Clase Rear Reg Los Final EC

jueves 6 de mayo de 2010

Los rearreglos de DNA se entienden como el movimiento de secuencias de un lugar a otro que generan cambios en la estructura física del genoma.

Las secuencias que sufren un rearreglo son modificadas, amplificadas o eliminadas.

REARREGLOS DE DNA

- Modificaciones (Conversiones)

-Amplificaciones (Duplicaciones)

-Ganancia (Virus y “transgenes”)

-Pérdida (Física o Funcional)


REARREGLOS DE DNA

Generalmente estos rearreglos suceden en las células somáticas, mientras que las germinales NO se alteran.

Estos rearreglos son usados para controlar la expresión genética: !! a) Creando nuevos genes.

! b) Cambiando el tipo de gen expresado.


- Rearreglos físicos, cambiando la secuencia expresada:! “Mating type” de levadura.! Variación de antígenos de superficie de tripanosoma.

- Introducción de material genético: ! Sistema de transferencia de T-DNA de Agrobacterium ! ! tumefaciens.

- Amplificación de un gen endógeno por presión selectiva.

Revisaremos:


“MATING TYPE” EN LEVADURA


Reproducción en levaduraLas levaduras pueden propagarse como diploides o haploides.


S. ceriviseae en estado haploide presenta dos tipos de apareamiento a y α determinados por el alelo presente en el LOCUS ACTIVO (MAT) del apareamiento.

“Mating type” en levaduraFenotipos de apareamiento


“Mating type” en levaduraApareamiento

El apareamiento sólo ocurre entre células haploides de

diferente tipo.


“Mating type” en levaduraInicio de la vía de señalización

Mutaciones en SCG1, STE4 o STE18


/ a-factor

/ Ste3

“Mating type” en levaduraCascada de Cinasas

Modificado de Peisajovich et al., 2010. Science (328): 368-372

ARRESTO CELULAR, FUSION CELULAR


“Mating type” en levaduraCambio de tipo de aparemiento

Dentro del mismo cromosoma existen copias silenciosas de los dos tipos de apareamiento, HML o HMR.

La levadura puede cambiar de tipo substituyendo la copia del locus activo por una silenciosa

MAT es el casette ACTIVO. El cambio de “mating” es no recíproco. La copia que estaba en MAT se pierde y se substituye por la de HML o HMR.

Las copias de HMR y HML nunca se pierden o cambian.

S iempre se copia de HMR o HML a MAT DIRECCIONAL.

Generalmente se cambia al tipo contrario de apareamiento.


“Mating type” en levaduraOrganización y productos de los cassettes de “mating”

Los cassettes inactivos están bordeados por secuencias comunes y poseen una secuencia interna única (Yα o Ya).

Los genes del locus MAT (activos), se transcriben de un promotor que está dentro de la región Y específica


“Mating type” en levaduraEl locus MAT

Mata

Mata HMRa

HMRa

a specific

a haploid

Los genes del locus MAT codifican para PROTEINAS REGULADORAS de la transcripción de los genes que especifican el tipo de mating. Su función es regular la expresión de la feromona y el receptor, entre otras.


“Mating type” en levaduraPatrones de Expresión Alelo Específicos


“Mating type” en levaduraSilenciamiento de los cassettes HMR y HML

A pesar de contener el promotor en la región Y la expresión de los genes está reprimida en los locus HML y HMR.

Esto se debe a los SILENCIADORES E e I, secuencias que bordean a estos locus, del lado izquierdo y derecho, respectivamente.

A estas secuencias se unen proteínas que se requieren para el silenciamiento:

- Complejo de reconocimiento del origen de replicación (ORC), que se une a ars.- SIR (“silent information regulators”), que actuan remodelando la cromatina, formando heterocromatina.-RAP1 se usa para mantener estado de heterocromatina- Histona H4, interactúan con las proteínas SIR.

REMODELACION PARA FORMAR HETEROCROMATINA


“Mating type” en levaduraTransposición unidireccional

Después del corte hay un apareamiento con locus donador. Toda la región Y que es diferente se degrada hasta llegar a una región homóloga. La región Y se substituye por el nuevo templado de HMR o HML.Este cambio lo inicia MAT, el locus reemplazado.El sitio donador NO se ALTERA semejante a Tn replicativa.El sitio receptor sufre una sustitución pero no hay ganacia de información, diferente a Tn.


“Mating type” en levaduraControl por HO


Variaciones en los Antígenos de Superficie (VGS) en

Trypanosoma sp.


VSG en Trypanosoma

Enfermedad del sueño

+


Variable Surface Glycoproteins:

- Principal componente de la cubierta.

- Monocapa 5-10 x 106 moléculas de la misma VSG.

- Sólo se expresa uno a la vez.

- VSG son reemplazadas cada 1-2 semanas.

VSG en TrypanosomaCiclo de transmisión


La VSG es una proteína de membrana de ~500 a.a

Presenta un región variable que es el determinante antigénico una región C-terminal conservada.

Se une a la membrana por fosfoglicolípidos.

VSG en TrypanosomaEstructura de las VGS


Genoma de Tripanosoma sp:

- # de Cromosomas ?.

- ~100 minicromosomas (50-150 Kb).

- ~1000 VSG genes dispersos en cromosomas y minicromosomas:

- Teloméricos (>200 sí 1/T)

- Internos

- Homología variable (isogenes/misma respuesta inmune).

-Sólo un VSG es expresado (ELC*) en un momento dado

*Expression-Linked Copy

VSG en Trypanosoma Variación antigénica


VSG en TrypanosomaRecambio de las VGS, generación de nuevos ELC


VSG en TrypanosomaRecambio de las VGS, generación de nuevos ELC

Mecanismos:

- Transferencia por duplicación*

- Activación (genes teloméricos)


Trasncripción por RNAPol I(Expression Site Body)

VSG en TrypanosomaEstructura de los genes de la VGS


TRANSFERENCIA INTERESPECIFICA DE GENES

T-DNA de Agrobacterium tumefaciens


Agrobacterium tumefaciens

Transferencia IneterspecíficaAgrobacterium tumefaciens, patógeno de plantas

Agalla de la Corona

A g r o b a c t e r i u m rhizogenes


Recombinación Ilegítima

Transferencia IneterspecíficaAgrobacterium tumefaciens, patógeno de plantas


T-DNA~ 23 Kpb

El plasmido Ti contiene genes que participan en el reconocimiento, la infección, la transformación y biosínteis y degradación de opinas

Hay diferentes tipos de plasmidos dependiendo de sus opinas:1) NOPALINA; induce teratomas contiene hormonas vegetales.2) OCTOPINA.3) AGROPINA.4) PLASMIDO Ri tiene agropina y se diferencia a raíces.

Las funciones codificadas en el Ti dependen del tipo de plasmidos e incluyen genes para la biosíntesis y degradación de opinas

Transferencia IneterspecíficaEstructura de los plásmidos Ti


Genes del plásmido Ti

Transferencia Ineterspecífica

T-DNA~ 23 Kpb


Se requiere de 3 tipos de funciones:A) Unión y reconocimiento. Genes chvA, chvB y pscA producen polisacáridos por la union inicial de la bacteria a la planta.B) Genes de virulencia (Vir) cortar y transferir el T-DNAC) T-DNA, mide 23 KB

Los genes virA y virG son reguladores que pertenecen a un sitema de dos componentes


Transferencia Ineterspecífica

Estructura de los bordes del T-DNA

Generación de la hebra “T”


Célula hospedera

Núcleo

Citoplasma


Célula hospedera

Núcleo

Citoplasma

VirA-VirG

Agrobacteriumjueves 6 de mayo de 2010

Célula hospedera

Núcleo

Citoplasma

VirA-VirG

Agrobacterium

TiTiRegión vir


Célula hospedera

Núcleo

Citoplasma

VirA-VirG

Agrobacterium

TiTi

Región vir

3ʼ3ʼ

5ʼ

5ʼ


Célula hospedera

Núcleo

Citoplasma

VirA-VirG

Agrobacterium

TiTi

Región vir

3ʼ3ʼ

5ʼ5ʼ

Célula hospedera

Núcleo

Citoplasma

VirA-VirG

Agrobacterium

TiTi

Región vir

3ʼ3ʼ

5ʼ5ʼ

Complejo-T


Célula hospedera

Núcleo

Citoplasma

VirA-VirG

Agrobacterium

TiTi

Región vir

3ʼ3ʼ

5ʼ5ʼ

Célula hospedera

Núcleo

Citoplasma

VirA-VirG

Agrobacterium

TiTi

Región vir

3ʼ3ʼ

5ʼ5ʼ

VirD1-VirD2

Complejo-T


Célula hospedera

Núcleo

Citoplasma

VirA-VirG

Agrobacterium

TiTi

Región vir

3ʼ3ʼ

5ʼ5ʼ

Célula hospedera

Núcleo

Citoplasma

VirA-VirG

Agrobacterium

TiTi

Región vir

3ʼ3ʼ

5ʼ5ʼ

VirE2, Vir E1

VirD4

VirF


Citoplasma

VirA-VirG

Agrobacterium

TiTi

Región vir

3ʼ3ʼ

5ʼ5ʼ

Célula hospedera

Citoplasma

VirA-VirG

Agrobacterium

TiTi

Región vir

3ʼ3ʼ

5ʼ5ʼ

VirE2, Vir E1

VirD4

Núcleo

VirF


Citoplasma

VirA-VirG

Agrobacterium

TiTi

Región vir

3ʼ3ʼ

5ʼ5ʼ

Célula hospedera

Citoplasma

VirA-VirG

Agrobacterium

TiTi

Región vir

3ʼ3ʼ

5ʼ5ʼ

VirE2, Vir E1

VirD4

Núcleo

CypA,RocA

VirF


Citoplasma

VirA-VirG

Agrobacterium

TiTi

Región vir

3ʼ3ʼ

5ʼ5ʼ

Célula hospedera

Citoplasma

VirA-VirG

Agrobacterium

TiTi

Región vir

3ʼ3ʼ

5ʼ5ʼ

VirE2, Vir E1

VirD4

Núcleo

CypA,RocA

VIP1, VIP2

VirF


Citoplasma

VirA-VirG

Agrobacterium

TiTi

Región vir

3ʼ3ʼ

5ʼ5ʼ

Célula hospedera

Citoplasma

VirA-VirG

Agrobacterium

TiTi

Región vir

3ʼ3ʼ

5ʼ5ʼ

VirE2, Vir E1

VirD4

Núcleo

CypA,RocA

VirF


Se parece a la conjugación en bacterias (homología entre los genes vir y los genes tra).

Transferencia IneterspecíficaMecanismo de transferencia del T-DNA


Transferencia IneterspecíficaMecanismo de integración del T-DNA

Se desconose gran parte del proceso de integración al cromosoma de la célula vegetal.El sitio de integración tiene preferencia por secuencias ricas en AT.


PRIMERAS APLICACIONES:MANIPULACIONES RELATIVAMENTE DIRECTAS DE UN SOLO GEN, POR EJEMPLO:

•Transferencia a algodón y maíz de material genético de la bacteria Bacillus thuringensis (Bt) la cual produce una proteína insecticida, (Cry-proteína).

•Transferencia a soya, maíz, algodón, betabel y canola de una gen que confiere resistencia al herbicida gliofosfato (Roundup).


Amplificación de DNASecuencias genómicas pueden ser amplificadas en tandem a partir de una secuencia existente. Copias de una unidad los genes contenidos en esta amplificación pueden no ser expresados pero en general aumenta el nivel de expresión.

•Estas copias pueden estar en forma: - extracromosomal, inestables, se pierden-integradas, son estables

• Provocadas por presión selectiva (drogas) metotrexato. Se aumenta la enzima DHFR por amplificación, ocurre frecuentemente 10-4 - 10-6

Las células resistentes aparecen paulatinamente, en relación a la amplificación. (Copias de 40-400).

- Líneas estables cromosoma-Inestables se pueden ver los cromosomas double-minute. Se pierden frecuentemente.-El locus amplificado puede verse en los cromosomas región HSR.La amplificación se mantiene mientras este la presión selectiva

La secuencia que se amplifica es mayor que el gen DHFR (31 Kb) como de 500 kb.La secuencia original no se pierde solo al parecer se recombinan las copias extras.


Duplicación “Extracromsomal”

Observado en líneas celulares resitentes al metotrexato por amplificación (10-4-10-6) del gen dhfr

La secuencia que se amplifica es mayor que el gen dhfr (31 Kb), ~500 kb.La secuencia original no se pierde.

Amplificación de DNA


Amplificación de Secuencias Genómicas

- Duplicación de elementos genéticos pre-existentes.

- Adquisición de genes de otras especies (transferencia horizontal).

Genes Ribosomales(Evolución Concertada)

Genes Globinas


Evolución por Duplicación

Cromosoma 14 Cromosoma 17 Cromosoma 22 Cromosoma 16 Cromosoma 11


Evolución por Rearreglos Genómicos(Duplicación, Conversión, Inactivación


Mecanismos de Duplicación


Mecanismos de Conversión


EL CAMBIO DE VSG SE GENERA POR UN CAMBIO DE GENESExisten como 1000 copias diferentes de VSG en los cromosomas o minicromosomas del parasitoUn parásito puede cambiar hasta 100 vecesTodas las copias existen en el genoma del parásitoLas copias pueden estar en los cromosomas y en los minicromosomas que son alrededor de 100 (50-150 Kb). Probablemente se generaron por duplicación entonces algunos se parecen entre ellos pero son suficientemente diferentes para evadir el sistema inmune

Existen genes en diferentes lugares:GENES TELOMERICOS Cerca del telómero (5-15 kb) se han visto como 200GENES INTERNOS Dentro de los cromosomasSolo una VSG esta ACTIVA y es transcrita y se le llama copia ligada a la expresión (ELC) y se localiza en el SITIO DE EXPRESIONELC siempre cerca del telómero-ELC puede ser siempre el mismo sitio (mas frecuente). A este sitio se la transfiere una VSG diferente.- Puede cambiar de sitio. En el mismo sitio para CAMBIAR de VSG una copia de un nuevo gen se transfiere al ELC. SUBSTITUCION DEL CASETTE

-***Cambiar de sitio ELC (raro). Solo genes cerca del telómero. El otro se apaga.-En casos muy raros nuevas VSgs se generan probablemente por rearreglos entre diferentes copias silenciosas aunque esto es raro

***


La estructura de los genes para VSG es poco común

El fragmento que se transfiere es de 2500- 3500 pb un fragmento grande del 5ʼ del gen aparte de la ORF (1500). El extra esta en el 5ʼEl estudio de la transcripción ha sido dificil porque 35 pb se añaden por trans-splicing.La transcripción puede iniciar varias Kb arriba del gen para la VSG. Dos promotores han sido mapeados y se encuentran muy arriba 4 Kb y 60 kb. El transcrito del promotor distante contiene otros genes ademas de la VSG y posteriormente se procesa y se le añaden 35 pb del líder.VSG transcribe por PolI y no PolII y forma una estructura que se llama el cuerpo del sitio de expresión (ESB). Es parecido al nucleolo.No hay sitios para enzimas de restriccion cerca (barren region) es DNA repetido.No existe un orden para la expresión de las VSGsEl cambio de antígeno de superficie se da también en otros parásitos como Borrelia

La formacion del ELC es por conversion genica y requiere de RECOMBINACION. Semejante a maiting type. Hay alrededor de 20 sitios ELC potencialesEsto se ve mapeando los genes expresadosLa VSG expresada siempre es una COPIA


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