Compuestos enjaulados con absorción a longitud de onda larga
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Universidad de Buenos Aires Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Departamento de Química Inorgánica, Analítica y Química Física Compuestos enjaulados con absorción a longitud de onda larga Tesis presentada para optar por el título de Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Química Inorgánica, Química Analítica y Química Física Lic. Yeraldith Rojas Pérez. Director de Tesis: Dr. Roberto Etchenique Consejero de Estudios: Dra. María G. Lagorio Lugar de Trabajo: INQUIMAE / DQIAyQF, FCEyN, UBA Buenos Aires, Marzo 2020.
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Universidad de Buenos Aires
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Departamento de Química Inorgánica, Analítica y Química Física
Compuestos enjaulados con absorción a
longitud de onda larga
Tesis presentada para optar por el título de Doctor de la Universidad de
Buenos Aires en el área de Química Inorgánica, Química Analítica y Química
Física
Lic. Yeraldith Rojas Pérez.
Director de Tesis: Dr. Roberto Etchenique
Consejero de Estudios: Dra. María G. Lagorio
Lugar de Trabajo: INQUIMAE / DQIAyQF, FCEyN, UBA
Buenos Aires, Marzo 2020.
A mi mamá.
iv
v
Resumen
Puede considerarse el uso de la luz como actor primordial en los avances más
recientes en neurociencias y biología. En efecto, la aplicación de técnicas
ópticas ofrece un control espacial y temporal de los procesos biológicos
sometidos a estudio de forma muy precisa y poco invasiva. El uso de la luz
como estímulo condicional ha fomentado el desarrollo de dispositivos
moleculares unidos covalentemente a moléculas de interés biológico. Estos
“compuestos enjaulados” al ser irradiados permiten la liberación de la
molécula de interés, y por ende la activación del proceso en observación. Entre
las herramientas químicas de fotoliberación hoy más usadas se encuentran
los complejos de coordinación de rutenio-bipiridina que presentan
propiedades únicas, una de ellas, la activación con luz visible.
Continuando con el estudio de estas tecnologías de liberación, el trabajo de
investigación se centró en la síntesis, caracterización, estudios fotoquímicos y
aplicabilidad biológica de compuestos de coordinación basados en la
fotoquímica de los complejos de [Ru(bpy)2(PMe3)L]n+, donde L es la molécula a
fotoliberar. En primer lugar, se ha logrado la manipulación óptica de la
activación de la respuesta alimentaria en Hydra vulgaris al liberar L-arginina.
De igual forma, se describe el desarrollo y aplicaciones del complejo cis-
[Ru(bpy)2(PMe3)(Norepinefrina)]2+ para sondear circuitos neuronales
noradrenérgicos en neuronas del Locus coeruleus, y de cis-[Ru(bpy)2(PMe3)(D-
Ser)]2+ para ser utilizado en investigaciones sobre bases fisiológicas de la
esquizofrenia.
Por otra parte, se realizó un estudio sistemático de la interconversión
fotoquímica entre los isómeros cis- y trans-[Ru(bpy)2(PMe3)(OH2)]2+, por
métodos experimentales y simulaciones computacionales (DFT / TDDFT)
demostrando que el isómero trans-[Ru(bpy)2(PMe3)(OH2)]2+ puede ser
considerado una nueva plataforma para el diseño y síntesis de nuevos
compuestos enjaulados de alta eficiencia de fotoliberación.
Palabras clave: Rutenio-bipiridina, respuesta alimentaria, Hydra vulgaris,
fotoliberación, norepinefrina, fotoisomerización, arginina.
vi
Abstract
Using light can be considered as the main actor in most recent advances in
the neuroscience and biology field. The application of optical techniques offers
a spatial-temporal control of the biological processes in a precise and non-
invasive way. Indeed, the use of light as a conditional stimulus has promoted
the development of molecular devices covalently bound to biologically active
molecules. Caged compounds release the molecule when are exposed to light.
Therefore, occurs the activation of the process under observation. Actually,
the chemical tools most used to photorelease are ruthenium-bipyridine
complexes. They are considered excellent phototriggers because they uncage
the biological molecule with visible light.
Continuing with the study of these photorelease technologies, the research
work focused on the synthesis, characterization, photochemical studies and
biological applicability of coordination compounds based on the
photochemistry of the [Ru(bpy)2(PMe3)(L)]n+ complexes, where L is the molecule
to release. First, optical manipulation of the activation of feeding response in
Hydra vulgaris has been achieved by releasing L-arginine. Likewise, we
showed the development and applications of the cis-
[Ru(bpy)2(PMe3)(Norepinephrine)]2+ and cis-[Ru(bpy)2(PMe3)(D-Ser)]2+
complexes. The first complex was used to probe noradrenergic neuronal
circuits in Locus coeruleus neurons. And, the last one is used in the research
about the physiological basis of schizophrenia.
On the other hand, a systematic study of the photochemical interconversion
between the cis- and trans-[Ru(bpy)2(PMe3)(OH2)]2+ isomers was carried out by
experimental methods and computational simulations (DFT / TDDFT). These
results demonstrate the trans-[Ru(bpy)2(PMe3)(OH2)]2+ isomer can be
considered a new platform for the design and synthesis of new caged
compounds with high photorelease efficiency.
Keywords: Ruthenium-bipyridine complexes, feeding response, Hydra
vulgaris, photorelease, norepinephrine, D-serine, photoisomerization, L-
arginine
vii
Indice general
Resumen ............................................................................................... v
Abstract ............................................................................................... vi
Capítulo 1. ........................................................................................... 1
Bases Teóricas. .................................................................................... 1
1.1 Introducción .......................................................................................... 1
1.2 Compuestos enjaulados. ........................................................................ 3
1.3 Compuestos de coordinación como grupos fotoactivables. ...................... 5
1.4 Características químicas de los compuestos fotoactivables de la forma
[Ru(bpy)2(PMe3)(L)]2+..................................................................................... 7
1.5 Fotoquímica en el estado excitado de la transición MLCT para complejos
Ru-bpy. ..................................................................................................... 11
1.6 Parámetros dependientes del máximo de absorción de la transición 1MLCT.
................................................................................................................. 13
1.7 Aplicaciones a sistemas biológicos. ...................................................... 15
1.8 Estructura de la tesis........................................................................... 17
Capítulo 2. ......................................................................................... 19
Materiales y Métodos ......................................................................... 19
2.1 Síntesis de los complejos precursores: Consideraciones generales ........ 19
2.1.1 Síntesis del cis-[Ru(bpy)2(PMe3)(Cl)]Cl ................................................ 19
2.1.2 Síntesis del cis-[Ru(bpy)2(PMe3)(OH2)](CH3SO3)2 ................................. 20
2.2 Cristalización ....................................................................................... 21
2.3 Instrumentación .................................................................................. 22
2.3.1 Espectroscopia ultravioleta-visible (UV/vis) ....................................... 22
2.3.2 Espectroscopia de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) ................... 22
2.3.3 Espectrometría de Masas .................................................................. 23
2.3.4 Difracción de Rayos X de monocristal. .............................................. 23
2.4 Determinación de los rendimientos cuánticos de fotoliberación de los
compuestos fotoactivables. ........................................................................ 24
2.5 Cálculos computacionales. ................................................................... 27
Capítulo 3. ......................................................................................... 31
viii
Manipulación óptica de la respuesta alimentaria en Hydra vulgaris. .. 31
3.1 Introducción ........................................................................................ 31
3.1.1 Hydra, un modelo fisiólogico muy económico .................................... 31
3.1.2 Respuesta alimentaria de la hidra. .................................................... 32
3.2 Parte Experimental .............................................................................. 33
3.2.1 Síntesis............................................................................................. 33
3.2.2 Modelos fisiológicos utilizados ........................................................... 35
3.3 Resultados ........................................................................................... 37
3.3.1 Síntesis............................................................................................. 37
3.3.2 Caracterización fotoquímica del complejo cis-[Ru(bpy)2(PMe3)(Arg)](PF6)2
................................................................................................................. 39
3.3.3 Caracterizació química del complejo cis-[Ru(bpy)2(PMe3)(Arg)](PF6)2 ... 39
3.3.4 Fotoliberación de arginina en Hydra vulgaris in vivo. ......................... 42
3.3.5 Análisis del sistema de irradiación .................................................... 50
3.4 Conclusiones ....................................................................................... 52
Capítulo 4. ......................................................................................... 53
Norepinefrina fotoactivable para sondear circuitos neuronales
adrenérgicos ...................................................................................... 53
4.1 Introducción ........................................................................................ 53
4.1.2 D- serina. ......................................................................................... 53
4.1.3 Norepinefrina: ................................................................................... 54
4.2 Parte Experimental .............................................................................. 56
4.2.1 Síntesis............................................................................................. 56
4.2.2 Modelos fisiológicos utilizados ........................................................... 58
4.3 Resultados ........................................................................................... 59
4.3.1 Síntesis............................................................................................. 59
4.3.2 Caracterización química. ................................................................... 61
4.4 Conclusiones. ...................................................................................... 72
Capítulo 5. ......................................................................................... 73
Interconversión cis-trans en complejos de Rutenio(II) Bipiridina........ 73
5.1 Introducción ........................................................................................ 73
5.2 Parte Experimental .............................................................................. 74
5.2.1 Síntesis............................................................................................. 74
5.3 Resultados. .......................................................................................... 80
5.3.1 Síntesis y caracterización de los complejos acuo. .............................. 80
ix
5.3.2 Propiedades fotoquímicas .................................................................. 84
5.3.3 Conversión térmica de la especie trans- a cis-[Ru(bpy)2(PMe3)(OH2)]2+ 87
5.3.4 Mecanismo de interconversión en el estado excitado. ........................ 89
5.3.5 Aplicaciones sintéticas ...................................................................... 91
5.4 Conclusiones ..................................................................................... 102
Capítulo 6. ........................................................................................ 105
Conclusiones generales ..................................................................... 105
Referencias ....................................................................................... 107
Anexo 1 ............................................................................................ 121
Datos complementarios de caracterización estructurales de los
complejos. ........................................................................................ 121
Anexo 2. ........................................................................................... 136
Trabajos Publicados .......................................................................... 136
Agradecimientos. .............................................................................. 137
1
Capítulo 1.
Bases Teóricas.
1.1 Introducción
Los fármacos potentes y selectivos son herramientas esenciales en medicina
clínica. Al estudiar la estructura nativa y la función de las proteínas blanco,
los investigadores se esfuerzan por diseñar moléculas que sean capaces de
interactuar y perturbar su actividad, para lograr efectos terapéuticos en el
paciente. El diseño de medicamentos está focalizado en obtener moléculas con
elevada eficacia y seguridad. Este enfoque ha ayudado a construir el
impresionante catálogo de medicamentos que tenemos en el mercado hoy en
día. Sin embargo, existe una seria limitación en la farmacoterapia tradicional;
después de distribuir el compuesto, no hay forma de regular cuándo y dónde
es activa la molécula; el control sobre ese agente esencialmente se pierde.1
Esta falta de control combinada con la —a menudo— baja selectividad del
objetivo, con frecuencia conduce a efectos adversos.2 Esto es particularmente
reconocible en tratamientos terapéuticos agresivos como la quimioterapia. Por
estas razones, la farmacoterapia apunta hoy en día al diseño de medicamentos
que permitan ser activados de forma controlada y sólo en el tejido enfermo.
Este enfoque está direccionado a un fotocontrol de la activación del
medicamento, de manera de tener un efecto local y por ende más eficiente y
seguro. Esta idea se ilustra en la figura 1.1
2
Figura 1.1 Comparación entre la farmacoterapia tradicional y un enfoque
fotocontrolado. Panel Izquierdo: en el enfoque tradicional, el medicamento
administrado (color rojo) debido a su poca selectividad también interactúa con otras
áreas distintas al objetivo, lo que provoca efectos secundarios generalmente adversos.
Panel derecho: en este enfoque controlado por luz, el fármaco es diseñado para que
esté inactivo en la forma administrada (color verde). Al exponer a la luz el área del
objetivo, el fármaco se activa (color rojo) y ejerce su acción de forma localizada.
En otros campos, el análisis de procesos neurológicos tales como los
mecanismos de acción y evolución temporal de receptores, agonistas,
antagonistas y transportadores requiere de un cambio rápido y determinado
en la concentración de estas moléculas. Comprender procesos biológicos de
señalización, interacciones proteína-proteína, proteína-ligando, elucidación
de circuitos neuronales, entre otros, requieren la capacidad de determinar con
precisión dónde, cuándo y en qué medida varían las concentraciones de las
especies involucradas, o cuándo se inicia o detiene un proceso. Por lo tanto,
es deseable contar con un agente externo de control. La luz, en ciertas
2) Bio-distribución 2) Bio-distribución
4) Efecto
Local
3) Fotoactivación
3) Efecto
Local
1) Administración 1) Administración
3
condiciones, representa ese elemento de control externo ideal, ya que la
irradiación de luz es una técnica poco invasiva, selectiva y permite un control
espacial y temporal de ciertos procesos.
A raíz del uso de la luz como estímulo condicional y de técnicas instrumentales
que permiten monitorear procesos en estudio, surgió el desarrollo de una clase
de sustancias que modifican la concentración de las moléculas bioactivas en
el sistema celular de forma controlada. Estos compuestos contienen la
molécula de interés y la liberan cuando reciben un estímulo lumínico
adecuado. Históricamente a estas moléculas se las ha llamado compuestos
enjaulados.
1.2 Compuestos enjaulados.
Los compuestos enjaulados son dispositivos moleculares que están
conformados por dos fragmentos: un grupo protector (la “jaula”) y una
molécula de interés biológico (ligando) que no tiene actividad mientras está
“enjaulada”. El compuesto al ser irradiado con luz, libera el fragmento
enjaulado y este puede interactuar con los receptores celulares3 (Figura 1.2).
Esta capacidad de liberar una molécula con localización temporal y espacial
también permite la aplicación muy selectiva de un fármaco (previamente
enjaulado) en células, grupos de células o tejidos determinados, lo cual es una
posibilidad muy interesante en medicina y farmacología. Una idea errónea
(pero común) con respecto a la terminología es que "enjaulado" implica un
confinamiento geométrico de la molécula activa, por ejemplo, en complejos de
inclusión en forma de jaula. Esto, sin embargo, normalmente no es así, la
molécula bioactiva y el grupo protector se encuentran generalmente unidos a
través de un enlace covalente. Por otra parte, a lo largo de este trabajo se
encontrarán los términos actuadores moleculares, compuestos fotoactivables,
grupo protector fotoactivo, dispositivo molecular y fotoliberador. Todas estas
denominaciones están referidas también al compuesto enjaulado.
4
Figura 1.2 Forma de acción de un complejo enjaulado: la molécula bioactiva
(cuadrado m —por molécula—) está unida al grupo protector (hexágono j —por
jaula—) y es liberada luego de irradiar el compuesto con luz y así interactuar con el
receptor biológico.
La activación de funciones biológicas utilizando compuestos enjaulados fue
reportada por primera vez por Kaplan et al.4 en 1978. Los experimentos
realizados consistían en la fotoactivación de la enzima Na,K-ATPasa al
fotoliberar ATP. El esquema se muestra en la figura 1.3.
Figura 1.3 Fotoliberación de una molécula de ATP enjaulada.
Gracias a este trabajo se sentaron las bases para el uso de estas sustancias
en preparaciones biológicas.5–7 El área que quizás más ha explotado la
versatilidad de estos compuestos ha sido la neurobiología.8,9 Un logro
importante fue enjaular Inositol 1,4,5-trifosfato (IP3), mensajero intracelular
que media la respuesta de numerosos neurotransmisores y hormonas10 en la
década de los 90. Otro ejemplo exitoso fue la fotoliberación localizada del
neurotransmisor glutamato que permitió estudiar los circuitos en cortes
cerebrales de mamíferos.11,12 Hoy en día existe un amplio espectro de
compuestos fotoliberadores de moléculas bioactivas: ácido γ-aminobutírico
5
(GABA)13, —neurotransmisor inhibitorio del sistema nervioso—,iones14,
ácidos15, péptidos16–18, inductores de genes19, oligonucleótidos20–22 y otros
aminoácidos neuroactivos.23
La mayoría de estos compuestos están basados en la fotoquímica del 2-
nitrobencilo, 2-nitrofenetilo, nitroindonilil24 y sus derivados como grupos
protectores fotolábiles. Por lo tanto, para promover la liberación de la molécula
bioactiva se debe irradiar la muestra con luz ultravioleta, lo cual resulta
indeseable debido a que se compromete la integridad de los sistemas celulares
en estudio. Adicionalmente, a menudo, estos compuestos son inestables en
medios acuosos, muchos se descomponen y presentan actividad biológica
antes de recibir el estímulo lumínico.
Un compuesto fotoactivable ideal debe reunir las siguientes características:
1. El compuesto enjaulado debe ser soluble y estable en condiciones
fisiológicas.
2. Presentar absorción a longitudes de onda mayores a los 400 nm para evitar
el uso de luz de alta energía que puede ocasionar daño celular.
3. Debe poseer un elevado coeficiente de absortividad para una fotoactivación
eficiente.
4. Es necesario que un importante porcentaje de moléculas que se
encuentran en el estado excitado experimenten la ruptura del enlace de
unión entre el grupo protector y la molécula enjaulada. Esta característica
se conoce como rendimiento cuántico de liberación o eficiencia de
fotoliberación (lib).
5. La reacción de fotólisis debe ser rápida. Como productos de reacción se
debe generar la molécula enjaulada y residuos no tóxicos para el sistema
a estimular.
1.3 Compuestos de coordinación como grupos fotoactivables.
La actividad biológica de las moléculas de interés puede controlarse mediante
la coordinación a un metal de transición. Esta jaula de base inorgánica
cumple la misma función que en los compuestos enjaulados tradicionales, por
6
lo tanto, el centro metálico puede verse como un grupo protector para evitar
la interacción de la molécula bioactiva con su objetivo biológico (Figura 1.4).
Figura 1.4 Concepto general de una molécula bioactiva (B) coordinada a un metal de
transición para dar un compuesto inerte. Una vez que ocurre la ruptura del enlace
fotolábil queda un sitio de coordinación vacío que puede ser ocupado por el solvente.
El uso de complejos metálicos como grupos protectores fotolábiles hasta ahora
ha girado en torno a compuestos de rutenio que contienen ligandos
polipiridínicos, con uno o más sitios de coordinación ocupados por la
biomolécula. La principal ventaja que presentan es que absorben en la región
visible del espectro y por lo tanto, no se necesita trabajar con luz de alta
energía para provocar la liberación. Además ofrecen estabilidad frente a
descomposición térmica y alta eficiencia de sustitución de ligandos.
Nuestro grupo de investigación fue pionero en la aplicación de complejos
polipiridínicos de rutenio como compuestos fotoactivables. El primer
compuesto enjaulado en base a rutenio-bipiridina Ru(bpy) fue el
[Ru(bpy)2(4AP)](Cl)2 que libera 4-aminopiridina, bloqueante de canales de K+ y
promueve un aumento de la actividad neuronal. Fue testeado en neuronas
Retzius de sanguijuelas Hirudo medicinalis.25 Posteriormente se desarrollaron
los fotoliberadores de ácido γ-aminobutírico (GABA)26–28 y glutamato29, los
cuales son los neurotransmisores inhibitorio y excitario más ubícuos del
sistema nervioso central, respectivamente. Además de ser activados con luz
visible presentan buena eficiencia de fotoliberación respecto de fotoliberadores
análogos.30,31 En la actualidad se tienen compuestos enjaulados Ru(bpy) de
Nicotina32, Serotonina33, Dopamina34, etc. Varios de estos compuestos son
comercializados35 con fines de investigación.
Compuesto
fotoactivable Fotoproductos Compuesto
Coordinación
7
El grupo de investigación de Turro36 sintetizó dispositivos fotoactivables
basados en Ru(II)-bpy para suministrar cisteína proteasa e inhibidores del
citocromo P450, con el fin de lograr un control selectivo en la inhibición
enzimática. Asimismo, muestra que tanto los cores Ru(bpy)2 como Ru(tpy)
(rutenio coordinando una molécula de terpiridina) pueden usarse para
enjaular 5- cianouracilo (5-CNU), un agente citotóxico que inhibe el
catabolismo de pirimidinas in vivo37,38, propuesto como fotosensibilizador en
terapia fotodinámica (PTD). Sadler et al. reportaron la síntesis de un
compuesto antituberculoso para inhibir infecciones microbacteriales.39 El
grupo de Renfrew usó Ru(phen)2 (phen= 1, 10 fenatrolina) para liberar el
antifúngico econazol y mostró que el complejo no solo libera selectivamente
ligandos de econazol tras la irradiación de luz sino que también exhibe una
fuerte luminiscencia para la visualización de células in vivo.40 Bonnet et al.41,42
desarrollaron complejos de RuII-bpy para ser utilizados como agentes
quimioterapeúticos en PACT (quimioterapia fotoactiva). Esta es un área nueva
en la que se está aprovechando las propiedades fotoquímicas que presentan
los complejos polipiridínicos de rutenio. El desarrollo de compuestos
fotoactivables basado en polipiridinas de Ru(II) se ha convertido en una
estrategia poderosa para la liberación de moléculas bioactivas proporcionando
altos niveles de control espacial y temporal sobre la actividad biológica.
1.4 Características químicas de los compuestos fotoactivables de la
forma [Ru(bpy)2(PMe3)(L)]2+.
Los compuestos enjaulados mostrados en este trabajo tienen la estructura
general [Ru(bpy)2(PMe3)(L)]2+ en la que el metal se encuentra unido a dos
bipiridinas (2, 2´-bipiridina), una fosfina (PMe3 = trimetilfosfina) y la molécula
bioactiva. El centro metálico corresponde a rutenio, un metal de transición
que se ubica en el grupo VIII de la Tabla periódica cuya configuración
electrónica es [Kr] 4d7 5s1. En los complejos estudiados está presente como
Ru2+, tiene 6 electrones en sus orbitales d y presenta una geometría
octaédrica, donde los ligandos se disponen alrededor del metal definiendo los
vértices de un octaedro (Figura 1.5). Los ligandos bipiridinas no tienen
absorción en la región visible del espectro electromagnético. Posee orbitales
8
donores localizados en el átomo de nitrógeno y orbitales donores y
aceptores * ubicados en los anillos aromáticos. Cuando se forma el enlace
coordinado, el metal acepta la densidad electrónica proveniente de los
orbitales de la bipiridina y a su vez, la bipiridina acepta densidad electrónica
proveniente del metal en sus orbitales * vacíos. La bipiridina es un ligando
bidentado — posee dos sitios de unión —mientras que la trimetilfosfina (PMe3)
y L son ligandos monodentados —poseen un sitio de unión—. La fosfina es un
ligando muy donor y a la vez un fuerte aceptor . Ambas características la
hacen más inerte a la fotoliberación.43 El ligando L puede ser nitrilo, piridina,
fosfito, tioéter —ligandos aceptores— o también ligandos donores como:
H2O, cloruro (Cl-), aminas alifáticas, etc.
Figura 1.5 Estructura general del complejo [Ru(bpy)2(PMe3)(L)]2+ utilizado para
fotoliberar moléculas bioactivas.
Los complejos [Ru(bpy)2(X)(Y)]2+ pueden presentar dos configuraciones
geométricas. En el isómero cis-[Ru(bpy)2(OH2)2]2+ las moléculas de agua se
encuentran adyancentes, mientras que en la configuración trans están
separadas por un ángulo de 180°. En soluciones acuosas el isómero más
estable térmicamente es el cis, sin embargo, a lo largo de este trabajo de tesis
se demostró que el isómero trans puede obtenerse fotoquímicamente44 (ver
figura 1.6).
9
Figura 1.6 Configuraciones cis y trans del compuesto [Ru(bpy)2(OH2)2]2+.
En el caso de nuestro grupo protector [Ru(bpy)2(PMe3)(L)]2+ todos los
compuestos que habían sido obtenidos hasta el momento presentaban
configuración cis. La estructura octaédrica de 2 ligandos bidentados y 2
monodentados diferentes dispuestos en cis es quiral. El compuesto
[Ru(bpy)2(PMe3)(OH2)]2+, precursor de la síntesis de las moléculas enjauladas
que se presentarán en este trabajo está presente cómo mezcla racémica: Λ-
[Ru(bpy)2(PMe3)(OH2)]2+ y Δ-[Ru(bpy)2(PMe3)(OH2)]2+. Si la molécula entrante
presenta quiralidad se pueden obtener una mezcla de diasterómeros.
Si bien ambos diasterómeros podrían tener propiedades ópticas y
fotoquímicas ligeramente diferentes, así como diversa capacidad de enjaulado,
no se han realizado intentos de separación.
Cuando se forma el complejo [Ru(bpy)2(PMe3)(L)]2+ la interacción de los
orbitales de las bipiridinas y el centro metálico da lugar a los niveles de energía
y transiciones electrónicas que se presentan en la figura 1.7. En este diagrama
simplificado cada orbital molecular está señalado de acuerdo a dónde se
localiza la densidad electrónica, la cual puede estar sobre el centro metálico
(M) o el ligando (L).
10
Figura 1.7 Representación esquemática de los niveles de energía de los orbitales
moleculares que posee un complejo Ru(bpy).
Los orbitales moleculares de menor energía que resultan de la combinación
de los orbitales del metal y los ligandos están descritos como: L y L. Estos
orbitales reciben mayor contribución electrónica de parte de los orbitales del
ligando. Los orbitales d que en el metal aislado se encuentran degenerados,
en el compuesto de coordinación se desdoblan en dos grupos al combinarse
con los ligandos. Los orbitales t2g, los cuales forman uniones *M aparecen a
menor energía que los orbitales eg, de mayor energía y que forma uniones *M.
En el estado basal de complejos polipiridínicos de Ru(II), los orbitales L; L y
*M se encuentran ocupados y los orbitales de mayor energía se encuentran
vacíos. Procesos de óxido-reducción o absorción de luz pueden producir
transiciones electrónicas dando lugar a nuevos estados electrónicos. Estás
transiciones se clasifican según la localización de los orbitales involucrados:
1. Las transiciones localizadas entre orbitales del centro metálico son
conocidas como centradas en el metal (MC), transiciones d-d o de campo
ligando (LF).
2. Las transiciones localizadas entre orbitales del ligando se conocen como
centradas en el ligando (LC) o transiciones intra-ligando (IL). Estas
transiciones no se ven afectadas por la coordinación al centro metálico.
4d
3s
3p
L
*M
*M
(eg)
*M
(t2g
)
*L *
Orbitales RuII Orbitales Moleculares Orbitales bpy
L
M
LMCT
MLCT LC
11
3. Las transiciones entre orbitales del metal y el ligando se denominan como
transiciones de transferencia de carga (CT). Si el desplazamiento de la
densidad electrónica ocurre desde el ligando al metal se les llama LMCT y
es desde el metal al ligando se las llama MLCT.
A continuación, se muestra en la Figura 1.8 un espectro de absorción del
complejo [Ru(bpy)2(PMe3)(OH2)]2+ con sus respectivas bandas que se deben a
transiciones: LC, MC y MLCT.
Figura 1.8 Espectro de absorción del complejo [Ru(bpy)2(PMe3)(OH2)]2+ en solución
acuosa a pH= 5.
Los procesos que ocurren en el estado excitado correspondiente a la transición
MLCT contistuyen la base de la fotoliberación de los complejos de la familia
Ru(bpy). La absorción de esta transición aparece en el rango visible de 400 –
500 nm y es dependiente de los ligandos sustituyentes — más adelante se
hará mención a este punto—.
1.5 Fotoquímica en el estado excitado de la transición MLCT para
complejos Ru(bpy).
Para describir los procesos que ocurren en el estado excitado de los
compuestos que se estudiaron en este trabajo y que conllevan a la liberación
de la molécula enjaulada, es útil recurrir a un compuesto de referencia de
estos sistemas, el Ru[(bpy)3]2+. Está molécula y sus derivados han sido muy
/ nm
200 300 400 500 600 700
/ c
m-1
M-1
0
10000
20000
30000
40000LC
MC
MLCT
12
estudiados en los últimos 30 años45–49 debido a sus propiedades redox,
reactividad, poca descomposición térmica y larga vida media de los estados
excitados, fotoluminescencia y la posibilidad de sintonizar sus propiedades
mediante variaciones en los ligandos. Los procesos fotoquímicos que sufren
los complejos Ru(bpy) están descritos en la figura 1.9.
Figura 1.9 Diagrama de Jablonski simplificado de los procesos fotoquímicos en
complejos Ru(bpy). Los productos son liberados desde el estado excitado 3d-d. kR:
constante cinética de la vía radiativa; kNR: constantes cinéticas de las vías no
radiativas; kISC: constante de cruce intersistemas; kA, constante activada hacia el
estado disociativo 3d-d, ΔE: energía necesaria para poblar el estado 3d-d desde el
estado 3MLTC; S0: estado fundamental.
Cuando absorben luz alcanzan un estado excitado de carácter singulete que
corresponde a la transición 1MLCT. Este estado excitado es de muy alta
energía y rápidamente decae a un estado de menor energía 3MLCT, el cual es
de carácter triplete. El decaimiento hacia el estado basal se puede dar por vía
no radiativa por relajación con el solvente (kNR) o por vía radiativa (kR)
generando la emisión de fosforescencia alrededor de 600nm para estos
complejos. Desde este estado emisivo se puede dar también la ocupación de
un estado 3d-d, que tiene una conformación muy distorsionada respecto al
estado basal y por lo tanto, tiene una fuerte tendencia a decaer por vías no
radiativas hacia el estado fundamental. Esta vía de relajación involucra
1MLCT
3MLCT
3d-d
fotoproductos
ΔE
S0
hv
kisc
kA
kNR1
kR k
NR2
φ = 1
Energ
í
a
ΓRu-N
13
reacciones de fotosustitución, que se dan a través de un mecanismo
disociativo y permite la liberación de ligandos monodentados. Esta es la
propiedad que se ha aprovechado para utilizar compuestos Ru(bpy) como
compuestos fotoactivables de moléculas bioactivas.
Como se describe en el gráfico una pequeña diferencia de energía entre los
estados 3MLCT y el 3d-d permite que con participación térmica se pueble este
último, favoreciendo los procesos de fotosustitución. Esta diferencia
disminuye cuánto más energética sea la banda 1MLCT, lo cual dependerá de
la naturaleza de los ligandos alrededor del centro metálico y de su capacidad
de modificar la densidad electrónica sobre el mismo.49
1.6 Parámetros dependientes del máximo de absorción de la transición
1MLCT.
En los complejos de la forma [Ru(bpy)2(X)(Y)]2+ la naturaleza de los ligandos
monodentados X e Y modifican la posición de la banda 1MLCT. Esto es muy
importante porque permite modular la eficiencia de fotoliberación debido a
que la misma resulta dependiente de la posición relativa de la banda 1MLCT.
Por ejemplo, ligandos donores como: Cl-, OH- y NH3, provocan un corrimiento
de la banda a menores energías, debido a que estabilizan el estado excitado
d (Ru)— *(bpy). Esta estabilización implica un aumento del ΔE entre el estado
3MLCT y 3d-d, con lo cual disminuye la probabilidad de poblar el estado d-d,
responsable de la fotólisis. Por otra parte, ligandos aceptores como nitrilos,
tioéteres, fosfitos, piridinas, provocan un desplazamiento a mayores energías
en el espectro, ya que reducen la densidad electrónica sobre el centro metálico.
Ligandos aceptores como CH3CN, CO o PPh3 desplazan la banda a menores
longitudes de onda porque estabilizan los orbitales d(Ru) por retrodonación
sin estabilizar los orbitales * de la bipiridina. Esto también conduce a una
mayor separación energética entre el estado fundamental y el excitado 1MLCT.
Este salto energético implica una disminución en ΔE y, por ende, aumento en
la ocupación de los estados d-d, como se describe en la figura 1.10.
14
Figura 1.10. Diagramas de energías que muestran la diferencia de energía de los
estados excitados al modificar la naturaleza de los ligandos coordinados al centro
metálico.
Pinnick et al.50 mostraron una correlación entre la naturaleza donora
/aceptora de los ligandos y el potencial de reducción de la cupla RuIII/ RuII.
En este caso, ligandos donores facilitan termodinámicamente la oxidación a
Ru3+ ya que generan una disminución del potencial de reducción de la cupla
RuIII/ RuII gracias a la mayor densidad electrónica donada al centro metálico.
De forma consistente con lo expresado anteriormente, un corrimiento de la
banda 1MLCT también influye en el valor del rendimiento cuántico de
fotosustitución. Cuanto mayor es la energía asociada a esta transición, mayor
es la tasa de fotoliberación de ligandos monodentados. La desestabilización de
los estados excitados Ru3+ provoca una reducción de la energía necesaria para
alcanzar los estados 3d-d. En la tabla 1.1 se muestra cómo varían los
parámetros de eficiencia de liberación, potencial de reducción, posición de la
banda 1MLTC de acuerdo a la naturaleza del ligando monodentado. Esta
correlación falla en ligandos muy aceptores, como CO o fosfinas, cuyos
rendimientos cuánticos de fotosustitución son muy bajos.
ΔE1 ΔE
2
ΔE1
ΔE2
1MLCT
3MLCT
3d-d
1MLCT
3MLCT
3d-d
So
Energ
ía
ΓRu-N
So
ΓRu-N
Ligandos más
aceptores o menos donores
15
Tabla 1.1 Posiciones de las bandas 1MLCT, potenciales de reducción y rendimientos
cuánticos de fotosustitución para complejos de la forma [Ru(bpy)2(X)(Y)]2+. Adaptado
de Pinnick y Durham et al.51.
Ligandos (X)(Y) MLTC / nm E1/2 / V lib
1 (piridina)(Cl) 505 0,79 0,04
2 (4-acetilpiridina)(Cl) 495 0,82 0,07
2 (imidazol)2 488 1,02 0,001
4 (N-metilimidazol)2 483 0,94 0,001
5 (CH3CN)(Cl) 481 0,86 0,12
6 (piridina)2 454 1,30 0,20
7 (4-acetilpiridina)2 442 1,45 0,29
8 (3-iodopiridina)2 442 1,36 0,24
9 (piridazina)2 440 1,42 0,06
10 (CH3CN)2 426 1,44 0,31
11 (PMe3)(5-HT) 446 1,07 0,034
aDeterminado en CH2Cl2 bDeterminado en acetonitrilo vs NHE.
1.7 Aplicaciones a sistemas biológicos.
El modelo biológico a manipular dirige el diseño y síntesis del complejo
fotoactivable. En nuestro laboratorio se han utilizado como modelos
fisiológicos para ensayar la liberación de los compuestos enjaulados: 1)
neuronas Retzius de sanguijuela para probar el complejo [Ru(bpy)2(4-AP)2]2+ y
otros compuestos; 2) ovocitos de rana y rodajas de cerebro de ratón para
liberar GABA; 3) ratones para liberar dopamina en experimentos in vivo; 4) en
cerebros de abejas vivas se liberó serotonina enjaulada, entre otros
experimentos realizados. Los modelos utilizados en su mayoría corresponden
a sistemas neuronales, ya que parte de la investigación que se realiza en el
laboratorio está focalizada a generar tecnologías que permitan mejorar la
comprensión del funcionamiento del cerebro y su circuitería.
Continuando con esta tradición de compuestos neuroactivos, otro modelo
biológico que se utilizará corresponde a neuronas del Locus Coeruleus (LC) del
cerebro de hembra de ratón. Estas neuronas son autorreguladas por
norepinefrina. La norepinefrina es un neurotransmisor que juega un rol
importante en procesos de atención, memoria y estrés. Por lo tanto, el
16
desarrollo de un complejo enjaulado de norepinefrina permitirá elucidar los
patrones noradrenérgicos que se establecen cuando se libera este compuesto.
El siguiente modelo a utilizar consiste en un pequeño invertebrado
emparentado con las medusas, llamado Hydra vulgaris. Rafael Yuste et al.52
presentaron un sistema para elucidar circuitos neuronales en Hydra, la cual
posee un sistema nervioso muy primitivo, que consiste en una red simple de
neuronas. Debido a su pequeño tamaño y gracias a un par de modificaciones
en su genoma para ser utilizada en Imaging Ca2+, este investigador y su grupo
lograron establecer un mapeo completo de la actividad neuronal en el cuerpo
entero de una hidra cuando esta realiza comportamientos espontáneos, como
elonganción, contracción, apertura de boca, entre otros. En la figura 1.11 se
muestra un modelo caricaturizado de la hidra y estos movimientos.
Figura 1.11 Esquemas de Comportamientos típicos de Hydra vulgaris
La hidra es uno de los primeros animales en poseer sistema nervioso, y por lo
tanto, ofrecen una aparente simplicidad para estudiarlos que podría arrojar
luz sobre los principios de diseño estructural y funcional de los circuitos
neuronales. Por esta razón, se adoptó como modelo biológico a manipular a
través del uso de compuestos fotoactivables de rutenio-bipiridina. En el
capítulo 3, se ampliará sobre las características de este invertebrado y cuál es
el comportamiento que se activa.
17
1.8 Estructura de la tesis
Esta tesis de doctorado se encuentra organizado en 6 capítulos, a
continuación, se detallará brevemente el contenido de cada uno de ellos.
En el Capítulo 2. “Materiales y Mëtodos”, se detallan las técnicas
experimentales utilizadas y el equipamiento requerido para los análisis
realizados.
En el Capítulo 3. “Manipulación óptica de la respuesta alimentaria en Hydra
vulgaris”, se presentará la caracterización química, el estudio fotoquímico y la
fotoliberación del complejo cis-[Ru(bpy)2(PMe3)Arg)](PF6)2 en Hydra vulgaris.
Así como un estudio aproximado de la difusión de arginina en el medio de
reacción.
En el Capítulo 4. “Norepinefrina fotoactivable para sondear circuitos
neuronales adrenérgicos”, se muestra la síntesis y aplicabilidad de los
complejos cis-[Ru(bpy)2(PMe3)(Norepinefrina)](PF6)2 y cis-[Ru(bpy)2(PMe3)(D-
Serina)]2+ en investigaciones neurológicas.
En el Capítulo 5: “Interconversión cis-trans en complejos de Rutenio(II)-
bipiridina”, se muestran estudios de interconversión térmica y fotoquímica de
los isómeros cis-[Ru(bpy)2(PMe3)(OH2)]2+ a trans-[Ru(bpy)2(PMe3)(OH2)]2+.
Adicionalmente se muestran estudios de cálculo computacional sobre los
estados fundamentales de ambos complejos y un estudio del mecanismo de
interconversión. Y finalmente, se presenta un estudio de las aplicaciones
sintéticas de los isómeros cis- y trans-[Ru(bpy)2(PMe3)(L)]2+.
En el Capítulo 6: “Conclusiones generales” se mostrarán las conclusiones
generales de este trabajo y las perspectivas a futuro del trabajo realizado hasta
ahora.
18
19
Capítulo 2.
Materiales y Métodos
En este capítulo se describirá los métodos y técnicas utilizadas durante el
desarrollo de la tesis.
2.1 Síntesis de los complejos precursores: Consideraciones generales
Todas las síntesis se realizaron en condiciones de baja iluminación para
minimizar la descomposición fotoquímica de los compuestos. Las soluciones
siempre fueron burbujeadas con argón antes de calentarse para evitar la
oxidación del metal (Ru2+ → Ru3+) en los complejos en solución acuosa.
Los reactivos fueron usados sin purificación previa. Los solventes fueron
destilados, de acuerdo con los métodos de destilación reportados
previamente.53 El precursor Ru(bpy)2Cl2 fue sintetizado según lo reportado en
la literatura.54
2.1.1 Síntesis del cis-[Ru(bpy)2(PMe3)(Cl)]Cl
520 mg de [Ru(bpy)2Cl2] se suspendieron en 20 mL de una mezcla 8:2 v/v de
etanol: agua. La mezcla se sometió a reflujo bajo atmósfera de argón durante
1 hora, y posteriormente de forma rápida y en caliente se filtró la solución. El
filtrado fue llevado a temperatura ambiente. Luego, bajo atmósfera de argón,
se agregaron 1,2 mL de trimetilfosfina 1M en THF y se dejó en agitación en un
baño termostatizado a 70° C durante 24 h. La reacción fue monitoreada por
espectroscopia UV-Visible (UV-Vis). En algunos casos, se agregó 1 equivalente
adicional de solución de fosfina. Luego, se eliminó el exceso de fosfina y
metanol con un rotavap y se realizaron lavados con etanol al 96% para
eliminar toda la fosfina excedente. El producto obtenido fue disuelto en 4,0
mL de una mezcla de etanol y acetona (1: 1v/v). A esta mezcla se le agregó
20
10,0 mL de THF para precipitar el complejo, filtrándose una vez obtenido el
sólido. Al sobrenadante se le adicionó THF y se obtuvo una segunda porción
de sólido. Se utilizó un total 30 mL de TFH para la precipitación del complejo,
el cual finalmente se lavó con éter y se llevó a un desecador. Se obtuvo un
sólido marrón con un rendimiento del 70 %.
El coeficiente de absortividad molar a máx (451 nm) = 4620 M-1cm-1 en
solución acuosa. A continuación se presentan los resultados obtenidos para
1H-NMR (500 MHz, CDCl3), informándose: desplazamiento δ (integración,
multiplicidad, constante de acoplamiento).
δ (ppm)= 9,83 (1H, d, 6,62 Hz); 9,13 (1H, d, 5,09 Hz); 9,01 (1H, d, 8,15 Hz);
8,41 (1H, d, 8,15 Hz); 8,37 (1H, t, 8,15 Hz); 8,25 (1H, t, 7,64 Hz); 8,07 (1H, t,
8,15 Hz), 7,95 (1H, t, 8,15 Hz)., 7,91 (1H, t, 7,64 Hz), 7,86 (1H, d, 5,60 Hz),
7,71 (1H, t, 6,62 Hz), 7,66 (1H, t, 6,62 Hz); 7,38 ( 1H, s); 7,28 (2H, m); 1,10
(9H, d, 8,84 Hz).
2.1.2 Síntesis del cis-[Ru(bpy)2(PMe3)(OH2)](CH3SO3)2
100 mg del complejo cis-[Ru(bpy)2(PMe3)Cl)]Cl se disolvieron en 3,0 mL de
agua destilada y la solución se sometió a agitación y calentamiento (70 °C)
durante 1 hora para formar el complejo acuo, cis-[Ru(bpy)2(PMe3)(OH2)]Cl2.
Luego, la solución fue agitada con 500 mg de resina aniónica Dowex-22
previamente cargada con el anión mesilato. Para un intercambio aniónico
satisfactorio se dejó la solución toda la noche en agitación orbital. Finalmente,
se filtró y la solución fue utilizada sin ningún proceso de purificación. Para la
obtención del sólido, se liofilizó la solución y se almacenó en condiciones de
mínima humedad.
El coeficiente de absortividad molar a máx (444 nm) = 6700 M-1cm-1 en
solución acuosa.
Datos de 1H-NMR (500 MHz, D2O), δ (ppm)= 9,19 (1H, d, 5,47 Hz); 8,95 (1H,
d, 5,47 Hz); 8,48 ( 1H, d, 8,12 Hz); 8,43 (1H, d, 8,24 Hz); 8,39 (1,H, d, 8,24
Hz); 8,21 (1H, d, 7,87 Hz); 8,17 (1H, t, 7,87 Hz); 8,11 (1H, t, 8,15 Hz); 7,93
(1H, t, 7,97 Hz); 7,72 (4H, m); 7,46 (1H, s); 7,24 (1H, t, 6,87 Hz); 7,02 (1H, t,
6,59); 1,03 (9H, d, 8,77 Hz).
21
2.2 Cristalización
Para determinar la estructura cristalina de los isómeros trans-
[Ru(bpy)2(PMe3)(L)]2+ se realizaron varios experimentos de cristalización. La
técnica de cristalización más efectiva fue la de difusión de vapor de solvente.
Este método consiste en la difusión de vapor de un solvente volátil sobre una
solución que contiene la muestra a ser cristalizada. El solvente en el que se
encuentra disuelta la muestra es el menos volátil, mientras que en el solvente
más volátil la muestra no es soluble. El vapor del solvente volátil difunde
lentamente dentro de la solución, disminuyendo así la solubilidad del
compuesto de interés hasta la formación del sólido cristalino (ver Figura. 2.1).
Para esto, se utilizaron viales de 2,0 mL dentro de frascos ámbar herméticos
de 10 mL que evitaban la evaporación del solvente. La solución se preparó
disolviendo entre 1,0 – 2,0 mg de la muestra en 2,0 mL de acetona anhidra y
se colocó en el interior del vial pequeño, mientras que en el frasco exterior se
colocó éter etílico. El sistema se colocó en reposo permitiendo la difusión lenta
y gradual para propiciar la cristalización de las sustancias.
Figura 2.1 Representación del método de cristalización por difusión con vapor
utilizado.
En este trabajo se muestra la estructura cristalina del isómero trans-
[Ru(bpy)2(PMe3)(OH2)]2+, la cual fue medida y refinida por la Dra: Florencia Di
Salvo y el Lic. Federico Movilla.
22
2.3 Instrumentación
A continuación, se presentan las distintas técnicas instrumentales utilizadas
en este trabajo de investigación para la caracterización estructural de los
compuestos sintetizados.
2.3.1 Espectroscopia ultravioleta-visible (UV/vis)
Los espectros de absorción fueron tomados en dos equipos diferentes, de
acuerdo con el rango de longitud de onda que se quería medir. Para medidas
ubicadas entre 190 a 800 nm se utilizó un equipo UV-vis HP 8453 y para
medir en el rango entre 400-900 nm se utilizó un equipo de arreglo de diodos
Ocean Optics Chem 2000 con lámpara de tungsteno o bien de Xenon pulsada
PX2 utilizando el software OOIChem. Para ambos casos, se usó una cubeta
de vidrio óptico o cuarzo de 1cm de camino óptico y para las medidas de
fotólisis una cubeta de 4 caras pulidas de igual camino óptico.
2.3.2 Espectroscopia de Resonancia Magnética Nuclear (RMN)
Los espectros de RMN para los compuestos sintetizados fueron obtenidos con
equipos Bruker AM 500, Bruker Advance Neo 500 y Bruker Fourier 300,
disponibles en el instituto UMYMFOR FCEyN- UBA CONICET. Para comprobar
la fotoliberación de las moléculas enjauladas se registró la aparición en el
espectro de las señales correspondientes al ligando libre luego de irradiar una
solución del complejo. Para ello la muestra fue colocada dentro de un tubo de
RMN tapado, y se introdujo dentro de un dispositivo de irradiación diseñado
en el laboratorio33, que contiene una serie de diodos emisores de luz de alta
potencia de color azul o verde como se indica en la figura 2.2
23
Figura 2.2 Esquema del sistema de irradiación utilizado para la fotólisis del complejo
en un tubo de RMN. Se utilizaron diodos emisores de 1W azul (450 nm) o verde (525
nm) para iluminar la muestra a través de las paredes del tubo, asegurando de esa
forma, la irradiación completa de toda la muestra.
2.3.3 Espectrometría de Masas
Las medidas fueron realizadas en un espectrómetro de masas de tiempo de
vuelo (Tof) y Xevo G2S Q-TOF (Waters Corp) equipado con una fuente de
electropulverización por ionización (ESI), y un analizador cuadrupolo híbrido
de alta resolución y precisión (Q). Las muestras fueron disueltas en metanol
de calidad LC-MS y se inyectaron directamente en el espectrotómetro.
Típicamente, los cationes se detectaron como especies gaseosas desnudas con
doble carga, pero también a través de una serie de cationes con estados de
carga reducidos logrados mediante emparejamiento iónico. En todos los casos,
solo se menciona el valor m/z observado del ion isótopo más abundante de las
especies multi-isotópicas.
2.3.4 Difracción de Rayos X de monocristal.
Los monocristales obtenidos se midieron con un haz de luz W01A-MX2 del
Laboratorio Nacional de Sincotrón (LNLS, Campinas, Brasil) usando una
longitud de onda λ = 0.8 Å. Los datos fueron recolectados usando un detector
de área PILATUS2M (Dectris). Las medidas se realizaron a 100 K y la reducción
Tubo de RMN
LEDs:
450 o 525 nm
Disipador de
Calor
Base
24
de datos se realizó utilizando el software MXCube.55 Las estructuras fueron
resueltas usando el software Olex256 mediante métodos estándar que emplean
ShelXS57 y se refinaron con el paquete ShelXT58, empleando mínimos
cuadrados.
2.4 Determinación de los rendimientos cuánticos de fotoliberación de los
compuestos fotoactivables.
Para determinar la eficiencia cuántica de fotoliberación de los compuestos
obtenidos se siguió la cinética de la reacción de fotólisis en soluciones acuosa
durante la irradiación. El experimento se llevó a cabo mediante el siguiente
protocolo.
1. Se fijan las condiciones del experimento tales como máximos de
absorbancia esperados, tiempo de toma de los espectros y promedio de
integración de los espectros.
2. Se miden y registran los espectros del complejo fotoactivable en solución
acuosa antes y durante la irradiación, usando un rango de medición entre
350 y 700 nm.
3. Se enciende el láser de irradiación y se registra la cinética de fotólisis.
Los módulos de láseres utilizados fueron de 405 nm, 445 nm o 532 nm. La
intensidad de los láseres fue calibrada con un medidor de potencia Marca
Coherent Modelo Fieldmaster con un detector SR45 o bien con un fotodiodo
previamente calibrado con este instrumento. Estos láseres fueron dispuestos
perpendicularmente al paso óptico de la cubeta para no introducir errores
apreciables en las medidas de absorbancia. La agitación se realizó con un buzo
magnético para garantizar homogeneidad en la concentración. El sistema de
fotólisis se muestra en la figura 2.3
25
Figura 2.3 Setup experimental utilizado para medir las eficiencias cuánticas de
fotliberación de los compuestos enjaulados.
4. Se detiene la cinética de fotólisis cuando se completan aproximadamente 4
tiempos de vida media de la reacción.
5. Luego los datos son analizados y tratados para obtener los valores de las
eficiencias cuánticas.
6. Cada fotólisis se realizó por triplicado.
En la figura 2.4 se muestra la cinética de fotólisis para el complejo
[Ru(bpy)2(PMe3)(ImH)]2+. Debido a que las especies iniciales y finales presentan
espectros ligeramente diferentes es posible hacer seguimiento de la reacción
de fotólisis por espectroscopia de absorción. La reacción de fotólisis genera la
molécula enjaulada y una mezcla de complejos cis y trans-
[Ru(bpy)2(PMe3)(OH2)]2+, complejo acuo.
trans-[Ru(bpy)2(PMe3)(ImH)]2+ → ImH + cis/ trans-[Ru(bpy)2(PMe3)(OH2)]2+
Las características químicas de este complejo se discutirán en el capítulo 5.
Se coloca este caso como referencia para el tratamiento que se realiza a todos
los compuestos sintetizados.
Láser
26
Figura 2.4 Cinética de fotólisis para el complejo trans-[Ru(bpy)2(PMe3)(ImH)]2+. La
flecha indica la dirección en la que avanza la reacción dé fotólisis.
La figura 2.5 muestra la cinética de formación de los fotoproductos en función
del tiempo. Del ajuste de estos datos a la ecuación diferencial integrada que
describe la fotólisis (ecuación 1) se puede obtener el rendimiento cuántico de
fotoliberación.
Figura 2.5 cantidad de fotoproductos obtenidos vs tiempo para el complejo
[Ru(bpy)2(PMe3)(ImH)]2+. Una vez que se enciende el láser y el complejo absorbe
fotones, comienza el proceso de fotoliberación de la molécula enjaulada y la
generación del complejo acuo. La línea continua (línea negra) es la curva teórica
calculada de acuerdo a la ecuación 1. La pendiente inicial de la curva representa el
rendimiento cuántico de fotoliberación.
A pesar de que el rendimiento cuántico del fotoliberación se puede obtener
directamente de la pendiente inicial del gráfico, se obtiene un valor más
t / nm
0 200 400 600 800 1000
foto
pro
ducto
/ n
mole
s
0
20
40
60
80
100
120
/ nm
400 500 600 700
Abs
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
27
preciso ajustando la curva completa a la integración de la siguiente ecuación
que describe la velocidad de formación diferencial de fotoproductos (np) en
función del tiempo.
𝑑𝑛𝑝
𝑑𝑡= 𝐼𝑏𝑒𝑎𝑚 · (1 − 10−𝐴𝑏𝑠𝑇) ·
𝐴𝑏𝑠𝑅
𝐴𝑏𝑠𝑇𝜑𝑃𝐷 (1)
donde:
1. np = es el número de moles de fotoproducto.
2. Ibeam = es la intensidad de la luz incidente en Einsteins/s.
3. AbsT y AbsR corresponden a la absorbancia de la solución total y la
absorbancia del reactivo, respectivamente.
4. φPD (también llamado φlib) es el rendimiento cuántico del fotoliberación.
La expresión contiene factores no lineales, pero se puede iterar sucesivamente
para pequeños incrementos finitos y luego ajustar el parámetro φPD que
minimice las diferencias con los valores reales obtenidos en la medida (curva
de color rojo en figura 2.5). De esta manera se obtiene el rendimiento cuántico
de fotoliberación. Otro término importante a tomar en cuenta es la eficiencia
global de fotoliberación que corresponde al producto (ε φlib) entre el
coeficiente de absortividad y el rendimiento cuántico de fotoliberación. Este
parámetro da una estimación directa de la cantidad de luz que el compuesto
enjaulado necesita para poder utilizarse en la práctica.
2.5 Cálculos computacionales.
En el capítulo 5 se detallan los resultados referentes a la interconversión de
los isómeros cis y trans-[Ru(bpy)2(PMe3)(OH2)]2+. Se recurrió a estudios de
cálculo computacional para determinar las geometrías de mínima energía,
espectros de absorción UV-visible, mecanismo de isomerización y
correlacionarlos con los resultados experimentales. Los cálculos se realizaron
con el programa Gaussian 09.59
A partir de los cálculos mecanocuánticos se determinaron las geometrías de
los isómeros correspondientes al estado fundamental y el estado triplete de
28
menor energía (3MLCT). Para ello se utilizó una combinación de distintos
parámetros: el funcional híbrido B3LYP60–63 (una combinación entre el
funcional de intercambio de Becke y el funcional de correlación Lee, Yan y
Parr) y el conjunto de bases de potencial de núcleo efectivo LanL2DZ
implementado para Gaussian 09.59 Este conjunto de bases describe los
elementos de la primera fila de la tabla periódica gracias al set de bases D95V
de Dunnig y para los elementos más pesados, la base ECP de Los Alamos más
DZ.64,65
Se utilizaron criterios de convergencia SCF ajustados y sin restricciones de
simetría a lo largo de las optimizaciones de geometría. La naturaleza de los
puntos estacionarios obtenidos en los procedimientos de optimización se
verificó mediante análisis vibracionales. La aproximación del modelo continuo
polarizable (PCM) se utilizó a lo largo de los cálculos para tener en cuenta los
efectos de la solvatación del agua, ya que el H2O coordinado podría participar
en interacciones específicas de soluto-solvente. Los espectros electrónicos
para las diferentes especies fueron calculados por (TD) DFT, involucrando al
menos 100 estados excitados con el mismo nivel de energía que el empleado
en el paso de optimización de la geometría.
Los perfiles de energía calculados para el estado fundamental electrónico, así
como para los estados excitados de triplete de menor energía, proporcionan
una descripción microscópica de la vía de reacción de menor energía. Teniendo
en cuenta que el intercambio de ligandos en complejos octaédricos de rutenio
generalmente se realiza a través de una vía disociativa, se exploró la
coordenada de alargamiento del enlace Ru-O en cis-/trans-
[Ru(bpy)2(PMe3)(OH2)]2+. Las especies pentacoordinadas cis-/trans-
[Ru(bpy)2(PMe3)]2+ generadas de la disociación completa de una molécula de
H2O se optimizaron completamente como especies singlete y triplete. Se
identificaron y optimizaron las geometrías del estado de transición asociadas
con la conversión cis- a trans-[Ru(bpy)2(PMe3)]2+. Para este propósito, se utilizó
el método de cuasi-Newton sincrónico guiado por tránsito (STQN method66 por
sus siglas en inglés).
29
La coordenada de reacción que une el estado de transición (TS) con los
mínimos locales de las especies pentacoordinadas cis-/trans-
[Ru(bpy)2(PMe3)]2+ sobre la PES del estado fundamental y excitado fue
estudiada por los cálculos de coordenadas de reacción intrínseca (IRC) de
Fukui.67–69. Estos cálculos computacionales fueron realizados en colaboración
con el Dr. Leonardo Slep.
30
31
Capítulo 3.
Manipulación óptica de la respuesta alimentaria en Hydra
vulgaris.
3.1 Introducción
Por su morfología simple, poseer un sistema nervioso primitivo y una
asombrosa capacidad de regeneración, el pólipo Hydra vulgaris ha sido
utilizado como modelo para numerosos estudios de biología celular,
fisiología70, regeneración celular71, ensayos de toxicidad72, entre otros. En este
capítulo se detallará la activación de un comportamiento fisiológico en este
cnidario, gracias a la fotoliberación de arginina enjaulada.
3.1.1 Hydra, un modelo fisiólogico muy económico
Hydra vulgaris es un invertebrado muy primitivo, que vive en agua dulce en
regiones templadas y tropicales. Pertenece al phylum Cnidaria, compuesto de
pólipos como anémonas de mar, medusas y corales. Son consideradas
“inmortales” debido a su gran capacidad de regeneración celular.71,73
El cuerpo de este invertebrado tiene forma tubular, que termina en un disco
basal que le permite fijarse a rocas y sustratos. En la otra extremidad posee
una sola cavidad, que actúa como boca y ano. Esta cavidad se encuentra
rodeada de tentáculos, tal como se muestra en la Figura 3.1a. Las hidras
pueden llegar a medir hasta 1,5 cm cuando estiran su cuerpo. Se reproducen
sexual y asexualmente. La reproducción asexual ocurre por un proceso
32
conocido como gemación (figura 3.1b). Son animales sésiles, no tienen órganos
que le concedan movilidad.
Figura 3.1 a) Imagen de la morfología de Hydra vulgaris b) Reproducción asexual en
hidra, donde se puede apreciar una protuberancia conocida como gemación.
Su capacidad de regeneración permite que sean fáciles de manipular y
mantener en el laboratorio. Gracias a su pequeño tamaño, se pueden mapear
o seguir comportamientos enteros a través del campo de un microscopio
común. Por tal motivo son usadas hoy en día en muchos estudios de
microscopía de fluorescencia.74 Las hidras no poseen cerebro, pero tienen un
sistema nervioso bastante simple, distribuido a lo largo de su cuerpo. Este
sistema está conformado por una red de neuronas que pueden ir de cientos a
miles, dependiendo del tamaño del animal.52,75 Esto le permite tener ciertos
comportamientos como, por ejemplo, comer, moverse, descansar, entre otros.
Entre estos comportamientos se encuentra la respuesta alimentaria.
3.1.2 Respuesta alimentaria de la hidra.
Hydra vulgaris se alimenta de pequeños invertebrados acuáticos. En el
laboratorio fue alimentada con nauplios de Artemia salina o dafnia. Cuando
una presa toca uno de sus tentáculos, ocurre la descarga de nematocistos que
permite paralizar a la presa.76–78 Simultáneamente, las señales químicas que
fluyen de la presa le indican a la hidra que está en presencia de alimento
adecuado. Entonces se inicia la actividad neuronal específica que da lugar a
a) b)
33
la activación de la respuesta alimentaria. Esta respuesta consiste en una serie
de movimientos coordinados descritos a continuación:
1) un movimiento concertado de los tentáculos para dirigir la presa a la boca;
2) La hidra abre la boca y engulle la presa, la cual es ingresada con ayuda de
los tentáculos
3) Cierra la boca e inicia el proceso de digestión.
Loomis et al.78 demostraron que el glutatión reducido (GSH: -glutamyl-L-
cysteinyl-glycine) inicia la activación de la respuesta de alimentación en
hidras. El GSH que fluye de la presa viva herida es detectado por
quimioreceptores externos ubicados en los tentáculos de las hidras y se da
lugar a los pasos involucrados en el proceso de alimentación. En
contrapartida, la mera activación mecánica de los nematocistos no es un
estímulo suficiente. También, existen otras sustancias con efecto análogos,
total o parcial, entre ellas S-metil-glutatión78 y L-arginina.79
La mayor parte del conocimiento sobre este comportamiento proviene de
experimentos en “bulk”, en los que se añade una determinada cantidad de la
sustancia química a un medio en el que se colocan muchas hidras, y se
registra la respuesta estadística de los animales.77 Por otro lado, el pequeño
tamaño y la alta sensibilidad de las hidras, incluso a pequeñas perturbaciones
mecánicas, hace que los experimentos con tentáculos individuales en
animales enteros y en condiciones fisiológicas sean casi imposibles de realizar.
Los resultados que se muestran en este capítulo están centrados en la
activación de un comportamiento fisiológico en individuos únicos de Hydra
vulgaris, mediante la fotoliberación de arginina.
3.2 Parte Experimental
3.2.1 Síntesis
La síntesis del precursor cis-[Ru(bpy)2PMe3Cl]Cl y del cis-
[Ru(bpy)2(PMe3)(OH2)](Mes)2 están descriptas en la sección 2.1 del capítulo 2.
34
3.2.1.1 Síntesis de cis-[Ru(bpy)2(PMe3)(GSH)]PF6 :
Se disolvieron 23 mg del complejo cis-[Ru(bpy)2PMe3Cl]Cl en 1,0 mL de agua.
Está solución fue burbujeada con argón durante 5 minutos. Se agregó 50 mg
de GHS disueltos en 500 L de agua destilada. Bajo atmósfera de argón se
agregaron 1,8 equivalentes de una solución de NaOH 1.0 M. Se realizó
seguimiento de la reacción por espectroscopia uv-visible. Se mantuvo en
reflujo por 2 h, observando la formación del complejo. Luego, la reacción fue
llevada a temperatura ambiente y se agregó 100 L de HCl 1,0 M. En las
pruebas fotoquímicas preliminares del complejo no se pudo fotoliberar el
ligando GSH, por lo tanto, no se continuó con la caracterización y purificación
completa de este compuesto.
3.2.1.2 Síntesis de cis-[Ru(bpy)2(PMe3)(Arg)]PF6
Se disolvieron 170 mg del complejo cis-[Ru(bpy)2PMe3Cl]Cl en 5,0 mL de agua.
La solución se dejó en reflujo bajo atmósfera de argón durante 1 h para formar
el complejo acuo, cis-[Ru(bpy)2PMe3(H2O)]Cl2. Luego, se agregó 610 mg de
Arginina•HCl y 1,15 mL de NaOH para llevar el pH a 9,25. La mezcla de
reacción fue calentada a 40 °C durante 24 horas, y luego fue llevada a
temperatura ambiente y filtrada. El filtrado obtenido se enfrió a 0 °C y se
agregaron muy lentamente 5 equivalentes de una solución de KPF6 0,5 M. Se
obtuvo un sólido naranja. El precipitado fue lavado 3 veces con agua fría y
luego se secó en un desecador. La purificación del complejo se realizó
disolviendo en resina Dowex-Cl y luego precipitando con KPF6 hasta que la
pureza fue confirmada por RMN.
El coeficiente de absortividad molar a máx (441 nm) = 6067 M-1cm-1 en
solución acuosa.
A continuación se presentan los resultados obtenidos para
1H-NMR (500 MHz, CDCl3), informándose: desplazamiento δ (integración,
multiplicidad, constante de acoplamiento).
Datos de 1H RMN ( 500 MHz, D2O/Acetona-d6) ppm= 9,11 (d, 1H); 9,07 (d, 1H);
9,00 (d, 1H); 8,95 (d, 1H); 8.47 (t, 2H); 8,45 (t, 2H); 8,34 (dd, 2H); 8,24 (dd,
2H); 8,22- 8,10 (m, 4H): 7,90 (m, 2H); 7,81-7,67 (m, 6H); 7.46 (dd, 2H); 7,37
(dd, 2H); 7,24 (dt, 2H), 7,09 (t, 2H); 4,16 (t, 1H), 3,74 (t, 2H); 3,61(d, 1H);
35
3,27(d,1H); 2.93 (dd, 2H); 2,86 (t, 2H); 2,71 (d,1H); 2,45 (d, 1H); 1,51 (m, 2H);
1,34 (m, 3H); 1,17 (m, 3H); 1,06 (dd, 18H).
Análisis elemental: RuC26H38N8O2P3F12 (M: 917g/mol): calculado C 36.52%, H
4.12 %, N 11.75 %; obtenido C 36,61 %, H 4.30 %, N 11,40 %.
3.2.2 Modelos fisiológicos utilizados
Para estudiar la eficiencia real de los compuestos sintetizados se utilizó como
sistema fisiológico el cnidario Hydra vulgaris. Las hidras fueron mantenidas
en medio de hidra (agua dulce artificial80) en un cámara termostatizada a 18
°C. Se les cambió el ciclo circadiano (mantenidos en un día inverso, 12 horas
fuera de fase desde la hora local). Fueron alimentadas con nauplios de Artemia
recién eclosionados. En las semanas previas a experimentos se les daba de
comer 4 veces por semana, mientras que el día antes de los ensayos las hidras
seleccionadas no fueron alimentadas.
Ensayos in vivo:
1. Para cada experimento se escogían hidras sanas, es decir, que
representaran la morfología característica de este animal, tal como se
muestra en la figura 3.1.
2. Antes de iniciar cada experimento, se sumergía una hidra o un tentáculo
recién cortado en una cápsula de Petri de 35 mm de diámetro con una
solución de hidra que contenía un rango de concentración entre 77 M y 1
mM de [RuBi-Arg]Cl según el experimento realizado.
3. Los experimentos de fotoliberación fueron llevados a cabo bajo condiciones
de máxima oscuridad posible para lo cual se cubrió el setup experimental
(Figura 3.2) con una tela negra.
36
Figura 3.2 Izquierda) Diseño del setup experimental usado; Centro) Sistema de
manipualción xyz con el que se manipulaba la dirección de la fibra óptica; Derecha)
Fibra óptica usada para irradiar el tentáculo de la hidra; en la imagen se observa
como el haz de luz (color violeta) incide sobre la solución de color naranja ( complejo
RuBi-Arg)
4. Las imágenes de vídeo de los tentáculos seccionados y de la liberación de
GSH o L-arginina libre fueron grabadas desde arriba en una configuración
de campo oscuro.
5. Para las pruebas de identificación de los movimientos involucrados en la
respuesta alimentaria se utilizó una micropipeta elaborada a partir de un
capilar afinado mediante un puller.
6. Las imágenes de vídeo de toda la hidra fueron grabadas usando dos
cámaras simultáneamente: una desde arriba y otra desde un lado, con el
fin de tener un mayor registro de todos los movimientos.
7. La iluminación para la obtención de imágenes se realizó con un LED NIR
(800 nm) con el fin de evitar estimular la hidra por acción de la luz81–83 y la
liberación del enjaulado antes de encender el láser seleccionado.
8. La irradiación se realizó con un láser de 445 nm enfocado y dirigido a través
de una fibra óptica de 62 µm de diámetro a la posición de fotoliberación.
La fibra se mantuvo en posición fija mediante un manipulador manual
XYZ, tal como se muestra en la figura 2.
9. El pulso de luz para desenjaular se fijó en 3 segundos.
10. Para el procesamiento de las imágenes se utilizó el software ImageJ.
37
3.3 Resultados
3.3.1 Síntesis
Se seleccionó como primer reactivo para enjaular el glutatión reducido (GSH)
Durante el seguimiento de reacción, los cambios en los máximos de la banda
1MLTC del complejo acuo, sugieren la formación del complejo. El máximo de
absorción para el Ru-GSH es de 451 nm, se desplazó hacia el rojo con respecto
el complejo (cis-[Ru(bpy)2(PMe3)(OH2)]2+ ; λ1MLCT = 444 nm), ver figura 3.3.
Figura 3.3 Fotoliberación del complejo formado en solución acuosa. La curva de trazo
rojo corresponde a la transición 1MLTC del Ru→GS. Cuando se irradia no hay
cambios en el máximo de la banda (curva naranja).
Sin embargo, al irradiar la solución no se evidencia la liberación del glutatión.
Esto es indicativo de que la coordinación no ocurre por el grupo amino sino
por el tiolato (S-). Por otra parte, el grupo tiolato cuando está desprotonado es
muy susceptible de oxidarse, generando una mezcla de productos tales como:
sulfonato (GSO), sulfinito (GSO2) y glutatión oxidado (GSSG).84,85 Todas estas
especies pueden coordinar al metal. Debido a las razones antes mencionadas,
no se continuó con la síntesis del complejo enjaulado de glutatión reducido.
Es preciso que el ligando enjaulado una vez fotoliberado revierta a su forma
original sin sufrir cambios en su estructura molecular para mantener la
efectividad del actuador.
/ nm400 500 600 700
Abs
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
38
A partir del resultado anterior, surgió la necesidad de encontrar otra sustancia
que suscite la activación. Hanai et al.86, mostraron en bulk que el aminoácido
L-arginina tiene un efecto parcial en la activación del comportamiento de
alimentación, que consiste en el retorcimiento y contracción de los tentáculos
y apertura de la boca, pero sin terminar de engullir la presa, con lo cual se
llevó a cabo la síntesis de un complejo de rutenio-bipiridina coordinado a L-
arginina. La figura 3.4 muestra la ruta de síntesis para este complejo. La
síntesis fue realizada a pH = 9,25.
Figura 3.4 Esquema de reacción para la obtención del complejo cis-
[Ru(bpy)2(PMe3)(Arg)]2+.
Es importante notar que este ligando tiene varios átomos donores en su
estructura: el oxígeno de grupo carboxilato (pK1= 1.82), el grupo amino (pk2=
8.99) y el grupo guanidino (pk3= 12.48). Sin embargo, la coordinación a
rutenio por el oxígeno para esta familia de compuestos no es estable en medio
acuoso. Por lo tanto, la coordinación puede resultar por el nitrógeno del grupo
amino y/o el grupo guanidino. Bajo esas condiciones intermedias de pH se
asegura de que la coordinación sea por el grupo amino alfa. A valores pH muy
altos se podría obtener una mezcla de productos coordinados por los grupos:
amino y guanidina.
La síntesis del actuador cis-[Ru(bpy)2(PMe3)(Arg)](PF6)2 fue satisfactoria. Se
obtuvo un sólido de color naranja, estable a temperatura ambiente y en
soluciones acuosas. No hay presencia del ligando libre. Presenta una banda
de absorción a 443 nm debido a la transición 1MLTC del Ru→bpy,
característica para estos compuestos.29,34,87
39
3.3.2 Caracterización fotoquímica del complejo cis-
[Ru(bpy)2(PMe3)(Arg)](PF6)2
Para medir la eficiencia cuántica de liberación del compuesto obtenido la
solución fue irradiada con un láser de 532 nm. El procedimiento está descripto
en el capítulo 2 sección 2.4. Se obtuvo un valor de eficiencia de 0,21. En la
figura 3.5a se muestra cómo varían los espectros UV-vis a medida que
transcurre la reacción de fotólisis. La curva de trazo azul corresponde al
complejo de Rubi-Arg, mientras que la curva de trazo rojo, corresponde al
complejo RuBiacuo. Los máximos de absorción en ambas especies no difieren
mucho. Esto se debe a que el ligando amino y el acuo tienen similar basicidad
frente al Ru. En el gráfico 3.5b se muestra la cinética de la cantidad de moles
de arginina libre en función del tiempo. La fotólisis resultó relativamente
rápida completándose los 25 min.
Figura 3. 5 a) Espectros de UV/vis de una solución 130 M de RuBi-Arg durante la
fotólisis en H2O (T=25°C, pH=7, = 532 nm, p = 7.35 mW). b) Gráfico del número de
moles de fotoproducto vs. tiempo. Línea sólida: ajuste de la Ec.1(capitulo2) para ɸPD
= 0,21.
3.3.3 Caracterizació química del complejo cis-[Ru(bpy)2(PMe3)(Arg)](PF6)2
En la figura 3.6 se muestra el espectro 1H-RMN del cis-
[Ru(bpy)2(PMe3)(Arg)](PF6)2. Se realizó en una mezcla D2O/acetona-d6 debido
a la poca solubilidad de las sales PF6 en agua. En la zona aromática se
observan la señales típicas de los hidrógenos de las bipiridinas que integran
nm
400 500 600 700
Ab
s
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
t / s
0 200 400 600 800 1000120014001600
foto
pro
du
cto
/ n
mo
les
0
50
100
150
200
250
300
40
para un total de 32 hidrógenos (la integración no se muestra en la figura).
Nótese que cada señal se encuentra duplicada debido a la presencia de la
mezcla aproximadamente equimolar de diasterómeros: Ʌ-Ru/L-arg y Δ-Ru/L-arg
formados. Es importante señalar que el complejo de partida cis-
[Ru(bpy)2(PMe3)(OH2)]2+ está presente como mezcla racémica.87
Figura 3.6 Espectro 1H- RMN: a) L-arginina; b) zona alifática del cis-
[Ru(bpy)2(PMe3)(Arg)]2+ y c) zona aromática del complejo cis-[Ru(bpy)2(PMe3)(Arg)]2+
medidos en una mezcla de D2O y Acetona-d6 (5:1).
La zona alifática muestra los protones de la arginina coordinada (también
duplicados). Las señales que aparecen a 4,16; 3,74; 3,61 y 3,27 ppm
corresponden a los hidrógenos de los grupos aminos coordinados (EΔ1, EΛ
1 EΛ2
1.52.02.53.03.5
7.07.58.08.59.0
0.51.01.52.02.53.03.54.04.5
a)
b)
c)
B C
D
EΛ1 EΔ1 EΛ2 EΔ2
DΛ1,2
AΔ BΔ1,2
BΛ1,2
CΛ1,2 CΔ2
CΔ1
AΛ DΔ1,2
+
+
/ ppm
41
y EΔ2). El hecho de que aparezcan estas señales aún en D2O indica que no
ocurre el intercambio isotópico, lo cual es habitual para los compuestos
Ru(bpy) coordinados a grupos aminos.34 Esto sugiere que la coordinación se
da por el grupo amino alfa al grupo carboxilo, tal como se esperaba. El
hidrógeno sobre el carbono asimétrico (HA) en el compuesto coordinado
aparece desplazado a campo alto respecto del hidrogeno HD. El doble-doblete
intenso que aparece a 1,05 ppm corresponde a los hidrógenos metílicos de la
trimetilfosfina. Es importante mencionar que no se realizó ningún esfuerzo
para separar la mezcla de diasterómeros ya que para los ensayos biológicos
ambos complejos cumplen su objetivo, el cual consiste en fotoliberar el
aminoácido.
Para identificar sí efectivamente se libera L-arginina cuando se irradia una
solución del complejo Rubi-Arg se tomaron espectros protónicos a distintos
tiempos de irradiación: t = 0 s, t = 30 s y t = 120 s
Figura 3.7 Zona alifática del espectro 1H-NMR del complejo Rubi-Arg durante la
fotólisis directa dentro del tubo de RMN con luz de 532 nm en una mezcla de
D2O/Acetona-d6 (5:1).
/ ppm
0.00.51.01.52.02.53.03.54.0
B C
D
EΛ1 EΔ1 EΛ2 EΔ2
DΛ1,2
AΔ AΛ DΔ1,2
* * *
CΛ1,2
BΛ1,2 CΔ1 +
CΔ2
+ BΔ1,2
C A B
D
trans-acuo
t= 120 s
t= 30 s
t= 0 s
42
En la figura 3.7 se muestra el seguimiento por RMN de una reacción de
fotólisis del complejo, específicamente se muestra la zona alifática. Al irradiar
la solución se puede observar el surgimiento de las señales de la arginina libre
y la desaparición las señales de los hidrógenos del grupo amino coordinado y
las correspondientes al esqueleto carbonado del ligando coordinado. En la
arginina libre las señales de –NH2 no se observan debido a que el intercambio
con el D2O es muy rápido y no se puede detectar en las condiciones que se
realiza la medida.
De la reacción de fotólisis se obtiene la arginina en su forma libre y una mezcla
cis/trans del [Ru(bpy)2(PMe3)(OH2)]2+ (ver figura 3.8). Las señales que aparecen
a 2,69, 2,20 y 0,87 ppm (señalados con un astérisco) corresponden al trans-
Rubi-Arg que se forman durante la fotólisis.
Figura 3.8 Productos de la reacción de fotólisis directa dentro del tubo de RMN con
luz de 532 nm en una mezcla de D2O/Acetona-d6 (5:1).
3.3.4 Fotoliberación de arginina en Hydra vulgaris in vivo.
Para probar la efectividad del actuador de arginina en hidras, primero se
realizaron experimentos liberando soluciones de las sustancias estimulantes
(GSH reducido y L-arginina) con el propósito de identificar los movimientos
que corresponden a la respuesta alimentaria. La liberación de estas
sustancias se realizó con micropipetas elaboradas a partir de capilares, para
no generar perturbaciones mecánicas ni respuestas violentas por parte de la
hidra cuando se agregaba el estimulante. La secuencia de estos eventos es
mostrada en la figura 3.9 y 3.10.
43
En la figura 3.9 a-c se observa cómo la extremidad del tentáculo de la hidra
se dobla, al detectar la presencia de alimento. En los frames c-e, el tentáculo
se contrae y es llevado a la boca (f-g). Dado que la sustancia en el experimento
que se muestra es GSH reducido se induce una respuesta alimentaria
completa que conlleva a la ingesta del hipotético alimento.
Dado que el compuesto fotoactivable de GSH no liberaba el GSH se realizó la
síntesis de un actuador con L-arginina. En la figura 3.10 se muestra la
secuencia de eventos de la respuesta alimentaria de forma parcial en hidra
liberando L-arginina para identificar los movimientos de esta respuesta
parcial.
Figura 3.9 Secuencia de imágenes que muestra el efecto que
ejerce el glutatión reducido al ser liberado en una hidra. Escanee
el código a la derecha si quiere ver el video.
44
En los frames a-c se agregó L-arginina. Una vez que la hidra percibe el
estimulante contrae levemente la punta del tentáculo (frame 3.10c) y
rápidamente dobla el tentáculo y lo acerca a la boca “creyendo que está
comiendo”. Esta secuencia se observa en los frames c-e. En el frame e se
observa movimiento de los tentáculos vecinos para ayudar en el proceso y
finalmente libera el tentáculo. Como se mencionó anteriormente la hidra no
abre la boca para engullir la “falsa presa”. Estos movimientos que se producen
cuando la hidra detecta L-arginina son los que se esperan observar una vez
se fotolibera el complejo RuBi-Arg.
Como siguiente paso se probó la funcionalidad del complejo sintetizado en
hidras. Para tener una respuesta favorable se trabajó con soluciones de 1 mM
t / s
0 2 4 6 8 10 12
b) a) c)
d) e) f)
g) h) i)
Figura 3.10 Secuencia temporal de la respuesta alimentaria
provocada en la hidra por acción de la arginina. Frames: a-b) se
libera arginina cerca del tentáculo; c) el tentáculo detecta la
presencia de arginina; d-e) hay una contracción rápida del
tentáculo; f-g) el tentáculo lleva a la boca “la falsa presa”; h) otros
tentáculos ayudan para llevar “el alimento” a la boca; i) culmina la
respuesta. Escanee el código a la derecha si quiere ver el video
45
de arginina. Este es el valor mínimo en el que se muestra activación por parte
del aminoácido según lo reportado en la literatura.79 Es importante señalar
que se realizaron pruebas de toxicidad con las concentraciones de trabajo.
Estas pruebas se basan en ensayos realizados por Granados et al.72, que
consistían en exponer las hidras a soluciones de 1mM, 2 mM y 4 mM de
complejo RuBiArg, observando cómo se ven afectados dichos organismos.
Si bien estas concentraciones no resultan dañinas para las hidras, sí generan
estrés visible en ellas. El estrés se manifiesta al presentar los tentáculos
contraídos y el cuerpo abultado. Debido a esto se cambió el contraión del
complejo en lugar de hexafluorofosfato (PF6) a cloruro (Cl- ) antes de trabajar
con las hidras. Está solución de cis-[Ru(bpy)2(PMe3)(Arg)](Cl)2 se mantiene
estable por varios días bajo oscuridad. Por otra parte cabe recordar que las
hidras no eran alimentadas 24 h antes del experimento. Las medidas se
llevaron a cabo manteniendo fija la cápsula que contenía el espécimen y
también fijando la fibra óptica a un manipulador XYZ que se controlaba a
través de un sistema electrónico remoto, que ayudó a minimizar las
perturbaciones mecánicas estaban minimizadas. La luz de iluminación tenía
una longitud de onda de 445 nm.
En la figura 3.11 se muestra la secuencia temporal de cómo se activa la
respuesta alimenticia por fotoliberación de L-arginina en el medio. Antes de
irradiar la solución, es preciso acercar la fibra óptica lo suficiente al tentáculo
de interés. El tiempo de encendido total es de 3 s. Al iniciarse la respuesta del
tentáculo inicia, él mismo adopta la forma de un gancho (conocida como hook
response), movimiento típico cuando de la hidra detecta la presencia de
alimento en el medio. Luego ocurre una contracción del tentáculo y la
activación de los demás tentáculos en respuesta al estímulo de alimentación
que recibe la hidra.
46
Se obtuvieron respuestas similares usando concentraciones tan bajas como
77 µM (ver figura 3.12). Hasta esta oportunidad nunca se había logrado
promover la respuesta de alimentación de la hidra con valores de
concentraciones tan bajos. Esto se logra gracias a la sensibilidad de este tipo
de sistemas debido a que permiten liberar la sustancia estimulante de forma
localizada y con mayor rango de precisión.
Figura 3.11 Secuencia temporal de la respuesta de alimentación
provocada en la hidra por acción de la arginina fotoliberada. a)
Antes de la irradiación; b) (t=0 s) Se enciende el láser; c) el
tentáculo detecta la arginina desenjaulada; d) (t= 3 s) El láser se
apaga; e, f) respuesta de los tentáculos; g, h) contracción rápida
del tentáculo; i-k) otros tentáculos ayudan para llevar el alimento
a la boca; l) culmina la respuesta. Ver video con el código QR.
47
En los experimentos mencionados se estimulaba y se observaba el
comportamiento del individuo entero. Otros experimentos consistieron en
fotoliberar el aminoácido a tentáculos únicos previamente seccionados del
animal. Para ello se cortaron tentáculos de las hidras y se estimularon con
soluciones de 400 M de RuBi-Arg. Segundos después de que la arginina es
fotoliberada cerca del extremo del tentáculo la contracción comienza hasta
Figura 3.12 Panel izquierdo: secuencia de eventos (respuesta de
alimentación) activada por fotólisis local de una solución de 77 µM de
RuBi-Arg.
Panel derecho: mismo experimento realizado a 100 µM RuBi-Arg.
Ver video con código QR
48
que su longitud total se acorta a menos de un tercio de su extensión original
(ver figura 3.13). Como el tentáculo no está adherido a ningún cuerpo masivo,
la contracción mantiene su centro de masa prácticamente inalterado. Aunque
algunos experimentos similares pueden realizarse mediante la aplicación
directa de un fármaco libre mediante una inyección con picospritzer, el
procedimiento de fotoliberación es el único que garantiza un entorno libre de
perturbaciones mecánicas
Figura 3.13 Secuencia de la contracción de un solo tentáculo de
Hydra vulgaris provocada por la liberación de arginina de una
solución de 400 M de RuBi-Arg utilizando una fibra óptica
representada en la Figura 2. a) 1 segundo antes de la irradiación.
b) 0 s. c) 4.9 s. d) 8.3 s. Irradiación láser (445 nm) de 0 a 3.5 s.
Ver video con código QR
49
Para confirmar que la liberación de Arginina es el único promotor de la
respuesta de alimentación, en lugar de la luz en sí misma, un posible proceso
fotoredox debido a la irradiación o del complejo acuo generado, se realizaron
dos pruebas adicionales. En primer lugar, la irradiación se dirigió a los
tentáculos de hidra en agua dulce artificial de hidra, en ausencia de cualquier
complejo de Ru-bipiridina (figura 3.14 panel izquierdo).
Figura 3.14 Panel izquierdo: Secuencia de imágenes que
muestran los eventos que ocurren después de la irradiación con
el láser cerca de un tentáculo en un baño que contiene solución
artificial de agua dulce hidra.
Panel derecho: el mismo experimento con una solución 1,0 mM
del complejo de [Ru(bpy)2PMe3(H2O)]2+
Ver video con código QR
50
En un segundo experimento se utilizó una solución 1 mM del complejo acuo
[Ru(bpy)2PMe3(H2O)]2+. En ninguno de los dos experimentos se observó la
activación de la respuesta alimentaria en hidra (ver figura 3.14, derecha),
demostrando así que efectivamente es la fotoliberación de la arginina quién
promueve el comportamiento de alimentación.
3.3.5 Análisis del sistema de irradiación
Es conocido que la excitación multifotónica permite un seccionamiento real
del eje z, lo cual permite direccionar la acción fotoquímica a un mínimo
volumen focal en vez de todo un cono de luz. Para obtener esta precisión
exquisita deben emplearse costosos láseres de femtosegundo. Por el contrario,
la óptica lineal no puede utilizarse para alcanzar este objetivo. Este hecho es
particularmente problemático cuando se requiere una localización 3D precisa
en entornos densos. Para poder obtener una respuesta fisiológica en un
pequeño volumen 3D utilizando un simple diodo láser, hemos diseñado una
sonda de fibra óptica que, en condiciones específicas, puede utilizarse para
conseguir una activación focal submilimétrica.
Por lo general, la excitación lineal se realiza en un régimen de baja absorción,
y por lo tanto el haz de luz se dirige lejos del plano focal. En nuestro caso, se
optó por utilizar condiciones de alta absorción e irradiación de fibra óptica.
Esta configuración evita que las zonas alejadas de la punta de la fibra sean
irradiadas, ya que la mayor parte de la luz ya fue absorbida en las
proximidades de la punta. Una de las claves para conseguir esta alta
absorción es el uso de la excitación azul (445 nm), con el fin de aprovechar la
alta absortividad molar de RuBi-Arg en esta longitud de onda (445nm= 6,2 *10-
3 M-1 cm-1). El rendimiento cuántico a 445 nm se midió de la forma habitual,
dando ɸPD (445) = 0.18. La Figura 3.15 muestra el sistema de fotoliberación y
las definiciones básicas de las coordenadas usadas para modelarlo. Por otro
lado, una medida experimental de la emisión del complejo excitado con una
luz de 445 nm desde la punta de la fibra óptica se puede ver en la Figura
3.15b. Se puede notar que la emisión disminuye abruptamente debido al
efecto de filtro interno de la solución rodeada.
51
Figura 3.15 Representación del sistema de irradiación usado en los ensayos
realizados. a) Imagen de la emisión de la solución durante la irradiación. b) Definición
de las coordenadas del haz de luz en las direcciones r y z. c) Imagen de simulación
de la fracción molar de la arginina liberada después de la irradiación. (p=30 mW,
t=3s, =445 nm, [RuBi]0=1 mM, NA=0.11, barr = 300 m).
El análisis del sistema de irradiación se realizó utilizando coordenadas
cilíndricas mediante el software FlexPDE 5. El origen de los vectores (r,z) se
encuentra en el centro de la punta de la fibra. Se considera que el haz tiene
una dependencia radial gaussiana g (r,z) con cintura mínima w0 a z=0. El área
(A) cubierta por el cono de luz aumenta con z, ya que A = NA2z2 + w02, donde:
NA es la apertura numérica de la fibra, que puede ser medida en el sistema
experimental. Suponiendo que las absortividades de RuBi-Arg y el complejo
acuo obtenido son similares, la cantidad diferencial de Arg que aparece en
cualquier punto (r,z) en un diferencial de tiempo dt es:
𝜕𝑐
𝜕𝑡= (𝐶𝑂 − 𝐶)𝐼𝑂𝜑𝑃𝐷𝑔(𝑟, 𝑧)𝑇(𝑟, 𝑧)
1
𝐴(𝑧)+ ∗ 𝐷∇𝐶 (1)
Donde:
- Co es la concentración de RuBi-Arg
- Io es la densidad de potencia del láser en la punta.
- ɸPD es el rendimiento cuántico de fotoliberación.
a b c
52
- T es la transmitancia de la solución en el punto (r,z)
- D es el coeficiente de difusión del complejo.
Reemplazando los parámetros experimentales y resolviendo la ecuación por
diferencias finitas para una irradiación total de 3 segundos, se calculó la
imagen en falso color de la Fig. 3.15c. Se puede observar que la concentración
de Arginina alcanza el máximo posible (1,0 mM) a distancias inferiores a 1
mm, mientras que a distancias mayores disminuye abruptamente, alcanzando
un 10% del máximo a 2 mm. Este efecto se debe en parte a la menor densidad
de luz lejos de la punta, pero principalmente al efecto pantalla de la solución
de alta absorbancia que impiden la llegada de luz a las secciones distantes del
haz de excitación. Si se utilizan concentraciones más bajas de arginina
enjaulada, se puede obtener un efecto de pantalla similar añadiendo una
cantidad equivalente de un complejo de rutenio no fotoactivo (es decir,
[Ru(bpy)3]2+, o de otro colorante que absorba cerca de la longitud de onda de
irradiación.
3.4 Conclusiones
La irradiación por fibra óptica de las soluciones RuBi-Arg representa una
herramienta ideal para activar la respuesta de alimentación en Hydra vulgaris
sin efectos secundarios de índole mecánica. Gracias a este sistema se logró
desacoplar las perturbaciones directas de presión y velocidad del medio (como
en la inyección rápida) y también la perturbación química debido al aumento
en la concentración de Arginina en el medio cuando es fotoliberada.
53
Capítulo 4.
Norepinefrina fotoactivable para sondear circuitos neuronales
adrenérgicos
4.1 Introducción
En este capítulo se describe la síntesis, caracterización y propiedades
químicas de los complejos cis-[Ru(bpy)2PMe3(nore)](PF6)2 y cis-
[Ru(bpy)2(PMe3)(D-ser)]2+ que liberan norepinefrina y D-serina al absorber luz
visible. Adicionalmente, se muestra la fotoliberación de la norepinefrina
mediante la modulación de la frecuencia de disparo de los potenciales de
acción en neuronas del locus coeruleus.
4.1.2 D- serina.
La D-serina es un enantiómero del aminoácido común, L-serina. Fue el
segundo aminoácido en configuración “D” en identificarse en cerebros de
mamíferos88, hasta hace relativamente poco se creía que solo se encontraba
en bacterias. Se encuentra en cantidades considerables en la corteza cerebral,
el hipocampo, y la amígdala.89 En el organismo se sintetiza a partir de la L-
serina por la serina racemasa (SRR), y la D-aminoácido oxidasa (DAO) la
degrada.
Figura 4.1 Estructura del aminoácido D-serina.
54
Este aminoácido es un regulador fisiológico de los receptores NMDA, un tipo
de receptor del neurotransmisor glutamato, ya que actúa sobre el sitio de
unión de glicina del receptor.89–91 Para que el receptor se abra, el glutamato,
la glicina o la D-serina deben enlazarse a los sitios de unión específicos que
tiene el receptor NMDA. Dicho receptor juega un papel muy importante en la
transmisión excitatoria y la plasticidad sináptica en el sistema nervioso
central. Se ha asociado a varios procesos fisiológicos como la formación de la
memoria, y la plasticidad sináptica en el desarrollo.92,93 Algunos estudios
sugieren que los niveles bajos de D-serina y sus efectos en los canales NMDA
pueden ser relevantes para la esquizofrenia. La administración de D-serina en
pacientes esquizofrénicos ha mostrado efectos beneficiosos, ya que existe una
relación estrecha entre niveles bajos de este aminoácido y la disfuncionalidad
de los receptores NMDA.94,95
La mayoría de los trabajos de serina enjaulada corresponde a compuestos
fotoactivables del aminoácido en configuración L, activados con luz
ultravioleta y utilizados para el estudio de cinéticas de transportadores y
receptores celulares en bacterias.96,97 Dada la importancia que presenta este
aminoácido en la regulación de los receptores NMDA y su estrecha relación
con la esquizofrenia. En este trabajo de tesis se presenta la síntesis y
caracterización de un compuesto fotoactivable de D-serina que permite
modular los canales de NMDA a conveniencia.
4.1.3 Norepinefrina:
La norepinefrina (NE) es un neurotransmisor que pertenece al grupo de las
catecolaminas, contiene un grupo catecol (un anillo bencénico con dos grupos
hidroxilo adyacentes) y una cadena de etilamina con un hidroxilo en el
carbono asímetrico, ver figura 4.2. La norepinefrina actúa como
neuromodulador, es decir, que la presencia de norepinefrina en una
determinada red neuronal no es suficiente para alterar el funcionamiento de
la red, sino que modula el efecto de otros neurotransmisores. En el organismo
es liberada por neuronas noradrenérgicas que se encuentran en el locus
coeruleus, núcleo que se encuentra en el tronco encefálico.
55
Figura 4.2 Estructura molecular de la norepinefrina.
El neuromodulador norepinefrina (NE) desempeña funciones fundamentales
en el sistema nervioso a través de la mediación de la atención,98–100
plasticidad,101,102 y en procesos de formación y consolidación de la
memoria.103 Algunos estudios han atribuido el trastorno por déficit de
atención e hiperactividad104,105 a un desequilibrio en los niveles de NE, así
como también en la depresión.106
Dadas las funciones de la NE en el sistema nervioso central (SNC) y la
diversidad de sus objetivos celulares, las herramientas para elucidar este
sistema neuromodulador son fundamentales para comprender sus múltiples
funciones. Un interés creciente por establecer la conectividad de los circuitos
noradrenérgicos ha llevado al desarrollo de dispositivos basados en NE para
detectar la actividad endógena de dicho neuromodulador, así como para
estimular o inhibir la liberación de NE. El desarrollo de sensores fluorescentes
como GRABNE107 y un nanosensor de NE basado en nanotubos de carbono,108
permiten la detección in vivo de la liberación endógena de NE. En un esfuerzo
por manipular los circuitos noradrenérgicos, varios grupos han activado o
inhibido optogenéticamente el locus coeruleus (LC) para estimular109–111 o
inhibir112 la liberación de NE en todo el sistema nervioso central (SNC). Si bien
la activación optogenética de LC proporciona un patrón espacial de liberación,
este patrón espacial es muy amplio y se dirige a muchas regiones del SNC.113–
115
Por otra parte, se ha demostrado que las neuronas del LC tienen la capacidad
de liberar dopamina junto con noradrenalina.116 Por lo tanto, en un esfuerzo
por proporcionar y desarrollar una herramienta tanto para sondear circuitos
56
noradrenérgicos con un mayor grado de precisión espacial como para aislar la
acción específica del NE en células y circuitos, se buscó desarrollar un
compuesto fotoactivable de NE basado en los complejos de rutenio bipiridina.
4.2 Parte Experimental
4.2.1 Síntesis
1. Síntesis del cis-[Ru(bpy)2(PMe3)(D-Ser)](PF6)2
Se disolvieron 267 mg del complejo cis-[Ru(bpy)2PMe3(OH)2](NO3)2 en 4,5 mL
de agua. Luego, se agregó 186,9 mg de D-serina y 350 L de NaOH 1M. El pH
obtenido fue cercano a 9. La mezcla de reacción se calentó a 70 °C durante 18
horas, se llevó a temperatura ambiente y se filtró. El filtrado obtenido se enfrió
a 0 °C y se acidificó con 100 L de HCl 1,0 M. Luego se agregaron muy
lentamente 4 equivalentes de una solución de KPF6 0,5 M. El precipitado
obtenido fue lavado varias veces con agua fría y se llevó al desecador. La
purificación del complejo se realizó utilizando el método de cristalización por
difusión de vapor mencionado en el capítulo 2, utilizando acetona y éter etílico
como solventes. Se obtuvo un sólido naranja con un rendimiento del 85 %.
El coeficiente de absortividad molar a máx (441 nm) = 5970 M-1cm-1 en
solución acuosa.
A continuación se presentan los resultados obtenidos para
1H-NMR (500 MHz, CDCl3), informándose: desplazamiento δ (integración,
multiplicidad, constante de acoplamiento).
Datos de 1H-NMR (500 MHz, D2O), δ(ppm)=9,21 (1H, d, 5,76 Hz); 9,02 (3H, dd,
5,76 y 22,56 Hz); 8,41 (4H, dd, 9,18 y 8,37 Hz); 8,28 (2H, dd, 8,10 y 8,37 Hz);
8,14 (6H,m); 7,86 (2H, t, 7,63 Hz); 7,70 (6H, m); 7,41 (4H, m); 7,19 (2H, t, 7,82
Hz); 7,04 (2H, t, 6,54 Hz), 3,89 (1H, t, 10,90 Hz); 3,83 (1H, d, 12,53 Hz), 3,60
(1H, d, 12,53 Hz); 3,53 (1H, dd, 3,81 y 11,99 Hz), 3,41 (1H, t , 11,99 Hz), 3,34
(1H, dd , 3,27 y 11,44 Hz), 3,27 (1H, dd , 9,26 y 11,44 Hz), 3,19 (1H, dd , 7,63
57
y 11,99 Hz), 2,86 (1H, t , 9,26 Hz), 2,31 (1H, t , 9,26 Hz), 1,05 (18H, d, 8,72
Hz).
2. Síntesis del cis-[Ru(bpy)2(PMe3)(Nore)](PF6)2
Cuidados: MUY IMPORTANTE: La norepinefrina se oxida en medio básico y
en aire, por ello, todas las soluciones son burbujeadas con argón durante una
hora antes de mezclar reactivos.
Se disolvieron 60,5 mg del complejo cis-[Ru(bpy)2PMe3(OH)2](CF3SO3)2 en 3,50
mL de agua. Está solución se burbujeó con argón durante 30 min. Luego, se
agregó 70,5 mg de norepinefrina bitartrato. Se dejó agitar por 10 min en bajo
atmósfera de argón y se agregó 23,9 mg de NaOH. El flujo de argón se dejó
durante 1,0 h después del agregado de la base. El sistema se cerró al vacío.
La mezcla de reacción se agitó y calentó a 63 °C durante 16 horas y se llevó a
temperatura ambiente. Se enfrió a 0 °C y se neutralizó con CH3COOH
concentrado. Se filtró la mezcla y al sobrenadante se le agregaron muy
lentamente 5 equivalentes de una solución de KPF6 0,5 M. El precipitado fue
lavado con agua fría 3 veces y se llevó al desecador. Se obtuvo un sólido
naranja con un rendimiento del 37 %.
El coeficiente de absortividad molar a máx (444 nm) = 7350 M-1cm-1 en
solución acuosa.
A continuación se presentan los resultados obtenidos para
1H-NMR (500 MHz, CDCl3), informándose: desplazamiento δ (integración,
multiplicidad, constante de acoplamiento).
Datos de 1H-NMR (300 MHz, D2O), δ(ppm)=9,36 (1H, d, 5,48 Hz); 9,27 (2H, d,
5,90 Hz); 9,10 (1H, d, 5,48 Hz); 8,87 (1H, d, 5,90 Hz); 8,86 (2H, d, 5,90 Hz);
8,74 (1H, d, 5,90 Hz); 8,40 (12 H, m); 8,15 (11 H, m); 7,90 (4 H, m); 7,73 (4 H,
m); 7,41 (4 H, d, 5,76 Hz); 7,36 (1H, s); 7,21 (3H, m); 7,02 (3H, t, 7,20 Hz);
6,60 (2H, d, 8,02 Hz); 6,33 (1H, t, 2,35); 6,31 (1H, t, 2,65 Hz); 6,26 (1H, d,
2,16); 6,22 (1H, d, 2,01); 4,39 (1H,t, 5,35 Hz); 4,32 (1H,d, 4,58 Hz); 3,88 (1H,t,
10,69 Hz); 3,36 (1H,t, 11,07 Hz); 3,07 (1H,t, 11,84 Hz); 2,39 (2H,d, 8,47 Hz);
2,15 (1H, m); 1,84 (1H, m); 1,53 (1H, m); 0,99 (1H, d, 9,36 Hz).
58
4.2.2 Modelos fisiológicos utilizados
Para confirmar la biocompatibilidad del complejo cis-
[Ru(bpy)2(PMe3)(Nore)](PF6)2 y evaluar su rendimiento como fotoliberador de
norepinefrina se realizaron una serie de experimentos de electrofisiología en
cortes cerebrales que contienen neuronas de LC.
1. Preparación de rodajas de cerebro y experimentos de electrofisiología
Se utilizaron ratones hembras Ai9+/-. Sus cerebros fueron extraídos y
sumergidos en una solución de slicing a -20°C compuesta por (mM): 222
sacarosa; 27 NaHCO3, 2,6 KCl; 2,0 MgSO4; 2,0 CaCl2; 1,5 NaH2PO4, que fue
burbujeada con 95% de O2/ 5% de CO2. Se prepararon cortes horizontales del
cerebro (350 µm) a nivel de las protuberancias en el tronco encefálico que
contenían el LC a partir de P28 – P34 TH-Cre+; Ai14+ y TH-Cre+; usando un
vibrátomo (VT1200; Leica) y usando solución de slicing. Las rodajas se
incubaron a 35 °C en fluido cerebro-espinal artificial (ASCF por sus siglas en
inglés) durante 30 min y luego se mantuvieron a temperatura ambiente hasta
el momento del registro. Composición del fluido ASCF (en mM): 123 NaCl; 26
NaHCO3; 10 dextrosa; 3 KCl; 2 MgSO4; 2 CaCl2; 1 NaH2PO4, burbujeado con
95% de O2/5% de CO2.
Las pipetas de Patch1 (resistencia de la punta de la pipeta 6–7 M, vidrio de
borosilicato, diámetro exterior 1,5 mm, diámetro interior 0,86 mm, Sutter
Instruments) se llenaron con la siguiente solución interna (en mM): 135 K-
metilsulfato, 10 KCl, 10 HEPES, 5 NaCl, 0.025 Alexa 594, pH 7.3 (ajustado
con KOH). La resistencia en serie osciló entre 15 y 30 MΩ, y la capacitancia
de la pipeta fue compensada. Las neuronas se registraron en la configuración
current-clamp2. El potencial de membrana en reposo medido para las neuronas
LC fue Vm~ 50mV.
1 Pipetas usadas para experimentos de electrofisiología 2 La configuración current-clamp hace referencia a que el experimento fue realizado
manteniendo fijo el valor de la corriente para registrar cambios en el potencial de
membrana.
59
2. Registro de las neuronas
Las neuronas se visualizaron usando microscopía de contraste DODT en un
microscopio vertical (Bruker) y las neuronas LC marcadas con la proteína
fluorescente tdTomato se identificaron usando una lámpara epifluorescente
EXFO X-Cite 120 (Excelitas) acoplada a un cubo de filtro rojo (TRITC-B-000,
Semrock). Se usó un objetivo NIR Apo 40X/0.80W (Nikon) y una cámara
infrarroja CCD en tiempo real (IR-2000, DAGE-MTI). Las grabaciones se
realizaron con un amplificador Multiclamp 700B (Molecular Devices) y se
adquirieron a una velocidad de 10 kHz con el software Prairie View 5.4.
3. Fotoliberación del cis-[Ru(bpy)2(PMe3)(Nore)](PF6)2 (RuBiNE)
Una vez que la neurona estaba en configuración whole-cell3 y en oscuridad se
añadió una solución madre de 10 mg/mL de RuBi-NE disuelta en ACSF a la
solución de baño4. La concentración final de RuBi-NE fue de 300 μM. Durante
el registro de campo, el complejo RuBi-NE se fotolizó irradiando con un pulso
de luz azul (446–486 nm) durante 10 ms a las neuronas de LC, usando una
lámpara epifluorescente EXFO X-Cite 120 (Excelitas) junto con un filtro de
paso de banda única de 466/40 nm (BrightLine, Semrock) con una potencia
aproximada de 14.3mW. Se añadió clorhidrato de idazoxano (Sigma Aldrich,
2 M) a la solución de baño ACSF para confirmar que el complejo RuBi-NE
estaba actuando sobre las neuronas a través de receptores adrenérgicos 2.
4.3 Resultados
4.3.1 Síntesis
Se lograron sintetizar los complejos cis-[Ru(bpy)2(PMe3)(Nore)](PF6)2, por
simplificación RuBiNE y el cis-[Ru(bpy)2(PMe3)(D-ser)](PF6)2, RuBi-Dser. El
monitoreo de la síntesis se realizó por absorción UV-vis, comparando el
3 Configuración whole-cell indica que el registro del cambio de potencial de membrana se
realizó sobre toda la célula. 4 La solución de baño es la solución externa donde se mantienen las células.
60
espectro de la mezcla de reacción con el complejo de partida, cis-
[Ru(bpy)2(PMe3)(OH2)](PF6)2, (RuBi-acuo).
Cuando se forma completamente el complejo y no hay presencia de RuBi-acuo
no hay cambios en el espectro al aumentar el pH. Esto no se vio con el
complejo RuBiNE, en cambio se observó siempre un equilibrio entre el
compuesto RuBiacuo y el RuBiNE. El agregado de NE en gran exceso no
favoreció la formación de productos. Por otra parte, se logró obtener con alto
gardo de pureza el complejo RuBi-Dser, no así el complejo de norepinefrina.
Este compuesto se obtuvo como una mezcla del complejo RuBiNE y los
complejos cis/trans-[RuBiacuo], sin embargo, no se observó la presencia de
ligando libre NE, por lo que la mezcla obtenida pudo ser utilizada en
preparaciones de electrofisiología. En la figura 4.3 se muestra el esquema
sintético.
Figura 4.3 Esquemas de reacción para la obtención de los complejos: Superior) cis-
[Ru(bpy)2(PMe3)(Nore)](PF6)2.Inferior) cis-[Ru(bpy)2(PMe3)(D-ser)](PF6)2
61
4.3.2 Caracterización química.
1. Caracterización del complejo cis-[Ru(bpy)2(PMe3)(D-ser)](PF6)2
En la figura 4.4 se muestran el espectro 1H-RMN del complejo RuBi-Dser.
Todas las señales se encuentran duplicadas debido a la presencia de los
diastereoisómeros: Ʌ-Ru/LD-Ser y Δ-Ru/LD-Ser. A campo bajo en la zona
aromática se observan las señales típicas de los hidrógenos de las bipiridinas,
las cuales integran para un total de 32 hidrógenos (la integración no es
mostrada en el espectro).
Figura 4.4 1H-RMN protónico del cis-[Ru(bpy)2(PMe3)(D-Ser)]2+ en D2O. a) zona
arómatica y b) zona alifática.
A campo alto se observan las señales del aminoácido coordinado. Los picos
identificados como CΔ1, CΛ
2, CΔ2 y CΛ
1 y que aparecen a 3,89; 3,83; 3,60 y 3,41
ppm corresponden a los hidrógenos sobre el nitrógeno. Estas señales aparecen
7.07.58.08.59.09.5
/ ppm
1.02.03.04.0
C1 C2
B2 B1
A
AΛ A Δ
BΛ2 BΔ1
BΔ2
BΛ1
CΛ1 CΛ2 CΔ1 CΔ2
PMe3
a)
b)
62
en este tipo de compuestos Ru(bpy) debido a que una vez formado el enlace
de coordinación no es posible el intercambio isotópico con el solvente
deuterado.34
Es característica la multiplicidad que presentan estos picos. Las señales CΔ1 y
CΔ2 se muestran como tripletes, mientras que CΛ
1 y CΛ2 como dobletes. Como
se observa en la proyección de Newman de la figura 4.5 por la disposición de
los átomos en la molécula, uno de los hidrógenos sobre el grupo amino no se
acopla con el hidrógeno del carbono adyacente (AΔ1) y, por lo tanto, se observa
como un doblete. El segundo hidrógeno (CΔ2) del amino sí se acopla con el
hidrogeno quiral vecino (AΔ1) y con el primer hidrógeno del nitrógeno (CΔ
1) y se
observa como un triplete.
Figura 4.5 Proyección de Newman para el complejo RuBi-Dser.
Los tripletes a 2,86 y 2,31 ppm señalados como AΔ y AΛ corresponden al
hidrógeno sobre el carbono asimétrico. En este caso del HA de cada
enantiómero se acopla con un hidrógeno sobre el nitrógeno y solo uno de los
hidrógenos diasterotópicos vecinos, ver figura 4.6.
Los hidrógenos geminales se identifican como BΔ1, BΛ
1, BΔ2 y BΛ
2. En el Ru-
Dser aparecen como doble-doblete a (3,41; 3,34; 3,27 y 3,19 ppm) debido a
cada hidrógeno se acopla con el segundo protón geminal y con el hidrógeno
del carbono quiral. A 1,05 ppm se observa un pico muy intenso asignado para
los protones de la fosfina (PMe3) e integra para 18H.
Δ-[Ru→L] Λ-[Ru→L]
63
Figura 4.6 Configuración de cuña para poder observar el acoplamiento del HA cuando
la D-serina está coordinada al centro metálico.
Para comprobar sí se libera D-serina cuando se irradia una solución del
complejo RuBi-Dser se tomaron espectros protónicos a distintos tiempos de
irradiación. En la Figura 4.7 se muestra el monitoreo por RMN de la reacción
de fotólisis del complejo. Los espectros medidos fueron a t = 0 s, t = 30 s y t =
150 s y luego se realizó un agregado de patrón para identificar las señales del
ligando libre.
A campo bajo se observa la presencia de nuevas señales correspondientes a
los protones de la bipiridina de los complejos cis/trans-[Ruacuo] formados una
vez que se libera el ligando.
A medida que aumenta el tiempo de irradiación se puede ver como van
desapareciendo las señales del -NH2 coordinado y en su lugar aparecen las
señales de la D-serina libre. El hidrógeno HA (3,73 ppm) cambia su
multiplicidad en el ligando libre, ya no se muestra como triplete sino como un
doble-doblete debido a que se acopla a los hidrógenos geminales (HB1 y HB
2).
En el ligando libre las señales de –NH2 no se observan debido a que el
intercambio con el D2O es muy rápido y no se puede detectar en las
condiciones que se realiza la medida.
Δ-[Ru→L] Λ-[Ru→L]
64
Figura 4.7. Espectros 1H-RMN de la fotoliberación del compuesto cis-
[Ru(bpy)2(PMe3)(D-ser)]2+ en D2O irradiando con un láser de 525 nm. a) Zona
aromática y b) zona alifática del espectro protónico. En el cuadrado de línea punteada
se muestran las señales del ligando libre y del complejo trans-[Ruacuo] formados.
A campo alto las señales de los hidrógenos de la fosfina del RuBi-Dser
desaparecen y aparecen dos dobletes, los cuales corresponden a los protones
de los metilos de los complejos cis y trans-[Ruacuo].
7.07.58.08.59.0
/ ppm
01234
patrón
t= 150 s
t= 30 s
t= 0 s
patrón
t= 150 s
t= 30 s
t= 0 s
A
B2
B1
A
B1 B2
65
En el monitoreo de la reacción de fotólisis demostró que no se genera
productos secundarios a los esperados y que la molécula enjaulada se
recupera.
2. Caracterización del complejo cis-[Ru(bpy)2(PMe3)(Nore)](PF6)2
Se determinó por RMN la estructura del complejo RuBiNE. En la figura 4.8 se
muestran el espectro 1H-RMN.
Figura 4.8 Espectro 1H-RMN del complejo cis-[Ru(bpy)2(PMe3)(NE)]2+ en D2O. a) zona
arómatica y b) zona alifática.
Tal como se mencionó anteriormente se obtuvo una mezcla del complejo
RuBiNE y los cis/trans-Ruacuo, sin la presencia de ligando libre. Por lo tanto,
se analizará de forma completa las señales referentes a la norepinefrina (NE)
coordinada y libre para determinar si efectivamente se da la coordinación y si
6.57.07.58.08.59.09.5
/ ppm
0.51.01.52.02.53.03.54.04.5
a)
b)
F
E
D
B2
C2 A C1
B1
FΛ, Δ EΛ, Δ
DΛ, Δ
AΛ
A Δ CΛ
1 CΛ
2 CΔ
1 CΔ
2
BΛ1
BΔ1
BΔ2 BΛ
2
PMe3
66
se libera el ligando sin descomponerse. Debido a que el complejo de partida
cis-[Ru(bpy)2(PMe3)(OH2)]2+ está presente como mezcla racémica en el complejo
también se presentan las señales duplicadas por los diasterómeros: Ʌ-Ru/LNE
y Δ-Ru/LNE. En la zona aromática además de observarse los picos de los
hidrógenos de las bipiridinas aparecen los protones del anillo aromático de la
norepinefrina, señalados como D, E y F.
En la zona alifática las señales de los hidrógenos sobre el nitrógeno aparecen
como tripletes a 3,88; 3,36; 3,07 y 2,39 ppm, cada hidrógeno se acopla con el
segundo hidrógeno sobre el amino y con uno de los hidrógenos geminales del
carbono adyacente. El hidrógeno del carbono quiral para cada diasterómero
(AΔ y AΛ) aparece 4,39 y 4,32 ppm. Este hidrógeno se acopla con los hidrógenos
geminales (HB1 y HB
2)
Los hidrógenos geminales identificados como BΔ1, BΛ
1, BΔ2 y BΛ
2 aparecen como
multipletes porque cada hidrogeno se acopla con: el hidrógeno geminal
restante, los hidrógenos del grupo amino (HC1 y HC
2) y el hidrógeno del carbono
quiral (HA). En el complejo RuBiNE se observan los picos de la fosfina del
complejo RuBiacuo, en el complejo RuBiNE y a campo muy alto la fosfina del
isómero trans-[Ruacuo].
La fotoliberación de la norepinefrina se monitoreó por 1H-RMN para distintos
tiempos de irradiación usando LEDs de 525 nm, ver figura 4.9. Luego se
realizó un agregado de norepinefrina libre.
Cuando solución del complejo es fotolizada se puede observar en la zona
aromática la aparición de los picos correspondientes a los hidrógenos del
anillo aromático (D´, E´ y F´) a 6,80, 6,79 y 6,70 ppm. Asimismo, desaparecen
las señales del amino coordinado (CΔ1, CΛ
1, CΔ2 y CΛ
2). Los picos que aparecen
a 4,07 y 3,11 ppm (HA´ y HB´) corresponden a los hidrógenos del carbono
asimétrico y del metileno en la norepinefrina libre. En la NE libre los
hidrógenos HB´ se acoplan con HA y su multiplicidad es un doble-doblete.
Los picos de los metilos de la PMe3 que aparecen a campo alto disminuyen su
intensidad y aumentan las señales de los complejos acuo. Se observa que el
doblete a 0,55 ppm aumenta su intensidad y corresponde con el complejo
67
trans-[Ruacuo], mientras que el doblete a 0,41 ppm parece ser el isómero trans
coordinado a norepinefrina libre, esto puede deberse a una recaptación del
ligando. Cuando se realiza el agregado de patrón se observa un incremento
significativo en la intensidad de los picos de la norepinefrina libre y el
desplazamiento de las señales se debe a que cambia el pH de la solución.
Figura 4.9. Fotoliberación de norepinefrina del compuesto cis-[Ru(bpy)2(PMe3)(NE)]2+
en D2O seguida por 1H-RMN. a) Zona aromática y b) zona alifática del espectro
protónico. La solución se irradió con un diodo láser verde 525 nm.
/ ppm
012345
6789
A´
B2
E´ D´
F´
B1
Nore coordinada
Nore libre
patrón
b)
t= 60 s
t= 30 s
t= 0 s
a)
patrón
t= 60 s
t= 30 s
t= 0 s
68
La fotólisis muestra que la molécula de norepinefrina es liberada sin sufrir
daños en su estructura cuando se irradia.
3. Fotoliberación por espectroscopia UV/vis.
La fotoliberación también se monitoreó por espectroscopia UV-vis de modo de
obtener una medición cuantitativa de su rendimiento. En la figura 4.10 se
puede observar los espectros de absorción de la reacción de fotólisis para cada
complejo. Al irradiarse una solución de cada compuesto se observa la
presencia de un único punto isosbéstico (433 nm y 438 nm para el RuBi-Dser
y RuBiNE, respectivamente), el cual indica que se ha generado solo una
especie coloreada, el complejo acuo [Ru(bpy)2(PMe3)(OH2)]2+. En realidad, se
genera una mezcla de cis y trans, pero la proporción de estos isómeros se
mantiene constante a lo largo de la irradiación.
Figura 4.10 Izquierda: Espectros de UV/vis de una solución 94 M de RuBi-Dser
durante la fotólisis en H2O (T=25°C, pH=, = 405 nm, potencia = 110 mW). Inserto:
moles de fotoproducto vs. tiempo. Línea sólida: ajuste de la Ec.1(capitulo2) para ɸPD
= 0,09. Derecha: Espectros de UV/vis de una solución 60 M de RuBi-NE durante la
fotólisis en H2O (T=25°C, pH= 4, = 454 nm, potencia = 10.8 mW). Inserto: moles de
fotoproducto vs. Tiempo, ɸPD = 0,08.
En el interior de cada figura se muestra un gráfico de la velocidad de
fotoproducto generado cuando se irradia la solución. Para ambos complejos
/ nm
400 500 600 700
Abs
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
t / s
0 200 400 600
foto
pro
ducto
s /
nm
0
40
80
120
160
200
/ nm
400 500 600 700
Abs
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
t / s
0 50 100 150 200 250
foto
pro
ducto
s /
nm
0
40
80
120
160
200
69
en las condiciones que se realizaron las medidas es muy rápida la reacción de
fotólisis. En un intervalo de 200 s la liberación de la molécula enjaulada se
completó. Se obtuvieron eficiencias cuánticas de fotoliberación φlib = 0,07 para
RuBiNE y φlib = 0,09 para el complejo RuBi-Dser, valores más bajos respecto
de lo esperado. Los complejos análogos [Ru(bpy)2(PMe3)(Dopa)]2+ 34,
[Ru(bpy)2(PMe3)(GABA)]+ 87, [Ru(bpy)2(PMe3)(Arg)]2+ 117 tienen la misma
absorción pero presentan más actividad que los complejos sintetizados, lo que
sugiere que puede haber cierto grado de recaptación de ambas moléculas
luego de la fotoliberación.
Una vez caracterizados los complejos se procedió a probar su efectividad en
preparaciones biológicas. Para confirmar la biocompatibilidad del complejo
cis-[Ru(bpy)2(PMe3)(Nore)](PF6)2 y evaluar su rendimiento como fotoliberador
de norepinefrina, se realizaron una serie de experimentos de electrofisiología
en cortes cerebrales que contienen neuronas de Locus coeruleus. Las
aplicaciones del complejo cis-[Ru(bpy)2(PMe3)(D-ser)](PF6)2 está siendo llevadas
a cabo pero no serán descritas en este trabajo pues no están dentro del
enfoque de esta tesis.
4. Fotoliberación del cis-[Ru(bpy)2(PMe3)(Nore)](PF6)2 en neuronas LC.
Los siguientes procedimientos para determinar la aplicabilidad del compuesto
se llevaron a cabo en el laboratorio de la Dra. Kira Poskanzer. Primero, se
identificaron las neuronas LC para hacer los registros. Para ello se cruzó una
línea de ratón que expresa Cre en las neuronas LC (TH-Cre) con una línea
indicadora fluorescente inducible por Cre (Ai14). La Cre es una enzima
recombinasa que promueve la expresión de la proteína fluorescente TdTomato
(emite a 581nm), la cual presenta emisión en el rojo. Estas neuronas
marcadas con fluorescencia exhibieron la morfología típica de los somas
neuronales LC. Se hicieron registros de patch clamp en configuración whole-
cell y además se hizo un control colocando Alexa 594 en la solución de la
pipeta para confirmar que está se distribuyó en toda la neurona (Figura 4.11).
70
Los registros en configuración current-clamp mostraron que las células
dispararon espontáneamente potenciales de acción (AP por sus siglas en
inglés), como ha sido descrito anteriormente.118–120 Se aprovechó de que las
neuronas LC expresan los receptores adrenérgicos 2 (ARs), y dado que la NE
activa estos receptores, entonces se inhibe la respuesta de la célula
observando una disminución en los disparos de AP.121
Figura 4.11. Imagen representativa de una neurona LC identificada para el registro.
Izquierda: imagen de contraste DODT de una neurona LC antes del registro; la línea
punteada marca el soma. Centro: imagen de la neurona LC fluorescente que expresa
td Tomato. Derecha: imagen de la excitación en 2P de la misma neurona LC en
configuración whole-cell patch-clamp, dializada con Alexa 594. La pipeta de patch se
muestra en el borde superior izquierdo de la celda.
Por lo tanto, en otro experimento control se agregó 30 μM de NE en la solución
de baño ACSF y se confirmó una marcada disminución en el número de
disparos de AP (Figura 4.12). Este hecho plantea que cualquier aumento de
NE disminuirá el número de disparos de los potenciales de acción en la célula.
Figura 4.12. Trazado representativo del patrón de disparos espontáneos de APs de
la neurona LC en la configuración current-clamp. La aplicación de NE en la solución
de baño (30 M) ocurre 30 s después del inicio del trazado (está representado como
una barra negra).
Aplicación de 30 M de NE
71
Para probar si la fotoactivación de RuBiNE causa un aumento local de NE en
la célula, se agregó RuBi-NE a la solución de baño (ACSF), sin ningún
agregado adicional de NE. En primer lugar, se confirmó que la RuBiNE en la
solución de baño no cambia la actividad de la neurona. Al observar los gráficos
de la izquierda y medio de la figura 4.13 en donde se representa el número de
disparos de AP en relación al tiempo se observó que no varían
significativamente cuando se expone la célula a la solución de baño ACSF
(1.94 ± 0.31 AP/s) y al complejo RuBiNE (2.09 ± 0.10 AP/s).
Sin embargo, luego de irradiar con luz azul durante 10 ms, se observó una
disminución constante en la frecuencia de disparos de APs (Figura 4.13 a, b
[arriba], c [medio]), lo que indica que se fotoliberó norepinefrina. Este efecto
no se observó en la solución ACSF cuando fue irradiada con luz (Figura 4.13c;
izquierda). Esto además indica que la luz en sí misma no causa un efecto
sobre la neurona.
Figura 4.13. a) Frecuencias de disparos de APs en una neurona LC antes de
fotoliberar RuBi-NE. La línea azul indica cuando se enciende el láser (laser encendido
= 10 ms). b) trazado de APs, arriba: antes de fotoliberar Rubi-NE; abajo: bloqueo de
los 2 ARs con una solución de idazoxanil (2 M). c) Promedio de los APs /s para una
neurona LC: izquierda: en una solución de baño ACSF (n = 8 pulsos de luz azul en 2
células); centro: en 300 M RuBi-NE (n = 14 pulsos de luz azul en 4 células); derecha:
en 300 M RuBi-NE + 2 M idazoxan ((n = 2 pulsos de luz azul en una célula). t= 0 s
indica el momento en que se enciende el láser.
AP
AP
AP
t / s t / s t / s
Pulso de luz (10 ms)
Pulso de luz (10 ms) Pulso de luz (10 ms) a) b)
c)
72
Para confirmar que la disminución en el número de disparos de AP se debió a
la fotoliberación de NE del complejo enjaulado y a la activación de los ARs 2,
se realizó el mismo experimento agregando una solución de idazoxan (2 M),
un antagonista de los receptores adrenérgicos 2, a la solución del baño ACSF
junto con RuBi- NE. Luego de la irradiación se observó un cambio en la
frecuencia de disparos de APs en las neuronas expuestas al idazoxan (Figura
13b [abajo], c [derecha]). Esto se debe a que el efecto inhibitorio de la NE es
bloqueado por la presencia del antagonista. Estos resultados muestran la
efectividad del complejo RuBiNE al aumentar específicamente la
concentración local de NE en las neuornas LC.
4.4 Conclusiones.
En este capítulo se mostró la síntesis y caracterización completa de dos
compuestos enjaulados que fotoliberan moléculas bioactivas presentes en el
organismo humano y que están relacionadas en procesos de aprendizaje,
memoria, plasticidad sináptica, entre otros. Se mostró la funcionalidad del
complejo RuBiNE para aumentar la concentración de NE de forma controlada
y en el momento deseado en un modelo biológico.
73
Capítulo 5.
Interconversión cis-trans en complejos de Rutenio(II)
Bipiridina
5.1 Introducción
Los complejos polipiridínicos de rutenio presentan una fotoquímica
interesante, que surge de la fuerte absorción en el visible debido a la transición
1MLCTdRuII → π*bpy, seguida por la población térmica de un estado
disociativo 3d-d. La vida media de este estado es lo suficientemente larga como
para producir reacciones fotoquímicas, generalmente se produce la liberación
de ligandos monodentados y un complejo de Ru(bpy)2-Solvente.51,122
Estas características han sido aprovechadas en la síntesis fotoquímica y en el
diseño de compuestos enjaulados activables por irradiación con luz
visible.25,36,87,123–125 También, se han reportado estudios teóricos relevantes
para esta familia de complejos.126,127 La mayoría de los trabajos están
dedicados a los complejos presentes en su forma cis, ya que es el isómero
térmicamente más favorable; mientras que sólo unos pocos reportan datos de
los isómeros trans, por ejemplo, para el compuesto di-acuo trans-
[Ru(bpy)2(H2O)2]2+ 44,128 o el complejo trans-[Ru(dcbpy)2(NCS)2.129
En este capítulo se presenta un estudio sistemático de la interconversión
fotoquímica entre los isómeros cis- y trans-[Ru(bpy)2(PMe3)(OH2)]2+. Con el
apoyo de metodologías computacionales se propone los posibles mecanismos
acerca de cómo ocurre está interconversión. Finalmente, se presenta un
estudio comparativo de las propiedades fotoquímicas entre complejos
análogos de la forma cis y trans que se sintetizaron.
74
5.2 Parte Experimental
5.2.1 Síntesis.
La síntesis del complejo cis-[Ru(bpy)2(PMe3)Cl)]Cl fue descripta en el capítulo
2, sección 2.1. La descripción de la síntesis se dividirá en dos grupos: isómeros
cis e isómeros trans.
1. Síntesis de los complejos trans.
1a. Síntesis del precursor: trans-[Ru(bpy)2(PMe3)(H2O)](CF3SO3)2, trans-
[Ruacuo].
A una solución del complejo cis-[Ru(bpy)2(PMe3)(H2O)](CH3SO3)2 se le
agregaron 5,0 equivalentes de CF3SO3 y se dejó agitando a 40 °C por 1,0 h.
Esta solución fue filtrada y se irradió con una lámpara Metal-Halide de 150 W
durante 3,5 h. La solución burbujeada previamente con argón se colocó en un
tubo hermético cerrado con agitación constante y en un baño agua-hielo (0°C)
durante el tiempo de irradiación. Después de 30 min de reacción se observó
el comienzo de la precipitación del isómero trans. Al finalizar la reacción, el
precipitado se filtró rápidamente y se lavó varias veces con una solución agua-
PF6 hasta que las aguas de lavado estuvieron a pH˃ 4. El precipitado se lavó
con terc-butanol y se secó al vacío. Se obtuvo un sólido rojo con un
rendimiento del 42 %.
El coeficiente de absortividad molar a máx (460 nm) = 9747 M-1cm-1 en
solución acuosa.
A continuación se presentan los resultados obtenidos para
1H-NMR (500 MHz, CDCl3), informándose: desplazamiento δ (integración,
multiplicidad, constante de acoplamiento).
Datos de 1H-NMR (500 MHz, D2O/Acetona-d6), δ(ppm)= 9,30 (4H, d, 5,66 Hz);
8,47 (4H, d, 8,32 Hz); 8,19 (4H, t, 7,68 Hz); 7,72 (4H, t, 6,65 Hz); 0,57 (9H, d,
9,95Hz).
A continuación se presentan los iónes representativos del análisis por
espectrometría de masas (MS), en donde [1] representa al complejo trans-
[Ru(bpy)2(PMe3)(H2O)]2+: MS (ESI+) m/z: 639,0417 = [[1] - H2O + CF3SO3]+;
75
254,0459 = [1]2+; 245,0444 = [[1] - H2O]2+; 216,0273 = [[1] - PMe3]2+; 207,0218
= [[1] - H2O - PMe3]2+ Anexo 1, Figura A2
1b. Síntesis del trans-[Ru(bpy)2(PMe3)(4-AP)](PF6)2
Se disolvieron 39,0 mg de complejo trans-[Ruacuo] en 2,0 mL de MeOH seco.
Luego se agregaron 5,0 equivalentes de 4-aminopiridina (4-AP) disueltos en
1,0 mL de MeOH. La reacción se calentó a 48,0 °C y se agitó durante 25 min.
El curso de la reacción fue seguido por espectroscopia UV-vis. Se dejó enfriar
hasta temperatura ambiente y luego se colocó en un baño de agua-hielo. Se
precipitó agregando gota a gota y muy lentamente 480 µL de una solución
KPF6 0,50 M. El sólido obtenido se filtró y lavó varias veces con agua. Se secó
al vacío. Se obtuvo un sólido naranja con un rendimiento del 90 %.
El coeficiente de absortividad molar a máx (470 nm) = 9820 M-1cm-1 en
solución acuosa.
Datos de 1H-NMR (500 MHz, D2O/Acetona-d6), δ(ppm)= 9,79 (4H, d, 5,67 Hz);
8,67 (4H, d, 8,21 Hz); 8,43 (4H, t, 7,74 Hz); 8,04 (4H, t, 6,75 Hz); 7,45 (2H, d,
6,17 Hz), 6,35 (2H, d, 6,17 Hz); 0,87 (9H, d, 9,01 Hz).
1c. Síntesis del trans-[Ru(bpy)2(PMe3)(Py)](PF6)2
Se disolvieron 50,0 mg de trans-[Ruacuo] en 2,6 mL de MeOH seco. Luego se
agregaron 100 L de una solución de piridina concentrada. La reacción se
calentó a 50 °C y se agitó durante 50 min. Se dejó enfriar hasta temperatura
ambiente y luego se colocó en un baño de agua-hielo. Se precipitó agregando
gota a gota 620 µL de una solución KPF6 0,50 M. El sólido obtenido se filtró y
lavó varias veces con agua. Se secó al vacío. Se obtuvo un sólido rojo con un
rendimiento del 69 %.
El coeficiente de absortividad molar a máx (458 nm) = 10320 M-1cm-1 en
solución acuosa.
Datos de 1H-RMN (500 MHz, Acetona-d6) δ (ppm) = 9.89 (4H, d, 5.58 Hz); 8.64
(4H, d, 8.30 Hz); 8.34 (4H, t, 7.84 Hz); 8.16 (2H, m); 7.99 (4H, t, 6.69 Hz); 7.76
(1H, t, 7.72 Hz); 7.20 (2H, t, 7.13 Hz); 0.84 (9H, d, 9.42 Hz).
76
1d. Síntesis del trans-[Ru(bpy)2(PMe3)(ImH)](PF6)2 :
Se disolvieron 21 mg de imidazol en 500 µL de MeOH seco y se mezclaron con
39,2 mg de trans-[Ruacuo] previamente disueltos en 2,0 mL MeOH seco. Esta
mezcla se calentó a 40 °C y agitó durante 40 min. Se dejó enfriar hasta
temperatura ambiente y luego se colocó en un baño de agua-hielo. Se precipitó
con la adición de éter etílico (5,0 mL). Se filtró y lavó 3 veces con éter etílico y
se secó al vació. El precipitado se obtuvo puro de esta forma. Se obtuvo un
sólido rojo con un rendimiento del 77 %.
El coeficiente de absortividad molar a máx (464 nm) = 8862 M-1cm-1 en
solución acuosa.
Datos de 1H-NMR (500 MHz, D2O/Acetona-d6), δ(ppm)= 9,81 (4H, d, 5,63 Hz);
8,67 (4H, d, 8,22 Hz); 8,33 (4H, t, 7,79Hz); 7,94 (4H, t, 6,92 Hz); 7,43 (1H, s),
7,00 (1H, s); 6,47 (1H, s); 0,80 (9H, d, 9,30 Hz).
Datos de MS en donde [4] representa al complejo trans-[Ru(bpy)2(PMe3)(ImH)]2+
(ESI+), m/z: 703.0875 [ [4] + PF6]+; 279.0617 [4]2+; 245.0430 [ [4] − ImH]2+;
207.0207 [ [4] − ImH − PMe3]2+ Anexo 1 Anexo 1, Figura A8
1e. Síntesis del trans-[Ru(bpy)2(PMe3)2](PF6)2: [6](PF6)2
95,0 mg de trans-[RuAcuo] se disolvieron en 2,0 mL de MeOH seco. A esta
solución, se agregaron 400 µL de una solución de PMe3 1,0 M en THF. Se
observó un cambio de color de la solución de rojo intenso a naranja claro. Se
mantuvo la agitación a temperatura ambiente durante 2 h. Luego, la mezcla
de reacción se llevó a 0°C y se precipitó el complejo agregando gota a gota 500
µL de una solución de KPF6 0,5 M. Se filtró y lavó 3 veces con una mezcla de
H2O: MeOH (1:1). Finalmente fue lavada con éter etílico. El sólido se secó al
vacío. Se obtuvo un sólido naranja claro con un rendimiento del 89 %.
El coeficiente de absortividad molar a máx (442 nm) = 11170 M-1cm-1 en
solución acuosa.
Datos de 1H-NMR (300 MHz, Acetona-d6), δ (ppm)= 9,66 (4H, d, 5,60 Hz); 8,82
(4H, d, 8,04 Hz); 8,40 (4H, d, 7,86 Hz); 7,97 (4H, d, 6,50 Hz); 0,65 (18H, d,
3,34 Hz).
77
Datos de MS en donde [6] representa al complejo trans-[Ru(bpy)2(PMe3)2]2+
(ESI+), m/z:283.0651 [[6] − 2PMe3]2+; 245.0450 [[6] − PMe3]2+; 207.0231
[6]2+.Anexo 1 Figura A12
1f. Síntesis del complejo trans-[Ru(bpy)2(PMe3)(PPh3)](PF6)2: [5](PF6)2
Se disolvieron 63,7 mg de trans-[RuAcuo] en 2,0 mL de MeOH. Se agregaron
10,0 equivalentes de PPh3 disueltos en MeOH. La mezcla de reacción se
calentó a 50°C durante de 3 h. Se llevó a temperatura ambiente y luego a 0°C
y se precipitó la trifenilfosfina que se encontraba en exceso. Se centrifugó y a
la solución sobrenadantese le agregaron 5,0 equivalentes de una solución de
KPF6. Se forma un precipitado naranja claro. Se centrifugó y el precipitado fue
lavado varias veces con MeOH y éter etílico. El sólido fue secado al vacío. Para
purificar el complejo, el sólido se disolvió en la mínima cantidad de acetona y
se precipitó con éter etílico. Se obtuvo un sólido naranja claro con un
rendimiento del 48 %.
El coeficiente de absortividad molar a máx (439 nm) = 10244 M-1cm-1 en
solución acuosa.
Datos de 1H-NMR (300 MHz, Acetona-d6), δ (ppm)= 9,29 (4H, d, 5,65 Hz); 8,58
(4H, d, 8,00 Hz); 8,32 ( 4H, t, 8,00 Hz); 7,80 (4H, t , 5,63 Hz); 7,40 (3H, t, 7,55
Hz); 7,16 (6H, t, 7,32 Hz); 6,41 (6H, t, 8,46 Hz); 0,55 (9H, dd, 9,40 Hz).
Datos de MS en donde [5] representa al complejo trans-
[Ru(bpy)2(PMe3)(PPh3)]2+ (ESI+), m/z: 376.0892 [5]2+; 338.0668 [[5] − PMe3]2+;
245.0430 [[5] − PPh3]2+; 207.0206 [[5] − PMe3 − PPh3]2+. Anexo 1, Figura A10
2. Síntesis de los complejos cis
2a. Síntesis del precursor: cis-[Ru(bpy)2(PMe3)(OH2)](CF3SO3)2; cis-
[Ruacuo]
50 mg de trans-[Ruacuo] se disolvieron en 3,0 mL de agua destilada. La mezcla
se calentó a 60C bajo atmósfera de argón durante 72,0 h. Una vez obtenido
el complejo cis-[Ruacuo] se liofilizó la solución para obtener el complejo en
forma sólida. Se obtuvo un sólido naranja con un rendimiento del 100 %.
78
El coeficiente de absortividad molar a máx (444 nm) = 6680 M-1cm-1 en
solución acuosa.
Datos de 1H-NMR (300 MHz, Acetona-d6), δ(ppm)=9,19 (1H, d, 5,79 Hz); 8,95
(1H, d, 5,50 Hz); 8,48 (1H, d, 8,16 Hz); 8,43 (1H, d, 8,08 Hz); 8,39 (1H, d, 8,25
Hz); 8,20 (1H, d, 8,25 Hz); 8,17 (1H, t, 8,25 Hz); 8,12 (1H, t, 8,25 Hz); 7,94
(1H, t, 7,83 Hz); 7,74 (4H, m); 7,46 (1H, s); 7,24 (1H, t, 6,58Hz); 7,02 (1H, t,
6,76 Hz); 1,03 (9H, d, 8,89 Hz).
Datos de MS en donde [2] representa al complejo trans-
[Ru(bpy)2(PMe3)(PPh3)]2+ (ESI+) m/z: 639,0388 = [[2] - H2O + CF3SO3]+;
245,0432 = [[2] - H2O]2+; 216,0262 = [[2] - PMe3]2+; 207,0208 = [[2] - H2O -
PMe3]2+. Anexo 1, Figura A4
2b. Síntesis del cis-[Ru(bpy)2(PMe3)(4-AP)](PF6)2
55,0 mg de cis-[Ruacuo] se mezclaron con 200 mg de 4-aminopiridina
disueltos en una mezcla de MeOH: H2O (1: 2,25) y se calentó a 70 °C durante
4 h. La mezcla fue llevada a temperatura ambiente. Luego, se enfrió en una
mezcla de agua-hielo. Se precipitó muy lentamente con 1,0 mL de una
solución de KPF6 0,5 M a 0 °C. Se filtró y el precipitado fue lavado con agua 5
veces y se llevó al desecador. La purificación del complejo se realizó
disolviendo en resina Dowex-Cl y luego precipitando con KPF6 0,5 M. Este
último paso se realizó por duplicado. Se obtuvo un sólido naranja con un
rendimiento del 98 %.
El coeficiente de absortividad molar a máx (443 nm) = 6041 M-1cm-1 en
solución acuosa.
Datos de 1H-NMR (500 MHz, D2O/Acetona-d6), δ(ppm)= 9,32 (1H, d, 5,66 Hz);
8,74 (1H, d, 8,10 Hz); 8,58 (1H, d, 7,67 Hz); 8,40 (2H, dd, 8,11 y 3.46 Hz);
8,32 (1H, d, 8,46 Hz); 8,24 (1H, t, 7,96 Hz); 8,12 (1H, t, 7,96 Hz); 7,85 (1H, t,
8,02Hz); 7,78 (2H, m); 7,66 (2H, d, 6,98 Hz); 7,50 (1H, d, ,2,77 Hz); 7,17 (1H,
t, 6,72 Hz); 6,35 (2H, d, 7,10Hz); 0,99 (9H, d, 8,36 Hz).
2c. Síntesis del cis-[Ru(bpy)2(PMe3)(Py)](PF6)2
50,0 mg de cis-[Ruacuo] fueron disueltos en 2,0 mL de agua destilada y luego
se mezclaron con 518 L de piridina y se calentó a 70 °C durante 3 h. La
79
mezcla fue llevada a temperatura ambiente. Luego, se enfrió en una mezcla de
agua-hielo. Se precipitó muy lentamente con 600 L de una solución de KPF6
0,5 M a 0 °C. Se filtró y el precipitado fue lavado con agua varias veces. Luego
se secó al vacío. Se obtuvo un sólido naranja con un rendimiento del 73 %.
El coeficiente de absortividad molar a máx (435 nm) = 6826 M-1cm-1 en
solución acuosa.
Datos de 1H-NMR (500 MHz, D2O/Acetona-d6), δ(ppm)= 9,40 (1H, d, 5,68 Hz);
8,80 (1H, d, 5,68 Hz); 8,67 (1H, d, 8,52 Hz); 8,48 (2H, d, 8,99 Hz); 8,45 (2H,
d, 5,21 Hz); 8,38 (1H, d, 8,05 Hz); 8,31 (1H, t, 7,57 Hz); 8,19 (1H, t, 8,05 Hz);
7,98 (1H, t, 8,05 Hz); 7,94 (1H, t, 7,81 Hz); 7,88 (1H, t, 6,78 Hz); 7,81 (3H, m);
7,63 (1H, d, 5,58 Hz); 7,42 (1H, t, 6,51 Hz); 7,27 (3H, m); 1,06 (9H, d, 8,67
Hz).
2d. Síntesis del cis-[Ru(bpy)2(PMe3)(ImH)](PF6)2: [3](PF6)2
90mg de cis-[Ruacuo] fueron disueltos en 3,0 mL de agua destilada. Luego se
agregaron 73 mg de Imidazol (ImH) y se calentó la mezcla a 50°C durante 24
h. Luego se enfrió a temperatura ambiente y se precipitó con 600 L de KPF6
0,5 M. Se filtró y se lavó el precipitado con agua varias veces. El sólido fue
secado al vacío. La purificación del complejo se realizó disolviendo en resina
Dowex-Cl y luego precipitando con KPF6 0,5 M. Este proceso se realizó por
triplicado. Se obtuvo un sólido naranja con un rendimiento del 60 %.
El coeficiente de absortividad molar a máx (431 nm) = 6037 M-1cm-1 en
solución acuosa.
Datos de 1H-NMR (500 MHz, D2O/Acetone-d6), δ(ppm)= 9,23 (1H, d, 5.45 Hz);
8,80 (1H, d, 8,35 Hz); 8,54 (1H, d, 7,35 Hz); 8,41 (1H, d, 7,85 Hz); 8,36 (1H,
d, 8,10 Hz); 8,33 (1H, d, 8,35 Hz); 8,20 (1H, t, 7,85 Hz); 8,09 (1H, t, 7,97 Hz);
7,91 (1H, t, 7,97 Hz); 7,84 (1H, t, 7,97 Hz); 7,73 (3H, m); 7,51 (2H, s); 7,30
(1H, t, 6,43 Hz); 7,17 (1H, t, 6,78 Hz); 7,02 (1H, t, 1,42 Hz); 6,76 (1H, t, 1,48
Hz); 0,99 (9H, d, 8,42 Hz).
Datos de MS en donde [3] representa al complejo trans-[Ru(bpy)2(PMe3)(ImH)]2+
(ESI+), m/z: 703,0878 [[3] + PF6]+; 279,0632 [3]2+; 245,0444 [[3] − ImH]2+;
207,0221 [[3] − ImH − PMe3]2+. Anexo 1, Figura A6
80
5.3 Resultados.
5.3.1 Síntesis y caracterización de los complejos acuo.
Al irradiar una solución del complejo cis-[Ru(bpy)2(PMe3)(OH2)](CH3SO3)2 se
obtuvo el isómero trans-[Ru(bpy)2(PMe3)(OH2)](CF3SO3)2 (Figura 5.1). Los
complejos trans del tipo Ru(bpy)22+ son menos solubles que los cis51 y con el
contraión adecuado (en este caso triflato) y en alta concentración precipitan
en solución. El isómero trans se obtuvo como un sólido de color rojizo intenso,
muy estable en fase sólida. Se puede almacenar por periodos largos (12 meses)
bajo condiciones mínimas de humedad, ya que es higroscópico y sus
soluciones tienden a isomerizar hacia la forma cis.
Figura 5.1. Esquema de la reacción fotoquímica entre las formas cis y trans para el
complejo -[Ru(bpy)2(PMe3)(OH2)]2+.
Figura 5.2. Espectro de absorción de los complejos cis (naranja) y trans-[Ruacuo]
(rojo).
cis-[Ruacuo] trans-[Ruacuo]
/ nm
400 500 600 700
Abs
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
81
En la figura 5.2 se observa el espectro de absorción correspondiente a ambos
isómeros -[Ruacuo]. La banda 1MLCT aparece a 460 nm para el trans-[Ruacuo]
y a 444 nm para el cis. Este desplazamiento a menores energías es
característico de los isómeros trans 44,51,130. Además, este isómero presenta un
coeficiente de absorción algo mayor respecto del cis.
La predicción de los espectros basada en cálculos (TD)DFT, muestra excelente
concordancia con las observaciones experimentales. Las bandas 1MLTC
Ru(II)→*bpy predichas para cis y trans concuerdan con los resultados
experimentales como se ve en la figura 5.3. Un resumen de los resultados para
cada isómero se ve en la tabla 5.1.
Figura 5.3. Espectro electrónico experimental y transiciones calculadas para cis-
[Ru(bpy)2(PMe3)(OH2)]2+ (izquierda) y trans-[Ru(bpy)2(PMe3)(OH2)]2+ (derecha).
Tabla 5.1. Parámetros de absorción de los isómeros cis / trans-
[Ru(bpy)2(PMe3)(OH2)]2+ referente a la transición 1MLTC.
-[Ruacuo] MLTC / nm
(TD)DFT
MLTC / nm
isom εmáx M-1cm-1
cis 444 432 0,105 6680
trans 460 464 0,158 9747
Asimismo, el espectro de RMN protónico muestra la naturaleza inequívoca del
isómero trans-[Ruacuo]. Presenta un patrón simple de señales en la zona
aromática correspondiente a los hidrógenos de las bipiridinas (bpy) que
aparecen como un conjunto de dos dobletes y dos tripletes. Este patrón simple
es el resultado de la alta simetría que presenta la bpy en el complejo trans, ya
200 300 400 500 6000
10000
20000
30000
40000
50000
(M
-1 c
m-1)
Wavelength / nm
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
Oscill
ato
r S
tre
ng
th
200 300 400 500 6000
10000
20000
30000
40000
50000
(M-1 c
m-1)
Wavelength / nm
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
Oscill
ato
r S
tre
ng
th
/ nm / nm
Fu
erz
a d
el oscilador
82
que los hidrógenos análogos de las bpy presentan el mismo entorno químico.
El caso contrario ocurre con los hidrógenos de la bpy en el complejo cis, en
que estas 4 señales se convierten en 16. (Figura 5.4 inferior) Esto se debe a
que las bpy se ubican en dos planos distintos.
En el complejo trans-[Ruacuo] el doblete que corresponde al acoplamiento de
los metilos en la PMe3 aparece a campo más alto respecto al isómero cis.
Figura 5.4 Espectros de 1H-RMN de los complejos acuo. Superior: trans-
[Ru(bpy)2(PMe3)(OH2)]2+. Inferior: cis-[Ru(bpy)2(PMe3)(OH2)]2+ (abajo). Los espectros
fueron realizados en D2O
Continuando con el estudio de estos isómeros acuo se optimizaron las
estructuras geométricas por DFT. Además, en el caso del isómero trans se
logró obtener un monocristal y determinar la estructura cristalográfica. En la
b c
0.57.58.08.59.09.5
/ ppm
12889910
a
b
b
c
c d
d
a e
e
83
figura 5.5a la geometría optimizada para el isómero cis-[Ruacuo] muestra a
los átomos ligantes ubicados alrededor del centro metálico en un octaedro
distorsionado. Ambas bpy se encuentran en distintos planos entre sí. Las
moléculas de H2O, PMe3 y el Ru2+ se disponen en un ángulo de 90°. Las
longitudes calculadas para los enlaces Ru-N, Ru-O y Ru-P son más largas que
las observadas experimentalmente para complejos relacionados. Estos
parámetros estructurales son consistentes con otros estudios que emplearon
la misma metodología computacional.
En la figura 5.5 b y c se muestran las estructuras optimizadas por DFT y por
difracción de rayos X del isómeros trans, respectivamente. La estructura
cristalográfica muestra a las moléculas de H2O y PMe3 dispuestas 177° entre
sí. Las dos bpy no se encuentran completamente sobre el plano del centro
metálico sino en forma ligeramente distorsionada.
Figura 5.5 Geometría de los complejos cis- y trans-Ru(bpy)2(PMe3)(H2O)]2+ a)
geometría optimizada (DFT) para cis-[Ruacuo]. b) geometría optimizada (DFT) para
trans-[Ruacuo]. c) Estructura cristalina del trans-[Ruacuo], en el interior se indican
las coordenadas de la celda unidad.
En la tabla 5. 2 se muestra las longitudes de enlace del isómero trans, de la
estructura cristalina y la optimización por DFT.
Tabla 5.2 Longitudes de enlaces para los isómeros cis y trans-[Ruacuo].
a b
c
a) b) c)
cis-[Ruacuo] trans-[Ruacuo]
84
Longitud de enlace (Å)
cis-[Ruacuo] DFT
trans-[Ruacuo] DFT
trans–[Ruacuo] DRX
Ru-N1 2.054 2.131 2.061
Ru-N2 2.079 2.136 2.093
Ru-N3 2.119 2.122 2.077
Ru-N4 2.105 2.134 2.107
Ru-O 2.204 2.21 2,169
Ru-P 2.497 2.433 2.247
5.3.2 Propiedades fotoquímicas
Una comparación entre ambos isómeros muestra una banda 1MLTC
desplazada al rojo y con mayor absorción para la forma trans. Esta
característica del complejo trans lo hace atractivo para el diseño de
compuestos enjaulados activos en la región de longitud de onda larga.
Cuando se irradia una solución que contiene inicialmente el complejo trans
puro se observa que rápidamente comienza a isomerizar hacia la forma cis, tal
como se muestra en la figura 5.6a. La fotólisis se realizó en solución acuosa
usando un diodo láser de 532nm. Se puede observar un único punto
isosbéstico, que indica la presencia de solo dos especies coloreadas, que
corresponden a los isómeros cis y trans-[Ruacuo].
Dado que la forma trans presenta desplazamiento batocrómico y mayor
absorbancia a 532 nm su producto ε532• será mayor que el correspondiente
al isomero cis, y por lo tanto, cuando se irradia con luz de esta longitud de
onda (532nm) el estado fotoestacionario se desplazará hacia la forma cis. Este
último presenta mayor absorbancia en el azul, por ende, si se irradia con un
láser de 405 nm, se observará el fenómeno contrario, enriqueciéndose la
mezcla estacionaria en la forma trans. El proceso de fotoisomerización
dificulta la obtención de las forma trans o cis puras, en cambio se obtiene un
85
estado fotoestacionario en el que están presentes las dos especies, una en
mayor proporción que la otra (ver figura 5.6b).
Figura 5.6 a) Espectros UV-Vis tomados durante la fotólisis de trans-
[Ru(bpy)2(PMe3)(OH2)]2+ en agua utilizando un láser de 532 nm. b) Fotoconversión
entre isómeros por irradiación con dos longitudes de onda diferentes.
Para conocer los parámetros que rigen la fotoquímica del proceso de
isomerización se utilizó un modelo simple, mostrado en el esquema de
reacción (esq1): donde ɸ1 y ɸ2 corresponde a los rendimientos cuánticos de
isomerización y k, es la constante cinética de la isomerización térmica trans-
cis. El mismo establece que la conversión de cis a trans se puede dar sólo por
vía fotoquímica y en cambio la conversión contraria puede ser de forma
radiativa o térmica.
𝑐𝑖𝑠 − [Ru(bpy)2(PMe3)(𝐻2𝑂)]2+ →𝜑1
←𝜑2
←𝑘
𝑡𝑟𝑎𝑛𝑠 − [Ru(bpy)2(PMe3)(𝐻2𝑂)]2+ esq.1
Entonces, la velocidad del proceso de conversión de la forma trans a cis es:
𝑑[𝑐𝑖𝑠]
𝑑𝑡= 𝑘𝑡[𝑡𝑟𝑎𝑛𝑠] + 𝐼0𝜑𝑡(1 − 10−𝜀𝑡l[trans]) − 𝐼0𝜑𝑐(1 − 10−𝜀𝑐𝑙[𝑐𝑖𝑠]) ec (1)
Donde I0 corresponde a la intensidad del láser con que se esté irradiando, εt y
εc indican las absorbancias molares de la forma trans y cis a la longitud de
onda de irradiación, l es el camino óptico. En un experimento de fotólisis
t / s
0 500 1000 1500 2000 2500
Xtr
ans
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
532 nm 405 nm
/ nm
400 500 600 700
Abs
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7trans
cis
a) b)
86
realizado a temperatura ambiente y bajo altas potencias de irradiación, se
puede considerar a k como despreciable. Si las absorbancias son bajas a la
longitud de irradiación (A<0.1), puede linealizarse la ecuación diferencial,
quedando:
𝑑[𝑐𝑖𝑠]
𝑑𝑡= 2.3 𝐼0𝑙(𝜀𝑡𝜑𝑡[𝑡𝑟𝑎𝑛𝑠] -𝜀𝑐𝜑𝑐[𝑐𝑖𝑠] ) ec (2)
Al resolver la ecuación (2) se tiene como resultado una monoexponencial de la
forma:
[𝑡𝑟𝑎𝑛𝑠] = 𝐴(1 − 𝑒−𝑘𝑡) + 𝐵 ; 𝑘 =2.3𝐼0
𝑉(𝜀𝑐𝜑𝑐 + 𝜀𝑡𝜑𝑡) ec (3)
En esta expresión V corresponde al volumen de reacción. Tanto, ɸc y ɸt
representan la eficiencia cuántica de la isomerización para las fotoreacciones
directa e inversa, respectivamente.
Debido a que el proceso de fotoisomerización ocurre en los dos sentidos, al
irradiar una solución cis o trans-[Ru(bpy)2(PMe3)(OH2)]2+ durante un tiempo
determinado siempre se tendrá una mezcla de ambos isómeros, cuyas
concentraciones relativas dependerán de la longitud de onda de irradiación
(ver Figura 5.6b). En el estado fotoestacionario la relación [cis]/[trans] viene
dada por el cociente εt ɸt / εc ɸc. El análisis de la fotólisis mostrada en la figura
5.6a arroja que la relación [cis]/[trans] equivale a 2,08. Al ajustar los valores
obtenidos en la ecuación 3, se obtiene un ɸt = 0,158 para el isómero trans y
ɸc = 0,105 para el cis.
El rendimiento cuántico de isomerización para el complejo trans es mayor que
para el cis. Este valor puede resultar sorprendente ya que muestra una
tendencia opuesta a la reflejada en los procesos de fotosustitución de
complejos cis-[Ru(bpy)2XY]n+ 51, que indican que un desplazamiento de la
banda 1MLCT a menores energías está asociado a una menor eficiencia
cuántica. Sin embargo, dado que se trata de compuestos con una estructura
electrónica muy diferente, sus propiedades no son directamente comparables
con la de los isómeros cis.
87
5.3.3 Conversión térmica de la especie trans- a cis-
[Ru(bpy)2(PMe3)(OH2)]2+
Para estudiar el proceso de conversión térmica de la forma trans a cis se
realizaron diversas cinéticas de reacción a distintas temperaturas (Tabla 5.3).
Se determinó la vida media del complejo trans-[Ru(bpy)2(PMe3)(OH2)]2+ en
solución acuosa, obteniéndose valores entre 14 h (a 30°C) y 30 min (a 60°C).
Esta relativa estabilidad junto a la rápida velocidad de intercambio de ligando
permite obtener diferentes complejos trans puros a partir del trans-
[Ru(bpy)2(PMe3)(OH2)]2+.
Tabla 5.3 Constantes cinéticas de la conversión térmica del isómero trans-
[Ru(bpy)2(PMe3)(OH2)]2+ a la forma cis.
T / °C 30 35 40 45 50 60
K * 10-4 / 0,135 0,246 0,722 1,06 2,81 4,57
t1/2 / h 14,2 7,83 2,70 1,80 0,70 0,50
El gráfico de la figura 5.7 muestra una entalpía y entropía de activación para
el decaimiento térmico de ΔH‡ = 118 kJ/mol y ΔS‡ = 50 J/Kmol,
respectivamente. Este último parámetro sugiere un camino disociativo para el
proceso de isomerización.
Figura 5.7 Diagrama de Eyring que describe el proceso de conversión térmica de
trans-[Ru(bpy)2(PMe3)(H2O)]2+ a cis-[Ru(bpy)2(PMe3)(H2O)]2+.
1 / T * 103 (K-1)
3.00 3.05 3.10 3.15 3.20 3.25 3.30
ln (
k/T
)
-18
-17
-16
-15
-14
-13
88
Para racionalizar los resultados experimentales se realizó una colaboración
con el Dr. Leonardo Slep, a modo de contar con los resultados de TD-DFT que
permitan inferir sobre los posibles caminos de isomerización. Por DFT se
exploró la superficie de energía potencial de la reacción de isomerización de
trans-[Ruacuo] (t-6C) a cis-[Ruacuo] (cis-6C). La isomerización se dividió
formalmente en 3 etapas que implican la formación de dos especies
intermediarias pentacoordinadas (5C) y un estado de transición. En la figura
5.8 se representa la coordenada de reacción del proceso de interconversión
por vía térmica. Se observa que el estado fundamental del complejo trans-
[Ruacuo] es de mayor energía (39 kJ mol-1) respecto al isómero cis. Esto
explica por qué no se obtiene este isómero térmicamente.
Figura 5.8 Representación esquemática de la coordenada de reacción involucrada en
la interconversión trans a cis sobre la superficie de energía potencial del estado
fundamental.
89
El primer paso consiste en la elongación del enlace Ru-O para dar lugar a la
disociación de la molécula de agua. Se genera un complejo pentacoordinado
trans-5C que conserva la geometría octaédrica de la especie hexacoordinada
de partida. De hecho, las longitudes de los enlaces Ru-N y Ru-P en el trans-
5C no varían si se comparan con las del trans-6C (ver datos en Tabla 5.4). El
ángulo entre vectores perpendiculares a los planos que contienen las
bipiridinas varía sólo de 32,0 º en el trans-6C a 33,3 º en el trans-5C. La
energía de disociación (teórica) asociada con este proceso es de 67,8 kJ mol-1.
Tabla 5.4 Longitudes de enlaces para: cis-6C = cis-[Ru(bpy)2(PMe3)(H2O)]2+; cis-5C =
cis-[Ru(bpy)2(PMe3)]2+; TS = [Ru(bpy)2(PMe3)]2+; trans-5C = trans-[Ru(bpy)2(PMe3)]2+;
trans-6C = trans-[Ru(bpy)2(PMe3)(H2O)]2+. Datos derivados de los cálculos DFT.
Longitud de enlace (Å)
cis-6C trans-6C cis-5C trans-5C TS
Ru-N1 2.054 2.131 2.02 2.121 2.042
Ru-N2 2.079 2.136 2.077 2.141 2.084
Ru-N3 2.119 2.122 2.127 2.125 2.133
Ru-N4 2.105 2.134 2.107 2.127 2.224
Ru-O 2.204 2.21 - - -
Ru-P 2.497 2.433 2.497 2.388 2.401
El segundo paso, está asociado a la rotación de un anillo de la bpy alrededor
del enlace Ru-N3. Esto implica un cambio en el ángulo entre las bipiridinas a
86,4º. La orientación de los ligandos alrededor del centro metálico es similar
al producto cis-6C (θ(bpy)cis = 89,4º). El estado de transición implica una barrera
de activación teórica de 36,6 kJ mol-1. Alcanzada está barrera se coordina una
molécula de agua a la especie cis-5C para producir la especie más estable, el
cis-6C.
5.3.4 Mecanismo de interconversión en el estado excitado.
Cuando se irradia una solución de cis-[Ru(bpy)2(PMe3)(OH2)]2+ fotoisomeriza
parcialmente hacia la forma trans. A tiempos largos de irradiación se alcanza
un estado fotoestacionario en el que la nueva especie que se forma también
90
presenta absorción y fotoisomerización permitiendo la reversibilidad de la
reacción. El proceso de interconversión de la especie cis hacia el trans se da
por vía fotoquímica únicamente, este proceso se describe en la Figura 5.9. Una
vez que absorbe luz, se alcanza el estado excitado 1MLTC (no indicado en la
figura). Seguido ocurre un cruce entre sistemas hacia el estado triplete 3MLTC
que presenta una energía de 195 kJ mol-1, correspondiente a una longitud de
onda de 613 nm, característica de los tripletes emisivos de Ru(bpy). Desde
este estado triplete se puebla el estado 3d-d que tiene una energía de 160 kJ
mol-1, mucho más estable que el 3MLTC. La geometría del complejo en estado
excitado es la misma que la del estado basal y por poseer naturaleza
antienlazante promueve la disociación de la molécula de agua, formándose
una especie pentacoordinada, cis-5C. Este proceso de disociación es
ligeramente endotérmico implicando un gasto energético de 10,9 kJ mol-1.
Desde este estado ocurre la rotación de una fracción de la bipiridina ubicada
perpendicular al plano del Ru(II) para adquirir la conformación trans.
Por último, desde el estado 3d-d de menor energía se coordina una molécula
de agua para dar al isómero trans-6C hexacoordinado. Se puede observar en
la figura 5.9 que las diferencias energéticas del complejo trans-6C y cis-6C son
mínimas, lo que aporta carácter de reversibilidad en el estado excitado. En la
tabla 5.5 se muestran las distancias de enlaces para el estado excitado 3MLTC.
Tabla 5.5 Longitudes de enlaces para el estado excitado 3MLTC de menor energía para: cis-6C = cis-[Ru(bpy)2(PMe3)(H2O)]2+; cis-5C = cis-[Ru(bpy)2(PMe3)]2+; TS = [Ru(bpy)2(PMe3)]2+; trans-5C = trans-[Ru(bpy)2(PMe3)]2+; trans-6C = trans-[Ru(bpy)2(PMe3)(H2O)]2+.
Longitud de enlace (Å)
cis-6C 3MLCT
cis-6C 3dd
trans-6C 3dd
cis-5C 3dd
trans-5C 3dd
TS 3dd
Ru-N1 2.054 2.131 2.02 2.121 2.042 2.224
Ru-N2 2.079 2.136 2.077 2.141 2.084 2.108
Ru-N3 2.119 2.122 2.127 2.125 2.133 2.100
Ru-N4 2.105 2.134 2.107 2.127 2.224 2.151
Ru-O 2.204 2.21
Ru-P 2.497 2.433 2.497 2.388 2.401 2.551
91
Figura 5.9 Representación esquemática de la coordenada de reacción involucrada en
la interconversión cis a trans sobre la superficie de energía potencial del estado
excitado.
5.3.5 Aplicaciones sintéticas
La química sintética de los complejos cis-[Ru(bpy)2]2+ es muy
conocida.28,32,33,131–136 En cambio, poco se conoce de los complejos trans
debido a que estos presentan tiempos de vida demasiado cortos en solución
como para efectuar el intercambio de ligandos en condiciones razonables.
En este capítulo se presenta la síntesis de una familia de isómeros cis y trans-
[Ru(bpy)2(PMe3)(L)]2+ coordinados a los siguientes ligandos: piridina (Py), 4-
aminopiridina (4-AP), Imidazol (ImH), PMe3 y PPh3. La caracterización
estructural se realizó por análisis de RMN y espectroscopia UV-vis. Para
algunos se determinó el ión molecular por espectrometría de masas. Los datos
92
de los espectros de masas de muestran en el capítulo de anexos. Además, se
realizó un estudio comparativo de las propiedades fotoquímicas de los
compuestos entre sí.
La ruta de síntesis más habitual en estos complejos involucra el uso de un
complejo acuo como reactivo de partida, en presencia del ligando que se quiere
introducir. En la mayoría de los casos es preferible efectuar la reacción con
agua como solvente. Dado que el grupo H2O coordinado es un grupo mucho
más lábil que el hidroxo, es muy útil conocer la química ácido-base de los
complejos acuo. Para obtener los valores de pKa de la reacción:
[Ru(bpy)2(PMe3)(OH2)]2+ [Ru(bpy)2(PMe3)(OH)]+ + H
Se realizó un procedimiento sencillo, que consiste en titular con NaOH(ac) una
solución de [Ru(bpy)2(PMe3)(OH2)]2+ contenida en una cubeta mientras se
miden los cambios espectrales. Del análisis de los espectros UV-vis se obtiene
fácilmente la fracción molar de las especies ácida y básica y se ajusta a la
ecuación (4) como se muestra en la figura 5.10.
xB = 1/(1+10(pKa-pH)) ec (4)
Figura 5.10 Valores de fracción molar del complejo cis-[Ru(bpy)2(PMe3)(OH)]+
variando el pH de una solución de cis-[Ru(bpy)2(PMe3)(OH2)]2+ y el mejor ajuste a la
ecuación 4 (pKa=11.05).
93
Un procedimiento similar llevado a cabo con una solución de complejo trans-
[Ruacuo] arrojó un resultado de pKa=12.15. Esta diferencia permite ampliar
la ventana de trabajo, y por lo tanto es posible coordinar en forma sencilla
ligandos muy básicos, con pKb<3, algo difícil en el caso de los complejos cis.
En relación al proceso sintético, los isómeros trans requieren tiempos de
reacción más cortos que los cis. Afortunadamente, esta mayor reactividad
hacia el intercambio de ligandos permite efectuar las reacciones sin que haya
una apreciable isomerización. De forma general, se observó por UV-vis que al
agregar el ligando a coordinar la reacción ocurre en forma casi inmediata. Por
ejemplo, trans-[Ru(bpy)2(PMe3)(Py)]2+ y trans-[Ru(bpy)2(PMe3)(4-AP)]2+
presentaron constantes de velocidad de reacción de 0,12 y 0,037 M-1s-1,
respectivamente. Es tan reactivo el trans-[Ruacuo] que para algunos
complejos la síntesis se llevó a cabo a temperatura ambiente.
5.3.5.1 Caracterización por espectroscopia UV-vis
Los espectros de absorción muestran para los isómeros cis una correlación
entre la posición de la banda 1MLTC con la naturaleza donora / aceptora de
los ligandos monodentados que coordinan al centro metálico 51. La banda se
desplaza a menor energía cuanto mayor es la capacidad donora del ligando.
Con respecto a los complejos trans no se observa claramente esta tendencia.
Por ejemplo, en el complejo trans-[Ru(bpy)2(PMe3)(Py)]2+ se observó que la
sustitución del ligando acuo por la piridina no modifica apreciablemente la
posición de la banda 1MLTC (460nm vs 458nm) a pesar de la diferencia
notable entre ambos ligandos. Los parámetros de absorción para cada uno de
los compuestos figuran en la tabla 5.6.
Es importante destacar que el desplazamiento de la banda 1MLTC hacia
longitudes de onda larga permite utilizar fuentes de irradiación de menor
energía para provocar la fotoliberacíón de las moléculas enjauladas, lo cual
implica mayor profundidad de penetración en los tejidos a estudiar y menor
daño celular.
94
Tabla 5.6 Parámetros de absorción y eficiencia cuántica de fotoliberación de los
compuestos cis y trans sintetizados.
[Ru(bpy)2(PMe3)(L)]2+
λMLTC / nm Φlib εmáx /M-1cm-1
cis
trans
cis trans cis trans
H2O 444 460 0,105 0,158 6680 9750
Py 435 458 0,210 0,240 6830 10300
4-AP 443 470 0,120 0,205 6040 8920
ImH 431 464 0,100 0,230 6040 8860
PPh3 * 442 * 0,016 * 10200
PMe3 * 439 -- -- * 11200
*Hasta el momento no se han obtenido los isómeros cis para estos complejos.
5.3.5.2 Determinación de eficiencias de fotoliberación
Se conoce que los complejos cis-[Ru(bpy)2(PMe3)(L)]2+ son herramientas de
fotoliberación muy eficientes137, por lo que se procedió a determinar las
eficiencias de fotoliberación para ambas familias y compararlas entre sí. En
un primer momento, se observó que los complejos trans presentan mayores
eficiencias. Esto resulta prometedor ya que sugiere mayor capacidad de
liberación de la molécula enjaulada. En el caso del complejo trans-
[Ru(bpy)2(PMe3)(ImH)]2+ la eficiencia es el doble que su análogo cis (Tabla 5.6,
Figura 5.11). La reacción de fotólisis de ambos isómeros, muestra un punto
isosbéstico indicando que el producto coloreado formado corresponde al
complejo acuo y no ocurren reacciones de descomposición.
Curiosamente, con las reacciones de fotólisis en solución acuosa de los
compuestos trans-[Ru(bpy)2(PMe3)(Py)]2+ y trans-[Ru(bpy)2(PMe3)(4-AP)]2+ se
observó por los valores obtenidos, que la fotólisis estaba contaminada por una
reacción de intercambio de ligandos puramente térmica. Al disolverse en agua,
estos compuestos establecen rápidamente un equilibrio con el complejo trans-
[Ru(bpy)2(PMe3)(OH2)]2+. Este equilibrio se desplaza rápidamente hacia la
formación de productos si se disminuye el pH de la solución.
95
Figura 5.11 Espectros UV-Vis de una solución acuosa de los complejos cis y trans-
[Ru(bpy)2(PMe3)ImH]2+ durante la fotólisis utilizando un láser de 532 nm. Gráfico
inserto: moles de fotoproducto vs. tiempo. Línea sólida: ajuste de la ec (1) (capitulo 2)
para ɸlib = 0,23 para trans y ɸlib = 0,094 para cis.
Por lo tanto, lo que antes se creía que era un único proceso de fotoliberación,
se corresponde en realidad con varios procesos que están ocurriendo
simultáneamente. En primer lugar, la liberación del ligando (L) a partir del
trans-[Ru(bpy)2(PMe3)(L)]2+ seguido por un segundo proceso de interconversión
fotoquímica del trans-[Ruacuo] a cis-[Ruacuo] y viceversa. Como se señala en
el esquema de reacción siguiente, donde 1 es la eficiencia de fotoliberación
del ligando, mientras que 2 y 3 corresponden a la eficiencia de fotoliberación
del proceso de fotoconversión del trans-[Ruacuo] a cis-[Ruacuo] y viceversa.
Los estudios cinéticos de los complejos trans-[Ru(bpy)2(PMe3)(Py)]2+ y trans-
[Ru(bpy)2(PMe3)(4-AP)]2+ muestran que no son estables en medio acuoso. Por
lo tanto, no son adecuados para ser utilizados como dispositivos de
fotoliberación en sistemas biológicos, en los cuales se precisa una baja
nm
400 500 600 700
Abs
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
t / s
0 300 600 900 1200 foto
pro
ducto
/ n
mole
s
0
40
80
120
160
nm
400 500 600 700
Abs
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
t / nm
0 300 600 900
foto
pro
ducto
/ n
mole
s
0
30
60
90
120
cis-ImH
[Ruacuo]
[Ruacuo]
trans-ImH *
*
*
*
96
liberación térmica y estabilidad en soluciones acuosas. Por el contrario,
resultan estables en solventes como metanol y acetona. En este caso, las
eficiencias de fotoliberación son mayores respecto de los cis.
Es interesante destacar que a pesar de que los complejos trans presentan
corrimiento de la MLTC a menores energías y, por ende, implica menor
eficiencia de fotoliberación los valores obtenidos son opuestos. Una hipótesis
a este hecho radica en la alta reactividad que presenta este isómero debida a
su inestabilidad.
Por otra parte, se obtuvo un lib = 0,016 para el trans-[Ru(bpy)2(PMe3)(PPh3)]2+.
A pesar de ser bastante bajo este valor, es muy significativo pues se logró
fotoliberar una fosfina —ligando aceptor—. En este compuesto, es la PPh3
que se libera debido a que la PMe3 es mucho más básica. No ocurre lo mismo
con el trans-[Ru(bpy)2(PMe3)2]2+ que al irradiarlo no libera ninguna de las
trimetilfosfinas coordinadas, dado que este complejo es muy estable. En la
figura 5.12 se muestra la fotolisis del trans-[Ru(bpy)2(PMe3)(PPh3)]2+.
Figura 5.12 a) Espectros UV-Vis de una solución acuosa trans-
[Ru(bpy)2(PMe3)(PPh3)]2+ durante la fotólisis utilizando un láser de 532 nm. b) moles
de fotoproducto vs. tiempo. Línea sólida: ajuste de la Ec (1) (capitulo 2) para ɸlib =
0,016.
Ab
s
400 500 600 700
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
t / s
0 200 400 600 800 1000 1200
foto
pro
du
cto
/
mo
les
0
20
40
60
80
100
120
/ nm
trans-PPh3
[Ruacuo]
a) b)
97
5.3.5.3 Caracterización por RMN
La identidad de los compuestos obtenidos fue verificada por espectroscopía
1H-RMN. El análisis de los espectros se realizará por grupo: trans y cis-
[Ru(bpy)2(PMe3)(L)]2+ de cada ligando.
Figura 5.13 inferior) 1H-RMN del trans-[Ru(bpy)2(PMe3)(ImH)]2+; superior) 1H-RMN del
cis-[Ru(bpy)2(PMe3)(ImH)]2+. Ambos fueron medidos en una mezcla D2O/Acetona-d6.
(5:1).
En la figura 5.13 se muestran los espectros protónicos de los compuestos cis
y trans-[Ru(bpy)2(PMe3)(ImH)]2+, por simplificación cis-ImH y trans-ImH,
respectivamente. Para ambos complejos los picos que aparecen en la zona
aromática integran para un total de 19 protones: 16 hidrógenos corresponden
a los hidrógenos de las dos bipiridinas y los 3 restantes al ligando coordinado.
En el cis-ImH se observa que el patrón de desdoblamiento para los hidrógenos
de las bipiridinas (bpys) es distinto respecto al complejo trans-ImH, debido a
que las bpys se encuentran en diferentes planos entre sí y aparecen como 8
dobletes y 8 tripletes (16H). En el trans-ImH los picos de las bpys se observan
d / ppm
01678910
01678910
b c a
trans-ImH
b
a c
cis-ImH
a c b
a
b
c
/ ppm
98
como dos dobletes y dos tripletes, como consecuencia de la alta simetría que
presenta el complejo en esta configuración, el entorno químico de los protones
de ambas bpys es muy similar. También aparecen las señales del ligando
coordinado.El imidazol (ImH) es simétrico y el espectro del ligando libre
presenta dos señales: una correspondiente a los hidrógenos Hb y Hc y otra a
Ha. Tanto en el isómero cis como en el trans cuando el ImH es coordinado al
centro metálico los hidrógenos Hb y Hc dejan de ser equivalentes. Los picos
que aparecen a 7,52; 7,07 y 6,76 ppm corresponden a Ha, Hc y Hb
respectivamente en el isómero cis y en el trans aparecen a 7,43; 7,00 y 6,47
ppm. Para ambos isómeros en la región alifática aparecen las señales de los
hidrógenos de los metilos de la trimetilfosfina y se presentan como dobletes
que integran para 9H (señalados con recuadro de línea punteada). Esta señal
aparece a campo más alto en los isómeros trans respecto a los cis.
Figura 5.14 superior: 1H-RMN del cis-[Ru(bpy)2(PMe3)(4AP)]2+ inferior: 1H-RMN del
trans-[Ru(bpy)2(PMe3)(4AP)]2+ medidos en una mezcla de D20/ acetona-d6
a
278910
/ ppm
01678910
trans-4AP
cis-4AP
a
v b
b
a
a
b
b
a
99
En los compuestos cis y trans-[Ru(bpy)2(PMe3)(4-AP)]2+ aparecen un conjunto
de dos dobletes que integran para los hidrógenos de la 4-aminopiridina. El
patrón de estas señales referente al ligando libre no cambia, pero aparecen
desplazadas ligeramente a campo alto en el compuesto coordinado. Tal cómo
se mostró en los procesos de fotólisis y cinéticas de estabilidad, este complejo
en solución acuosa establecía un equilibrio entre la forma acuo y el complejo
coordinado liberando ligando sin irradiar (sección 5.3.4.2 de este capítulo).
Por esta razón se observan señales del ligando libre, que aparecen marcadas
en los recuadros de línea sólida, ver figura 5.14
La figura 5.15 muestra los espectros de RMN protónicos de los isómeros cis y
trans-[Ru(bpy)2(PMe3)(Py)]2+. En el isómero trans es muy evidente la labilidad
que presenta el ligando, pues el espectro está siempre contaminado por
señales del trans-[Ruacuo] de partida y el ligando libre. En el complejo cis, las
señales Ha, Hb y Hc se superponen con señales de los hidrógenos de las
bipiridinas, lo que hace difícil la asignación.
Figura 5.15 inferior: 1H-RMN del trans-[Ru(bpy)2(PMe3)(Py)]2+ superior: 1H-RMN del
cis-[Ru(bpy)2(PMe3)(Py)]2+. Los complejos fueron medidos en D2O.
0178910
/ ppm
0178910
a b
trans-Py
c
cis-Py
100
Los espectros de los isómeros trans coordinados a las fosfinas: trimetilfosfina
(PMe3) y trifenilfosfina (PPh3) muestran un patrón muy similar al compuesto
trans-[Ruacuo] (Figura 5.16). En el espectro del trans-[Ru(bpy)2(PMe3)(PPh3)]2+
se observan las señales de los hidrógenos de la PPh3 que aparecen en la zona
aromática junto con los hidrógenos de las bipiridinas.
Figura 5.16 Inferior: 1H-RMN del trans-[Ru(bpy)2(PMe3)2]2+; Superior: 1H-RMN del
trans-[Ru(bpy)2(PMe3)(PPh3)]2+. Los espectros fueron medidos en una mezcla de
Acetona-d6 / D2O (1:1).
Se monitoreo la fotoliberación para los complejos cis/trans-
[Ru(bpy)2(PMe3)(ImH)]2+ y el trans-[Ru(bpy)2(PMe3)(PPh3)]2+ por RMN. El
compuesto trans-[Ru(bpy)2(PMe3)2]2+ no presentó actividad fotoquímica, por lo
que se midieron espectros antes y después de la fotólisis.
En la figura 5.17 se presenta la zona aromática de los espectros de RMN
protónicos para la fotólisis del cis-ImH y el trans-ImH a distintos tiempos de
irradiación. En las mismas condiciones de la fotólisis (intensidad y tiempo de
irradiación, 30s) se observa que en el trans-ImH desaparecen casi en su
0178910
08910
trans-(PMe3)2
trans-(PPh3)2
/ ppm
101
totalidad las señales del imidazol coordinado. El isómero trans presenta un
rendimiento cuántico de fotoliberación del doble en comparación con el cis.
Figura 5.17 Superior: Monitoreo por 1H-RMN de la fotólisis del complejo cis-
[Ru(bpy)2(PMe3)(ImH)]2+ Inferior: Fotólisis del complejo trans-[Ru(bpy)2(PMe3)(ImH)]2+.
Los complejos estaban disueltos en D2O/Acetona-d6 dentro de un tubo de RMN. La
irradiación se llevó a cabo con un LED de 525 nm, 3W.
En los espectros protónicos referentes a la fotólisis del trans-PPh3 a 30 s de
exposición ya se observa la señal de PPh3 libre (Figura 5.18). El aumento de
la intensidad de esta señal es muy pequeño debido a que la eficiencia para
este complejo es muy baja, lib = 0,016. Los complejos correspondientes con
estructura cis-[Ru(bpy)2(PPh3)L]2+ han sido ampliamente estudiados.28,87 Es
6.57.07.58.08.59.09.5
678910
t = 60 s
t = 30 s
t = 0 s
ImH
ImH coordinado
Fotólisis del cis-ImH
Fotólisis del trans-ImH
t = 0 s
t = 30 s
/ ppm
ImH
102
un hecho bien estudiado que en estos complejos la irradiación en la banda de
1MLCT siempre es seguida por la fotoliberación del ligando L, mientras que la
fosfina permanece coordinada con el centro de Ru. Por el contrario, la fotolisis
del trans-[Ru(bpy)2(PMe3)(PPh3)]2+ libera PPh3, aunque no PMe3,
probablemente debido a la mayor basicidad sigma de esta última.
Figura 5.18 Fotólisis del complejo trans-[Ru(bpy)2(PMe3)(PPh3)]2+ en D2O/Acetona-d6
dentro de un tubo de RMN. La irradiación se llevó a cabo con un LED 525 nm, 3W.
5.4 Conclusiones
En este capítulo se mostró la síntesis del isómero trans-
[Ru(bpy)2(PPh3)(OH2)]2+.
La reacción, que implica una isomerización en el estado excitado, se
racionalizó mediante cálculos DFT.
/ ppm12789
t = 0 s
t = 60 s
t = 120 s
t = 30 s PPh3 PPh3
103
Se demostró que a pesar de que el isómero trans vuelve espontáneamente a la
forma cis, es suficientemente estable en forma sólida e incluso en solución
acuosa, como para permitir el intercambio de ligandos y estudios de liberación
de fotorreceptores, y otros usos sintéticos de forma directa y limpia.
Tanto los complejos cis- como trans-[Ru(bpy)2(PMe3)(OH2)]2+ se someten a un
proceso de fotoisomerización bajo irradiación de la banda 1MLCT. En solución
acuosa se alcanza un estado fotoestacionario, que depende principalmente de
la longitud de onda de irradiación.
Si bien los compuestos trans no muestran la fuerte correlación, encontrada
por Pinnick y Durham51 para el rendimiento cuántico de fotoliberación en
función de la capacidad donora del ligando monodentado, todos ellos
muestran un desplazamiento de su banda 1MLCT hacia el rojo y un
rendimiento cuántico mayor respecto a su isómero cis. Este hecho podría ser
útil para crear eficientes fotoliberadores desplazados al rojo.
También se sintetizaron complejos con dos fosfinas, mientras que hasta el
momento no fue posible producir sus isómeros cis. Mientras que el complejo
trans-[Ru(bpy)2(PMe3)(PPh3)]2+ libera PPh3 bajo irradiación con luz visible, el
complejo con dos PMe3 no presentaba una fotoquímica apreciable.
104
105
Capítulo 6.
Conclusiones generales
El trabajo de tesis desarrollado se centró principalmente en la síntesis y
caracterización de compuestos fotoactivables basados en el core
[Ru(bpy)2(PMe3)(L)]2+ para ser utilizados como herramientas de control
espacio-temporal para la liberación de sustancias en sistemas biológicos. A lo
largo de este trabajo se mostró que estos complejos pueden funcionar como
grupos protectores removibles por luz visible, muy conveniente cuando se
trabaja con sistemas complejos. En forma general, se mostró que la reacción
de fotólisis ocurre sin la generación de especies secundarias y obteniendo el
ligando enjaulado.
Se demostró la posibilidad de inducir la respuesta alimentaria en un único
tentáculo de Hydra vulgaris en animal completo, mediante la aplicación de luz
en forma localizada a una solución del complejo cis-[Ru(bpy)2(PMe3)(Arg)]2+
donde estaba libre el cnidario. Además se probaron por primera vez
fotoliberadores de estás características utilizando este modelo biológico, donde
se logró la activación de un comportamiento sin pertubaciones mecánicas ni
efectos de presión cuando se aplicaba la sustancia estimulante.
Gracias a la simplicidad del sistema nervioso de este organismo, su pequeño
tamaño y modificaciones genéticas, hoy en día se conoce el mapa neuronal de
la actividad muscular de una hidra entera. Aprovechar este conocimiento
actual con el desarrollado del fotoliberador sintetizado en este trabajo podría
darnos una imagen de la película completa desde la activación alimentaria
específica, pasando por la circuitería neuronal, hasta la respuestas
comportamentales más tardías y eventualmente un aprendizaje si lo hubiera.
Esto sentaría las bases para poder establecer cómo se modula el patrón de
106
este comportamiento en un organismo tan simple y primitivo; y extrapolarlo
de ser posible a organismos superiores.
Continuando con el desarrollo de herramientas para ser utilizadas en
neurociencias se sintetizó por primera vez un compuesto enjaulado de
norepinefrina de base rutenio-bipiridina y se pudo comprobar su eficiencia en
neuronas de Locus Coeruleus de roedor, observando que al aumentar la
concentración de norepinefrina producto de la fotoliberación disminuye la
frecuencia de los potenciales de accción. Este nuevo actuador no sólo permite
sondear circuitos noradrenérgicos con mayor precisión espacio-temporal sino
además aislar cuál es la acción específica de la norepinefrina en células.
Por último se presentó el complejo trans-[Ru(bpy)2(PMe3)(OH2)]2+ como nueva
plataforma para obtener compuestos fotoactivables con absorción a una
longitud de onda más larga con respecto a los análogos en configuración cis y
que además presenta mayores eficiencias de fotoliberación. Este core, por su
reactividad, puede servir de base para sintetizar fotoliberadores de móleculas
de interés biológico tales como péptidos y otras moléculas estéricamente
impedidas, en las cuales la síntesis del isómero cis no ha resultado.
En su conjunto en esta tesis se muestra la potencialidad de varios complejos
rutenio-bipiridina como herramientas de fotoliberación de sustancias para la
manipulación de sistemas biológicos. Estos compuestos han logrado utilizarse
en diversos ambientes, siendo no tóxicos en preparaciones agudas, incluso
con animales enteros, y abriendo por lo tanto un camino posible hacia
aplicaciones terapéuticas, como PACT o PDT.
107
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121
Anexo 1
Datos complementarios de caracterización estructurales de los
complejos.
Tabla A1. Datos de la estructura cristalina y su refinamiento para el trans-[Ru(bpy)2(PMe3)(OH2)](CF3SO3)2
Muestra YR01
Fórmula Empírica C25H27F6N4O7PRuS2
Masa Molar (g / mol) 805.66
Temperatura / K 100(1)
Estructura cristaina monoclinico
Grupo espacial C2/c
a/Å 29.760
b/Å 11.420
c/Å 18.470
α/° 90
β/° 98.73
γ/° 90
Volume / Å3 6204.4
Z 8
ρcalc g/cm3 1.725
μ/mm-1 1.174
F(000) 3248.0
Tamaño del cristal / mm3 0.5 × 0.4 × 0.3
Radiación Synchrotron (λ = 0.826)
Rango de 2Θ /° 4.446 de 56.998
Rango de indexación -33 ≤ h ≤ 33, -13 ≤ k ≤ 13, -21 ≤ l ≤ 21
Cantidad de reflexiones colectadas 60638
Cantidad de reflexiones independientes 4815 [Rint = 0.0442, Rsigma = 0.0187]
Cantidad de:
datos/restricciones/parámetros 4815/1/430
Calidad del ajuste en F2 1.035
Indices R finales [I>=2σ (I)] R1 = 0.0261, wR2 = 0.0662
Indices R finales [datos totales] R1 = 0.0261, wR2 = 0.0663
Mayor diferencia peak/hole / e Å-3 0.77/-0.51
122
Tabla A2. Longitudes de enlace para el trans-[Ru(bpy)2(PMe3)(OH2)](CF3SO3)2
Átomo Átomo Longitud de
enlace / Å
Átomo Átomo Longitud de
enlace / Å
Ru1 P1 2.2476(6)
N3 C15 1.359(3)
Ru1 N4 2.0615(19)
N3 C11 1.349(3)
Ru1 N2 2.0937(19)
F5 C24 1.305(4)
Ru1 N3 2.0697(19)
N1 C5 1.361(3)
Ru1 O1 2.1692(17)
N1 C1 1.348(3)
Ru1 N1 2.079(2)
C15 C16 1.474(3)
P1 C22 1.813(2)
C15 C14 1.389(3)
P1 C23 1.820(2)
C20 C19 1.378(3)
P1 C21 1.816(2)
C16 C17 1.384(3)
S1 O4 1.436(2)
C10 C9 1.384(3)
S1 O3 1.441(2)
C6 C7 1.389(4)
S1 O2 1.433(2)
C6 C5 1.473(4)
S1 C25 1.818(3)
F4 C24 1.313(4)
S2 O6 1.441(2)
C9 C8 1.374(4)
S2 O5 1.418(3)
C11 C12 1.378(4)
S2 C24 1.816(3)
C14 C13 1.382(4)
S2 O7 1.497(13)
C13 C12 1.376(4)
S2 O0A 1.414(9)
C7 C8 1.381(4)
F2 C25 1.329(3)
C19 C18 1.380(4)
F1 C25 1.332(3)
C5 C4 1.383(4)
F3 C25 1.335(3)
C17 C18 1.382(4)
N4 C20 1.341(3)
C1 C2 1.378(4)
N4 C16 1.367(3)
C2 C3 1.372(5)
N2 C10 1.347(3)
C4 C3 1.382(4)
N2 C6 1.363(3)
C24 F6 1.325(5)
123
Tabla A3. Ángulo de enlace para el trans-[Ru(bpy)2(PMe3)(OH2)](CF3SO3)2
Átomo Átomo Átomo Angulo/˚ Átomo Átomo Átomo Angulo/˚
N4 Ru1 P1 92.46(5)
C11 N3 C15 117.6(2)
N4 Ru1 N2 103.71(7)
C5 N1 Ru1 115.78(16)
N4 Ru1 N3 77.26(7)
C1 N1 Ru1 126.69(18)
N4 Ru1 O1 84.87(8)
C1 N1 C5 117.5(2)
N4 Ru1 N1 174.63(7)
N3 C15 C16 113.98(19)
N2 Ru1 P1 89.74(5)
N3 C15 C14 121.9(2)
N2 Ru1 O1 90.93(7)
C14 C15 C16 123.6(2)
N3 Ru1 P1 94.19(6)
N4 C20 C19 123.4(2)
N3 Ru1 N2 175.92(7)
N4 C16 C15 113.8(2)
N3 Ru1 O1 85.20(8)
N4 C16 C17 121.8(2)
N3 Ru1 N1 101.57(8)
C17 C16 C15 123.9(2)
O1 Ru1 P1 177.33(6)
F2 C25 S1 112.19(15)
N1 Ru1 P1 92.86(6)
F2 C25 F1 107.1(2)
N1 Ru1 N2 77.09(8)
F2 C25 F3 107.06(19)
N1 Ru1 O1 89.81(8)
F1 C25 S1 111.67(16)
C22 P1 Ru1 115.44(8)
F1 C25 F3 107.13(19)
C22 P1 C23 101.21(11)
F3 C25 S1 111.40(17)
C22 P1 C21 103.11(12)
N2 C10 C9 123.0(2)
C23 P1 Ru1 115.85(8)
N2 C6 C7 121.7(2)
C21 P1 Ru1 116.95(9)
N2 C6 C5 114.5(2)
C21 P1 C23 102.04(12)
C7 C6 C5 123.7(2)
O4 S1 O3 115.22(13)
C8 C9 C10 119.2(2)
O4 S1 C25 103.68(11)
N3 C11 C12 122.5(3)
O3 S1 C25 103.22(12)
C13 C14 C15 118.8(3)
O2 S1 O4 115.21(14)
C12 C13 C14 119.1(2)
O2 S1 O3 115.01(15)
C8 C7 C6 119.6(2)
O2 S1 C25 101.87(12)
C20 C19 C18 118.9(2)
O6 S2 C24 102.37(13)
N1 C5 C6 114.3(2)
O6 S2 O7 105.8(12)
N1 C5 C4 121.7(2)
O5 S2 O6 115.63(17)
C4 C5 C6 123.8(2)
O5 S2 C24 104.83(17)
C9 C8 C7 118.8(2)
O5 S2 O7 126.7(16)
C13 C12 C11 119.3(2)
O7 S2 C24 97.1(7)
C18 C17 C16 119.4(2)
O0A S2 O6 122.7(5)
N1 C1 C2 123.0(3)
O0A S2 O5 99.5(10)
C19 C18 C17 118.9(2)
O0A S2 C24 110.8(8)
C3 C2 C1 119.2(3)
C20 N4 Ru1 128.36(15)
C3 C4 C5 119.7(3)
C20 N4 C16 117.4(2)
C2 C3 C4 118.8(3)
C16 N4 Ru1 114.05(15)
F5 C24 S2 111.4(2)
C10 N2 Ru1 127.60(16)
F5 C24 F4 107.2(3)
C10 N2 C6 117.4(2)
F5 C24 F6 108.0(3)
C6 N2 Ru1 114.79(15)
F4 C24 S2 112.8(3)
C15 N3 Ru1 113.16(15)
F4 C24 F6 106.5(3)
C11 N3 Ru1 128.83(18)
F6 C24 S2 110.6(2)
124
Figura A1. Espectro de RMN COSY del complejo trans-
[Ru(bpy)2(PMe3)(H2O)](CF3SO3-)2 en D2O
Tabla A4. Espectrometría de masas para el complejo trans-
[Ru(bpy)2(PMe3)(H2O)](CF3SO3)2. [1](CF3SO3)2 ([1]2+ = [C23H27N4OPRu]2+
m/z (exp) Fragmentos Asignación m/z (calc)
207.0218 [C20H16N4Ru]2+ [[1] - H2O -
PMe3]2+ 207.0204
216.0273 [C20H18N4ORu]2+ [[1] - PMe3]2+ 216.0257 245.0444 [C23H25N4PRu]2+ [[1] - H2O]2+ 245.0425
254.0459 [C23H27N4OPRu]2+ [1]2+ 254.0478
639.0417 [C24H25F3N4O3PRu
S]+
[[1] - H2O +
CF3SO3]+ 639.0375
125
Figura A2. Fragmentos isotópicos experimentales y simulados para las
diferentes señales registradas en el MS-ESI(+) para el complejo trans-
[Ru(bpy)2(PMe3)(H2O)](CF3SO3)2. [1](CF3SO3)2 ([1]2+ = [RuC23H27PN4O]2+).
126
Figura A3. Espectro de RMN COSY del complejo cis-
[Ru(bpy)2(PMe3)(H2O)](CF3SO3-)2 en una mezcla de D2O/ Acetona-d6
Tabla A5. Espectrometría de masas para el complejo cis-
[Ru(bpy)2(PMe3)(H2O)](CF3SO3)2. [2](CF3SO3)2 ([2]2+ = [C23H27N4OPRu]2+
m/z (exp) Fragmentos Asignación m/z (calc)
207.0208 [C20H16N4Ru]2+ [[2] - H2O -
PMe3]2+ 207.0204
216.0262 [C20H18N4ORu]2+ [[2] - PMe3]2+ 216.0257 245.0432 [C23H25N4PRu]2+ [[2] - H2O]2+ 245.0425
639.0388 [C24H25F3N4O3PRuS]
+ [[2] - H2O + CF3SO3]+
639.0375
127
Figura A4. Fragmentos isotópicos experimentales y simulados para las
diferentes señales registradas en el MS-ESI(+) para el complejo cis-
[Ru(bpy)2(PMe3)(H2O)](CF3SO3)2. [2](CF3SO3)2 ([2]2+ = [RuC23H27PN4O]2+).
128
Figura A5. Espectro COSY RMN del complejo cis-
[Ru(bpy)2(PMe3)(ImH)](CF3SO3-)2 en una mezcla de D2O/ Acetona-d6
Tabla A5. Espectrometría de masas para el complejo cis-
[Ru(bpy)2(PMe3)(ImH)](PF6)2. [3](PF6)2 ([3]2+ = [C26H29N6PRu]2+)
m/z (exp) Fragmentos Asignación m/z (calc)
207.0221 [C20H16N4Ru]2+ [[3] - ImH -
PMe3]2+ 207.0204
245.0444 [C20H18N4ORu]2+ [[3] - ImH]2+ 245.0425 279.0632 [C26H29N6PRu]2+ [3] 2+ 279.0612
703.0878 [C26H29F6N6P2Ru]+ [[3] + PF6]+ 703.0871
129
Figura A6. Fragmentos isotópicos experimentales y simulados para las
diferentes señales registradas en el MS-ESI(+) para el cis-
[Ru(bpy)2(PMe3)(ImH)](PF6)2. [3](PF6)2 ([3]2+ = [C26H29N6PRu]2+).
130
Figura A7. Espectro de RMN COSY del complejo trans-[Ru(bpy)2(PMe3)(ImH)]2+
[4](PF6)2 in Acetone-d6
Tabla A7. Espectrometría de masas para el complejo trans-
[Ru(bpy)2(PMe3)(ImH)](PF6)2. [4](PF6)2 ([4]2+ = [C26H29N6PRu]2+).
m/z (exp) Fragmentos Asignación m/z (calc)
207.0207 [C20H16N4Ru]2+ [[4] - ImH -
PMe3]2+ 207.0204
245.0430 [C20H18N4ORu]2+ [[4] - ImH]2+ 245.0425
279.0617 [C26H29N6PRu]2+ [4]2+ 279.0612 703.0875 [C26H29F6N6P2Ru]+ [[4] + PF6]+ 703.0871
131
Figura A8 Fragmentos isotópicos experimentales y simulados para las
diferentes señales registradas en el MS-ESI(+) para el trans-
[Ru(bpy)2(PMe3)(ImH)](PF6)2. [4](PF6)2 ([4]2+ = [C26H29N6PRu]2+).
132
Figura A9. Espectro RMN COSY del complejo trans-[Ru(bpy)2(PMe3)(PPh3)]2+en
Acetona-d6
Tabla A10. Espectrometría de masas para el complejo trans-
[Ru(bpy)2(PMe3)(PPh3)](PF6)2. [5](PF6)2 ([5]2+ = [C41H40N4P2Ru]2+).
m/z (exp) Fragmentos Asignación m/z (calc)
207.0206 [C20H16N4Ru]2+ [[5] - PMe3 –
PPh3]2+ 207.0204
245.0430 [C23H25N4PRu]2+ [[5] – PPh3]2+ 245.0425
338.0668 [C38H31N4PRu]2+ [[5] – PMe3]2+ 338.0659 376.0892 [C41H40N4P2Ru]2+ [5]2+ 376.0880
133
Figura A10. Fragmentos isotópicos experimentales y simulados para las
diferentes señales registradas en el MS-ESI(+) para el trans-
[Ru(bpy)2(PMe3)(PPh3)](PF6)2. [5](PF6)2 ([5]2+ = [C41H40N4P2Ru]2+)
134
Figura A11. Espectro RMN COSY del complejo trans-[Ru(bpy)2(PMe3)2]2+en
Acetona-d6
Tabla A12. Espectrometría de masas para el complejo trans-
[Ru(bpy)2(PMe3)2](PF6)2. [6](PF6)2 ([6]2+ = [C26H34N4P2Ru]2+).
m/z (exp) Fragmentos Asignación m/z (calc)
207.0231 [C20H16N4Ru]2+ [[6] - 2PMe3]2+ 207.0204 245.0450 [C23H25N4PRu]2+ [[6] – PMe3]2+ 245.0425 283.0651 [C26H34N4P2Ru]2+ [6]2+ 283.0646
135
Figura A12. Fragmentos isotópicos experimentales y simulados para las
diferentes señales registradas en el MS-ESI(+) para el trans-
[Ru(bpy)2(PMe3)2](PF6)2. [6](PF6)2 ([6]2+ = [C26H34N4P2Ru]2+).
136
Anexo 2.
Trabajos Publicados
1. Cis–Trans Interconversion in Ruthenium(II) Bipyridine Complexes.
Yeraldith Rojas Pérez, Leonardo D. Slep, Roberto Etchenique. Inorg. Chem.
2019, 58, 17, 11606-11613.
https://doi.org/10.1021/acs.inorgchem.9b01485
2. Optical manipulation of animal behavior using a ruthenium-based
phototrigger.
Yeraldith Rojas Pérez y Roberto Etchenique. Photochem. Photobiol. Sci.,
2019,18, 208-212. https://doi.org/10.1039/C8PP00467F
137
Agradecimientos.
Esta historia está llegando a su final.
Y me llena de alegría que al hacer el balance de lo vivido, aprendido, conocido,
gozado y también sufrido (no todo es color de rosa) mereció la pena haber
viajado más de 7000 Km al sur.
Agradezco a la vida
Agradezco a mi mamá, por su valentía y atreverse a romper barreras para que
sus hijas pudiesen estudiar y vivir algo muy distinto de lo conocido por ella.
Mi mayor privilegio ha sido ser tu hija. Te amo.
Agradezco a mis hermanos, Tania, Katy y Milton por su apoyo y su cariño, y
en especial a ti Tania por estar ahí siempre aún en la distancia. ¡Los adoro
mucho!
A mi sobrinita Valentina por alegrarme la vida con su llegada.
A mi nona Leodora y a mi papá por su cariño.
A Marlon por su amor perruno.
A mi país Venezuela que, a pesar de no haber nacido en sus hermosas tierras,
sus instituciones me brindaron la oportunidad de gozar de una educación
pública y gratuita en cada una de las etapas.
Al profesor Ricardo Contreras por su disposición y su apoyo cuando se me
presentó esta oportunidad.
A CONICET y al pueblo argentino, que gracias a sus impuestos pude
trasladarme a estas tierras gauchas.
A UBA y INQUIMAE por brindarme la oportunidad de estudiar en sus aulas y
desarrollar este trabajo en sus instalaciones. Me gustó mucho ver la pasión
que le ponen la mayoría de sus integrantes a la docencia, a la investigación.
A Alejandra, Andrea, Lili, Cintia, Mariana y Graciela siempre por su
amabilidad y disposición para hacer fácil la burocracia. Gracias a Gustavo,
Juana, Jorgito.
A los integrantes del laboratorio: Lore, Guille, Richus, Fernanda, Pablo,
Chechuna, Quela por las charlas de ciencia, de política, las risas. Por la ayuda
que me prestaron cuando los necesite. Me gané un par de amigos más.
A ti Chechuna hay que regalarte una oración, gracias por tu cariño, por tu
ayuda y tu apoyo cuando la cosa se puso difícil y gracias por el gordito.
138
A Florencia Di Salvo y Leo Slep por darle otro sentido a los trans.
A el equipo de edición “copy-paste” de este manuscrito: Chechu, Dari, Paty,
Pablo, Fer, Samu, Graciela y Uriel. Gracias chicos por tomarse su tiempo para
revisar este trabajo
A Graciela Gonzales por tu apoyo, tus consejos. ¡Gracias Gra!
A Vicente Povce por enseñarme a usar los equipos, por las bromas de los
pasillos. Ya no te pedirán agua destilada a las 20 h cuando te estás por ir.
A Gernot por las medidas de los RMN, el cuidado que tenías con mis muestras
y las charlas y el café durante las medidas.
A los del labo del fondo: Juli, Nahir, Germán, Bruno, Silvina y a los del otro
labo, los Doctorovichs: Andrea, Agos, Ceci, Fede y Juan porque siempre los
moleste buscando algún material.
A Sebastián Suárez por su disponibilidad siempre que necesite de su ayuda y
su buena onda para enseñarme.
A los de P8: Lucy, Cele, Mati, Kari, Ceci gracias por los almuerzos.
Al Futchibol del INQUIMAE y los viernes de torta: Dani, Nahue, Marcos,
Charly, JL, Mar, Nico, Mariana, Leito, Santi, Lean, Lili y bueno son un montón
A mis compañeros del ITBA: Caro, Alejandra, Guille, Lucy, Vero, Jorge y Maza
A Hernán por aceptarme en el grupo de boxeo, porque fue de gran ayuda poner
unas cuántas caras en la pera de boxeo para mantener la paz. Y a Jony por
ser conejillo de indias en las peleas.
Al Hogar Amaranta porque me permitió por un tiempo aportar mi granito de
arena con los peques.
A la doñita Olga por las calorías extras comiendo nutella y las conversaciones
en el 11C. Porque me abriste las puertas de tu casa cuando llegue a este país.
Porque aún hoy en la distancia sigue estado muy presente.
A karencilla por tener siempre esa palabra tranquilizadora en los momentos
difíciles, porque con el tiempo te has convertido en alguien muy especial para
mí.
A Dari por acompañarme en esta última etapa ¡Gracias amis!
A Samu, el veci, por la complicidad, por el yoga, la poesía. Te quiero veci.
A luismi y Anita porque con ustedes la comida y la amistad tiene otro sabor.
A Astrid y Kikin por sus risas y humor único.
139
A Miguel, Raquel, Lichin, Paty y Aimépor las risas y los buenos momentos.
A todos los que participaron en las noches de karaoke, just dance, las noches
de juego, las comelonas en casa ¡Gracias!
A Uriel por tu amistad y esa paz que transmites.
Finalmente le quiero dar las gracias a las dos personas más importantes para
mí en esta etapa.
A ti Lucy, prima del mal porque desde que inició nuestra amistad siempre has
sido incondicional conmigo. Gracias por creer en mí mucho más de lo que yo
lo hago. Gracias por tus regaños, tu presión para que dejara el miedo y me
sumara a nuevos retos profesionales. Gracias por quedarte conmigo hasta
horas de la madrugada cuando necesitaba preparar un concurso. Si hay
alguien que saca lo mejor de las personas esa eres tú ¡Te quiero mucho
primita!
Ya casi llegamos al final, Rober. Gracias por recibirme en tu laboratorio sin
conocerme. Gracias por tus asesorías, por apoyarme cuando yo me quería
arriesgar a hacer algo. Gracias por tu ejemplo, tu forma de ver la ciencia y la
vida, gracias por enseñarme que no está mal equivocarse o no saber algo, de
que hay que ser perseverante. Y sobre todo gracias por tu paciencia en esta
última etapa. Eres el mejor PADRE CIENTÍFICO que la vida me pudo haber
dado ¡Te voy a extrañar mucho!
A todos………………………………………………….. ¡Muchas Gracias!
