Corr Hetero Nuclear

ESPECTROSCOPIA 2D DE CORRELACIÓN HETERONUCLEAR

Francisco José Blanco Gutiérrez

Unidad de Biología EstructuralCIC bioGUNE

Parque Tecnológico de Vizcaya, Edificio 80048160 Derio

ESPECTROSCOPÍA 2D DE CORRELACIÓN HETERONUCLEAR

José Adrián Gavín Sazatornil

Instituto Universitario de Bio-Orgánica IUBO “Antonio Gónzalez”

Departamento Química OrgánicaUniversidad de La Laguna

ESPECTROSCOPÍA 2D DE CORRELACIÓN HETERONUCLEAR




¿Espectroscopia o espectroscopía?

Diccionario de la RAE: − Espectroscopia

¿Espectroscopia o espectroscopía?


Google:− Espectroscopia 126.000− Espectroscopía 93.000

¿Espectroscopia o espectrometría?


Conjunto de conocimientos referentes al análisis espectroscópicoImagen obtenida por un espectroscopio

− EspectrometríaTécnica del empleo de los espectrómetros.

Google:− Espectroscopia de RMN 44.400 (1.010.000 en inglés)− Espectrometría de RMN 506 ( 69.500 en inglés)

¿Espectroscopio o espectrométro?

Diccionario de la RAE: − Espectroscopio

Instrumento que sirve para obtener y observar un espectro

− EspectrómetroAparato que produce la separación de partículas o radiaciones de una determinada característica, como la masa, la carga, la longitud de onda, etc., y mide su proporción.

Google:− Espectroscopio de RMN 32 ( 1.510 en inglés)− Espectrómetro de RMN 999 (192.000 en inglés)

Espectroscopia bidimensional

Preparación MezclaEvoluciónAdquisición

t1

t2


ESPECTROSCOPIA 2D DE CORRELACIÓNHETERONUCLEAR

Diccionario de la RAE: − Correlación

Correspondencia o relación recíproca entre dos o más cosas o series de cosas Medida de la dependencia existente entre variables aleatorias

Acoplamiento entre espínes

Acoplamiento escalar (acoplamiento dipolo-dipolo indirecto)

− A través de los electrones de los orbitales enlazantes

J (+, -, 1H-13C ~150 Hz)

− Un núcleo experimenta ≠ microcampos magnéticos (2 si I = ½) generados por la polarización inducida en los electrones de enlace por el otro núcleo acoplado

Acoplamiento entre espínes

Acoplamiento escalar (acoplamiento dipolo-dipolo indirecto)

− A través de los electrones de los orbitales enlazantes

J (+, -, 1H-13C ~150 Hz)

− Un núcleo experimenta ≠ microcampos magnéticos (2 si I = ½) generados por la polarización inducida en los electrones de enlace por el otro núcleo acoplado

Acoplamiento dipolar (acoplamiento dipolo-dipolo directo)

− A través del espacio

D (+, -, 1H-1H ~50 kHz)

− Un núcleo experimenta el microcampo magnético creado por otro núcleo cercano (dependiente de la orientación y distancia)

Las interacciones espín-campo y espín-espín son anisótropas

Espectro RMN-2D en estado sólido

RMN en estado líquido: Interacciones isótropas

03/312cos31 __ =−⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ →⎯⎟⎠⎞⎜

⎝⎛ −∝ isotrópicorápidomovimiento

dH θ

Espectro RMN-1D en estado líquido

Acoplamiento escalar débilNúcleos I y S débilmente acoplados

− Rotación independiente de los espines acoplados

− Las transiciones de los espines inducidas por pulsos no afectan al estado de los espines acoplados

− Es el caso general en heteronúcleos

Núcleos I y S fuertemente acoplados− Cambios de estado en un espín puede inducir el cambio de estado en el

espín acoplado

− No es incompatible un acoplamiento fuerte y un valor absoluto pequeño de J

00SIISJ ωωπ −<<

Núcleos I y S manipulables por pulsos de radiofrecuencia independientemente

− 1H-13C, 1H-15N, 13C-15N, … (espín ½)

− 13Cα-13C´ (Δδ ~ 120 ppm)

− 1Hα-1HN (Δδ ~ 4 ppm; 3D-HNHA) Los núcleos de elementos distintos tienen frecuencias de resonancia muy diferentes y el acoplamiento escalar es siempre débil


¿Para qué?

Medida de las frecuencias de resonancia de los heteronúcleos acoplados

− Generalmente a 1H

Identificación de acoplamientos− Asignación espectral− Estructura química− Estructura 3D

Resolución de señales mediante la dispersión en la frecuencia del núcleo acoplado

− Escala de frecuencias de mayor rango que la de 1H

Baja sensibilidad intrínseca de heteronúcleos

Núcleo γ (rad.s-1.T-1) Abundancia Sensibilidadnatural (%) relativa

1H 2,7 x 108 99,98 1,0

13C 6,7 x 107 1,11 0,004

15N -2,7 x 107 0,36 0,0004

31P 1,1 x 108 100,0 0,5

Sensibilidad en la medida de correlaciónheteronuclear

]1[/ ,123det

RexctRexc eNS −−∝ γγ

Ventajas en la medida de núcleo con γ grandes

− A mayor γI mayor momento magnético y mayor señal− Como , y la inducción en la bobina es proporcional

a la velocidad de cambio del momento magnético, la señal aumenta con γI

− El desdoblamiento de niveles es proporcional a γI la polarización en el equilibrio es mayor mayor señal

− A mayor momento magnético mayor acoplamiento con el entorno, mayor R1 y se puede pulsar más rápido mayor S/N

oII Bγω =0

Sensibilidad relativa: detección inversa

HSQCCorrelación heteronuclear de cuanto sencillo

τ = 1/(2JIS)

2IZSY IYcos(ωSt1) + 2IXSX sen(ωSt1)

IZ 2IZSY

HMQCCorrelación heteronuclear de cuanto múltiple

τ = 1/(2JIS)

2IXSY

2IXSZ

IYcos(ωSt1) + 2IXSX sen(ωSt1)

Comparación HSQC-HMQC

⎯⎯⎯⎯ →⎯ ciaTransferen ⎯⎯⎯⎯ →⎯ )( 1tEvolución⎯⎯⎯⎯⎯⎯ →⎯ reversaciaTransferen ⎯⎯⎯⎯ →⎯ )( 2tDetecciónS II

• Coherencias de SQ durante t1• Pulsos 180° sobre I para reenfocar ωI

• Más vulnerable a– Imperfecciones de los pulsos– Heterogeneidad de B1

Menor sensibilidad • Coherencia SQ no modulada por JII´

– Mayor resoluciónmayor sensibilidad

• Transferencia de polarización– Sólo acoplamiento escalar

• Coherencias de MQ durante t1• Un solo pulso de 180° sobre S• Más robusta

más sensible

• Coherencia MQ modulada por JII´– Menor resolución

menor sensibilidad• Transferencia de polarización

– Acoplamiento escalar– Relajación correlacionada cruzada

mayor sensibilidad cuando PM es alto

HSQC HMQC

2IZSY2IXSY

Relajación transversal y correlación heteronuclear

En un HXQC de moléculas con tiempos de correlación largos baja S/N

− R2 grande, las coherencias no sobreviven a los tiempos τ de transferencia

− En el HMQC se podría aprovechar esta relajación más eficiente para transferir polarización de I a S ajustando el tiempo τ < 1/(2JIS) y óptimo para la transferencia de tipo CRINEPT, y además reducir la pérdida de señal por relajación.

Aun así es probable que no detectásemos señal alguna. − Al desacoplar el núcleo S durante la adquisición de la señal de I se mezclan las

dos componentes del doblete, que pueden tener distintas R2 (una relajando más rápido, más ancha).

− La mezcla de ambas por el desacoplamiento (para incrementar sensibilidad y reducir complejidad espectral) puede resultar en menor sensibilidad y en menor resolución.

Se podría aumentar la relación S/N si se detecta la señal de I acoplado al S (doblete)

Se simplificaría el espectro si se eliminase la componente con relajación más rápida).

Espectroscopia TROSY, que aprovecha la cancelación mutua de entre la relajación transversal debida a la CSA y al acoplamiento dipolo-dipolo.

TROSYTiempos de correlación largos

− Movimiento browniano modulación temporal de CSA y acoplamientos dipolares

Eficientes mecanismos de relajación

Campos magnéticos intensos

− Aumenta al CSA

− Acoplamiento dipolar constante

Cancelación entre los dos mecanismos de relajación

− 1H-15N óptimo a ~1000 MHz

− 1H-13C (aromaticos) óptimo a ~600 MHz

Interferencia constructiva o destructiva entrela relajación inducida por acoplamiento

dipolar (DD) y CSA

Tomado de Riek et al., (2006) Ann Rev Biochem Biophys Chem vol. 35. pp. 319-342)

TROSY: secuencia de pulsos

No se desacopla el espín I durante la evolución con la frecuencia del espín S en t1No se desacopla el espín S durante la detección del espín I en t2,

- Se observa el múltiplete de cuatro señales correspondiente al acoplamiento escala

TROSY: señales y selección

HSQCacoplado

HSQCdesacoplado

TROSY

DDIS + CSAS

DDIS - CSAS

DDIS + CSAI DDIS - CSAI

ωI

ωS

JIS

JIS

ISβ

SIα

ISα

SIβ

“Single transition to single transition polarization transfer” o “Spin state selective pol. trans.”

ST2-PT reemplaza al retro-INEPT de la secuencia HSQC, y determina una ruta de transferencia de coherencias que conecta cada una de las dos posibles transiciones del espín S con una (y sólo una) de las dos transiciones del espín I.

Se obtienen dos coherencias:

la componente TROSY, relajación transversal más lenta (señal estrecha)

la componente anti-TROSY, relajación más rápida (señal ancha).

Se separan como imágenes de cuadratura en la frecuencia del espín S y se filtra la componente anti-TROSY mediante el ciclo de fases de dos pasos

TROSY: secuencia de pulsos

TROSY

Proteína de 45 kDa a 750 MHz, 0.8mM, U-2H-15N, 25 °C

Tomado de Wider y Wüthrich (1999) Cur Opin Struc Biol, vol. 9, pp. 594-601

HMQC CRINEPT

τ = 1/(2JIS)

τ = óptimo para transferencia (acoplamiento escalar + relajación correlacionada cruzad

X

¿ HSQC o HMQC ?En general (tiempo de correlación τc > 13 ns) usar el experimento HSQC por su mayor resolución en la dimensión indirecta. Sin embargo:

− para moléculas pequeñas con pocas correlaciones la resolución o el ensanchamiento de la señal es menos importante que la pérdida de sensibilidad del HSQC y puede ser preferible registrar un HMQC,

− Considerar la capacidad del espectrómetro de dar pulsos de 180° sobre el heteronúcleosuficientemente cortos (el HMQC no los usa),

− Considerar si las calibraciones de los pulsos son correctas (el HMCQ es menos vulnerable)

Al aumentar el tiempo de correlación puede resultar provechoso registrar experimentos TROSY.

− En una proteína globular con un peso molecular > 25 kDa (en agua, a 25 °C, τc > 13 ns) puede compensar detectar la mitad de la señal seleccionando la componente más estrecha de 1H-13C, o 1H-15N en un experimento INEPT-TROSY

− Para moléculas con 13 ns < τc < 70 ns (entre 25 y 150 kDa), el experimento CRINEPT-HMQC-TROSY será más adecuado,

− Si la movilidad es aún menor (tc > 120 ns, peso molecular > 300 kDa) puede ser beneficioso registrar experimentos CRIPT-TROSY (efecto TROSY en los tres tiempos τ, t1 y t2 sin selección (la componente ancha se pierde por relajación).

HSQC y HMQC como módulos de experimentos 3D

INEPTRetro-INEPT

Tomado de la NMRGuide, de Teo Parella/Bruker

3D-1H-15N-HSQC-NOESY

HSQC-SE (incremento de sensibilidad)

IYcos(ωSt1) - 2IXSX sen(ωSt1)

IZcos(ωSt1) + 2IXSZ sen(ωSt1)

-IZcos(ωSt1) + IY sen(ωSt1)

La S/N puede aumentar hasta en un factor de √2

-Ixcos(ωSt1) + IYsen(ωSt1) / Ixcos(ωSt1) + IYsen(ωSt1)(φ1, φ3)

CT-HSQC (tiempo constante)

Eliminación de la estructura de multipletes del espín S en la dimensión indirecta debida a los acoplamientos homonucleares JSS´

Uso de un periodo constante de duración 2T durante el cual se combina la evolución con el desplazamiento químico del espín S y el reenfoque de los acoplamientos homonucleares.

• INEPT

• Detección inversa de heteronúcleos

• Criosondas– Detección directa– Mayor resolución en la dimensión

directa– metaloproteínas

• Polarización cruzada (CP)– Condición de Hartman-Hahn

• Detección directa de heteronúcleos– Fuertes acoplamientos diplares 1H-1H– MAS a velocidades > 40 kHz

• Detección inversa posible

Líquidos Sólidos

C´N-Líquidos

• The 2D CON-IPAP spectrum on 450 nmol, 7.2 mg uniformly 13C- and 15N-labeled SOD

• 600 MHz spectrometer equipped with a cryoprobe optimized for 13C detection at 298 K.

• Uniformly 13C- and 15N-labeled ubiquitin (22 nmolor 0.2 mg) microcrystals doped with 10 mM Cu-EDTA (time 2.7 h with recycle delays of 165 ms(1H T1 55 ms).

• 40 kHz spinning speed• 400 MHz

C´N-Sólidos

Tomado de Wermel et al., (2005)J Magn Res Vol. 178, pp. 56-64

Tomado de Wickaramasinghe et al., (2009)Nature Methods, Vol. 6, pp. 215-218.

FuentesJ.A. Gavín (2005) “Espectroscopia 2D de correlación heteronuclear”. En “Curso avanzado de RMN”. Texto de las lecciones del curso editado por O. Millet.

P.K. Mandal, A.Majumdar (2004) “A comprehensive discussion of HSQC and HMQC pulse sequences”.Concepts in Magnetic Resonance 20A, 1-23.

R. Riek, K. Pervushin, K Wüthrich (2000). “TROSY and CRINEPT: NMR with large molecular and supramolecularstructures in solution”. Trends Biochem Sci 25, 462-468.

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