Crecimiento y Multiplicación Bacteriana

I. VISION GLOBAL DEL CRECIMIENTO CELULARI. VISION GLOBAL DEL CRECIMIENTO CELULAR

La célula bacteriana es capaz de duplicarse a sí misma. Para el crecimiento de la célula bacteriana son necesarios no menos de 2000 reacciones bioquímicas de biosíntesis, dentro de las cuales las mas importantes son las reacciones de polimerización (síntesis de ADN, ARN y proteínas).

Una vez que los polímeros están fabricados, se puede decir que está dispuesto el escenario para los acontecimientos finales del crecimiento celular.

División Bacteriana

II. CRECIMIENTO DE POBLACIONES

Crecimiento se define como aumento en el numero de células microbianas en una población, lo cual también puede ser medido como un incremento en la masa microbiana.

Velocidad de crecimiento es el cambio en el numero de células o masa celular por unidad de tiempo.

Tiempo de generación o de duplicación. Tiempo requerido para que a partir de una célula se formen dos células. El tiempo de generación varia de un microorganismo a otro.

Crecimiento exponencial

Se llama crecimiento exponencial al incremento de la población bacteriana en el que el número de células se dobla cada cierto periodo de tiempo.

tiempo (hr) numero total de células

0 1 0.5 2 1 4 1.5 8 2 16 2.5 32 3 64 3.5 128 . . . . . . 10 1,048,576

CULTIVO DISCONTINUO:

Llamado también sistema cerrado. Los microorganismos se incuban en un recipiente cerrado con medio líquido al que no se añade más cantidad de medio que el inicial, en consecuencia, las concentraciones de nutrientes disminuyen y los residuos aumentan.

Requerimientos para el Crecimiento

A. Requerimientos Físicos: Incluyen Temperatura, el pH, Presión osmótica.

B. Requerimientos Químicos: Incluyen fuentes de carbono, nitrógeno, azufre, fósforo, oligoelementos, oxígeno y factores de crecimiento.

Temperatura

Las bacterias se dividen en 3 categorías: A) Sicrófilos (afinidad por el frío) B) Mesófilos (afinidad por Tº moderada) C) Termófilos (afinidad por el calor). Tº mínima de crecimiento: Es la Tº mas baja en

la cual crecerá la especie. Tº óptima de crecimiento: Es la Tº a la cual la

especie crece mejor. Tº máxima de crecimiento: Es la Tº mas alta a la

cual es posible el crecimiento

Presión Osmótica

Casi todos los nutrientes que requieren las bacterias se encuentran disueltos en el agua circundante.

Cuando la PO es elevada tiende a eliminar agua de la célula (plasmólisis), esto sucede cuando el m.o, se encuentra en un medio hipertónico (Halófilos, Osmófilos)

pH

Se refiere a la acidez o alcalinidad de una solución.

La mayoría de las bacterias crecen mejor en un rango cercano a la neutralidad (6,5 – 7,5).

Cuando las bacterias crecen en los medios de cultivo a menudo producen ácidos que al final interfieren con su crecimiento, esto se corrige agregando al medio sustancias químicas que actúan como tampones o buffers.

Oxígeno

Los m.o que utilizan el oxígeno molecular producen mas energía a partir de los nutrientes que los que no lo utilizan.

Los m.o se dividen según la necesidad de Oxígeno:

A) Aerobios estrictos. B) Anaerobios facultativos. C) Anaerobios estrictos. D) Anaerobios aerotolerantes. E) Microaerófilos

Jarra de Brewer

Fase de latenciaFase de latencia

Fase exponencialFase exponencial

Fase estacionaria

Fase de muerte

III. CICLO DE CRECIMIENTO POBLACIONAL

En un recipiente cerrado conocido como cultivo en “batch”, o en medio no renovado la curva de crecimiento se divide en:

Fase de Latencia

Aunque no hay división celular ni crecimiento de masa, la célula esta sintetizando nuevos componentes macromoleculares, de la actividad metabólica y de la susceptibilidad a los componentes químicos y físicos.

La fase de latencia es un periodo de ajuste necesario para el reabastecimiento del pool celular de metabolitos a un nivel compatible a la síntesis celular máxima.

Una fase de latencia previa al comienzo de la división celular puede ser necesaria por diversas razones:

Las células pueden ser viejas y poseer una cantidad reducida de ATP, cofactores esenciales y ribosomas; estas sustancias deben sintetizarse antes del crecimiento.

El medio puede ser diferente al anterior donde crecían los microorganismos. En este caso necesitarán nuevas enzimas para usar otros nutrientes.

Los microorganismos pudieron ser alterados y necesitan un tiempo de recuperación.

La duración de la fase de latencia varia, y según la condición de los microorganismos y la naturaleza del medio. Puede ser bastante larga si el inóculo procede de un cultivo viejo o de uno que haya sido refrigerado.

Cuando una célula se divide en dos, estas en otras Cuando una célula se divide en dos, estas en otras dos y así sucesivamente.dos y así sucesivamente.

La mayoría de los microorganismos unicelulares La mayoría de los microorganismos unicelulares crecen exponencialmente, pero las velocidades de crecen exponencialmente, pero las velocidades de crecimiento exponencial puede variar.crecimiento exponencial puede variar.

En esta fase los microorganismos crecen y se En esta fase los microorganismos crecen y se dividen hasta el nivel máximo, en función de su dividen hasta el nivel máximo, en función de su potencial genético, el tipo de medio y las condiciones potencial genético, el tipo de medio y las condiciones en que crecen. en que crecen. La velocidad de crecimiento es constante durante la La velocidad de crecimiento es constante durante la fase exponencial; es decir los microorganismos se fase exponencial; es decir los microorganismos se dividen y duplican en número a intervalos regulares.dividen y duplican en número a intervalos regulares.

Fase exponencialFase exponencial

En esta fase el crecimiento de la población cesa y la curva de crecimiento se vuelve horizontal. Las bacterias llegan a esta fase cuando el nivel de la población es de aproximadamente de 109 células por ml. Otros microorganismos como los protozoos y algas llegan a una concentración de 106 células por ml. No hay incremento neto (o decremento) del numero de células. Durante esta fase en algunos organismos tiene lugar el crecimiento críptico.

Implicancia de los genes sur (por survival = supervivencia ), necesarios para la supervivencia celular durante la fase estacionaria.

Fase estacionaria

Las poblaciones microbianas entran en fase estacionaria por varias rezones:

Un factor es la limitación de nutrientes, Si se reduce intensamente la concentración de un nutriente esencial, la población crecerá lentamente. Por ejemplo los organismos aerobios están limitados a menudo por la disponibilidad de O2.

El crecimiento de una población puede también cesar debido a la acumulación de residuos tóxicos. Este factor limita el crecimiento de cultivos anaerobios.

En la fase estacionaria el número total de microorganismos viables permanece constante. Este hecho puede ser resultado del equilibrio entre la división y la muerte de las células, o simplemente porque la población deja de dividirse, aunque siga su actividad metabólica.

Fase de muerte

Si la incubación continua después que la población alcance la fase estacionaria, las células deben permanecer vivas y metabólicamente activas, pero también deben morir. Si esto último ocurre se dice que las células entran en fase de muerte.

CURVA TÍPICA DEL CRECIMIENTO BACTERIANO EN UN CULTIVO EN “BATCH”, O EN MEDIO NO RENOVADO

IV. MEDICIÓN DEL CRECIMIENTO MICROBIANO

El crecimiento de una población microbiana se mide siguiendo los cambios en el numero de células o el peso de la biomasa celular.

A)Métodos Directos de la Masa celular

Determinación del Peso Húmedo

Determinación del Peso Seco

B) Métodos Indirectos

Nefelometría o Turbiometría

Recuento de Células Viables

MÉTODOS DIRECTOS

DETERMINACIÓN DEL PESO HÚMEDO: se tara un tubo de centrífuga; se centrifuga el cultivo y se elimina el

sobrenadante. se determina el peso del sedimento. Inconvenientes: grandes errores, debido al

líquido intercelular retenido, cuya cuantía depende a su vez de la forma y tipo de agrupaciones de la cepa, intensidad del empaquetamiento, etc.

DETERMINACIÓN DEL PESO SECO: Como el anterior, pero el sedimento se seca

antes de ser pesado (105ºC, toda la noche), hasta peso constante. Las medidas de peso seco suelen representar el 10-15% de los valores de peso húmedo.

Inconvenientes: método tedioso (requiere mucho tiempo) y con bastantes errores: es difícil pesar menos de 1 mg con exactitud en las balanzas habituales de laboratorio. 1 mg de peso seco equivale a unas 5 x 10 9 bacterias.

MÉTODOS INDIRECTOS MÉTODOS TURBIDIMÉTRICOS (ÓPTICOS). Son muy usados en la práctica cotidiana del

laboratorio. La base común de estos métodos consiste en la medición de la cantidad de luz dispersada o transmitida a través de un cultivo bacteriano.

Recordemos aquí que las suspensiones bacterianas dispersan la luz, al igual que cualquier partícula pequeña suspendida en agua (efecto Tyndall). La dispersión de la luz es, dentro de ciertos límites, proporcional a la masa del cultivo.

NEFELOMETRÍA O TURBIDIOMETRÍA

Este método implica un estudio comparativo entre el cultivo celular y una solución de bicloruro de Bario en solución de ácido sulfúrico, esta solución se le conoce como nefelómetro de Macfarland.

ESPECTROFOTÓMETRO:

Este aparato es de uso habitual en cualquier laboratorio de Microbiología o Bioquímica. Mide la densidad óptica (D.O.), es decir la absorbancia (una medida de la luz transmitida a través de la supensión).

Por supuesto, hay que realizar una curva estándar para relacionar los valores de A con la masa bacteriana en una muestra problema.

Comentarios: La cantidad de luz dispersada es proporcional al cociente entre el tamaño de la partícula y la longitud de onda incidente; la sensibilidad de la técnica aumenta pues a longitudes de onda (l) cortas. La proporcionalidad entre A y masa bacteriana sólo es válida para >107céls/ml.

Espectrofotómetro en medida del crecimiento

MEDIDA DEL NÚMERO DE INDIVIDUOS. MÉTODOS DIRECTOS

CÁMARA DE RECUENTO DE PETROFF-HAUSER: Consiste en un portaobjetos especial con una

graduación en superficie y unas medidas muy concretas:

Excavación con 0.02 mm de profundidad. Área de 1 mm2, dividida en un retículo de 25

cuadrados grandes. Cada cuadrado grande está subdividido a su

vez en 4x4 = 16 cuadrados pequeños. Es decir, la muestra se distribuye en 16 x 25 =

400 celdillas (cuadros pequeños).

Contaje Microscópico Directo Utilizando la Cámara Petroff - Hausser

1. Las células muertas no se distinguen de la vivas.

2. Las células pequeñas son difícil de ver al microscopio y algunas de ella probablemente no se cuentan.

3. Se requiere tiempo y habilidad para conseguir precisión por este método.

4. Se requiere de un microscopio de contraste de fases cuando la muestra no esta teñida.

5. Este método no es bueno para una suspensión de células poco densas.

Limitaciones del Contaje Microscópico Directo

CONTADORES ELECTRÓNICOS DE PARTÍCULAS (TIPO COULTER):

Se hace pasar una suspensión microbiana por un tubo capilar, entre los dos polos de una corriente eléctrica. Cada vez que por un orificio (30 mm diámetro) pasa una partícula (p. ej., bacteria) se interrumpe la corriente, lo cual es recogido por un dispositivo de registro electrónico, que detecta el número y el tamaño de las partículas que van pasando. (El tamaño detectado es función de la intensidad del pulso de voltaje al paso de la partícula).

Comentarios: hay que usar suspensiones absolutamente libres de partículas extrañas (las pequeñas serían contabilizadas erróneamente como bacterias, y las mayores pueden obturar el orificio del aparato).

RECUENTO DE CELULAS VIABLES

Una célula viable se define como la que es capaz de dividirse para dar lugar a descendencia y la forma habitual de llevar a cabo un contaje de este tipo, es determinado en número de células capaces de generar colonias sobre la superficie de un medio sólido.

El método de siembra puede ser:

Siembra por extensión

Por vertido en placa

SIEMBRA POR EXTENSIÓN

SIEMBRA POR VERTIDO EN PLACA

FUENTE DE ERROR EN EL MÉTODO DE CONTAJE EN PLACA

Las células depositadas sobre el medio de cultivo no desarrollarán colonias al mismo tiempo, de modo que si en tiempo de incubación es corto se obtendrá un numero más bajo de lo real.

Es normal el determinar las condiciones de incubación (medio, temperatura y tiempo), que darán el número máximo de colonias para un organismo dado y a partir y ahí utilizar siempre las mismas condiciones.

El contaje de viables puede ser fuente de errores muy grandes de modo que hay que tomar muchas precauciones y replicar las placas de las diluciones claves.

A menudo se expresan comunidades formadoras de colonias en lugar de células viables.

DILUCIONES

Para obtener el número de colonias apropiado la muestra debe ser casi siempre diluida, necesariamente es necesario hacer más de una dilución, generalmente seriadas en base 10.

Para hacer una dilución de 10 veces uno puede mezclar 0,5 ml de muestra con 4,5 de diluyente, o 1,0 de muestra con 9,0 de diluyente.

En la mayoría de las ocasiones hay que realizar tales diluciones seriadas para que el numero de colonias sea el deseado. Por tanto, si se necesita una dilución de un millón de veces se puede conseguir por tres seriadas de 100 veces, o por seis seriadas de 10 veces.

Método del Número Mas Probable

Es una estimación estadística, basada en el hecho de que cuanto mayor sea el número de bacterias en una muestra, mayor será la dilución necesaria para reducir la densidad hasta el punto en el cual no se desarrolle ningún m.o, en los tubos de una serie de diluciones.

Número Mas Probable (NMP)

Tabla del NMP (Serie de tres tubos)

Recuento sobre Filtros Se usa para suspensiones diluidas de bacterias.

Se hace pasar un gran volumen de suspensión a través de una membrana de nitrocelulosa o de nylon estériles (con un diámetro de poro que retiene las bacterias pero permite el tránsito de sustancias). Posteriormente, el filtro se deposita sobre la superficie de un medio de cultivo sólido. Las colonias se forman sobre el filtro a partir de las células retenidas. Dichas colonias se cuentan, deduciéndose la concentración original de viables en función del volumen de suspensión que se hizo pasar por el filtro.

Recuento sobre Filtros

VI. CULTIVO CONTINUO

Es un sistema abierto de cultivo de microorganismos en el que se mantienen las condiciones ambientales constantes a través de un suministro continuo de nutrientes y de la retirada de residuos.En este tipo de cultivo se puede mantener una población microbiana en fase de crecimiento exponencial, a una concentración constante de biomasa durante un periodo largo de tiempo.Una vez que se alcanza el equilibrio, el número de células y el estado metabólico se mantienen constantes, se dice entonces que se alcanza el Estado de Equilibrio.

EL QUIMIOSTATO

Es el tipo mas común de cultivo continuo, que permite el control de la densidad de la población y la velocidad de crecimiento del cultivo.

Consta de un recipiente de cultivo que se alimenta con un medio estéril a la misma velocidad con que se gasta el medio que contiene los microorganismos.

En el control del quimiostato se utilizan dos elementos: La velocidad de Dilución y la Concentración de un Nutriente Limitante (tales como la fuente de carbono o nitrógeno).

Debido a la presencia del nutriente limitante la velocidad del crecimiento se determina por la velocidad a la que se incorpora más cantidad de medio en la cámara de cultivo y la densidad final celular depende de las concentraciones del nutriente limitante.

La velocidad de dilución es la velocidad de recambio del nutriente, velocidad a la que el medio fluye en el recipiente de cultivo, respecto del volumen del mismo:

D=f V

D= Velocidad de Dilución

f= velocidad de flujo (mL/h)

V= volumen del recipiente (mL)

Sistema de cultivo continuo al que se le renuevan los nutrientes y retiran los residuos. Las condiciones ambientales se mantienen constantes

VII. CRECIMIENTO EQUILIBRADO Y DESEQUILIBRADO

• El crecimiento exponencial, tanto en cultivos discontinuos como continuos, es un crecimiento equilibrado.

• Es equilibrado cuando todos los componentes celulares se forman a una velocidad constante.

• Si se modifican las concentraciones de nutrientes y otras condiciones ambientales, se origina un crecimiento desequilibrado.

• Se produce un crecimiento desequilibrado cuando:

. Si se transfieren bacterias desde un medio pobre en nutrientes a otro más rico.

. Si pasa una población bacteriana de un medio rico en nutrientes a otro más pobre.