 10μM  como a 20  μM  (Fig. 30). La  identidad de  las bandas  se comprobó mediante secuenciación. 

 

Exon 14 Exon 15

Exon 14 Exon 15

Exon 14 Exon 15

Exon 14 Exon 15

1 2 3 4Exon 6 Exon 7

Exon 6 Exon 7

1 2 3 4Exon 6 Exon 7

Exon 6 Exon 7

Figura  30: RT‐PCR  a partir de mRNA obtenido de  fibroblastos  control y de  los pacientes 22742  y 23660 sin transfectar o 72 horas tras la transfección con 10 μM ó 20 μM de AON. a) carril 1: fibroblastos control, carril 2: 22742, carril 3: 22742 + 10 μM AON, carril 4: 22742 + 20 μM AON. b) carril 1:  fibroblastos    control, carril 2: 23660, carril 3: 23660 + 10 μM AON, carril 4: 23660 + 20 μM AON  

Por  otra  parte  se  llevo  a  cabo  la  medida  de  la  actividad  PCC  en  los fibroblastos de los pacientes transfectados con los AONs, para comprobar si 72 horas tras  la  transfección  la  recuperación  del  transcrito  normal  era  paralela  a  una recuperación de  la  actividad. Los  resultados  indican  que  la  actividad  se  recupera totalmente alcanzando niveles control en ambas líneas celulares (Fig. 31). 

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

0 0 10 20 0 10 20

Act

ivid

ad P

CC

(pm

ol/m

in/m

g)

22742 23660 Línea celularControl

[ AONs ] µM

Figura 31: Medida de la actividad carboxilasa en fibroblastos control y de los pacientes 22742 y 23660 72 horas tras la transfección con distintas concentraciones de AONs. Todos los datos son la media de tres experimentos independientes por duplicado. 

1 2 3 4

a)   b) 

Page 92: Cristina Aguado Esteban

76

Asimismo, en el caso del defecto en el gen PCCA, analizamos la cantidad de proteína PCCA biotinilada en los fibroblastos del paciente 22742 transfectados o no con 20 μM de AONs durante 72 horas, observándose que en presencia de AONs se recupera la proteína PCCA (Fig 32). 

Figura 32: Detección de las proteínas biotiniladas PCCA y MCCA en extractos celulares de fibroblastos del paciente 22742 sin transfectar con AON o 72 horas tras la transfección con 20µM del AONs. Se utilizaron mitrocondrias de hepatoma como control.

Para comprobar que el efecto de los oligonucleótidos antisentido sobre los fibroblastos de los pacientes era específico de secuencia se hicieron una serie de experimentos utilizando diferentes AONs y diferentes líneas celulares. En primer lugar   se cultivaron  los  fibroblastos del paciente 22742 con un oligo antisentido específico de otro gen diferente a PCCA y  se midió  la actividad  en  el  extracto celular tras transfección durante 72 horas con 20 μM de este AON, el resultado obtenido fue que la línea celular 22742 no presentaba aumento de actividad con respecto al cultivo sin  transfectar,  lo mismo ocurría para  la  línea celular 23660, cuando  se  transfectaba durante  72 horas  con 20  μM de un AON no  específico para el gen PCCB.  

La  secuencia  intrónica  que  se  incorpora  en  el  mRNA  de  PCCA  del 

paciente  22742  ya  había  sido  descrita  (Campeau  et  al.  1999)  como  transcrito minoritario  en  individuos  normales  y  también  es  detectada  en  pacientes  con mutaciones de  frameshift o mutaciones nonsense que producen mRNA con un codón  de  parada  prematuro  (PTC).  Se  eligió  un  paciente  (21398)  con  una mutación  nonsense  en  homocigosis  y  que  presentaba  la  inserción  para comprobar  si  la  eliminación  de  la  inserción  utilizando  el  AONs  revertía  el fenotipo  deficiente.  El  resultado  fue  que  no  se  recuperó  la  actividad  en  este paciente, siendo por  lo tanto el efecto observado para el AONs, específico de  la mutación del paciente 22742.  

 

Hep 3B - AON

MCCA PCCA

20 µM AON

Page 93: Cristina Aguado Esteban

77

                  

5. DISCUSIÓN 

Page 94: Cristina Aguado Esteban

78

5.1 RESPUESTA A COFACTORES EN EMH  5.1.1 Respuesta a tetrahidrobiopterina en fenilcetonuria.   

El  genotipado  de  pacientes  PKU  sometidos  a  sobrecarga  con  BH4  intenta establecer  las  relaciones entre el  fenotipo y el genotipo de  los  fenilcetonúricos que responden a BH4 para  intentar predecir en base al genotipo que pacientes, a priori, son  susceptibles  de  ser  respondedores.  La  expresión  y  caracterización  de  las mutaciones  asociadas  a  respuesta  a  BH4  intenta  esclarecer  cuales  con  los mecanismos moleculares subyacentes a la respuesta.  

Un  alto  porcentaje  de  los  pacientes  del  presente  trabajo  con  una  respuesta favorable al  test de  sobrecarga presentaban  fenotipos  suaves  (HFAs y PKU  leves). Actualmente  se cree que el número de pacientes que  se pueden beneficiar de este tratamiento podría representar el 60‐80 % PKU  leves o moderados y un 40% de  la población total PKU (Blau and Erlandsen 2004; Zurfluh et al. 2008). 

 En general  la diversidad alélica en  los pacientes que responden es grande y 

casi  el  90%  de  ellos  son  compuestos  heterocigotos,  por  lo  tanto  es  importante  el estudio de los genotipos asociados a respuesta en cada población para determinar su prevalencia. 

 La mayoría de las variantes alélicas missense que portaban los pacientes que 

respondían (Tabla10) habían sido previamente descritas en pacientes respondedores, excepto la R176L, S87R, P275R y L348V. De estas cuatro mutaciones las dos primeras  se  encontraban  presentes  en  pacientes  hemicigotos  (en  combinación  con  una mutación  funcionalmente nula) permitiendo determinar  su  relación directa  con  la respuesta a BH4, las otras dos mutaciones aparecen combinadas en un paciente  y se desconoce  cual de  las dos o  si  la  combinación de ambas es  responsable del efecto positivo  frente  a BH4, ya que L348V  aparece  junto  a Y414C  en un PKU  leve que responde pero también en un paciente que presenta una mutación de splicing y  que es no respondedor.   

Otras  dos  mutaciones  interesantes  son  D415N  y  E390G,  que  han  sido previamente descritas  como posiblemente  asociadas  a  respuesta pero  que  en  este estudio se encontraban combinadas en algún paciente con mutaciones nulas por  lo que se demuestra su implicación directa en la respuesta.   

  Todas  las mutaciones missense asociadas a respuesta en este  trabajo  (excepto P275R) han sido analizadas cinéticamente en diversos trabajos y presentan actividad residual (Pey et al. 2003), de ellas el 70% se localizan en el dominio catalítico, el 15% 

Page 95: Cristina Aguado Esteban

79

en el dominio regulador y el otro 15% en la región de tetramerización, coincidiendo esta distribución con la descrita en otros estudios (Zurfluh et al. 2008)  

La única mutación no missense que está asociada a respuesta es IVS10‐3ntC>T, esta aparece en homocigosis en un paciente HFA (19548) que presenta una respuesta lenta. Esta mutación produce un skipping del exón 11 en el mRNA. Los estudios de splicing  en  este  trabajo  (Fig.  12)  y  en  otros  anteriores  (Jaruzelska  et  al.  1995)  han demostrado que existen transcritos normales, y por lo tanto proteína normal, lo cual explicaría el fenotipo suave del paciente. Este caso es el primero en el que se asocia una mutación de splicing a una respuesta a BH4  (recientemente se ha descrito otra mutaciones de splicing (IVS4  ‐5C>G) que ha sido asociada claramente a respuesta a BH4    (Zurfluh  et  al.  2008)).  La  estabilización,  al  actuar  la  BH4  como  chaperona química,  de  los  niveles  reducidos  de  proteína  PAH  normal  en  este  paciente, produciría un aumento en  la  cantidad y actividad PAH y  justificaría  la  respuesta. Esta  hipótesis  se  correlaciona  con    resultados  en  hepatoma  que  se discuten  en  el siguiente apartado. Otra hipótesis que explicaría  la respuesta en este paciente sería que  los  niveles  elevados  de  BH4  produjeran  la  activación  de  la  transcripción  del mRNA  de  la  PAH  o  la  activación  de  factores  de  splicing  que  aumentarían  el porcentaje de transcrito correctamente procesado con el exón 11.   

En  este  trabajo  ciertas mutaciones  (I65T, R261Q, L348V,)  aparecen  tanto  en individuos  que  responden  como  en  aquellos  que  no  y  se  han  descrito  en  otros trabajos    inconsistencias  en  la  respuesta  en  pacientes  con  el  mismo  genotipo, particularmente en pacientes que portan las mutaciones L48S, I65T, R158Q, R261Q e Y414C  (Desviat et al. 2004; Fiori et al. 2005; Leuzzi et al. 2006; Yildirim et al. 2007) esto  hace  que  todavía  sea  desconocida,  para  algunas  mutaciones,  cual  es  su implicación  en  la  respuesta, desconociéndose por  el momento hasta que punto  la combinación  de  distintas  mutaciones  y  las  características  fisiológicas  de  cada individuo determinan la respuesta. A pesar del número de trabajos realizados y del elevado número de  pacientes descritos con una repuesta positiva, la diversidad en los protocolos utilizados no permite comparar todos los casos de forma cuantitativa.  

La presencia de algunas mutaciones de  forma persistente  (I65T aparece en 4 de los 11 respondedores de este trabajo y D129G aparece en 3 pacientes descritos en varios  trabajos  (Baldellou  et  al.  2006; Hennermann  et  al.  2005)  y  la  existencia  de individuos  homocigotos  (IVS10‐3  C>T)  o  hemicigotos  (D415N,  E390G...)  que responden, permite pensar que determinadas mutaciones o combinados genotípicos están asociados directamente a la respuesta.   

Los  casos  reportados  de  monoterapia  con  BH4  a  largo  plazo  parecen prometedores  ya  que  algunos  pacientes  mantienen  en  su  sangre  niveles  de fenilalanina dentro de los rangos terapéuticos (Belanger‐Quintana et al. 2005; Cerone et al. 2004; Hennermann et al. 2005; Lambruschini et al. 2005; Trefz et al. 2005) por lo 

Page 96: Cristina Aguado Esteban

80

que  esta  terapia  se  muestra  como  una  alternativa  real  a  la  dieta  y  hace  muy interesante  la posibilidad de poder predecir en muchos casos  ,en base al genotipo, qué  individuos  fenilcetonúricos  tienen  altas  probabilidades  de  beneficiarse  del tratamiento oral  con BH4. Recientemente  se ha descrito  la eficacia del  tratamiento con  una  forma  sintética  biológicamente  activa  de  la  BH4,  la  dihidroclorido sapropterina  (comercialmente  llamado KuvanTM) y que se encuentra en  fase clínica III(Burton et al. 2007; Levy et al. 2007)  

Con  el  objetivo  de  entender  los mecanismos  que  subyacen  a  la  respuesta positiva  a  BH4  se  han  llevado  a  cabo  diversos  estudios  de  expresión  para  caracterizar cinética y estructuralmente la PAH normal y varias proteínas mutantes presentes en pacientes que responden.  

 Por estudios estructurales previos se conoce que  las mutaciones asociadas a 

respuesta no sólo afectan a las regiones de unión al BH4 o a regiones próximas a esta zona sino que se encuentran distribuidas por los tres dominios de la PAH por lo se han propuesto  varias hipótesis para  explicar  el  efecto de  la BH4  sobre  la PAH:1) efecto  catalítico  (compensación  de  Km  elevadas),  2)  efecto  estabilizador  sobre  la proteína  (chaperona  química),  3)  efecto  sobre  la  expresión  génica  de  la  PAH, aumentando la transcripción o estabilizando el mRNA , 4) efecto por compensación de concentraciones subsaturantes de cofactor en hígado y 5) efecto protector de  la BH4 frente a la inactivación  Mediante el análisis cinético llevado a cabo en cinco proteínas mutantes (D129G, 

H170D, V190D, E390G, P407S)  como proteínas de  fusión  a MBP,  se ha observado que cuatro de  las cinco presentan defectos en alguna de  las propiedades catalíticas y/o reguladoras, con pérdida de función,  pero manteniendo actividad residual.  

 La Km por BH4 sólo está elevada en  la proteína mutante D129G, por  lo que 

para las otras cuatro variantes analizadas cinéticamente en este trabajo, la hipótesis catalítica no es la que subyace a la respuesta positiva. Respecto a la mutante D129G analizando la estructura de la proteína PAH se observa que el Asp 129 se encuentra localizado en el dominio catalítico y forma un puente de hidrógeno con la Ala132 y con  la Arg 234. El cambio del aspártico 129 por una glicina altera  las  interacciones con estos dos aminoácidos produciendo una desestabilización de la parte inicial de la  región  catalítica,  este  cambio  estructural  podría  propagarse  al  centro  activo pudiendo  afectar  a  la  afinidad por BH4 y  resultando  en un  incremento de  la Km (Fig. 33). 

Se han  identificado más mutantes de Km en estudios previos en el  laboratorio (F39L,  I65T,  P244L,  L308F  y  A309V),  pero  además  de  representar  un  número reducido dentro de  las mutaciones  asociadas  a  respuesta,  los  incrementos de Km detectados en ellas son leves, por lo que se  piensa que este no es el mecanismo más 

Page 97: Cristina Aguado Esteban

81

importante  implicado en  la respuesta. Se ha descrito que en PKU solo un tercio de las proteínas mutantes asociadas a respuesta a BH4 presentan una afinidad reducida por este cofactor (Pérez et al. 2005). 

Figura 33: Visualización parcial de la estructura cristalizada de la PAH humana. La figura muestra la Asp129 (verde),  los aminoácidos con  los que interaccionan,  la Arg 243 y la Ala132. Se muestra la BH4 (rojo) localizada en el sitio activo.  

Para  analizar  el  efecto  de  la  BH4  sobre  la  estabilidad  de  las  proteínas mutantes  se  han  analizado  once  proteínas mutantes  (F39L,  R68S,  E178G, V190A, A300S, A309V, A313T, A373T, V388M, E390G,   Y414C) en el  sistema de expresión TNT  libre  de  células,  la  mayoría  de  ellas  tienen  vidas  medias  disminuidas  en ausencia de BH4 y con  respecto a  la salvaje, confirmándose un defecto estructural que originaría una degradación acelerada. En tres de ellas (A309V, V388M y Y414C) este defecto  es  corregido  al  aumentar  los  niveles de BH4. Este  resultado  avala  la hipótesis de que la BH4 ejerce un efecto protector sobre algunas mutaciones frente a la degradación proteolítica.  En la PAH recombinante se ha demostrado que la unión a BH4 resulta en una reducción en la proteólisis por tripsina (Solstad and Flatmark 2000).   

La utilización de un modelo celular de hepatoma para estudiar el efecto de distintos niveles de BH4 sobre la PAH endógena y sobre proteínas de fusión PAHwt y mutantes  transfectadas permite  estudiar  la  relación  entre BH4  y  la PAH  en un entorno más  fisiológico.  Cuando  el  hepatoma  se  cultiva  en  presencia  de  niveles elevados  de  BH4  se  observa    una  mayor  cantidad  de  proteína  y  una  mayor estabilidad de  la PAH endógena, este efecto ha sido observado  también utilizando como modelo  el  ratón wt y  el  ratón deficiente  en  el gen PTS  (Scavelli  et  al.  2005; Thony  et  al.  2004).  Este  efecto  estabilizador  sobre  la  PAH  endógena  justifica  la respuesta  a  BH4  que  existe  en  el  paciente  19548  (Tabla  10).  Este  paciente  es homocigoto para  la mutación de  splicing  IVS10nt‐3 C>T,  este  cambio nucleotídico altera  el  sitio aceptor de  splicing del  intrón 10 y  como  consecuencia  se produce  la eliminación del exón 11 en  la maduración del mensajero aunque esto no ocurre en todos los transcritos, sino que se ha comprobado (Fig. 12) (Jaruzelska et al. 1995) que existen niveles reducidos de mRNA PAH normal. Esto haría que en el paciente se 

Page 98: Cristina Aguado Esteban

82

sintetizara  una  cantidad  reducida  de  PAH  normal  que  sería  estabilizada  por  la sobrecarga a BH4, aumentando  la cantidad relativa de  la enzima y produciendo  la respuesta. 

 Las  tres proteínas expresadas como proteínas de  fusión al péptido FLAG en 

células Hep3B  (A309V, V388M  y  Y414C)  fueron  seleccionadas  por  presentar  una corrección en su defecto estructural en el sistema TNT en presencia de BH4. Cuando transfectamos estas proteínas mutantes en el sistema de hepatoma observamos que dos de las tres se acumulan en menor cantidad que la proteína wt, esto coincide con la menor cantidad de estas proteínas detectadas en el modelo TnT  y como proteínas MBP‐PAH expresadas en E coli. También se observa que al cultivar el hepatoma con niveles  elevados  de  BH4  las  tres  proteínas mutantes  transfectadas  aumentan  su cantidad relativa entre 1,5 ‐ 2,5 veces alcanzando y superando en algunos casos los niveles  de  la  proteína  FLAG‐PAHwt,  coincidiendo  también  con  los  resultados obtenidos en el modelo TNT.  

Todos  estos  resultados  obtenidos  en  diversos  trabajos  y  con  diversas metodologías  permiten  afirmar  que  el  efecto  estabilizador  de  la  BH4  como chaperona  química  sobre  la  PAH  previniendo  su  degradación  es  un mecanismo relevante en la respuesta.  

Existen varios trabajos en la literatura sobre el efecto a nivel de regulación de la expresión génica de la BH4. Para la proteína oxido nítrico sintasa, de la que la BH4 es también cofactor, se ha descrito que un aumento en los niveles de BH4 producen un aumento en los niveles de mRNA de esta enzima (Linscheid et al. 1998; Saura et al.  1996)  y para un  ratón  transgénico  con defecto  en  la GTP  ciclohidrolasa,  se ha descrito  un  aumento  de  actividad,  niveles  de  proteína  y mRNA  para  la  PAH  en hígado tras administración oral de cofactor (Hyland and Munk‐Martin 2001).  

En  el  presente  estudio  se  analizó  el  posible  efecto  de  la  BH4  sobre transcripción y estabilidad del mRNA de la PAH en hepatoma. Para ello se midió el efecto  de  niveles  elevados  de  BH4  sobre  el  mRNA  PAH  endógeno  y  sobre  la expresión  de  genes  reporter  clonados  bajo  el  promotor  de  la  PAH.  Los  niveles elevados de BH4 no ejercen ningún efecto ni en la mayor expresión del gen PAH, ni en  la mayor estabilidad del mRNA. Esto concuerda con otro estudio utilizando un modelo experimental de ratón con defecto en  la ruta de biosíntesis del cofactor (en concreto el gen PTS) en el cual se observó que mientras la actividad y la cantidad de enzima disminuyen (al estar disminuidas las concentraciones de BH4) las cantidades de mRNA son similares para  los ratones control que para  los defectivos (ratón k.o. para PTPS)(Thony et al. 2004).  

En  los  estudios  con  hepatoma  se  observa  un  efecto  del  dicumarol,  este disminuye la cantidad de mRNA de la PAH. El hecho de que el dicumarol no sólo sea un inhibidor de la sepiapterina reductasa y por lo tanto de la biosíntesis de BH4, 

Page 99: Cristina Aguado Esteban

83

sino  que  también  inhibe  otros  procesos  celulares  sugiere  que  la  inestabilidad  y disminución del mensajero de la PAH quizá no sea específico de la bajada del BH4 sino secundario a otros efectos del dicumarol, esto coincide con que al utilizar otro inhibidor de la vía de síntesis del cofactor (DAHP) no se observa disminución en los niveles  de  mRNA.  De  manera  inesperada  la  inhibición  de  la  enzima  GTP ciclohidrolasa con DAHP produce un aumento en  la cantidad y por  lo  tanto en  la actividad  de  la PAH  que podría  explicarse por un posible  efecto  inespecífico del DAHP sobre la traducción que justificaría este resultado.  

Existen otras hipótesis asociadas al efecto de la BH4 que han sido analizadas en otros estudios y que podrían contribuir a  la respuesta,   una de ellas se basa en que  las  concentraciones  fisiológicas  de  BH4  en  el  hígado  son  subsaturantes,  concentraciones inferiores a la Km por BH4 de la PAH, produciendo una actividad submáxima  de  la  PAH.  La  sobrecarga  con  BH4  produciría  un  aumento  en  las concentraciones  del  cofactor  en  el  hígado  aumentando  la  actividad  fenilalanina hidroxilasa (Kure et al. 2004).   

También  en  trabajos  previos  en  el  laboratorio  se  ha  postulado  que  la  BH4 ejerce un efecto protector frente a la inactivación por un fenómeno de tipo oxidativo. Este efecto protector de  la BH4  frente a  la  inactivación oxidativa puede deberse al cambio conformacional que el cofactor parece inducir sobre la proteína, que causa la oclusión del centro activo por una  secuencia autorreguladora presente en el dominio N‐terminal,  pudiendo  proteger  de  este  modo  a  los  residuos  esenciales  para  la catálisis. La BH4 también podría actuar directamente como antioxidante (Kohnen et al. 2001; Kuzkaya et al. 2003)  ya sea libre en disolución o unido al centro activo de la PAH.   

Los distintos datos existentes en  la  literatura y  los obtenidos en este estudio permiten  afirmar  que  aunque  los  mecanismos  moleculares  que  subyacen  a  la respuesta positiva a BH4  todavía no han  sido  totalmente dilucidados,  se confirma que posiblemente sea un efecto multifactorial y dependiente del  tipo de mutación, apuntando a un efecto estabilizante de la BH4 que actuaría como chaperona química como mecanismo mayoritario. 

Page 100: Cristina Aguado Esteban

84

5.1.2 Respuesta a cobalamina en acidemia metilmalónica aislada  Para  conocer  los  mecanismos  moleculares  responsables  de  la  respuesta  a 

cobalamina  in vivo e  in vitro que se ha descrito en diversos pacientes con acidemia metilmalónica  aislada perteneciente  al  grupo de  complementación  cblB    (mutante MMAB) se ha utilizado un sistema de expresión procariota  para expresar y analizar cinética  y  estructuralmente  la  enzima  codificada  por  el  gen  MMAB,  la ATP:cob(I)alamina    adenosiltransferasa  humana  (hATR)    con  varias  mutaciones (I96T y  R195H) asociadas a esta respuesta. 

 La primera mutación I96T es una mutación missense localizada en el exón 3  y 

la segunda mutación aparece en el último nucleótido del exón 7 y afecta al correcto procesamiento del mRNA produciendo la deleción del exón 7 y como consecuencia una mutación  de  parada  prematura  p.S174fs.  Existe  la  posibilidad  de  que  haya transcritos con el exón 7 pero con la mutación R195H, aunque datos del laboratorio indican  que  dichos  transcritos  serán muy minoritarios  por  lo  que  la  respuesta  a cobalamina será responsabilidad fundamentalmente de las características cinéticas y conformacionales de la proteína mutante I96T. 

 La mutación  I96T aparece en otro paciente con  respuesta positiva  in vitro a 

cobalamina  en  combinación  con  la mutación  R191W,  localizada  en  la  región  de trimerización  (Fig.  34)  La mutación  R191W  ha  sido  expresada  como  proteína  de fusión a GST   y presenta una disminución de su afinidad por  los sustratos ATP y cob(I)alamina (Zhang et al. 2006). Para este paciente la respuesta a cobalamina por lo tanto será debida a un efecto a varios niveles debido a las características cinéticas y estructurales  tanto de la mutante R191W  como de la mutante I96T. 

Figura 34: Visualización parcial de la estructura trimérica cristalizada de la ATR humana. La figura muestra la región de interacción entre los tres monómeros con los pares implicados en trimerización Glu84(gris)  /Arg195(azul oscuro) y Glu91(verde oscuro)  / Arg191 (rosa) y  los puentes de hidrógeno que establecen entre ellos en verde punteado. En azul claro se muestra la I96.  

 Mediante el análisis cinético se ha observado que la proteína con la mutación 

I96T tiene un 60% de actividad con respecto a proteína la wt, pero esta disminución 

I96

R191

R195

E91

E84

Page 101: Cristina Aguado Esteban

85

de la actividad no es debida a una disminución de la afinidad por los sustratos ATP o Cob(II)alamina cuyas Km y Kd se ha comprobado que son normales. Esta menor actividad  tampoco parece  ser debida  a una distribución oligomérica  incorrecta ya que por  cromatografía en gel  se ha observado una  composición mayoritariamente trimérica muy similar a la obtenida para la proteína salvaje por lo que es posible que la menor actividad de la proteína sea debida a una menor estabilidad de la misma. 

 El análisis cinético para  la mutación R195H revela unos niveles de actividad 

iguales a  los de  la proteína wt. Sin embargo  la distribución de  los oligómeros esta alterada apareciendo una proporción de monómeros mayor. Parece, por  tanto una mutación  estructural,  este  resultado  sería  coherente  con  la  posición  que  ocupa  el aminoácido alterado, la arginina 195. El aminoácido R195 es esencial en la región de trimerización junto con Glu 84, Glu 91 y Arg 191 (Fig 34), la alteración en cualquiera de estos aminoácidos podría alterar de forma significativa la formación y estabilidad del oligómero. La proteína ATR con la mutación R195H presenta una proporción de trímeros  disminuida  pero  una  actividad  similar  a  la  wt,  este  resultado  podría deberse a que el ensayo de actividad se llevó a cabo inmediatamente después de la purificación de la proteína mientras que la cromatografía se realizó tras almacenar la proteína durante 48 horas a 4ºC.  

Sería necesario llevar a cabo experimentos para calcular la vida media de las dos  proteínas  mutantes  para  poder  determinar  la  existencia  de  un  defecto estructural.  

En el caso más probable de que la mayoría de los trímeros que forma la hATR en  el  paciente  portaran  la  mutación  I96T  y  teniendo  en  cuenta  los  resultados obtenidos en  los estudio cinéticos y de estructura,  la respuesta a cobalamina no es debida a una  compensación por alteraciones en  las  constantes de afinidad por  los sustratos sino que parece más probable que la hidroxicobalamina ejerza otros efectos entre  los que estaría un efecto estabilizante. Sería necesario analizar el efecto de  la cobalamina sobre la estabilidad de las proteínas mutantes de manera similar a como se ha hecho para PAH y BH4. 

 La ATR no sólo cataliza la transferencia de un grupo adenosilo desde el ATP 

a  la cobalamina para generar  la adenosilcobalamina, sino que es  la  responsable de transferir esta AdoCbl a la enzima de la que es cofactor, la metilmalonil‐CoA mutasa (MCM),  en  este  proceso  está  implicada  además  la  proteína  MMAA  (que  tiene actividad  GTPasa)  aunque  todavía  se  desconoce  que  papel  exacto  ejerce  en  la transferencia  (Banerjee 2006). Se postula que  las  tres proteínas  interaccionarían por lo  que  mutaciones  en  cualquiera  de  las  tres  proteínas  pueden  alterar  estas interacciones  y  producir  como  resultado  un  defecto  en  la  actividad MCM.  Sería interesante  conocer  como  afectan  las  mutaciones  de  la  proteína  ATR  en  la interacción  con  las  otras  dos  proteínas  y  si  niveles  elevados  de  cobalamina estabilizan esta unión. 

Page 102: Cristina Aguado Esteban

86

 5.1.3 Respuesta a biotina en acidemia propiónica y en metilcrotonilglicinuria   

 En  este  estudio  hemos  utilizado  dos  líneas  celulares,  linfoblastos  (MCR)  y 

hepatoma 3B (Hep3B), para determinar el efecto de diferentes niveles de biotina en el medio de cultivo de las células sobre la expresión de varios genes, entre ellos, los genes que codifican para la subunidad que une biotina en dos carboxilasas celulares (PCC  y  MCC),  defectivas  en  acidemia  propiónica  y  metilcrotonilglicinuria, respectivamente 

 No  se  han  obtenido  evidencias  de  que  exista  modulación  a  nivel 

transcripcional por parte de  la  biotina de  los  genes MCCA  y PCCA  en  estos dos tipos celulares. Estos datos coinciden con  los resultados obtenidos en estudios con células Jurkat (Manthey et al. 2002; Rodriguez‐Melendez et al. 2001) y en células de rata de diversos tejidos (Rodriguez‐Melendez et al. 2001; Rodriguez‐Melendez et al. 1999) pero son contrarios a  los obtenidos en HepG2    (Pacheco‐Alvarez et al. 2004; Solorzano‐Vargas  et  al.  2002)  donde  se  muestra  una  regulación  dependiente  de biotina  de  los  niveles  de mRNA  de  las  carboxilasas.  También  se  observó  que  no existía efecto de la biotina sobre la transcripción del gen HLCS que codifica para la enzima  holocarboxilasa  sintetasa  responsable  de  la  biotinilización  de  la apocarboxilasas. Para este gen  también ha sido documentado una regulación de  la expresión génica por parte de la biotina (Solorzano‐Vargas et al. 2002). La diferencia de  resultados en  los distintos estudios puede  ser atribuida a  las diferencias en  las técnicas  experimentales  utilizadas  y/o  a  efectos  de  factores  biológicos  aun  no identificados.   

Aunque no existía un efecto de la biotina sobre la transcripción de ninguno de los genes más  relevantes para  las  carboxilasas  en nuestro modelo  celular,  esto no descartaba  la posibilidad de un efecto a otros niveles. El estudio de  los niveles de actividades  carboxilasas  y proteínas  biotiniladas  llevado  a  cabo  en  células Hep3B permitió observar que existía una correlación directa entre los niveles de biotina, las actividades PCC y MCC y  la cantidad de proteína biotinilada,  también se observó que la proteína MCC es más sensible a la disminución de los niveles de biotina que la PCC, este efecto coincide con otros trabajos (Suormala et al. 2002). 

 Los  estudios  de  reactivación  de  las  carboxilasas  con  biotina  a  distintos 

tiempos  y  en  presencia  o  ausencia  de  puromicina  permitieron  determinar  que  la síntesis de proteína no es requerida para  la recuperación de  la actividad. Sí parece que podría existir un cierto efecto estabilizador de la biotina ya que la recuperación de la actividad en ausencia de puromicina y añadiendo biotina 10 μM no es total a los 30 minutos (la PCC alcanza un 55% de actividad con respecto a la wt y la MCC tan solo recupera un 20% de actividad), aunque tras ocho horas ambas actividades alcanzan  los  niveles  control.  En  cualquier  caso  no  es  descartable  un  cierto  efecto 

Page 103: Cristina Aguado Esteban

87

estabilizante de  la biotina  sobre  las  carboxilasas aunque parece que  el mecanismo mayoritariamente  responsable  de  la  reactivación  es  el  paso  de  apocarboxilasa  a holocarboxilasa. 

 In  vivo  la  terapia  con  biotina  produce  respuesta  positiva  en  pacientes  con 

deficiencia en  los defectos de biotinidasa y en  los defectos en HCS, en este último caso  la  base  molecular  mayoritariamente  responsable  de  esta  respuesta  es  la compensación  en  el  defecto  de  afinidad  (Km  elevada)  por  biotina  que  existe  en muchas de  las proteínas HCS mutantes  (Sakamoto et al. 1999; Suzuki et al. 1996)} aunque  también han sido  reportados casos en  los que  la  respuesta esta asociada a mutaciones de splicing (Sakamoto et al. 2000; Santer et al. 2003), lo que indicaría que puede haber otros mecanismos implicados en al respuesta. Sin embargo en acidemia propiónica  (AP)  no  ha  sido  reportado  ningún  caso  de  respuesta  a  biotina    y  en metilcrotonilglicinuria  (MCG)  sólo  se  ha descrito un paciente  (Baumgartner  et  al. 2004).  

 Aunque por los estudios existentes hasta ahora no parece haber una respuesta 

significativa, desde el punto de vista bioquímico, a  la administración de biotina en pacientes  con  acidemia  propiónica,  se  recomienda  la  administración  de  biotina continuada a dosis de 5‐10 mg/día, que podría ser útil para mantener la enzima con actividad residual plenamente activa en los momentos de stress metabólico, además son necesarios más estudios que permitan entender las diferencias en los resultados obtenidos en distintos tipos celulares y la no respuesta in vivo.  

Los  resultados  hasta  ahora  indican  que  la  respuesta  a  biotina  en  acidemia propiónica y metilcrotonilglicinuria es un evento poco común, por lo que no parece que pueda llegar a ser una terapia relevante en estas enfermedades.   

Page 104: Cristina Aguado Esteban

88

5.2 TERAPIAS MODULADORAS DE MUTACIONES DE SPLICING EN ACIDEMIA PROPIÓNICA   5.2.1  Efecto  de  drogas  sobre  mutaciones  de  splicing  que  producen  niveles detectables de transcritos normales.  

Se ha descrito que  el uso de  compuestos  como valproico, butirato  sódico y kinetina aumenta  los niveles de  transcritos correctamente procesados en genes con mutaciones  de  splicing  responsables  de  algunas  enfermedades  como  atrofia muscular espinal, fibrosis cística, disautonomía familiar (Andreassi et al. 2001; Hims et al. 2007; Nissim‐Rafinia et al. 2004).  

 El valproico y  el butirato  sódico  son  inhibidores de  las histonas deacetilasas 

(HDAC) y actúan como activadores transcripcionales de genes entre ellos genes que codifican para algunos factores de splicing como Htra2‐β1 y SC35 (Brichta et al. 2003; Chang et al. 2001), estos factores a su vez facilitan el correcto splicing del mRNA, esto ocurre  para  el  caso  del  splicing  del  gen  SMN2  asociado  a  atrofia muscular  espinal (Britchta  L  et  al  2003).  La  kinetina  por  su  parte  favorece  el  splicing  correcto  en  la disautonomía  familiar  y  se  postula  que  influye  en  la  activación  o  la  localización celular  de  proteínas  específicas  de  splicing  (Hims  et  al;  2007).  Debido  a  .que  los factores de  splicing aumentados mediante  la utilización de  los diversos  compuestos son generales, su efecto podría ser efectivo para muchos genes con mutaciones que alteran  el  splicing  pero  que  presentan  ciertos  niveles  de  transcrito  normal,  siendo interesante  llevar  a  cabo  experimentos  en  los diversos pacientes  con  enfermedades metabólicas hereditarias que cumplen estas características.  

En  los  estudios  realizados  en  este  trabajo  con  pacientes  que  portaban mutaciones de splicing responsables de skiping exónico en PCCA  no se ha observado este  efecto  positivo,  no  se  ha  incrementado  el  nivel  de  transcritos  correctamente procesados. El splicing es regulado por  la  interacción de un complejo repertorio de factores  de  splicing  con  diferentes  secuencias  reguladoras  por  lo  que  serían necesarios  estudios  sobre  que  factores  y  en  que  nivel  están  implicados  en  el procesamiento  del  mRNA  para  el  gen  PCCA,  de  esta  manera  podríamos comprender porque no ocurre un efecto favorable de los compuestos utilizados.  

 Para algunos compuestos como la kinetina se ha demostrado que se requieren 

determinados  elementos  en  las  proximidades  de  las  secuencias  canónicas  de  los exones diana (un elemento CAA cerca del extremo 5´ del exón) (Hims et al. 2007) que no están presentes en los exones del gen PCCA. 

 

Page 105: Cristina Aguado Esteban

89

Los  niveles  de  transcrito  normal  PCCA  en  los  pacientes  estudiados  eran aproximadamente entre un 5‐15 % mientras que en  los estudios en  la  literatura el porcentaje  de mRNA  normal  del  gen  correspondiente  nunca  es menor  del  20%, quizá sea necesario un nivel mínimo de reconocimiento de la maquinaria de splicing sobre las secuencias mutantes para que pueda existir un efecto positivo significativo de las drogas en el proceso de splicing.  5.2.2 Efecto de  la  terapia  con  oligonucleótidos  antisentido  sobre mutaciones de splicing que producen inclusión de pseudoexones.  

La modulación del  splicing mediante  el uso de  oligonucleótidos  antisentidos (AONs)  ha  sido  usada  en  fibrosis  cística  y  en  la  distrofia muscular  de  Duchene (Takeshima  et  al.  2006)  para  interferir  el  proceso  de  splicing  y  originar  proteína funcional.  La  existencia  de  pacientes  con  acidemia  propiónica  cuyas  características genéticas  permitían  postular  una  posibilidad  de  beneficio  tras  aplicación  de  esta terapia fue el motor que impulsó los ensayos realizados en el presente trabajo.   

En  los  intrones  existen  secuencias  correspondientes  a  sitios  potenciales  de splicing 3´y 5´de manera muy abundante, sin embargo, no se incluyen estas regiones como exones de manera  frecuente en el mRNA maduro y esto es debido a que, a pesar  de  tener  unos  buenos  valores  de  splicing,  estas  regiones  presentan  otros defectos  importantes,  además  de  un  enriquecimiento  de  regiones  silenciadoras (Buratti et al. 2006) que impiden su reconocimiento como exones verdaderos.  

Estudios  genéticos previos  en  el  laboratorio  en dos pacientes  con  acidemia propiónica permitieron observar que estos pacientes presentaban una  inserción de una  región  intrónica  (pseudoexones)  en  el  mensajero  maduro  y  un  cambio nucleotídico en el gDNA en homocigosis. (Tabla 22).  Tabla 22: Secuencia intrónica insertada y variaciones intrónicas genómicas. 

Gen /Paciente Origen de la secuencia insertada 

Cambio en el mRNA 

Cambio en el gDNA 

PCCA/22742  Intrón 14   r.1284ins84 A→G en el medio del pseudoexón 

(IVS14‐1416A→G) 

PCCB/23660   Intrón 6  r.654ins72 A→G en posición +5 del sitio 5´ 

donador del pseudoexón  (IVS6+462 A→G) 

  

Los estudios in silico de las regiones 3´y 5´de los pseudoexones incorporados en  estos  pacientes  predicen  scores  de  splicing  elevados.  Esto  sugiere  que  tales secuencias deben ser  incluidas en el mRNA maduro generando un mRNA con un 

Page 106: Cristina Aguado Esteban

90

codón de parada prematuro (PTC), que probablemente será diana del sistema NMD que lo degradará, el mensajero que no es degradado predeciblemente generará una proteína no funcional.    

 Para el caso del pseudoexón del gen PCCA (inserción de 84 pares de bases) la 

inserción  es detectada  en  células  control  en niveles muy bajos y  en pacientes  con mutaciones de frameshift o mutaciones nonsense que producen mRNA con PTC. Es posible  que  estos  transcritos  con  la  inserción  de  pseudoexones  formen  parte  del mecanismo de control del splicing en el cual eventos alternativos de splicing pueden regular  la  expresión génica por  inclusión de pseudoexones y activación de NMD, como  se ha descrito para  el gen de  la  tropomiosina  (Grellscheid and Smith 2006). Para  el  caso del pseudoexón del gen PCCB  la  inserción no ha  sido descrita ni  en otros  pacientes  ni  en  individuos  control  por  lo  que  es  un  evento  específico  del genotipo de este paciente. 

 La hipótesis en  los dos pacientes es que el cambio nucleotídico en el gDNA 

activa la inserción del pseudoexón. Para el caso de PCCA el cambio identificado se encuentra  en medio del pseudoexón  y  es una A por una G. El  análisis mediante programas de predicción de enhancers de splicing, en concreto el uso de ESEfinder ha mostrado que este cambio nucleótidico elimina un sitio de unión para SRp55 y crea una nueva secuencia de unión a SRp40. Serían necesarios estudios con RNAi contra el gen SRp40 para demostrar  la  implicación de este factor en el reconocimiento del pseudoexón promovido por la mutación. 

 Para  el paciente 23660  la  inserción  en  el  cDNA de PCCB  es de 72 pares de 

bases entre los exones 6 y 7. El cambio nucleotídico en gDNA es IVS6+462A>G y se encuentra en la posición +5 relativa al gt de la secuencia insertada, incrementando el sitio 5´críptico donador de splicing aumentando el score de 0,93 a 1 y  aumentando la afinidad de la secuencia consenso de reconocimiento de U1snRNA (Fig. 31). Análisis adicionales  in  silico  utilizando  el  ESEfinder  predicen  la  creación  de  un  sitio  para SRp55.  

El uso de oligos antisentido tipo morfolinos en fibroblastos de estos pacientes PCCA  y  PCCB  ha  permitido  recuperar  la  actividad  normal,  revirtiendo  así  el fenotipo mutante en ambos pacientes. La recuperación de la actividad al impedir la incorporación del pseudoexón en los mRNA, demuestra  que estas inserciones son la causa de la enfermedad en estos pacientes 

 Cuando se llevó a cabo la RT‐PCR, tras el tratamiento con AONs, se observó 

un  100%  de  transcritos  normales,  probablemente  los  transcritos  aberrantes  sean inestables  debido  a  la  presencia  de  PTC,  por  lo  que  el  mRNA  normal  será amplificado de manera preferente. Aunque no se puede afirmar que en la población de células tratadas, solo exista mRNA correctamente procesado, la cantidad de este 

Page 107: Cristina Aguado Esteban

91

mRNA correctamente procesado es suficiente para corregir el defecto enzimático. La recuperación  de  la  actividad  permite  deducir  que  el  mRNA  es  procesado correctamente y traducido en proteínas activas, la detección de proteína  biotinilada en el paciente PCCA tras el cultivo en presencia de AONs confirma esta teoría.   

Los  experimentos  con  oligonucleótidos  diseñados  contra  otros  genes  no producen ningún efecto,  por lo que el efecto de los AONs es específico de secuencia, además  no  se  ha  observado  un  efecto  citotóxico  de  estos  oligonucleótidos  sobre  ninguna de las líneas celulares utilizadas. 

 Tampoco  existe  un  efecto  de  los  oligonucleótidos  antisentido  diseñados 

específicamente contra las inserciones en pacientes con las inserciones no activadas, este hecho junto a los experimentos llevados a cabo en el laboratorio con minigenes demuestran  que  los  cambios  nucleotídicos  detectados  en  gDNA  activan  la exonización de las secuencias.  

 Una gran ventaja de estos oligonucleótidos antisentido tipo morfolinos es que 

tienen una gran estabilidad, son muy resistentes a nucleasas y a la degradación por RNAsaH cuando forman híbridos con RNA.  

 Las mayores  dificultades  para  la  utilización  in  vivo  de  estos  AONs  es  su 

vehiculización para que puedan llegar a los tejidos de interés y la determinación de la  dosis  óptima  que  permita  obtener  de  forma  simultánea  la  recuperación  de  los transcritos de interés sin una toxicidad elevada. Otra desventaja de esta terapia es su elevada  especificidad  de  mutación,  son  efectivas  únicamente  para  un  genotipo concreto, por lo que su aplicación es limitada.  

 Un  ejemplo  de  utilización  in  vivo  de  este  tipo  de  terapia  es  la  distrofia 

muscular de Duchene en la que los oligonucleótidos antisentido han sido utilizados en pacientes de  forma  intramuscular y se ha  restaurado parcialmente  la distrofina (Aartsma‐Rus  et  al.  2007).  Todos  estos  datos  sugieren  que  el  uso  terapéutico  de oligonucleótidos  antisentidos  puede  ser  clínicamente  prometedor  para  acidemias orgánicas. 

 En  las  enfermedades  metabólicas  hereditarias  el  porcentaje  de  variantes 

alélicas  identificadas, analizando  los  fragmentos exónicos que comprenden  toda  la región codificante más  las regiones  intrónicas adyacentes a cada exón, está entre el 95‐98 % de  los alelos, para el 2‐5% restante se postula que  las mutaciones podrían encontrarse en regiones promotoras, regiones de poliadenilación o podrían producir inserciones de pseudoexones que generarían un mRNA aberrante, que sería diana del sistema NMD siendo degradado de manera acelerada y no siendo detectado por los  sistemas  tradicionales  de  detección  de mutación.  En  el  caso  de  los  pacientes descritos en este  trabajo, al  ser homocigotos,  la detección de  los  transcritos  con  la 

Page 108: Cristina Aguado Esteban

92

inserción  fue  inmediata.  Para  otros  casos,  utilizando  compuestos  (emetina  o puromicina)  que  inhiben  este  sistema  NMD,  se  podrían  rescatar  transcritos  con pseudoexones,  por  lo  que  potencialmente  podría  haber  un  mayor  número  de pacientes que  los  identificados actualmente que serían susceptibles de ser  tratados con terapia antisentido. 

 Las terapias basadas en el RNA, dentro de  las cuales se encuentra  la terapia 

con  AONs  presentan  toda  una  serie  de  ventajas  con  respecto  a  las  terapias convencionales  de  reemplazamiento  génico  ya  que  no  presentan  peligro  de integración  en  el  genoma  huésped  y  permiten modificar  la  expresión  génica  sin alterar la regulación normal del gen a nivel de gDNA (Wood et al. 2007). Es esencial, para el conocimiento completo de los mecanismos moleculares de las enfermedades, no  sólo  identificar  las  mutaciones  a  nivel  de  gDNA  sino  también  conocer  que alteraciones  a  nivel  de mRNA  están  asociadas  a  esas mutaciones,  ya  que  se  está comprobando  que  la  modulación  de  este  mRNA  es  una  estrategia  terapéutica eficiente y prometedora.   

Page 109: Cristina Aguado Esteban

93

                  

6. CONCLUSIONES  

Page 110: Cristina Aguado Esteban

94

 1. La  respuesta  a  BH4  en  los  pacientes  fenilcetonúricos  españoles  se  asocia 

mayoritariamente a fenotipos leves o moderados siendo un fenómeno menos frecuente en aquellos fenotipos más severos.  

 2. En general  se puede afirmar que aquellos pacientes  con  fenotipos  suaves y 

con  mutaciones  missense  que  mantienen  una  actividad  residual  presentan altas probabilidades de responder de forma favorable al tratamiento oral con BH4. 

 3. La base molecular de la respuesta a tetrahidrobiopterina en fenilcetonuria es 

multifactorial  y  dependiente  del  tipo  de mutación,  apuntando  a  un  efecto estabilizante,  como  chaperona  química  de  la  BH4,  como  mecanismo mayoritario  y  descartando  un  efecto  de  la  BH4  sobre  la  expresión  del  gen PAH. 

 4. En algunos casos,  la  respuesta a cobalamina en acidemia metilmalónica por 

defecto  en  la  enzima  ATR,  puede  deberse  a  un  efecto  estabilizante  de  la coenzima, ya que mutaciones asociadas a  la respuesta no alteran  la afinidad del enzima por sus sustratos, ATP y cobalamina. 

 5. La biotina no afecta a la expresión génica de dos carboxilasas celulares PCC y 

MCC, en  los modelos  celulares de hepatoma  (Hep3B) y  linfoblastos  (MCR), pero sí favorece su activación de apocarboxilasas a holocarboxilasas. 

 6. El  uso  de  diversas  drogas  moduladoras  de  splicing  no  ha  resultado  una 

terapia efectiva en fibroblastos de tres pacientes con acidemia propiónica que portan  mutaciones  de  splicing  con  niveles  detectables  de  mRNA correctamente procesado. 

 7. El uso de oligonucleótidos  antisentido  en  fibroblastos de dos pacientes  con 

acidemia  propiónica  ha  demostrado  que  las  inserciones  presentes  en  estos pacientes  son  la  causa  de  la  enfermedad  y  que  la  terapia  antisentido  es altamente  efectiva  para  mutaciones  que  generan  la  inserción  de pseudoexones.

 8. Los  estudios  presentados  en  este  trabajo  sobre  las  bases  moleculares 

responsables del  efecto de  las diferentes variantes alélicas permiten aportar una base científica para la aplicación de terapias específicas de mutación. 

Page 111: Cristina Aguado Esteban

95

                   

7. BIBILIOGRAFÍA   

Page 112: Cristina Aguado Esteban

96

Aartsma‐Rus A,  Janson AA,  van Ommen GJ,  van Deutekom  JC  (2007) Antisense‐induced  exon  skipping  for  duplications  in Duchenne muscular  dystrophy. BMC Med Genet 8: 43 

Allen KR, Degg TJ, Rushworth PA, Smith M, Henderson MJ (1999) Measurement of phenylalanine  and  tyrosine  in  plasma  by  high‐performance  liquid chromatography  using  the  inherent  fluorescence  of  aromatic  amino  acids. Ann Clin Biochem 36 ( Pt 2): 207‐11 

Ames BN, Elson‐Schwab  I, Silver EA  (2002) High‐dose vitamin  therapy  stimulates variant enzymes with decreased coenzyme binding affinity (increased K(m)): relevance to genetic disease and polymorphisms. Am J Clin Nutr 75: 616‐58 

Andersen OA, Flatmark T, Hough E (2001) High resolution crystal structures of the catalytic  domain  of  human  phenylalanine  hydroxylase  in  its  catalytically active  Fe(II)  form  and  binary  complex with  tetrahydrobiopterin.  J Mol Biol 314: 279‐91 

Andersen OA, Flatmark T, Hough E (2002) Crystal structure of the ternary complex of  the  catalytic  domain  of  human  phenylalanine  hydroxylase  with tetrahydrobiopterin  and  3‐(2‐thienyl)‐L‐alanine,  and  its  implications  for  the mechanism of catalysis and substrate activation. J Mol Biol 320: 1095‐108 

Andreassi C, Jarecki J, Zhou J, Coovert DD, Monani UR, Chen X, Whitney M, Pollok B, Zhang M, Androphy E, Burghes AH (2001) Aclarubicin treatment restores SMN  levels  to  cells  derived  from  type  I  spinal muscular  atrophy  patients. Hum Mol Genet 10: 2841‐9. 

Baez‐Saldana  A,  Diaz  G,  Espinoza  B,  Ortega  E  (1998)  Biotin  deficiency  induces changes in subpopulations of spleen lymphocytes in mice. Am J Clin Nutr 67: 431‐7 

Bain MD, Jones M, Borriello SP, Reed PJ, Tracey BM, Chalmers RA, Stacey TE (1988) Contribution of gut bacterial metabolism to human metabolic disease. Lancet 1: 1078‐9 

Baker RE, Shiman R (1979) Measurement of phenylalanine hydroxylase turnover in cultured hepatoma cells. J Biol Chem 254: 9633‐9 

Baldellou A,  Salazar M, Ruiz‐Echarri M, Campos C, Desviat LR, Ugarte M  (2006) Tratamiento de la hiperfenilalaninemia por déficit de fenilalanina hidroxilasa con tetrahidrobiopterina.¿Cuándo y cómo? An Pediatr (Barc) 64: 146‐152 

Banerjee R  (2006) B12  trafficking  in mammals: A  for coenzyme escort service. ACS Chem Biol 1: 149‐59 

Baumgartner MR,  Almashanu  S,  Suormala  T,  Obie  C,  Baumgartner  ER,  Valle  D (2001a) 3‐methylcrotonyl‐CoA carboxylase deficiency: extension of molecular analysis to patients detected by tandem MS based newborn screening. J Inher Metab Dis 24: 57 

Baumgartner  MR,  Almashanu  S,  Suormala  T,  Obie  C,  Cole  RN,  Packman  S, Baumgartner  ER,  Valle  D  (2001b)  The  molecular  basis  of  human  3‐methylcrotonyl‐CoA carboxylase deficiency. J Clin Invest 107: 495‐504. 

Page 113: Cristina Aguado Esteban

97

Baumgartner  MR,  Dantas  MF,  Suormala  T,  Almashanu  S,  Giunta  C,  Friebel  D, Gebhardt B, Fowler B, Hoffmann GF, Baumgartner ER, Valle D (2004) Isolated 3‐methylcrotonyl‐CoA  carboxylase deficiency:  evidence  for an allele‐specific dominant  negative  effect  and  responsiveness  to  biotin  therapy. Am  J Hum Genet 75: 790‐800 

Baur B, Suormala T, Baumgartner ER  (2002) Biocytin and biotin uptake  into NB2a neuroblastoma and C6 astrocytoma cells. Brain Res 925: 111‐21 

Belanger‐Quintana A, Garcia MJ, Castro M, Desviat LR, Perez B, Mejia B, Ugarte M, Martinez‐Pardo  M  (2005)  Spanish  BH4‐responsive  phenylalanine hydroxylase‐deficient  patients:  evolution  of  seven  patients  on  long‐term treatment with tetrahydrobiopterin. Mol Genet Metab 86 Suppl 1: S61‐6 

Bergman  I,  Finegold D, Gartner  JC,  Jr., Zitelli BJ, Claassen D,  Scarano  J, Roe CR, Stanley  C,  Goodman  SI  (1989)  Acute  profound  dystonia  in  infants  with glutaric acidemia. Pediatrics 83: 228‐34 

Bjørgo  E,  Knappskog  PM,  Martinez  A,  Stevens  RC,  Flatmark  T  (1998)  Partial characterization  and  three‐dimensional‐structural  localization  of  eight mutations in exon 7 of the human phenylalanine hydroxylase gene associated with phenylketonuria. Eur. J. Biochem. 257: 1‐10 

Blau  N,  Erlandsen  H  (2004)  The  metabolic  and  molecular  bases  of tetrahydrobiopterin‐responsive  phenylalanine  hydroxylase  deficiency.  Mol Genet Metab 82: 101‐11 

Blau N, Thony B, Cotton GH, Hyland K (2001) Disorders of tetrahydrobioterin and related biogenic amines. In: Scriver CR, Beaudet AL, Sly WS, Valle D, Childs B, Vogelstein B (eds) The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Disease, 8th edn. McGraw‐Hill, New York, pp 1725‐1776 

Bradford MM (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities  of  protein  utilizing  the  principle  of  protein‐dye  binding.  Anal Biochem 72: 248‐54 

Brichta L, Hofmann Y, Hahnen E, Siebzehnrubl FA, Raschke H, Blumcke I, Eyupoglu IY, Wirth  B  (2003) Valproic  acid  increases  the  SMN2  protein  level:  a well‐known drug  as  a potential  therapy  for  spinal muscular  atrophy. Hum Mol Genet 12: 2481‐9 

Buratti  E,  Baralle  M,  Baralle  FE  (2006)  Defective  splicing,  disease  and  therapy: searching  for master  checkpoints  in  exon  definition. Nucleic Acids Res  34: 3494‐510 

Burton BK, Grange DK, Milanowski A, Vockley G, Feillet F, Crombez EA, Abadie V, Harding CO, Cederbaum S, Dobbelaere D, Smith A, Dorenbaum A (2007) The response of patients with phenylketonuria and elevated serum phenylalanine to  treatment with oral sapropterin dihydrochloride  (6R‐tetrahydrobiopterin): a phase  II, multicentre, open‐label,  screening  study.  J  Inherit Metab Dis  30: 700‐7 

Page 114: Cristina Aguado Esteban

98

Campeau E, Dupuis L, Leclerc D, Gravel RA  (1999) Detection  of  a  normally  rare transcript in propionic acidemia patients with mRNA destabilizing mutations in the PCCA gene. Hum Mol Genet 8: 107‐13 

Cartegni  L,  Chew  SL,  Krainer AR  (2002)  Listening  to  silence  and  understanding nonsense: exonic mutations that affect splicing. Nat Rev Genet 3: 285‐98 

Cartegni  L,  Wang  J,  Zhu  Z,  Zhang  MQ,  Krainer  AR  (2003)  ESEfinder:  A  web resource to identify exonic splicing enhancers. Nucleic Acids Res 31: 3568‐71 

Cauthen  SE,  Foster MA, Woods  DD  (1966) Methionine  synthesis  by  extracts  of Salmonella typhimurium. Biochem J 98: 630‐5 

Cerone R,  Schiaffino MC,  Fantasia AR, Perfumo M, Birk Moller L, Blau N  (2004) Long‐term  follow‐up  of  a patient with mild  tetrahydrobiopterin‐responsive phenylketonuria. Mol Genet Metab 81: 137‐9 

Clavero  S,  Perez  B,  Rincon  A,  Ugarte  M,  Desviat  LR  (2004)  Qualitative  and quantitative analysis of the effect of splicing mutations in propionic acidemia underlying non‐severe phenotypes. Hum Genet 115: 239‐47 

Coelho D ST, Stucki M, Lerner‐Ellis  JP, Rosenblatt DS, Newbold RF, Baumgartner MR, Fowler B (2007) Identification of the gene responsible for the cblD defect of  vitamin  B12 metabolism: MMADHC,  one  gene  and  three  phenotypes.  J. Inherit Metab Dis (2007) 30 (Suppl 1) 

Cohen FE, Kelly  JW  (2003) Therapeutic approaches  to protein‐misfolding diseases. Nature 426: 905‐9 

Collins  JC,  Paietta  E,  Green  R,  Morell  AG,  Stockert  RJ  (1988)  Biotin‐dependent expression  of  the  asialoglycoprotein  receptor  in  HepG2.  J  Biol  Chem  263: 11280‐3 

Coulombe  JT,  Shih  VE,  Levy  HL  (1981)  Massachusetts  Metabolic  Disorders Screening Program. II. Methylmalonic aciduria. Pediatrics 67: 26‐31 

Chang  JG, Hsieh‐Li HM,  Jong YJ, Wang NM, Tsai CH, Li H  (2001) Treatment  of spinal muscular atrophy by  sodium butyrate. Proc Natl Acad Sci U S A 98: 9808‐13 

Chapman‐Smith A, Cronan  JE,  Jr.  (1999)  In  vivo  enzymatic  protein  biotinylation. Biomol Eng 16: 119‐25 

Chauhan  J, Dakshinamurti K  (1991)  Transcriptional  regulation  of  the  glucokinase gene by biotin in starved rats. J Biol Chem 266: 10035‐8 

Chloupkova M,  Ravn  K,  Schwartz M,  Kraus  JP  (2000)  Changes  in  the  carboxyl terminus of the beta subunit of human propionyl‐CoA carboxylase affect the oligomer  assembly  and  catalysis:  expression  and  characterization  of  seven patient‐derived mutant forms of PCC in Escherichia coli. Mol Genet Metab 71: 623‐32 

Dakshinamurti  K,  Li  W  (1994)  Transcriptional  regulation  of  liver phosphoenolpyruvate  carboxykinase  by  biotin  in  diabetic  rats.  Mol  Cell Biochem 132: 127‐32 

Dakshinamurti K, Tarrago‐Litvak L, Hong HC (1970) Biotin and glucose metabolism. Can J Biochem 48: 493‐500 

Page 115: Cristina Aguado Esteban

99

Davis BJ  (1964) Disc Electrophoresis.  Ii. Method and Application  to Human Serum Proteins. Ann N Y Acad Sci 121: 404‐27 

De La Vega LA, Stockert RJ (2000) Regulation of the insulin and asialoglycoprotein receptors via cGMP‐dependent protein kinase. Am J Physiol Cell Physiol 279: C2037‐42 

De Lucca M, B. P, Desviat LR, Ugarte M (1998) Molecular basis of phenylketonuria in Venezuela: presence of two novel null mutations. Human Mutation 11: 354‐359 

Desviat LR, B. P, Garcia MJ, Martínez‐Pardo M, Baldellou A, Arena  J,  Sanjurjo P, Campistol  J,  Couce  ML,  Fernández  A,  Cardesa  J,  Ugarte  M  (1997) Relationship  between mutation  genotype  and  biochemical  phenotype  in  a heterogeneous  Spanish  phenylketonuria  population.  Eur.  J. Hum. Genet.  5: 196‐202 

Desviat LR, Clavero S, Perez‐Cerda C, Navarrete R, Ugarte M, Perez B (2006) New splicing mutations in propionic acidemia. J Hum Genet 51: 992‐7 

Desviat  LR,  Perez‐Cerda  C,  Perez  B,  Esparza‐Gordillo  J,  Rodriguez‐Pombo  P, Penalva MA, Rodriguez De Cordoba S, Ugarte M (2003a) Functional analysis of MCCA and MCCB mutations causing methylcrotonylglycinuria. Mol Genet Metab 80: 315‐20 

Desviat LR, Perez B, Gamez A, Sanchez A, Garcia MJ, Martinez‐Pardo M, Marchante C,  Boveda D,  Baldellou A, Arena  J,  Sanjurjo  P,  Fernandez A, Cabello ML, Ugarte  M  (1999)  Genetic  and  phenotypic  aspects  of  phenylalanine hydroxylase  deficiency  in  Spain: molecular  survey  by  regions.  Eur  J Hum Genet 7: 386‐92 

Desviat LR, Perez B, Ugarte M (2003b) Investigation of folding and degradation of in vitro synthesized mutant proteins in the cytosol. Methods Mol Biol 232: 257‐63 

Djouadi  F, Aubey  F,  Schlemmer D,  Ruiter  JP, Wanders  RJ,  Strauss AW,  Bastin  J (2005) Bezafibrate increases very‐long‐chain acyl‐CoA dehydrogenase protein and mRNA expression  in deficient  fibroblasts and  is a potential  therapy  for fatty acid oxidation disorders. Hum Mol Genet 14: 2695‐703 

Dobson  CM, Wai  T,  Leclerc D,  Kadir H, Narang M,  Lerner‐Ellis  JP, Hudson  TJ, Rosenblatt DS, Gravel RA  (2002a)  Identification of  the gene  responsible  for the  cblB  complementation  group  of  vitamin  B12‐dependent methylmalonic aciduria. Hum Mol Genet 11: 3361‐9 

Drummond  JT,  Matthews  RG  (1993)  Cobalamin‐dependent  and  cobalamin‐independent methionine  synthases  in  Escherichia  coli:  two  solutions  to  the same chemical problem. Adv Exp Med Biol 338: 687‐92 

Erlandsen H, Stevens RC  (2001) A structural hypothesis  for BH4 responsiveness  in patients with mild forms of hyperphenylalaninaemia and phenylketonuria. J Inherit Metab Dis 24: 213‐30. 

Fan  JQ,  Ishii S  (2007) Active‐site‐specific  chaperone  therapy  for Fabry disease. Yin and Yang of enzyme inhibitors. Febs J 274: 4962‐71 

Page 116: Cristina Aguado Esteban

100

Fiori L, Fiege B, Riva E, Giovannini M  (2005)  Incidence  of BH4‐responsiveness  in phenylalanine‐hydroxylase‐deficient  Italian  patients.  Mol  Genet  Metab  86 Suppl 1: S67‐74 

Flatmark  T,  Stevens  RC  (1999)  Structural  Insight  into  the Aromatic Amino Acid Hydroxylases and their Disease‐Related Mutant Forms. Chem. Rev. 99: 2137‐2160 

Fukushima  T, Nixon  JC  (1980)  Chromatographic  analysis  of  pteridines. Methods Enzymol 66: 429‐36 

Fusetti  F,  Erlandsen  H,  Flatmark  T,  Stevens  RC  (1998)  Structure  of  Tetrameric Human Phenylalanine Hydroxylase and its implications for Phenylketonuria. J. Biol. Chem. 273: 16962‐16967 

Gallardo ME, Desviat LR, Rodriguez JM, Esparza‐Gordillo J, Perez‐Cerda C, Perez B, Rodriguez‐Pombo P, Criado O, Sanz R, Morton DH, Gibson KM, Le TP, Ribes A, de Cordoba SR, Ugarte M, Penalva MA  (2001) The molecular basis of 3‐methylcrotonylglycinuria, a disorder of leucine catabolism. Am J Hum Genet 68: 334‐46 

Gamez  A,  Perez  B,  Ugarte  M,  Desviat  LR  (2000)  Expression  analysis  of phenylketonuria  mutations:  effect  on  folding  and  stability  of  the phenylalanine hydroxylase protein. J Biol Chem 275: 29737‐29742 

Garrod A (1908) The Croonian Lectures on inborn errors of metabolism. Lecture II. ALkaptonuria. Lancet 2: 73‐79 

Gjetting T, Petersen M, Guldberg P, Guttler F  (2001) Missense mutations  in  the N‐terminal domain of human phenylalanine hydroxylase interfere with binding of regulatory phenylalanine. Am J Hum Genet 68: 1353‐1360 

Gravel  RA,  Akerman  BR,  Lamhonwah  AM,  Loyer M,  Leon‐del‐Rio  A,  Italiano  I (1994) Mutations  participating  in  interallelic  complementation  in  propionic acidemia. Am J Hum Genet 55: 51‐8 

Gregersen N, Bross P,  Jorgensen MM, Corydon TJ, Andresen BS  (2000) Defective folding  and  rapid  degradation  of  mutant  proteins  is  a  common  disease mechanism in genetic disorders. J Inherit Metab Dis 23: 441‐7 

Grellscheid  SN,  Smith  CW  (2006)  An  apparent  pseudo‐exon  acts  both  as  an alternative exon that  leads to nonsense‐mediated decay and as a zero‐length exon. Mol Cell Biol 26: 2237‐46 

Gurnani S, Mistry SP, Johnson BC (1960) Function of vitamin B12 in methylmalonate metabolism.  I.  Effect  of  a  cofactor  form  of  B12  on  the  activity  of methylmalonyl‐CoA isomerase. Biochim Biophys Acta 38: 187‐8 

Harlow  E,  Lane D  (1988) Antibodies: A  Laboratory Manual. Cold  Spring Harbor Laboratory, N. Y. 

Hector ML,  Cochran  BC,  Logue  EA,  Fall  RR  (1980)  Subcellular  localization  of  3‐methylcrotonyl‐coenzyme  A  carboxylase  in  bovine  kidney.  Arch  Biochem Biophys 199: 28‐36 

Page 117: Cristina Aguado Esteban

101

Hennermann  JB, Buhrer C, Blau N, Vetter B, Monch E  (2005) Long‐term  treatment with  tetrahydrobiopterin  increases phenylalanine  tolerance  in  children with severe phenotype of phenylketonuria. Mol Genet Metab 86 Suppl 1: S86‐90 

Hims MM, Ibrahim el C, Leyne M, Mull J, Liu L, Lazaro C, Shetty RS, Gill S, Gusella JF, Reed R, Slaugenhaupt SA (2007) Therapeutic potential and mechanism of kinetin as a treatment for the human splicing disease familial dysautonomia. J Mol Med 85: 149‐61 

Holzinger  A,  Roschinger W,  Lagler  F, Mayerhofer  PU,  Lichtner  P,  Kattenfeld  T, Thuy LP, Nyhan WL, Koch HG, Muntau AC, Roscher AA  (2001) Cloning of the  human  MCCA  and  MCCB  genes  and  mutations  therein  reveal  the molecular cause of 3‐methylcrotonyl‐CoA: carboxylase deficiency. Hum Mol Genet 10: 1299‐306. 

Hyland  K,  Munk‐Martin  TL  (2001)  Tetrahydrobiopterin  regulates  tyrosine hydroxylase and phenylalanine hydroxylase gene  expression  in dominantly inherited GTP cyclohydroxylase deficiency. J Inher Metab Dis 24 (Suppl 1): 30 

Hymes  J,  Stanley  CM,  Wolf  B  (2001)  Mutations  in  BTD  causing  biotinidase deficiency. Hum Mutat 18: 375‐81 

Hymes J, Wolf B (1999) Human biotinidase isnʹt just for recycling biotin. J Nutr 129: 485S‐489S 

Jaruzelska J, Abadie V, dʹAubenton‐Carafa Y, Brody E, Munnich A, Marie J (1995) In vitro  splicing deficiency  induced by a C  to T mutation at position  ‐3  in  the intron  10  acceptor  site  of  the  phenylalanine  hydroxylase  gene  in  a  patient with phenylketonuria. J Biol Chem 270: 20370‐5 

Johnson  CL,  Pechonick  E,  Park  SD,  Havemann  GD,  Leal  NA,  Bobik  TA  (2001) Functional  genomic,  biochemical,  and  genetic  characterization  of  the Salmonella  pduO  gene,  an  ATP:cob(I)alamin  adenosyltransferase  gene.  J Bacteriol 183: 1577‐84 

Kalousek  F,  Darigo  MD,  Rosenberg  LE  (1980)  Isolation  and  characterization  of propionyl‐CoA  carboxylase  from  normal  human  liver.  Evidence  for  a protomeric tetramer of nonidentical subunits. J Biol Chem 255: 60‐5 

Kapadia CR (1995) Vitamin B12 in health and disease: part I‐‐inherited disorders of function, absorption, and transport. Gastroenterologist 3: 329‐44 

Kaufman S  (1993) The phenylalanine hydroxylating system. Adv. Enzymol. 67: 77‐264 

Knappskog PM, Eiken HG, Martinez A, Bruland O, Apold J, Flatmark T (1996a) PKU mutation (D143G) associated with an apparent high residual enzyme activity: expression  of  a  kinetic  variant  form  of  phenylalanine  hydroxylase  in  three different systems. Hum. Mutat. 8: 236‐246 

Knappskog  PM,  Flatmark  T,  Aarden  JM,  Haavik  J,  Martinez  A  (1996b) Structure/function relationships  in human phenylalanine hydroxylase. Effect of  terminal deletions on  the oligomerization, activation and cooperativity of substrate binding to the enzyme. Eur. J. Biochem. 242: 813‐821 

Page 118: Cristina Aguado Esteban

102

Knowles JR (1989) The mechanism of biotin‐dependent enzymes. Annu Rev Biochem 58: 195‐221 

Kohnen SL, Mouithys‐Mickalad AA, Deby‐Dupont GP, Deby CM, Lamy ML, Noels AF  (2001)  Oxidation  of  tetrahydrobiopterin  by  peroxynitrite  or  oxoferryl species occurs by a radical pathway. Free Radic Res 35: 709‐21 

Kozak  M  (1984)  Compilation  and  analysis  of  sequences  upstream  from  the translational start site in eukaryotic mRNAs. Nucleic. Acids Res. 12: 857‐872 

Krawczak M, Reiss J, Cooper DN (1992) The mutational spectrum of single base‐pair substitutions  in  mRNA  splice  junctions  of  human  genes:  causes  and consequences. Hum Genet 90: 41‐54 

Kure S, Hou DC, Ohura T, Iwamoto H, Suzuki S, Sugiyama N, Sakamoto O, Fujii K, Matsubara  Y,  Narisawa  K  (1999)  Tetrahydrobiopterin‐responsive phenylalanine hydroxylase deficiency. J Pediatr 135: 375‐8. 

Kure  S,  Sato K,  Fujii K, Aoki Y,  Suzuki Y, Kato  S, Matsubara Y  (2004) Wild‐type phenylalanine  hydroxylase  activity  is  enhanced  by  tetrahydrobiopterin supplementation  in  vivo:  an  implication  for  therapeutic  basis  of tetrahydrobiopterin‐responsive  phenylalanine  hydroxylase  deficiency.  Mol Genet Metab 83: 150‐6 

Kurreck  J  (2003)  Antisense  technologies.  Improvement  through  novel  chemical modifications. Eur J Biochem 270: 1628‐44 

Kuzkaya  N,  Weissmann  N,  Harrison  DG,  Dikalov  S  (2003)  Interactions  of peroxynitrite,  tetrahydrobiopterin, ascorbic acid, and  thiols:  implications  for uncoupling endothelial nitric‐oxide synthase. J Biol Chem 278: 22546‐54 

Laemmli UK (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680‐5 

Lambruschini N, Perez‐Duenas B, Vilaseca MA, Mas A, Artuch R, Gassio R, Gomez L,  Gutierrez  A,  Campistol  J  (2005)  Clinical  and  nutritional  evaluation  of phenylketonuric  patients  on  tetrahydrobiopterin  monotherapy. Mol  Genet Metab 86 Suppl 1: S54‐60 

Lamhonwah A, Troxel C, Schuster S, Gravel RA (1990) Two distinct mutations at the same site in the PCCB gene in propionic acidemia. Genomics 8: 249‐254 

Leal  NA,  Olteanu  H,  Banerjee  R,  Bobik  TA  (2004)  Human  ATP:Cob(I)alamin adenosyltransferase and its interaction with methionine synthase reductase. J Biol Chem 279: 47536‐42 

Lerman LS, Silverstein K  (1987) Computational simulation of DNA melting and  its application  to  denaturing  gradient  gel  electrophoresis. Methods  Enzymol. 155: 482‐501 

Leuzzi V, Carducci C, Carducci C, Chiarotti F, Artiola C, Giovanniello T, Antonozzi I (2006) The  spectrum  of  phenylalanine  variations  under  tetrahydrobiopterin load  in  subjects  affected  by phenylalanine  hydroxylase deficiency.  J  Inherit Metab Dis 29: 38‐46 

Page 119: Cristina Aguado Esteban

103

Levy H, Burton B, Cederbaum S, Scriver C (2007) Recommendations for evaluation of  responsiveness  to  tetrahydrobiopterin  (BH(4))  in phenylketonuria and  its use in treatment. Mol Genet Metab 92: 287‐91 

Linscheid P, Schaffner A, Schoedon G  (1998) Modulation of  inducible nitric oxide synthase mRNA  stability by  tetrahydrobiopterin  in vascular  smooth muscle cells. Biochem Biophys Res Commun 243: 137‐41 

Liu  HX,  Chew  SL,  Cartegni  L,  Zhang  MQ,  Krainer  AR  (2000)  Exonic  splicing enhancer motif  recognized  by  human  SC35  under  splicing  conditions. Mol Cell Biol 20: 1063‐71 

Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ  (1951) Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem 193: 265‐75 

Lualdi S, Pittis MG, Regis S, Parini R, Allegri AE, Furlan F, Bembi B, Filocamo M (2006) Multiple  cryptic  splice  sites  can be activated by  IDS point mutations generating misspliced transcripts. J Mol Med  

MacMahon M (1995) Requesting vitamin B12 and folate assays. Lancet 346: 973 Manthey KC, Griffin JB, Zempleni J (2002) Biotin supply affects expression of biotin 

transporters, biotinylation of carboxylases and metabolism of interleukin‐2 in Jurkat cells. J Nutr 132: 887‐92 

Maquat  LE  (2004)  Nonsense‐mediated  mRNA  decay:  splicing,  translation  and mRNP dynamics. Nat Rev Mol Cell Biol 5: 89‐99 

Martínez A, Knappskog PM, Olafsdottir S, Døskeland AP, Eiken H. G., Svebak R. M., Bozzini M, Apold J., Flatmark T (1995) Expression of recombinant human phenylalanine  hydroxylase  as  fusion  protein  in  Escherichia  coli  circumvents proteolytic degradation by host cell proteases. Biochem. J. 306: 589‐597 

Matalon  R,  Koch  R,  Michals‐Matalon  K,  Moseley  K,  Surendran  S,  Tyring  S, Erlandsen H, Gamez A, Stevens RC, Romstad A, Moller LB, Guttler F (2004) Biopterin responsive phenylalanine hydroxylase deficiency. Genet Med 6: 27‐32 

Matsui SM, Mahoney MJ, Rosenberg LE  (1983) The natural history of  the  inherited methylmalonic acidemias. N Engl J Med 308: 857‐61 

Miranda  FF,  Teigen K,  Thorolfsson M,  Svebak  RM,  Knappskog  PM,  Flatmark  T, Martinez  A  (2002)  Phosphorylation  and  mutations  of  Ser(16)  in  human phenylalanine  hydroxylase. Kinetic  and  structural  effects.  J Biol Chem  277: 40937‐43 

Mock DM, Lankford GL, Mock NI  (1995) Biotin accounts  for only half of  the  total avidin‐binding substances in human serum. J Nutr 125: 941‐6 

Muntau AC, Roschinger W, Habich M, Demmelmair H, Hoffmann B, Sommerhoff CP, Roscher AA  (2002) Tetrahydrobiopterin  as  an  alternative  treatment  for mild phenylketonuria. N Engl J Med 347: 2122‐32 

Nielsen DA, Chou J, MacKrell AJ, Casadaban MJ, Steiner DF (1983) Expression of a Preproinsulin‐ß‐Galactosidase Gene  Fusion  in Mammalian Cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80: 5198‐5202 

Page 120: Cristina Aguado Esteban

104

Nissim‐Rafinia  M,  Aviram  M,  Randell  SH,  Shushi  L,  Ozeri  E,  Chiba‐Falek  O, Eidelman O,  Pollard HB, Yankaskas  JR, Kerem  B  (2004) Restoration  of  the cystic  fibrosis  transmembrane  conductance  regulator  function  by  splicing modulation. EMBO Rep 5: 1071‐7 

Ohura  T,  Narisawa  K,  Tada  K  (1993)  Propionic  acidemia:  sequence  analysis  of mutant mRNA  from  Japanese  b  subunit‐deficient  patients.  J.  Inher. Metab. Dis. 16: 863‐867 

Ornstein L (1964) Disc Electrophoresis. I. Background and Theory. Ann N Y Acad Sci 121: 321‐49 

Pacheco‐Alvarez D, Solorzano‐Vargas RS, Del Rio AL  (2002) Biotin  in metabolism and its relationship to human disease. Arch Med Res 33: 439‐47 

Pacheco‐Alvarez  D,  Solorzano‐Vargas  RS,  Gravel  RA,  Cervantes‐Roldan  R, Velazquez  A,  Leon‐Del‐Rio  A  (2004)  Paradoxical  regulation  of  biotin utilization  in  brain  and  liver  and  implications  for  inherited  multiple carboxylase deficiency. J Biol Chem 279: 52312‐8 

Pàmpols  Ros  T  (2006)  Diagnóstico  prenatal  de  las  enfermedades  metabólicas hereditarias.  In:  P.  SC,  A.  BV  (eds)  Diagnóstico  y  tratamiento  de  las enfermedades metabólicas hereditarias, 2th edn. ergon, pp 31‐46 

Pérez  B,  Desviat  LR,  De  Lucca  M,  Ugarte  M  (1994)  Spectrum  and  origin  of phenylketonuria mutations in Spain. Act. Pediac.Suppl. 407: 34‐36 

Perez B, Desviat LR, Gomez‐Puertas P, Martinez A,  Stevens RC, Ugarte M  (2005) Kinetic and stability analysis of PKU mutations identified in BH4‐responsive patients. Mol Genet Metab 86 Suppl 1: S11‐6 

Perez B, Desviat LR, Rodriguez‐Pombo P, Clavero S, Navarrete R, Perez‐Cerda C, Ugarte  M  (2003)  Propionic  acidemia:  identification  of  twenty‐four  novel mutations in Europe and North America. Mol Genet Metab 78: 59‐67 

Perez B, Desviat LR, Martinez‐Pardo M, Garcia MJ, Ugarte M (1999) Fenilcetonuria: 30 años de investigación y prevención. Anal. Real. Acad. Farm. 65: 271‐304 

Perez  B, Desviat  LR, Ugarte M  (1997) Analysis  of  the  phenylalanine  hydroxylase gene  in  the  Spanish  population:  mutation  profile  and  association  with intragenic polymorphic markers. Am J Hum Genet 60: 95‐102 

Pey AL, Desviat LR, Gamez A, Ugarte M, Perez B (2003) Phenylketonuria: Genotype‐phenotype  correlations  based  on  expression  analysis  of  structural  and functional mutations in PAH. Hum Mutat 21: 370‐8 

Richard  E,  Desviat  LR,  Perez  B,  Perez‐Cerda  C,  Ugarte  M  (1999)  Genetic heterogeneity  in  propionic  acidemia  patients  with  alpha‐subunit  defects. Identification of  five novel mutations, one of  them causing  instability of  the protein. Biochim Biophys Acta 1453: 351‐8 

Rodriguez‐Melendez R, Cano S, Mendez ST, Velazquez A (2001) Biotin regulates the genetic  expression  of  holocarboxylase  synthetase  and  mitochondrial carboxylases in rats. J Nutr 131: 1909‐13 

Rodriguez‐Melendez R, Perez‐Andrade ME, Diaz A, Deolarte A, Camacho‐Arroyo I, Ciceron I, Ibarra I, Velazquez A (1999) Differential effects of biotin deficiency 

Page 121: Cristina Aguado Esteban

105

and replenishment on rat liver pyruvate and propionyl‐CoA carboxylases and on their mRNAs. Mol Genet Metab 66: 16‐23 

Rodriguez‐Melendez R, Zempleni  J  (2003) Regulation of gene expression by biotin (review). J Nutr Biochem 14: 680‐90 

Sakamoto O, Suzuki Y, Li X, Aoki Y, Hiratsuka M, Holme E, Kudoh  J, Shimizu N, Narisawa K  (2000) Diagnosis  and molecular  analysis  of  an  atypical  case  of holocarboxylase synthetase deficiency. Eur J Pediatr 159: 18‐22 

Sakamoto O, Suzuki Y, Li X, Aoki Y, Hiratsuka M, Suormala T, Baumgartner ER, Gibson KM, Narisawa K  (1999)  Relationship  between  kinetic  properties  of mutant  enzyme  and  biochemical  and  clinical  responsiveness  to  biotin  in holocarboxylase synthetase deficiency. Pediatr Res 46: 671‐6 

Samols  D,  Thornton  CG,  Murtif  VL,  Kumar  GK,  Haase  FC,  Wood  HG  (1988) Evolutionary conservation among biotin enzymes. J Biol Chem 263: 6461‐4. 

Santer R, Muhle H, Suormala T, Baumgartner ER, Duran M, Yang X, Aoki Y, Suzuki Y,  Stephani  U  (2003)  Partial  response  to  biotin  therapy  in  a  patient  with holocarboxylase  synthetase  deficiency:  clinical,  biochemical,  and molecular genetic aspects. Mol Genet Metab 79: 160‐6 

Saudubray  JM,  Sedel  F, Walter  JH  (2006)  Clinical  approach  to  treatable  inborn metabolic diseases: an introduction. J Inherit Metab Dis 29: 261‐74 

Saura  M,  Perez‐Sala  D,  Canada  FJ,  Lamas  S  (1996)  Role  of  tetrahydrobiopterin availability  in  the  regulation  of  nitric‐oxide  synthase  expression  in  human mesangial cells. J Biol Chem 271: 14290‐5 

Scavelli R, Ding Z, Blau N, Haavik  J, Martinez A, Thony B  (2005)  Stimulation  of hepatic  phenylalanine  hydroxylase  activity  but  not  Pah‐mRNA  expression upon oral loading of tetrahydrobiopterin in normal mice. Mol Genet Metab 86 Suppl 1: S153‐5 

Scriver CR, Kaufman  S  (2001) Hyperphenylalaninemia:phenylalanine  hydroxylase defciency.  In: Scriver CR, Beaudet AL, Valle D, Sly WS  (eds) The Metabolic and Molecular bases of  Inherited Disease,  8th  edn. McGraw‐Hill., pp  1667‐1724 

Scriver CR,  Treacy  EP  (1999)  Is  there  treatment  for  ʺgeneticʺ  disease? Mol Genet Metab 68: 93‐102 

Schubert  HL,  Hill  CP  (2006)  Structure  of  ATP‐Bound  Human  ATP:Cobalamin Adenosyltransferase. Biochemistry 45: 15188‐96 

Shintaku H, Kure S, Ohura T, Okano Y, Ohwada M, Sugiyama N, Sakura N, Yoshida I, Yoshino M, Matsubara Y, Suzuki K, Aoki K, Kitagawa T (2004) Long‐term treatment  and  diagnosis  of  tetrahydrobiopterin‐responsive hyperphenylalaninemia  with  a  mutant  phenylalanine  hydroxylase  gene. Pediatr Res 55: 425‐30 

Smith  SC,  Kemp  BE, McAdam WJ, Mercer  JF,  Cotton  RG  (1984)  Two  apparent molecular weight  forms  of  human  and monkey phenylalanine  hydroxylase are due to phosphorylation. J Biol Chem 259: 11284‐9 

Page 122: Cristina Aguado Esteban

106

Solorzano‐Vargas RS,  Pacheco‐Alvarez D,  Leon‐Del‐Rio A  (2002) Holocarboxylase synthetase is an obligate participant in biotin‐mediated regulation of its own expression  and  of  biotin‐dependent  carboxylases  mRNA  levels  in  human cells. Proc Natl Acad Sci U S A 99: 5325‐30 

Solstad  T,  Flatmark  T  (2000)  Microheterogeneity  of  recombinant  human phenylalanine hydroxylase as a result of nonenzymatic deamidations of labile amide containig amino acids. Eur. J. Biochem. 267: 6302‐6310 

Spaapen LJ, Bakker JA, Velter C, Loots W, Rubio‐Gonzalbo ME, Forget PP, Dorland L, De Koning TJ, Poll‐The BT, Ploos van Amstel HK, Bekhof J, Blau N, Duran M  (2001)  Tetrahydrobiopterin‐responsive  phenylalanine  hydroxylase deficiency in Dutch neonates. J Inherit Metab Dis 24: 352‐8. 

Spaapen  LJ,  Estela  Rubio‐Gozalbo  M  (2003)  Tetrahydrobiopterin‐responsive phenylalanine hydroxylase deficiency,  state of  the art. Mol Genet Metab 78: 93‐9 

Stanley  JS, Griffin  JB, Zempleni  J  (2001)  Biotinylation  of  histones  in  human  cells. Effects of cell proliferation. Eur J Biochem 268: 5424‐9 

Stockert  RJ,  Morell  AG  (1990)  Second  messenger  modulation  of  the asialoglycoprotein receptor. J Biol Chem 265: 1841‐6 

Stockert RJ, Paietta E, Racevskis J, Morell AG (1992) Posttranscriptional regulation of the asialoglycoprotein receptor by cGMP. J Biol Chem 267: 56‐9 

Streit  WR,  Entcheva  P  (2003)  Biotin  in  microbes,  the  genes  involved  in  its biosynthesis,  its  biochemical  role  and  perspectives  for  biotechnological production. Appl Microbiol Biotechnol 61: 21‐31 

Suormala T, Wick H, Bonjour JP, Baumgartner ER (1985) Rapid differential diagnosis of  carboxylase  deficiencies  and  evaluation  for  biotin‐responsiveness  in  a single blood sample. Clin Chim Acta 145: 151‐62 

Suormala  T, Wiesmann  UN,  Cruz  F, Wolf  A,  Daschner M,  Limat  A,  Fowler  B, Baumgartner  ER  (2002)  Biotin‐dependent  carboxylase  activities  in  different CNS  and  skin‐derived  cells,  and  their  sensitivity  to  biotin‐depletion.  Int  J Vitam Nutr Res 72: 278‐86 

Suzuki Y, Aoki Y, Sakamoto O, Li X, Miyabayashi S, Kazuta Y, Kondo H, Narisawa K (1996) Enzymatic diagnosis of holocarboxylase synthetase deficiency using apo‐carboxyl carrier protein as a substrate. Clin Chim Acta 251: 41‐52 

Sweetman L, Williams  JC  (2001) Branched  chain organic acidurias.  In: Scriver CR, Beaudet  AL,  Sly W,  Valle  D  (eds)  The metabolic  and molecular  bases  of inherited disease, 8th edn. McGraw Hill, New York, pp 2125‐2163 

Takeshima Y, Yagi M, Wada H, Ishibashi K, Nishiyama A, Kakumoto M, Sakaeda T, Saura R, Okumura K, Matsuo M  (2006) Intravenous  infusion of an antisense oligonucleotide  results  in  exon  skipping  in  muscle  dystrophin  mRNA  of Duchenne muscular dystrophy. Pediatr Res 59: 690‐4 

Teigen K, Froystein NA, Martinez A (1999) The structural basis of the recognition of phenylalanine  and  pterin  cofactors  by  phenylalanine  hydroxylase: implications for the catalytic mechanism. J. Mol. Biol. 294: 807‐823 

Page 123: Cristina Aguado Esteban

107

Thompson GN, Chalmers RA  (1990)  Increased urinary metabolite excretion during fasting in disorders of propionate metabolism. Pediatr Res 27: 413‐6 

Thompson  GN,  Chalmers  RA,  Walter  JH,  Bresson  JL,  Lyonnet  SL,  Reed  PJ, Saudubray  JM, Leonard  JV, Halliday D  (1990) The use of metronidazole  in management of methylmalonic and propionic acidaemias. Eur  J Pediatr 149: 792‐6 

Thony B, Auerbach G, Blau N (2000) Tetrahydrobiopterin biosynthesis, regeneration and functions. Biochem J 347 Pt 1: 1‐16 

Thony  B,  Ding  Z, Martinez  A  (2004)  Tetrahydrobiopterin  protects  phenylalanine hydroxylase activity  in vivo:  implications  for  tetrahydrobiopterin‐responsive hyperphenylalaninemia. FEBS Lett 577: 507‐11 

Thorolfsson  M,  Teigen  K,  Martinez  A  (2003)  Activation  of  phenylalanine hydroxylase:  effect  of  substitutions  at  arg68  and  cys237.  Biochemistry  42: 3419‐28 

Towbin H,  Staehelin  T, Gordon  J  (1979)  Electrophoretic  transfer  of  proteins  from polyacrylamide  gels  to  nitrocellulose  sheets:  procedure  and  some applications. Proc Natl Acad Sci U S A 76: 4350‐4 

Trefz  FK,  Scheible D,  Frauendienst‐Egger  G,  Korall H,  Blau N  (2005)  Long‐term treatment  of  patients  with  mild  and  classical  phenylketonuria  by tetrahydrobiopterin. Mol Genet Metab 86 Suppl 1: S75‐80 

Ugarte M,  Perez‐Cerda  C,  Rodriguez‐Pombo  P,  Desviat  LR,  Perez  B,  Richard  E, Muro S, Campeau E, Ohura T, Gravel RA (1999) Overview of mutations in the PCCA and PCCB genes causing propionic acidemia. Hum Mutat 14: 275‐82 

van  ʹt Hoff WG, Dixon M, Taylor  J, Mistry P, Rolles K, Rees L, Leonard  JV  (1998) Combined  liver‐kidney transplantation  in methylmalonic acidemia. J Pediatr 132: 1043‐4. 

Vázquez   López M MBA, Martínez  Jímenez A, García Muñoz MJ, Royo Orejas A, Arcas  Martínez  J,  López  Martín  V,  Pascual  Castroviejo  I  (1996)  Necrosis bilateral de ganglios basales en la acidemia metilmalónica. An Esp Pediatr 44: 273‐276 

Vlasova  TI,  Stratton  SL, Wells AM, Mock NI, Mock DM  (2005)  Biotin  deficiency reduces expression of SLC19A3, a potential biotin  transporter,  in  leukocytes from human blood. J Nutr 135: 42‐7 

Vockley  J, Rogan PK, Anderson BD, Willard  J, Seelan RS, Smith DI, Liu W  (2000) Exon skipping in IVD RNA processing in isovaleric acidemia caused by point mutations in the coding region of the IVD gene. Am J Hum Genet 66: 356‐67. 

Walker GA, Murphy S, Huennekens FM  (1969) Enzymatic conversion of vitamin B 12a  to  adenosyl‐B  12:  evidence  for  the  existence  of  two  separate  reducing systems. Arch Biochem Biophys 134: 95‐102 

Watanabe  T,  Endo  A  (1990)  Teratogenic  effects  of maternal  biotin  deficiency  on mouse embryos examined at midgestation. Teratology 42: 295‐300 

Waters PJ (2003) How PAH gene mutations cause hyper‐phenylalaninemia and why mechanism matters: insights from in vitro expression. Hum Mutat 21: 357‐69 

Page 124: Cristina Aguado Esteban

108

Waters  PJ,  Parniak  MA,  Akerman  BR,  Scriver  CR  (2000)  Characterization  of phenylketonuria  missense  substitutions,  distant  from  the  phenylalanine hydroxylase active  site,  illustrates a paradigm  for mechanism and potential modulation of phenotype. Mol. Genet. Metab. 69: 101‐10 

Wiedmann  S,  Eudy  JD,  Zempleni  J  (2003)  Biotin  supplementation  increases expression  of  genes  encoding  interferon‐gamma,  interleukin‐1beta,  and  3‐methylcrotonyl‐CoA  carboxylase,  and  decreases  expression  of  the  gene encoding  interleukin‐4  in human peripheral blood mononuclear cells. J Nutr 133: 716‐9 

Wolf B  (2001) Disorders of biotin metabolism.  In: Scriver CR, Beaudet AL, Sly WS, Valle  D  (eds)  The  metabolic  and  molecular  bases  of  inherited  disease. McGraw‐Hill, New York, pp 3935‐3962 

Wood M, Yin H, McClorey G (2007) Modulating the expression of disease genes with RNA‐based therapy. PLoS Genet 3: e109 

Yang X, Sakamoto O, Matsubara Y, Kure S, Suzuki Y, Aoki Y, Sakura N, Takayanagi M, Iinuma K, Ohura T  (2004a) Mutation analysis of  the MMAA and MMAB genes  in  Japanese  patients  with  vitamin  B(12)‐responsive  methylmalonic acidemia: identification of a prevalent MMAA mutation. Mol Genet Metab 82: 329‐33 

Yang  X,  Sakamoto  O,  Matsubara  Y,  Kure  S,  Suzuki  Y,  Aoki  Y,  Yamaguchi  S, Takahashi Y, Nishikubo T, Kawaguchi C, Yoshioka A, Kimura T, Hayasaka K, Kohno Y,  Iinuma K, Ohura T  (2004b) Mutation  spectrum of  the PCCA and PCCB genes in Japanese patients with propionic acidemia. Mol Genet Metab 81: 335‐42 

Yildirim S, Tokatli A, Yilmaz E, Coskun T (2007) Assessment of tetrahydrobiopterin responsiveness in Turkish hyperphenylalaninemic patients. Turk J Pediatr 49: 1‐6 

Zekanowski  C,  B.  P,  Desviat  LR,  Wiszniewski  W,  Ugarte  M  (2000)  In  vitro expression  analysis  of  R68G  and  R68S  mutations  in  phenylalanine hydroxylase gene. Acta Biochimica Polonica 47: 365‐369 

Zhang J, Dobson CM, Wu X, Lerner‐Ellis J, Rosenblatt DS, Gravel RA (2006) Impact of cblB mutations on the function of ATP:cob(I)alamin adenosyltransferase in disorders of vitamin B12 metabolism. Mol Genet Metab 87: 315‐22 

Zurfluh MR,  Zschocke  J,  Lindner M,  Feillet  F,  Chery  C,  Burlina  A,  Stevens  RC, Thony B, Blau N (2008) Molecular genetics of tetrahydrobiopterin‐responsive phenylalanine hydroxylase deficiency. Hum Mutat 29: 167‐75 

  

Page 125: Cristina Aguado Esteban

109

                  

8. PUBLICACIONES   

Page 126: Cristina Aguado Esteban

110

Parte de este trabajo se encuentra descrito en las siguientes publicaciones:  Aguado C, Perez B, Garcia MJ, Belanger‐Quintana A, Martinez‐Pardo M, Ugarte M, 

Desviat  LR  (2007)  BH4  responsiveness  associated  to  a  PKU mutation with decreased binding affinity for the cofactor. Clin Chim Acta 380: 8‐12 

 Aguado  C,  Perez  B,  Ugarte  M,  Desviat  LR  (2006)  Analysis  of  the  effect  of 

tetrahydrobiopterin  on  PAH  gene  expression  in  hepatoma  cells.  FEBS  Lett 580: 1697‐701 

 Desviat LR, Perez B, Belanger‐Quintana A, Castro M, Aguado C, Sanchez A, Garcia 

MJ, Martinez‐Pardo M, Ugarte M (2004) Tetrahydrobiopterin responsiveness: results  of  the BH4  loading  test  in  31  Spanish PKU patients  and  correlation with their genotype. Mol Genet Metab 83: 157‐62 

 Erlandsen H, Pey AL, Gamez A, Perez B, Desviat LR, Aguado C, Koch R, Surendran 

S, Tyring S, Matalon R, Scriver CR, Ugarte M, Martinez A, Stevens RC (2004) Correction  of  kinetic  and  stability  defects  by  tetrahydrobiopterin  in phenylketonuria patients with certain phenylalanine hydroxylase mutations. Proc Natl Acad Sci U S A 101: 16903‐8 

 Pey AL,  Perez  B, Desviat  LR, Martinez MA, Aguado C,  Erlandsen H, Gamez A, 

Stevens  RC,  Thorolfsson  M,  Ugarte  M,  Martinez  A  (2004)  Mechanisms underlying  responsiveness  to  tetrahydrobiopterin  in mild  phenylketonuria mutations. Hum Mutat 24: 388‐99 

 Rincon A*, Aguado C*, Desviat LR, Sanchez‐Alcudia R, Perez B, Ugarte M  (2007) 

Propionic and Methylmalonic Acidemia: Antisense Therapeutics  for  Intronic Variations Causing Aberrantly Spliced Messenger RNA. Am J Hum Genet 81 

  

Page 127: Cristina Aguado Esteban

111

 INTRODUCCIÓN................................................................................................................. 1  ENFERMEDADES METABÓLICAS HEREDITARIAS (EMH)................................... 2  RESPUESTA A COFACTORES EN EMH ........................................................................ 5  FENILCETONURIA Y RESPUESTA A TETRAHIDROBIOPTERINA (BH4) .......... 7 Estructura y función de la fenilalanina hidroxilasa ..................................................... 10 El cofactor tetrahidrobioterina.......................................................................................... 12  ACIDEMIA METILMALÓNICA AISLADA Y RESPUESTA A COBALAMINA.. 14 Estructura y función de la ATP:cob(I)alamina adenosiltransferasa (ATR).............. 15  ACIDEMIA PROPIÓNICA Y METILCROTONILGLICINURIA Y RESPUESTA A  BIOTINA........................................................................................................................... 18 

Estructura y función de la propionil‐coA carboxilasa y metilcrotonil‐coA carboxilasa ........................................................................................................................ 21 

La coenzima biotina ............................................................................................................ 21  SPLICING Y ENFERMEDADES GENÉTICAS ............................................................. 24  OBJETIVOS.......................................................................................................................... 26  MATERIALES Y MÉTODOS............................................................................................ 28  MATERIALES...................................................................................................................... 29 Reactivos y aparatos............................................................................................................ 29 Material biológico ............................................................................................................... 30 Pacientes................................................................................................................................ 30 Líneas celulares establecidas ............................................................................................ 31 Cepas bacterianas ................................................................................................................ 31 Vectores plasmídicos .......................................................................................................... 31  MÉTODOS ........................................................................................................................... 31 Tratamiento de ácidos nucleicos ...................................................................................... 31 Electroforesis en geles con gradiente de desnaturalización (DGGE) ....................... 35 Expresión y purificación de proteínas en E. coli ........................................................... 35 Expresión y purificación de la proteína de fusión MBP‐PAH.................................... 35 Expresión y purificación de la proteína hATR.............................................................. 36 Cromatografía en gel .......................................................................................................... 38 Electroforesis, transferencia  y detección de proteínas ................................................ 38 Electroforesis, transferencia e  inmunodetección de la proteína  

Page 128: Cristina Aguado Esteban

112

PAH ........................................................................................................................................ 38 Electroforesis, transferencia y detección de la proteína α‐PCC mediante marcaje con avidina conjugada a fosfatasa alcalina ................................................................ 39 

Ensayos enzimáticos ........................................................................................................... 39 Actividad fenilalanina hidroxilasa .................................................................................. 39 Actividad ATP:cob(I)alamina adenosiltransferasa....................................................... 40 Actividad propionil‐CoA carboxilasa y metilcrotonil‐CoA carboxilasa ............................................................................................................................ 41 Síntesis in vitro  y pulso caza de las proteínas PAH .................................................... 42 Cultivo celular...................................................................................................................... 43 Expresión transitoria en células eucariotas Hep3B....................................................... 43 Transfección de oligonucleótidos antisentido tipo morfolinos en fibroblastos..... 44 Medida de pterinas ............................................................................................................. 44 Soporte informático ............................................................................................................ 45  RESULTADOS..................................................................................................................... 46  BASES MOLECULARES DE LA RESPUESTA A BH4 EN FENILCETONURIA ... 47 Identificación de mutaciones asociadas a respuesta a BH4 en pacientes fenilcetonúricos españoles .............................................................................. 47 Expresión de proteínas PAH mutantes implicadas en la respuesta  a BH4...................................................................................................................................... 50 Análisis cinéticos................................................................................................................. 51 Análisis del efecto del cofactor BH4 sobre la   estabilidad de las proteínas PAH  normal y mutantes........................................................................................................... 53 

Efecto de la BH4 sobre la transcripción y traducción del gen PAH........................... 57  BASES MOLECULARES DE LA RESPUESTA A COBALAMINA (VIT B12) EN ACIDEMIA METILMALÓNICA AISLADA............................................................. 61 

Expresión de proteínas mutantes implicadas en respuesta in vitro  a B12; Análisis cinéticos ..................................................................................................... 61  BASES MOLECULARES DE LA RESPUESTA A BIOTINA EN ACIDEMIA PROPIÓNICA Y METILCROTONILGLICINURIA ................................................ 66 

 TERAPIAS MODULADORAS DE  MUTACIONES DE SPLICING EN ACIDEMIA PROPIÓNICA........................................................................................... 71 

Análisis del efecto de drogas sobre mutaciones de splicing   que producen niveles detectables de transcritos  normales........................................ 71 Análisis del efecto de oligonucleótidos antisentido sobre la  inclusión aberrante de pseudoexones. ............................................................................ 73  DISCUSIÓN......................................................................................................................... 77 

Page 129: Cristina Aguado Esteban

113

 RESPUESTA COFACTORES Y COENZIMAS EN EMH............................................ 78 Respuesta a tetrahidrobioterina en fenilcetonuria ....................................................... 78

Page 130: Cristina Aguado Esteban

114

Respuesta a cobalamina en acidemia metilmalónica aislada ..................................... 84 Respuesta a biotina en acidemia propiónica y en  metilcrotonilglicinuria ....................................................................................................... 85  TERAPIAS MODULADORAS DE MUTACIONES DE SPLICING EN ACIDEMIA PROPIÓNICA.................................................................................................................. 88 

Efecto de la terapia con oligonucleótidos sobre mutaciones de  splicing que producen inclusión de pseudoexones...................................................... 88 Efecto de drogas sobre mutaciones de splicing que producen  niveles detectables de transcritos normales. .................................................................. 89  CONCLUSIONES ............................................................................................................... 93  BIBLIOGRAFÍA................................................................................................................... 96  PUBLICACIONES............................................................................................................. 109    

Page 131: Cristina Aguado Esteban

115

(Aguado et al. 2007; Aguado et al. 2006; Desviat et al. 2004; Erlandsen et al. 2004; Pey et al. 2004; Ugarte et al. 2007)     

Page 132: Cristina Aguado Esteban

116

Parte de este trabajo se encuentra descrito en las siguientes publicaciones:  Aguado C, Perez B, Garcia MJ, Belanger‐Quintana A, Martinez‐Pardo M, Ugarte M, 

Desviat  LR  (2007)  BH4  responsiveness  associated  to  a  PKU mutation with decreased binding affinity for the cofactor. Clin Chim Acta 380: 8‐12 

 Aguado  C,  Perez  B,  Ugarte  M,  Desviat  LR  (2006)  Analysis  of  the  effect  of 

tetrahydrobiopterin  on  PAH  gene  expression  in  hepatoma  cells.  FEBS  Lett 580: 1697‐701 

 Desviat LR, Perez B, Belanger‐Quintana A, Castro M, Aguado C, Sanchez A, Garcia 

MJ, Martinez‐Pardo M, Ugarte M (2004) Tetrahydrobiopterin responsiveness: results  of  the BH4  loading  test  in  31  Spanish PKU patients  and  correlation with their genotype. Mol Genet Metab 83: 157‐62 

 Erlandsen H, Pey AL, Gamez A, Perez B, Desviat LR, Aguado C, Koch R, Surendran 

S, Tyring S, Matalon R, Scriver CR, Ugarte M, Martinez A, Stevens RC (2004) Correction  of  kinetic  and  stability  defects  by  tetrahydrobiopterin  in phenylketonuria patients with certain phenylalanine hydroxylase mutations. Proc Natl Acad Sci U S A 101: 16903‐8 

 Pey AL,  Perez  B, Desviat  LR, Martinez MA, Aguado C,  Erlandsen H, Gamez A, 

Stevens  RC,  Thorolfsson  M,  Ugarte  M,  Martinez  A  (2004)  Mechanisms underlying  responsiveness  to  tetrahydrobiopterin  in mild  phenylketonuria mutations. Hum Mutat 24: 388‐99 

 Rincon A, Aguado  C, Desviat  LR,  Sanchez‐Alcudia  R,  Perez  B, Ugarte M  (2007) 

Propionic and Methylmalonic Acidemia: Antisense Therapeutics  for  Intronic Variations Causing Aberrantly Spliced Messenger RNA. Am J Hum Genet 81