CRECIMIENTO Y MULTIPLICACIÓN BACTERIANA, MEDICIÓN DEL CRECIMIENTO: APLICACIONES EN LA INDUSTRIA.

CRECIMIENTO:

El crecimiento de cualquier sistema biológico es el incremento ordenado de todos los componentes de un ese sistema, lo cual implica un aumento de la masa celular que eventualmente conduce la multiplicación celular. En organismos pluricelulares dicha multiplicación se traduce en un aumento del tamaño del individuo, mientras que en unicelulares lo que ocurre es un aumento de la población. Por lo que, el aumento de tamaño que resulta cuando una célula capta agua o deposita lípidos o polisacáridos, no es un crecimiento verdadero.

CRECIMIENTO BACTERIANO

El crecimiento bacteriano podemos estudiarlo desde dos puntos de vista:

Los eventos de crecimiento en el ámbito individual hacen referencia al ciclo celular, y dentro de éste podemos abordar los siguientes temas:

- Inicio y transcurso de la replicación cromosómica y de plásmidos.

- Segregación de cromosoma y plásmido a las células hijas.

- Síntesis de nuevos materiales de las envueltas, sobre todo de pared celular.

- Señales que coordinan la replicación genómica con la división celular.

El estudio del crecimiento a nivel de poblaciones incluye los siguientes tópicos:

- Cinética del crecimiento.

- Factores que afectan al tiempo medio de generación (g)

- Factores ambientales que limitan el crecimiento.

I. A escala individual:

1. Ciclo celular procariota.

Hasta hace unos 20 años se pensaba que los ciclos bacterianos carecían de eventos clave. Ello se debía a que en bacterias no existe mitosis y porque en

los medios de cultivo ricos empleados entonces la síntesis de ADN parecía continua durante todo el ciclo.

Pero hoy sabemos que sí existen fenómenos clave, que se pueden poner mejor de manifiesto cuando el crecimiento se estudia en medios menos ricos que permiten sólo crecimientos lentos. Lo períodos del ciclo procariota son:

Fase C (equivalente a la S eucariótica): replicación del ADN cromosómico.

Fase D (equivalente a G2 + M): se distingue porque su terminación coincide con el final de la división celular.

Fase innominada, equivalente a la G1 eucariótica.

Lo característico del ciclo es que las fases C y D son relativamente constantes, y por lo tanto, cuando disminuye el tiempo de generación (g), lo hace a expensas de la fase “G1”. Por ejemplo, en Escherichia coli, C = unos 40 minutos, y D = unos 20 minutos.

2. Ciclo celular en función del tiempo de generación.

El ejemplo de E. coli que ocurre con el ciclo celular a distintos tiempos de generación.

3. Control de la replicación del ADN cromosómico.

De lo anterior se deduce que debe de existir algún tipo de acoplamiento entre las ondas de replicación y l división celular.

Contar C + D minutos a parir de g, y entonces se puede prever que la ronda de replicación tendrá lugar g – (C+D) minutos antes de la próxima división celular.

Pero, la célula no es tan “lista” (no sabe contar hacia atrás en el tiempo) ni ten el don d la predicción (los humanos tampoco, para la mayor parte de de las cosas importantes). La bacteria tampoco sabe “contar hacia adelante”, ya que el tiempo de inicio de una ronda de replicación no guarda una relación sencilla con la división celular previa

Entonces, ¿cómo se acoplan división celular y replicación cromosómica? Una clave hacia la respuesta a esa pegunta es que la razón (proporción) entre orígenes de replicación y masa celular en el inicio (inmediatamente antes de la replicación) es igual para todas las tasas de crecimiento. Este es un modelo hipotético sobre el mecanismo de coordinación entre ambos eventos del ciclo celular.

E sistema de coordinación detecta la concentración de orígenes de replicación; conforme la bacteria crece, esta concentración va decreciendo, hasta que se alcanza un valor umbral crítico que desencadena una nueva onda de replicación. Ello hace que se doble el número de orígenes. Una ulterior ronda no se pone en marcha hasta que el crecimiento haga de nuevo descender la concentración de orígenes.

Se trataría, de un especie de reloj biológico y “oscilador” que usaría como medida del tiempo el parámetro d masa celular, volumen, u otro equivalente, de tal modo que la concentración crítica de un factor iniciador o la dilución de un represor servirían para disparar la replicación a una concentración determinad.

4. Relaciones entre velocidad de crecimiento y tamaño celular.

Es fácil comprobar en los cultivos bacterianos que cuanto más rico es un medio, y por lo tanto menor es el tiempo de generación (g), mayor es el tamaño medio de las células.

1. Bacterias en crecimiento en un medio relativamente pobre (supongamos que en este medio g = 60min, C+D = g).

2. Si transportamos una célula recién dividida procedente del cultivo anterior a un medio más rico (por ejemplo, que permite un tiempo de generación g = 35 min) podemos observar que:

a. La primera división ocurre C+D (60 minutos) después; es decir, con un tiempo idéntico al que tenía en el medio anterior.

b. Pero como en este medio g = 35 min, la iniciación de una nueva ronda de replicación ocurre antes de dicha replicación celular (es decir, C y D se superponen).

c. Se observa que se alcanza u nuevo equilibrio, con un tamaño celular mayor que en el medio pobre, y una masa de inicio (tras la división celular) mayor, alterándose igualmente el tiempo de inicio.

5. Segregación de cromosomas y plásmidos.

Existe un mecanismo eficiente que asegura la segregación de los cromosomas bacterianos a las células hijas. El cromosoma se encuentra unido a la membrana citoplasmática, al parecer a través de un mesosoma. Existen indicios de que durante la replicación, el vértice de la horquilla de replicación va pasando por ese punto de anclaje.

La replicación cromosómica se inicia en una región especial oriC, a partir de la cual se efectúa una replicación bidireccional, hasta que ambas horquillas se encuentran en un punto situado a 180° respecto a oriC. Cuando el mesosoma llega a ese término de replicación se escinde en dos mesosomas, cada uno de los cuales constituye el punto de anclaje de cada copia del cromosoma. Cuando se forme el septo transversal, cada mesosoma va a parar a cada célula hija, de modo que las copias de los cromosomas quedan segregadas. Parece ser que algunos plásmidos se segregan por este mismo mecanimo.

Así pues, el mesosoma parece actuar como un análogo primitivo del aparato mitótico.

6. Productos anómalos de la división celular.

Existen diversos tipos de mutantes cuyos fenotipos implican serias alteraciones del proceso de división celular y de replicación o segregación del material genético a las células hijas. Algunos de estos mutantes han encontrado útiles aplicaciones en estudios genéticos y moleculares.

Células sin cuerpos nucleares (maxicélulas). Determinados mutantes termosensibles son incapaces de iniciar la replicación a temperaturas elevadas, de modo que siguen creciendo en tamaño y se dividen mucho después de que se haya completado la última replicación cromosómica

(iniciada a una temperatura más baja, permisiva). El resultado de la división celular a la temperatura no permisiva es que se producen células de tamaño normal, pero sin cromosomas, aunque poseen los demás componentes celulares, incluyendo copias de plásmidos.

Por estos mutantes se puede deducir que no existe una relación directa entre la septación (la fase D de división celular) y la replicación cromosómica anterior (fase C).

Minicélulas. Se producen en ciertos mutantes que forman septos anómalos acéntricos (asimétricos, cerca de un extremo y no en el centro). En las minicélulas tampoco se segrega cromosomas, pero pueden “heredar” copias de plásmidos.

De estos mutantes se deduce otro rasgo del ciclo celular: el lugar habitual donde se produce la septación está programado genéticamente, y esta programación se puede alterar por mutaciones.

Usos de maxicélulas y minicélulas en estudios moleculares y genéticos. Un empleo habitual de estas “células” anómalas en el laboratorio se deriva del hecho de que durante cierto tiempo pueden sintetizar proteínas codificadas por los únicos genes presentes: los del plásmido o plásmidos que alberguen. Por marcaje radiactivo y electroforesis en gel de proteínas, se detectan unas pocas bandas, correspondientes sólo a las proteínas de los pocos genes existentes con la ventaja de que no hay interferencia de los cientos de miles de proteínas de la célula normal.

7. Métodos para el estudio y medición del crecimiento a escala individual.

Por microscopía

Se basan en la observación microscópica de microcultivos a temperaturas constantes

Seguimiento de células individuales por microfotografía secuencial.

Por inmunoflourescencia: se observan en microscopio de fluorescencia la incorporación de materiales de pared celular o de membrana marcados con algún colorante fluorescente.

Por obtención de cultivos sincrónicos.

En el cultivo bacteriano habitual, las distintas células se encuentran en fases distintas del ciclo celular, es decir, no están sincronizados. Por lo tanto, del estudio de la población no es posible sacar conclusiones sobre eventos del ciclo

celular. Sin embargo, por una serie de procedimientos, es factible producir cultivos sicrónicos, en l que durante cierto tiempo todas las células están en la misma fase, de modo que tienen la misma edad, el mismo tamaño, y se dividen y replican el cromosoma al mismo tiempo. Entonces, el comportamiento de la población es una “imagen ampliada” del individual.

Los principales métodos de obtención de cultivos sincrónico se basan en seleccionar, a partir de un cultivo estándar no sincrónico, aquellas células que o bien son del mismo tamaño, o bien son de la misma edad. Las técnicas principales son:

Selección por tamaños: se suele recurrir a gradientes de densidad, sobre todo los formaos por mezclas de agua normal y agua deuterada (H2O/D2O)

Selección pro edades: el método más empleado es la selección pro filtración (técnica d Helmstetter-Cummings), aunque sólo se puede aplicar a ciertas cepas (E. coli funciona con la cepa B/r, pero no con la K12).

Procedimiento: se filtra un cultivo asincrónico que esté en fase exponencial a través de una membrana de nitrocelulosa: las células se adhieren al filtro.

Se invierte el filtro.

Se va pasando medio fresco (nuevo) precalentado. Cada célula unida al filtro se nutre y crece, y finalmente se divide: una de las células hijas queda unida al filtro y la otra pasa al eluato, que se recoge. En cada momento concreto de esta operación, las células hijas eluidas y recogidas corresponden a células “recién nacidas”. Las células eluidas en cada momento concreto (y por lo tanto, de la misma edad) sirven como “fundadoras” de un cultivo sincrónico.

Observar la cinética de un cultivo “sincrónico” expresada como número de individuos en función del tiempo:

Durante unas pocas generaciones el cultivo es más o menos sincrónico.

Las mesetas indican las fases en que el número de células no varía, porque todas están creciendo en tamaño ates de dividirse.

Las subidas bruscas (casi verticales) en el número de individuos nos indican que todas las células del cultivo se están dividiendo al mismo tiempo.

La sincronía se va perdiendo paulatinamente, de modo que al cabo de unas generaciones la gráfica se convierte en una recta con pendiente.

La explicación estriba en que el tiempo exacto de división, o más concretamente C y D no duran exactamente lo mismo en los distintos individuos. Estas pequeñas variaciones estadísticas se van acumulando, generando desfases cada vez mayores entre células, hasta que la sincronía se pierde irreversiblemente.

II. A escala poblacional:

1. Cultivo en sistemas cerrados.

En los sistemas cerrados (que pueden ser líquidos o sólidos), no existe continuo de nutrientes, ni drenaje de células ni de sustancias de desecho.

En estos sistemas la fase exponencial de crecimiento balanceado no restringido dura sólo unas cuantas generaciones, debido al agotamiento de nutrientes y/o a la acumulación de desechos.

En la naturaleza no es normal ver crecimientos balanceados indefinidos. Para hacer una idea de lo que es el crecimiento exponencial indefinido de una bacteria a través de los siguientes datos: si una sola bacteria (que pesa 10 -12g) pudiera crecer nada menos que 2.2x1031 g, equivalentea 4000 veces el peso de nuestro planeta.

A. Curva de crecimiento en un sistema cerrado en medio líquido.

El crecimiento en un sistema cerrado consta de varias fases, que pasamos a comentar:

Fase de latencia o retardo (fase “lag”):

Es el período de tiempo durante el que el inóculo se adapta a las condiciones

del medio fresco sobre el que se ha sembrado. Se trata de un período de ajuste metabólico.

Cuando se introducen microorganismo en una medio de cultivo fresco, normalmente no se produce un aumento inmediato del número de células o de masa y, por ello, este periodo se denomina fase de latencia. Aunque la división celular no se produce inmediatamente y no hay un crecimiento neto de masa, la célula está sintetizando nuevos componentes. Una fase de latencia previa al comienzo de la división celular puede ser necesaria por varias razones. Las células pueden ser viejas y poseer una cantidad reducida de ATP, cofactores esenciales y ribosomas; estas sustancias deben sintetizarse antes que se inicie el crecimiento. El medio puede ser diferente al anterior donde crecían los microorganismos. En este caso, necesitará nuevas enzimas para usar otros nutrientes. Quizás los microorganismos hayan sido alterados y necesiten un tiempo de recuperación. Cualquiera que sea el motivo, finalmente, las células se equipan de nuevo, replican su DNA, comienzan a incrementar su masa y por último, se dividen.

La duración de la fase de latencia varía considerablemente según la condición de los microorganismos y la naturaleza del medio. Esta fase puede ser bastante larga si el inóculo procede de un cultivo viejo o de uno que haya sido refrigerado. La inoculación de una cultivo en otro químicamente diferente provoca también una fase de latencia mayor. Por otra parte, cuando se transfiere un cultivo en fase de crecimiento exponencial vigoroso a un medio nuevo de la misma composición, la fase de latencia se acorta o no se produce.

Fase de transición de crecimiento acelerado: que conduce a la siguiente fase, aunque algunos autores la consideran dentro de la fase exponencial.

Fase de crecimiento exponencial (fase logarítmica).

Durante la fase exponencial o logarítmica, los microorganismos crecen o se dividen hasta el nivel máximo posible, en función a su potencial genético, el tipo de medio y las condiciones en que crecen. La velocidad de crecimiento es constante durante la fase exponencial; es decir, los microorganismos se dividen y se duplican en número de intervalos regulares.

Como cada célula se divide en un momento ligeramente diferente del resto, la curva de crecimiento aumenta suavemente, en lugar de realizar discretos saltos. Durante esta fase, la población es más uniforme, química y fisiológicamente, por ello, los cultivos en fase exponencial se utilizan normalmente en estudios bioquímicos y fisiológicos.

Durante la fase logarítmica se da un crecimiento balanceado no restringido durante unas pocas generaciones (normalmente menos de 10). El tiempo de generación (g) es característico para cada especie o cepa, en cada medio concreto. El valor de tiempo de generación (g) depende de:

- Composición del medio.

- Temperatura.

- pH.

- Osmolaridad (tonicidad), etc.

Los microorganismos heterótrofos suelen crecer más rápidamente en los medios complejos, ricos, que en los medios sintéticos, y dentro de estos últimos, mejor con glucosa que con otras fuentes de carbono.

Fase de aceleración negativa: de crecimiento desequilibrado, conduce a la siguiente fase. De igual modo que la fase de transición de crecimiento acelerado, algunos autores no la consideran como tal, sino dentro de la fase estacionaria.

Fase estacionaria:

Finalmente, el crecimiento de la población cesa y la curva de crecimiento se vuelve horizontal. Las bacterias llegan normalmente a esta fase estacionaria cuando el nivel de población es de aproximadamente 109 células por mL.

El tamaño final de la población depende, por supuesto, de la disponibilidad de los nutrientes y otros factores, así como del tipo de microorganismo que se cultive. En la fase estacionaria el número total de microorganismos viables permanece constante. Este hecho puede ser resultado del equilibrio entre división y muerte de la célula o, simplemente, que la población deje de dividirse, aunque siga activa metabólicamente.

Esta fase se caracteriza porque el coeficiente neto de crecimiento se hace nulo (µ = 0), o aún existe crecimiento. Lo que ocurre es que el crecimiento bruto se equilibra con las muertes celulares.

Las poblaciones microbianas entran en fase estacionaria por varias razones. Un factor obvio es la limitación de nutriente, si se reduce intensamente la concentración de un nutriente esencial la población crecerá lentamente. Los organismos aeróbicos están limitados a menudo por la disponibilidad de O2. El no es muy soluble y puede reducirse tan

rápidamente que sólo la superficie del cultivo tenga una concentración de O2 adecuada para el crecimiento. En este caso, las células situadas por debajo de la superficie del cultivo no podrán crece, salvo que el cultivo se agite o airee de otra manera. El crecimiento de una población puede también cesar debido a la acumulación de productos residuales tóxicos. Parece que este factor limita el crecimiento de muchos cultivos anaeróbicos (cultivos que crecen en ausencia de o2). Por ejemplo, los estreptococos pueden producir tanto ácido láctico y otros ácidos orgánicos a partir de la fermentación de azucares que acidifican su medio, inhibiendo el crecimiento.

Los cultivos de estreptococos pueden también entrar en fase estacionaria debido a la reducción del suministro de azúcar. En definitiva, un cultivo entra en fase estacionaria como consecuencia de varios factores que actúan conjuntamente.

En este período se agotan nutrientes especiales y se acumulan sustancias de desecho, incluso el pH del medio empieza a hacerse inadecuado para el crecimiento celular.

Si la bacteria crece en un medio complejo, la fase 4 de transición (de aceleración negativa) puede ser relativamente larga, debido a que va recurriendo a fuentes alternativas, puede recurrir a aminoácidos como fuentes de C una vez agotados los hidratos de carbono.

En la fase estacionaria aún existen reacciones metabólicas, pero el metabolismo general es diferente al de la fase logarítmica:

- Las células son más pequeñas, debido a que existe división celular después de que se haya detenido el incremento de masa.

- El citoplasma se condensa.

- En las bacterias Gram-negativas aumenta el volumen relativo del periplasma.

- El nucleoide se condensa, por sustitución de ciertas proteínas que se unen a ADN.

- La membrana citoplasmática se hace menos fluida.

- Suelen ser más resistentes a los cambios físicos (temperatura, estrés osmótico) y químicos.

- Existe un cambio en el patrón de expresión genética: se desconectan cientos de genes que habían estado expresándose durante la fase exponencial, mientras que se inactivan unos 50 – 100 genes que

antes estaban reprimidos (genes de fase estacionaria); estos genes se transcriben mediante la holoenzima de la ARN-polimerasa dotada de la subunidad σ38.

- Existe reciclado de ciertos materiales intracelulares.

- Baja el crecimiento en ARN.

Fase de muerte exponencial.

Cambios ambientales perjudiciales, como privación de nutrientes y acumulación de residuos tóxicos, originan la disminución de células viables, hecho que caracteriza la fase de muerte. La muerte de una población microbiana, al igual que su crecimiento durante la fase exponencial, es normalmente logarítmica (es decir, una cantidad constante de células que mueren a cada hora). Este modelo es válido aún cuando el número total de células permanece constante, simplemente porque las células no se lisen después de morir. A menudo, la única forma de decidir si una bacteria es viable consiste en incubarla en un medio fresco; si no crece ni se multiplica, se considera que está muerta. Se debe a agotamiento de reservas de energía.

Algunas veces las células aparecen grandes, hinchadas, distorsionadas (formas “fantasmas”, “ghost”).

La pendiente de esta parte de la curva depende de las especies (por ejemplo, en bacterias entéricas es suave, mientras que en Bacillus es más acentuada).

Aunque la mayor parte de una población microbiana normalmente muere en forma logarítmica, la velocidad de la mortalidad puede disminuir después de reducirse drásticamente la población. Esto se debe a la supervivencia prolongada de algunas células particularmente resistentes.

EXPRESIÓN MATEMÁTICA DEL CRECIMIENTO

Durante la fase exponencial, cada microorganismo se divide en intervalos constantes. Por ello, la población duplicará su número durante un periodo determinado de tiempo, denominado tiempo de generación o de duplicación.

Por ejemplo supongamos que se inocula un tubo de ensayo con una célula que se divide cada 20 minutos. La población será de 2 células cada 20 minutos, de 4 células a los 40 minutos y así sucesivamente.

Como la población se duplica en cada generación, el aumento de población será siempre de 2n donde n es el número de generaciones. El aumento de población resultante es exponencial o logarítmica.

Estas observaciones pueden expresarse en ecuaciones para calcular el tiempo de generación.

Supongamos que N0= número inicial de la población

Nt= número final de células en un tiempo t

n = número de generaciones en un tiempo t

A partir de los resultados de la siguiente tabla podemos inferir que:

Nt = N0 x 2n

Despejando n, número de generaciones, donde todos los logaritmos son de base decimal,

Log Nt = log N0 + n.log 2 y

n = log N t – log N 0 = log N t – log N 0

log 2 0.301

Ejemplo de crecimiento exponencial

Tiempo Número de

divisiones

2n Población

(No x 2n)

Log10 Nt

0 0 20 = 1 1 0.00020 1 21 = 2 2 0.30140 2 22 = 4 4 0.60260 3 23 = 8 8 0.90380 4 24 = 16 16 1.204

100 5 25 = 32 32 1.505120 6 26 = 64 64 1.806

El cultivo hipotético comienza con una célula con un tiempo de generación de 20 minutos.

La velocidad de crecimiento en un cultivo discontinuo puede expresarse por la constante de velocidad media de crecimiento (k). Equivale al número de generaciones por unidad de tiempo, expresado a menudo como generaciones por hora.

K= n/t = log N t – log N 0

0.301tA partir de las formulas anteriores se puede calcular el tiempo que tarda una población en duplicar su número (n=1), es decir, el tiempo medio de generación o tiempo medio de duplicación (g). Si la población se duplica, entonces,

Nt = 2N0

Se sustituye 2N0 en la ecuación de velocidad media de crecimiento y se despeja k.

K= log (2 N 0) – log N 0 = log2 + log N 0 – log N 0

0.301g 0.301g

K= 1/g

El tiempo medio de generación es la inversa de la constante de velocidad media de crecimiento.

g= 1/k

El tiempo medio de generación (g) puede determinarse directamente a partir de una gráfica semilogarítmica con los datos de crecimiento y la constante de velocidad de crecimiento, a partir del valor g. El tiempo de generación puede también calcularse directamente a partir de las ecuaciones anteriores. Por ejemplo, supongamos que una población bacteriana aumenta de 103 a 109 células en 10 horas.

K= log109 – log 103 = 9 – 3 = 2.0 generaciones/h (0.301)(10h) 3.01 h

g = 1 = 0.5h/gen. o 30 min/generación 2.0 gen/h

Los tiempos de generación cambian notablemente según la especie microbiana y las condiciones. Los valores varían desde menos de 10 minutos (0.17 horas) en unas pocas bacterias.

2.

Crecimiento diáxico.

Supongamos que inoculamos una bacteria en un medio líquido provisto de dos fuentes de carbono (glucosa y lactosa), de las cuales una (por ejemplo, la glucosa) es usada preferentemente.

Se darán dos fases de crecimiento exponencial separadas por una breve fase intermedia estacionaria. Esta modalidad de crecimiento con dos fases exponenciales s conoce con el nombre d crecimiento diáuxico.

Bases del crecimiento diáuxico:

La bacteria usa en primer lugar sólo la fuente preferencial de C (en este caso, la glucosa, que suele ser la fuente preferencial en muchos heterótrofos), sin usar la otra fuente.

Una vez que agota la primera fuente, se dispone a usar la segunda (por ejemplo la lactosa), pero tarda un tiempo hasta que sintetiza las enzimas catabólicas necesarias para degradar esa segunda fuente.

3. Crecimiento en sistemas cerrados en medio sólidos.

Un medio sólido es una solución nutritiva (como el líquido), pero incorporado a un gel, que le da consistencia. Los tipos de gelificantes usados para medios sólidos:

- Agar-agar (o simplemente agar): es el más comúnmente empleado.

- Gelatina (inconveniente de que se licúa a temperaturas bajas).

- Silicagel (o gel de sílice): tedioso de preparar. Uso casi exclusivo para quimioautótrofos.

Los medios sólidos se suelen inocular mediante asa de siembra o espátula, diseminando las bacterias sobre su superficie libre, en recipientes adecuados, como las placas de Petri.

Tas la inoculación a la temperatura y condiciones pertinentes, cada bacteria o agrupación de bacterias que ha quedado en un punto determinado del medio da origen, por crecimiento a una acumulación de células, visibles a simple vista, denominada colonia. L densidad de cada colonia es muy alta (del orden de 107 células para un colonia de unos5 mm). Esto se debe a que en el medio sólido, las bacterias no pueden dispersarse, y durante mucho tiempo este sólido permite un aporte continuo de nutrientes (por difusión desde el entorno de la colonia, hacia ella), y eliminación continua de productos de desecho (por difusión dese la colonia hacia afuera). Por lo tanto, se parece a un cultivo continuo, excepto que no hay drenaje de células.

Con vistas a la determinación taxonómica, se suele tomar nota de una serie de características de las colonias (características culturales):

- Tamaño (relativo).

- Forma general.

- Forma d los bordes de la colonia.

- Aspecto de la superficie y elevación sobre el sustrato.

- Color.

- Consistencia, etc.

4. Cultivo continuo.

Se basa en el cultivo de microorganismos en un sistema abierto, en el que se mantiene las condiciones ambientales constantes a través de un suministro continuo de nutrientes y de la retirada de los residuos. En este tipo de cultivo se puede mantener una población microbiana en fase de crecimiento exponencial, a una concentración constante de biomasa durante un periodo largo de tiempo.

Es un cultivo balanceado mantenido por tiempo indefinido por un sistema de flujo que se compone de:

- Una cámara de cultivo de volumen constante, a la que llega un suministro de nutrientes. De la que se eliminan o separan los productos tóxicos de desecho (por un dispositivo de rebosadero).

Una vez que el sistema alcanza el equilibrio, el número de células y la concentración de nutrientes en la cámara permanecen constantes, y entonces se dice que el sistema está en estado estacionario, con las células creciendo exponencialmente.

Mayormente se utilizan dos clases de sistemas de cultivo continuo: 1) quimiostato y 2) turbidostato.

Quimiostato y Turbobidostato.

Un quimiostato se construye de forma que se alimenta un recipiente de cultivo con un medio estéril a la misma velocidad con que se gasta el medio que contiene a los microorganismos. El medio de cultivo de un quimiostato contiene un nutriente esencial en cantidades limitadas. Debido a la presencia del nutriente limitante, la velocidad del crecimiento se determina por la velocidad a la que se incorpora más cantidad de medio en la cámara de cultivo y la densidad final celular depende de las concentraciones del nutriente limitante. La velocidad de recambio del nutriente se expresa como velocidad de dilución (D), velocidad a la que el medio fluye en el recipiente del cultivo, respecto del volumen del mismo, donde f es la velocidad de flujo (mL/h) y V es el volumen del recipiente (mL).

D = f/V

Por ejemplo, si f es 30 mL/h y V, 100 mL, la velocidad de dilución será de 0.30 h-1.

Tanto el nivel de población microbiana como el tiempo de generación están relacionados con la velocidad de dilución. La densidad de permanece inalterada a lo largo de un amplio rango de velocidades de dilución. El tiempo de generación disminuye (es decir, la velocidad de crecimiento aumenta), al aumentar la velocidad de dilución. El nutriente limitante quedará casi completamente agotado en estas condiciones de equilibrio. Si la velocidad de dilución aumenta con demasiada rapidez. Los microorganismos pueden incluso desaparecer del cultivo antes de que se multipliquen la eliminarse por el rebosadero, porque la velocidad de dilución es superior a la máxima de crecimiento. La concentración de nutriente limitante es mayor a velocidades de dilución elevadas, porque en esas condiciones habrá pocos microorganismos presentes para utilizarlo.

A velocidad de dilución muy baja, un aumento D causa un aumento tanto de la densidad celular como la velocidad de crecimiento. Esto se debe al efecto de la concentración del nutriente sobre la velocidad de crecimiento, a veces denominada relación de Monod. A velocidades de dilución bajas, solo hay disponible una cantidad limitada de nutriente. Gran parte de la energía disponible debe utilizarse para el mantenimiento celular, no para el crecimiento ni la multiplicación. A media que aumenta la velocidad de dilución, se eleva la cantidad de nutrientes y la densidad celular resultantes, porque la energía está disponible tanto para el mantenimiento como el crecimiento. La velocidad de crecimiento aumenta cuando la energía total disponible supera la energía de mantenimiento.

El segundo sistema de cultivo continuo, el turbobidostato, tiene una fotocélula que mide la absorvancia o turbidez de un cultivo en el recipiente de un cultivo. La velocidad de flujo del medio a través del recipiente de regula automáticamente para mantener una turbidez o densidad

celular predeterminada. El turbidostato se deferencia del quimiostato por varias razones. La velocidad de dilución en un turbidostato es variable, en lugar de permanecer constante y el medio de cultivo no contiene un factor limitante. Un turbidostato funciona mejor a velocidades de dilución altas; un quimiostato es más estable y eficaz a velocidades de dilución bajas.

Los sistemas de cultivo continuo son muy útiles porque ofrecen un aporte constante de células en fase exponencial, que crecen a una velocidad conocida. Estos sistemas permiten el estudio del crecimiento microbiano con niveles muy bajos de nutrientes, concentraciones próximas a las existentes en los medios naturales.

5. Determinación del crecimiento de poblaciones bacterianas.

El crecimiento de una población o cultivo bacterianos se puede expresar en función de:

Aumento de masa del cultivo.

Aumento del número de células.

Ambos tipos de expresiones son equivalentes entre sí en cultivos que estén en crecimiento balanceado (en el que todos los componentes aumentan una misma proporción por unidad de tiempo).

Medida de masa bacteriana.

El aumento de la masa celular total, así como el del número de células, acompaña al crecimiento de una población. Por ello, las técnicas empleadas para medir los cambios de masa pueden utilizarse para medir el crecimiento. Existen los siguientes métodos:

1. Métodos directos:

En estos métodos se requieren preparaciones limpias sin partículas extrañas.

Determinación del peso húmedo.

- Se tara un tubo de centrífuga.

- Se centrifuga el cultivo y se elimina el sobrenadante.

- Se determina el peso del sedimento.

Inconvenientes: grandes errores, debido al líquido intercelular retenido, cuya cuantía depende a su vez de la forma y tipo de agrupaciones de la cepa, intensidad del empaquetamiento, etc.

Determinación del peso seco.

Como el anterior, pero el sedimento se seca antes de ser pesado (105°C, toda una noche), hasta peso constante. Las medidas de peso seco suelen representar el 10-15% de los valores de peso húmedo.

Inconvenientes: método tedioso (requiere mucho tiempo) y con bastantes errores; es difícil pesar meno de 1 mg con exactitud en las balanzas habituales de laboratorio, 1 mg de peso seco equivale a unas 5x109 bacterias.

Determinación de un componente característico: peptidoglucano, ADN, ARN, proteínas, etc.

Se suele usar en baterías para las que otros métodos más fáciles dan errores debido a que forman grupos no dispersables, crecen en filamentos, etc. Se emplean en determinaciones de crecimiento en ambientes naturales.

2. Métodos indirectos.

Medida de consumo de nutrientes o de producción de algún metabolito por unidad de tiempo

Consumo de oxígeno (QO2) y consumo de carbónico (QCO2), determinados por el respirómetro de Warburg.

Métodos turbimétricos (ópticos).

La base de estos métodos consiste en la medición de la cantidad e luz dispersada o transmitida a través de un cultivo bacteriano. Recordemos que las suspensiones bacterianas dispersan la luz, al igual que cualquier partícula pequeña suspendida en agua. La dispersión de la luz es, dentro de ciertos límites, proporcional a l masa del cultivo.

Medición de luz transmitida

A. Escala de MacFarland. Se trata de una serie de patrones de turbidez previamente calibrados. Consiste en varios tubos de vidrio herméticamente cerrados que contienen: 1% de BaCl2

+cantidades crecientes de H2SO4 al 1%, por lo tanto, en cada tubo se origina un precipitado de BaSO4, origen de la turbidez. Para cada cepa bacteriana hay que establecer la equivalencia entre la turbidez de cada tubo y la masa o la concentración de bacterias (en cel/ml) que genera una turbidez similar.

Inconveniente: es un método poco preciso, que sólo se emplea cuando no hace falta exactitud. Ha sido desplazado por los métodos espectrofotométricos.

B. Espectrofotómetro. Este aparato es de uso habitual en cualquier laboratorio de Microbiología o Bioquímica. Mide la densidad óptica (D.O) es decir la absorbancia.

D.O = A = -log T/100

Donde: T = transmitancia

Por supuesto, hay que realizar una curva estándar para relacionar los valores de A con la masa bacteriana.

La cantidad de luz dispersa es proporcional a cociente entre el tamaño de la partícula y la longitud de onda incidente; la sensibilidad de la técnica aumenta pues a longitudes de onda corta. La proporcionalidad entre A y masa bacteriana sólo es válida para > 107 cel/ml.

C. Nefelómetro. Es un aparato similar al anterior, pero el dispositivo sensor está situado en ángulo recto respecto de la dirección de la luz incidente, y lo que se mide es pues, la luz dispersada directamente por la preparación. Posee mayor sensibilidad que el espectrofotómetro.

Medida del número de individuos.

La forma más obvia de determinar el número de células es por recuento directo. La utilización de una cámara de recuento es fácil, económica y relativamente rápida; ofrece también información acerca del tamaño y morfología de los microorganismos. Se presenta los siguientes métodos:

1. Métodos directos

Cámara de recuento de Petroff-Hauser:

Se cuentan bacterias en varios cuadrados centrales, normalmente, a un aumento de 400x a 500x. El número medio de bacterias en estos cuadrados sirve para calcular la concentración de células en la muestra original. Hay como 25 cuadrados en un área de 1mm2, el número de total de bacterias en 1mm2 de la cámara es la suma de las baterías presentes en los 25 cuadrados. La cámara tiene una profundad de 0.02 mm y por ello,

Bacterias/mm3 = (bacterias/cuadrado) (25 cuadrados) (50).

El número de bacterias por cm3 es 103 veces este valor. Por ejemplo, supongamos que el recuento medio por cuadrado es de 28 bacterias:

Bacterias/cm3 = (28 bacterias) (25 bacterias) (50) (103) = 3.5 x 107.

Esta técnica posee algunos inconvenientes. La población microbiana tiene que ser bastante grande para que el resultado tenga precisión, debido al pequeño volumen de la muestra. Es también difícil o imposible distinguir entre células vivas y muertas en las cámaras de recuento.

Las cámaras de recuento y los contadores electrónicos permiten contar todas la células, vivas o muertas. Existen también otras técnicas factibles de recuento, que son procedimientos específicos para contar células capaces de crecer y multiplicarse. En la mayoría de estos métodos de recuento, se siembre una muestra diluida de bacterias u otros microorganismos sobre una superficie de agar sólido. Cada microorganismo o grupo de microorganismos desarrolla una colonia clara. El original de microorganismos viables en la muestra puede calcularse a partir del número de colonias formadas y la dilución de la muestra. Por ejemplo: Si 1.0 mL de una dilución de 1 x 10-6 produce 150 colonias, la muestra original contendría alrededor de 1,5 x 108 células por mL. Normalmente, el recuento es más exacto si se utiliza un contador especial de colonias.

Recuento en preparaciones teñidas.

Se dispone de un porta con una excavación circular (de área At) con un volumen conocido (v).

Sobre esta excavación se extiende la muestra con asa de siembra o con micropipeta, y se fija y tiñe por algún colorante.

Se observa con un microscopio dotado de un juego de ocular y objetivo que delimitan un área de campo (Ac). Si en dicho campo se cuentan n bacterias, la concentración de bacterias por mililitro será:

n. At/Ac . 1/V

Recuento proporcional de Wright.

Se mezcla la suspensión bacteriana problema con una cantidad conocida de bolitas de látex o de hematíes.

La concentración bacteriana se deduce de la proporción de bacterias y partículas observadas en el mismo campo microscópico.

Este método se emplea más frecuentemente en Virología.

Contadores electrónicos de partículas (tipo Coulter).

Se hace pasar una suspensión bacteriana pro un tubo capilar, entre los dos polos de una corriente eléctrica.

Cada vez que por un orificio (30 µm de diámetro) pasa una partícula (bacteria) interrumpe la corriente, lo cual es recogido por un dispositivo de registro electrónico, que detecta el número y el tamaño de las partículas que van pasando. El tamaño detectado es función de la intensidad dl pulso de voltaje a paso de la partícula.

Recientemente se ha introducido la citometría de flujo activada por fluorescencia (FACS). Es una sofisticada modificación en la que partículas a contar se marcan previamente con un anticuerpo monocional u otro ligando específico hacia alguna molécula de superficie, unidos a su vez un fluorocromo, una molécula que emite fluorescencia al incidir sobre ella una haz de luz láser.

Contador de colonias Quebec.

El contador ilumina una placa de Petri uniformemente desde un lado, y se amplifica la imagen para mostrar más fácilmente las colonias pequeñas. Con este modelo sofisticado, se toca con una sonda eléctrica cada colonia para anotar el recuento.

Contador automático.

La cámara forma una imagen amplificada de la placa; todos los objetos del rango de tamaño deseado se cuentan

con este instrumento. El contador puede estar conectado a un ordenador independiente.

Las técnicas de siembra en placa con sencillas, sensibles y se utilizan ampliamente para contar bacterias en muestras como alimentos, agua y suelo. Sin embargo, existen varios problemas que pueden provocar recuentos inexactos. Se pueden obtener recuentos si no se separan las agrupaciones de células y no se dispersan bien los microorganismos. Como no es posible estar totalmente seguro de que la colonia proceda de una célula individual, los resultados pueden ser expresados en unidades formadoras de colonias (CFU, colony forming units), en lugar de “número de microorganismos”. Las muestras deben producir entre 25 y 250 colonias para obtener resultados significativos. Por supuesto, el recuento será también bajo si el medio con agar empleado no puede mantener el crecimiento de todos los microorganismos viables presentes. El agar caliente que se utiliza en la siembra en profundidad puede dañar o matar células sensibles, por ello, la siembra en placa por extensión ofrece a veces recuentos superiores que con la técnica de siembra en profundidad.

El número de microorganismos se determina también con frecuencia a partir de colonias que crecen sobre filtros especialmente pequeños para retener bacterias. En esta técnica, se pasa una muestra a través de un filtro de membrana especial. Luego, el filtro se coloca sobre un medio con agar y se incuba hasta que cada célula forme una colonia separada. Un recuento de colonias permite obtener el número de microorganismos presentes en la muestra filtrada y pueden emplearse medios especiales para seleccionar microorganismos específicos.

Sistema de filtro de membrana Millipore.

Primero, se filtra la muestra a través de un filtro de membrana policarbonatado que se ha teñido de negro para crear un fondo oscuro que permita observar objetos fluorescentes. Luego, se tiñen las bacterias con un colorante fluorescentes, como naranja de acridina, y se observa con el microscopio. Los microorganismos teñidos con naranja de acridina brillar con un color naranja (células muertas) o verdes (vivas) y pueden contarse fácilmente con un microscopio de epifluorescencia. Normalmente los

recuentos obtenidos mediante este método son muchos más elevados que con las técnicas del cultivo. Actualmente se dispone de equipos comerciales que emplean otros reactivos fluorescentes para teñir diferencialmente células vivas y muertas. Esto permite contar directamente el número de microorganismos vivos y muertes en una muestra.

Rendimiento del crecimiento y efectos de un nutriente limitante.

Cuando el crecimiento microbiano está limitado por una concentración baja de un nutriente esencial, el crecimiento neto final o rendimiento celular aumenta con la cantidad inicial del nutriente limitante. Ésta es la base de los bioanálisis para cuantificar vitaminas y otros factores de crecimiento. La velocidad de crecimiento aumenta también con la concentración del nutriente, pero de manera hiperbólica. La forma curva parce que refleja el grado de captación de un nutriente por las proteínas microbianas transportadas. A niveles de nutrientes suficientemente altos, los niveles de transporte se saturan y la velocidad de crecimiento no sigue aumentando con la concentración del nutriente.

La cantidad de masa microbiana producida a partir de un nutriente puede expresarse cuantitativamente como rendimiento del crecimiento. (Y, yield)

Y = masa de microorganismos formadaMasa de sustrato consumido

El valor Y se expresa a menudo en gramos de células formadas por gramos de sustrato utilizado, o como rendimiento molar del crecimiento (gramos de células por mol de nutrientes consumido). Se trata de un índice de eficacia de conversión de nutrientes en material celular. Microorganismos aeróbicos cultivados en

un medio rico pueden asimilar entre un 20 y un 50% del carbono de los azucares que captan. En medios diluidos, algunas bacterias parecen que son capaces de aumentar su eficacia y asimilar hasta el 80% del azúcar adquirido.

Los rendimientos del crecimiento de bacterias fermentadoras se han estudiado extensamente. Cuando crecen en medios ricos en nutrientes, las bacterias pueden utilizar la fermentación de hidratos de carbono solo para generar energía y emplear otras sustancias. La eficacia de la utilización de ATP durante la fermentación queda reflejada en el valor ATP.

YATP = gramos de células formadasMol de ATP producido

Aunque los valores de YATP pueden variar a concentraciones muy bajas de azúcar, YATP para la mayoría de las bacterias es aproximadamente 10.5g/mol, a niveles elevados de azúcar. Por ello, parece que las bacterias utilizan generalmente energía en la biosíntesis con una eficacia bastante constante. Además el valor de YATP es mucho más pequeño que le máximo teórico de 332, que es el esperado si se emplease todo el ATP en la biosíntesis, que es el esperado si se emplea todo el ATP en la biosíntesis.

Gran parte del ATP se utiliza en el transporte, en el metabolismo mecánico y probablemente, de otras formas.

2. Métodos indirectos.

Son métodos que miden el número de bacterias viables, que no equivale al de totales.

Método del número más probable.

Su fundamento estriba en la distribución de Poisson: una distribución aleatoria de partículas en una serie de muestras iguales, en función del número medio de partículas presentes en una suspensión:

Px =

Donde:

x = número real de partículas en cada muestra

m = concentración (n° de partículas por volumen)

La técnica cosiste en sembrar alícuotas de la suspensión original problema sobre un medio líquido o sólido adecuado; tras el tiempo de incubación adecuado se anota la proporción obtenida de muestras donde no se haya dado crecimiento, P0 (x=0).

Entonces, según la distribución de Poisson: P0= e-m

Y por lo tanto es fácil calcular el valor de m: m = -ln P0

Recuento de viables en placa:

Es una de las técnicas de recuento más usadas en la rutina de laboratorio de Microbiología.

Perecuaciones:

- Para minimizar los errores estadísticos de muestreo, se recomienda sembrar 5 palcas de cada dilución.

- Hay que usar pipetas nuevas en cada dilución.

- Contar las placas donde existan entre 50 y 300 colonias.

Determinación de la proporción de células viables/células totales.

Si se está interesado en conocer esa proporción se recurre a una técnica de microcultivos en cubreobjetos: hay que seguir periódicamente la evolución del crecimiento de células individuales y determinar la proporción de aquellas células no viables (visibles al microscopio, pero incapaces de crecer).

Recuento sobre filtros de nitrocelulosa.

Se usa para suspensiones diluidas de bacterias. Se hace pasar un gran volumen de suspensión a través de una membrana de nitrocelulosa estéril, que retiene las bacterias. Posteriormente, el filtro se deposita sobre la superficie de un medio de cultivo sólido. Las colonias se forman sobre el filtro y se cuentan, deduciéndose la concentración original en función del volumen de suspensión que se hizo pasar por el filtro.

MEDIOS DE CULTIVO Y CONDICIONES DE CRECIMIENTO

Una gran cantidad d microorganismos sin requerimientos, como por ejemplo muchos pseudomonas del suelo y del agua, pero también Escherichia coli, se desarrollan perfectamente en un caldo de cultivo con una composición. Muchos organismos necesitan además de uno u otro de los oligoelementos, vitaminas o suplementos antes indicados. Si el medio de cultivo está compuesto por sustancias químicas definidas, se habla de un medio de cultivo sintético o definido. Se pretende conseguir definir para cada microorganismo los nutrientes mínimos para establecer un medio mínimo, que contenga únicamente los componentes necesarios para el crecimiento. Las especies más exigentes requieren un gran número de complementos. Para Leuconostoc mesenteroides se ha desarrollado un medio sintético que contiene más de 400 componentes.

Medios de cultivos complejos: Para muchos microroganismos exigentes no se conocen aùn suficientemente bien los requerimientos nutritivos. Se cultivan en disoluciones que contienen extracto de levadura, autolisado de levadura, peptona o extracto de carne. Par algunos grupos de organismos son también corrientes: mosto (extracto de malta), infusión de heno, jugo de ciruelas, jugo de zanahoria, leche de coco, y para hongos coprófilos incluso extracto de excremento de caballo. Debido a los costos, a los medios de cultivo se les añade en lugar de sustancias puras otras complejas, como lactosuero, melazas, agua de maíz o extracto de soja, que son productos de desecho baratos. Los medios de cultivo de este tipo se denominan complejos o no definidos.

Medios de cultivo sólidos: Para obtener medios de cultivo sólidos se añade a los caldos de cultivo sustancias solidificantes, que dan a los disoluciones acuosas una consistencia gelatinosa. La gelatina ya solo se utiliza en casos aislados, porque licua ya a 26-30οC y muchos microorganismos son capaces de licuar la gelatina. Un solidificante casi ideal es el descubierto en 1883 por HEESE, un colaborador de R. KOCH, al introducir el agar en la técnica bacteriológica. Es un polisacárido extraído de algas marinas, intensamente ramificado y entrelazado, de composición compleja. Se añade a las disoluciones acuosas en una concentración de 15-20 g/l. El agar funde a 100οC, pero se mantiene líquido al enfriarse hasta 15οC de temperatura. Es atacado tan solo por pocas bacterias. Cuando se necesitan medios sin componentes orgánicos se utiliza el gel de sílice como solidificante.

Concentración de iones hidrogeno: Los iones H+ y OH- son los iones más móviles de todos; por ello, pequeñas modificaciones en su concentración tienen grandes consecuencias. El establecimiento de un pH inicial óptimo y el mantenimiento del pH durante el crecimiento es por ello de gran importancia.

La mayoría de los organismos se desarrolla óptimamente cuando los iones H+ y OH- están aproximadamente en igual concentración (pH 7,0). Muchas bacterias prefieren valores de pH superiores, un medio ligeramente alcalino, p. ej. Los

nitrificantes, los rizobios, los actinomicetos, las bacterias degradadoras de la urea. Tan solo pocas son acidotolerantes (lactobacilos, Acetobacter, Sarcina ventriculi) los hongos prefieren valores de pH bajos, si se inocula con tierra medios complejos a distintos valores de pH, aparecerán preferentemente hongos a pH 5,0, y preferentemente bacterias a pH 8,0.

El mantenimiento de un determinado valor de pH durante el crecimiento tiene gran importancia sobre todo para aquellos microorganismos que a pesar de producir ácidos, no lo toleran (lactobacilos, Enteronacteráceas, muchos pseudomonas). La autodestrucción por los ácidos formados se combate utilizando sustratos no fermentables (para cultivos de larga duración) o tamponando el medio. Los fosfatos inorgánicos tienen ya un cierto efecto tampón, aunque leve a pH superior a 7,2. Si se da una excreción mas fuerte de ácidos, se recomienda la adición de carbonato cálcico, y si no se quieren componentes insolubles, de carbonato sódico. En el ultimo caso, hay que tener en cuenta que los iones bicarbonato están en equilibrio con el CO2 disuelto físicamente, y por tanto con el contenido en anhídrido carbónico de la atmosfera gaseosa (p. ej. El aire):

CO2(gas) CO2(disuelto) CO2 + H2O H2CO3

H+ + HCO3-

La relación entre el pH, concentración de bicarbonato y presión parcial de CO2

de la atmosfera gaseosa viene dada por la ecuación de HENDERSON- HASSELBACH; la concentración de acido carbónico es igual al producto de la presión parcial de acido carbónico y el coeficiente de solubilidad α:

pH 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

hongos bacterias

acidófilos neutrófilos alcalófilos

Thiobacillus thiooxidansSulfolobus acidocaldariusPyrodictium occultum

Acetobacter Lactobacillus

AlcaligenesPseudomonas

Rhizobium Nitrificantes Actinomicetos

Natronobacterium Ectothiorhodospira Especies de Bacillus ureolíticos

Márgenes de pH tolerados o preferenciales para hongos y bacterias

Por lo demás, muchas bacterias son poco sensibles a pequeñas oscilaciones del pH entre 6 y 9. No obstante, las modificaciones rápidas determinan brevemente una leve alteración del valor del pH intracelular, aunque al cabo de 30 minutos se reinstaura el valor anterior de pH interno.

Las lesiones que aparecen a valores desfavorables de pH no se deben a los iones H+ y OH-; los últimos elevan únicamente el porcentaje de ácidos o bases débiles no disociados, que en estado no cargado penetran mucho más fácilmente en las células que sus productos de disociación. Los fisiológicamente activos son siempre los ácidos no disociados. El succinato, bibásico, o el acido cítrico, tribásico, penetran tanto mas rápidamente en la célula cuanto mas bajo sea el valor de pH del medio.

Anhídrido carbónico: Un medio específico para el crecimiento de microorganismos autótrofos fijadores de CO2 contiene generalmente bicarbonato sódico, y se incuba bajo una atmósfera que contenga anhídrido carbónico en un recipiente cerrado. También puede hacerse pasar aire o aire enriquecido en CO2. Siempre hay que tener en cuenta la relación anteriormente indicada entre el pH, la concentración de bicarbonato y la presión parcial de CO2 en la atmósfera.

Pero también los microorganismos heterotróficos, los que asimilan fuentes de carbono orgánicas, necesitan anhídrido carbónico. Muchas bacterias que viven de forma parasita en la sangre, los tejidos o el canal intestinal están adaptadas a atmosferas con un contenido elevado en anhídrido carbónico. Para ello se incuba a dichas bacterias con una mezcla de aire o gas que contenga en volumen un 10% de anhídrido carbónico. Hay que considerar además, que la eliminación del anhídrido carbónico, por ejemplo por absorción con hidróxido potásico, impide el crecimiento de casi todas las bacterias.

Contenido hídrico y presión osmótica: Los microorganismos se diferencian ampliamente entre si con respecto al contenido en agua. Para poder comparar las disoluciones acuosas y las sustancias solidas desde el punto de vista del agua disponible, se recurre al parámetro actividad del agua (aw) o humedad relativa. Este parámetro hace referencia a la fase de vapor de agua que se encuentra en equilibrio con un material sòlido o una disolución. Indican el cociente entre la concentración de agua en la fase gaseosa en el espacio aéreo por encima del material, y la concentración de agua en el espacio aéreo por encima de agua pura a una temperatura determinada.

Los microorganismos pueden crecer a actividades hídricas entre 0,998 hasta 0,6. La menos exigente es la levadura Saccharomyces rouxii, que tolera altas presiones osmóticas; crece a aw= 0,6. Aspergillus glaucus y otros mohos crecen

a aw = 0,8. La mayoría de las bacterias necesitan actividades hídricas de más de 0,98. La única excepción la constituyen las bacterias halófilas, con un aw = 0,75.

Temperatura: Los microorganismos presentan distintos comportamientos en cuanto a las temperaturas de incubación que requieren. La mayoría de las bacterias del suelo o del agua son mesófilas; tienen su tasa máxima de crecimiento entre los 20οC y los 42οC. Los microorganismos termotolerantes son los que todavía pueden crecer a 50οC (Methylococcus capsulatus). Las bacterias termófilas crecen a temperaturas superiores a los 40οC con una tasa máxima y tienen el límite superior a los 70οC (Bacillus stearothermophilus, Thermoactinomyces vulgaris). Se denominan organismos termófilos extremos a aquellos que tienen su optimo de crecimiento por encima de los 65οC (Thermus aquaticus, Sulfolobus); algunos de ellos pueden crecer a temperaturas por encima de los 70οC (varias especies del genero Bacillus y Clostridium) o incluso por encima de los 80οC (Sulfolobus acidocaldarius) o incluso a 105οC (Pyrodictium occultum, una bacteria reductora de sulfato anaeróbica estricta). A las bacterias que crecen por encima de los 80οC y 100οC se las denomina organismos hipertermófilos. Al otro extremo de la escala de temperaturas se encuentran los psicrófilos (o criófilos), organismo entre los que predominan algunas bacterias marinas (bacterias luminiscentes) y las bacterias del hierro (Galliomella); tienen su tasa óptima de crecimiento por debajo de los 20οC.

Rango de temperaturas que permiten el crecimiento de diversas bacterias

οC 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110

psicrófilos termófilos hipertermófilos

mesófilos termófilos extremos

GallionellaLeptothrixBacillusFlavobacterium islandicum

Escherichia coliAlcaligenesPseudomonasStaphylococcus

Bacillus stearothermophilusThermoactinomyces vulgarisThermus aquaticus

ThermococcusThermotogaSulfolobusThermoproteusDesulfurolobusAcidianus

Pyrodictium occultumPyrodictium brockiiMethanophyrusPyrobaculum

Aireación: El oxigeno es el aceptor de electrones imprescindibles para todos los microorganismos aeróbicos estrictos. Para la mayoría de las bacterias que crecen sobre placas de agar o en medios líquidos poco profundos es suficiente el oxigeno del aire. No obstante, incluso en el interior y por debajo de una colonia bacteriana puede bajar hasta cero la presión parcial de oxigeno. En la figura explica esta situación y aclara el hecho conocido desde antiguo de que, por ejemplo, la bacteria Escherichia coli, anaeróbica facultativa, cuando crece sobre un sustrato fermentable como la glucosa, incluso en presencia de aire pasa de respirar a fermentar, produce entonces ácidos orgánicos, y se suicida.

En los cultivos líquidos de mayor

profundidad las bacterias aeróbicas solo crecen en la superficie; por debajo las condiciones se van haciendo cada vez más anaeróbicas. Para permitir el crecimiento de microorganismos aeróbicos también en las capas profundas de un cultivo líquido es necesaria la aireación. Los microorganismos solo pueden utilizar el oxigeno disuelto. Mientras que las sales minerales y los nutrientes orgánicos pueden estar en los medios de cultivo a concentraciones que permitan el crecimiento bacteriano durante horas o días, la solubilidad del oxigeno es baja. Un litro de agua que esté en equilibrio con el aire a la presión

Distribución del oxigeno en el interior de una colonia de Escherichia coli, y por debajo de ella, tras crecimiento sobre agar complejo. Las presiones parciales se midieron al cabo de tres días se incuban a 30οC mediante un microelectrodo de O2. Los valores se dan en porcentajes de la presión parcial medida en el agar saturado de aire.

atmosférica a 20οC contiene tan solo 6,2 ml o 0,28 mmol de oxigeno. Esta cantidad es únicamente suficiente para oxidar 0,046 mmol o 8,3 mg de glucosa (aproximadamente la milésima parte de la glucosa que se encuentra en un medio de cultivo normal). Por tanto, el oxigeno no puede almacenarse en el medio liquido, sino que hay que ir proporcionándolo continuamente. Afortunadamente los microorganismos están adaptados a una concentración muy baja de oxigeno disuelto; no obstante, no puede sobrepasarse una cantidad mínima, la concentración critica de O2 sin perjudicar la respiración celular.

La velocidad con la que se disuelve el oxigeno se incrementa estableciendo grandes superficies entre las fases gaseosas y liquidas, y elevando la presión parcial de oxigeno en la fase gaseosa. La aireación de cultivos líquidos se realiza generalmente con el aire o mezclas de oxigeno, nitrógeno y anhídrido carbónico. Se intenta por distintos medios establecer una gran superficie de contacto entre las dos fases. 1. Cultivo en capas finas. 2. Movimiento del líquido por agitación (alternativa o circular). 3. Rotación de frascos planos a lo largo de su eje longitudinal. 4. Burbujeo de la columna liquida mediante aire a presión a través de difusores (placas porosas, frascos de KLUYVER). 5. Percolación. 6. Agitación mecánica. En los cultivos sumergidos de microorganismos aeróbicos se utiliza frecuentemente la combinación de la aireación forzada con difusores (placas porosas, tuberas) y agitación mecánica. El “fermentador sin difusor” y el “sistema Waldhof” emplean la turbulencia ocasionada por una fuerte agitación. La figura representa algunos frascos de cultivo en los que se procuró obtener a través de la forma una superficie máxima del líquido, y también algunos frascos para el cultivo sumergido. Hay que considerar que, incluso un fermentador bien aireado o en las aguas naturales, la distribución del oxigeno no es siempre homogénea. Ya los mismos grumos de bacterias establecen microambientes en los que reina una presión parcial de O2 reducida. Estos microambientes semianaeróbicos se forman en las aguas naturales por la materia en suspensión que contienen. Experimentalmente pueden simularse estas condiciones añadiendo partículas solidas (arcilla, celulosa, quitina) a una suspensión bacteriana; en este caso las bacterias crecen como un “crecimiento masivo” denso alrededor de la

superficie de las partículas y sufren igualmente una deficiencia de O2. Para la demostración de este efecto resultan idóneas las bacterias anaeróbicas facultativas, que en condiciones de deficiencia de oxigeno pasan a fermentar (Escherichia coli) o a respirar nitratos (Pseudomonas denitrificans).

Aparato de percolación para hacer fluir una solución nutritiva y aire a través de un material de soporte (suelo, bolas de vidrio, etc.). Si por el tubo aspirador (As) se extrae continua y lentamente el aire, en la entrada de aire (Lu) éste penetra y conduce la solución nutritiva (NL) hacia la parte superior a través del tubo ascendente (Sr); la solución nutritiva y el aire

Cultivo anaeróbico: Para el cultivo de bacterias anaeróbicas estrictas es imprescindible la exclusión del oxigeno del aire. La técnica anaeróbica emplea medios de cultivo a los que se elimina el aire: hervidos, frascos cerrados sin que queden burbujas, atmosferas sin oxigeno en desecadores o frascos de WITT, sustancias para la absorción del oxigeno (pirogalol alcalino, ditionito, cloruro de cobre I), y otros medios auxiliares. La adición de sustancias reductoras (acido ascórbico, tioglicolato, cisteína –si es posible- o también sulfuro) a los caldos de cultivo permite reducir o eliminar los efectos tóxicos del oxigeno del aire.

Las bacterias extremamente sensibles al oxigeno pueden subcultivarse también en el aire cuando se procura, mediante una corriente continua de nitrógeno libre de oxigeno en el frasco de cultivo, que el medio no entre en contacto con el aire (técnica de HUNGATE). Alternativamente, puede trabajarse en cabinas de siembra llenadas con nitrógeno, argón o hidrogeno libres de oxigeno. Como indicador coloreado de las condiciones anaeróbicas se añade resazurina al medio de cultivo (en presencia de oxigeno es azul, anaeróbicamente incoloro, después de reoxidación rojo) o bien se añade a los

Recipientes para el cultivo superficial y sumergido de microorganismos aerobiosRecipientes para el cultivo superficial y sumergido de microorganismos aerobios

frascos de incubación anaeróbica un frasco con una disolución de glucosa y azul de metileno (anaeróbica: incoloro).

Radiación.

Muchas formas de radiación electromagnética son muy perjudiciales para los microorganismos. Estos es especialmente cierto en caso de la radiación ionizante, de longitud de onda muy corta o de energía alta, que puede provocar que los átomos pierdan electrones, es decir, que se ionicen. Dos formas de radiación ionizante son. 1) Los rayos x, que se producen artificialmente, y 2) los rayos gamma, que se emiten durante la desintegración de radioisótopos. Niveles bajos de radiación bajo de radiación ionizante producirán mutaciones y pueden causar indirectamente la muerte, mientras que niveles superiores son directamente letales. Aunque los microorganismos son más resistentes a la radiación ionizante que los organismos superiores, pueden ser destruidos con una dosis suficientemente grande. Algunas bacterias (Deinococcus radiodurans) y las endosporas bacterianas pueden sobrevivir a dosis elevadas de radiación ionizante.

La luz visible es enormemente benefiosa porque es la fuente de energía de la fotosíntesis. Sin embargo, incluso la luz visible, cuando está presenta a un cierta intensidad, puede dañar o destruir células microbianas. Normalmente se precisan O2 y pigmentos denominados fotosensibilizadores. Todos los microorganismos poseen pigmentos como la clorofila, bacterioclorofila, citocromos y flavinas, que pueden absorber energía lumínica, excitarse o activarse, y actuar como fotosensibilizadores. El fotosensibilizador excitado (F) transfiere su energía al O2 generando un O2 en estado de singlete (1O2).

El oxígeno en estado de singlete es muy reactivo y un agente con gran poder oxidante, que destruye rápidamente una célula. Es probablemente el agente principal empleado por los fagocitos para destruir las bacterias fagocitadas.

RANGOS DE TEMPERATURA PARA EL CRECIMIENTO MICROBIANO

MICROORGANISMO TEMPERATURAS CARDINALES

MÍNIMA ÓPTIMA MÁXIMA

BACTERIAS NO FOTOSINTÉTICAS

Bacillus psychrophilusMicrococcus cryophilusPseudomonas fluorescensStraphylococcus aureusEnterococcus faecalisEscherichia coliNeissseria gonorrhoeaeThermoplasma acidophilumBacillus stearothermophilusThermus aquaticusSulfolobus acidocaldariusPyrococcus abyssiPyrodictium occultumPyrolobus fumarii

BACTERIAS FOTOSINTÉTICAS

Rhodospirillum rubrumNostoc muscorumAnabaena variabilisAnacystis nidulansOscillatoria tenuisSynechococcus lividusSynechococcus eximius

-10-44

6.50

103045304060678290

SDSDSDSDSDSD70

23-2410

25-3030-37

3737

35-3659

60-6570-72

8096

105106

30-3532.53541SDSD79

28-3024404644453862757985

102110113

SDSDSDSD

45-477484

EFECTOS DEL PH EN EL CRECIMIENTO MICROBIANO

MICROORGANISMO LÍMITE INFERIOR PH ÓPTIMO LÍMITE SUPERIOR

BACTERIAS

Picrophilus oschimaeThiobacillus thiooxidansSulfolobus acidocaldariusLactobacillus acidophilusStaphylococcus aureusProteus vulgarisEscherichia coliClostridium sporogenesPseudomonas aeruginosaChlorobium limicolaEspecies de NitrosomonasBacillus pasteuriiNostoc muscorumAnabaena variabilisMicrocystis aeruginosaBacillus alcalophilus

= 00.51.0

4.0-4.64.24.44.4

5.5-5.85.66.0

7.0-7.68.5SDSDSD8.5

0.72.0-3-5

2.55.8-6-67.0-7.56.0-7.06.0-7.06.0-7.66.6-7.0

6.88.0-8.8

SD6.9-7.76.9-9

1010.6

SD6.04.06.89.38.49.0

8.5-9.08.07.09.4SDSDSDSD

11.5

USOS Y APLICACIÓN EN LA INDUSTRIA

Propiedades de un microorganismo con valor de interés industrial

Un microorganismo que pueda que pueda usarse en la industria debe producir, por supuesto, la sustancia de interés, pero se trata de mucho más. El organismo debe ser capaz de crecer y sintetizar el producto en cultivo a gran escala. Además preferiblemente, el organismo debe producir esporas o alguna otra forma de célula reproductiva de modo que pueda ser fácilmente inoculada en grandes fermentadores. Otra característica importante de un organismo industrial es que debe crecer rápidamente y sintetice el producto deseado, en un periodo relativamente coro de tiempo. El microorganismo también debe ser capaz de crecer en un medio de cultivo líquido relativamente barato, que se obtenga en grandes cantidades.

Muchos procesos micro0biológicos industriales utilizan productos de desecho carbonados provenientes de otras industrias, para los medios de cultivo a gran escala. Por ejemplo, el licor de maceración del maíz (un producto de la industria del molino y maceración del maíz mojado humedecido que es rico en nitrógeno y factores de crecimiento), suero de leche (un líquido residual de la industria láctea que contiene lactosa y minerales), y otros materiales residuales de la industria con elevado contenido en carbono orgánico. Además, un microorganismo industrial no debe ser patógeno, especialmente para el hombre, o para animales o plantas. Debido al enorme tamaño de la población

bacteriana de un fermentador industrial y que es prácticamente imposible evitar la contaminación del ambiente fuera del fermentador, la presencia de un patógeno supondría un problema desastroso. Por último, un microorganismo debe ser susceptible a ser manipulado genéticamente. En microbiología industrial, a menudo se ha incrementado genéticamente el rendimiento, mediante mutación y selección. Por tanto, disponer de un microorganismo productor estable y fácilmente manipulable es una clara ventaja.

Ejemplos de productos industriales

Los productos microbianos con interés industrial son de varios tipos principales (Fig. 30.1). Estas son las células propiamente dichas, por ejemplo, las levaduras cultivadas para alimentos, panadería o cerveza y sustancias producidas por las células. Ejemplos de estas últimas son la glucosa isomerasa, agentes farmacológicamente activos como los antibióticos, esteroides y alcaloides, particularmente productos químicos y aditivos alimentarios tales como el popular aspartamo, edulcorante de alimentos y bebidas; y productos químicos comunes como el etanol. En la Figura 30.1 se resumen de algunos de los productos industriales importantes, muchos de los cuales se comentarán con más detalle posteriormente.

En el capítulo anterior explicamos el proceso de crecimiento microbiano en varias fases: de latencia, exponencial y estacionaria. Aquí describimos el crecimiento microbiano y la formación del producto en un contexto industrial y nos preguntamos:” ¿Cuándo se produce el metabolito industrialmente útil en el ciclo celular?”.

Metabolitos primarios y secundarios

Hay dos tipos básicos de metabolitos microbianos: primarios y secundarios. Un metabolito primario es el que se forma durante la fase exponencial de crecimiento, mientras que un metabolito secundario es el que se forma casi al final de la fase exponencial de crecimiento, con frecuencia muy cerca de o ya

en la fase estacionaria de crecimiento. La diferencia entre un metabolito primario y un metabolito secundario se ilustra en la figura (30.2).

Relación entre metabolismo primario y secundario

La mayoría de los metabolitos secundarios son moléculas orgánicas complejas que requieren un gran número de reacciones enzimáticas específicas para su síntesis. Por ejemplo, se sabe que al menos 72 reacciones enzimáticas distintas están implicadas en la síntesis del antibiótico tetraciclina, y unas 25 reacciones en la síntesis de la eritromicina; ninguna de ellas tiene lugar durante el metabolismo primario. No obstante las rutas metabólicas de estos metabolitos secundarios provienen del metabolismo primario, porque las moléculas precursoras para el metabolismo secundario se forman en las principales rutas

biosintéticas primarias. Esto se resume en la figura 30.3, que muestra la relación entre la principal ruta metabólica primaria para la síntesis de aminoácidos aromáticos con las rutas del metabolismo secundario para una serie de antibióticos. Como puede observarse, muchos metabolitos secundarios estructuralmente complejos se originan a partir de moléculas precursoras con una estructura muy similar.

Metabolitos primarios

Los metabolitos primarios son moléculas de bajo peso molecular que intervienen, bien como productos finales o intermediarios, en las distintas rutas anabólicas y catabólicas.

Productos de interés industrial:

Alcoholes: etanol Aminoácidos: ácido glutámico, lisina, ornitina Ácidos orgánicos: acético, cítrico, glutónico Vitaminas: cianocobalamina (B12), riboflavina (B2) Polioles: glicerol Nucleótidos: 5’guanílico, 5’ inosínico

Las características de los metabolitos primarios son las siguientes:

Son necesarios para el crecimiento del microorganismo que los produce. Se producen como productos únicos. Estos productos son producidos por todos los microorganismos (son

universales). La producción no puede perderse fácilmente por mutación espontánea.

Metabolitos secundarios

A diferencia de lo que hemos visto para la producción de etanol por levaduras, en algunos procesos biocatalíticos el producto deseado no se sintetiza durante la fase activa de crecimiento sino durante la fase estacionaria. Los metabolitos producidos durante la fase estacionaria se denominan metabolitos secundarios y son algunos de los metabolitos más comunes e importantes desde el punto de vista industrial.

Las características de los metabolitos secundarios son las siguientes:

Los metabolitos secundarios no son esenciales para el crecimiento y la reproducción.

La formación de metabolitos secundarios depende fundamentalmente de las condiciones de cultivo, sobre todo de la composición del medio.

A menudo los metabolitos secundarios se producen como un grupo de estructuras muy relacionadas. Por ejemplo, se han encontrado que una única sepa de una especie de Streptomyces produce alrededor de 30 antibióticos antraciclina diferentes pero relacionados.

Se puede incrementar enormemente la sobreproducción de los metabolitos secundarios, mientras que los metabolitos primarios, asociados al metabolismo primario, habitualmente no pueden sobreproducirse en la misma medida.

Relaciones entre trofofase – idiofase

En el metabolismo secundario las fases de crecimiento se denominan trofofase, fase de crecimiento logarítmico donde normalmente no se producen los metabolitos secundarios, e idiofase, fase estacionaria donde normalmente se producen los metabolitos secundarios. Aunque es una simplificación pensar sólo en dos fases, esta simplificación nos permite comprender mejor la fermentacción industrial de los metabolitos secundarios. Es decir, si nosotros queremos producir un metabolito secundario primero debemos asegurar las condiciones apropiadas durante la trofofase para un buen crecimiento y después, debemos alterar esas condiciones en el momento adecuado para asegurar una excelente producción del metabolito secundario.

Este retraso en la formación de metabolitos secundarios es uno de los principales mecanismos mediante el cual los microorganismos productores de antibióticos evitan el suicidio, puesto que al comienzo de la fase logarítmica de crecimiento son sensibles a su propio antibiótico, para posteriormente, durante la idiofase, volverse resistentes al antibiótico que están produciendo.

Los factores que ponen en marcha la producción de metabolitos secundarios al final de la trofofase no se conocen; únicamente se sabe que este mecanismo se dispara normalmente cuando algún nutriente del medio se ha agotado. En algunas ocasiones el nutriente responsable es una fuente de Carbono, en otras, sin embargo es el Nitrógeno o el Fósforo. La explicación puede ser que al faltar nutrientes se alteren los metabolitos primarios y se originen inductores de los enzimas encargados de la síntesis de los metabolitos secundarios. Otra explicación puede ser que al faltar la fuente de Carbono cesa la represión por catabolito, sintetizándose a partir de este momento los enzimas necesarios para la biosíntesis de estos metabolitos secundarios.

Cualquiera que sea el mecanismo general por el que se dispara el metabolismo secundario al final de la trofofase, es un hecho que en este punto hay unos cambios muy fuertes en la composición enzimática de las células, apareciendo los enzimas que están específicamente relacionados con la formación de metabolitos secundarios. Sin embargo, e independientemente de este aspecto general del metabolismo secundario, se ha puesto de manifiesto la existencia de sistemas de regulación que juegan un papel importante en la síntesis de determinados productos industriales.

Efecto de los precursores

Las manipulaciones, tanto del medio de cultivo como de las condiciones ambientales que se llevan a cabo durante el screening secundario de una forma sistemática, incluyen la adición de centenares de aditivos en los medios de cultivo que puedan actuar como posibles precursores del producto que estamos investigando. Ocasionalmente se encuentra un precursor que incrementa de forma notable la producción de este metabolito secundario. El precursor puede incluso dirigir la síntesis de un determinado producto de entre

varios que se producían anteriormente; es lo que se conoce como biosíntesis dirigida.

Como ejemplos de precursores están el ácido fenilacético en el caso de la producción de bencil penicilina; determinados aminoácidos específicos en la producción de actinomicinas y tirociclinas; ácidos benzoicos sustituidos en la formación de novobiocinas.

En muchas fermentaciones, sin embargo, los precursores no muestran ninguna actividad. Esto es debido a que su síntesis por el microorganismo no es el factor limitante de la producción del metabolito secundario. En estos casos, la adición de aditivos ha revelado efectos dramáticos, tanto estimuladores como inhibidores en la producción del metabolito secundario por parte de una molécula no precursora. Este efecto se debe normalmente a la interacción de estos compuestos con los mecanismos reguladores del microorganismo productor. Precisamente, estudiando estos efectos se puso de manifiesto que los mecanismos reguladores de los microorganismos ejercen un efecto notable en la producción de los metabolitos secundarios..

Principales productos de la microbiología industrial

Consideramos ahora la producción industrial de productos microbianos, comenzando con los antibióticos. La producción de antibióticos es una de las más potentes industrias a nivel mundial y donde se desarrollaron inicialmente muchos principios importantes de los cultivos microbianos a gran escala.

Antibióticos: aislamiento y caracterización

De los productos de origen microbiano que se fabrican comercialmente, probablemente los antibióticos son los más importantes. El desarrollo de los antibióticos como agentes para el tratamiento de las enfermedades infecciosas ha sido el que, sin ningún género de duda, ha tenido el mayor impacto en la práctica de la medicina, mucho más que cualquier otro descubrimiento. Los antibióticos son los metabolitos secundarios típicos.

Aquellos que se usan comercialmente son producidos inicialmente por hongos filamentosos y por bacteria del grupo de los actinomicetos. En la tabla 30.2 se recoge una lista de los antibióticos más importantes producidos por fermentación a gran escala.

Búsqueda de nuevos antibióticos

Aunque las compañías farmacéuticas actualmente realizan gran parte de la búsqueda y descubrimiento de nuevos medicamentos por modelización computarizada, la forma tradicional por la que se descubren nuevos antibióticos consiste en el rastreo (screening).

Con este tipo de aproximación se aísla de la naturaleza, en cultivo axénico (puro), un gran número de microorganismos productores de antibióticos (Figura 30.7a), y en estos aislamientos se ensaya la producción de antibióticos viendo si producen cualquier sustancia difusible que inhiba el crecimiento de ciertas bacterias usadas como control en el test. Dichas bacterias se seleccionan entre varios tipos bacterianos de modo que representen a, o estén relacionados con, patógenos bacterianos. El procedimiento clásico para ensayar la producción de antibióticos en los aislamientos microbianos nuevos es el método de siembra en estría en superficie (en placa), utilizado por primera vez por Fleming en sus estudios pioneros sobre la penicilina.

Aquellos aislamientos que sean candidatos en la producción de antibióticos se estudian posteriormente, a fin de saber si los antibióticos que producen son nuevos o no. La mayoría de los aislamientos que se obtienen producen antibióticos conocidos, por lo que el biólogo industrial ha de identificar rápidamente dichos microorganismos para no perder tiempo ni medios estudiándolos. Cuando se descubre un microorganismo que produce un nuevo antibiótico, éste se produce en cantidades suficientes para proceder al análisis de su estructura, y después determinar su toxicidad y actividad terapéutica en animales infectados. Por desgracia, la mayoría de los nuevos antibióticos fallan el test en animales de experimentación, y sólo unos pocos tienen eficacia terapéutica en medicina y se producen comercialmente. No obstante ya que el número de tipos de antibióticos diferentes producidos por especies del género Streptomyces se estima en unos 100 000, la investigación orientada al descubrimiento de nuevos antibióticos ocurre continuamente.

Producción industrial de penicilinas y tetraciclina

Una vez que el antibiótico se ha caracterizado estructuralmente, se ha probado su eficacia terapéutica y bajo grado de toxicidad ensayándolos en animales de experimentación y, por último, ha pasado las diferentes fases de los ensayos clínicos (triales)(esta secuencia de ensayos puede durar varios años según los protocolos actuales), está listo para producirse comercialmente y venderse. Para antibióticos como la penicilina y la tetraciclina, hace años que superaron estos obstáculos; en la actualidad se fabrican, literalmente, toneladas de estos

antibióticos para uso en medicina y veterinaria. Aquí nos centramos en la producción industrial de estos dos antibióticos, como ejemplo de la producción de antibióticos en general (metabolitos secundarios).

Antibióticos β-lactámicos: penicilinas y compuestos relacionados

Las penicilinas son una clase de antibióticos que se caracterizan por tener un anillo β-lactámico y son producidos por varios hongos de los géneros Penicillium y Aspergillis, y por algunos procariotas.

Entre las penicilinas con utilidad en clínica se conocen varias formas, y estos derivaos pueden proceder de las reacciones biocatalítica de síntesis y posterior modificación por el químico orgánico, para producir la penicilina con propiedades clínicas específicas.

La estructura básica de todas las penicilinas es el ácido 6-aminopenicilánico (6-APA).

El 6-APA lleva una cadena variable en la posición 6. Si la síntesis de la penicilina se realiza si la adición de precursores de la cadena lateral, se producen las penicilinas naturales (Fig. 30.9).

La fermentación también puede ser más específica, suplementando al medio de cultivo con los precursores de la cadena lateral, de modo que sólo se

produzca la penicilina deseada. Los productos que se forman en estas condiciones se denominan penicilinas biosintéticas.

Sin embargo, con el fin de producir las penicilinas más útiles, aquellas con actividad frente a bacterias Gram negativas, suelen utilizarse una fermentación combinada con un procedimiento químico, lo cual conduce a una producción de penicilinas semisintéticas. En este caso, una penicilina natural producida microbiológicamente es escindida, química o enzimáticamente para dar 6-APA, y posteriormente modificada químicamente por adición de una cadena lateral (Fig. 30.9). Las penicilinas semisintéticas tienen muchas ventajas dese el punto de vista clínico, en términos de su espectro de acción y del hecho de que muchas de ellas, por ejemplo la amplicina, pueden administrase por vía oral y, por tanto no requieren una inyección. Por estas razones, las penicilinas semisintéticas representan la mayoría de las penicilinas comercializadas en la actualidad.

Métodos de producción de antibióticos β-lactámicos

La penicilina G, se produce en fermentadores de 40 000 a 200 000 litros de capacidad. La producción de penicilina es un proceso aeróbico, por lo que se necesita una aireación muy eficiente. La penicilina es un metabolito secundario, durante la fase de crecimiento, se produce muy poca penicilina, pero una vez que la fuente de carbono se ha consumido así completamente, empieza la fase de producción de penicilina. Alimentando al fermentador con diversos componentes del medio de cultivo, la fase de producción de producción de penicilina se puede alargar por varios días.

Uno de los principales ingredientes en la mayoría de los medios de producción de penicilina es el licor de maceración de maíz. Esta sustancia constituye la fuente de nitrógeno y contiene otros factores de crecimiento. Generalmente la fuente de carbono es la lactosa. La penicilina se excreta al medio, y una vez que las células se han separado del medio por filtración, se baja el pH del medio, y se extrae el antibiótico con un disolvente orgánico.

Después de concentrarse en el solvente, el antibiótico se vuelve a extraer en un medio acuoso a pH alcalino, posteriormente se concentra y se cristaliza. Rápidamente puede obtenerse penicilina altamente purificada con este método.

Producción de tetraciclinas

La biosíntesis de una tetraciclina requiere un gran número de reacciones enzimáticas. En el caso de la clortetraciclina (30.11), pueden estar implicados hasta 72 productos intermediarios, la mayoría de los cuales sólo se conocen de forma general. Estudios realizados sobre la genética de Streptomyces aureofaciens, la bacteria productora de la tetraciclina, han mostrado que están

implicados más de 300 genes. Con tal elevado número de genes, la regulación de la biosíntesis de este antibiótico es muy compleja. No obstante, se conoce una serie de señales reguladoras y programas de producción que funcionan bien. Por ejemplo se sabe que la glucosa y fosfato reprimen la síntesis de clortetraciclina. La represión por fosfato es especialmente significativa, y por ello el medio de cultivo usado en la producción comercial contiene una baja concentración de fosfato.

En la figura 30.11 se muestra un esquema de producción para la clortetraciclina, como en la producción de penicilina, el licor de maceración del maíz se emplea en la producción a gran escala de la clortetraciclina, pero la fuente de carbono, en este caso, es la sacarosa (no la lactosa). Se evita la glucosa porque causa una represión por catabolito en la producción de antibiótico.

Aminoácidos y vitaminas

Las vitaminas y los aminoácidos son factores de crecimiento que frecuentemente se usan con fines farmacológicos o se añaden a los alimentos. Varias vitaminas importantes y aminoácidos se producen comercialmente por procesos biocatalíticos

Aminoácidos

Los aminoácidos tienen muchos usos en la industria alimentaria, como aditivos alimentarios, como aditivos en la alimentación, en medicina, y como precursores en la industria química (Tabla 30.3). El aminoácido más importante es el ácido glutámico, que se utiliza para aumentar el sabor (glutamato monosódico). Otros dos aminoácidos importantes son el ácido aspártico y la fenilalanina, que son los ingredientes en las bebidas bajas en calorías y otros productos sin azúcar. La lisina, un aminoácido esencial para el hombre y algunos animales de granja, se produce comercialmente a partir de la bacteria Brevibacterium flavum, para utilizarse como aditivo alimentario, aquí nos centraremos en este último.

Dado que los microorganismos utilizan los aminoácidos como unidades fundamentales para sintetizar proteínas, su síntesis sigue una regulación celular estricta. Sin embargo para producir industrialmente un aminoácido, es necesario evitar estos mecanismos reguladores a fin de obtener una cepa que sobreexpese dicho aminoácido y sea capaz de producirlo de forma económica. La producción de lisina por Brevibacterium flavum se controla bioquímicamente a nivel de la enzima aspartoquinasa, en la que el exceso de lisina retroinhibe la actividad de esta enzima (Fig. 30.13a).

Sin embargo la sobreproducción de la lisina puede obtenerse aislando mutantes de Brevibacterium flavum en los que la aspartoquinasa ya no esté

sujeta a reroinhibición. Esto se logra con el aislamiento de mutantes resistentes al análogo de la lisina S-aminoetilcisteína (AEC), que se une al sitio alostérico de la aspartoquinasa e inhibe la actividad de la enzima.

Los mutantes resistentes a la AEC, que se obtienen fácilmente por slección positiva, producen una forma modificada de la aspartokinasa con un sitio alostérico que ya no reconoce a la AEC o a la lisina, por lo que la retroinhibición por lisina está muy reducida. Dichos mutantes de Brevibacterium flavum pueden producir hasta 60g de lisina por litro en fermentadores industriales, una concentración lo suficientemente elevada como para que el progreso sea viable.

Vitaminas

Las vitaminas se usan como suplementos para ala alimentación humana y ciertos animales, y la producción en vitaminas sigue en importancia a la de los antibióticos sólo en términos de ventas totales de productos farmacéuticos. La mayoría de las vitaminas se obtienen comercialmente por síntesis química. Sin embargo, algunas son demasiado complicadas para sintetizarlas a bajo costo, pero pueden obtenerse por biocatálisis. La vitamina B12 y la riboflavina son las más importantes dentro de este tipo de vitaminas.

Para la producción industria de vitamina B12 se usan las cepas microbianas que se han seleccionado específicamente por su alto rendimiento en la

producción de esa vitamina. Especies bacterians del género Propionibacterium y seudomonas son las principales productoras comerciales.

El cobalto es un importante componente de la estructura de la vitamina B12 y el rendimiento en la producción de la vitamina se incrementa mucho mediante la adición de cobalto al medio de cultivo.

La riboflavinaes el compuesto parental de las flavinas, FAD y FMN, coenzimas que tienen importantes funciones en las enzimas implicadas en las reacciones de oxidación-reducción en casi todos los organismos.

La riboflavina es sintetizada por muchos microorganismos, como bacterias, levaduras y hongos.

Enzimas:

Cada organismo produce una gran variedad de enzimas, muchas de las cuales se sintetizan en pequeñas cantidades y están implicadas en procesos celulares. No obstante, algunas enzimas se producen en cantidades mucho mas grandes en algunos organismos y, en ves de quedarse en el interior de la célula, se excretan al medio de cultivo. Las enzimas extracelulares (exoenzimas) son capaces de dirigir polímeros insoluble como la celulosa, las proteínas y el almidón; posteriormente, los productos de de digestión son transportado al interior de la célula donde se utiliza como nutrientes para el crecimiento. Algunas de estas exoenzimas se utilizan en las industrias alimentarias, lácticas, farmacéuticas y textiles, y se producen en grandes cantidades por síntesis microbiana. Las enzimas son biocatalizadores especialmente útiles porque a menudo actúan en grupo funcionales químicos que son únicos, distinguen fácilmente entre grupos funcionales similares en una misma molécula y, en muchos casos, canalizan reacciones de forma estereoespecifica, produciendo solo uno de los dos posibles enantiómeros.

Proteasas, amilasas y jarabes ricos en fructosa:

Tanto los hongos como las bacterias producen enzimas. Las enzimas microbianas producidas en mayores cantidades desde el punto de vista industrial, son las proteasas, que se usan como aditivos en el detergente para lavar ropa. La mayoría de detergentes para lavar la ropa actúan contienen enzimas, principalmente proteasas, pero también amilasas, lipasas, reductasas y otras. Muchas de estas enzimas se aíslan en bacterias alcalófilas, sobre todo de especies de género Bacillus, como bacillus lichemiformis. Esta enzima que tiene un pH optimo entre 9 y 10, permanecen activas al pH alcalino de las soluciones de los detergentes.

Otras enzimas importantes fabricadas comercialmente son las amilasas y las glucoamilasas, que se emplean en la producción de glucosa partir del almidón.

La glucosa así producida puede entonces convertirse en fructuosa por acción de la enzima glucosa isomerasa, lo que da como resultado la producción final de un edulcorante rico en fructosa a partir del maíz, trigo o almidón de patata. En la industria alimentaria este proceso es muy importante y un gran negocio, sobre todo en la producción de bebidas no alcohólicas.

Extremo enzimas: enzimas de procariotas que viven en ambientes extremos

Algunas procariotas, llamados hipertermófilos, crecen óptimamente a temperaturas muy altas e incluso, en algunos casos, a temperaturas superiores a las de ebullición del agua. Los hipertermófilos crecen a estas temperaturas tan elevadas porque producen macromoléculas termoestables, por ejemplo: enzimas como las que se resumen en la Tabla 30.4 pero que funcionan a temperaturas muy altas. El término extremoenzimas se refiere a enzimas que funciona a temperaturas extremadamente altas (o enzimas que funcionan de forma óptima en cualquier ambiente extremo; por ejemplo, en el frio, con altas concentraciones de sal, o a pH muy ácidos o muy alcalinos (Fig. 30.15ª). Los organismos que producen extremoenzimas se denominan extremófilos para indicar que crecen en condiciones que no son viables para la mayoría de los microorganismos.

Debido a que muchos procesos industriales operan mejor a temperaturas elevadas, las extremoenzimas de los hipetermófilos están siendo utilizadas, cada vez más, como biocatalizadores en las aplicaciones industriales que se recogen en la Tabla 30.4 y también en muchas técnicas en la investigación que requieren enzimas. Además de la taq y la pfu polimerasas para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), se han aislado y caracterizado proteasas, amilasas, celulasas, pelulanasas (Fig. 30.15b) y xilanasas extremadamente termoestables de varios hipertermófilos. Dichos catalizadores termoresistentes y extremoenzimas crioactivas –activas en frío- (de psicrófilos), activas en presencia de altas concentraciones de sal (de halófilos), o activas a pH alto o bajo (de alcalófilos y acidófilos, respectivamente), sin ningún género de duda serán cada ve más utilizados en la industria, en situaciones en las que se requiera una actividad catalítica en condiciones extremas. Por lo tanto, la gran especificidad de las enzimas y su capacidad para distinguir entre isómeros quirales hacen que aquellas que funcionan en ambientes extremos, sean particularmente importantes para la industria química.

Vinagre

El vinagre es el producto resultante de la conversión del alcohol acético por la acción de las bacterias del ácido acético, que son miembros de los géneros Acetobacter y Gluconobacter. El vinagre puede producirse a partir de cualquier sustancia que contenga etanol, aunque el material de partida es el vino, la cerveza o el zumo alcohólico de manzana (la sidra). El vinagre puede también producirse a partir de una mezcla de alcohol puro en agua. En este caso recibe el nombre de vinagre destilado, en donde el término destilado se refiere más al alcohol del que se fabrica el producto que al vinagre en sí mismo. El vinagre se utiliza como ingrediente aromatizante para ensaladas y otros alimentos, así como para el encurtido de ciertas carnes y las hortalizas que, de este modo (si el proceso se ha llevado a cabo de forma adecuada) se pueden almacenar sin refrigeración durante años.

Las bacterias de ácido acético representan un grupo interesante de procariotas. Se trata de bacterias estrictamente aerobias que se diferencian de la mayor parte de otros microorganismos aerobios en el hecho de que algunas de ellas, como la especie Gluconbacter, no oxidan completamente sus donadores de electrones orgánicos hasta CO2 y agua. De esta manera, cuando disponen de alcohol etílico como donador de electrones, lo oxidan a través de quinonas sólo hasta ácido acético, que se acumula en el medio. Las bacterias del ácido acético son muy tolerantes a los ácidos, por lo que no se destruyen mediante la acidez que producen. En todo caso, existe una lata demanda de oxígeno durante el crecimiento, por lo que el problema principal en la producción del vinagre consiste en garantizar una aireación suficiente del medio.