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MÉTODOS ALTERNATIVOS PARA LA GENERACIÓN DE COLECCIONES

ESTRATÉGICAS EN BIOBANCO

Jiménez A.1, Martínez B.1, Díaz T.1,Ferro P.1 Ortega-Pinazo J.2, Acosta-Andrade C. 1 and Hortas M.L.3

1. Andalusian Public Health System Biobank, Instituto de Investigación Biomédica de Málaga

(IBIMA), Sanitary Distric of Málaga, University of Málaga.

2. Neurology Service, Instituto de Investigación Biomédica de Málaga (IBIMA), Sanitary Distric of

Málaga, University of Málaga.

3. Costa del Sol Sanitary Agency, Sanitary District of Málaga.Congreso Nacional Laboratorio Clínico

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CONTENIDO

1.Introducción

2.Objetivos

3.Material y métodos

4.Resultados

5.Conclusiones

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1. INTRODUCCIÓN

-¿Qué son los biobancos?

- ¿Por qué surgen?

-¿Qué requisitos deben cumplir?

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1. INTRODUCCIÓN

1.1.- Dificultad para crear determinadas

colecciones: niños, ancianos…

1.2.- Coste almacenamiento a largo plazo

Coagulo como fuente de ADN

-BBSSPA: 800.000 muestras catalogadas

-Nodo Provincial Málaga: Año 2017 52.328 biorecursos almacenados y aprox. 40.000 cedidos

-Generación de colecciones estratégicas

Excedente de diagnostico clínico:

1.1.- Dificultad para crear determinadas

colecciones: niños, ancianos…

1.2.- Coste almacenamiento a largo plazo

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2. OBJETIVOS

1.- Evaluar la obtención de ácidos nucleicos desde

coágulos como matriz alternativa a la sangre periférica

para poder aprovechar muestras procedentes del

laboratorio asistencial, sobre todo en aquellos casos en

los que el volumen de sangre es limitante en la

extracción.

2.- Desarrollar un protocolo de extracción de ácidos

nucleicos desde coágulo y sangre periférica incluida en

parafina como posible alternativas de almacenaje a RT.

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- Rendimiento

- Pureza

- Integridad

- Funcionalidad

3. MATERIAL Y MÉTODOS

En este estudio se extrajo sangre por venopunción a 20 voluntarios sanos.

- Coágulo

- Sangre Total

- Sangre Total Parafinada

- Sangre Total Congelada OCT

- Coágulo

- Coágulo Parafinado

- Coágulo Congelado OCT

Obtención ADN

Nota: El ADN del se extrajo utilizando Gentra Puregene Blood Kit (QIAGEN).La calidad del ADN extraído se comparó mediante espectrofotometría

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4. RESULTADOS

NanoDrop Ratio

260/280

P-value

SANGRE TOTAL 266,84 ng/µl ± 97,59 1,96 ± 0,01

COAG NO GEL 242,28 ng/µl ± 193,62 1,75 ± 0,15 0,82

COAG GEL 151,98 ng/µl ± 63,18 1,76 ± 0,12 0,05*

COAG GEL CONG 112,7 ng/µl ± 5,66 1,78 ± 0,02 0,05*

CASO 1.- Concentración de ADN (Media±DS) obtenida desde sangre total, sangre coagulada (COAG) sin gel, sangre

coagulada con gel y sangre coagulada con gel congelado durante 3 meses a -80 ºC y cuantificada mediante espectrofotometría

(Nanodrop). Gel de agarosa para valorar integridad y funcionalidad.

*Los valores medios

obtenidos de 20

voluntarios. Niveles de

significancia comparados

con sangre total: * 0.01 <

p ≤ 0.05 (t´student test).

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4. RESULTADOS

CASO 2.- Concentración de ADN (Media±DS) obtenida desde muestras parafinadas procedentes de sangre coagulada

fijada en ácido acético (COAG AC), sangre coagulada fijada en formol (COAG F), plug de sangre total fijado en ácido acético

(ST AC) y plug de sangre total fijado en formol (ST F) y cuantificada mediante espectrofotometría (Nanodrop)y fluorometría

(PicoGreen). Gel de agarosa para valorar integridad y funcionalidad.

*valores medios obtenidos

de 20 voluntarios. Niveles de

significancia comparados

con sangre fijada en AC: *

0.01 < p ≤ 0.05, ** 0.001 < p

≤ 0.01, and ***p ≤ 0.001

(t´student test).

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4. RESULTADOS

CASO 3.- Concentración de ADN (Media±DS) obtenida desde muestras congeladas de sangre

coagulada (CONG OCT), sangre total (ST OCT) congelados en OCT y sangre coagulada congelada

(COAG CONG) y cuantificada mediante espectrofotometría (Nanodrop) y fluorometría(PicoGreen).

Gel de agarosa para valorar integridad y funcionalidad.

*Se muestran los valores medios

obtenidos de 20 voluntarios.

Niveles de significancia

comparados con sangre coagulada

cong.: * 0.01 < p ≤ 0.05, ** 0.001 <

p ≤ 0.01, and ***p ≤ 0.001 (tstudent

test).

NANODROP RATIO 260/280

PICOGREEN P-VALUE

COAG CONG 112,7 ng/µl ± 5,66 1,78 ± 0,02 -

COAG OCT 2,88 ng/µl ± 1,31 1,67 ± 0,15 1,67 ng/µl ± 0,8 2,95E-10***

ST OCT 3,08 ng/µl ± 1,12 2,01 ± 0,22 1,97 ng/µl ± 0,51 2,91E-8***

*

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5. CONCLUSIONES

1.- La extracción de ácidos nucleicos desde sangre coagulada presenta una buen

rendimiento, pureza e integridad, aunque algo menor que en sangre total. La extracción en

esta matriz se ve alterada por la presencia de gel en los tubos de recolección.

2.- El proceso de congelación de la sangre coagulada no altera el proceso de extracción

de los ácidos nucleicos extraídos ni sus características, por lo que se plantea como una

alternativa para aprovechar las muestras biológicas desechadas en el circuito asistencial que

podrían ayudar a crear colecciones estratégicas en biobancos para determinas patologías o

grupos de población.

3.- La congelación de sangre en OCT muestra que este compuesto altera

significativamente la posibilidad de obtener ácidos nucleicos con un buen rendimiento y

calidad, por lo que no es un buen método para poder almacenar la sangre coagulada en frío.

4.- Se trata de un estudio piloto que debe ser ampliado, aumentando el número de

muestras de partida, utilizando long PCR en el análisis de los ácidos nucleicos obtenidos y

extrayendo más tipos de muestras útiles para la investigación biomédica

Los resultados obtenidos mostraron que:

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