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INSTITUTO TECNOLÓGICO DEL ALTIPLANO DE TLAXCALA

MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA

MTA. ROSA MARÍA FLORES MORENO MORENO

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RECOMENDACIONES GENERALES

1.-La hora de entrada tendrá 5 minutos de tolerancia, después de este tiempo, no se permitirá al acceso al laboratorio 2.-Al entrar al laboratorio, el alumno deberá ponerse la bata y abotonarla completamente, sólo podrá quitársela al salir de éste. 3.- Las mesas deberán estar siempre limpias y desocupadas, las mochilas deberán ser colocadas donde se le indique. 4.- No comer ni fumar en el laboratorio, no introducirse ningún objeto a la boca. 5.- Recogerse el pelo para efectuar el trabajo de laboratorio. 6.- Limpiar y desinfectar el área de trabajo antes y después de usarla. 7.- No pasear entre las mesas del laboratorio, el trabajo deberá efectuarse en su lugar y en su equipo de trabajo. 8.-Hablar sólo lo necesario con los compañeros. 9.- Días antes de iniciar la práctica lea cuidadosamente que es lo que se va a realizar, si no entiende pregunte al profesor. 10.- Si hay necesidad de llevar material biológico para la realización de la práctica, es necesario conseguirlo de lo contrario la práctica se suspenderá para todo el equipo. 11.- El asa utilizada para el cultivo de microorganismos deberá esterilizarse en la flama del mechero, antes y después de su uso. 12.-Informe al profesor de cualquier accidente que ocurra. 13.-En caso de derramar material que contenga microorganismos, cúbralo con fenol o benzal y deje actuar diez minutos y de aviso al profesor. 14.- Todo el material que se va a incubar o desechar, debe colocarse en el sitio indicado por el profesor. 15.-Etiquete todo el material que va a incubar con los siguientes datos: equipo, grupo, fecha, nombre del material e iniciales del nombre del alumno. 16.- Después de la incubación es necesario la esterilización del material para eliminar microorganismos que pudieran hacernos daño a nuestra salud. 17.- Lávese las manos con agua y jabón antes de salir del laboratorio. 18.- Es obligación de cada equipo entregar todo el material limpio.

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MONTAJE DE PREPARACIONES FRESCAS Y PERMANENTES

Nombre del alumno___________________________________________ ANTECEDENTES Para poder observar al microscopio células, tejidos animales o vegetales y microorganismos es necesario hacer preparaciones sobre portaobjetos. Hacer una preparación consiste por lo tanto en colocar y extender el tejido o la muestra sobre un portaobjetos, cubriéndolo después con un cubreobjetos. Las preparaciones pueden ser temporales, frescas y permanentes. Las primeras son aquellas que solo se van a utilizar durante la práctica, unos días; las frescas se usan solo durante la práctica y posteriormente se lavan. Y las permanentes son aquellas que se han sometido a un proceso largo de preparación, el que permite que se mantengan en buenas condiciones para su observación por periodos prolongados de tiempo. La preparación de estas muestras incluye etapas de fijación del material, deshidratación, inclusion en parafina, corte de la muestra en capas muy finas con un micrótomo, colocación de estas capas que contienen la muestra en un portaobjetos. por lo que deben hacerse con un material especial (bálsamo de Canadá) para que el cubre-objetos permanezca perfectamente adherido al porta-objetos, durante años. OBJETIVOS: • Aprender a montar preparaciones frescas y permanentes. MATERIAL Y EQUIPO:

• Microscopio compuesto • Mortero con pistilo • Navaja de bisturí • Pinzas de disección • Aguja de disección • Frasco gotero o piceta • Portaobjetos • Cubreobjetos • Solución fisiológica • Barniz de uñas. • Bálsamo de Canadá • Azul de metileno o lugol • Agua de charco • Moho de pan, de tortilla o de cualquier fruta • Tejidos meristemáticos

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• Raíz de plantas y nódulos de leguminosa PROCEDIMIENTO: • Para hacer preparaciones frescas, simplemente coloca un corte muy delgado de tejido meristemáticos, una gota de agua de charco o una muestra pequeña de moho (extendida con la aguja de disección) sobre el portaobjetos. • Si el material utilizado es moho o tejidos meristemáticos, coloca sobre tu muestra una gota de agua o solución fisiológica.

• Cubre tu muestra con el cubreobjetos dejándolo caer suavemente para que no forme burbujas. Observa la figura:

A) Células vegetales (Epidermis de cebolla) 1. Se corta la cebolla por la mitad y se separa una de las capas de la misma. 2. Marca con el bisturí o con las tijeras una cuadrícula de pequeño tamaño (1

cm de lado) en la parte interna o cóncava de la capa. 3. Separa el fragmento de epidermis con las pinzas y colócalo en el centro del

portaobjetos. 4. Coloca el portaobjeto en la placa de Petri, añade unas gotas de colorante

sobre la muestra y déjalo actuar durante cinco minutos. 5. Lava con cuidado el exceso de colorante y sécalo con un poco de papel de

filtro. 6. Añade una gota de agua a la muestra. 7. Coloca el cubre apoyándolo por un lado y dejándolo caer para que no

queden burbujas. 8. Observa la preparación al microscopio, utilizando varios objetivos, realiza

un dibujo detallado de las células e indica el aumento del mismo. B) Endobacterias 1. Lavar la raíces con agua de llave y enjuagar con agua destilada. 2. Colocar las raíces recién lavadas en el mortero, agregar agua destilada

aproximadamente 5 ml y machacadas hasta hacer un caldo de raíces dejar reposar durante 30 min.

3. Pasado el tiempo tomar una gota de la muestra, colocar sobre el portaobjetos y colocar el cubreobjetos apoyando por un lado y dejar caer suavemente para evitar burbujas.

• Esta preparación fresca; está lista para que hagas observaciones

microscópicas. Su duración es de aproximadamente una hora ya que al

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evaporarse el agua con el calor de la lámpara del microscopio, las células o los organismos morirán.

• Para hacer preparaciones temporales; coloca un corte o una muestra sobre el

portaobjetos y añade agua o colorante según se te indique; con un pincel de barniz de uñas cubre los cuatro lados del cubreobjetos, déjalo secar y tendrás una preparación temporal.

Esta preparación está lista para que hagas observaciones microscópicas. Su duración es de aproximadamente de un mes o mas dependiendo de la muestra. • Preparaciones permanentes; realiza los cortes muy finos con la ayuda de una

navaja de bisturí extienda muy bien sobre el portaobjetos, agrega una gota de colorante si se requiere; antes de fijarlos observar tras el microscopio compuesto con el cubre-objetos puesto, una vez que se observe bien volver a quitar el cubre-objetos y agregar una gota de bálsamo de Canadá tratando de cubrir la parte interna del cubre-objetos dejar secar durante unos min, con un pincel de barniz de uñas cubre los cuatro lados del cubreobjetos, déjalo secar y tendrás una preparación permanente.

RESULTADOS: Esquematiza el procedimiento que seguiste para obtener tus preparaciones y tus resultados. CUESTIONARIO: 1.- El hacer estudios biológicos con preparaciones frescas es muy importante, ¿explica por qué? ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ 2.- Investiga por qué debe ponerse una gota de agua o de solución fisiológica a la muestra. ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ 3.- ¿Cuál es el medio de montaje en una preparación fresca y cuál en una preparación permanente? ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________

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4.- ¿Qué tipo de bacterias pudiste observar en las muestras que se estudiaron ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ CONCLUSIONES:

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MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO COMPUESTO

Nombre del alumno___________________________________________ OBJETIVO El alumno reconocerá el microscopio compuesto, identificará cada una de sus partes y lo manejará correctamente observando la Presencia de microorganismos en muestras biológicas. INTRODUCCIÓN. El microscopio es el instrumento más frecuentemente utilizado y el más útil en un laboratorio de microbiología, proporciona la amplificación o agrandamiento que nos permite ver organismos y estructuras invisibles a simple vista. Los microscopios permiten una amplia gama de amplificaciones, desde cien veces a cientos miles de veces. Las dos categorías de microscopios disponibles son los microscopios ópticos y los microscopios electrónicos. Los microscopios ópticos utilizan un sistema de lentes ópticas y comprenden los microscopios de campo claro, campo oscuro, fluorescencia y contraste de fases. Los microscopios electrónicos emplean haces de electrones en lugar de ondas de luz para producir una imagen ampliada. Manejo y uso del microscopio óptico

Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y bajar la platina completamente. Si el microscopio se recogió correctamente en el uso anterior, ya debería estar en esas condiciones. Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas. 1. Comenzar la observación con el objetivo de 4x (ya está en posición) o colocar

el de 10 aumentos (10x) si la preparación es de bacterias. 2. Para realizar el enfoque: a. Acercar al máximo la lente del objetivo a la preparación, empleando el

tornillo macrométrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a través del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparación pudiéndose dañar alguno de ellos o ambos.

b. Mirando, ahora sí, a traves de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la preparación con el macrométrico y, cuando se observe algo nítida la muestra, girar el micrométrico hasta obtener un enfoque fino.

5.- Pasar al siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el micrométrico para lograr el enfoque fino. Si

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al cambiar de objetivo se perdió por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operación desde el paso 3. El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparación y por ello es fácil que ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la preparación si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con aceite de inmersión si se observa una preparación que ya se enfocó con el objetivo de inmersión. MATERIAL. Microscopio compuesto Porta y cubre objetos Sol. de yodo-lugol Palillo, Hiposo; Lanceta estéril etanol (para limpiar las la minas) metanol Colorante Giensa Gasas Sarro dental Baselina PROCEDIMIENTO TECNICAS DE MONTAJE HÚMEDO La gota pendiente o las preparaciones húmedas permiten examinar organismos vivos suspendidos en un fluido. Las preparaciones húmedas se hacen colocando una gota del fluido que contiene el organismo sobre una lámina de vidrio y cubriéndola con una fina pieza de vidrio (cubreobjetos): para reducir la tasa de evaporación y eliminar corrientes de aire, generalmente se rodea la gota con vaselina. Cuando se examinan las preparaciones húmedas por microscopía de campo claro, es importante ajustar la fuente de luz de forma adecuada. Es posible disminuir la intensidad de la luz mediante la utilización de filtros especiales. MONTAJE EN SOLUCION SALINA FISIOLÓGICA (NaCl 0.85%) O AGUA Utilizada para estudiar la movilidad de las bacterias A) 1.- En el centro de un portaobjetos coloca una gota de solución salina 2.- Con un hisopo toma muestra de sarro dental de un compañero que no se haya lavado los dientes y colócala en la solución salina mezclando cuidadosamente 3.- Examinar con objetivos de 40X y 60 X. 1 Tomar una lamina con la muestra ( extendido de sangre previamente realizado)

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2 una vez la muestra este seca, realizar la coloración de WRIGHT 3 observar en el objetivo de inmersión Frotis sanguíneo: 1. Lave muy bien tres portaobjetos. Si es necesario límpielos con etanol/eter

utilizando un trozo de gasa. 2. Ubique el sitio de toma de la muestra en la parte lateral del dedo medio o

anular de la mano izquierda donde es menos sensible que en la punta, como lo indica el esquema.

3. Limpie el sitio donde se tomara la muestra de sangre, utilizando una gasa empapada con etanol y luego se quelo con gasa.

4. Con una lanceta con un movimiento firme y rápido realizar una punción en un pulgar.

5. Limpie la primera gota de sangre con gasa. 6. Con la mano derecha tome un portaobjeto y sosténgalo por los bordes. Con

la mano izquierda presione el dedo y deje fluir una gota pequeña de sangre (2mm de diámetro). Coloque una gota de sangre sobre el portaobjeto en el centro de uno de los extremos de la la mina.

7. Coloque un segundo portaobjeto apoyado sobre el otro por delante de la gota de sangre en a ngulo de 45º, y se hace retroceder hasta que el borde coincida con la gota, que se extenderá por capilaridad por todo el borde. Antes de que la sangre se extienda por los extremos del porta, se hace deslizar por el porta hacia delante con movimiento firme y rápido, elevando la mano derecha antes de que el porta que se desliza llegue al final. Mientras mayor sea el a ngulo que forman las dos láminas, mayor será el espesor de la capa de ce lulas.Deje secar la muestra durante 5 minutos.

8. Fije con metanol (1 minuto). Deje secar nuevamente (10 minutos). Coloree con colorante Giensa (20 minutos).

B) 1.- Centrífuga aproximadamente 10 ml de orina a 2,500 rpm durante 5 minutos. 2.- Desecha el líquido sobrenadante y procede a mezclar el sedimento urinario 3.- Coloca una gota del sedimento mezclado en el centro de un portaobjetos limpio y seco 4.- Sobre el sedimento pon un cubreobjetos y observa con el objetivo de 40X y 60X MONTAJE EN SOLUCIÓN YODO LUGOL Utilizada para identificar en Protozoos con sus organelos citoplasmáticos 1.- En un portaobjetos limpio y seco, coloca una gota de solución de yodo lugol.

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2.- Con un palillo de madera toma una pequeña cantidad de muestra y deposítala en el portaobjetos mediante movimientos de rotación y extendiendo la muestra por toda la gota 3.-Coloca un cubreobjeto sobre la preparación y observa en el microscopio CUESTIONARIO: 1.- ¿Que es poder de resolución? _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ 2.- ¿Qué finalidad te proporciona el utilizar microscopio compuesto: ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 3.- ¿Cuál es la importancia que tiene el diafragma en el microscopio?. __________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 4.- ¿Qué importancia tiene el estudiar y observar los microorganismos en muestras biológicas? ______________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 5.- Dibuje y escribe el nombre de cada una de las partes del microscopio compuesto OBSERVACIONES Dibuja lo observado en los diferentes objetivos para cada muestra que preparaste durante el experimento. CONCLUSIONES ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

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ESTERILIZACIÓN POR CALOR HÚMEDO

Nombre del alumno___________________________________________ OBJETIVO: El alumno conocerá y aplicará el procedimiento de esterilización por calor húmedo, así como las ventajas del procedimiento. INTRODUCCIÓN

AGENTES FÍSICOS ANTIMICROBIANOS. A) CALOR HÚMEDO.- La temperatura elevada, combinada con una humedad elevada, es uno de los métodos más efectivos para matar microorganismos. El calor húmedo mata a los microorganismos coagulando sus proteínas. Es mucho más rápido y efectivo que el calor seco. El vapor a presión proporciona temperaturas por encima de las que se pueden obtener al hervir. Tiene la ventaja de un calentamiento rápido, así como penetración rápida y abundante humedad.. El aparato a esterilizar que utiliza vapor de agua a presión regulada se denomina autoclave. Consta de una cámara de doble pared que se llena de vapor saturado libre de aire y se mantiene a la temperatura indicada y a la presión establecida durante un periodo de tiempo determinado. Generalmente el autoclave funciona a una presión de 15 libras/ pulgada cuadrada a 121·C ( 249·F). El tiempo de funcionamiento para lograr la esterilidad depende de la naturaleza del material que se va a esterilizar, del tipo de envase y del volumen del material. Una temperatura de l00·C es la suficiente para matar a todas las formas bacterianas en 2 o 3 minutos, excepto a las esporas, para matar a estas se requiere una temperatura de 121·C durante 15 minutos y a una presión de 15 libras. Este método es adecuado para esterilizar aparatos que tienen hule, jeringas que contienen metal, para medios de cultivo que contienen un azúcar especial dextrosa. El autoclave se puede sustituir por la olla de presión. B) CALOR SECO.- En este tipo de esterilización existe una destrucción de los microorganismos oxidando sus constituyentes químicos, desnaturalizando las proteínas y los ácidos nucleicos de las células así como fragmentando las membranas celulares. Para materiales que deben permanecer secos como ciertos instrumentos de vidrio de laboratorio tales como: cajas de petri, pipetas, así como aceites, polvos ( por ser impermeables al vapor), los materiales que no se pueden

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esterilizar por calor seco son: Material textil (algodón, sedas, lino, etc.), Gomas y Materiales sintéticos. Todo material que se altere a la temperatura de trabajo se dispone de hornos eléctricos por los que circula aire caliente, en vista de que el calor es menos eficaz en materiales secos, se acostumbra a aplicar una temperatura de 160·C a 170·C durante una hora o más. Para materiales de vidrio de laboratorio es suficiente una exposición de dos horas de duración a 160·C ( 320 ·F) para que quede esterilizado. Otras formas útiles de calor seco incluyen incineración para objetos que deben ser destruidos y flameados por pasaje de agujas o pequeños instrumentos a través de la llama de un mechero bunsen. MATERIAL Agua de la llave Autoclave u olla de presión. Extran Mechero Material de cristalería limpio, seco y empacado Matraz Erlenmeyer 250 ml Tubos de ensaye con tapón de rosca Cajas Petri de vidrio Pipetas de 1 ml Pipeta graduada de 10 ml Probeta graduada 250 ml Probeta graduada 100 ml Asa de platino PROCEDIMIENTO b) ESTERILIZACIÓN POR CALOR HÚMEDO (vapor a presión) 1.- Lava el material que te proporcione tu profesor con mezclas adecuadas como Extran, mezcla Crómica con concentraciones adecuadas tomando en cuenta lo sucio del material, seca en estufa o en forma manual con papel absorbente y empácalo. Tenlo listo para su esterilización. 2.- Coloca el agua necesaria en la autoclave u olla de presión hasta la marca e introduce unas gradillas metálicas que servirán de base al material a esterilizar. Coloca el material a esterilizar dentro de la autoclave u olla de presión, evitando que el material toque las paredes.

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3.- Cierra la autoclave u olla de presión, cuidando de dejar abierta la válvula de salida de vapor que ayudará a expulsar el aire contenido dentro y que éste es desplazado por el vapor que se produce. si el aire no fue eliminado totalmente de la autoclave, el manómetro aumentará a 15 libras. Pero la temperatura no habrá alcanzado los 121˚C Por esto se debe medir el tiempo cuando la temperatura llegue a l21˚C 4.- Cierra la válvula cuando el vapor sea continuo. La temperatura de l05·C indica que está libre de aire. Vigila el termómetro. Cuando vaya en 120·C, mantenla durante 15 minutos para que se efectúe la esterilización (15 libras de presión). Transcurrido este tiempo se apaga. 5.-Deja enfriar hasta que el manómetro marque cero. Abre la válvula de salida de vapor, para expulsar el vapor restante. Abre el autoclave y retira el material 6.- Si el material no está en estado líquido la válvula se puede abrir rápido a la salida de vapor, pero si está en estado líquido la rápida pérdida de presión las hace hervir o bien saltar los tapones. Por lo tanto se espera unos minutos a que se enfríe perfectamente CUESTIONARIO. 1.- Cuál material se puede esterilizar por calor seco y cuál no. ¿Porqué? ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ 2.- Qué tipo de material se puede esterilizar por calor húmedo?_________________ ______________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 3.- A qué condiciones de temperatura y presión se destruyen todas las formas vegetativas?__________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ 4.- A qué condiciones de temperatura y presión se destruyen las esporas? ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________

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5.- Cuáles son las condiciones necesarias de tiempo y temperatura para esterilizar por calor seco? ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ 6.- Cuáles son las condiciones necesarias de tiempo y temperatura para esterilizar por calor húmedo? ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ 7.-Cómo actúa la esterilización por calor seco en los microorganismos? ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ 8.- Cómo actúa la esterilización por calor húmedo en los microorganismos? ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ 9.- Qué tipo de esterilización es más recomendable y por qué? ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________ OBSERVACIONES: Realiza esquemas y dibujos correspondientes a la esterilización por calor húmedo que realizaste en la práctica.

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PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO SÓLIDOS

Nombre del alumno___________________________________________ OBJETIVO: Adiestrar al alumno en la preparación de diferentes medios de cultivo. MATERIAL Frasco Schot 1 Baño maría Mecheros Fisher Placas de calentamiento Agitador Vaso de precipitado de 250 ml 1 Espátula Cajas de petri Tapones de algodón Autoclave u olla de presión Papel estraza Tubos de ensayo 16X150 Medios de cultivo INTRODUCCIÓN Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo.. Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuado, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante. La mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientes complejos similares en composición a los líquidos orgánicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una infusión de extractos de carne y Peptona a la que se añadirán otros ingredientes. El Agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios de cultivo. En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para

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incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentación de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se añaden para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes. Por su aspecto físico. Los medios de cultivo preparados pueden ser clasificados por su aspecto en: Líquidos, Semisólidos, Sólidos. Y por su uso en: I.- Medios de cultivos básicos II:_ Medios de cultivos especiales como: mejorados, selectivos, diferenciales, de transporte. PROCEDIMIENTO: 1- Primeramente se desinfecta el área de trabajo con fenol al 5% o alcohol y se enciende el mechero PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO SÓLIDOS 1.- Leer las instrucciones del fabricante para cada medio de cultivo y pesar la cantidad necesaria según el volumen requerido. 2.- Colocar el medio en un vaso de precipitado que contenga el agua destilada en el volumen requerido, agitar y calentar a ebullición para disolver el Agar. En el último paso se debe tener cuidado ya que el recipiente se calienta en exceso y el producto tiende a hervir y proyectarse, lo cual puede producir serias quemaduras. El Agar disuelto hace transparente al medio que originalmente estaba turbio. Puede utilizarse un baño maría para aumentar la solubilidad. 3.- Si se va a envasar en cajas de petri, es necesario conservar el medio en un frasco schot y esterilizarlo a 121·C durante 15 minutos. Al terminar, es conveniente mantener el mechero encendido para formar un área de esterilidad al momento del vaciado en las cajas de petri aproximadamente de 15 ml a 20 ml de medio de cultivo por caja procurando que no se forman burbujas. Tapar la caja inmediatamente 4.- Si se desea que el Agar quede en tubos, entonces se esterilizará el Agar directamente en ellos a 121·C durante 15 minutos tapados con algodón, gasa y papel estraza. Si desea que solidifiquen inclinados, colocarlos en una superficie lisa inclinándolos en un ángulo de 20 a 30 · sobre una varilla de vidrio. A) VACIADO EN CAJAS DE PETRI 3.- No destapar las cajas de petri, sino hasta el momento que vayan a ser utilizadas. Es conveniente colocarse un cubre bocas la persona que va a realizar el vaciado y evitar hablar en todo momento para no contaminar el medio de cultivo. 4.- Es conveniente mantener el mechero encendido y trabajar cerca del área estéril al momento del vaciado en las cajas de petri. Levantar la tapadera de la caja petri con la mano izquierda , sin soltarla y sin retirarla demasiado de la base de la misma caja mientras que con la mano derecha tomar el matraz que

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contiene el medio de cultivo y realizar el vaciado de aproximadamente 15 ml a 20 ml de Agar por caja procurando que no se forman burbujas, se procede a tapar la caja inmediatamente 5.- Si se forman burbujas, tomar el mechero, flamear el medio de cultivo sobre la superficie de la caja de petri y de manera rápida. Se procede a tapar la caja. 6.- Esperar a que el medio solidifique, Se rotulan los medios de cultivo, anotando la fecha y con iniciales el tipo de medio de cultivo. Si las placas no se van a utilizar el mismo día se sujetan con cinta y se colocan en el refrigerador de manera invertida para evitar que el vapor condensado caiga sobre el medio de cultivo y lo pueda contaminar. 7.- Cuando se vayan a utilizar los medios de cultivo preparados, será necesario secar las placas invertidas en estufa a 37 °C. Antes de realizar el sembrado de microorganismos. CUESTIONARIO 1.- ¿Qué es un medio de cultivo? ___________________________________________________________________________ 2.- Qué es un cultivo de microorganismo? ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 3.- Qué finalidad tiene utilizar medios de cultivo sólidos? ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 4.- Escribe el nombre de 5 medios de cultivo que pueden ser empleados en el laboratorio de microbiología. ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 5.- De dónde es obtenido el extracto Agar- Agar para la preparación de medios de cultivos?________________________________________________________ 6.- Por qué es necesario desinfectar la mesa entes de realizar el vaciado del medio de cultivo en las cajas de petri?______________________________________

___________________________________________________________________________ 7.-Por qué la base de muchos medios de cultivo es una infusión de extractos de carne y Peptona? ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ 8.- Escribe la composición química un medio de cultivo, menciona el nombre.

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____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ OBSERVACIONES. Dibuja todos los pasos realizados en la preparación de los medios de cultivo. CONCLUSIONES __________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

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TÉCNICAS DE SEMBRADO

Nombre del alumno___________________________________________ OBJETIVOS - Observar la gran variedad de microorganismos presentes en el medio

ambiente, determinando las diferentes morfologías de colonias que se obtienen.

- Los efectos de un desinfectante por medio del crecimiento de colonias de bacterias en un medio de cultivo en cajas de Petri.

INTRODUCCIÓN La población microbiana existente en nuestro entorno es grande y compleja. Cientos de especies microbianas habitan normalmente en distintas. Ellos flotan alrededor hasta que entran en contacto con una superficie que ofrezca comida y resguardo. Se encuentran más frecuentemente en la oscuridad, en objetos húmedos que a menudo entran en contacto con la comida, la suciedad o la vegetación. Un estudio adecuado de microorganismos que hay en estos hábitat requiere técnicas que permitan conocer y ordenar la compleja población mixta o cultivo mixto, separándole en sus distintas especies como cultivos puros. Un cultivo puro consta de una población de células derivadas todas ellas de una célula parental. Los microorganismos se cultivan en el laboratorio sobre materiales nutritivos denominados medios. Se dispone de una gran cantidad de medios y la clase que se debe de utilizar depende de muchos factores, uno de los cuales es la clase de microorganismos que se va a cultivar. El material que se inocula sobre el medio se denomina inóculo mediante alguna técnica (siembra por estría en placa o siembra en masa en placa). Durante la incubación a 37˚C, las células microbianas individuales se reproducen tan rápidamente que en un lapso de 18 a 24 horas producen masas visibles de células denominadas colonias. Una colonia es visible a simple vista. Cada colonia diferente es presumiblemente un cultivo puro de una sola clase de microorganismo. Si dos células microbianas procedentes del inóculo original quedan muy cerca una de otra sobre el medio de Agar, la masa de células observables no será un cultivo puro. La mayoría de los microbios en nuestro cuerpo y otras superficies son inofensivas, pero algunos son patógenos o causan enfermedad. Por esta razón, queremos controlar el número de microbios que nos rodea. La posibilidad de infectarnos aumenta con el número de microbios en los objetos circundantes. Pero ¿qué podemos hacer para reducir el número de microbios en las superficies que nos rodean? MATERIAL • cajas de Petri estériles preparadas con medio de cultivo PDA

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• Cinta pegante • Marcador permanente o lápiz de cera • Un desinfectante con 70% de solución de alcohol, 10% de una solución

blanqueadora, jabón líquido Extran o alkox. PROCEDIMIENTO A partir de una suspensión bacteriana o cultivo mixto: - Agotamiento, con asa de platino y en placa de AN. Tomar una muestra del cultivo mixto, con ayuda del asa de siembras previamente flameada. Debe flamearse la boca del tubo antes y después de tomar la muestra. La muestra se extiende con suavidad con el asa sobre la superficie del medio de agar nutritivo en placa Petri. Para ello la placa se destapa ligeramente en las proximidades del Mechero bunsen. Una vez finalizado se vuelve a tapara la placa y está se dispone en posición invertida para llevar a incubar. Este es el proceso general para la siembra de placas. - Estrías escocesas, con asa de platino y en placa de AN Para obtener colonias aisladas por este procedimiento, según se índice en el esquema, se realizan una serie de estrías sobre la superficie del medio, tras lo cual se cierra la placa y se flamea el asa. Con el asa estéril se realizan nuevas estrías arrastrando células de las estrías anteriores, y por tanto diluyendo la muestra. El proceso se repite varias veces, flameando el asa entre cada nuevo paso de estrías. Al final se puede realizar un pequeño agotamiento. La placa se lleva a incubar, invertida, como en el caso anterior. Ello permitirá obtener colonias aisladas. Incubar a 27º C Ver esquema:

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CUESTIONARIO 1.- Qué es un cultivo puro de microorganismos? ___________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 2.- Qué es un inóculo? ___________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 3.- Físicamente en un medio de cultivo de microorganismos cuando se dice que no forma un cultivo puro? __________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 4.- ¿Cómo podemos controlar la contaminación microbiana? ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ OBSERVACIONES: Dibuja todos los pasos empleados en el sembrado de las cajas de petri con Agar nutritivo.

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CONCLUSIONES_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

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CUENTA DE MICROORGANISMOS VIABLES POR DILUCIÓN EN PLACA

Nombre del alumno___________________________________________

INTRODUCCIÓN Existen diferentes técnicas para determinar el número de microorganismos en suelos o aguas, tanto directas como indirectas, Para la determinación de microorganismos heterótrofos totales e hidrocarbonoclastas aerobios, se seleccionó la cuenta microbiana por dilución en placa. Es una técnica indirecta de cuantificación; sin embargo, provee una medición de la viabilidad microbiana, permite determinar indirectamente el potencial de biodegradación en un suelo contaminado, es la más adecuada para medios con hidrocarburos como substrato, es rápida de efectuar y no requiere de mucho material (Lorch et al., 1995; Bossert y Kosson, 1997). MÉTODO El conteo de poblaciones microbianas por dilución en placa es un método simple y rápido para la cuenta viable de células microbianas en el suelo. Sin embargo, la cuenta obtenida es generalmente 10 a 100 veces menos que aquella determinada por cuenta directa por microscopia. Las razones para esta discrepancia incluyen la exclusión de la cuenta no viable directamente en el suelo y la inhabilidad para proveer apropiados nutrimentos en el medio de crecimiento, para obtener la cuenta total en placa. FUNDAMENTO El método de dilución en placa se fundamenta en que cualquier célula viable inoculada en un medio de cultivo se multiplica y produce datos de fácil identificación, como la formación de colonias en placas de agar. Este método consiste en la preparación de una serie de diluciones de una muestra de suelo en un diluyente apropiado, esparciendo una alícuota de una dilución sobre la superficie de un medio de cultivo sólido e incubando la placa de agar bajo condiciones ambientales apropiadas. La dilución debe permitir generar colonias separadas, cada colonia puede proceder de una sola célula o de una agrupación (unidad viable), la cual se contará como una bacteria. Bajo este fundamento, estas placas pueden ser usadas no sólo para el conteo de poblaciones microbianas, sino también para el aislamiento de organismos. Un medio selectivo o no selectivo puede ser usado dependiendo de la naturaleza del microorganismo que se desea contar o aislar (Ramírez et al., 1992). INTERFERENCIAS Los errores más frecuentes en este método son: a) Que durante la realización de las diluciones no se logre separar perfectamente los agregados bacterianos y más de una bacteria forme una colonia. b) Cuando el diluyente se esteriliza en tubos tapados con torundas de algodón el volumen inicial generalmente se altera, por lo que se recomienda el uso de tubos con tapón de rosca o la esterilización separada del diluyente y tubos, a fin de

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pipetear en cada tubo el volumen exacto del diluyente al que se agrega el volumen exacto de la muestra. c) Debe evitarse el choque osmótico cuando se hacen las diluciones; se recomienda el empleo de agua peptonada, solución salina isotónica; el medio de cultivo utilizado para su crecimiento o diferentes soluciones amortiguadoras. d) La temperatura de la varilla para extender el inóculo en la placa. Cuando la varilla queda muy caliente después de ser esterilizada con alcohol y flameada, puede quemar el inóculo. e) Durante el recuento se pueden producir dificultades ocasionadas por la carencia de uniformidad en la extensión de los microorganismos (Ramírez et al., 1992). MATERIAL Y EQUIPO:

Tubos de vidrio de 15 ml para cultivo con 9 ml de solución salina 0.85% estéril o agua estéril.

Matraz Erlenmeyer (250 ml) con tapa con 99 ml de solución salina 0.85% estéril.

Pipetas de 1 ml y de 0.2 ml, estériles. Pipeta de 10 ml Vórtex. Balanza. Espátulas. Campana de flujo laminar o área estéril. Cajas de Petri con medio de cultivo-agar. Varilla de vidrio. Muestra de suelo o agua. Incubadora. Papel aluminio estéril.

SOLUCIONES Y REACTIVOS 1) Solución salina 0.85% estéril. Adicionar 8.5 g de cloruro de sodio (NaCl) en 1 L de agua destilada. 2) Cajas de Petri con medio de cultivo adecuado para el crecimiento. 3) Etanol (CH3-CH2-OH). PROCEDIMIENTO 1) En condiciones estériles (trabajar en campana de flujo laminar), adicionar 1 g del suelo a una botella de dilución o matraz con tapa de rosca con 99 ml de solución salina isotónica estéril (dilución 10-2). Dispersar el suelo y homogeneizar con agitación vigorosa en vórtex. 2) Tomar 1 ml y transferirlo a un tubo con 9 ml de solución salina estéril (Dilución 10-3). De ahí se hacen diluciones sucesivas hasta completar diluciones decimales hasta 10-10 o las adecuadas, asegurándose de utilizar una punta o pipeta estéril diferente en cada paso. Agitar de forma constante con vórtex en cada paso. 3) Tomar 0.1 ml de la dilución seleccionada y colocarla en el centro de la superficie del medio de cultivo seleccionado para el crecimiento. Realizar esto por

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triplicado y con tres diluciones próximas (ej. 10-3, 10-4 y 10-5) para asegurar la cuenta. 4) Extender la alícuota en la superficie de la placa con una varilla de vidrio previamente esterilizada (inmersa en alcohol y pasándola por la flama del mechero permitiendo su enfriamiento). Asegurar una distribución homogénea por toda la superficie del medio. 5) Incubar las placas de forma invertida a 30ºC en ausencia de luz. 6) Después de un periodo de incubación (de 3 a 7 días, dependiendo del tipo de microorganismo), contar el número de colonias y reportar como unidades formadoras de colonias (UFC)/ g de suelo seco. CÁLCULOS Seleccionar las placas que presenten un rango de conteo entre 30 – 300 colonias. Como se utilizan duplicados de cada dilución se debe promediar el numero de colonias encontradas en ambas placas de la misma dilución y multiplicar por el inverso de la dilución. En caso de obtener recuentos dentro del rangoen diluciones consecutivas, registrar el número de colonias de cada dilución, multiplicar por el inverso de la dilución y luego determinar el promedio del recuento bacteriano entre ambas diluciones. Se informará como UFC/g de suelo.

INFORME Escribir en la tabla siguiente el número de colonias encontradas en cada una de las diluciones.

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Bacteria aerobias

Dilución No. De Colonias UFC/ml

CUESTIONARIO: 1. Consultar el significado de cuenta viable ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 2. Cuales son las bacterias mesófilas aerobias? ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 3. Mencione 3 ejemplos de bacterias fitopogenas ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 4. Mencione 3 ejemplos de bacterias patógenas de animales domésticos___________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

5. Porque es importante la técnica de recuento de microorganismos viables por dilución en placa. ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

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COLORACIÓN DE GRAM

Nombre del alumno___________________________________________ INTRODUCCIÓN Las coloraciones diferenciales se emplean junto con otras técnicas en la identificación y diferenciación de las bacterias. La coloración de Gram permite separar a las bacterias en dos grandes grupos, las Gram positivas y las Gram negativas En esta técnica se utiliza el cristal violeta como colorante primario el lugol como mordente, una mezcla de etanol-acetona o etanol como agente decolorante y safranina como colorante de contraste. Las bacterias que retienen el cristal violeta después de la decoloración se observan de color morado y son Gram positivas. Las bacterias Gram negativas por el contrario pierden el colorante primario por el tratamiento diferencial y toman el colorante de contraste, se observan entonces de color rojo. La capa de peptidoglicano de la pared celular bacteriana juega un papel fundamental en la coloración, el cristal violeta y el lugol forman una laca en el interior de las bacterias. Al aplicar el agente decolorante, las bacterias Gram + sufren una deshidratación y la red de peptidoglicano que es muy abundante, se condensa y constituye un obstáculo para la salida del complejo cristal violeta-lugol. Las bacterias Gram – también contienen peptidoglicano pero en menor cantidad por lo que constituye una barrera laxa, de modo que las bacterias queda más permeables que las Gram + y el complejo cristal violeta-lugol sale con más facilidad dejando así lugar a la safranina. A la coloración de Gram están asociadas otras propiedades de las bacterias como son: su sensibilidad a diferentes antibióticos, a los colorantes del grupo de trifenil metano, a la lisozima, su capacidad de producir toxinas diferentes entre si, etc. Objetivo: El alumno aplicará una técnica de coloración para la diferenciación de bacterias. Material Mechero bunsen Asa bacteriológica Portaobjetos y cubreobjetos Aceite de inmersión Solución de cristal violeta Solución de lugol Solución de alcohol-acetona Solución de safranina

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Puentes de coloración Cepas PROCEDIMIENTO 1) El primer paso es preparar y fijar un frotis de la siguiente manera: • Con la ayuda de un mechero, flamear un asa bacteriológica y esperar que enfríe un poco. - Tomar el asa (previamente flameada) y con ésta tomar un poco de muestra. - Una vez obtenida una pequeña cantidad de la muestra (con el asa), hacer que ésta tenga contacto con una lámina portaobjetos, la cual servirá para depositar la muestra contenida en el asa. • Con el asa (conteniendo la muestra) sobre la lámina portaobjetos, proceder a realizar la extensión de la muestra en el portaobjetos mediante movimientos giratorios (dar vueltas con el asa) sobre la lámina, de tal forma que al terminar la extensión, tengamos como producto un espiral en la parte media la lámina. • Esperar que seque al aire libre o ayudarse con la llama de un mechero para fijar la muestra, teniendo en cuenta que el calor no debe ser directo (sólo se pasa por la llama), puesto que el calor excesivo puede cambiar la morfología celular de las bacterias a observar. El calor deseable es aquel en el que el portaobjetos sea apenas demasiado caliente pare ser colocado sobre el dorso de la mano. 2) Una vez obtenido el frotis con la muestra, se procede a teñir la misma con violeta cristal o violeta de genciana, utilizando una cantidad suficiente de dicho colorante sobre la muestra, como para lograr cubrirla por completo. Se deja actuar al colorante por 1 minuto. Esta tinción de 1 minuto está dada para trabajar a una temperatura ambiente de 25 grados. 3) Al transcurrir el minuto, se debe enjuagar la lámina conteniendo la muestra con agua corriente. Para realizar el lavado, se debe tener en cuenta que el chorro de agua NO debe caer directamente sobre la muestra, ésta debe caer sobre la parte superior de la lámina que no contiene muestra. El chorro debe ser un chorro delgado, aproximadamente de medio a un centímetro de espesor. También el enjuague se debe realizar poniendo la lámina en posición inclinada hacia abajo. Una vez enjuagado el portaobjetos, se aplica como mordente yodo o lugol durante 1 minuto más. El mordente es cualquier sustancia que forme compuestos insolubles con colorantes y determine su fijación a las bacterias. 5) Pasado el minuto de haber actuado el mordente, el frotis se decolora con etanol al 75 %, etanol al 95 %, acetona o alcohol-acetona, de 5 a 15 segundos. Para esto se utiliza el gotero del frasco del decolorante. Se van añadiendo cantidades suficientes del decolorante, hasta lograr que éste salga totalmente transparente.

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6) Lavar con agua para quitar los residuos de decolorante y esperar que seque la lámina al aire libre o con la ayuda de la llama de un mechero de la forma anteriormente descrita. 7) Una vez que la lámina ya secó, procedemos a teñir nuevamente, pero esta vez se va a utilizar un colorante de contraste como por ejemplo la safranina, dejar actuar durante 1 minuto. 8) Pasado el minuto correspondiente, se procede a enjuagar la lámina con agua, se escurre el agua sobrante y se seca en la

forma anteriormente descrita.

De esta manera, ya tendremos listo el frotis para su respectiva observación microscópica. Informe Después de aplicar la técnica de Gram a las cepas proporcionadas y de acuerdo a sus observaciones indique la morfología y agrupación microscópica y la reacción de Gram de cada cepa. Realizar esquemas a colores de las preparaciones observadas en base a sus resultados. Cuestionario 1. ¿Qué importancia tiene la técnica de coloración de Gram en la identificación de las bacterias? __________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 2. ¿Cuál es el paso crítico en la técnica de Gram? Diga porque. ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 3. Diga el nombre de tres bacterias (género y especie) Gram positivas de importancia agronómica. ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 4. Diga el nombre de tres bacterias (género y especie) Gram negativas de importancia agronómica.

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________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ 5. ¿Por qué en general, las eubacterias son el único grupo microbiano que responden a la coloración de Gram? __________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

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AISLAMIENTO DE HONGOS FITOPATÓGENOS


INTRODUCCIÓN Para aislar hongos fitopatógenos de tejidos vegetales enfermos que presente síntomas; si es de raíz con la ayuda de una espátula o paleta delgada se extrae del suelo tan completa como sea posible, el suelo adherido a la raíz se lava con agua y se coloca sobre una toalla de papel hasta que se seque, si son tejidos de hojas o tallos se corta la parte infectada se envuelve en una toalla de papel que sirve también para absorber la humedad. MATERIAL: Camara de flujo laminar tijeras cajas petri con medio de cultivo hipoclorito de sodio al 2% toallas de papel pinzas muestras de tejidos vegetales con síntomas Todos los procedimientos se deben ejecutar dentro de la cámara de flujo laminar, además debe cumplirse todas las condiciones de asepsia y esterilidad que se exige en un laboratorio - Tomar la muestra que presente síntomas de la enfermedad. - Envolver cada muestra en una toalla de papel, colocarla en una bolsa de papel

y adherir a esta el rotulo que corresponda. y trasladarlo al laboratorio. - En laboratorio y bajo condiciones de asepsia se seleccionan varios cortes

pequeños de 5 a 10 mm2 a partir del borde de la lesión infectada (parte de tejidos enfermos y parte de tejidos sanos) utilizando tijera estéril o navaja de bisturí.

- Desinfectar los trozos de tejido en un frasco pequeño que contenga una solución de hipoclorito de sodio al 2.0% durante 15 ó 30 min.

- Los cortes se toman asépticamente uno por uno a intervalos regulares de tiempo (por ejemplo, cada 10 ó 15 segundos), a fin de que cada uno de ellos se esterilice (a nivel de su superficie) a diferentes tiempos.

- Posteriormente enjuagar tres veces con agua estéril los tejidos vegetales. - Colocar los cortes lavados sobre una toalla de papel estériles durante 5 min

para que se sequen. - Cuando las muestras estén secas, tomar los trozos de tejido con una pinza

estéril y sembrarlos en una caja petri que contenga medio de cultivo PDA; colocar tres a 5 trozos por caja, repetir el procedimiento para todas las muestras. Incubar la caja a 24ºC durante 5 días. (ver figura).

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NOTA: Días después el aislamiento estará listo podrá purificarse mediante un aislamiento monomicelial. el objetivo de este procedimiento es obtener una cepa del hongo genéticamente pura, siempre y cuando el hongo se aísle de un tejido infectado, es necesario purificar el hongo obtenido en el primer paso del aislamiento. Si el hongo no produce esporas en el medio de cultivo, se utilizan puntas de hifa. -Cortar un cuadrado de aproximadamente 0.5 cm (de lado) del medio de cultivo donde se observe crecimiento micelial, transferir el corte al centro de una caja petri que contenga medio de cultivo incubar a 25ºC durante 24 h. -Observe a las 48 h, bajo el estereoscopio y en la cámara de flujo laminar; el micelio del hongo en crecimiento y enfocar los bordes de la colonia para identificar las puntas de hifa en crecimiento. -Con un alfiler flameado, cortar un trocito de agar que contenga la punta de una sola hifa, teniendo la precaución de no tocar otras hijas al rededor de la que se está aislando. - Transferir el trocito de agar con la hifa a una caja petri con medio de cultivo,

colocar una sola hifa en el centro de cada caja. - Incubar a 25 ºC durante 5-7 días. - Una vez formada la colonia, obtener estructuras reproductivas y realizar

observaciones microscópicas y compararlos con claves dicotómicas o con el apoyo de imágenes de estructuras fructíferas y de esta manera identificar tu cepa y basándose del huésped realizar investigación para entregar tu reporte.

CUESTIONARIO

1. Escribe algunos sustratos de donde podemos aislar a los microorganismos:

_____________________________________________________________________________

2. Que tipo de organismos son los mohos?

_____________________________________________________________________________

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HONGOS TOTALES POR DILUCIÓN EN PLACA

Nombre del alumno___________________________________________ INTRODUCCIÓN:

Los hongos tienen hábitats muy diversos, sin embargo la mayoría son terrestres y habitan en el suelo. Desempeñando un actividad muy importante en la mineralización del carbono orgánico, cuando se compara a los hongos con las bacterias en general , estos tienen requerimientos nutricionales muy simples, sin embargo su desarrollo es muy lento, por lo que requieren mayor tiempo de incubación para su cultivo. En el aislamiento, cultivo y cuenta de la mayoría de los hongos se aprovecha ciertas características especiales de ellos, como su tolerancia a pH ácidos y su preferencia por medios de cultivo con grandes concentraciones de azúcar fácilmente degradable, además su resistencia a penicilina y estreptomicina permite usar estos antibióticos, que al ser agregados los medios de cultivo reducen el número de bacterias contaminantes.

En la preparación de los medios de cultivo para hongos con frecuencia se prefiere usar mezclas de vegetales (agar-papa; agar-harina de maíz, etc.) entre otras sustancias naturales (Ramírez et al, 1992).

OBJETIVO: El alumno aislará poblaciones fúngicas del suelo mediante el método extensión en placa utilizando una varilla angular de vidrio. METODO: El método recomendado para la detección y enumeración de hongos y levaduras es papa dextrosa agar (PDA) adicionado con rosa bengala con las propiedades de limitar su crecimiento permitiendo su conteo así como la adición de estreptomicina para evitar el crecimiento indeseable de bacterias. MATERIAL Muestra de suelo 1 varilla de vidrio doblada ¿? pipetas de 1 ml cajas con medio de cultivo estéril PDA 6 Tubos de ensayo con tapón de rosca 1 Asa bacteriológico Alcohol al 70%

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Espátula 1 Matraz Erlenmeyer 250 ml 1 Frasco Schot Balanza analítica Medio de cultivo PDA Rosa Bengala Sulfato de estreptomicina Vortex PROCEDIMIENTO Técnica se aislamiento y recuento. Diluciones en serie. Técnica que consiste en obtener una suspensión de la mezcla de microorganismos y hacer diluciones seriadas que se vierten en una placa Petri hasta conseguir colonias aisladas. Instrucciones: Se debe trabajar, como siempre, en condiciones estériles, flameando la boca de los tubos antes y después de introducir la pipeta, en las proximidades del mechero. 1. Preparar medio de cultivo para hongos totales utilizando PDA (39 gL-1 o lo indicado en el frasco) y rosa bengala (50 mgL-1) llevar a ebullición hasta su completa disolución. 2. Esterilizar el medio en autoclave a 121°C (15 Lb)/ 15 minutos. 3. Una vez que el medio de cultivo esté a 50° C aproximadamente, en condiciones estériles (en campana de flujo laminar) adicionar estreptomicina (50 mg L-1). Nota: Para suprimir el crecimiento bacteriano algunas veces es necesario acidificar el medio a pH 3.5. Esto se puede conseguir adicionando 1 ml de ácido láctico al 10% por cada 100 ml de medio estéril y a 50°C. El medio no debe ser calentado después de la adición del ácido, ya que podría hidrolizar el agar alterando su propiedad gelificante. Si no se requiere de medio selectivo se sugiere el empleo de PDA sin la adición de ácido o utilizar algún antibiótico como sulfato de estreptomicina. 4. Mezclar bien antes de vaciar el medio en cajas de Petri, una vez vaciado en cajas esperar a que gelifique. 5. Prepara la muestra de suelo y diluciones e inocular 500 µL a cada caja de Petri. 6. Incubar las cajas invertidas a 30°C. 7. A partir de 48 hrs observar si ya hay crecimiento o espera a que se observen las colonias. 8. Para el cálculo final de UFC se debe considerar la dilución con que se inoculó la caja. La cantidad de inóculo (0.1 ml) y la humedad de la muestra, reportando finalmente UFC/g suelo seco.

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Cálculos: para realizar los cálculos de UFC/g s. s. seguir el procedimiento de la figura.

CUESTIONARIO 1.- A qué grupo de microorganismos pertenecen los actinomicetos? ___________________________________________________________________________ 3.-Qué tipo de técnica utilizaste para sembrar hongos? ___________________________________________________________________________ 4.- Menciona otra técnica para aislar cultivos puros de microorganismos? ___________________________________________________________________________ 5.- ¿Cuál fue la finalidad de quemar el alcohol sobre la varilla de vidrio? ______________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

6.- ¿Por qué iniciaste a distribuir con la varilla en forma uniforme las diluciones l0-5 que contenían a los microorganismos y no con las diluciones de l04?

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____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 7.-¿Qué apariencia (color, textura; bordes, elevaciones..) presentaron las colonias después del tiempo de incubación? ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ OBSERVACIONES Dibuja todo el proceso llevado a cabo para el aislamiento del cultivo puro de su hongo por extensión en placa, así como los resultados obtenidos en su identificación. CONCLUSIONES ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

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COPROPARASITOSCOPICO

CONCENTRACIÓN POR SEDIMENTACIÓN

Nombre del alumno___________________________________________ INTRODUCCIÓN. La sedimentación de parásitos intestinales en heces se logra por centrifugación ligera o por gravedad del material fecal, conduciendo a la recuperación de todos los protozoarios, huevos y larvas, especialmente huevos de trematodos. Concentra bien estas formas y elimina bastantes detritus orgánicos. Aunque se inactivan las formas móviles de los protozoarios, se mantiene la integridad de los organismos. Es efectivo aún en heces con cantidades excesivas de grasas y pueden observarse la mayoría de los quistes de protozoarios, así como huevecillos y larvas de helmintos, incluyendo los huevos con opérculo y tiene una eficacia moderada para los huevos de Esquistosoma . La técnica es útil para examinar heces que contienen substancias grasas que interfieren en los métodos de flotación. APLICACIÓN La técnica de flotación es recomendada generalmente para Oocystis de coccidios, quistes de protozoarios, huevos de nematodos y algunos huevos de gusanos y planos acintados. La técnica de sedimentación consiste en concentrar quistes de protozoarios, trematodos, acantocéfalos y algunos huevos de gusanos aplanados. OBJETIVO Desarrollo y comprensión de la técnica para identificar parásitos intestinales en heces. EQUIPO Y MATERIAL

1. Centrífuga 2. Microscopio 3. Balanza 4. Tubos de centrífuga 5. 2 Pipeta de 10 ml 6. 1 Pipeta de 5 ml 7. Portaobjetos y cubreobjetos 8. Colador de plástico o gasas 9. Pipeta pasteur 10. Aplicador de madera

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11. Guantes de plástico 12. Gasa cortada en cuadros de 15 cm por lado 13. Embudos de polietileno 14. Vasos de precipitado de 50 ml

REACTIVOS: 1. Solución salina(cloruro de sodio 7 g agua destilada 1000 ml) 2. Formalina (10 ml de formol al 40%, 90 ml agua destilada, neutralizar

agregando tetraborato de sodio hasta llevar a un pH de 7.0 o 7.3) 3. Éter etílico (grado analítico) MÉTODO DE CONCENTRACIÓN Y LAVADO- CUALITATIVO El examen para la identificación de parásitos y protozoos se realiza por el método de concentración por centrifugación y lavado, el que consta de dos procedimientos, el de flotación (sulfato de zinc) y el de sedimentación (formol-éter). TÉCNICA DE SEDIMENTACIÓN

Método del Formol-éter (Método de Ritchie): 1. Coloque en un vasito 1 g de heces (aprox. el tamaño de un cacahuate) mediante la ayuda con un abatelenguas y adicione 10-12 ml de solución salina fisiológica. Mezcle con un aplicador de madera y homogenice. 2. Filtre la suspensión a través de un colador o malla y reciba el filtrado en un tubo de centrífuga de vidrio de 14 ml 3. Centrifugue 1 min a 2000 r.p.m. Elimine el sobrenadante y resuspenda en solución salina. 4. Repita el paso anterior, dos o tres veces para lavar, resuspendiendo el sedimento en solución salina y homogenizando con un aplicador, para obtener un sedimento más limpio. 5. Agregue al sedimento 10 ml de formol al 10% en solución salina, mezcle y deje en reposo durante 5 min. 6. Añada 3 ml de éter y agite vigorosamente 30 segundos. 7. Centrifugue 1 min a 1500 r.p.m. 8. Después de centrifugar, se observan 4 capas en orden descendente. 1) éter y lípidos en la superficie 2) un tapón de restos fecales 3) formaldehido 4) sedimento en el fondo del tubo conteniendo los parásitos.

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9. Se decanta la muestra y se conserva el sedimento. Se le adiciona unas gotitas de lugol y se homogeniza. Se toma una gotita con una pipeta Pasteur y se monta entre portaobjeto y cubreobjetos. Se observa a 10 y a 40 X. 10. Fuentes comunes de error: una suspensión fecal demasiado cargada, suspensión fecal pobre, centrifuga mal equilibrada, tiempo y velocidad de centrifugación inadecuados Haga dibujos detallados de los parásitos encontrados e identifíquelos mediante la comparación de su morfología con los manuales y libros. FLOTACIÓN DIRECTA CON CENTRÍFUGA (F.D.C.):

Solución concentrada de sacarosa (Sheather) 1. Coloque en un vasito 1 g de heces (aprox. el tamaño de un cacahuate) mediante la ayuda con un abatelenguas y adicione 10-12 ml de solución Sheather’ sugar. Mezcle con un aplicador de madera y homogenice. 2. Filtre la suspensión a través de un colador o malla y reciba el filtrado en un tubo de centrífuga de vidrio de 14 ml 3. Se centrifuga a 500 r.p.m. durante 5 min. 4. Se toma un poco de la superficie y se coloca en portaobjetos y cubreobjetos. Se observa con 10 y a 40 X. RESULTADOS, DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES. En caso de encontrar algún parasito durante la realización de esta prueba se Deberá anotar en la hoja de resultados el nombre del parasito así como su estadío evolutivo (trofozoito o quiste en el caso de los protozoos y huevo o larva en caso de helmintos) Haga dibujos detallados de los parásitos encontrados e identifíquelos mediante la comparación de su morfología con los manuales y libros. TÉCNICA DE ZIEHL NEELSEN

MODIFICADA PARA OBSERVAR COCCIDIAS:

FUNDAMENTO: Se basa en el comportamiento acido-resistente de la cubierta de estos

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parásitos, los cuales se tiñen de rojo y destacan sobre un fondo verde o azul , dependiendo del colorante de contraste usado. MATERIAL Y EQUIPO: Portaobjetos Cubreobjetos Puente para tinción Fucsina fenicada Verde de malaquita o azul de metileno acuoso Metanol Hidróxido de sodio al 4% Alcohol acido MÉTODO: a) Realizar un frote de heces en el portaobjetos y dejar secar. b) Colocar las láminas sobre el puente de tinción c) Fijar la lamina con alcohol metílico de 2 a 3 minutos y dejar secar d) Agregar hidróxido de sodio, sobre el preparado por un minuto y eliminar el exceso con agua de la llave. e) Cubrir la lámina con fucsina fenicada (previa agitación del frasco que contiene dicho reactivo). Por 5 minutos. Es importante recordar que la fucsina debe ser diluida previamente con agua al tercio (1 ml de colorante mas 2 ml de agua). f) Lavar suavemente la lámina con agua corriente g) Cubrir el portaobjetos con alcohol acido por unos segundos hasta quitar el colorante. h) Lavar suavemente la lámina con agua corriente i) Colocar el colorante de contraste a la lamina que puede ser verde de malaquita al 1% o azul de metileno al 1.4%, durante 5 minutos( diluidas previamente al tercio) j) Lavar suavemente la lámina con agua corriente y secar a temperatura ambiente. k) Realizar el montaje con cytoseal, bálsamo de Canadá o Permount, cubrir con un portaobjetos. l) Observar al microscopio. NOTA: Los ooquistes de Cryptosporidium, Isospora y Cyclospora, aparecen de un color rojo fucsina, sobre un fondo verdoso (verde de malaquita). En algunos no se colorean bien, pero la refringencia característica permite diferenciarlos. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:

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En caso de encontrar algún parasito acido alcohol resistente en la tinción se deberá anotar en la hoja de resultados el nombre del parasito así como su estadio evolutivo. Método del embudo de Baerman El método del embudo de Baerman se utiliza para extraer nematodos del suelo o de material vegetal macerado. Se basa en la movilidad que presentan los nematodos, que tienden a emigrar hacia el fondo del embudo, cuando la muestra de suelo o vegetal está saturada de humedad. Algunos géneros se obtienen rápidamente y en grandes cantidades con este método pero otros, de movimientos torpes son difíciles de obtener. Para los nematodos que presentan una estructura hinchada algunas hembras) o cutícula segmentada el papel filtro utilizado en este método les forma una barrera difícil de atravesar. MATERIAL NECESARIO Soporte universal Anillo Embudo de vidrio Manguera de goma de 10 cm Pinza mohr Pizeta Malla de plástico PROCEDIMIENTO 1. El dispositivo consiste en un soporte metálico con un anillo donde se

suspende el embudo de cristal de cuello largo unido al tubo del embudo va un trozo de manguera que se cierra en su extremo libre mediante una pinza mohr.

2. El embudo se llena de agua con una pizeta, dejando vacios unos 2 cm bajo el borde, sobre el embudo se coloca una malla de plástico.

3. Para poseer datos cuantitativos, se pesan aproximadamente 100 gramos de suelo y se depositan sobre el papel y cuidadosamente se coloca sobre la malla de plástico.

4. Asegúrese que el nivel del agua rebase ligeramente la muestra de suelo drenando agua o agregando por la parte de arriba depositándola por un lado.

5. Doble los bordes del papel sobre la muestra, de manera que ningún borde el papel salga de los límites del embudo.

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6. Solamente cuando los nematodos sean numerosos se podrán extraer. Por lo general conviene dejarlos de 24 horas hasta cinco días. Se sugiere un término medio de 48 horas.

Los nematodos por movimiento propio atravesarán el papel filtro y sedimentarán en la parte inferior del embudo. Las partículas de suelo quedarán retenidas en el papel filtro. Debe evitarse que los borde del papel sobrepasen el diámetro del embudo. 7. Terminado el periodo de espera, habrá las pinzas mohr, recoja en un

frasquito unos 10 ml del agua del fondo que contiene los nematodos. 8. observe bajo el microscopio estereoscópico los nematodos colectados. RESULTADOS, DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES Haga dibujos detallados de los nematodos encontrados e identifíquelos mediante la comparación de su morfología con los manuales y libros.

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FERMENTACIÓN

Nombre del alumno___________________________________________ ANTECEDENTES El complemento de la fotosíntesis es la respiración, pues los productos de uno son empleados en el otro y viceversa, formando un ciclo de vital importancia, pues gracias a ellas se produce ATP, que es la molécula energética de los organismos. Todos los seres vivos respiran, sean bacterias, protozoarios, hongos, vegetales o animales. Sin embargo, no todos lo hacen de la misma manera; hay organismos que no requieren el oxígeno para poder respirar, incluso en su presencia pueden morir. Éste tipo de organismos reciben el nombre de anaerobios. La fermentación, es también conocida como respiración anaerobia, es la respiración que se realiza en ausencia de oxígeno y consiste en el rompimiento de compuestos orgánicos granes (azucares) formándose compuestos pequeños que contienen menos energía química que las moléculas con que se inicia el proceso. En ésta vía metabólica la glucosa se rompe en dos moléculas de ácido pirúvico; cada molécula de este ácido tiene tres átomos de carbono y además se producen dos moléculas de CO2 y dos moléculas de ATP. Las variantes de la fermentación se refieren al destino del ácido pirúvico. Por ejemplo, en las células animales (cuando la ausencia de oxígeno impide la respiración aerobia), este ácido se convierte en ácido láctico. En células vegetales, levaduras y algunas bacterias que tienen condiciones pobres de oxígeno, el ácido pirúvico se convierte en CO2 y etanol. OBJETIVOS: Conocer el proceso de fermentación, a traves de la degradación de la glucosa hasta la obtención de CO2 MATERIAL: 5 tubos de ensayo grandes 5 tubos de ensayo pequeños 1 gradilla 1 balanza 1 probeta de5 ml Levadura de pan Suspensión de levaduras en sacarosa al 5% Jugo de naranja, manzana o uva

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PROCEDIMIENTO: 1. Con uno de los tubos de ensayo grandes mide primero con agua el volumen necesario para que el jugo cubra ¾ partes del tubo. 2. Coloca en los cinco tubos de ensayo grandes la misma cantidad de jugo de fruta. Cada equipo puede realizar la experiencia con diferente jugo. 3. Etiqueta y numera cada uno de los tubos. 4. Pesa las siguientes cantidades de levadura: 1.0g, 1.5g, 2.0g, 2.5g y 3.0g. 5. Agrega las diferentes cantidades de levadura a cada tubo de ensayo. 6. Introduce los tubos pequeños, boca abajo, en los tubos grandes. Debes llenar el tubo pequeño con la mezcla del jugo y levadura, procurando que no quede ninguna burbuja de aire. Para llenar los tubos pequeños con la mezcla del tubo grande introdúcelo en este último inclinándolo, después mueve lentamente el tubo hacia abajo. Cuando ambos tubos estén en posición horizontal enderézalos, de ésta manera el tubo pequeño se llenará con el contenido del tubo grande. 7. espera de 20 a 40 minutos el experimento; al término de este tiempo mide con una regla milimétrica la longitud de la burbuja de cada tubo. RESULTADOS: Haz aquí tus esquemas y anota tus observaciones. Con tus resultados elabora la siguiente gráfica: Cantidad Número de tubo de levadura Longitud de la burbuja en mm g. de levadura

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CUESTIONARIO. 1. ¿Qué puedes concluir acerca de la relación entre la cantidad de sustrato y

la producción de CO2?______________________________________________________

____________________________________________________________________________ 2. ¿Qué usos industriales tienen el proceso de fermentación? ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 3. ¿Qué tipo de organismos son las levaduras? ____________________________ ____________________________________________________________________________ Conclusiones:

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CONTROL BIOLÓGICO PRUEBAS DE ANTAGONISMO


INTRODUCCIÓN El uso de agroquímicos ha permitido obtener incrementos en la producción no obstante sus efectos adversos están impactando de manera significativa la sostenibilidad de la agricultura. La práctica del monocultivo y la contaminación por el uso indiscriminado de agroquímicos han reducido la biodiversidad de los agroecosistemas, causando la inestabilidad de los mismos, la cual se manifiesta en otros efectos nocivos, en una mayor incidencia de plagas y enfermedades en los cultivos, esto y los problemas de seguridad pública inherentes a la fabricación y uso de agroquímicos han conducido a la búsqueda y establecimiento de alternativas de manejo y enfermedades. Así surge el interés por el control biológico que puede definirse como “cualquier forma de control que reduce la incidencia o severidad de la enfermedad o incrementa la producción del cultivo aun cuando no haya aparentemente un efecto significativo en la reducción de la enfermedad o inóculo y su impacto nocivo en el ambiente sea mínimo o nulo. Los agentes de control biológico de plagas del suelo son bacterias, hongos y otros organismos no patógenos que compiten por el espacio y los nutrientes de patógenos o son antagónicos de alguna manera contra éstos en el área de la rizósfera y, en algunos casos, pueden actuar como protectores contra posibles infecciones de la raíz. Varios ejemplos de patógenos como Sclerotium rolfsii Socc, Rhizoctonia solani y Pythium spp. han sido controlados biológicamente utilizando antagonistas como Trichoderma spp, Penicillium spp, Aspergillus spp y algunas bacterias. OBJETIVO: El alumno conocerá la capacidad antagónica de los organismos para controlar el crecimiento de otro. Para la evaluación comparativa de la actividad antagónica en cultivos duales se utilizaran como Fitopatógenos Sclerotium sepivorum, Fusarium spp y Botritis cinérea y como potenciales biocontroladores serán evaluados Trichoderma spp., y Bacillus subtilis.

PROCEDIMIENTO

MATERIAL Y EQUIPO NECESARIO:

1. Cajas con medio de cultivo PDA

2. Campana de flujo laminar

3. Navaja con bisturí

4. Cepas fitopatógenos

5. Cepas antagónicas

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1. De la periferia de las colonias se cortan discos con sacabocados de 0.5 cm de diámetro que serán transferidos a caja petri con PDA en posiciones opuestas de tal modo que queden enfrentadas uno del fitopatógeno y otro del antagonista a probar en cada tratamiento.

2. Para la siembra de Bacillus subtilis se realiza por estría a lo largo del medio de cultivo en un extremo y en el otro extremo un disco de 0.5 cm tomado del borde del crecimiento del fitopatógenos.

3. Cada prueba debe realizarse con tres repeticiones como mínimo. 4. Se realizará la siembra de un testigo que consistirá en el crecimiento de los

distintos aislamientos de fitopatógenos sin la presencia de antagonistas. 5. Las cajas serán mantenidas en incubación a una temperatura de 25 - 27⁰C. 6. Se medirá el diámetro de las colonias a las 24, 48 y 72 horas efectuándose

un análisis de varianza y prueba de Tukey de los valores obtenidos. RESULTADOS: Observe las placas bajo lupa y/o microscopio. Describa las alteraciones que se observan. RESULTADOS: Mediante una gráfica reporte los resultados

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BIBLIOGRAFÍA:

Cúndom, María A. - Mazza, Silvia - Gutiérrez, Susana A. - Mazzanti de Castañón,

María A. Evaluación de Tricoderma spp. contra Rhizoctonia solani in vitro e ivernáculo Cátedra de Fitopatología - Facultad de Ciencias Agrarias –.E:mail: [email protected].

E. Savaleta Mejía. 1999. Alternativas de manejo de las enfermedades de las

plantas. Terra latinoamericana. Julio-septiembre año/vol. 17, núm. 003. Gaviño de la Torre Gonzalo.1993. Técnicas Biológicas Selectas de Laboratorio y

de Campo. Editorial Limusa S. A. de C. V. Primera edición pag.147-155. GEORGE A. WISTREICH. 2003. MICROBIOLOGY LABORATORY

FUNDAMENTALS AND APPLICATIONS SECOND EDITION.PEARSON EDUCATION. INC. UPPER SADDLE RIVER, NEW JERSEY

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