cm&tialltfanpo 1- UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA DIVISION DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD SECRETARlA ACADÉMICA

A QUIEN CORRESPONDA:

Por medio de la presente se hace constar que la:

del Departamento de BlOTECNOLOGíA de la División de Ciencias Biológicas y de la Salud, asesoró el siguiente Servicio Social:

TITULO "IDENTIFICACIÓN FENOTIPICA DE DOS CEPAS DE BACTERIAS SULFATO REDUCTORAS PRESENTES EN UN REACTOR UASB"

M. en B. FLORINA RAM¡REZ VIVES

ALUMNO CERÓN VILLEDA MARICELA M ATRíCU LA 90236805 LICENCIATURA INGENlERlA BiOQUíMlCA INDUSTRIAL PERIODO JUNIO I o . 1998 a JUNIO 10 1999

Se extiende la presente para los fines que a la interesada convengan, en la Ciudad de México, Distrito Federal a seis de octubre de mil novecientos noventa y nueve.

A T E N T A M E N T E, "CASA ABIERTA AL TIEMPO"

/ SECRETARIO ACADÉMICO

UNIDAD IZTAPALAPA AY Mlchoacan y ia Puriama Coi Vicentina. 0 F 09340 Te1 (5) 723 63 51 Fax (5)612 80 83 e-mail Cdcb%xanum uam rnx

NOMBRE: CERÓN VILLEDA MARICELA

MATRICULA : 90236805

LICENCIATURA : INGENlERíA BlOQUíMlCA INDUSTRIAL

UNIDAD IZTAPALAPA CBS Unl.ei.ida4 Luionona

WI mna )I ihmv

TELÉFONO : 57-51-50-27 1

TRIMESTRE LECTIVO : 98 PRIMAVERA J

2 f - 1 DIVISION CBS 4 SERVICIO S3CIAL # WDAD lZlNALA?A 2

I

HORAS ALA SEMANA : VEINTE

TITULO DEL TRABAJO: BIOTEGNOLOGIAS PARA EL TRATAMIENTO

DE AGUAS RESIDUALES DE CIUDADES GRANDES.

TITULO DEL SERVICIO S0CIAL:IDENTIFICACIÓN FENOTIPICA DE DOS

CEPASDE BACTERIASSULFATOREDUCTORAS PRESENTESENUN

REACTOR UASB.

r-7 ASESORES: M. EN B. FLORINA RAMíREZ VIVES *

LUGAR DONDE SE REALIZA EL SERVICIO: LABORATORIO DE

MlCROBlOLOGiA AMBIENTAL Y TRATAMIENTO DE AGUAS

RESIDUALES.

FECHA DE INICIO : 1 DE JUNIO DE 1998

FECHA DE TEIiMINACIÓN. 1 DE DICIEMBRE DE 1558

CLAVE:iB1.024.58 4-

11 Junio de 1999

Dr. José Luis Arredondo F.

Director.

División de Ciencias Biológicas y de la Salud.

PRESENTE:

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a

Por medio de la presente me permito informarle la terminación de mi Servicio Social el cual se llevo a cabo en el laboratorio de Microbiología Ambiental del Departamento de Biotecnología de esta Universidad y que llevo por título: Identificación Fenotipica de dos Cepas de Bacterias Sulfato Reductoras Presentes en un Reactor UASB.

El proyecto tubo como asesor a la M. en C. Flotina Ramírez Vives, profesor titular del Departamento de Biotecnología de la División de Ciencias de la Salud.

Agradeciendo de antemano su atención a la presente.

.C

! ]

Atentamente:

11 Junio de 1999

Dr. José Luis Arredondo F.

Director.

División de Ciencias Biológicas y de la Salud.

P R E S E N T E :

La que suscribe Cerón Villeda Maricela Alumna de la Universidad de la Carrera de Ingeniería Bioquímica Industrial, me dirijo a usted par justiicar él por que hago entrega del reporte de Servicio Social con una fecha posterior a la originalmente señalada.

Esto se debió principalmente a que di más prioridad al Paquete Tecnológico y materias atrasadas que me faltaban para poder terminaren el tiempo establecido por la Universidad.

Esperando contar con su aprobación, y agradeciendo de antemano quedo de usted.

Atentamente

11 Junio de 1999

Dr. José Luis A d o n d o F.

Director.

’* j ,

División de Ciencias Bidiógicas y de la Salud.

P R E S E N T E :

La que suscribe, Florina Ramírez Vives, miembro del personal académico de esta Universidad, por medio de la presente hago constar que la alumna Cerón Villeda Maricela con número de matricula 90236805 y perteneciendo a la carrera de Ingeniería Bioquímica Industrial, cumplió satisfactoriamente su Servicio Social comprendido del 1 de Junio de 1998 al 1 de Diciembre de 1998 con el tema : Identificación Fenotipica de dos Cepas de Bacterias Sulfato Reductoras Presentes en un Reactor UASB en el Laboratorio de Microbiología Ambiental del Departamento de Biotecnología de esta Unidad.

Después de haber revisado el informe final, considero cumplidos los objetivos planteados en el proyecto respectivo y manifiesto mi confomidad en el contenido del mismo, agradeciendo de antemano ala presente.

Atentamente:

M. en C. Florina Ramírez Vives. Profesor Titular C Tiempo Completo. Departamento de Biotecnología UAMl

FORMATO PARA SER LLENADO POE EL (LOS) ASESORES INTERNO O EXTERNO PARA EL INFORME FINAL DE SERVICIO SOCIAL.

1. Nombre y adscripción del asesor. Florina Ramírez Vives. Departamento de Biotecnología

2. La naturaleza del Proyecto del que procede el Servicio Social es

Interno. Externo Porconvenio

u Proyecto de Servicio Social asociado a actividades disciplinarias realizadas por el

3. Nombre del Proyecto del que deriva el Servicio Social e institución u organismo que lo avala. BIOTEGNOLOGIAS PARA EL TRATAMIENTO DE AGUAS RESIDUALES DE CIUDADES GRANDES.

Proyecto de Servicio Social asociado a la investigación que se realiza en las áreas departamentales.

,/ -L

asesor.

4. Desglosar las actividades que desarrolló el asesor para favorecer el cumplimiento de los objetivos planteados en el Proyecto Inicial de Servicio Social. Asesoría continua al alumno durante la realización de su Servicio Social. Revisión periódica de los resultados obtenidos

5. ¿Cómo evalúa el desempeño del alumno prestador del Servicio Social? ¿ Considera que la formación que le alumno recibe en la UAMl es adecuada y suficiente para su desempeño profesional? ¿ Por qué? Considero que la alumna desempeñó un buen papel en la realización de su Servicio Social.

6. Anote las fortalezas y debilidades detectadas por usted con respecto a la formación del estudiante. La mayoría de los alumnos prestadores de un Servicio Social presentan deficiencias en los conocimientos generales de química analítica.

7. Nombre y firma del asesor.

... i

Florina Ramírez Vives.

i* 1 ' I '

I I

NOMBRE CERdN VILLEDA MARICELA

MATRICULA : 90236805

LICENCIATURA : INGENlERfA BiWUfMlCA INDUSTRIAL

TITULO DEL TRABAJO BlOTEGNOLOGlAS PARA EL TRATAMIENTO DE AGUAS

RESIDUALES DE CIUDADES GRANDES.

TITULO DEL SERVICIO SOCIAL:IDENTlFICACI6N FENOTIPICA DE DOS CEPAS DE

BACTERIAS SULFATO REDUCTORAS PRESENTES EN UN REACTOR UASB.

FECHA DE INICIO : 1 DE JUNIO DE 1998

FECHA DE TERMINACIÓN 1 DE DICIEMBRE DE 1998

CLAVEIBI.024.98

ASESORES M. EN B. FLORINA RAMfRU VIVES

UNIDAD UTAPALAPA CBS

RESUMEN

Los procesos biotecnológicos son una alternativa para el tratamiento de aguas residuales usanda micrcerganisrnos desulforantes que junto con los microorganismos acetogénicos son los más

abundante en estas siendo de bajo costo, y fácil operación y sin generar desechos tóxicos. Dentro del grupo de micruorganismos desulforantes se encuentran las bacterias sulfato

reductoras que en su respiración anaerobia utilizan el azufre en forma de sulfato como aceptor final de electrones, oxidando ácidos orgánicos, ácidos grasos. anicares, alcoholes e M comc

donadores de electrones. Se puede utilizar una gran variedad de aceptores de electrones en la respiración anaerobia, lala

como: fumarato, tiosulfato, sulfato etc..

. El producto final de la reducción de sulfato es el MS. Es importante distinguir entre reducciór asimilativa y desasimilativa. La reducción asimilativa de sulfato, el HrS que se forma se convierte en azufre orgánico en f m a de aminoáadas, etc. Y en la reducción desasimilativa del sulfato SE

excreta el H2S.

Es importante definir entre los diferentes géneros de BacteriaU.Sulfato-Reductoras para su clasificaci6n en función de su fuente de carbono y su aceptor final de electrones para SL caractenzadón fenotípoca. Ademes del tipo de reacción Gram que presentan.

Los resultados mostraron que la cepa us6 bien el tiosulfato en el caso de la cepa 5 y el sulfato er el caso de la cepa 3 como aceptores finales de electrones y como donadores ocuparon mejor e lactato etanol siendo la dos cepas representatiwas del genero DesuNowMo.

M. EN B.: FLORINA RAMfRU VIVES CER6N VILLEDA MARICELA

INTRODUCCI~N

Las transformaciones del azufre son complejas por sus distintos estados de oxidación del azufre y porque algunas transformaciones se efectúan a velocidades rápidas tanto químicas como biológicas. El ciclo rédox para el azufre y la paitidpación de los microorganismos en las

transformaciones se dan en la Fig.1, solo hay tres formas significativas del azufre en la naturaleza. -2 (sulfhidnlo, R-SH y sulfuros, HS-) , O (azufre elemental, So ) y +6 ( sulfatos).

Sulfato oxjdación Aerobia

Suiíuro respiración

üasulfuración

R-SH Suiíato-reducción

Asimilación Suiíatoreducción

Desirnilatoria

So

Sulfur0 oxjdación

So Anaerobia

Oxidación Fototrófica

Fig.1 Ciclo del azufre. (Atlas, 1993).

El ciclo del azufre, depende en gran medida de la proporción de oxigeno, la mineralización de los compuestos orgánicos del azufre para originar sulfatos, tiene lugar en condiciones aerobias, pero por medio anaerobio puede producirse hidrogeno sulfurado y pérdida de azufre.

El principal gas volátil del azufre es el ácido sulfhídrico este se forma principalmente por la reducción bacteriana del sulfato, como se muestra a continuación.

i - \ r

SOi2 + 8 e - + 8 H ' = H2S+2H20+20H'

La forma en que el sulfato esta presente en un ambiente depende de su pH, debido al equilibrio siguiente.

HzS = HS' = S"

pH bajo pH neutro pH alto

Una gran variedad de microoganismos pueden utilizar el sulfato como fuente de azufre y llevar a cabo reducciones asimilatorias del sulfato convirtiendo el HS . formado en azufre orgánico. El R-SH se forma a partir de la descomposición de este azufre orgánico mediante la putrefacción y la desulfuración y esta constituye una fuente importante de HS . en agua dulce. La reducción desasimilatoria o desimilatoria del sulfato en el cual el sulfato sirve como aceptor de electrones, es efectuada por diversas bacterias sulfato - reductoras anaerobias estrictas.

Las bacterias desempeñan un papel importante en la oxidación del azufre y de sulfuros como las litotróficas que producen sulfato o HoS aciddicando el ambiente. Las bacterias sulfato - reductoras utilizan el sulfato como receptor de electrones en la respiración anaerobia produciendo sulfuro de hidrogeno.

Los requerimientos nutricionales de las bacterias sulfato - reductoras son simples. Requieren un aceptor.horgánico de electrones, que generalmente es el ion sulfato. Existen otras bacterias, que son capaces de utilizar otros compuestos sulfurados, así como también son capaces de utilizar alcoholes monovalentes, ácidos dicarboxílicos, compuestos aromáticos, ácidos orgánicos cíclicos saturados, aminoácidos, azucares, glicerol e hidrocarburos (Widdel 1988). Pero en ausencia de un aceptor de electrones externo, algunas bacterias pueden fermentar sustratos. tales como piruvatos, fumaratos, malatos y lactato. Gibson (1990),.

Las bacterias sulfato reductoras se dividen en dos grandes grupos: a) las que pueden oxidar los compuestos orgánicos hasta bióxido de carbono y b) las que únicamente oxidan los compuestos orgánicos hasta acetato. Los géneros representativos de estos dos grupos son:

1 .- Desulfobulbus, Desulfomonas, Desulfotomaculumy Desulfovibrio*.

coz Compuestos orgánicos - 2.- Desulfobacter, Desulfococcus, Desulfosarcha, Desulfobactenum, Desulfonema

/ - CHaCOO- Compuestos orgánicos ___,

L a

'Algunas cepas de este genero llegan hasta acetato. Los donadores de electrones que pueden usar las bacterias sulfato reductoras son compuestos de bajo peso molecular, siendo algunos de ellos producto de la fermentación de catbohidratos o proteínas por lagunas bacterias anaerobias. Las especies sulíuro reductoras pueden crecer tanto en presencia de hidrógeno o en acetato. Las sulfato reductoras y sulfuro reductoras, pueden crecer en acetato e hidrogeno, como única fuente de energía. Se ha observado que las sulfato reductoras tiene la habilidad de crecer con compuestos orgánicos reducidos, como el propionato, butirato, ácidos grasos, que son sustratos, de baja energía bajo condiciones anaerobias. Pero también son capaces de usar sustratos de alta energía como el lactato o etanol, contando con aceptores de electrones externos.

Clasificación

Para clasificar a las bacterias sulfato reductoras es importante basarse en las características nutricionales, bioquímicas y morfológicas así como el contenido de DNA y la presencia de algunos pigmentos particulares. La clasificación es completa pues algunas bacterias presentan similitudes morfológicas, pero difieren nutricionalmente y viceversa. Widdel (1988),. Se ha logrado la identificación de cepas, usando como criterios: el donador de electrones, la fuente de carbono, la temperatura y la tolerancia a la sal.

-3

I i.."

CARACTERISTICAS GENERALES DE LOS GENEROS DE BACTERIAS SULFATO REDUCTOAS (Según el Bergey's Manual, 1994)

csnfildlag I D U M C M W I ~ IDWNOIWW. ILMWVM 1r-m espiral O vblwdn C m U b en tomia ds

+

'h El üergey's manual divide a las bacterias sulfato reductoras en:

Tabla No.1 características diferenciales más importantes de los géneros del

I I incanwta del Susbato I del susbato I Rsaictaas de sulfato 01 + I + I + i

+ d - + + harta COI I I Simtoios ver dcAnidones estándar b Desdfivibrb baarsii oxida completamente hasta co1: estos fucmn reclasülcados en Desulfmrculus baarsii

Tabla N0.3 Características diferenciales más importantes de los géneros subgrupo3. I

I I I I I I Adú@sprsaos (C, - C.) I - . + b - t. + + >35h

ümuoMo 1 + b - I t b - I + I + b - I +

Dentro del subgrupo2 el genero üesulfovibrio es el que mayormente se ha encontrado dado que contiene 13 especies. Son células en forma de espiral o vibrio su tamaño es de 0.5-1.3 X 0.8- micrómetros de diámetro se mueven por presencia de flagelos polares, son anaerobias estrictas. El sulfato y tiosulfato lo reducen hasta I+&. Como donadores de electrones utilizan el HPi lactato, etanol y algunas utilizan malato, glicerol y algunos aminoácidos. Dado que en dos cepas en este estudio presentaron una morfología similar a este genero es importante hacer una descripción del genero mostrado en la tabla No. 5.

..

Y T e . --

OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL:

Identificación en base.1 crecimiento de diferentes fuentes de carbono a dos cepas de bacterias Sulfáto-Reductoras aisladas de un reactor anaerobio UASB.

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.-

OBJETIVOS PARTICULARES

1 .- Medir el crecimiento como D:O (Densidad óptica ) de dos cepas de Bacterias-Sulfato- Reductoras aisladas de un reactor con diferentes compuestos orgánicos con el fin de caracterizadas fenotipicamente.

(- d 2.- Con los sustratos oxidados probar sulfato y tiosulfato como aceptores finales de

electrones para la sulfato reducción.

3.- Estudios morfoiógicos de las dos cepas para definir el género. Gram y observación al microscopio.

METODOLOGIA

PROCEDENCIA DE LA MUESTRA

Las cepas fueron aisladas de un Reactor UASB que trataba un medio con sulfato.

Medio de cultivo: se utilizaron dos medios de cultivo para el aislamiento. La composición de estos medios se muestra en la tabla 6

*- r ...

*Concentración de sales :(glL) N k C k 1, KzHP0~0.3, KHzPOF 0.3, NaCk10.0. MgCI~%Hz0=0.2.

"Oligoelernentos de Balch: (g/L)MgCOd'7HzO=3.0, MnSOC2Hz0=0.50, CaC12'Hz0=0.10, FeSOiMzO=0.10, CoClz '2 H20=0.10, ZnSO~0.10, CUS0i5H20=0.011 ALK(S04)~0.01, Acido nitrilo acático=l.5, NaCI=l .O, H3B0~0.01 Na~No0~*2H20=0.01.

CaClz'2HzO=O.lI KCkO.1.

f- a

Las soluciones se prepararon en condiciones anoxicas, con comente de nitrógeno y posterior esterilización.

PREPARACI~N DEL MEDIO DE CULTIVO

Se adicionan todos los componentes en el orden en que aparecen en la tabla No.6 están en agua destilada, posteriormente se agrega la solución de oligoelementos llegando casi al volumen deseado previamente medido con una probeta, se ajusta a pH de 7 con una solución de KOH IM. Posteriormente se agrega el NaHC03 a una concentración de 2911 se agrega la resarzurina y ajusta el volumen de aforo. Se marca la cantidad de medio que se tiene en el matraz y se adiciona el 30 % mas de volumen de agua. Se tapa el matraz con papel aluminio perforando con dos orificios pequeiíos y se pone en la pamlla a ebullición hasta que se reduzca el agua. Poco antes de llegar a la

marca de aforo se conecta a un flujo de nitrógeno para evitar la entrada de oxigeno. Cuando se llega al volumen de aforo se suspende la ebullición se deja enfriar, una vez ya frío se le agrega la cisteína y se deja con el flujo de nitrógeno conectado.

DISTRIBUCt6N EN LOS TUBOS Y BOTELLAS

Con un pipeteador automático se distribuye el medio en tubos o botellas según sea el caso. Para los tubos 5 mL y botellas 50 mL. Se pone la manguera de succión del pipeteador en el matraz del medio con la comente de nitrógeno se enjuaga con el medio el pipeteador dos a tres veces si sé trata de tubos o una ves si son botellas posteriormente. Se ponen los tubos con una manguera de comente de nitrógeno para desplazar el oxigeno presente en la botella o tubos según se al caso y se procede a llenarlos con el pipeteador automático se deja un instante la manguera con la comente de nitrógeno burbujeando en el medio, se saca rápidamente la manguera y se tapa con tapones de goma y posteriormente tapones para tubos huntage y para las botellas serólogicas se engargolan.

ESTERILIZACI~N

La esterilización se lleva acabo en el autoclave previa revisión que contenga en nivel de agua adecuado de lo contrario sé ajusta con agua destilada al nivel, se conecta y se pone la perilla en mínimo. Dentro de una canastilla se colocan las botellas serólogicas con medio y los tubos con medio, se pone la canastilla dentro del autoclave se cierra y apretando bien las llaves para que quede bien cerrada se pone la perilla en máximo y sé checa el termómetro cuando llegue a 90% se pone la válvula de presión y esperamos a que llegue a 121 QC o 15 Libras de presión se pone la perilla en mínimo esperando 15 minutos, pasando el tiempo se apaga y desconecta dejando enfriar.

PREPARACION DE LOS DIFERENTES SUSTRATOS

Los diferentes substratos utilizados para la identificación de las sepas fueron preparados con agua reducida por ebullición a una concentración 1 M., Los sustratos ocupados fueron: 1

Azucares

Acidos orgánicos

Compuestos aromáticos Alcoholes Compuestos varios

D-Manitol,Maltosa,L(+)Ramnosa,Galactosa, D(+) Fructosa, D-Ribosa, L-Xilosa, Manosa, Sacarosa, Lactosa. D-Glucosa, D-Xilosa. ác. Succinico, ác.Oxalim, ác. Propionico, ác. Butirico, ác. Mako, ác. Fórmico. Catacol. Tolueno, Anilina, Fenol, ác Benzoico. Etanol, 1-Butanol Lactato de sodio, C02+H2, acetona, casaminoacidos, acetato.

Se probaron dos aceptores de electrones: sulfato y tiosulfoto.

La utilización de sustratos: La utilización de los compuestos fue determinada por el crecimiento medido como absorbancia a 480 nm en un fotocolorimetro Bausch & Lomb. Todos los sustratos fueron por duplicado y con un control para descartar el crecimiento presentado por los otros componentes del medio.

Determinación de H$3 Se midió HaS disuelto por el método de determinación de disolventes y precipitación de sulfuros en cultivos de bacterias sulfato - reductoras (Ruwisch, 1985), el His gaseoso se determinó por cromatografía de gases en un cromatógrafo Varían (modelo 3400) bajo las siguientes condiciones de operación: temperatura de la columna 80°C, temperatura del inyector 150 "C, temperatura del detector 210 "C. Como gas acarreador se uso Helio. Se uso una columna de 25 m de largo por 0.25 mm de diámetro. Un detector fotométrico de flama (FPD). La muestra era tomada directamente de la fase vacía de los cultivos a razón de 1 mL con jeringas de insulina bajo condiciones anóxicas y estériles.

TÉCNICA DE TINCIÓN DE GRAM

Las características morfológicas de las bacterias se pueden observar utilizando organismos vivos o muertos. La realización en células fijas permite : realizar un examen más detallado de las células; lograr una diferenciación de especies microbianas ; conservar las preparaciones mayor tiempo. La tinción de los microorganismo?, puede realizarse para mostrar la forma tamaiío y arreglo de las células, adquiriendo información adicional en su morfología y composición química de las bacterias, en base al color que retienen.

Preparación de los colorantes

1 .- Cristal violeta : Disolver en un vaso de precipitado 1 g de cristal violeta y agregar 1 O ml de alcohol etlco. Disolver en otro vaso de precipitado 0.4 g de oxalato de amonio con 40 ml de agua destilada. Mezclar las dos soluciones en la obscuridad durante 24 horas. Filtrar con papel Whatman .

2.- Solución de lugol :En un matraz aforado de 50 ml colocar 20 ml de agua destilada y disolver 0.1 g de yodo y 0.2 g de yoduro de potasio. Mezclar y aforar con agua destilada.

3.-Decolorante: Colocar en una probeta de 50 ml , 30 ml de alcohol etflico y 20ml de acetona. Poner esta solución en una piseta.

4.- Safranina: En un matraz aforado de 50 ml colocar 5 ml de alcohol etílico y disolver 0.125 g de safranina aforar con agua destilada.

5.- Azul de metileno: Pesar 0.25 g del compuesto y disolverlo en 50 ml de agua destilada.

Preparación del frotis

1 .- Esterilizar con el mechero el asa microbiología hasta rojo vivo.

2.- Enfriar el asa atrás del mechero y tomar el cultivo bajo condiciones estériles.

3.- Colocar en el centro del porta objetos una gota de la muestra y extender perfectamente.

4.-Fijar suavemente la muestra con el calor del mechero.

Coloración

1 .- Cubrir el frotis con dos gotas de solución del cristal violeta. Esperar un minuto.

2.- Lavar con agua destilada el exceso de colorante.

3.-Cubrir el frotis con dos gotas de solución de lugol y esperar un minuto.

4.-Lavar nuevamente con agua destilada.

5.- Lavar con el decolorante hasta que no fluya mas tintura.

6.-Lavar con agua nuevamente.

7.- Aplicar al frotis dos gotas de solución de safranina y esperar 30 segundos.

8.- Lavar con agua y dejar secar la preparación al aire. '

9.- Realizar previamente la iluminación de K6ehller con el objetivo 1 O.

1 O.-Observar las tinciones con el objetivo IOOX y aceite de inmersión.

3

ACTIVIDADES REALIZADAS

1 .- Revisión bibliográfica.

2.- Medición del crecimiento por densidad óptica.

3.- Medición de HIS disuelto por el método colonmétrico de Ruwisch.

4.- Medición de H2S gaseoso por cromatografia de gases.

5.- Tinción de Gram y observaciones al microscopio.

6.- Pruebas complementarias para definir el genero bacteriano.

'3

:3

OBJETIVOS Y METAS ALCANZADOS

La identificación en base a crecimiento de diferentes fuentes de carbono de las dos cepas de bacterias Sulfato-Reductoras aisladas de un reactor anaerobio UASB se llevo a cabo satisfactoriamente.

Midiendo el crecimiento como DO: (Densidad óptica ) de dos cepas de Bacterias-Sulfato- Reductoras aisladas del reactor con los diferentes compuestos orgánicos con el fin de caracterizadas fenotipicamente.

Con los sustratos oxidados se probo al sulfato con la cepa 3 y al tiosulfato las cepas C3 y C5 como aceptores finales de electrones pata la sulfato reducción. '3 Los estudios morfológicos de las dos cepas para su definición del género. Gram y la observación al microscopio se cumplieron.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

La tabla No. 7 muestra el crecimiento de las cepas de Bacterias-Sulfato-Reductoras en los diferentes sustratos y los dos aceptores de electrones tiosulfato y sulfato en la primera inoculación a un pH de 7 y una temperatura de 35 QC. La cepa 3 con sulfato no se probó por que no se encontraba completamente pura y se termino de aislar. A esta cepa no se le hizo pnieba de sustratos.

SUBSTRATO

CONTROL' AZUCARES

TABLA N0.7 ICEPA 3 ICEPA 5 ICEPA 5 ler. INOWIAC16N ITIOSULFATO ITIOSULFATO ISULFATO

I I

ABSORBANCIA ABSORBANCIA ABSORBANCIA MAX A 580(nm) MAX. A 580(nm) MAX A 580(nm)

0.14 0.13 0.06

En una 2* inoculación con los mismos sustratos se midió crecimiento como D.O. y producción de H2S como se muestra en la tabla No. 8.

Tabla No. 8 Crecimiento de las cepas en una segunda inoculación y la concentración de

3

3

Tabla No. 9 Crecimiento de la tercera inoculación con los diferentes sustratos y los dos

CASAMINOACIDOS

En la tabla No. 8 al igual que la tabla No. 9 se muestran con negritas las cepas que crecieron mas que el control y la producción de HzS gaseoso característico de las Bacterias-Sufato-Reductoras. Algunas muestran crecimiento pero no producción de gas. Los compuestos que presentan asteriscos son compuestos que presentaron turbidez desde el tiempo cero pero conforme se continuaba la cinética de crecimiento disminuye su turbidez, esto produjo confusión de que si la bacteria consumía al sustrato pero la lectura en el cromatógrafo de gases mostró que no hubo producción de HzS gas.

Mostrando que la disminución se pudo deber a la sedimentación del mismo. AI no tener una buena agitación en el momento de medir. Es importante resaltar que a partir de la segunda inoculación se realizo la medición de H2S gas ya que se considero que no había sustrato residual proveniente del inoculó.

CINÉTICA DE CRECIMIENTO DE LA CEPA 3 CON TIOSULFATO CON LOS SUSTRATOS QUE

PRESENTARON UN CRECIMIENTO MAYOR QUE EL CONTROL. 0.45 -

0.4 - 0.35 - 4 8 E 0%

!zo 02- $ 0.15 - 4 0.1 -

0.05 - O,

O 5 7 11 13

TIEMPO EN D!AS

+CONTROL +MALTOSA

-CLACTATO DE SOD10 -C02 + H2 I ~

- -A- .ETANOL -x 'I-BUTANOL

En la tercera inoculación de los compuestos que tienen una R son compuestos que presentaron coloración rosa mostrando presencia de oxigeno en el tubo siendo así una lectura incorrecta del crecimiento. De la tercera inoculación se presentan las cinéticas de crecimiento de los compuestos que presentaron un crecimiento mayor al control y producción de H2S gas.

TABLA No. 10 Cinetica de crecimiento de la cepa 3 con tiosulfato

Fig. 2 Cinetlca de crecimiento de la cepa 3 con tiosulfato con los sustratos que presentaron un crecimiento mayor que el control.

'3

3

CODIO C02 + H2 I 0.05) 0.14) 0.21 I 0.21 0.19

/e

3

3

Fig. 3 Cinetica de crecimiento de la cepa 5 con tiosulfato.

0.4 7

0.35 - 0.3 -

0.25- 8 5 5 0.2 - m $ K 0.15 - m 0.1 - a

0.05 -

CINETICA DE CRECIMIENTO DE LA CEPA 5 CON CULFATO

7,. O 4

O 5 7 11 13

TiEMPO EN MAS

-CONTROL -+- ETANOL - - 1-BUTANOL +LACTAT0 DE SODIO -CO2 + H2

'3

Fig. 4 Cinética de crecimiento de la cepa 5 con sulfato.

En la figura 2 se observa el crecimiento de la bacteria con los diferentes fuentes de carbono utilizados y se puede ver que el mejor crecimiento se presentó con lactato y etanol. Esta cepa no creció con acetato por lo que se trata de una bacteria del grupo 2 es decir una degradadora incompleta. Las figuras 3 y 4 nos muestran las cinéticas de crecimiento de la cepa 5 con sulfato y tiosulfato como aceptores finales de electrones con los sustratos que presentaron mayor crecimiento que el control. Como se puede observar el mayor crecimiento se presentó con galactosa y manosa cuando se tiene como aceptor final de electrones al tiosulfato y lactato y etanol cuando se tiene como aceptor final de electrones al sulfato. Sin embargo los azucares fueron mejor consumidos en presencia del tiosulfato probablemente se debió a que este compuesto es mejor aceptor que el sulfato para estos sustratos.

MORFOLOGIA.

Resultados de la tinción de Gram y morfología microscópica.

La cepa 3 se presento en forma de bacilos alargados y se observaron algunos en forma circular con una reacción de Gram positivo. Como se muestra en la figura No. 5.

La cepa 5 se presento en forma de bacilos pequeños curvados y puntas redondeadas con una reacción de Gram positivo. Como se muestra en la figura No. 6.

'3

Fig. 5 Morfología de la cepa 3

Fig. 6 Morfología de la cepa 5.

CONCLUSIONES

1 .- Las dos cepas estudiadas difieren en morfología y sustratos útilizados.

2.- El tiosulfato es mejor aceptor de electrones que el sulfato en el caso de la cepa 5.

'3

3.- Por sus características morfológicas y bioquímicas la cepa 3 y la cepa 5 pueden considerarse unas bacterias representativas del genero de Desuifovivno.

CRiTERIOS DE EVALUACIÓN

1 .- Revisión periódica de resultados

2.- Seminarios

3.- Trabajo de laboratorio

3 i

BlBLlOGRAFíA

Widdel F. 1988 Microbiology and ecology of Sulfate and sulfur-

reducing bacteria. In AJB Zehnder (eds. )Biology of Anaerobic,

Microormanisms. John Wiley and. Sons Inc. pp 469-586.

Jimenez C.B. y Torres B:L: 1996 "Eliminación del azufre por vía

biológica del conbustoleo 'l. En biodegradación de compuestos

orgánicos industriales Instituto de Ingeniería UNAM pp 23-27. '3

Rheinthetlerimer Gerhard. 1987 Microbiología de las aguas 4a.

Edición pp 293-295.

Zehn J:B: 1993 Biology of anaerobic. microorganisms. pp 234. Wiley

Liss NEW York.

Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. 1994 J.G. Holt., N.R.

Krieng., P.H.A. Sneath.,J:TStaley and S.T: Williams Ninth edition,

Williams and Wilkins, pp. 335-346. '3

Roger Y, Stanier 1992 "Microbiología De. Reverte, S.A. pp 324-352

Aivarez P. Julieta (1 998)"Aislamiento de Bacterias Sulfato-Reductoras de Pozos Petroleros". UAMX Tesis pp 8,9.