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ORGANISMOS CELULARES ORGANISMOS CELULARES EUCARIÓTICOS EUCARIÓTICOS PROCARIÓTICOS PROCARIÓTICOS Monera Monera ou bacterias ou bacterias MULTICELULAR MULTICELULAR UNICELULAR UNICELULAR Protista Protista ou protozoa ou protozoa e algas unicelulares e algas unicelulares FOTOSSINTÉTICOS FOTOSSINTÉTICOS Plantae Plantae ou plantas ou plantas ABSORTIVOS ABSORTIVOS Fungi Fungi ou fungos ou fungos INGESTIVOS INGESTIVOS Animalia Animalia ou animais ou animais CLASSIFICAÇÃO DOS ORGANISMOS CELULARES CLASSIFICAÇÃO DOS ORGANISMOS CELULARES

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ORGANISMOS CELULARESORGANISMOS CELULARES

EUCARIÓTICOSEUCARIÓTICOS PROCARIÓTICOSPROCARIÓTICOSMonera Monera ou bacteriasou bacterias

MULTICELULARMULTICELULAR UNICELULARUNICELULARProtista Protista ou protozoaou protozoae algas unicelularese algas unicelulares

FOTOSSINTÉTICOSFOTOSSINTÉTICOSPlantae Plantae ou plantasou plantas

ABSORTIVOSABSORTIVOSFungi Fungi ou fungosou fungos

INGESTIVOSINGESTIVOSAnimalia Animalia ou animaisou animais

CLASSIFICAÇÃO DOS ORGANISMOS CELULARESCLASSIFICAÇÃO DOS ORGANISMOS CELULARES

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FOTOSSINTÉTICOScaptam a luz para converter CO2 e H20 em O2 e açúcares

6H2O + 6CO2 6O→ 2 +C6H12O6

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INGESTIVOS INGESTIVOS: captam partículas não dissolvidas (animais)

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ESQUEMA GERAL DE UM PROCESSO FERMENTATIVO

microrganismo

Inóculo Laboratório

Inóculo Industrial

Ar

CompressorEsterilização

do Ar

Biorreator

Industrial

Matérias-primas

Esterilização

Meio de cultura

Células

Caldo fermentado

Recuperação Produto

Separação das células

Produto Tratamento efluentes

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Crescimento Microbiano Aumento em tamanho da população Aumento no número de células Aumento da massa celular

Duplicação Fissão binária Tempo de geração Curva do crescimento microbiano

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Crescimento Microbiano Fonte de carbono

Energia

Aceptor de elétrons

Doador de elétrons

H2O

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Crescimento Microbiano Nutrientes orgânicos: aminoácidos, vitaminas, purinas e

pirimidinas

Nutrientes inorgânicos: macro e micro

Condições ambientais: pH, temperatura, potencial hídrico, condutividade, pressão, potencial redox, superfície para crescimento

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Grupos nutricionais Fotoautotróficos: luz é energia para sintetizar ATP, e CO2 é fonte de

C para sintetizar compostos orgânicos (bactérias fotossintéticas, cianobactérias, algas, etc.)

Fotoheterotróficos: luz é energia para sintetizar ATP, mas o C é obtido em formas orgânicas mais complexas

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Grupos nutricionais Quimioautotróficos: energia obtida pela oxidação de compostos

inorgânicos como H2S, NH3, e Fe2+, e CO2 como fonte de C (bactérias

que oxidam S, bactérias nitrificadoras, bactérias que oxidam H2, bactérias que oxidam Fe)

Quimioheterotróficos: energia e C obtidos de moléculas orgânicas complexas

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Fatores que afetam o crescimento Fatores químicos:

pH: neutrófilos – pH ≈ 7.0 acidófilos – pH < 7.0

alcalófilos – pH > 7.0

Importância:• Atividade enzimática• Conformação protéica• Disponibilidade de metais e elementos orgânicos

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Fatores que afetam o crescimento Fatores químicos:

O2:

Aeróbicos obrigatórios

Anaeróbicos obrigatórios Anaeróbicos facultativos Microaerófilos Aerotolerantes

Importância:• Respiração• Reações de óxido-redução• Atividade enzimática

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aeróbios anaeróbios anaeróbios microaerófilos anaeróbios obrigatórios obrigatórios facultativos aerotolerantes

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Fatores que afetam o crescimento Fatores químicos:

Capacidade de troca de íons:

Importância:• Disponibilidade de nutrientes• Ligações substrato-microrganismo• Defesa• Atração de íons

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Fatores que afetam o crescimento Fatores físicos:

Temperatura: Psicrófilos: - 5 C a 20 C Mesófilos: 20 C a 50 C Termófilos: 50 C a 80 C Termófilos extremos: acima de 80 C

Importância:• Respostas enzimáticas• Respostas a choques térmicos• Razão de crescimento

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Fontes de Microrganismos• Os microrganismos de Interesse Industrial

pode ser obtidos:• Isolamento de recursos naturais: (solo, água,

plantas, etc);• Compra em coleções de cultura: (Agricultural

Research Service Culture Collection (EUA), Coleção de Cultura Tropical (Campinas);

• Obtenção de mutantes naturais;• Obtenção de mutantes induzidas por métodos

convencionais;• Obtenção de microrganismos recombinantes. 17

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Características Desejáveis do Microganismo

• Os microrganismos de Interesse Industrial devem:• Apresentar elevada eficiência na conversão do substrato em

produto;• Permitir o acúmulo do produto no meio, de forma a ser elevada

concentração do produto no caldo fermentado;• Não produzir substâncias imcompatíveis com o produto;• Apresentar constância quanto ao comportamento fisiológico;• Não ser patogênico;• Não exigir condições de processo muito complexas;• Não exigir meios de cultura dispendiosos;• Permitir rápida liberação do produto para o meio.

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Características Desejáveis do Microganismo

• Exemplo da Fermentação Alcoólica:

• C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2

Fator estequiométrico teórico=0,511Cada grama de glicose é convertida em 0,511g de etanolSaccharomyces cerevisiae, alcança 90% deste rendimento,

enquanto outros microrganimos produzem etanol, mas com rendimentos muito inferiores;

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Características Desejáveis do Microganismo

• Exemplo da Fermentação Alcoólica:

• C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2

Por outro lado, sabe-se que quando se atinge 8 à 10% em volume de álcool no meio, ocorre inibição da levedura e diminui a velocidade de conversão de açúcar em álcool.

Portanto no caso de obtenção de álcool combustível, deve-se trabalhar com valores que não ultrapassem esta concentração alcoólica.

Neste caso, a matéria prima incide em 60% do valor do custo do etanol.

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Características Desejáveis do Microganismo

• Exemplo da produção de enzimas ou antibióticos:

• Açúcar + O2 Células + CO2 + Produtos + IntermediáriosOxigênio, faz com que aumente consideravelmente a produção

de células, enquanto pequena quantidade do produto é obtida.A matéria-prima é barata, mas a recuperação do produto é

onerosa, chegando a 70% do valor do custo, porém o produto tem maior valor agregado.

Portanto, buscar microrganismo, que cresçam menos, ou que acumulem menos intermediários, podem diminuir o custo do processo.

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Características Desejáveis do Microganismo

• Exemplo da produção de glicoamilase por Aspergillus:

• Glicoamilase, enzima que hidrolisa amidos em glicose;

• Transglicosidase, enzima que polimeriza a glicose formando amido;

• Um microrganismo ideal, seria aquele que produz o mínimo de substâncias competitivas, ao mesmo tempo sintetize muito bem o produto pretendido.

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Características Desejáveis do Meio de Cultivo

• Ser o mais barato possível;• Atender as necessidades nutricionais do microrganismo;• Auxiliar no controle do processo, como é o caso de ser

ligeiramente tamponado, o que evita variações drásticas de pH, ou evitar excessiva formação de espuma;

• Não provocar problemas na recuperação do produto;• Os componentes devem permitir algum tempo de

armazenamento, a fim de estarem disponíveis para o uso a qualquer tempo;

• Ter composição razoavelmente fixa;• Não causar dificuldades no tratamento final do efluente. 23

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Meio de Cultivo

• Os microrganismos utilizam:• Fonte de carbono e energia, diversos açúcares, como glicose,

sacarose, frutose, polissacarideos como amido e celulose;• Fonte de nitrogênio: sais como (NH4+)2SO4, (NH4)2HPO4,

aminoácidos e uréia;• Fonte de fósforo: Monoamônio fosfato ou Diamônio fosfato;• Outros elementos: Na, K, Ca, Fe, Cu, Mg, Mn, Co, etc. em

concentrações bem reduzidas, porém necessárias.• Meios constituídos apenas por estas substâncias são

denominados de meios sintéticos.24

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SUBSTRATOS Monossacarídeos (glicose, frutose, galactose, manose, ribose, xilose,

arabinose) Dissacarídeos: Sacarose (glicose + frutose) Lactose (galactose + glicose) Maltose (glicose + glicose) Trissacarídeos: Rafinose (glicose + frutose + galactose) Maltotriose (glicose + glicose + glicose) Polímeros de alto peso molecular: Amido (amilose + amilopectina) Amilose: cadeia linear de glicose ligações alfa 1-4 Amilopectina: cadeia ramificada com ligações alfa 1-4 e alfa 1-6 Celulose: polímero de glicose em ligações beta 1-4 Glicogênio: polímero de glicose com ligações alfa 1-4 e alfa 1-6 Pectina: polímero de ácidos galacturônico, raminose, arabinose e

galactose

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Perfil de Utilização de Fontes de Carbono

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Meio de Cultivo

• Meios de cultivo preparados com fatores de crescimento:• aminoácidos;• Vitaminas (biotina, tiamina, riboflavina, etc.);• Extratos de leveduras, extratos de malte, extratos de carne,

peptona, hidrolisados de proteínas;

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Meio de Cultivo

• Meios mais complexos e menos onerosos, por esta razão empregados na maioria dos processos fermentativos em grande escala:

• Caldo de cana-de-açúcar;• Melaço,• Cereais (trigo, milho, cevada, soja);• Frutas (uvas, jaboticabas, laranjas, bananas)• Estas matérias-primas são de composição química

desconhecidas, mas os teores de açúcares, nitrogênio e fosforo, devem ser determinados para avaliar sua complementação ou não.

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Considerações Finais

• A definição adequada do microrganismo a ser empregado, assim como do meio de cultura para este microganismo, é etapa fundamental para o sucesso de um processo fermentativo;

• No entanto, é sempre importante lembrar que a definição de um processo fermentativo mais adequado, assim como as preocupações com a recuperação do produto, são etapas da mais alta importância;

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Considerações Finais

• Em alguns casos o emprego de microrganismos disponíveis em coleções de cultura pode levar ao desenvolvimento de processos produtivos que sejam atraentes;

• É necessário lembrar, no entanto, que presentemente se dispõem de muitos recursos para o aprimoramento de linhagens produtivas, o que torna os processos fermentativos cada vez mais promissores;

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Considerações Finais• Essas considerações trazem também um importante

alerta sobre a constante necessidade de desenvolvimento do processo produtivo já instalado, justamente por essa grande variedade de desenvolvimentos possíveis;

• Presentemente e bastante dificial imaginar que uma dada empresa disponha do microrganimso “ótimo” ou do meio de cultura “otimizado”;

• É da mais alta importância que essa empresa continue a busca por melhores condições, em termos de microrganismos e de meio, caso contrário, poderá ser ultrapassada pela concorrente. 31

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ESTERILIZAÇÃO DE MEIOS• ESTERILIZAÇÃO DE MEIOS DE FERMENTAÇÃO POR

AQUECIMENTO A VAPOR• MUITOS PROCESSOS FERMENTATIVOS EXISTEM A

PRESENÇA DE MICORRGANISMOS ESTRANHOS “CONTAMINANTES”;

• EXEMPLO: • 1. PINICILINA OS CONTAMINANTES PODEM PRODUZIR

PENICILINASE;• 2. FERMENTAÇÃO ACETONA-BUTANÓLICA, A BACTÉRIA

PODE SER DESTRUÍDA POR VIRUS BACTERIÓFAGOS;• OS CONTAMINANTES CONSOMEM AÇÚCARES E

NUTRIENTES, COMPETINDO COM OS MICRORGANISMOS DE INTERESSE.

• O GRAU DE ELIMINTAÇÃO DOS CONTAMINANTES DEPENDE DE CADA CASO.

Prof. Dr. João Batista de Almeida e [email protected]

[email protected]

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ESTERILIZAÇÃO DE MEIOS• PROCESSOS DE ESTERILIZAÇÃO POR AQUECIMENTO• PROCESSOS DESCONTÍNUO:• O MEIO É COLOCADO NO FERMENTADOR E ENTÃO TODO O

SISTEMA É AQUECIDO COM VAPOR. ESTERILIZA-SE O MEIO E O FEMENTADOR AO MESMO TEMPO, PODENDO SER POR VAPOR DIRETO OU INDIRETO;

• O AQUECIMENTO COM VAPOR DIRETO, PROVOCA DILUIÇÃO DO MEIO ENTRE 10 E 15%;

• A ESTERILIZAÇÃO DESCONTÍNUCA TEM AS SEGUINTES FASES:

• 1. AQUECIMENTO: elevação da temperatura próximo de 120 oc;• 2. ESTERILIZAÇÃO: temperatura é mantida constante durante o tempo

de esterilização;• 3. RESFRIAMENTO: refrigera-se o sistema por serpentina ou pela

camisa do fermentador. 33

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ESTERILIZAÇÃO DE MEIOS• PROCESSOS DE ESTERILIZAÇÃO POR AQUECIMENTO• A DESTRUIÇÃO TÉRMICA DOS MICRORGANISMOS

OCORREM QUANDO A TEMPERATURA ESTÁ ACIMA DA TEMPERATURA MÍNIMA LETAL (80 A 100 oC).

• DESVANTAGENS DA ESTERILIZAÇÃO DESCONTÍNUA:

a) Manutenção do meio em teperaturas relativamente altas por períodos longos, favorecendo o desenvolvimento de reações químicas e decomposição de nutrientes;

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ESTERILIZAÇÃO DE MEIOS• DESVANTAGENS DA ESTERILIZAÇÃO

DESCONTÍNUA:

a) Elevados consumos de vapores no aquecimento e de água no resfriamento;

c) Problemas de corrosão nos equipamentos;d) Tempo não produtivo relativamente elevados,

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ESTERILIZAÇÃO DE MEIOS• ESTERILIZAÇÃO CONTÍNUA:• Pode ser por vapor direto ou indireto também.O meio preparado é bombeado para um trocador de

calor de placas ou tubos, A temperatura sobe instantâneamente e mantida por um

determinado tempo de residência;O meio é enviado para outro trocador de calor para o

resfriamento;O meio é enviado para um fermentador, já esterilizado;

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ESTERILIZAÇÃO DE MEIOS• ESTERILIZAÇÃO CONTÍNUA:• ALGUNS VALORES NUMÉRICOS DE

ESTERILIZAÇÃO CONTÍNUA• a) vapor de aquecimento: vapor saturado (6,8 a

8,5 atm• b) bombas de recalque do mosto não esterilizado

podem ser bombas centrífugas, rotativas ou de pistão;

• c) tempo de enchimento do fermentador: não superior a 8 hs;

• d) temperatura de esterilização: 130 A 165 oC;37

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ESTERILIZAÇÃO DE MEIOS• VANTAGENS DA ESTERILIZAÇÃO

CONTÍNUA:• Temperaturas mais altas, porém tempos de

permanência entre 5 e 10 minutos, o que diminui a destruição dos nutrientes melhorando a fermentação;

• Meios com densidade ou viscosidade altas, como mostos de cereais, o processo contínuo dispensa motores de potencia elevada, o que seria necessário no caso do processo descontínuo;

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ESTERILIZAÇÃO DE MEIOS

• VANTAGENS DA ESTERILIZAÇÃO CONTÍNUA:• Economia de vapor, de água de

resfriamento;• Os esterilizadores podem ser utilizados nos

processos de cozimentos e de sacarificação;

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ESTERILIZAÇÃO DE MEIOS• CINÉTICA DA DESTRUIÇÃO TÉRMICA DOS

MICRORGANISMOS:• A VELOCIDADE DE DESTRUIÇÃO DEPENDE:• a) dos microrganismos• b) do meio• c) da temperatura• Do ponto vista cinético a destruição é dada pela

equação de primeira ordem:• onde: N= número de mo vivos

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NKdtdN *−=