1-Aislamiento de genes-(Clonado molecular)

2015

Salvador Domingo Felipe Jacinto Dal i Domnech (1904-1989)

2

GENES AISLADOS

Clulas eucariotas(cultivo)

Clulas procariotas (cultivo)

Animales Vegetales

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GENES AISLADOS

Clulas eucariotas(cultivo)

Clulas procariotas (cultivo)

Animales Vegetales

VECTOR

4

GENES AISLADOS

Clulas eucariotas(cultivo)

Clulas procariotas (cultivo)

Animales Vegetales

VECTOR

Plasmido Virus

----SISTEMA BIOLGICO----

3COMO SE OBTIENE UNGEN AISLADO ???

Clonado Molecular

~1973Reaccin en cadena

de la polimerasa (PCR)1983

Sntesis Qumica~ 1980

Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)

1983

COMO SE OBTIENE UNGEN AISLADO ???

Clonado Molecular

~1973

Sntesis Qumica~ 1980

4Deteccin, qu sonda usamos

???

Cromosoma

Proteina

Gen

vector

Clula

LIBRERAS GENMICAS

Eucariota

ProcariotaIntrones ?

A B C D E

Clonar en un vector

A B C D E

Digerir cromosoma

Cromosoma

Introducir el vector en E. coli

Librerias en colonias (o fagos)

Cpsula de Petri

SISTEMA BIOLOGICO ?

Cmo detecto ??el gen

( el DNA)

5LIBRERAS DE cDNA

A B C D E

Clonar en un vector

Introducir el vector en E. coli

Libreria en colonias

Clula

Aislar mRNA

mRNA cDNATranscripcin reversa

Cpsula de Petri

Eucariota

ProcariotaIntrones ?

SISTEMA BIOLOGICO ?

Cmo detecto ??el cDNA

LIBRERIAS DE EXPRESION

A B C D E

Cada colonia produce una proteina diferente

mRNA cDNATranscripcin Reversa

Fragmento de cDNAPromotor

Introducir el vector en E. coli

Cpsula de Petri

region codificante sin intrones, mayoritariamente bacterias

611

Paul Berg, es considerado el padre de la rama de la bioqumica conocida como: ingeniera genticaBioqumico estadounidense. Recibi el premio Nobel de Qumica en 1980 por sus estudios sobre los cidos nucleicos, en especial por el cido desoxirribonucleico (ADN) recombinado, galardn que comparti con Walter Gilbert y Frederick Sanger. Paul Berg fue testigo de primera mano en la historia de la investigacin sobre el ADN recombinado, de la que ha sido uno de sus protagonistas desde joven. Se granje muy pronto el reconocimiento de la comunidad cientfica al describir los pasos clave en los que el ADN produce las protenas.

Premio Nobel en Qumica, 1980

Paul Berg (1926)

A mediados de la dcada de los 70 la Academia Nacional de las Ciencias de USA le encomend revisar la seguridad de la tecnologa del ADN recombinado. La respuesta fue la denominada "Carta Berg", donde se peda una moratoria en la investigacin sobre el ADN recombinado hasta que se consiguiese resolver los problemas de seguridad. Fue uno de los organizadores de la Conferencia Asilomar (foro internacional sobre la tecnologa del ADN recombinado, celebrada en febrero de 1975) que reuni a cien cientficos relevantes para discutir los riesgos potenciales de los experimentos para ensamblar genes. Como resultado de estas discusiones se public, un ao ms tarde, la Directiva de los Institutos Nacionales de Salud, un hito en la autorregulacin de los investigadores cientficos. No obstante, el grupo de investigacin de Berg sigui trabajando con las tcnicas de ADN recombinado

12

Cortar el DNA

Separar los fragmentos de DNA

Producir cantidad de c/u de ellos

Identificar el fragmento que contiene el gen

Pasos para el clonado molecular de genes:

7ENZIMAS DE RESTRICCIN TIPO II

EcoRI: gives sticky ends EcoRV: gives blunt ends

Cortan en sitios especficos dentro de secuencias palindrmicas

EcoRI EcoRIV

8Sitios de reconocimiento y corte de algunas enzimas de restriccin Tipo II

Enzima Secuencia de reconocimiento Microorganismo AluI AGC*T Arthrobacter luteusBamHI GGATC*C Bacillus amyloliquefaciens HBglI GCCNNNNNNGGC Bacillus globigiiBglII A GATCT Bacillus globigiiEcoRI G AA*TTC Escherichia coli RY13EcoRII CC*(TA )GG Escherichia coli R245EcoRV GA*T ATC Escherichia coli J62P4G74HaeII RGCGC Y Haemophilus aegyptiusHaeIII GG C*C Haemophilus aegyptiusHindIII A* AGCTT Haemophilus influenzae MspI

C* CGG Moraxella speciesPstI CTGCA* G Providencia stuartii 164PvuII CAG C*TG Proteus vulgarisSalI G TCGAC Streptomyces albus GTa q I T CGA* Thermus aquaticusXhoI C TCGAG Xanthomonas holcicola

(A* is N 6 -methyladenine and C* is 5-methylcytosine). R, Y, and Nrepresent a purine nucleotide, a pyrimidine nucleotide, and any nucleotide, respectively.

DNA ligasa

9VECTORES DE CLONADO

Vector Max. tamao del inserto (kb)

Plsmido 10 - 15Fago l 25Csmido 35 - 45Fago P1 80 - 100BAC 50 - 300YAC 300 - >1500

Cunto DNA puede llevar ?

Cmo ingresa a la clula?

Qu destino intracelular ?

Cmo se selecciona ?

Qu cantidad (Nro de copias) ?

DNA

DNA

PLASMIDOS

10

Plsmido

Amp

E. Coli

Ampicilina

Ampicilina

Enz

11

BACTERIFAGO LAMBDA

12

BACTERIOFAGO LAMBDA (l)

secuencias cos

El DNA puede ser empaquetado in vitro para formar partculas virales

PLASMIDOS FAGOS

Fcil manipulacin

Acomoda hasta 10 Kb

Transformacin relativamente eficiente

Colonias

Manipulacin complicada

Acomoda 20-40 Kb

Transfeccin muy eficiente

Placas

13

25

CONSTRUCCIN DE UN BANCO DE CLONES (GENOMICO) (a)

26

CONSTRUCCIN DE UN BANCO DE CLONES (b)

14

27

RASTREO DEL BANCO PARA DETECTAR EL GEN DE INTERES

28

Aislar el clon deseado

Infectar bacterias frescas

Membrana

Cpsula original

Aislar DNA del fago

Anlisis del DNA

Enz. restriccin

OBTENCION DEL FRAGMENTO CLONADO

15

29

El nmero de clones requeridos para tener 99% de probabilidad de encontrar un detrminado fragmento de DNA en el banco de clones depende del tamao de los insertos y del tamao del genoma.El # de clones necesarios para tener una dada probabibilidad de encontrar un fragmento de DNA es:

N = ln(1-P) / ln(1-f)

N = # de clones,

P es la probabilidad de obtener un dado fragmento.

f es la fraccin del genoma en cada clon.

Ej. Genoma humano = 3 x 106 kb DNA

Tamao promedio de insertos en el vector = 17 kb

Probabilidad = 0.99

Se calcula que 8 x 105 fagos son requeridos para tener el 99% de probabilidad de obtener un fragmento determinado.

CUANTOS CLONES HAY QUE RASTREAR????

30

16

31

DNA genmico y cDNA

32

Sntesis de cDNA

17

33

CONSTRUCCIN DE UN BANCO

DE CLONES (cDNA)

34

RASTREO

18

35

Fago l

BANCO DE CLONES DE EXPRESIN (cDNA)

36

19

37

RASTREO

38

NO EXPRESION

PROMOTOR

EXPRESION

20

39

40

Ac

Secuencia aa (parcial)

Oligonucletido

Funcin

Peptido Ac

DNA (homologo)

Si la protena posee capacidad de unirse especficamente a otra protena celular o unir un ligando o unir DNA se puede utilizar alguna de estas propiedades para utilizar identificar un clon que contenga el cDNA o gen.

(requiere cantidad)

Banco de clones

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-galactosidasa

CLONADO POR COMPLEMENTACIN

E. coli -gal (-) glucosa

lactosa

42

CLONADO POR COMPLEMENTACION

DNA library(E. coli)

E. Coli mutantes (gal-)

Transformacin de la cepa mutante con la libreria de DNA

Seleccin en lactosa como nica fuente de carbono

Crecimiento de la cepa complementada y asilamiento del plsmido para el anlisis del gen clonado