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Contribuciones del Instituto Nacional de Investigaciones Nucleares al avance de la Ciencia

y la Tecnologa en Mxico

Edicin conmemorativa 2010

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Radiofrmacos: nanopartculas como sistemas multifuncionales para la obtencin in vivo de imgenes moleculares

Guillermina Ferro FloresDepartamento de Materiales Radiactivos

Flor de Mara Ramrez de la Cruz Departamento de Qumica

Blanca El Ocampo Garca,

Enrique Morales vila, Clara Leticia Santos Cuevas, Andrei N. Mendoza Snchez

Departamento de Materiales [email protected]

1. Introduccin

Las tcnicas de obtencin de imgenes moleculares, directa o indirectamente, detectan y registran la dis-tribucin espacio-temporal de procesos moleculares o celulares para aplicaciones bioqumicas, biolgi-cas, diagnsticas o teraputicas. Las tcnicas avanzadas de imagen como la resonancia magntica nuclear (MRI), la tomografa computarizada por emisin de fotn nico (SPECT), la tomografa por emisin de po-sitrones (PET) y la imgenes de fluorescencia ptica (OI) han sido exitosamente utilizadas para detectar dichos procesos.

Las nanopartculas pueden ser definidas como partculas de cualquier material que contienen de 20 a 15 000 tomos con dimensiones de 100 nm o menores y con caractersticas de superficie y propiedades fisicoqumicas propias que difieren de las que presenta el mismo material a macroescala. La utilidad de las nanopartculas para cualquier aplicacin es dependiente de dichas propiedades, siendo posible mo-dificar su superficie al hacerlas reaccionar con diferentes biomolculas lo que permite la formacin de conjugados con reconocimiento molecular especfico. La unin de varias molculas de protenas, pptidos u oligonucletidos a la superficie de una nanopartcula (NP) produce un sistema multifuncional capaz de incrementar las uniones multivalentes de las NP-biomolculas a sus receptores para la obtencin de im-genes moleculares in vivo.

Los pptidos estimulan, regulan o inhiben numerosas funciones de la vida, actuando principalmente como transmisores de informacin y coordinadores de actividades de varios tejidos en el organismo. Los receptores de pptidos reguladores estn sobreexpresados en numerosos tipos de clulas de cncer y son estructuras proteicas. Estos receptores han sido usados como blancos moleculares de pptidos marcados, para localizar tumores malignos primarios y sus metstasis, utilizando las tcnicas diagnsticas de imagen molecular mencionadas antes, las cuales consisten bsicamente en el uso de radiopptidos y de pptidos conjugados a fluorocromos1, a nanopartculas2 metlicas y a nanocristales (quantum dots) (figura 1).

1 Molcula que absorbe energa de una longitud de onda especfica y la emite a mayor longitud de onda (menor energa).2 Partculas con dimensiones de 100 nm o menores y con caractersticas propias que difieren de las que presenta el mismo ma-

terial a macroescala.

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G. Ferro Flores | F. M. Ramrez de la Cruz | B. E. Ocampo Garca | E. Morales vila | C. L. Santos Cuevas | A. N. Mendoza Snchez

2. Pptidosutilizadoscomoagentesdediagnsticoradiomarcados

Es bien conocido por la comunidad radiofarmacutica el uso de pptidos marcados con radionclidos para detectar tumores malignos (111In, 99mTc, 18F, 68Ga, 64Cu), as como para esquemas teraputicos (90Y, 177Lu, 188Re) en la prctica de la medicina nuclear molecular [1-5]. Por tanto, es posible identifi car de forma es-pecfi ca gastrinomas y cnceres de pncreas con pptidos anlogos de la somatostatina, cncer de mama con la bombesina, angiognesis in vivo con el cicloArg-Gly-Asp- (cRGD)3, procesos infecciosos de forma especfi ca con el pptido antimicrobiano ubiquicidina (UBI) y cncer de tiroides diferenciado con colecisto-quinina, por mencionar algunos ejemplos [6,7]. De importancia es el pptido HIV Tat(49-57) que, aunque no es un pptido regulador, penetra fcilmente la membrana celular acompaando siempre al virus del SIDA (HIV) y que, conjugado a diferentes frmacos, protenas, pptidos y nanopartculas, acta como un caba-llo de Troya pues incrementa de forma signifi cativa la internalizacin celular de los diferentes frmacos o biomolculas [8,9].

Figura 1. Ilustracin esquemtica de las mltiples modalidades para la imagen molecular in vivo de cncer

de mama con pptidos conjugados a nanocristales, nanopartculas metlicas, fl urocromos de infrarrojo cercano o radionclidos [2].

La acumulacin de los pptidos radiomarcados en los tumores podra potenciarse si decenas o cientos de stos se conjugan a nanopartculas de entre 5 y 20 nm para tomar ventaja del efecto de mejoramiento de la permeabilidad y retencin (EPR=enhanced permeation and retention effect). Es decir, por lo general en un tejido normal el espacio entre clulas del endotelio es de alrededor de 2 nm pero, cuando el tejido se vuelve maligno, acumula nutrientes de manera que dicho espacio puede aumentar hasta 400-600 nm; adems de que deja de funcionar la depuracin linftica, lo que facilita la acumulacin de macromolculas por un mecanismo pasivo. Si adems la macromolcula tiene en su superfi cie varias molculas radiomarcadas,

3 CicloArginina-Glicina-cido asprtico.

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Captulo 2. Radiofrmacos: nanopartculas como sistemas multifuncionales para la obtencin in vivo de imgenes moleculares

con reconocimiento especfico por receptores sobreexpresados en las clulas cancerosas, puede sumarse una acumulacin del radiofrmaco por un mecanismo celular activo. El sistema multifuncional de la na-nopartcula podra tambin conjugarse con un frmaco especfico y liberarse en el tumor (figura 2) [10,11].

Figura 2. Ventaja de los pptidos conjugados a nanopartculas como sistemas multifuncionales. Se aprovecha tanto el mecanismo activo como el pasivo para acumular el radiofrmaco en el tejido tumoral.

3. Pptidosparaimagenptica

La seal ptica de diversas biomolculas utilizada para diagnsticos por imagen puede mejorarse cuando dichas molculas se conjugan con nanopartculas metlicas. De particular inters es el desarrollo de conju-gados tipo nanopartculas-biomolculas que absorban y emitan fotones en la regin del infrarrojo cercano, tal como se ha reportado para las nanopartculas de oro y los nanocristales de CdTe o CdSe (Quatum Dots =QD), ya que podran detectarse eventos moleculares por rutas pticas en mayor profundidad del tejido biolgico y en tiempo real. La respuesta ptica de este tipo de conjugados en la regin del infrarrojo cerca-no (650 a 900 nm) se debe al bajo coeficiente de absorcin de la hemoglobina (absorbedor primario de luz visible), el agua y los lpidos (absorbedores primarios de luz infrarroja).

El desarrollo de agentes de contraste con reconocimiento especfico biomolecular y tamao de partcula nanomtrico, que le confiera al material propiedades pticas adecuadas para la obtencin de imgenes moleculares por fluorescencia, es un campo cientfico de inters ya que permitira generar tecnologas ti-les en el diagnstico y tratamiento de diversas enfermedades, a partir de blancos moleculares especficos.

Las tcnicas avanzadas de imgenes por fluorescencia, tales como la tomografa molecular por fluorescen-cia (FMT) y las Imgenes por reflactancia fluorescente (FRI) emplean longitudes de onda del infrarrojo cercano. Usando FMT se ha demostrado, en modelos murinos4, que es posible detectar cncer de mama y diferenciar si es o no invasivo empleando una proteasa especfica marcada con una sustancia fluorescente [12-14].

4 Ratones.

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En estudios recientes, se report un procedimiento detallado para la preparacin de QD-RGD (Quantum Dots-arginina-glicina-cido asprtico) [15], con el que fue posible obtener imgenes in vivo de tumores de gliobastoma humano en ratones. Young y Rozengurt [16] demostraron que los conjugados QD-bombesina pueden ser usados in vivo para detectar la expresin de receptores de protena G. Los QD conjugados al pptido HIV Tat, se unieron rpidamente a clulas y fueron internalizados va endocitosis [17].

Las nanopartculas de oro (AuNP) presentan un plasmn de resonancia5 con la luz incidente, son resis-tentes a la oxidacin y no son txicas [18]. Estas propiedades son relevantes para posibles aplicaciones en biodeteccin ptica, imagen celular y medicina teraputica fototrmica. Por ejemplo, el plasmn de reso-nancia para AuNP (20 nm) es de 520 nm, pero ste puede recorrerse a la regin del infrarrojo cercano (NIR) de 800 a 1200 nm. Esto es muy til porque, como se mencion anteriormente, el tejido humano es modera-damente transparente a la luz NIR. Las nanopartculas diseadas para absorber en el espectro NIR generan una cantidad de calor considerable que causa destruccin celular trmica irreversible [19]. El primer uso de las partculas de oro para terapia hipertrmica lo reportaron Hirsh y West en 2003 [19]. La irradiacin NIR aumenta la temperatura en el tejido entre 40 y 50 C, destruyendo selectivamente un tejido tumoral.

4. Pptidosparaimagenporresonanciamagnticanuclear(mri)

Las nanopartculas magnticas de xido de hierro conjugadas a dextrn (cross linked iron oxide, CLIO) y a bombesina, han demostrado ser tiles para visualizar tumores en un modelo murino de adenocarcinoma pancretico ductal por MRI [20]. Montet y cols. [21] prepararon nanopartculas de cRGD-CLIO(Cy5.5), es decir, aadieron un fluorocromo NIR (Cy5.5). Los resultados indicaron que las nanopartculas magneto-fluorescentes de RGD se unieron a clulas tumorales que expresaban

v

36 in vivo y fueron detectadas por

tomografa molecular por fluorescencia, MRI y reflactancia fluorescente.

5. Usodenanopartculasdeoroparaeldiseoderadiofrmacosenelinstitutonacionaldeinvestigacionesnucleares

Las AuNP (Au0) son cidos dbiles y tienden a formar enlaces de carcter covalente con bases dbiles como los grupos -tiol, adems de enlaces moderadamente fuertes con grupos amina. Los residuos de cistena (C) y lisina (K) representan al nico ligante con el cual las protenas se pueden unir a las AuNP, para formar mo-lculas con actividad biolgica. Muchas de las aplicaciones mdicas de las AuNP requieren de la unin con ligantes en sus superficies, ya sea de forma nica o combinando distintas molculas funcionales, aunque, para las AuNP solas se ha reportado que producen un efecto antiangiognico [22]. Es importante mencio-nar que cuando las nanopartculas logran ser cubiertas en su superficie por biomolculas naturales como los pptidos funcionales o sus anlogos, stas pueden parecer invisibles al sistema inmune, ya que no las reconoce como extraas al organismo.

Bsicamente, el trabajo en Mxico ha girado en torno a la hiptesis de que la unin de varias mol-culas de RGD-SH o bombesina a nanopartculas de oro (AuNP) marcadas con 99mTc, producir un sistema heterofuncional capaz de incrementar las uniones multivalentes de las AuNPpptido a sus receptores, para la obtencin de imgenes moleculares in vivo de angiognesis y la sobre-expresin del pptido libe-rador de gastrina en cncer de mama. La conjugacin de octretido a las AuNP, les confiri propiedades fluorescentes de inters para la imagen ptica, tal como la emisin a 692 nm [23, 24].

5 Oscilacin coherente de electrones en la banda de conduccin inducidos por la interaccin con campos magnticos que resulta en una banda intensa de absorcin y es caracterstica del tipo de material, tamao, distribucin de tamao y forma.

6 Biomarcador de angiognesis (formacin de nuevos vasos sanguneos)

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Un caso especial ha sido conjugar manosa a AuNP para la deteccin del ganglio centinela, ya que los macrfagos tienen mltiples receptores de manosa. El objetivo de este trabajo fue preparar un sistema multifunctional de nanopartculas de oro conjugadas a HYNIC-GGC7/manosa y marcadas con 99mTc para evaluar su potencial biolgico en la identifi cacin por imagen molecular del ganglio centinela en pacientes con cncer de mama.

Las nanopartculas de oro (AuNP, 20 nm), el pptido hidrazinonicotinamida-Gly-Gly-Cys-NH2 (HYNIC-GGC) y

el derivado tiol-triazol-manosa fueron sintetizados para preparar el sistema HYNIC-GGC-AuNP-manosa, por me-dio de la reaccin espontnea del tiol (Cys) presente en la secuencia HYNIC-GGC y en el derivado tiol-manosa, con la superfi cie de la AuNP (fi gura 3). El nanoconjugado fue caracterizado por microscopia de transmisin de electrones (TEM) y las espectroscopas de emisin de fotoelectrones por rayos X (XPS), UVVis, Raman e in-frarrojo. El marcado con tecnecio-99m se realiz utilizando EDDA/tricina como coligantes y SnCl

2 como agente

reductor. Los estudios de biodistribucin se realizaron en ratones Balb-C y en ratas Wistar [25].

Figura 3. Representacin esquemtica de la preparacin del sistema multifuncional 99mTc-EDDA/HYNIC-GGC-AuNP- manosa para la deteccin del ganglio centinela.

Los anlisis por cromatografa de alta efi ciencia con exclusin molecular (HPLC-SE) y por cromatografa en capa fi na instantnea (ITLC-SG) indicaron una pureza radioqumica mayor al 95% para las nanopartculas conjugadas radiomarcadas. Despus de una hora postadministracin subcutnea del 99mTc-EDDA/HYNIC-GGC-AuNP-manosa en el cojinete plantar de los ratones, los niveles de radiactividad en el ganglio poplteo y lumbar mostraron que el 90% de la actividad fue extrada por el primer ganglio (extraccin popltea = 90%). Los estudios de biodistribucin y las imgenes in vivo obtenidas con el micro-SPECT/CT mostraron una evidente captacin en el ganglio linftico (8.37 2.8% A.I.8 a dos horas) con alta retencin durante 24 horas, mnima acumulacin renal (0.59 0.09% A.I./g) y nula captacin en el resto de los tejidos (fi gura 4). En conclusin, las nanopartculas de oro conjugadas a manosa y marcadas con tecnecio99m muestran

7 H2N-Cistena-Glicina-Glicina-Hidrazinonicotinamida.

8 Actividad inyectada.

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potencial como nuevos y especficos nanorradiofrmacos, para la identificacin del ganglio centinela por tcnicas de medicina nuclear molecular [25].

Figura 4. Imagen en micro-SPECT/CT del 99mTc-EDDA/HYNIC-GGC-AuNP-Manosa en el ganglio linftico de una rata Wistar dos h despus de la administracin del radiofrmaco.

Entre otros trabajos tambin puede mencionarse la preparacin de AuNP conjugadas al pptido RGD (de-teccin de angiognesis in vivo) y a la bombesina (deteccin de cncer de mama en etapa temprana) mar-cadas con Tc99m, como sistemas multifuncionales con reconocimiento multivalente [26-28].

6. Perspectivas:tcnicasmultimodalesparaimagen

Las imgenes para detectar blancos moleculares especficos representan el futuro de la imagen diagnsti-ca. Las diferentes tcnicas de imagen son en general complementarias ms que competitivas. El marcado dual de agentes especficos para imgenes permite la validacin cruzada y comparacin directa entre, por ejemplo, la imagen nuclear (estndar de oro) y la imagen ptica por fluorescencia, o MRI y fluorescencia o la trimodal nuclear-MRI-fluorescencia.

En esta direccin encontramos en la literatura investigaciones recientes como la modalidad dual PET/NIR con un pptido fluorescente reportada por Cai y cols. [29]. Ellos utilizaron un QD conjugado a RGD9 (90 pptidos por QD) y al cido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-N,N,N,N-tetraactico (DOTA) para preparar el radiofrmaco 64Cu-DOTA-QD-RGD e identificar por imagen in vivo PET/NIRF la integrina

v

3 en glioblasto-

mas humanos U87MG en un modelo murino. Obtuvieron una excelente correlacin del sistema dual. La sntesis y caracterizacin in vivo de nanopartculas de xido de hierro radiomarcadas, 18F-CLIO, fueron

reportadas por Devaraj y cols. [30]. La funcionalizacin con el radionclido se realiz utilizando la qumica click10. Estas nanopartculas se utilizaron para detectar el ganglio centinela (~1 mm) por imagen PET/MRI

9 ArgininaGlicinacido Asprtico (RGD).10 Reaccin de cicloadicin-1,3 de alquinos terminales a azidas catalizada por Cu(I) para formar 1,2,3 triazoles 1,4 disustituidos.

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con informacin anatmica precisa. Asimismo, Bhushan y cols. [31] desarrollaron un sistema para la detec-cin de microcalcificaciones en cncer de mama utilizando la modalidad dual SPECT/NIR.

Varias estrategias que emplean nanopartculas conjugadas a pptidos, para tcnicas de imagen multi-modal, estn evolucionando rpidamente hacia la aplicacin clnica. Las principales reas de investigacin estn enfocadas a sistemas moleculares funcionales especficos, apoyados por las nuevas capacidades tecnolgicas de fusin de imgenes.

En la terapia del cncer es importante tener en la mente que la bala mgica no existe y que, con la finalidad de incrementar la respuesta teraputica, la aplicacin de terapias combinadas es necesaria. Las nanopartculas de oro radiomarcadas y conjugadas a pptidos como por ejemplo 177Lu-DOTA-Gly-Gly-Cys-AuNP-Lys3-bombesina (10 nm), podra representar un radiofrmaco de reconocimiento a un blanco molecu-lar especfico multifuncional que, administrado como un solo frmaco, sera capaz de actuar para imagen molecular y como un sistema de terapia combinada: radioterapia dirigida, terapia fototrmica, inhibicin de la angiognesis e induccin de apoptosis en cncer de mama y prstata [24].

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